KR20090091721A - 사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질 - Google Patents

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Abstract

식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖고 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 물질이 기재되어 있다. 또한, 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질을 탐색하는 방법으로서, 수용체를 갖는 세포가 수용체에 대해 효능 활성을 갖는 화학 물질 및 시험될 물질과 접촉하는 계에서 수용체로부터의 세포내 신호전달의 수준을 측정하고, 이전 단계에서 측정된 세포내 신호전달의 수준과 화학 물질의 부재 하에 측정된 세포내 신호전달의 수준을 비교하며, 상기 비교에 의해 수득된 차이를 기준으로 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질로서의 화학 물질을 결정하는 것을 포함하는 방법 등이 기재되어 있다.

Description

사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질 {SUBSTANCE CAPABLE OF INHIBITING CYTOKININ SIGNALING}
본 발명은 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖고, 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 약제 등에 관한 것이다.
사이토카이닌은 고등식물의 세포분열 및 분화에 관한 식물 호르몬이고, 고등식물 세포의 분열을 유도하고, 캘러스 또는 속 (pith) 으로부터 경엽 (foliage) 으로 분화하고, 잎의 황화, 낙옆, 낙과를 방지하고, 정단 우성 (apical dominance) 이 되지 않도록 하는 작용을 하는 것으로 알려진 중요한 생리 활성 물질이다 (Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function, CRC Press (1994)). 사이토카이닌에 의해 유발되는 생리현상을 제어하는 방법으로서, 외부로부터 사이토카이닌을 제공하는 것을 포함하는 방법, 식물체에서 사이토카이닌의 생합성을 제어하는 것을 포함하는 방법, 식물체에서 사이토카이닌의 대사를 제어하는 것을 포함하는 방법 등이 제시되어 왔다.
식물 성장 조절제의 유효 성분으로서 제공되는 화학 물질은 통상적으로 시험 화학 물질을 식물과 직접 접촉시켜 식물의 생물학적 활성을 시험하는 랜덤 선별에 의해 발견된다. 상기 경우에서 화학 물질의 안전성 및 환경에 대한 부담을 예 측하기 위해, 유용한 생물학적 활성을 갖는 화학 물질을 측정한 후, 화학 물질에 대해 그의 효과를 나타내는 작용 메카니즘의 종류 및 화학 물질에 의해 분자 레벨로 표적화되는 것을 집중적으로 연구할 필요가 있다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제, 및 표적이 명확한 유용한 생물학적 활성을 갖는 화학 물질을 탐색하는 방법, 즉, 표적 부위를 화학적으로 조절하기 위한 지표로서 특정 표적에 대한 활성을 사용하여 화학 물질을 선별하는 방법을 제공하는 것이다. 상세하게는, 본 발명의 목적은 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖고, 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 약제, 및 약제의 유효 성분으로서 제공되는 화학 물질을 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 하기를 제공한다:
(1) 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제;
(2) 상기 (1) 에 있어서, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제가 식물 성장 조절제인 약제;
(3) 상기 (1) 에 있어서, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제가 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제인 약제;
(4) 상기 (1) 에 있어서, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제가 식물 세포의 분화를 제어할 수 있는 약제인 약제;
(5) 상기 (3) 에 있어서, 식물의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 눈의 성장을 제어할 수 있는 약제인 약제;
(6) 상기 (5) 에 있어서, 식물의 눈의 성장을 제어하는 것이 겨드랑눈 (axillary bud) 의 성장을 저해하는 것인 약제;
(7) 상기 (5) 에 있어서, 식물의 눈의 성장을 제어하는 것이 꽃눈 (flower bud) 의 성장을 저해하는 것인 약제;
(8) 상기 (3) 에 있어서, 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 입묘 (stand establishment) 를 촉진할 수 있는 약제인 약제;
(9) 상기 (3) 에 있어서, 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 분얼 (tillering) 을 촉진할 수 있는 약제인 약제;
(10) 상기 (3) 에 있어서, 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 약제인 약제;
(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체가 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체인 약제:
<군 A>
(a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질;
(12) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성이 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포와 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질의 접촉계에서 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성인 약제;
<군 A>
(a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질;
(13) 유효 성분으로서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질, 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 식물 성장 조절제;
(14) 상기 (13) 에 있어서, 화학 물질이 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질, 및 화학 물질을 포함하는 접촉계에서 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는 식물 성장 조절제:
<군 A>
(a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질;
(15) 상기 (14) 에 있어서, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질이 트랜스-제아틴인 식물 성장 조절제;
(16) 상기 (13) 에 있어서, 화학 물질이 접촉계에 존재하지 않는 경우에 비해, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 0.6 ppm 의 트랜스-제아틴 및 2 ppm 의 상기 화학 물질을 포함하는 접촉계에서 화학 물질이 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는 식물 성장 조절제;
<군 A>
(a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질;
(17) 상기 (13) 에 있어서, 화학 물질이 접촉계에 존재하지 않는 경우에 비해, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 0.6 ppm 의 트랜스-제아틴 및 2 ppm 의 화학 물질을 포함하는 접촉계에서 화학 물질이 하기의 군 A 로부터 선택된 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 90 % 이상 저해하는 활성을 갖는 식물 성장 조절제;
<군 A>
(a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질;
(18) 하기를 포함하는, 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질의 탐색 방법:
<1> 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질 및 시험 물질을 포함하는 접촉계에서, 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 양을 측정하는 첫 번째 단계; 및
<2> 첫 번째 단계에서 측정된 세포내 신호전달의 양을 화학 물질의 부재 하의 세포내 신호전달의 양과 비교하여 수득된 차이를 기준으로 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질을 선택하는 두 번째 단계;
<군 A>
(a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질;
(19) 상기 (18) 에 있어서, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포가 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환 세포인 탐색 방법;
(20) 상기 (18) 에 있어서, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포가 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환 효모 세포인 탐색 방법;
(21) 상기 (18), (19) 또는 (20) 에 있어서, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질이 트랜스-제아틴인 탐색 방법;
(22) 유효 성분으로서, 상기 (18), (19), (20) 또는 (21) 에 따른 탐색 방법에 의해 선택된 화학 물질 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 식물 성장 조절제;
(23) 상기 (13), (14), (15), (16), (17) 또는 (22) 에 따른 식물 성장 조절제의 유효량을 식물 또는 식물의 서식 장소에 적용하는 것을 포함하는 식물 성장 조절 방법;
(24) 상기 (18), (19), (20) 또는 (21) 에 따른 탐색 방법에 의해 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질을 결정하고, 이와 같이 결정된 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질을 식물과 접촉시키는 것을 포함하는 식물 성장 조절 방법;
(25) 유효 성분으로서, 하기의 화학식 (I) 에 의해 나타나는 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 식물 성장 조절제:
Figure 112009030583530-PCT00001
(식 중, R 및 X 는 동일하거나 상이하고, 임의로 치환된 탄화수소기, NR1R2 에 의해 나타나는 기, OR3 에 의해 나타나는 기, S(O)mR4 에 의해 나타나는 기, 니트로기 또는 할로겐 원자를 나타내고,
여기서, R1 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
R2 는 수소 원자, 임의로 치환된 탄화수소기, NR5R6 에 의해 나타나는 기 (식 중, R5 및 R6 은 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 또는 OR7 에 의해 나타나는 기 (식 중, R7 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 를 나타내거나, R1 및 R2 는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 시클릭 아미노기를 형성하고,
R3 및 R4 각각은 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
l 은 0 내지 1 의 정수를 나타내고,
m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고,
n 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,
n 이 2 이상인 경우, 각 X 는 서로 동일하거나 상이하고,
Ar 은 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 헤테로아릴기를 나타냄);
(26) 상기 (25) 에 있어서, l 이 1 이고, R 이 임의로 치환된 탄화수소기인 식물 성장 조절제;
(27) 상기 (25) 에 있어서, l 이 1 이고, R 이 할로겐 원자(들) 또는 옥소기(들) 로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인 식물 성장 조절제;
(28) 상기 (26) 에 있어서, 임의로 치환된 탄화수소기가 할로겐 원자(들) 또는 옥소기(들) 로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인 식물 성장 조절제;
(29) 상기 (25) 에 있어서, l 이 1 이고, R 이 NR1R2 에 의해 나타나는 기인 식물 성장 조절제;
(30) 상기 (29) 에 있어서, R1 이 수소 원자 또는 C1-3 알킬기를 나타내고, R2 가 수소 원자, 아미노기, C1-3 알킬아미노기, 디 C1-3 알킬아미노기, 아미디노기, C1-3 알콕시기, 페닐기, C1-3 아실기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내거나 (여기서 페닐기는 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 C1-3 알킬기로 임의로 치환되고, 상기 페닐기, 아실기, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 할로겐 원자, 히드록실기, C1-3 알콕시기, 히드록시 C1-3 알콕시기, 카르복실기, C1-3 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 아미노기, C1-3 알킬아미노기, 디 C1-3 알킬아미노기, 메르캅토기, C1-3 아실티오기, 시아노기, 푸릴기 및 테트라히드로푸릴기로부터 선택된 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 치환기로 임의로 치환됨), R1 및 R2 는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 피롤리디노기, 피페리디노기 또는 모르폴리노기를 형성하는 식물 성장 조절제;
(31) 상기 (29) 에 있어서, R1 이 수소 원자를 나타내고, R2 가 수소 원자, 포르밀기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내고, 여기서, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기가 히드록실기, 메톡시기, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 시아노기 및 푸릴기로부터 선택된 치환기(들) 로 임의로 치환되는 식물 성장 조절제;
(32) 상기 (25) 에 있어서, l 이 1 이고, R 이 OR3 에 의해 나타나는 기인 식물 성장 조절제;
(33) 상기 (32) 에 있어서, R3 이 아미노기로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인 식물 성장 조절제;
(34) 상기 (25) 에 있어서, l 이 1 이고, R 이 S(O)mR4 에 의해 나타나는 기인 식물 성장 조절제;
(35) 상기 (34) 에 있어서, R4 가 아미노기 또는 히드록실기로 임의로 치환된 C1-3 알킬기이고, m 이 0 인 식물 성장 조절제;
(36) 상기 (25) 에 있어서, l 이 1 이고, R 이 할로겐 원자인 식물 성장 조절제;
(37) 상기 (36) 에 있어서, 할로겐 원자가 염소 원자인 식물 성장 조절제;
(38) 상기 (25) 내지 (37) 중 어느 하나에 있어서, n 이 1 내지 2 이고, X 가 C1-3 알킬기, C1-3 알콕시기, C1-3 할로알킬기, 시아노기, 할로겐 원자 또는 니트로기인 식물 성장 조절제;
(39) 상기 (38) 에 있어서, X 가 염소 원자, 브롬 원자 또는 니트로기이고, X 가 6-위치 및/또는 8-위치에 있는 식물 성장 조절제;
(40) 상기 (25) 내지 (37) 중 어느 하나에 있어서, Ar 이 할로겐 원자(들) 또는 C1-3 알킬기(들) 로 임의로 치환된 페닐기인 식물 성장 조절제;
(41) 상기 (25) 내지 (40) 중 어느 하나에 따른 식물 성장 조절제의 유효량을 식물 또는 식물의 서식 장소에 적용하는 것을 포함하는 식물 성장 조절 방법;
(42) 화학식 (XI) 에 의해 나타나는 화합물, 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염:
Figure 112009030583530-PCT00002
(식 중, Ph 는 페닐기를 나타내고, R11 은 수소 원자, 포르밀기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내고, 여기서, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 히드록실기, C1-3 알콕시기, C1-3 알콕시카르보닐기, 시아노기, 2-푸릴기 및 2-테트라히드로푸릴기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고,
m 은 0 내지 3 의 정수를 나타내고,
n 은 0 내지 1 의 정수를 나타내고,
m 및 n 중 하나 이상은 0 이 아니고,
X1 및 X2 는 동일하거나 상이하고, 염소 원자, 브롬 원자, 트리플루오로메틸기, 시아노기 또는 니트로기를 나타내고,
m 이 2 이상인 경우, 각 X1 은 서로 동일하거나 상이하고; 단,
a) m 이 1 이고, X1 이 5-염소 원자 또는 7-염소 원자이고, R11 이 메틸기를 나타내는 경우, n 은 1 의 정수를 나타내거나,
b) n 이 1 이고, 하기 조건 (1) 내지 (3) 중 어느 하나를 만족하는 경우, m 은 1 내지 3 의 정수를 나타냄:
(1) X2 는 염소 원자이고, R11 은 수소 원자, 메틸기, 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기, 2,2-디메톡시에틸기 및 시아노메틸기로부터 선택된 기임,
(2) X2 는 브롬 원자이고, R11 은 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기 및 2-메톡시에틸기로부터 선택된 기임, 및
(3) X2 는 니트로기이고, R11 은 3-히드록시프로필기임);
(43) 상기 (42) 에 있어서, R11 이 수소 원자, 포르밀기, 메틸기, 에틸기, 2-히드록시에틸기, 2-메톡시에틸기, 푸르푸릴기, 메톡시카르보닐메틸기 또는 에톡시카르보닐메틸기를 나타내고, m 이 0 이고, n 이 1 이고, X2 가 염소 원자 또는 니트로기인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염;
(44) 상기 (42) 에 있어서, R11 이 수소 원자, 포르밀기, 메틸기, 에틸기, 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기, 2-메톡시에틸기, 푸르푸릴기, 메톡시카르보닐메틸기 또는 에톡시카르보닐메틸기를 나타내고, m 이 1 이고, n 이 1 이고, X1 이 8-염소 원자이고, X2 가 염소 원자 또는 니트로기를 나타내는 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염;
(45) 상기 (42) 에 있어서, m 이 1 내지 3 의 정수이고, n 이 0 인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염;
(46) 상기 (42) 에 있어서, R11 이 포르밀기, C4-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내거나 (여기서, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 히드록실기(들) 또는 C1-3 알콕시기(들)로 임의로 치환됨), R11 이 C1-3 알콕시카르보닐메틸기, C1-3 알콕시 C1-3 알킬기 또는 푸르푸릴기를 나타내고,
m 이 0 이고,
n 이 1 이고,
X2 가 염소 원자인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염;
(47) 상기 (42) 에 있어서, n 이 1 인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염;
(48) 상기 (42) 에 있어서, m 이 1 내지 3 이고, n 이 1 인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염;
(49) 상기 (42), (45), (47) 또는 (48) 에 있어서, R11 이 C1-3 알콕시카르보닐메틸기 또는 푸르푸릴기인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염; 및
(50) 상기 (42) 에 있어서, n 이 1 이고, X2 가 트리플루오로메틸기 또는 시아노기인 화합물; 등.
발명을 수행하는 형태
본 발명에서, 용어 "식물" 은 풀 및 나무와 같은 뿌리를 통해 고정적으로 살아가는 유기체를 나타내고, 또한 식물체, 식물 조직, 식물 세포 등을 포함하는 개념을 갖는 것으로 광범위하게 사용된다. 상세하게는, 용어 "식물" 은 뿌리로 언급되는 기관이 토양에서 식물을 고정하고, 외부로부터 물 및 영양분을 흡수하는 중요한 역할을 수행할 수 있는 고등 식물과 같은 유기체를 의미하고, 그의 예는 개화 식물과 같은 관상용 식물 및 관상용 관엽 식물, 곡물, 야채 및 과수 등과 같은 작물, 섬유 식물, 나무, 및 풀을 포함한다. 그의 특정예는 쌀 및 옥수수와 같은 곡물류; 겨이삭띠 및 금잔디와 같은 풀류; 토마토, 녹색 고추, 적색 고추 및 수박과 같은 박과 식물류; 오이, 호박, 멜론 및 수박과 같은 박과 식물류; 양배추, 브로콜리 및 배추와 같은 야채류; 샐러리, 파슬리 및 양상추와 같은 생채류; 양념용 채소류; 부추, 양파 및 마늘과 같은 파류; 대두, 강낭콩, 완두콩 및 팥과 같은 콩류; 딸기와 같은 과채류; 일본 무, 일본 순무, 당근 및 우엉과 같은 직근류: 토란, 감자, 고구마 및 참마와 같은 감자류; 아스파라거스, 시금치 및 붕어마름과 같은 연채류; 꽃도라지, 비단향 꽃무, 카네이션 및 국화와 같은 화판류; 레이프 및 땅콩과 같은 유과작물류; 사탕수수 및 사탕무와 같은 당과작물류; 면 및 등심초와 같은 섬유과작물류; 토끼풀 및 수수와 같은 먹이 작물류; 사과, 배, 포도, 복숭아 및 밤과 같은 낙엽 과수류; 밀감, 레몬 및 자몽과 같은 감귤류; 및 진달래, 진달래속의 각종 화목 및 삼나무와 같은 목본류를 포함한다.
본 발명에서, 용어 식물의 "성장" 은 이미 존재하는 발육 기관 (뿌리, 줄기, 잎) 이 종자 발아에서 시작하는 식물의 초기 발생에서 뿌리, 줄기 및 잎의 성장 및 발달, 꽃의 형성에 이은 종자의 성숙 분열에 이르는 과정 동안 새롭게 생성되고 쌓이는 일반적인 과정을 의미한다. 성장의 예는 발아, 뿌리 성장, 눈의 신장, 줄기의 신장, 끝눈 (terminal bud) 및 겨드랑눈의 형성 및 신장, 가지 및 잎의 발달, 화아의 형성, 개화, 결실 및 종자의 성숙 분열을 포함한다.
본 발명에서, 용어 식물의 "분화" 는 뿌리, 줄기 또는 잎과 같은 식물 조직이 분화전능성을 얻은 식물 세포 집단인 캘러스로부터 형성되는 것 (재분화) 을 의미하거나, 캘러스가 뿌리, 줄기 또는 잎과 같은 식물 조직의 세포로부터 형성되는 것 (탈분화) 을 의미한다.
본 발명에서, "눈의 성장의 제어" 는 끝눈 또는 겨드랑눈의 성장을 촉진 또는 제어하는 것을 의미하고, 그의 예는 정단 우성에 의해 억제되는 겨드랑눈 성장의 개시, 끝눈을 제거하여 개시되는 겨드랑눈 성장의 억제, 통상의 끝눈 성장의 억제를 포함한다.
본 발명에서, "식물의 성장 및 분화를 제어할 수 있는 약제" 는 다양한 방법에 의해 식물을 약제로 처리하여 식물의 성장 및 분화를 제어할 수 있는 약제이다. 식물의 성장 또는 분화의 제어는 농작물과 같은 유용한 식물의 성장 또는 발달을 제어할 수 있고, 이로써 초기 성장을 개선시키고, 품질을 증강시키고, 수율을 증가시키고, 바람직하지 않은 조건하에서도 수율을 안정화하고, 생산에 드는 노력을 절약할 수 있다. 따라서, "식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제" 는 "식물 성장 조절제" 로서 사용될 수 있다.
본 발명에서, 식물의 "뿌리" 는 쌍자엽 식물 및 겉씨 식물의 경우에서 종자의 배에 존재하는 유근 (radicle) 으로부터 발달한 주근 (main root), 및 가지화를 통해 주근에서 신장된 측근 (lateral root) 을 포함한다. 단자엽 식물의 경우에서는, "뿌리" 는 종자의 배아에 존재하는 유근 (종근), 종근 성장의 종결 후 상부에서 형성된 치근 (소위 수염 뿌리), 및 가지화를 통해 부정근에서 신장된 측근을 포함한다. 또한 "뿌리" 는 종종 뿌리의 표피 세포로부터 형성되는, 외부를 향해 연속으로 신장하는 근모를 의미한다. 식물의 뿌리는 토양에 식물을 고정하고, 외부로부터 물 및 영양분을 흡수하는 것과 같은 식물에 대해 중요한 역할을 수행하는 기관이다. 식물의 뿌리는 또한 식물 호르몬이 생성되는 장소로서 매우 중요하다. 농업의 관점에서, 많은 작물은 그의 종자를 통해 번식한다. 그러므로, 식물 성장의 초기 단계에서 균일한 입묘를 달성하는 것은 고품질 및 고수율을 유발하는 매우 중요한 요소이다. 식물의 뿌리 성장의 촉진은 토양에서 발근율을 개선하고, 입묘 등을 개선하여 생산성 또는 품질을 개선하고, 입묘를 개선하여 초기 단계에서 잡초를 제거하고, 종자원의 효율성을 개선하는 등의 다양한 이점을 갖는 것으로 예상된다. 뿌리 확산의 촉진은 건조 스트레스 내성 또는 병해충 내성을 증가시키고, 영양분 흡수 능력을 개선하여 비료량을 감소시키는 것으로 예상된다.
본 발명에서, 식물의 "뿌리 성장" 은 뿌리 세포의 분열, 성장, 및 중량 증가의 결과로서, 뿌리의 길이 및 뿌리의 수가 증가하거나, 뿌리의 양, 두께 및 활성이 증가하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 식물의 "뿌리 성장의 촉진" 은 식물의 뿌리 성장이 평소보다 더욱 활성화되고, 따라서 처리하지 않은 경우에 비해 뿌리의 길이 및 뿌리의 수가 증가하거나 뿌리의 양, 두께 및 활성이 증가하는 것을 의미한다.
본 발명에서, "식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 약제" 는 다양한 방법에 의해 식물을 물질로 처리하여 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 약제이다. 식물의 뿌리 성장의 촉진은 농작물과 같은 유용한 식물의 성장 또는 발달을 제어할 수 있고, 이로써 초기 성장을 개선시키고, 품질을 증강시키고, 수율을 증가시키고, 바람직하지 않은 조건에서도 수율을 안정화하고, 생산에 드는 노력을 절약할 수 있다. 따라서, "식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 약제" 는 "식물 성장 조절제" 로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "입묘" 는 파종된 종자가 발아한 다음, 식물체로 통상적으로 성장할 수 있는 상태로 토양에 발근, 또는 식물의 이식된 모가 토양에 발근한 후 통상적으로 성장하는 것을 의미한다. 입묘의 촉진은 식물의 초기 성장을 개선하고, 따라서 건강한 식물로 성장할 수 있도록 한다. 더욱이, 건강하게 성장한 식물의 수가 증가함으로써 최종 수율의 증가가 예상된다. 예를 들어, 벼 직파 재배의 경우, 불안정한 발아 및 입묘로 인해 소정량의 심어진 모를 항상 보장하는 것은 통상적으로 어렵다. 본 발명의 입묘를 촉진할 수 있는 약제는 입묘를 촉진시켜 벼의 직파 재배의 효율성을 개선시킬 수 있다. 용어 "입묘율" 은 파종된 종자의 총수 또는 이식된 식물의 모의 총수에 대한 입묘된 식물의 비율을 의미한다. 본원에서 사용되는 벼의 경우에서 "입묘율" 을 하기의 식으로 정의할 수 있다.
[입묘율 (%)] = [잎의 선단이 수면에 나타나는 모의 수] / [파종수] × 100
용어 식물의 "분얼" 은 식물이 성장하는 동안 가지를 내는 것 또는 분얼의 결과로서 성장하는 가지를 의미한다. 벼과 식물의 경우에서, 예를 들어, 용어 "분얼" 은 측지를 의미한다. 분얼의 촉진은 초기 분얼 및 분얼의 수를 증가하는 것을 포함한다. 예를 들어, 저온, 고온 및 건조와 같은 스트레스 조건 하에 본 발명의 식물 성장 조절제를 식물에 사용하여 식물의 분얼 시기를 빠르게 함으로써 건강한 모를 조기에 확보하는 경우, 스트레스에 의한 모의 파손을 피할 수 있다. 예를 들어, 조기 분얼은 식물의 경작 기간을 짧아지게 한다. 식물의 분얼 형성이 직접적으로 이삭의 수에 영향을 미치기 때문에, 수율의 증가는 경작 조건에 따라 다르다는 것을 예상할 수 있다.
옥신 활성 물질은 식물의 종류, 옥신 처리 농도 등에 따라 잎의 상위생장, 줄기 뒤틀림, 줄기 분열, 및 뿌리 혹의 유발과 같은 바람직하지 않은 특성을 나타낼 수 있다.
사이토카이닌 활성 물질은 식물의 뿌리 성장을 억제 및 촉진하는 특성을 모두 갖는 것으로 여겨진다 [예를 들어, PNAS 101 (23): 8821-8826 (2004)]. 그러나, 농업의 실시에서, 상기 특성을 이용하기 위해서는 많은 지식이 축적되어야만 한다. 식물체에서 사이토카이닌의 양을 조정하는 것 (특히, 내생 사이토카이닌의 양을 감소시키는 것) 이 통상적으로 어렵기 때문에, 식물에서 사이토카이닌의 역할을 상세하게 연구하는 것은 당업자에게도 쉽지 않다.
식물의 고유 사이토카이닌이 사이토카이닌 신호전달 변이를 저해하여 음성적으로 제어되어 사이토카이닌에 대한 반응성을 약하게 할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 사이토카이닌 신호 전달은 사이토카이닌 수용체 자체를 변이시켜 저해될 수 있고, 사이토카이닌 수용체의 변이체는 단리된다 [The Plant Cell 16:1365-1377 (2004), PNAS 101 (23):8821-8826 (2004)]. 그러나, 변이체를 사용하여, 단계적으로 저해 정도를 조절하는 것은 어렵다. 사이토카이닌 수용체의 단일 변이체는 야생형과 동일한 표현형을 나타낸다. 한편, 사이토카이닌 수용체의 삼중 변이체는 뿌리 신장의 저해 및 식물체의 성장 결함을 나타낸다.
본 발명에서 "세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체" 는 식물에 존재하는 사이토카이닌 수용체를 의미한다. 사이토카이닌 수용체는 사이토카이닌, 예컨대, 키네틴 또는 제아틴과 같은 퓨린 사이토카이닌 또는 N-페닐-N'-(4-피리딜)우레아와 같은 우레아 사이토카이닌에 특이적으로 결합하여, 2-성분 제어계 (Two-component regulatory system) (또는 His to Asp 인산전달계 (phosphorelay system)) 로 불리는 세포내 신호전달을 통해 고등 식물 세포의 증식 및 분화를 제어하는 단백질이다. 본 발명에서 사용되는 사이토카이닌 수용체는 히스티딘 키나제 속에 속하는 단백질이고, 세포외 영역, 막투과 영역, 히스티딘 키나제 영역 (세포 중 히스티딘 키나제 활성을 갖고 활성 부위가 되는 His 잔기를 유지하는 영역) 및 수용기 영역 (인산기 전이를 위한 수용부를 갖고 활성 부위가 되는 Asp 잔기를 유지하는 영역) 으로 구성된다.
2-성분 제어계는 진성세균, 원세균, 진균류 및 식물에서 광범위하게 사용되는 정보 수용 및 세포내 신호전달 메카니즘이다. 상기 메카니즘에서, 히스티딘 키나제는 N-말단부에서 신호를 수용하는 입력 영역, 및 전달 영역이라고 불리는, C-말단부에서의 인산기 전이에 관한 영역을 가진다. 입력 영역이 신호를 인식하는 경우, 전달 영역에서 His 잔기 (앞서 기재된 사이토카이닌 수용체의 히스티딘 키나제 영역) 를 자가인산화한다. 인산기는 교대로 보존된 특정 His 및 Asp 잔기를 인산화하면서 전이되고, 최종적으로는 반응 조절제로 불리는 단백질의 수용기 영역에서 Asp 잔기를 인산화한다. 인산기는 직접적으로 히스티딘 키나제에서 반응 조절제로 전이될 수 있거나, 인산기 전이의 일부 단계를 통해 반응 조절제로 전이될 수 있다. 전자와 같은 간단한 2-성분 제어계는 주로 원핵생물에 존재한다. 한편, 다단계 인산 전이는 주로 진핵생물에서 발견되고, 수용기 영역은 종종 상기 진핵생물의 히스티딘 키나제에 부착된다. 인산기 전이 매개체는 또한 인산기 전이에 관여한다. 반응 조절제의 인산화는 반응 조절제에 부착된 출력 영역의 활성을 조절한다. 출력 영역은 종종 전사 조절제이다.
식물의 사이토카이닌 수용체의 경우에서, 수용기 영역은 동일한 분자에 존재한다. 즉, 사이토카이닌에 결합하는 사이토카이닌 수용체의 경우에서는, 분자 내 His 잔기가 자가인산화한 다음, His 잔기로부터 분자 내 Asp 잔기로 인산기가 전이하는 것으로 알려져 있다. 이어서, 인산기는 인산 전이 매개체의 His 잔기를 통해 반응 조절제의 Asp 잔기로 전이하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 의 경우에서, 인산기는 인산기 매개체 AHP 를 통해 사이토카이닌 수용체 CRE1, AHK2 또는 AHK3 로부터 반응 조절제로 전이하는 것으로 발견된다.
앞서 알려진 사이토카이닌 수용체를 코딩하는 유전자의 예는 애기장대 (CRE1: accession No. AB049934, AHK2: accession No. AB046869, AHK3: accession No. AB046870), 카타란투스 로세우스 (Cataranthus roseus) (accession No. AY092025), 벼 (Oryza sativa) (accession No. AY572461), 및 옥수수 (Zea mays) (ZmHK1: accession No. AB042270, ZmHK2: accession No. AB102956, ZmHK3a: accession No. AB102957, ZmHK3b: accession No. AB121445) 로부터 유래된 유전자의 염기 서열을 포함한다. 알려진 염기 서열을 갖는 상기 유전자는 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노 말단 부근에 해당하는 염기 서열 및 그의 카르복실 말단 부근에 해당하는 염기 서열을 기초로 제조된 주형 및 프라이머로서 원하는 유전자를 갖는 유기체의 게놈 DNA 또는 cDNA 를 사용하여 PCR 에 의해 증폭되고, 이어서 단리될 수 있다. 사이토카이닌 수용체를 코딩하는 유전자는 또한 앞서 기재된 식물 이외의 식물로부터 수득될 수 있다. 첫 번째로, mRNA 를 원하는 식물로부터 제조하고, cDNA 를 주형 및 역전사효소로 mRNA 를 사용하여 합성한다. cDNA 를 ZAPII 와 같은 파지 벡터 또는 pUC 와 같은 플라스미드 벡터로 혼입하여 cDNA 라이브러리를 생성한다. 그 다음, 앞서 기재된 바와 같이 알려진 염기 서열을 갖는 유전자 중에서 잘-보존된 염기 서열을 기초로 고안 및 합성된 cDNA 라이브러리를 주형 및 프라이머로서 사용하여 PCR 을 수행하고, 따라서 사이토카이닌 수용체를 코딩하는 유전자의 적어도 일부를 함유하는 DNA 단편을 증폭할 수 있다. 그 다음, cDNA 라이브러리는 양성 클론을 선택하는 탐침으로서 DNA 단편을 사용하여 선별된다. 선택된 클론의 DNA 는 서열화되고, 유전자가 원하는 사이토카이닌 수용체를 코딩하는 것이 확인될 수 있다.
애기장대의 세 종류의 사이토카이닌 수용체 (CRE1, AHK2, AHK3) 모두는 수용기 영역이 동일한 분자 내에 부착된 히스티딘 키나제이다. 세 개의 상기 사이토카이닌 수용체 중 아미노산 서열 상동성은 높고, 특히, 사이토카이닌에 결합하는 것으로 고려되는 그의 세포외 영역 중 높은 아미노산 서열 상동성이 있다. 또한, 하기에 기재되는 재조합 효모의 경우에서, 사이토카이닌 수용체의 세 가지 종류 모두는 사이토카이닌에 대한 세포내 신호전달을 개시하고, 사이토카이닌 수용체의 활성을 갖는 것으로 확인될 수 있다. 다른 식물의 사이토카이닌 수용체는 또한 히스티딘 키나제이고, 그의 아미노산 서열은 애기장대의 사이토카이닌 수용체의 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는다.
표 1 은 다른 사이토카이닌 수용체와 애기장대의 사이토카이닌 수용체 CRE1 의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.
"세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체" 의 바람직한 예는 애기장대의 사이토카이닌 수용체 CRE1 의 아미노산 서열과 45% 이상, 바람직하게는 49% 이상, 더욱 바람직하게는 53% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루지고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질을 포함한다.
[표 1]
Figure 112009030583530-PCT00003
"세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달" 은 사이토카이닌에 결합하는 사이토카이닌 수용체의 자가인산화로부터 개시되는 인산기 전이에 의해 달성되는 앞서-기재된 신호 변이이다. 식물 세포에서, 사이토카이닌 반응의 신호는 사이토카이닌의 결합에 의해 유도되는 사이토카이닌 수용체의 자가인산화, 자가인산화된 사이토카이닌 수용체로부터 인산기 전이 매개체로의 인산기의 전이, 이어서 인산기 전이 매개체로부터 반응 조절제로의 인산기의 전이에 의해 전달된다. 유사하게는, 식물-유래 사이토카이닌 수용체를 갖는 재조합 세포에서, 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달은 인산기의 전이에 의해 달성된다. 그러나, 상기 경우에서, 인산기 전이 매개체 및 반응 조절제는 숙주 세포로부터 유래될 수 있다. 그의 모두가 숙주 세포로부터 유래될 수 있거나 그의 일부가 숙주 세포로부터 유래될 수 있다. 더욱이, 인산기 전이 매개체는 존재할 수 없다. 예를 들어, 식물-유래 사이토카이닌 수용체를 갖는 재조합 출아 (budding) 효모에서, 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달은, 숙주 출아 효모 세포로부터 유래된 인산기 전이 매개체인 인산기 전이 매개체 Ypd1 를 통해, 인산기를 사이토카이닌 결합에 의해 자가인산화된 사이토카이닌 수용체로부터 숙주 출아 효모 세포로부터 유래된 반응 조절제인 반응 조절제 Ssk1 으로 전이시켜 달성된다. 식물-유래 사이토카이닌 수용체를 갖는 재조합 분열 (fussion) 효모에서, 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달은 숙주 분열 효모로부터 유래된 인산기 전이 매개체 Spy1 를 통해, 인산기를 숙주 분열 효모로부터 유래된 반응 조절제 Mcs4 로 전이시켜 달성된다. 식물-유래 사이토카이닌 수용체를 갖는 재조합 대장균에서, 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달은 숙주 대장균으로부터 유래된 인산기 전이 매개체 YojN 를 통해, 인산기를 숙주 대장균으로부터 유래된 반응 조절제 RcsB 로 전이시켜 달성된다.
식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 상기 세포내 신호전달의 양 또는 유무를 측정하기 위한 방법의 예는 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 다운스트림에 위치하는 반응 조절제에 의해 조절되는 전사를 갖는 표적 유전자의 발현의 양 또는 유무를 측정하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 표적 유전자의 발현의 양 또는 유무를 직접적으로 측정하는 것을 포함하는 방법뿐만 아니라 형광 단백질의 유전자 또는 β-갈락토시다제의 유전자와 같은 리포터 유전자가 표적 유전자의 프로모터 영역에 연결되는 리포터 플라스미드로 숙주 세포를 변형시킨 다음, 지표로서 형광 또는 발색을 사용하여 리포터 유전자의 발현의 양 또는 유무를 측정하는 것을 포함하는 방법, 및 표적 유전자의 발현에 관한 세포수의 증가 또는 감소, 세포 특징의 변화 등을 관찰하거나 측정하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 앞서-기재된 재조합 출아 효모의 경우에서, 사이토카이닌에 따라 다른 재조합 출아 효모의 성장은 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 양 또는 유무를 측정하기 위한 지표로서 사용될 수 있다. 재조합 분열 효모의 경우에서, 사이토카이닌에 따라 다른 재조합 분열 효모의 크기는 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 양 또는 유무를 측정하기 위한 지표로서 사용될 수 있다. 재조합 대장균의 경우에서, 표적 유전자 cps 의 프로모터 영역에 연결된 β-갈락토시다제 유전자의 발현으로 인한 발색은 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 양 또는 유무를 측정하기 위한 지표로서 사용될 수 있다. 리포터 유전자가 A-형 반응 조절제 ARR5 또는 ARR6 의 프로모터 영역에 연결된 리포터 플라스미드로 변형된 애기장대의 경우에서, 사이토카이닌에 따라 다른 형광 또는 발색은 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 양 또는 유무를 측정하기 위한 지표로서 사용될 수 있다. 상기-기재된 방법은 예를 들어 [Higuchi 등의 Nature 409, 1060-1063 (2001); Suzuki 등의 Plant Cell Physiol. 42, 107-113 (2001); Hwang and Sheen, Nature 413, 383-389 (2001) 등] 에 기재된다.
앞서 기재된 것과 같은 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 측정하는 다양한 방법 중, 기계적이고, 정량적이며 효율적인 방법으로서 바람직한 예는 분광광도계로 액체 매질의 탁도를 측정하여 사이토카이닌에 따라 다른 재조합 출아 효모의 성장을 측정하는 것을 포함하는 방법이다. 그의 특정예는 JP-2003-079393 에 기재된 방법을 포함한다.
"세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성" 은 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 감소시키는 능력을 의미한다. 달리 말하면, 이는 사이토카이닌 수용체의 자가인산화에 의해 개시되고, 인산기가 사이토카이닌 수용체로부터 반응 조절제로 전이되는 인산기 전이량을 감소시키는 능력을 의미한다. 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성의 특정예는 사이토카이닌 수용체의 히스티딘 키나제 활성을 저해하는 능력, 인산기를 사이토카이닌 수용체로부터 인산기 전이 매개체로 전이하는 것을 저해하는 능력, 인산기를 인산기 전이 매개체로부터 반응 조절제로 전이하는 것을 저해하는 능력, 및 반응 조절제의 전사 조절을 저해하는 능력을 포함한다. 더욱 상세하게는, 사이토카이닌 수용체의 히스티딘 키나제 활성의 저해를 유발하는, 사이토카이닌 수용체의 히스티딘 키나제 활성을 저해하는 능력의 예는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 것의 존재 또는 부재가 사이토카이닌 효능 활성을 갖는 물질과 사이토카이닌 수용체 간의 결합을 저해하는 것의 존재 또는 부재에 따라 다르게 측정되는 메카니즘에 의해 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 능력을 포함한다. 상기 경우에서, 시험 물질이 실제로 사이토카이닌 효능 활성을 갖는 물질과 사이토카이닌 수용체 간의 결합을 저해하는 경우, 측정 방법의 예는 사이토카이닌 효능 활성을 갖는 방사성표지 물질과 사이토카이닌 수용체의 사용을 포함하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 매우 방사성이도록 수소 방사성동위원소인 삼중수소로 표지된 사이토카이닌 효능 활성을 갖는 물질, 및 사이토카이닌 수용체 유전자가 도입되는 재조합 효모로부터 생성된 사이토카이닌 수용체 단백질을 적절한 완충액에 공존하도록 한 다음, 사이토카이닌 수용체 단백질을 유리 여과기에 수집하여 방사능을 측정한다. 따라서, 매우 방사성이도록 삼중수소로 표지화되고 사이토카인 수용체와 결합하는, 사이토카이닌 효능 활성을 갖는 물질이 검출될 수 있다. 시험 물질을 또한 완충액에서 사이토카이닌 수용체 단백질 및 사이토카이닌 효능 활성을 갖는 방사성표지된 물질과 공존하도록 하는 경우, 시험 물질이 지표로서 방사능 측정 값을 감소시켜 사이토카이닌 효능 활성을 갖는 물질과 사이토카이닌 수용체 간의 결합을 저해한다면 측정될 수 있다. 그 다음, 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 양 또는 유무를 측정하는 앞서-기재된 반응계에 시험 물질을 첨가하는 경우, 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달에 대한 시험 물질의 영향력을 연구할 수 있다.
"세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는 약제" 는 유효 성분으로서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는 물질을 포함하는 약제를 의미한다.
본 발명에서, "세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제" 는 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있고, 앞서 기재된 방법에 의해 측정된 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 능력을 갖는 약제를 의미한다. 약제는 바람직하게는 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제가 식물 성장 조절제인 약제이다.
본 발명에서, "식물 성장 조절제" 는 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제이다.
식물의 성장 또는 분화를 제어하는 능력을 측정하는 방법의 예는 식물에서 뿌리 성장 촉진 활성을 측정하는 방법뿐만 아니라 본 발명에 개시된 방법을 포함한다. 상세하게는, 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 능력은 예를 들어 하기의 방법에 따라 측정될 수 있다.
하기 기재된 조성에 따라서, Enshi 표준 배지를 제조한다 (표 2 참조). DMSO 중 화학 물질의 용액을 최종 농도가 0.001 ppm 내지 10 ppm 이 되도록 클러스터 튜브에 각각 4 ㎕ 씩 분배한다. 그 다음, 600 ㎕ 의 멸균 Enshi 표준 배지를 각 클러스터 튜브에 첨가한 다음 혼합한다. 각 튜브에서, 10 내지 20 개의 애기장대의 종자를 넣고, 밝은 장소에서 10 일 동안 22 ℃ 에서 배양한다. 그 다음, 주근의 평균 길이를 측정한다. 8 회 반복의 평균을 측정한 다음, 뿌리 성장률을 하기의 식으로 측정한다.
[표 2]
Figure 112009030583530-PCT00004
뿌리 성장률 (%) = (화학 물질로 처리된 영역 중 주근의 평균 길이) / (대조 영역 중 주근의 평균 길이) × 100
현저히 높은 뿌리 성장률을 나타내는 시험 물질은 뿌리 성장-촉진 활성을 갖는다고 언급될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 120 % 이상의 뿌리 성장률을 갖는 시험 물질은 뿌리 성장-촉진 활성을 갖는 것으로 판단될 수 있다.
본 발명에서 식물 성장 조절제는 유효 성분으로서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
본 발명에서, "농학적으로 허용가능한 염" 은 식물 성장 조절제를 생성하고 생성물에 적용하는 것을 불가능하지 않게 하는 형태의 염을 의미하고, 임의 형태의 염일 수 있다. 염의 특정예는 염화수소산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 질산염 및 인산염과 같은 미네랄산염; 포름산염, 아세트산염, 피로피온산염, 옥살산염, 말론산염, 숙신산염, 푸마르산염, 말레산염, 락트산염, 말산염, 타르타르산염, 시트르산염, 메탄설폰산염 및 에탄설폰산염과 같은 유기산염; 산부가염, 예를 들어, 아스파르트산염 및 글루탐산염과 같은 산성 아미노산염; 알칼리 금속산염 (나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염 (마그네슘염 등), 및 알루미늄염과 같은 금속염; 메틸아민, 에틸아민 및 에탄올아민과 같은 유기 염기와 리신 및 오르니틴과 같은 염기성 아미노산의 부가염; 및 암모늄 염을 포함한다.
식물 성장 조절제는 고체 담체, 액체 담체 등과 혼합하고, 필요하다면 거기에 계면활성제(들) 및 기타 제제 보조제를 첨가하여 수득할 수 있는 유화성 농축액, 수화성 분말, 현탁액 또는 수용성 분말과 같은 제제의 형태로 통상적으로 사용된다. 제제는 사이토카닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질을 통상적으로 0.5 내지 90 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량% 로 함유한다.
제제에 사용되는 고체 담체의 예는 점토 (카올리나이트, 규조토, 합성함수 산화규소, 푸바사미 점토, 벤토나이트, 산 점토 등), 탈크, 기타 무기 광물 (세리사이트, 석영 분말, 황 분말, 활성 탄소, 탄산 칼슘 등) 및 화학 비료 (황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 염산암모늄, 우레아 등) 의 미세 분말 및 미립을 포함한다. 액체 담체의 예는 물, 알코올 (메탄올, 에탄올 등), 케톤 (아세톤, 메틸 에틸 케톤, 시클로헥사논 등), 방향족 탄화수소 (톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠, 메틸나프탈렌 등), 비-방향족 탄화수소 (헥산, 시클로헥산, 케로센 등), 에스테르 (에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트 등), 니트릴 (아세토니트릴, 이소부티로니트릴 등), 에테르 (디옥산, 디이소프로필 에테르 등), 산 아미드 (디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등) 및 할로겐화 탄화수소 (디클로로에탄, 트리클로로에틸렌 등) 을 포함한다.
계면활성제의 예는 알킬 설페이트, 알킬 설포네이트, 알킬 아릴 설포네이트, 알킬 아릴 에테르 및 그의 폴리옥시에틸렌 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 다가 알코올 에스테르 및 당 알코올 유도체를 포함한다.
다른 제제 보조제의 예는 점착제 및 분산제, 예컨대 카제인, 젤라틴, 다당류 (녹말, 아라비아검, 셀룰로오스 유도체, 알긴산 등), 리그닌 유도체, 벤토나이트, 합성 수용성 중합체 (폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴 산 등), 및 안정화제, 예컨대 PAP (산성 이소프로필 포스페이트), BHT (2,6-tert-부틸-4-메틸페놀), BHA (2-/3-tert-부틸-4-메톡시페놀), 식물성오일, 미네랄 오일, 지방산 및 지방산 에스테르를 포함한다.
본 발명에서, "유효 성분으로서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 식물 성장 조절제" 는 유효 성분으로서, 앞서 기재된 방법에 의해 측정된 세포의 화학 물질의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 능력을 갖는 화학 물질 또는 화학 물질의 농학적으로 허용가용 가능한 염을 함유하여 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제이다. 화학 물질은 바람직하게는 사이토카이닌 수용체 및 사이토카이닌 수용체에 대해 효능 활성을 갖는 물질을 포함하는 앞서 기재된 재조합 출아 효모의 접촉계에서, 사이토카이닌 수용체로부터의 신호전달을 저해하는 능력을 갖는 화학 물질이다. 더욱 바람직하게는 화학 물질의 예는, 화학 물질이 부재하는 경우에 비해 0.6 ppm 의 트랜스-제아틴 및 2 ppm 이상의 화학 물질의 존재 하에 사이토카이닌 수용체의 활성이 감소될 수 있도록, 사이토카이닌 수용체 및 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질을 포함하는 앞서 기재된 재조합 출아 효모의 접촉계에서 화학 물질의 예는 사이토카이닌 수용체의 활성을 저해하는 능력을 갖는 화학 물질을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 화학 물질의 예는, 화학 물질이 부재하는 경우에 비해 0.6 ppm 의 트랜스-제아틴 및 2 ppm 이상의 화학 물질의 존재 하에 사이토카이닌 수용체의 활성이 90% 이상 감소될 수 있도록, 사이토카이닌 수용체 및 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질을 포함하는 앞서 기재된 재조합 출아 효모의 접촉계에서, 화학 물질의 예는 사이토카이닌 수용체의 활성을 저해하는 능력을 갖는 화학 물질을 포함한다.
본 발명에서,
"(1) 사이토카이닌 수용체, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질 및 시험 물질을 갖는 세포를 포함하는 접촉계에서, 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성 (또는 세포내 신호전달의 양 또는 유무) 을 측정하는 첫 번째 단계; 및
(2) 첫번째 단계에서 측정된 활성을 대조군에서의 활성과 비교하여 수득된 차이를 기준으로 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 시험 물질의 능력을 평가하는 두 번째 단계를 포함하는, 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 시험 물질의 능력을 시험하는 방법"은 시험 물질의 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 능력을 시험하기 위한 다양한 방법 중 첫 번째 단계 및 두 번째 단계를 포함하는 방법이다.
"군 A" 는 다음과 같다:
(a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
(d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질.
첫 번째 단계는 앞서 기재된 다양한 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질 및 시험 물질을 포함하는 접촉계에서 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성 (또는 세포내 신호전달의 양 또는 유무) 을 측정하는 단계이다. 두 번째 단계는 첫 번째 단계에서 측정된 활성을 대조군에서의 활성과 비교하여 수득된 차이를 기준으로 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 시험 물질의 능력을 평가하는 단계이다. 본원에서 사용된 것과 같이, 예를 들어, 용매 중 시험 물질의 용액이 반응계에 첨가되는 경우, 대조군은 용매만 첨가된 시험을 의미한다.
첫 번째 단계 및 두 번째 단계를 포함하는 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 시험 물질의 능력을 시험하는 방법에 사용되는 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체는 앞서 기재된 군 A 에 나타난 단백질이다. 앞서 기재된 군 A 의 단백질 중, (b), (c), (d) 및 (e) 에 나타난 단백질의 아미노산 서열에서 종종 발견될 수 있는 (a) 의 아미노산 서열과의 차이는 일부 아미노산의 결실, 치환, 첨가 등에 의한 것이다. 차이는 (a) 의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 세포에서 경험하는 과정에 의해 유발된 결실을 포함한다. 더욱이, 차이는 단백질이 유래된 유기체의 종 상이성, 개체 상이성 등으로 인해 유전적 변이를 자연적으로 발생시키거나, 부위-특이적 변이도입법, 랜덤 변이도입법, 변이도입 처리 등에 의해 인위적으로 유도된 유전적 변이에 의해 유발된 아미노산의 결실, 치환, 첨가 등을 포함한다.
상기 아미노산의 결실, 치환, 첨가 등의 수는 사이토카이닌 수용체의 히스티딘 키나제 활성이 발견될 수 있는 범위 내일 수 있다. 아미노산 치환의 예는 소수성, 전하, pK 및 입체 구조와 같은 유사한 특징을 갖는 아미노산으로의 치환을 포함한다. 상기 치환기의 특정예는 (1) 글리신, 알라닌; (2) 발린, 이소류신, 류신; (3) 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; (4) 세린, 트레오닌; (5) 리신, 아르기닌; (6) 페닐알라닌, 티로신; 등의 군에 있는 치환기를 포함한다.
상기 아미노산의 결실, 첨가 또는 치환을 인위적으로 수행하는 방법의 예 (이하에서, 통상적으로 종종 아미노산의 대체 (alternation) 로서 언급됨) 는 (a) 의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 를 부위 특이적 변이도입법으로 처리한 다음, 통상의 기술로 DNA 를 발현시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 부위 특이적 변이도입법의 예는 암베르 변이의 사용을 포함하는 방법 (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)) 및 변이를 도입하기 위해 프라이머를 사용하는 PCR 을 포함하는 방법을 포함한다. 아미노산의 대체를 인위적으로 수행하는 방법의 예는 (a) 의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 를 랜덤 변이도입법으로 처리한 다음, 통상의 방법으로 DNA 를 발현시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 랜덤 변이도입법의 예는 기질로서 사용되는 각각의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 의 첨가 농도가 통상의 조건으로부터 변화된 반응 조건 또는 중합효소 반응을 촉진하기 위한 Mg2+ 의 농도가 통상의 조건보다 증가된 반응 조건에서, 주형으로 앞서 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나를 코딩하는 DNA 및 DNA 의 전체 길이를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 사용하는 PCR 을 포함하는 방법을 포함한다. 상기 PCR 기술의 예는 [Molecular Biology, (31), 1994, 97-112] 에서의 방법에 기재된 방법뿐만 아니라 WO0009682 에 기재된 방법을 포함한다.
본원에서 사용되는 "서열 동일성" 은 두 개의 염기 서열 또는 두 개의 아미노산 서열 간의 동일성을 의미한다. "서열 동일성" 은 그의 모든 영역에 걸쳐 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 측정된다. 염기 서열 또는 아미노산 서열의 최적 배열은 첨가 또는 결실 (예를 들어, 갭) 을 함유할 수 있다. 상기 서열 동일성은 구조 배열에 대해 FASTA [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 2444-2448 (1988)], BLAST [Altschul 등의 Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)], 및 CLUSTAL W [Thompson, Higgins & Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680 (1994a)] 와 같은 프로그램을 사용하는 상동성 분석을 수행하여 계산될 수 있다. 앞서 기재된 프로그램은 통상적으로 일본의 DNA Data bank [international DNA data bank operated in Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan; CIB/DDBJ of National Institute of Genetics] 의 홈페이지 (http://www.ddbj.nig.ac.jp) 등에서 일반적으로 이용가능하다. 서열 동일성은 또한 상용화된 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 수득될 수 있다. 상세하게는, 예를 들어, 상동성 분석은 구조 배열에 대해 Lipman-Pearson 방법 [Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)] 및 GENETYX-WIN Ver.5 (Software Development 사 제품) 을 사용하여 수행되고, 따라서 서열 동일성이 계산될 수 있다.
(e) 에 기재된 "엄격한 조건" 은 통상의 방법, 예를 들어, [Molecular Cloning 2nd edition written by Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T. issued by Cold Spring Harbor Laboratory Press] 에 기재된 통상의 방법에 따라 수행되는 교배에서, 교배가 6 × SSC (10 × SSC 는 1.5M 의 NaCl 및 0.15M 의 삼나트륨구연산염을 함유함) 을 함유하는 용액 중 45 ℃ 에서 수행한 다음, 50 ℃ 에서 2 × SSC 로 세정하는 조건 [Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6] 을 포함한다. 세정 단계에서의 염 농도는 예를 들어, 2 × SSC (낮은 엄격한 조건) 내지 0.2 × SSC (매우 엄격한 조건) 의 범위에서 선택될 수 있다. 세정 단계의 온도는 예를 들어, 실온 (낮은 엄격한 조건) 내지 65 ℃ (매우 엄격한 조건) 의 범위에서 선택될 수 있다. 염 농도 및 온도 모두는 변할 수 있다.
각각의 상기 단백질은 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질이다. 바람직하게는, 하기의 단백질이 사용된다: 최대 서열 동일성이 수득될 수 있도록 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 의 아미노산 서열로 배열된 경우, 서열 번호: 1 의 (I) 459 및 (II) 973 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 각각 (I) 459 위치에서는 히스티딘 및 (II) 973 위치에서는 아스파르트산인 아미노산 서열을 포함하는 단백질. 본원에서 사용되는 "최대 서열 동일성이 수득될 수 있도록 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 의 아미노산 서열로 배열된다" 는 것은 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 관심있는 복수의 아미노산 서열의 서열 동일성 분석이 아미노산 서열을 배열하는 FASTA, BLAST, 또는 CLUSTAL W 와 같은 앞서 기재된 프로그램을 사용하여 수행되는 것을 의미한다. 상기 방법에 의한 복수 서열의 배열 결과로서, 아미노산 서열에 존재하는 삽입 또는 결실에도 불구하고, 각각의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 상동위치를 측정할 수 있다. 상동 위치는 3 차원 구조에서 동일한 위치라고 고려되고, 관심있는 단백질의 특정 작용에 유사한 효과를 갖는 것으로 예상될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 서열을 갖는 사이토카이닌 수용체를 포함하는 공지된 사이토카이닌 수용체의 경우에서, 최대 서열 동일성이 수득될 수 있도록 사이토카이닌 수용체의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 의 아미노산 서열로 배열되는 경우, 서열 번호: 1 의 (I) 459 및 (II) 973 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 각각 (I) 459 위치에서는 히스티딘이고 (II) 973 위치에서는 아스파르트산이다.
식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제의 유효 성분은 예를 들어, 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 능력을 측정하여 탐색될 수 있다.
앞서 기재된 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체를 사용하는 것을 포함하는 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 능력을 시험하는 방법은 또한 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 능력을 갖는 물질을 탐색하는데 사용될 수 있다. 상세하게는, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체를 사용하는 것을 포함하는 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 능력을 시험하는 방법을 사용하여 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 시험 물질의 능력을 특정값 이상 또는 특정값 이하가 되도록 측정할 때, 물질이 선택된다. 따라서, 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 능력을 갖는 물질이 탐색될 수 있다.
탐색 방법에 의해 선택된 물질이 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 능력을 갖기 때문에, 유효 성분으로서 물질 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 함유하는 조성물은 식물 성장 조절제일 수 있다.
사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질의 특정예는 사이토카이닌 길항제 및 사이토카이닌 효능제를 포함한다.
앞서 기재된 탐색 방법에 의해 선택된 사이토카이닌 신호전달-저해 물질은 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있다. 뿌리 성장은 주근의 신장, 측근의 신장, 및 근모의 신장을 포함한다.
앞서 기재된 탐색 방법에 의해 선택되는 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 뿌리 성장-촉진 활성은 예를 들어, 하기의 방법을 사용하여 시험할 수 있다. 예를 들어, 0.0001 내지 100 ppm 의 범위 내에서 상이한 농도로 사이토카이닌 신호전달-저해 물질을 함유하는 수용액, 수경 배양 배지 또는 조직 배양 배지는 식물의 종류 및 어세이 (assay) 방법에 따라 다르게 제조된다. 페트리 디쉬 시험의 경우에서, 페트리 디쉬에 펼쳐진 여과지에 용액을 침지시키고, 식물 종자를 그 위에 놓는다. 파우치 시험의 경우에서, 종자 성장용 파우치와 같이 뿌리 성장 관찰용 파우치에 위치하는 무거운 종이에 용액을 침지시키고, 식물 종자를 그 위에 심는다. 고체 배지는 플라스틱 페트리 디쉬 또는 플라스틱 원심분리 튜브에서 정제한천, 한천 등을 용액에 첨가하여 제조되고, 식물 종자를 거기에 심는다. 빛의 존재 하에 10 내지 30 ℃ 에서 특정 기간 동안 인큐베이션 후, 주근 및 측근의 길이, 측근의 수, 뿌리의 습식 중량, 뿌리의 건조 중량 등을 측정한다.
앞서 언급된 탐색 방법에 의해 선택된 사이토카이닌 신호전달-저해 물질은 식물 성장 조절제로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 화학식 (I) 에 의해 나타나는 화합물 (이하에서, 때로는 화합물 (I) 으로 언급됨) 중 R, X, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 에 의해 나타나는 기에서, "탄화수소기" 의 예는 지방족 탄화수소기, 모노시클릭 포화 탄화수소기 및 방향족 탄화수소기를 포함하고, 탄소수 1 내지 16 의 탄화수소기가 바람직하다. 그의 특정예는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 아랄킬기 및 아릴기를 포함한다.
"알킬기" 는 바람직하게는 예를 들어, 저급 알킬기이다. 알킬기의 특정예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸, 펜틸 및 헥실과 같은 C1-6 알킬기를 포함한다.
"알케닐기" 는 바람직하게는 예를 들어, 저급 알케닐기이다. 알케닐기의 특정예는 비닐, 1-프로페닐, 알릴, 이소프로페닐, 부테닐 및 이소부테닐과 같은 C2-6 알케닐기를 포함한다.
"알키닐기" 는 바람직하게는 예를 들어, 저급 알키닐기이다. 알키닐기의 특정예는 에티닐, 프로파르길 및 1-프로피닐과 같은 C2-6 알키닐기를 포함한다.
"시클로알킬기" 는 바람직하게는 예를 들어, 저급 시클로알킬기이다. 시클로알킬기의 특정예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실과 같은 C3-6 시클로알킬기를 포함한다. "아랄킬기" 는 바람직하게는 예를 들어, 벤질 또는 페네틸과 같은 C7-11 아랄킬기이다. 상세하게는, 예를 들어, 벤질기가 사용된다.
"아릴기" 는 바람직하게는 예를 들어, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 비페닐일 또는 2-안트릴과 같은 C6-14 아릴기이다. 상세하게는, 예를 들어, 페닐기가 사용된다.
"임의로 치환된 탄화수소기" 및 "임의로 치환된 C1-6 알킬기" 의 "탄화수소기" 및 "C1-6 알킬기" 에 대한 치환기의 예는 할로겐 원자 (예를 들어, 불소, 염소, 브롬, 요오드 등), 니트로기, 시아노기, 히드록실기, 저급 알킬기 (예를 들어, C1-6 알킬기, 예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 또는 헥실 등), 저급 알콕시기 (예를 들어, C1-6 알콕시기, 예컨대, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, 펜틸옥시 또는 헥실옥시 등), 아미노기, 모노-저급 알킬아미노기 (예를 들어, 모노-C1-6 알킬아미노기, 예컨대, 메틸아미노 또는 에틸아미노 등), 디-저급 알킬아미노기 (예를 들어, 디-C1-6 알킬아미노기, 예컨대, 디메틸아미노 또는 디에틸아미노 등), 이미노기, 카르복실기, 저급 알킬카르보닐기 (예를 들어, C1-6 알킬카르보닐기, 예컨대, 아세틸 또는 프로피오닐 등), 저급 알콕시카르보닐기 (예를 들어, C1-6 알콕시카르보닐기, 예컨대, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로폭시카르보닐 또는 부톡시카르보닐 등), 카르바모일기, 티오카르바모일기, 모노-저급 알킬카르바모일기 (예를 들어, 모노-C1-6 알킬카르바모일기, 예컨대, 메틸카르바모일 또는 에틸카르바모일 등), 디-저급 알킬카르바모일기 (예를 들어, 디-C1-6 알킬카르바모일기, 예컨대, 디메틸카르바모일 또는 디에틸카르바모일 등), 아릴카르바모일기 (예를 들어, C6-10 아릴카르바모일기, 예컨대, 페닐카르바모일 또는 나프틸카르바모일 등), 아릴기 (예를 들어, C6-10 아릴기, 예컨대, 페닐 또는 나프틸 등), 아릴옥시기 (예를 들어, C6-10 아릴옥시기, 예컨대, 페닐옥시 또는 나프틸옥시 등), 헤테로시클릭기 (예를 들어, 2- 또는 3-티에닐, 2- 또는 3-테트라히드로티에닐, 2- 또는 3-푸릴, 2- 또는 3-테트라히드로푸릴, 1-, 2- 또는 3-피롤릴, 1-, 2- 또는 3-피롤리디닐, 2-, 4- 또는 5-옥사졸릴, 3-, 4- 또는 5-이속사졸릴, 2-, 4- 또는 5-티아졸릴, 3-, 4- 또는 5-이소티아졸릴, 3-, 4- 또는 5-피라졸릴, 2-, 3- 또는 4-피라졸리디닐, 2-, 4- 또는 5-이미다졸릴, 4- 또는 5-1H-1,2,3-트리아졸릴, 3- 또는 5-1,2,4-트리아졸릴, 5-1H- 또는 5-2H-테트라졸릴, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 1-, 2- 또는 3-티오모르폴리닐, 1-, 2- 또는 3-모르폴리닐, 1-, 2-, 3- 또는 4-피페리디노, 2-, 3- 또는 4-피페리딜, 2-, 3- 또는 4-티오피라닐, 2-, 3- 또는 4-4H-1,4-옥사디닐, 2-, 3- 또는 4-4H-1,4-티아지닐, 1,3-티아지닐, 1- 또는 2-피페라지닐, 3-, 5- 또는 6-1,2,4-트리아지닐, 2-1,3,5-트리아지닐, 3- 또는 4-피리다지닐, 2-피라지닐 등), 저급 알킬카르보닐아미노기 (예를 들어, C1-6 알킬카르보닐아미노기, 예컨대, 아세틸아미노 등), 메르캅토기, C1-6 알킬티오기 (예를 들어, C1-6 알킬티오기, 예컨대, 메틸티오 등), 알킬설피닐기 (예를 들어, C1-6 알킬설피닐기, 예컨대, 메틸설피닐 등), 알킬설포닐기 (예를 들어, C1-6 알킬설포닐기, 예컨대, 메틸설포닐 등), 아릴티오기 (예를 들어, C6-10 아릴티오기, 예컨대, 페닐티오 등), 아릴설피닐기 (예를 들어, C6-10 아릴설피닐기, 예컨대, 페닐설피닐 등), 아릴설포닐기 (예를 들어, C6-10 아릴설포닐기, 예컨대, 페닐설포닐 등), 옥소기 및 티옥소기를 포함한다.
아실기 (예를 들어, 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 피발로일, 아크릴로일, 벤조일 등) 는 옥소기로 치환된 탄화수소기의 종류이고, "임의로 치환된 탄화수소기" 및 "임의로 치환된 C1-6 알킬기" 에 포함된다.
"임의로 치환된 탄화수소기" 및 "임의로 치환된 C1-6 알킬기" 의 "탄화수소기" 및 "C1-6 알킬기" 는 치환가능한 위치에서 1 개 이상, 바람직하게는 1 내지 3 개의 앞서 기재된 치환기를 가질 수 있다. 치환기가 할로겐 원자인 경우, 탄화수소기 및 C1-6 알킬기는 치환가능한 최대 수의 치환기를 가질 수 있다. 그것이 2 개 이상의 치환기를 갖는 경우, 치환기는 동일하거나 상이하다.
치환기가 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 모노-저급 알킬아미노기, 디-저급 알킬아미노기, 저급 알킬카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 모노-저급 알킬카르바모일기, 디-저급 알킬카르바모일기, 아릴카르바모일기, 아릴기, 아릴옥시기, 헤테로시클릭기, 저급 알킬카르보닐아미노기, 알킬티오기, 알킬설피닐기, 알킬설포닐기, 아릴티오기, 아릴설피닐기, 아릴설포닐기 등인 경우, 치환기는 할로겐 원자 (예를 들어, 불소, 염소, 브롬, 요오드 등), 니트로기, 시아노기, 히드록실기, C1-4 알콕시기 (예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로필옥시, 부톡시, 이소부틸옥시), 아릴기, 옥소기 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3 개의 치환기로 임의로 치환된다. 치환기가 아릴카르바모일기, 아릴기, 아릴옥시기, 헤테로시클릭기, C6-10 아릴티오기, C6-10 아릴설피닐기, C6-10 아릴설포닐기 등인 경우, 치환기는 1 내지 3 개의 C1-4 알킬기 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸 등) 로 임의로 치환된다.
"C1-6 알킬기" 의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸, 펜틸, 및 헥실을 포함한다.
"C1-3 알킬기" (C1-3 알킬아미노기 및 디 C1-3 알킬아미노기에 포함되는 C1-3 알킬기를 포함함) 의 예는 메틸, 에틸, 프로필 및 이소프로필을 포함한다.
"C3-6 알케닐기" 의 예는 1-프로페닐, 알릴, 이소프로페닐, 부테닐 및 이소부테닐을 포함한다.
"C3-6 알키닐기" 의 예는 프로파르길 및 1-프로피닐을 포함한다.
"C1-3 알콕시기" (히드록시 C1-3 알콕시기 및 C1-3 알콕시카르보닐기에 포함되는 C1-3 알킬기를 포함함) 의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로필옥시를 포함한다.
"C1-3 아실기" (C1-3 아실티오기에 포함되는 C1-3 아실기를 포함함) 의 예는 포르밀, 아세틸 및 프로피오닐을 포함한다.
"C1-3 할로알킬기" 의 예는 클로로메틸, 트리플루오로메틸, 2-브로모에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸 및 2,2,3,3,3-펜타플루오로프로필을 포함한다.
"R1 및 R2 가 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 시클릭 아미노기를 형성함"의 "시클릭 아미노기" 의 예는 1-아지리디닐, 피롤리디노, 피페리디노, 모르폴리노 및 티오모르폴리노를 포함한다. "시클릭 아미노기" 에 대한 치환기의 예는 C1-3 알킬기, C1-3 알콕시기 및 히드록실기와 같은 상기 기재된 치환기 중 1 내지 3 개를 포함한다.
Ar 에 의해 나타나는 기에서 "아릴기" 의 예는 R, X, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 에 의해 나타나는 "탄화수소기" 의 예로 기재된 아릴기를 포함한다.
Ar 에 의해 나타나는 기에서 "헤테로아릴기" 의 예는 2- 또는 3-티에닐, 2- 또는 3-푸릴, 1-, 2- 또는 3-피롤릴, 2-, 4- 또는 5-옥사졸릴, 3-, 4- 또는 5-이속사졸릴, 2-, 4- 또는 5-티아졸릴, 3-, 4- 또는 5-이소티아졸릴, 3-, 4- 또는 5-피라졸릴, 2-, 4- 또는 5-이미다졸릴, 4- 또는 5-1H-1,2,3-트리아졸릴, 3- 또는 5-1,2,4-트리아졸릴, 5-1H- 또는 5-2H-테트라졸릴, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 1- 또는 2-피페라지닐, 3-, 5- 또는 6-1,2,4-트리아지닐, 2-1,3,5-트리아지닐, 3- 또는 4-피리다지닐, 및 2-피라지닐을 포함한다.
"아릴기" 및 "헤테로아릴기" 에 대한 치환기의 예는 R, X, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 에 의해 나타나는 "임의로 치환된 탄화수소기" 및 "임의로 치환된 C1-6 알킬기" 에 대한 치환기의 예로서 기재된 기를 포함한다.
l 이 0 인 화학식 (I) 의 화합물은 퀴나졸린 골격의 2-위치가 비치환된 화합물, 즉, 화학식 (I-1) 의 화합물이다:
Figure 112009030583530-PCT00005
(식 중, X 는 임의로 치환된 탄화수소기, NR1R2 에 의해 나타나는 기, OR3 에 의해 나타나는 기, S(O)mR4 에 의해 나타나는 기, 니트로기 또는 할로겐 원자를 나타내고,
여기서, R1 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
R2 는 수소 원자, 임의로 치환된 탄화수소기, NR5R6 에 의해 나타나는 기 (여기서, R5 및 R6 은 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 또는 OR7 에 의해 나타나는 기 (여기서, R7 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 를 나타내거나, R1 및 R2 는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 시클릭 아미노기를 형성하고,
R3 및 R4 각각은 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고,
n 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,
n 이 2 이상인 경우, 각 X 는 서로 동일하거나 상이하고,
Ar 은 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 헤테로아릴기를 나타냄).
l 이 1 인 화학식 (I) 의 화합물은 퀴나졸린 골격의 2-위치가 R 로 치환된 화합물, 즉, 화학식 (I-2) 의 화합물이다:
Figure 112009030583530-PCT00006
(식 중, R 및 X 는 동일하거나 상이하고, 임의로 치환된 탄화수소기, NR1R2 에 의해 나타나는 기, OR3 에 의해 나타나는 기, S(O)mR4 에 의해 나타나는 기, 니트로기 또는 할로겐 원자를 나타내고,
여기서, R1 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
R2 는 수소 원자, 임의로 치환된 탄화수소기, NR5R6 에 의해 나타나는 기 (여기서, R5 및 R6 은 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 또는 OR7 에 의해 나타나는 기 (여기서, R7 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 를 나타내거나, R1 및 R2 는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 시클릭 아미노기를 형성하고,
R3 및 R4 각각은 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고,
n 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,
n 이 2 이상인 경우, 각 X 는 서로 동일하거나 상이하고,
Ar 은 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 헤테로아릴기를 나타냄).
화합물 (I) 은 앞서 기재된 "농학적으로 허용가능한 염" 의 형태일 수 있다.
화합물 (I) 이 하나 이상의 비대칭 중심을 갖는 경우, 화합물은 두 개 이상의 입체이성질체 (예를 들어, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 등) 을 포함한다. 본 발명의 화합물은 모든 입체이성질체 및 두 개 이상의 입체이성질체의 혼합물을 포함한다.
화합물 (I) 이 이중 결합 등에 근거한 기하학적 이성질현상을 갖는 경우, 화합물 (I) 은 두 개 이상의 기하학적 이성질체 (예를 들어, E/Z 또는 트랜스/시스 이성질체, S-트랜스/S-시스 이성질체 등) 를 포함한다. 화합물 (I) 은 모든 기하학적 이성질체 및 두 개 이상의 이성질체의 혼합물을 포함한다.
화합물 (I) 의 바람직한 예는 하기의 화합물을 포함한다:
(1) l 이 1 이고, R 이 임의로 치환된 탄화수소기인, 화학식 (I) 의 화합물.
(2) l 이 1 이고, R 이 할로겐 원자(들) 또는 옥소기(들) 로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인, 화학식 (I) 의 화합물.
(3) 임의로 치환된 탄화수소기가 할로겐 원자(들) 또는 옥소기(들) 로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인, 화학식 (I) 의 화합물.
(4) l 이 1 이고, R 이 NR1R2 에 의해 나타나는 기인, 화학식 (I) 의 화합물.
(5) R1 이 수소 원자 또는 C1-3 알킬기를 나타내고, R2 가 수소 원자, 아미노기, C1-3 알킬아미노기, 디 C1-3 알킬아미노기, 아미디노기, C1-3 알콕시기, 페닐기, C1-3 아실기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내거나, 여기서, 상기 페닐기가 동일하거나 상이한 1 내지 3 개의 C1-3 알킬기로 임의로 치환되고, 상기 페닐기, 아실기, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기가 할로겐 원자, 히드록실기, C1-3 알콕시기, 히드록시 C1-3 알콕시기, 카르복실기, C1-3 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 아미노기, C1-3 알킬아미노기, 디 C1-3 알킬아미노기, 메르캅토기, C1-3 아실티오기, 시아노기, 푸릴기 및 테트라히드로푸릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 동일하거나 상이한 1 내지 3 개의 치환기로 임의로 치환되고, R1 및 R2 가 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 피롤리디노기, 피페리디노기 또는 모르폴리노기를 형성하는, 상기 (4) 의 화합물.
(6) R1 이 수소 원자를 나타내고, R2 가 수소 원자, 포르밀기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내고, 여기서, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기가 히드록실기, 메톡시기, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 시아노기 및 푸릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기(들) 로 임의로 치환되는, 상기 (4) 의 화합물.
(7) l 이 1 이고, R 이 OR3 에 의해 나타나는 기인, 화학식 (I) 의 화합물.
(8) R3 이 아미노기로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인, 상기 (7) 의 화합물.
(9) l 이 1 이고, R 이 S(O)mR4 에 의해 나타나는 기인, 화학식 (I) 의 화합물.
(10) R4 가 아미노기 또는 히드록실기로 임의로 치환된 C1-3 알킬기이고, m 이 0 인, 상기 (9) 의 화합물.
(11) l 이 1 이고, R 이 할로겐 원자인, 화학식 (I) 의 화합물.
(12) 할로겐 원자가 염소 원자인, 상기 (11) 의 화합물.
(13) n 이 1 내지 2 이고, X 가 C1-3 알킬, C1-3 알콕시기, C1-3 할로알킬기, 시아노기, 할로겐 원자 또는 니트로기인, 화학식 (I) 의 화합물.
(14) X 가 염소 원자, 브롬 원자 또는 니트로기이고, X 가 6-위치 및/또는 8-위치에서 치환되는, 상기 (13) 의 화합물.
(15) Ar 이 할로겐 원자(들) 또는 C1-3 알킬기(들) 로 임의로 치환된 페닐기인, 화학식 (I) 의 화합물.
화합물 (I) 은 공지된 화합물을 포함하고, 공지된 방법 또는 그와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
예를 들어, l 이 1 이고, R 이 염소 원자인 화합물 (Ia) 을 하기의 제조 방법 1 에 따라 화합물 (II) 와 옥시염화인을 가열하여 제조할 수 있다.
문헌예: JP-A 62-145073
제조 방법 1
Figure 112009030583530-PCT00007
(식 중, 기호는 상기 정의된 것과 같음).
상기 반응은 반응에 불리한 영항을 미치지 않는 용매에서 수행될 수 있고, 통상적으로는 용매의 부재 하에 과량의 옥시염화인 (화합물 (II) 에 대해 5 당량 내지 30 당량) 을 사용하여 수행된다. 반응 온도는 통상적으로 약 80 내지 200 ℃, 바람직하게는 90 ℃ 내지 환류 온도 (105 ℃) 이다. 반응 시간은 통상적으로 0.1 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 5 시간, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 시간이다. 반응이 환류 하에서도 서서히 진행되는 경우, 반응을 또한 약 200 ℃ 로 가열할 수 있고, 내압 밀폐 용기에서 가압할 수 있다 (예를 들어, 1.1 내지 100 대기압).
l 이 1 이고, R 이 할로겐 원자 이외의 기 Ra 인 화합물 (Ib) 를 예를 들어, 하기의 제조 방법 2 에 따라 화합물 (III) 와 화합물 (IV) 를 반응시켜 제조할 수 있다.
문헌예: Journal of the Chemical Society of Japan, 1973 년, p 1944; JP-A 58-88369
제조 방법 2
Figure 112009030583530-PCT00008
(식 중, Y 는 이탈기 (예를 들어, 할로겐 원자, 예컨대, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드; 알칸- 또는 아렌-설포닐옥시기, 예컨대, 메탄설포닐옥시기, 벤젠설포닐옥시기 또는 p-톨루엔설포닐옥시기; 알칸-, 아렌- 또는 아렌알칸-설포닐기, 예컨대, 메탄설포닐, 벤젠설포닐, 또는 페닐메탄설포닐 등) 를 나타내고; Ra 는 R 과 동일한 의미를 가지나, 단, Ra 는 할로겐 원자는 아니고; 다른 기호는 상기 정의된 것과 같음).
상기 반응은 용매를 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다. 용매의 예는 지방족 탄화수소, 예컨대, 펜탄, 헥산, 헵탄, 석유에테르, 또는 시클로헥산; 에스테르, 예컨대, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 또는 에틸 프로피오네이트; 케톤, 예컨대, 아세톤, 또는 메틸 에틸 케톤; 에테르, 예컨대, 디에틸 에테르, 메틸 tert-부틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 테트라히드로푸란, 또는 디옥산; 알코올, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올; 니트릴, 예컨대, 아세토니트릴, 또는 프로피오니트릴; 산 아미드, 예컨대, 디메틸포름아미드, 또는 디메틸아세트아미드; 시클릭 아미드, 예컨대, 1-메틸-2-피롤리돈; 인산 아미드, 예컨대, 헥사메틸인산아미드; 시클릭 우레아, 예컨대, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논; 설폭시드, 예컨대, 디메틸 설폭시드; 설폰, 예컨대, 설폴란; 할로겐화 탄화수소, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 또는 사염화탄소; 방향족 아민, 예컨대, 피리딘, 피콜린, 루티딘, 또는 퀴놀린; 그의 혼합물, 물, 및 용매와 물의 혼합물을 포함한다.
용매와 물의 혼합물을 사용하고 반응이 균일반응계가 아닌 경우, 상이동 촉매 (예를 들어, 사차암모늄염, 예컨대, 벤질트리에틸암모늄 클로라이드, 또는 벤질트리에틸암모늄 브로마이드, 크라운 에테르, 예컨대, 18-크라운-6 등) 가 사용될 수 있다.
염기의 예는 알칼리 금속 알코올레이트, 예컨대, 나트륨 에틸레이트, 나트륨 메틸레이트, 또는 칼륨 tert-부톡시드; 유기염기, 예컨대, 피리딘, 피콜린, 루티딘, 퀴놀린, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 4-디메틸아미노피리딘, 또는 N,N-디메틸아닐린; 무기염기, 예컨대, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산수소나트륨, 또는 탄산수소칼륨; 금속 수소화물, 예컨대, 수소화리튬, 수소화나트륨, 또는 수소화칼륨; 및 유기 리튬 시약, 예컨대, 부틸 리튬, 또는 리튬 디이소프로필아미드를 포함한다.
사용되는 염기의 양은 반응에 불리한 영향을 미치지 않는한 특별히 제한되지 않는다. 과량의 염기가 또한 용매로서 사용될 수 있다.
화합물 (IV) 가 아민인 경우, 과량의 화합물 (IV) 가 또한 염기 및 용매 모두로서 사용될 수 있다.
반응 온도는 통상적으로는 -50 내지 200 ℃, 바람직하게는 실온 내지 150 ℃ 이다. 반응 시간은 통상적으로 0.1 내지 96 시간, 바람직하게는 0.1 내지 72 시간, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 24 시간이다.
화합물 (IV) 가 저비등점 화합물, 예컨대, 암모니아, 메틸아민 또는 에틸아민이거나 반응이 서서히 진행되는 경우, 반응을 또한 약 40 내지 150 ℃ 로 가열하고, 내압 밀폐 용기에서 가압할 수 있다 (예를 들어, 1.1 내지 100 대기압).
화합물 (II) 는 공지된 화합물을 포함하고, 공지된 방법 또는 그와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
예를 들어, 화합물 (II) 를 하기의 참조 제조 방법 1 에 따라 화합물 (V) 과 화합물 (VI) 및 메틸 클로로카르보네이트를 반응시켜 제조할 수 있다.
문헌예: Tetrahedron 42, 3697 (1986)
참조 제조 방법 1
Figure 112009030583530-PCT00009
(식 중, Z 는 할로겐 원자, 예컨대, 염소, 브롬 또는 요오드를 나타내고, 다른 기호는 상기 정의된 것과 같음).
상기 반응에서, 첫 번째로 화합물 (V) 를 화합물 (VI) 과 반응시킨다. 용매는 통상적으로 사용된다. 용매의 예는 지방족 탄화수소, 예컨대, 펜탄, 헥산, 헵탄 또는 석유에테르; 방향족 탄화수소, 예컨대, 벤젠, 톨루엔, 또는 자일렌; 에테르, 예컨대, 디에틸 에테르, 메틸 tert-부틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 테트라히드로푸란, 또는 디옥산, 및 그들의 두 종류 이상의 화합물을 포함한다.
화합물 (VI) 은 통상적으로 화합물 (V) 에 대해 1 내지 5 당량, 바람직하게는 2 내지 2.5 당량의 양으로 사용된다.
상기 단계에서, 반응 온도는 통상적으로 40 내지 100 ℃, 바람직하게는 50 내지 70 ℃ 이다.
반응 시간은 통상적으로 0.2 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 시간이다.
그 다음, 메틸 클로로카르보네이트를 반응계에 첨가한다. 메틸 클로로카르보네이트는 통상적으로 화합물 (V) 에 대해 1 내지 5 당량, 바람직하게는 1 내지 2 당량의 양으로 사용된다. 상기 단계에서, 0 내지 20 ℃ 의 온도로 냉각한 후 메틸 클로로카르보네이트를 첨가한 다음 가열하는 것이 바람직하다. 가열시 반응 온도는 통상적으로 40 내지 200 ℃, 바람직하게는 50 내지 70 ℃ 이다. 총 반응시간은 통상적으로 0.2 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 10 시간, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 3 시간이다.
화합물 (II) 는 또한 하기의 참조 제조 방법 2 에 따라 화합물 (VII) 을 염화 트리클로로아세틸과 반응시켜 화합물 (VIII) 을 산출하고, 화합물 (VIII) 을 암모니아 또는 약한 산성 물질을 갖는 암모니아의 염과 반응시켜 제조할 수 있다.
문헌예: Chem. Pharm. Bull., 26, 1633 (1978)
참조 제조 방법 2
Figure 112009030583530-PCT00010
(식 중, 기호는 상기 정의된 것과 같음).
첫 번째 반응에서, 염기의 존재 하에 염화 트리클로로아세틸을 화합물 (VII) 과 반응시킨다. 반응은 용매의 부재하에 수행될 수 있고, 통상적으로는 용매의 존재 하에 수행된다. 용매의 예는 제조예 2 에 기재된 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 에스테르, 케톤, 에테르, 니트릴, 산 아미드, 시클릭 아미드, 인산 아미드, 시클릭 우레아, 설폭시드, 설폰, 할로겐화 탄화수소, 및 그의 혼합물을 포함한다. 염기의 예는 제조예 2 에 기재된 염기를 포함한다. 상기 염기 중, 유기 염기 또는 무기 염기가 바람직하고, 트리에틸아민이 통상적으로 사용된다.
반응 온도는 통상적으로 -50 내지 100 ℃, 바람직하게는 0 내지 20 ℃ 이다. 반응 시간은 통상적으로는 약 0.1 내지 96 시간, 바람직하게는 0.2 내지 5 시간, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 3 시간이다.
두 번째 반응에서, 첫 번째 반응에서 제조된 화합물 (VIII) 을 암모니아 또는 계에서 암모니아를 생성하는 화합물과 반응시킨다. 상기 화합물의 예는 암모니아의 약한 산성 물질을 갖는 염, 예컨대, 암모늄 카르보네이트, 암모늄 포르메이트, 또는 암모늄 아세테이트를 포함한다. 반응에서, 제조예 2 에 기재된 용매가 통상적으로 사용된다. 용매의 바람직한 예는 산 아미드, 시클릭 아미드, 인산 아미드, 시클릭 우레아, 설폭시드, 및 설폰을 포함한다.
반응 온도는 통상적으로 20 내지 200 ℃, 바람직하게는 50 내지 120 ℃ 이다.
반응 시간은 통상적으로 0.2 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 10 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 시간이다.
화합물 (III) 은 공지된 화합물을 포함하고, 공지된 방법 또는 그와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
예를 들어, Y 가 염소 원자인 화합물 (III) 은 화합물 (I) 에 포함된 화합물 (Ia) 이고, 상기 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.
화합물 (IV), 화합물 (V), 화합물 (VI) 및 화합물 (VII) 은 통상적으로 공지된 화합물이고, 시판되거나 알려진 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 특히, 화합물 (VI) 은 그리나드 시약으로 불리는 화합물이다. 화합물 (VI) 은 시판 제품일 수 있거나 공지된 제조 방법에 의해 제조한 다음, 단리 및 정제없이 사용할 수 있다.
상기 기재된 제조 방법 1, 2 및 참조 제조 방법 1, 2 에 의해 제조된 화합물은 공지된 수단, 예를 들어, 농축, 감압 하 농축, 추출, 용해, 결정화, 재결정화, 또는 크로마토그래피에 의해 단리 및 정제될 수 있다.
화학식 (XI) 에 의해 나타나는 화합물 (이하에서, 때로는, 화합물 (XI) 로 언급됨) 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염은 또한 식물 성장 조절제의 유효 성분으로서 사용될 수 있다. 2-위치에서 치환된 아미노기를 갖는 특정 퀴나졸린 화합물이 공지된다 (국제공개 WO 2005/042501).
본 발명의 화학식 (XI) 에 의해 나타나는 화합물 (이하에서, 화합물 (XI) 로 언급될 수 있음) 중 R11 에 의해 나타나는 "C1-6 알킬기" 의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 3-메틸부틸, 및 헥실을 포함한다. "C3-6 알케닐기" 의 예는 알릴, 2-부테닐, 3-부테닐, 및 3-메틸-2-부테닐을 포함한다. "C3-6 알키닐기" 의 예는 프로파르길, 2-부티닐, 및 3-펜티닐을 포함한다. "C4-6 알킬기" 의 예는 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 3-메틸부틸, 및 헥실을 포함한다. "C1-3 알콕시카르보닐메틸기" 의 예는 메톡시카르보닐메틸, 에톡시카르보닐메틸, 프로필옥시카르보닐메틸, 및 이소프로필옥시카르보닐메틸을 포함한다. "C1-3 알콕시 C1-3 알킬기" 의 예는 2-메톡시에틸, 2-메톡시프로필, 3-메톡시프로필, 2-에톡시에틸, 및 3-에톡시프로필을 포함한다.
상기 기재된 "C1-6 알킬기", "C3-6 알케닐기", "C3-6 알키닐기" 및 "C4-6 알킬기" 는 치환가능한 위치에서, 히드록실기, C1-3 알콕시기, C1-3 알콕시카르보닐기, 시아노기, 2-푸릴기 및 2-테트라히드로푸릴기로부터 선택되는 하나 이상의 치환기, 바람직하게는 1 내지 3 개의 치환기를 가질 수 있다. 치환기의 수가 2 이상인 경우, 치환기는 동일하거나 상이할 수 있다.
치환기의 예로서 기재된 "C1-3 알콕시기" 의 예는 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 및 이소프로필옥시를 포함한다. "C1-3 알콕시카르보닐기" 의 예는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로필옥시카르보닐, 및 이소프로필옥시카르보닐을 포함한다.
화합물 (XI) 은 산부가염을 형성할 수 있다. 산부가염의 예는 무기산염, 예컨대, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 인산염, 황산염, 질산염 또는 과염소산염; 및 유기산염, 예컨대, 포름산염, 아세트산염, 타르타르산염, 말레산염, 시트르산염, 옥살산염, 숙신산염, 벤조산염, 피크산염, 메탄설폰산염, 또는 p-톨루엔설폰산염을 포함한다.
화합물 (XI) 이 산성기, 예컨대, 카르복실기, 페놀 히드록실기 또는 활성 메틸렌기를 갖는 경우, 형성될 수 있는 염의 예는 금속염, 예컨대, 알칼리 금속염 (리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염 (마그네슘염, 칼슘염, 바륨염 등); 암모늄염; 및 유기 염기를 갖는 부가염 (예를 들어, 메틸아민, 트리에틸아민, 피페라진, 피롤리딘, 피페리딘, 2-페닐에틸아민, 벤질아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피리딘, 콜리딘 등) 을 포함한다.
따라서, 화합물 (XI) 은 상기 기재된 것과 같은 농학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다.
화합물 (XI) 이 하나 이상의 비대칭 중심을 갖는 경우, 화합물은 두 개 이상의 입체이성질체 (예를 들어, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 등) 를 포함한다. 본 발명의 화합물은 모든 입체이성질체 및 두 개 이상의 입체이성질체의 화합물을 포함한다.
화합물 (XI) 이 이중 결합 등에 근거하는 기하학적 이성질현상을 갖는 경우, 화합물은 두 개 이상의 기하학적 이성질체 (예를 들어, E/Z 또는 트랜스/시스 이성질체, S-트랜스/S-시스 이성질체 등) 를 포함한다. 화합물 (XI) 은 모든 기하학적 이성질체 및 두 개 이상의 기하학적 이성질체의 혼합물을 포함한다.
m 이 1 내지 3 의 정수이고, n 이 0 인 화학식 (XI) 의 화합물은 퀴나졸린 골격의 6-위치가 비치환된 화합물, 즉, 화학식 (XI-1) 의 화합물이다:
Figure 112009030583530-PCT00011
(식 중, Ph 는 페닐기를 나타내고, R11 은 수소 원자, 포르밀기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내고, 상기 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 히드록실기, C1-3 알콕시기, C1-3 알콕시카르보닐기, 시아노기, 2-푸릴기 및 2-테트라히드로푸릴기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고,
m' 은 1 내지 3 의 정수를 나타내고,
X1 은 염소 원자, 브롬 원자, 트리플루오로메틸기, 시아노기 또는 니트로기를 나타내고,
m' 이 2 이상인 경우, 각 X1 은 서로 동일하거나 상이하고,
단, m' 이 1 인 경우, X1 은 염소 원자이고, R11 은 메틸기를 나타내고, X1 은 8-염소 원자임).
n 이 1 인 화학식 (XI) 의 화합물은 퀴나졸린 골격의 6-위치가 X2 로 치환된 화합물, 즉, 화학식 (XI-2) 의 화합물이다:
Figure 112009030583530-PCT00012
(식 중, Ph 는 페닐기를 나타내고, R11 은 수소 원자, 포르밀기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내고, 상기 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 히드록실기, C1-3 알콕시기, C1-3 알콕시카르보닐기, 시아노기, 2-푸릴기 및 2-테트라히드로푸릴기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고,
m 은 0 내지 3 의 정수를 나타내고,
X1 및 X2 는 동일하거나 상이할 수 있고, 염소 원자, 브롬 원자, 트리플루오로메틸기, 시아노기 또는 니트로기를 나타내고,
m 이 2 이상인 경우, 각 X1 은 서로 동일하거나 상이하고,
단, 하기의 조건 (1) 내지 (3) 중 어느 하나를 만족하는 경우, m 은 1 내지 3 의 정수를 나타냄:
(1) X2 는 염소 원자이고, R11 은 수소 원자, 메틸기, 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기, 2,2-디메톡시에틸기 및 시아노메틸기로부터 선택된 기임,
(2) X2 는 브롬 원자이고, R11 은 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기 및 2-메톡시에틸기로부터 선택된 기임, 및
(3) X2 는 니트로기이고, R11 은 3-히드록시프로필기임).
화합물 (XI) 의 바람직한 예는 하기의 화합물을 포함한다.
(1) R11 이 수소 원자, 포르밀기, 메틸기, 에틸기, 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기, 2-메톡시에틸기, 푸르푸릴기, 메톡시카르보닐메틸기 또는 에톡시카르보닐메틸기이고, m 이 0 이고, n 이 1 이고, X2 가 염소 원자 또는 니트로기인, 화학식 (XI) 의 화합물.
(2) R11 이 수소 원자, 포르밀기, 메틸기, 에틸기, 2-히드록시에틸기, 2-메톡시에틸기, 푸르푸릴기, 메톡시카르보닐메틸기 또는 에톡시카르보닐메틸기이고, m 이 1 이고, n 이 1 이고, X1 이 8-염소 원자이고, X2 가 염소 원자 또는 니트로기인, 화학식 (XI) 의 화합물.
(3) m 이 1 내지 3 의 정수이고, n 이 0 인, 화학식 (XI) 의 화합물.
(4) R11 이 포르밀기, C4-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기이거나, 여기서, 상기 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기가 히드록실기(들) 또는 C1-3 알콕시기(들)로 임의로 치환되고, R11 이 C1-3 알콕시카르보닐메틸기, C1-3 알콕시 C1-3 알킬기 또는 푸르푸릴기이고, m 이 0 이고, n 이 1 이고, X2 가 염소 원자인, 화학식 (XI) 의 화합물.
(5) n 이 1 인, 화학식 (XI) 의 화합물.
(6) m 이 1 내지 3 이고, n 이 1 인, 화학식 (XI) 의 화합물.
(7) R11 이 C1-3 알콕시카르보닐메틸기 또는 푸르푸릴기인, 화학식 (XI) 의 화합물.
(8) n 이 1 이고, X2 가 트리플루오로메틸기 또는 시아노기인, 화학식 (XI) 의 화합물.
화합물 (XI) 은 신규한 물질이고, 하기 제조 방법 11 에 따라 화합물 (XII)와 화합물 (XIII)을 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
제조 방법 11
Figure 112009030583530-PCT00013
[식중
Y 는 이탈기 (예를 들어, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드와 같은 할로겐 원자; 메탄설포닐옥시기, 벤젠설포닐옥시기 또는 p-톨루엔설포닐옥시기와 같은 알칸- 또는 아렌-설포닐옥시기; 또는 메탄설포닐, 벤젠설포닐 또는 페닐메탄설포닐과 같은 알칸-, 아렌- 또는 아렌알칸-설포닐기)를 나타내고, 다른 기호는 상기 정의된 바와 같음].
상기 반응은 용매를 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다. 상기 용매의 예는 펜탄, 헥산, 헵탄, 석유 에테르, 또는 시클로헥산과 같은 지방족 탄화수소; 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 에틸 포메이트, 또는 에틸 프로피오네이트와 같은 에스테르; 아세톤, 또는 메틸 에틸 케톤과 같은 케톤; 디에틸 에테르, 메틸 tert-부틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 테트라히드로푸란, 또는 디옥산과 같은 에테르; 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올과 같은 알코올; 아세토니트릴, 또는 프로피오니트릴과 같은 니트릴; 디메틸포름아미드, 또는 디메틸아세트아미드와 같은 산 아미드; 1-메틸-2-피롤리돈과 같은 시클릭 아미드; 헥사메틸인산아미드와 같은 인산 아미드; 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논과 같은 시클릭 우레아; 디메틸 설폭시드와 같은 설폭시드; 설폴란과 같은 설폰; 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 또는 사염화탄소와 같은 할로겐화 탄화수소; 피리딘, 피콜린, 루티딘, 또는 퀴놀린과 같은 방향족 아민; 이들의 혼합물, 물, 및 용매와 물의 혼합물을 포함한다.
용매와 물의 혼합물이 사용되고, 반응이 균질계가 아닌 경우에, 상이동 촉매(예를 들어, 벤질트리에틸암모늄 클로라이드, 또는 벤질트리에틸암모늄 브로마이드와 같은 4차 암모늄염, 18-크라운-6 과 같은 크라운 에테르, 등)가 사용될 수 있다.
염기의 예는 나트륨 에틸레이트, 나트륨 메틸레이트, 또는 칼륨 tert-부톡시드와 같은 알칼리 금속 알코올레이트; 피리딘, 피콜린, 루티딘, 퀴놀린, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 4-디메틸아미노피리딘, 또는 N,N-디메틸아닐린과 같은 유기 염기; 탄산칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산수소나트륨, 또는 탄산수소칼륨과 같은 무기 염기; 수소화리튬, 수소화나트륨, 또는 수소화칼륨과 같은 금속 수소화물; 및 부틸 리튬, 또는 리튬 디이소프로필아미드와 같은 유기 리튬 시약을 포함한다.
사용되는 염기의 양은 반응에 역효과를 나타내지 않는 한 특별히 제한되지 않는다. 과량의 염기는 용매로서 또한 사용될 수 있다.
화합물 (XIII) 이 아민일 경우, 과량의 화합물 (XIII)은 또한 염기 및 용매로서 사용될 수 있다.
반응 온도는 보통 -50 내지 200 ℃ 이고, 바람직하게는 실온 내지 150 ℃ 이다. 반응 시간은 보통 0.1 내지 96 시간이고, 바람직하게는 0.1 내지 72 시간, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 24 시간이다.
화합물 (XIII) 이 암모니아, 메틸아민 또는 에틸아민과 같은 낮은 비등점-화합물이거나, 반응이 천천히 진행될 때, 반응은 또한 약 40 내지 150 ℃ 의 온도로 가열되고, 내압 밀폐 용기에서 (예를 들어, 대기압 1.1 내지 100 로) 가압될 수 있다.
화합물 (XII) 은 공지된 화합물을 포함하고, 공지된 방법 또는 그와 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, Y 가 염소 원자인 화합물 (XIIa) 는 하기 참조 제조 방법 11 에 따라 화합물 (XIV)와 옥시염화 인을 반응시켜 제조될 수 있다.
문헌예: JP-A 62-145073
참조 제조 방법 11
Figure 112009030583530-PCT00014
[식중 기호는 상기 정의된 바와 같다].
상기 반응은 반응에 역효과를 주지 않는 용매에서 수행될 수 있고, 보통 과량의 옥시염화 인 (화합물 (XIV)에 대해 5 당량 내지 30 당량)을 사용하여 용매의 부재하에서 수행된다.
반응 온도는 보통 80 내지 200 ℃ 이고, 바람직하게는 90 ℃ 내지 환류 온도 (105 ℃) 이다.
반응 시간은 보통 0.1 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 5 시간, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 시간이다. 환류시키면서도 반응이 느리게 진행되는 경우, 반응은 또한 약 200 ℃ 의 온도로 가열되고, 내압 밀폐 용기에서 (예를 들어, 대기압 1.1 내지 100) 가압될 수 있다.
화합물 (XIV) 은 공지된 화합물을 포함하고, 공지된 방법 또는 그와 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 화합물 (XIV) 은 하기 참조 제조 방법 12 에 따라 화합물 (XV)과 화합물 (XVI) 및 메틸 클로로카르보네이트를 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
문헌예: Tetrahedron 42, 3697 (1986)
참조 제조 방법 12
Figure 112009030583530-PCT00015
[식중 Z 는 염소, 브롬, 또는 요오드와 같은 할로겐 원자를 나타내고, 다른 기호는 상기 정의된 바와 같음].
상기 반응에서, 우선 화합물 (XV) 은 화합물 (XVI)과 반응한다. 보통 용매는 사용되고, 이의 예는 펜탄, 헥산, 헵탄, 또는 석유 에테르와 같은 지방족 탄화수소; 벤젠, 톨루엔, 또는 자일렌과 같은 방향족 탄화수소; 디에틸 에테르, 메틸 tert-부틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 테트라히드로푸란, 또는 디옥산와 같은 에테르, 및 이들 중 둘 이상의 혼합물을 포함한다.
화합물 (XVI) 은 보통 화합물 (XV) 에 대해 1 내지 5 당량, 바람직하게는 2 내지 2.5 당량의 양으로 사용된다.
반응 온도는 보통 40 내지 100 ℃이고, 바람직하게는 50 내지 70 ℃ 이다.
반응 시간은 보통 0.2 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 시간이다.
다음으로, 메틸 클로로카르보네이트를 반응계에 첨가한다. 메틸 클로로카르보네이트는 보통 화합물 (XV)에 대해 1 내지 5 당량, 바람직하게는 1 내지 2 당량의 양으로 사용된다. 이 단계에서, 메틸 클로로카르보네이트가 0 내지 20 ℃ 의 온도까지 냉각된 후 첨가되고 그 후 가열되는 것이 바람직하다. 가열시 반응 온도는 보통 40 내지 200 ℃이고, 바람직하게는 50 내지 70 ℃ 이다. 총 반응 시간은 보통 0.2 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 10 시간, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 3 시간이다.
화합물 (XIV) 은 또한 하기 참조 제조 방법 13에 따라 화합물 (XVII)과 트리클로로아세틸 클로라이드를 반응시켜 화합물 (XVIII)을 수득하고, 화합물 (XVIII)와 암모니아 또는 약산성 물질의 암모니아를 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
문헌예: Chem. Pharm. Bull., 26, 1633 (1978)
참조 제조 방법 13
Figure 112009030583530-PCT00016
[식중 기호는 상기 정의된 바와 같음].
첫번째 반응에서, 트리클로로아세틸 클로라이드는 염기의 존재하에서 화합물 (XVII)와 반응한다. 상기 반응은 용매의 부재하에서 수행될 수 있고, 보통 용매의 존재하에서 수행된다. 용매의 예는 제조예 11 에 기술된 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 에스테르, 케톤, 에테르, 니트릴, 산 아미드, 시클릭 아미드, 인산 아미드, 시클릭 우레아, 설폭시드, 설폰, 할로겐화 탄화수소 및 이들의 혼합물을 포함한다.
염기의 예는 제조예 11에 기재된 염기를 포함한다. 상기 염기들 중, 유기 염기 또는 무기 염기가 바람직하고, 트리에틸아민이 일반적으로 사용된다.
반응 온도는 보통 -50 내지 100 ℃이고, 바람직하게는 0 내지 20 ℃ 이다.
반응 시간은 보통 약 0.1 내지 96 시간, 바람직하게는 0.2 내지 5 시간, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 3 시간이다.
두 번째 반응에서, 첫 번째 반응에서 제조된 화합물 (XVIII)은 암모니아 또는 상기 계에서 암모니아를 발생하는 화합물과 반응된다. 화합물의 예는 암모늄 카르보네이트, 암모늄 포르메이트, 또는 암모늄 아세테이트와 같은 약산성 물질의 암모니아를 갖는 염을 포함한다. 반응에서, 제조예 11 에 기술된 바와 같은 용매가 보통 사용된다. 용매의 바람직한 예는 산 아미드, 시클릭 아미드, 인산 아미드, 시클릭 우레아, 설폭시드, 및 설폰을 포함한다.
반응 온도는 보통 20 내지 200 ℃, 바람직하게는 50 내지 120 ℃ 이다.
반응 시간은 보통 0.2 내지 96 시간, 바람직하게는 0.5 내지 10 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 시간이다.
화합물 (XIII), 화합물 (XV), 화합물 (XVI) 및 화합물 (XVII)은 보통 공지된 화합물이고, 시판되거나 공지된 제조 방법으로 제조될 수 있다.
특히, 화합물 (XVI)은 그리나드 시약으로 불리는 화합물이다. 화합물 (XVI)은 시판 제품일 수 있고, 또는 공지된 제조 방법에 의해 제조된 후 분리 및 정제 없이 사용될 수 있다.
제조 방법 11 및 참조 제조 방법 11, 12 및 13 에 의해 제조된 화합물은 공지된 수단, 예를 들어, 농축, 감압 하 농축, 추출, 용해, 결정화, 재결정화, 또는 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
본 발명에서 식물의 성장은 보통 유효량의 식물 성장 조절제를 식물 또는 그 식물의 서식 장소에 적용함으로써 조절된다.
본 발명의 식물 성장 조절제가 농업 및 임업에 사용되는 경우, 적용량은 보통 0.01 내지 1,000 g/1000m2 이다. 본 발명의 식물 성장 조절제가 유화성 농축액, 수화성 분말, 유동성 제제, 또는 미소캡슐제의 형태인 경우, 보통 유효 성분 농도가 0.001 내지 10,000 ppm 이 되도록 물로 희석한 후 분무된다. 본 발명의 식물 성장 조절제가 분말 또는 미립 형태인 경우, 보통 그대로 사용된다.
경작지 토양의 식물 뿌리의 성장을 촉진시키는 목적으로, 토양은 본 발명의 이와 같이 제제화된 식물 성장 조절제와 직접, 또는 식물 성장 조절제의 희석으로 처리될 수 있다. 또한, 식물 성장 조절제는 시트 또는 끈모양의 형태의 수지 제제로 제제화될 수 있다. 수지 제제는 식물 주변을 감싸고, 식물의 주변로 퍼지고, 식물 피트에서 토양 표면에 놓는 등으로 적용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 경엽 처리 또는 눈의 처리에 의해 사용될 수 있다. 또한, 작물의 묘목을 심어주기 전의 모판이나 모내기의 때에 식혈(植穴)이나 주원(株元)에 처리하는 것에 따라 사용될 수 있다. 표적 식물은 1 회 또는 다회 식물 성장 조절제로 처리된다.
본 발명의 식물 성장 조절제가 식물체의 경엽 처리 또는 토양 처리에 사용되는 경우, 적용량은 제제 형태, 시기, 적용하는 방법 및 장소 및 표적 식물에 따라 변화할 수 있고, 헥타르당 보통 0.1 내지 10,000 이다. 식물 성장 조절제가 물로 희석되어 사용되는 경우, 식물 성장 조절제의 농도는 제제 형태, 시기, 적용하는 방법 및 장소 및 표적 식물에 따라 변화할 수 있고, 보통 0.001 내지 10,000 ppm, 바람직하게는 0.01 내지 1,000 ppm 이다.
본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 이식 전, 식물의 처리에 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제가 이식 전, 식물에 직접적으로 흡수되는 경우, 식물의 뿌리 부분 또는 전체가 농도가 0.001 ppm 내지 10,000 ppm 인 식물 성장 조절제 용액 또는 현탁액에 침지될 수 있다.
표적 식물의 종자는 본 발명의 식물 성장 조절제의 제제로 직접 처리될 수 있다. 이러한 처리 방법의 예는 유효 성분의 농도가 1 내지 10,000 ppm 이 될 수 있도록 제조된 본 발명의 식물 성장 조절제에 식물의 종자를 침지하는 것을 포함하는 방법, 유효 성분의 농도가 1 내지 10,000 ppm 이 될 수 있도록 제조된 본 발명의 식물 성장 조절제로 식물의 종자를 코팅하거나 분무하는 것을 포함하는 방법, 및 본 발명의 식물 성장 조절제의 분말로 식물의 종자를 코팅하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 식물 성장 조절제는 수경재배를 위해 수경 배지와 혼합될 수 있거나, 조직배양을 위한 배지 성분 중 하나로서 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제가 수경재배에 사용되는 경우, 식물 성장 조절제는 엔시(Enshi) 와 같은 수경 배지에 0.001 ppm 내지 10,000 ppm 의 농도로 용해되거나 현탁될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제가 조직배양 또는 세포배양에 사용되는 경우, 식물 성장 조절제는 통상적으로 사용된 식물 조직배지에서 MS 배지의 농도가 0.001 ppm 내지 10,000 ppm 인 것과 같이 용해되거나 현탁될 수 있다. 이 경우에서, 탄소원과 같은 당류 및 다양한 식물 호르몬은 통상적으로 배지에 첨가될 수 있다.
본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 살균제, 살충제, 살비제, 살선충제, 제초제, 식물 성장 조절제 및/또는 비료와 병용될 수 있다.
이러한 적용량 및 적용농도는 제제 형태, 시기, 적용하는 장소 및 방법, 식물의 종류 및 기대되는 효과에 따라 변화할 수 있고, 따라서 상기 범위에 제한 없이 증가하거나 감소할 수 있다.
상기 기술된 바와 같이 식물 성장 조절 방법에 있어서, 식물 성장 조절제가 사용될 수 있다.
군 A 로부터 선택된 사이토카이닌 수용체를 사용하는 첫 번째 단계 및 두 번째 단계를 포함하는, 식물 뿌리의 성장을 촉진하는 시험 물질의 능력을 시험하는 방법에 의해 평가된 식물 뿌리의 성장을 촉진하는 능력이 있는 물질을 지정하고 나서, 식물 뿌리의 성장을 촉진하는 능력이 있는 지정된 물질을 식물 뿌리의 성장을 촉진하는 식물과 접촉시키는 것이 또한 가능하다. 식물 뿌리의 성장을 촉진하는 능력이 있는 지정된 물질을 식물과 접촉시키는 방법은 전술한 바와 같은 제제 방법 및 적용 방법을 포함한다.
본 발명의 식물 성장 조절제는 벼의 직파재배시 뿌리 성장의 촉진에 의한 묘목 정착 (seedling establishment)의 개선 및 토양에서의 발근율의 개선의 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 묘포 상자에서 벼 묘목의 재배시 뿌리의 성장의 촉진의 목적을 위해 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 골프장의 녹색잔디의 뿌리 부종과 열- 및 건조-저항성에 대한 개선의 목적을 위해 또한 사용될 수 있다. 콩, 옥수수 및 밀과 같은 농작물의 경우에 있어서, 본 발명의 식물 성장 조절제는 뿌리 부종의 개선, 초기 단계에서 묘목 정착에 의한 생산성의 개선 또는 제초제의 적용량의 감소의 목적을 위해 사용될 수 있다. 토마토, 후추 등의 재배의 경우에 있어서, 본 발명의 식물 성장 조절제는 이식시 토양에서 발근율의 개선을 목적을 위해 사용될 수 있다. 채소 묘목의 생산에 있어서, 본 발명의 식물 성장 조절제의 사용은 묘목 정착을 균일하게 하여 기계적 이식의 효율이 개선되는 것을 기대할 수 있다.
본 발명의 식물 성장 조절제는 식물의 정단 우성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 식물 성장 조절제는 담배, 장미 등의 겨드랑눈의 성장을 저해하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 과일 농작물, 꽃 식물 등의 꽃눈의 형성을 제어할 수 있고, 따라서 적화제(flower thinning agent)로서 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 꽃눈을 증가시킬 수 있어서, 과일 농작물의 수득이 향상되고, 꽃 식물의 품질이 개선될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 과일 농작물의 가지 성장을 저해하여 가지 수를 감소시킬 수 있고, 과일 농작물의 가지 성장을 촉진하여 가지 수를 증가시킬 수 있어서, 나무 몸체의 성장을 제어하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 식물 성장 조절제는 캘러스에 탈분화 또는 캘러스로부터 재분화와 같은 조직배양 기술을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 식물 성장 조절제는 식물 조직으로부터 캘러스 형성을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 콩 등의 부정 배아(adventive embryo) 로부터 재분화 효율을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 식물 성장 조절제는 식물 노화를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 식물 성장 조절제는 카네이션과 같은 꽃 식물의 꽂이꽃의 노화를 저해하고 보존을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 과일의 숙성을 저해하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 조절제는 또한 논벼(paddy rice)의 묘목 잎의 노화를 예방할 수 있다. 면과 같은 식물은 잎의 숙성을 촉진하기 위해 수확 전에 본 발명의 식물 성장 조절제로 처리될 수 있다.
상기 군 B 에서 보여준 아미노산 서열로 이루어진 식물-유래 사이토카이닌 수용체는 연구 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같이 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 능력의 시험, 또는 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 능력을 갖는 화학 물질의 조사와 같은 연구를 수행하기 위해 연구 도구로서 사용될 수 있다. 사이토카이닌 수용체는 사이토카이닌 수용체에 작용하는 약물의 작용 메커니즘을 분석하기 위한 연구에서 연구 도구로서 또한 사용될 수 있다.
군 B 에서 보여준 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이에 상보성인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 군 B 에서 보여준 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 부분적 염기 서열과 상보성인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 부분적 염기 서열, 및 서열 번호: 3 또는 4 의 염기 서열을 포함하는 폴리펩티드는 또한 연구 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 중 일부는 전술한 바와 같이 사이토카이닌 수용체의 제조 방법으로 사용되기 위해 폴리뉴클레오티드로서 작용할 수 있다. 또한 이들 중 일부는 전술한 바와 같이, PCR 을 사용하는 폴리뉴클레오티드 군 B 에서 보여준 폴리뉴클레오티드를 수득하거나, 교배를 사용하는 폴리뉴클레오티드 군 B 에서 보여준 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위한 중요한 연구 도구로서 사용될 수 있다.
식물 성장 조절제의 스크리닝이 수행될 때, 그들은 스크리닝 실험에서 시험 도구로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 전술한 바와 같이, 이는 식물의 뿌리 성장을 촉진하는 능력을 시험하고, 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 능력이 있는 화학 물질을 탐색하는 실험에서 시험 도구로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달전달을 저해하는 시험 물질의 활성 (또는 세포내 신호전달의 유무 또는 이의 양)에 대한 데이터 정보의 입력, 저장 및 관리를 위한 수단 (이후, 종종 수단 a 로서 언급함), 원하는 조건에 근거한 데이터 정보의 조사 및 탐색하기 위한 수단 (이후, 종종 수단 b 로서 언급함), 및 조사되고 찾은 데이터의 표시 및 출력을 위한 수단 (이후, 종종 수단 c 로서 언급함) 을 포함하는 시스템 (이후, 종종 본 발명의 시스템으로서 언급함)을 포함한다.
우선, 상기 수단 a 를 기술한다. 전술한 바와 같이, 수단 a 는 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하기 위한 시험 물질의 활성의 데이터 정보를 입력하고 나서, 입력한 정보를 저장하고 관리하는 수단이다. 그러한 정보는 입력 수단 1 에 의해 입력되고, 보통 기억 수단 2 에서 기억된다. 입력 수단은 키보드 또는 마우스와 같이, 정보를 입력할 수 있는 수단을 포함한다. 정보의 입력, 저장 및 관리가 완료된 경우, 정보는 후속 수단 b 로 진행한다. 정보의 저장 및 관리시, 많은 데이터는 컴퓨터와 같은 하드웨어 및 OS 및 데이터베이스와 같은 소프트웨어를 사용한 데이터 구조를 갖는 정보를 입력하고, 적절한 저장 장치, 예를 들어 플렉시블 디스크, 광자기 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, 또는 하드 디스크와 같은 컴퓨터-판독가능 기록 매체에 정보를 저장함으로써 효율적으로 저장되고 관리될 수 있다.
수단 b 를 기술한다. 전술한 바와 같이, 수단 b 는 원하는 결과를 얻기 위한 조건에 기초한 수단 a 에 의해 저장되고 관리된 데이터 정보를 조사하고 탐색하는 수단이다. 조사 및 연구에 대한 조건이 입력 수단 1 에 의해 입력되고, 상기 조건에 상응하는 정보가 보통 저장 수단 2 에 저장된 정보로부터 선택되고, 상기 정보는 후속 수단 c 로 진행한다. 선택된 결과는 보통 저장 수단 2 에 저장되고, 표시 및 출력 수단 3 에 의해 표시될 수 있다.
수단 c 를 기술한다. 전술한 바와 같이, 수단 c 는 조사되고 찾은 결과를 표시하고 출력하는 수단이다. 표시 및 출력 수단 3 은 디스플레이 및 프린터를 포함하고, 결과는 컴퓨터의 디스플레이 장치에 표시되고, 종이에 인쇄되어 출력된다.
도 1 은 실시예 8 에서 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질을 사용하는 농도-응답성 시험의 결과를 나타낸다. 이 도면에서, 데이타 선은 농도-응답성 성장 저해 곡선을 나타내며, 여기서 X 축은 시험할 화학 물질의 농도를 나타내고 Y 축은 상대 성장률을 나타낸다. 좌측 도면들 (1 개의 좌측 종열로된 세 개의 하위도면) 은 형질전환된 세포 TM182-CRE1 을 사용하는 시험계에서의 결과를 나타낸다. 우측 도면들 (1 개의 우측 종열로된 세 개의 하위도면) 은 형질전환된 세포 TM182-p415CYC1 을 사용하는 시험계에서의 결과를 나타낸다. 상단 도면, 중간 도면, 및 하단 도면은 각각 화학 물질 Ic7-1, 화학 물질 Ic3-1, 및 화학 물질 Ic3-3 을 사용하는 시험계에서의 결과를 나타낸다.
도 2 는 실시예 10 에서 양상추를 사용하는 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 평가 결과를 나타낸다. 이 도면에서, 데이타 선은 농도-응답성 성장 촉진 곡선을 나타내고, 여기서 X 축은 시험할 화학 물질 (화학 물질 Ic3-1) 의 농도를 나타내고, Y 축은 뿌리 성장률 (%) 을 나타낸다.
도 3 은 실시예 10 에서 양상추를 사용하는 사이토카이닌 신호전달-저해 물 질의 뿌리 성장-촉진 활성의 평가 결과를 나타낸다. 이 도면에서, 데이타 선은 농도-응답성 성장 촉진 곡선을 나타내고, 여기서 X 축은 시험할 화학 물질 (화학 물질 Ic7-1) 의 농도를 나타내고, Y 축은 뿌리 성장률 (%) 을 나타낸다.
도 4 는 실시예 11 에서 벼를 사용하는 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 평가 결과를 나타낸다. 이 도면에서, 데이타 선은 농도-응답성 성장 촉진 곡선을 나타내고, 여기서 X 축은 시험할 화학 물질 (화학 물질 Ic3-1) 의 농도를 나타내고, Y 축은 뿌리 성장률 (%) 을 나타낸다.
도 5 는 실시예 11 에서 벼를 사용하는 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 평가 결과를 나타낸다. 이 도면에서, 데이타 선은 농도-응답성 성장 촉진 곡선을 나타내고, 여기서 X 축은 시험할 화학 물질 (화학 물질 Ic7-1) 의 농도를 나타내고, Y 축은 뿌리 성장률 (%) 을 나타낸다.
도 6 은 실시예 12 에서 벼 종자 처리에 의한 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 평가 결과를 나타낸다. 이 도면에서, "UTC" 는 종자 처리에 오직 아세톤만 사용하는 대조 시험의 결과를 나타낸다. "IAA" 는 옥신 화합물 IAA 를 사용하는 시험의 결과를 나타낸다.
도 7 은 실시예 13 에서 식물 분화-촉진 활성을 평가하기 위한 A. 탈리아나의 배축을 사용하는 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 부정근 (adventitious root) 형성 활성의 측정 결과를 나타낸다. 이 도면에서, "대조 영역" 은 실시예 13 에 기재된 것과 같이 한천 배지를 사용하는 대조 시험에서의 결과를 나타낸다.
도 8 은 실시예 14 에서 벼를 사용하는 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 측정 결과를 나타낸다. 이 도면에서, "UTC" 는 토양 관주 처리에서 오직 아세톤만을 사용하는 대조 시험의 결과를 나타낸다.
도 9 는 실시예 14 에서 뿌리 길이를 측정하기 위해 이미지 분석 장치를 사용하여, 벼를 사용하는 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 분석 결과를 나타낸다. 이 도면에서 데이타 선에 관해, X 축은 시험할 화학 물질 (화학 물질 Ic3-3) 의 농도를 나타내고, Y 축은 뿌리 직경 각각의 뿌리 길이의 총 합 (총 뿌리 길이) 을 나타낸다. 이 도면에서, "UTC" 는 토양 관주 처리에서 오직 아세톤만을 사용하는 대조 시험의 결과를 나타낸다. 범례값 (L) 은 뿌리 직경 (mm) 을 나타낸다.
도 10 은 실시예 19 에서 시험 물질에 의해 사이토카이닌 수용체에 대한 사이토카이닌의 결합을 저해하는 시험의 결과를 나타낸다. 이 도면에서, "오직 DMSO" 는 시험 물질이 첨가되지 않고, 시험 물질의 DMSO 용액 대신 시험 물질에 대한 용매로서 사용되는 DMSO 만이 첨가되는 대조군을 나타낸다. "t-제아틴" 은 시험 물질로서 트랜스 제아틴의 첨가를 나타내고, "Ic3-4" 는 시험 물질로서 Ic3-4 의 첨가를 나타내고, "ABA" 는 시험 물질로서 아브시스산의 첨가를 나타낸다. 방사성 표지 2IP 의 농도는 10 nM 이고, 각 시험 물질의 농도는 10 μM이다.
도 11 은 실시예 21 에서 시험 물질로 처리된 종자가 직접 건답 (dry seeding) 에 의해 배양되는 시험계에서 사이토카이닌 신호전달-저해 물질의 벼 분얼-촉진 활성의 평가 결과를 나타낸다. 이 도면에서 "Ic3-3" 은 종자 처리용 시험 물질 Ic3-3 의 블랭크 슬러리 (Blank slurry) 용액을 사용하는 경우, 식물 당 분얼 수를 나타내고, "블랭크 슬러리 처리" 는 Ic3-3 용액 대신에 종자 처리용 블랭크 슬러리 용액을 사용하는 경우 식물 당 분얼 수를 나타낸다.
이후, 본 발명은 실시예에 의해 상세히 기술될 것이나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용된 화합물 (I) 은 합성예 및 참조 합성예에 의해 더욱 상세하게 기술될 것이나, 화합물 (I) 는 이러한 실시예에 한정되지 않는다.
합성예 및 참조 합성예에 있어서, "실온" 은 보통 10 내지 30 ℃ 의 온도를 의미한다. "1H NMR" 은 프로톤 자기 공명 분광을 의미한다. 내부표준으로써 테트라메틸실란을 사용하는 측정은 분광계 (400 MHz), JEOL Ltd. 사의 Model JNM-AL400 로 수행되었고, 화학적 이동(δ) 은 ppm 으로서 표현된다. "Mp" 는 용융점을 의미하고, 용융점 측정계, Model Mettler FP61 로 측정하였다.
하기 합성예, 참조 합성예 및 표 3 내지 7 에 사용된 약어는 하기 의미를 갖는다. CDCl3: 중수소화 클로로포름, DMSO-d6: 중수소화 디메틸 설폭시드, s: 단일항, d: 이중항, t: 삼중항, q: 사중항, dd: 이중 이중항, m: 다중항, br: 폭넓이(broad), J: 결합 상수, Me: 메틸, Et: 에틸, Pr: 프로필, i-Pr: 이소프로필, t-Bu: 3차 부틸, Ph: 페닐, Ac: 아세틸, THF: 테트라히드로푸란, DMF: N,N-디메틸포름아미드, DMSO: 디메틸 설폭시드 및 MTBE: 메틸 3차 부틸 에테르
합성예 1 (2,8-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-11)의 제조)
8-클로로-4-페닐-2(1H)-퀴나졸리논 (화합물 No. II-11) 1.24 g 에 옥시염화 인 6.65 g 을 첨가하고, 95 ℃ 에서 에서 1 시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 용액을 얼음 물 200 ml 에 붓고, 나트륨 바이카르보네이트을 첨가하고, pH 9로 조절하였다. 그 후, 침전된 결정을 여과하여 수집하였다. 수집한 생성물을 에탄올로부터 재결정하여 표제 화합물 1.07 g 을 수득하였다. Mp.154.4. ℃.
1H NMR (CDCl3): 7.52-7.65 (4H, m), 7.76-7.80 (2H, m), 8.02-8.08 (2H, m).
합성예 2 (2-아미노-6,8-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic12-4)의 제조)
내압 반응용기에서 2,6,8-트리클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-12) 300 mg, 28% 암모니아 수용액 30 g 및 아세토니트릴 6 ml 의 혼합물을 105 ℃ 에서 1.5 시간 동안 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 냉각시키고, 물 100 ml 에 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트 60 ml 로 추출하고, 생성된 추출물을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (클로로포름)로 정제하여 표제 화합물 230 mg 을 수득하였다. Mp.212.7 ℃.
1H NMR (CDCl3): 5.56 (2H, br. s), 7.54-7.60 (3H, m), 7.63-7.68 (2H, m), 7.74 (1H, d, J = 2.3 Hz), 7.79 (1H, d, J = 2.3 Hz).
합성예 3 (6-클로로-2-푸르푸릴아미노-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-16) 의 제조)
2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-3) 275 mg 및 푸르푸릴아민 486 mg 의 혼합물을 85 ℃ 에서 40 분 동안 교반하고, 물 50 ml 에 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 생성된 추출물을 물로 세척하고 나서, 농축하였다. 생성된 잔여물을 에탄올로부터 재결정하여 표제 화합물 280 mg 을 수득하였다. Mp.142.0 ℃.
1H NMR (CDCl3): 4.77 (2H, d, J = 5.6 Hz), 5.70 (1H, br. t, J = 5.6 Hz), 6.29-6.32 (2H, m), 7.36 (1H, dd, J = 1.8, 0.9 Hz), 7.53-7.70 (7H, m), 7.78 (1H, d, J = 2.2 Hz).
합성예 4 (6-클로로-2-에톡시카르보닐메틸아미노-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-33)의 제조)
2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-3) 550 mg 및 글리신 에틸 에스테르 히드로클로라이드 419 mg 에 DMF 3 ml 및 트리에틸아민 607 mg 을 첨가하고, 85 ℃ 에서 5.5 시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 용액을 물 100 ml 에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산: 에틸 아세테이트 = 6:1 내지 3:1) 로 정제하여 표제 화합물 503 mg 을 수득하였다. Mp.146.1 ℃.
1H NMR (CDCl3): 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz), 4.25 (2H, q, J = 7.2 Hz), 4.31 (2H, d, J = 5.2 Hz), 5.97 (1H, br. s), 7.54-7.63 (5H, m), 7.67-7.70 (2H, m), 7.79 (1H, s).
합성예 5 (6-클로로-2-메톡시아미노-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-32)의 제조)
2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-3) 275 mg, 아세토니트릴 10 ml 및 메톡시아민 히드로클로라이드 334 mg 의 혼합물에 트리에틸아민 506 mg 을 실온에서 적가하여 혼합물을 수득하였다. 혼합물을 스테인레스강으로 만든 내압 반응용기에 채우고, 105 ℃ 에서 3.5 시간 동안 반응을 수행하였다. 냉각 후, 반응 용액을 물 100 ml 에 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 생성된 추출물을 물로 세척하고, 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산: 에틸 아세테이트 = 3:1)로 정제하여 미정제 결정 156 mg 을 수득하였다. 미정제 결정을 에틸 아세테이트로부터 재결정하여 표제 화합물 55 mg 을 수득하였다. Mp.173.9 ℃.
1H NMR (CDCl3): 3.98 (3H, s), 7.47-7.72 (6H, m), 7.87 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.89 (1H, d, J = 2.2 Hz), 8.03 (1H, br. s).
합성예 6 (6-클로로-2-(2-히드록시에틸티오)-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ie3-1)의 제조)
2-메르캅토에탄올 86 mg 의 DMF (7.5 ml) 용액에 수소화나트륨 (60%) 44 mg 을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 2,6-디클 로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-3) 275 mg을 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 물 100 ml 에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 생성된 추출물을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트: 헥산 = 1:5) 로 정제하여 표제 화합물 266 mg 을 수득하였다. Mp.124.4 ℃.
1H NMR (CDCl3): 3.50 (2H, t, J = 5.5 Hz), 3.64 (1H, br. t), 4.07 (2H, q-형, J = 5.5 Hz), 7.57-7.61 (3H, m), 7.71-7.74 (2H, m), 7.77 (1H, dd, J = 8.9, 2.3 Hz), 7.85 (1H, d, J = 8.9 Hz), 7.97 (1H, d, J = 2.3 Hz).
합성예 7 (6-클로로-2-포름아미도-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-35)의 제조)
건조 포름아미드 54 mg 의 DMF (5 ml) 용액에 수소화나트륨 (60%) 48 mg 을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-3) 275 mg 을 첨가하고, 85 ℃ 까지 가온하고, 3 시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 용액을 물 100 ml 에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트: 헥산 = 1:3)로 정제하여 표제 화합물 64 mg 을 수득하였다. Mp.252.1 ℃.
1H NMR: 7.59-7.66 (3H, m), 7.72-7.81 (3H, m), 7.88 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.02 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.37 (1H, br. d, J = 10.4 Hz), 9.71 (1H, d, J = 10.4 Hz).
합성예 8 (6-클로로-2-(1-메틸히드라지노)-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-27)의 제조)
2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-3) 275 mg 및 모노메틸히드라진 461 mg 의 혼합물을 85 ℃ 에서 30 분 동안 교반하였다. 생성된 반응 생성물을 냉각시키고, 여기에 물 200 ml 을 첨가하였다. 침전된 결정을 여과하여 수집하고, 수집한 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물 225 mg 을 수득하였다. Mp. 155.9 ℃.
1H NMR (CDCl3): 3.52 (3H, s), 4.65 (2H, s), 7.54-7.63 (5H, m), 7.70-7.74 (2H, m), 7.80 (1H, d, J = 2.0 Hz).
합성예 9 (2-(2-아미노에톡시)-6-클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Id3-1)의 제조)
합성예 6 과 동일한 방식으로, 2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ia1-3) 500 mg 및 N-(2-히드록시에틸)프탈이미드 382 mg 을 반응시켜, 6-클로로-4-페닐-2-(2-프탈이미도에톡시)퀴나졸린 380 mg 을 수득하였다. Mp. 154.7 ℃.
1H NMR (CDCl3): 4.25 (2H, t, J = 5.8 Hz), 4.84 (2H, t, J = 5.8 Hz), 7.53-7.60 (3H, m), 7.67-7.71 (3H, m), 7.72-7.76 (3H, m), 7.78-7.82 (2H, m), 7.97 (1H, d, J = 2.2 Hz).
6-클로로-4-페닐-2-(2-프탈이미도에톡시)퀴나졸린 380 mg, 히드라진 수화물 70 mg 및 에탄올 6 ml 의 혼합물을 2 시간 동안 환류시키면서 가열하였다. 생성된 반응 용액에 물 1.2 ml 을 첨가하고, 에탄올을 증류하였다. 생성된 잔여물에 농축 염산 1.5 ml 을 첨가하고, 1 시간 동안 환류시키면서 가열하였다. 생성된 반응 생성물을 냉각시키고, 물 중 나트륨 바이카르보네이트의 포화 용액에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 농축하여, 표제 화합물 240 mg 을 수득하였다. Mp.134.9 ℃.
1H NMR (CDCl3): 3.59-3.63 (2H, m), 3.84 (2H, t, J = 4.6 Hz), 6.15 (2H, br. s), 7.53-7.59 (5H, m), 7.63-7.67 (2H, m), 7.75 (1H, d, J = 1.2 Hz).
합성예 10 (2-(2-아세틸티오에틸아미노)-6-클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-14)의 제조)
트리페닐포스핀 292 mg 의 탈수 THF (3ml) 용액에 디이소프로필카르보디이미드 40% 톨루엔 용액의 563 mg 을 얼음 냉각하면서 적가하고, 20 분 동안 교반하였다. 생성된 현탁액에 6-클로로-2-(2-히드록시에틸아미노)-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-1) 167 mg 의 탈수 THF (2ml) 용액을 얼음 냉각하면서 적가하고, 즉시 티오아세트산 127 mg 을 적가하였다. 생성된 황색의 맑은 용액을 얼음 냉각하면서 1 시간 동안 교반하고, 1 시간 동안 실온에서 교반하고, 물 중 나트륨 바이카르보네이트 포화 용액에 붓고, 클로로포름으로 추출하였다. 추출물을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (클로로포름: 에틸 아 세테이트 = 10:1)로 정제하여, 표제 화합물 170 mg 을 수득하였다. Mp.128.9 ℃. 1H NMR (CDCl3): 2.34 (3H, s), 3.22 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.73 (2H, q, J = 6.5 Hz), 5.74 (1H, br. t, J = 6.5 Hz), 7.53-7.62 (5H, m), 7.65-7.70 (2H, m), 7.77 (1H, s).
합성예 11 (6-클로로-2-(2-메르캅토에틸아미노)-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-13) 및 비스[2-(6-클로로-4-페닐-2-퀴나졸리닐)아미노에틸] 이황화물 (화합물 No. Ic3-15))
2-(2-아세틸티오에틸아미노)-6-클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ic3-14) 108 mg, 에탄올 2 ml 및 10% 수산화나트륨 수용액 362 mg 의 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 30 분 동안 환류 가열시키면서 교반하였다. 불용성 물질을 여과하여 반응 용액으로부터 수집하였다. 수집한 생성물 (고체)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (클로로포름: 에틸 아세테이트 = 10:1)로 정제하여, 우선 6-클로로-2-(2-메르캅토에틸아미노)-4-페닐퀴나졸린 50 mg 을 수득하였다. Mp.165.9 ℃. 1H NMR (CDCl3): 1.46 (1H, t, J = 8.5 Hz), 2.84 (2H, q-형, J=7.2 Hz), 3.66 (2H, q-형, J=6.4 Hz), 5.79 (1H, br. t, J = 5.4 Hz), 7.55-7.57 (3H, m), 7.60 (2H, s), 7.66-7.69 (2H, m), 7.77-7.78 (1H, m). 그 후, 비스[2-(6-클로로-4-페닐-2-퀴나졸리닐)아미노에틸] 이황화물 (하기 화학식으로 나타낸 화합물) 28 mg 을 수득하였다.
Figure 112009030583530-PCT00017
Mp.159.2 ℃. 1H NMR (CDCl3): 3.02 (4H, t, J=6.4 Hz), 3.89 (4H, q, J=6.4 Hz), 5.81 (2H, br. t, J=6.4 Hz), 7.51-7.61 (10H, m), 7.63-7.68 (4H, m), 7.75 (2H, d, J = 2.2Hz).
전술한 합성예와 동일한 방식으로 제조할 수 있는 화합물의 예 및 시판중인 화합물을 표 3, 표 4, 표 5 및 표 6 에 (전술한 합성예에서 제조한 화합물을 포함하여) 제시하였다.
표 4 및 표 5 의 주석 "a)", "b)", "c)" 및 "d)" 는 하기와 같다.
[표 3]
Figure 112009030583530-PCT00018
[표 4]
Figure 112009030583530-PCT00019
[표 5]
Figure 112009030583530-PCT00020
[표 6]
Figure 112009030583530-PCT00021
a) 구조를 합성예 11 에 기술하였다.
b) 1H NMR (CDCl3): 1.66-1.75 (1H, m), 1.86-2.08 (3H, m), 3.57-3.64 (1H, m), 3.75-3.83 (2H, m), 3.89-3.59 (1H, m), 4.13-4.20 (1H, m), 5.70 (1H, br. s), 7.52-7.60 (5H, m), 7.64-7.69 (2H, m), 7.75-7.76 (1H, m).
c) 1H NMR (CDCl3): 1.22 (3H, t, J = 7.0 Hz), 3.55 (2H, q, J = 7.0 Hz), 3.68 (2H, t, J = 5.2 Hz), 3.78 (2H, q-형, J = 5.2 Hz), 5.75 (1H, br. t), 7.53-7.60 (5H, m), 7.65-7.69 (2H, m), 7.75-7.77 (1H, m).
d) 1H NMR (CDCl3): 1.22 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.96 (2H, 오중항, J = 6.3 Hz), 3.50 (2H, q, J = 7.0 Hz), 3.58 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.67 (2H, q-형, J = 6.3 Hz), 5.65 (1H, br. t), 7.53-7.60 (5H, m), 7.65-7.69 (2H, m), 7.74-7.76 (1H, m).
참조 합성예 1 (8-클로로-4-페닐-2(1H)-퀴나졸리논 (화합물 No. II-11)의 제조)
페닐마그네슘 브로마이드 (32% THF 용액) 7.10 g 에 2-아미노-3-클로로벤조니트릴 953 mg 의 THF (7 ml) 용액을 실온에서 적가하고, 30 분 동안 환류시키면서 가열하였다. 생성된 반응 생성물에 얼음 냉각시키면서 메틸 클로로카르보네이트 885 mg 을 적가하고, 40 분 동안 환류시키면서 가열하였다. 생성된 반응 용액을 냉각시키고, 2N-염산 40 ml 에 붓고, 나트륨 바이카르보네이트 8 g 및 MTBE 20 ml 를 여기에 첨가하고, 교반하였다. 침전된 결정을 여과하여 수집하고 표제 화합물 1.30 g 을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6): 7.24(1H, t, J = 8.0 Hz), 7.57-7.70 (6H, m), 7.90-7.93 (1H, m), 11.45 (br. s).
참조 합성예 2 (4-페닐-6-트리플루오로메틸-2(1H)-퀴나졸리논 (화합물 No. II-6))
2-아미노-5-트리플루오로메틸벤조페논 762 mg 의 클로로포름 10 ml 용액에 트리에틸아민 349 mg 을 적가하고, 트리클로로아세틸 클로라이드 627 mg 을 얼음 냉각시키면서 적가하였다. 동일한 온도에서 30 분 동안 교반한 후, 물 50 ml 을 첨가하고, 용액을 분리하였다. 유기층을 수집하고, 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산: 에틸 아세테이트 = 5:1)로 정제하고, 2'-벤조일-2,2,2-트리클로로-4'-트리플루오로메틸아세트아닐리드 1.08 g 을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3): 7.53-7.58 (2H, m), 7.66-7.75 (3H, m), 7.90-7.95 (2H, m), 8.81 (1H, d, J = 8.6 Hz), 12.38 (1H, br. s).
2'-벤조일-2,2,2-트리클로로-4'-트리플루오로메틸아세트아닐리드 1.08 g, DMSO 10 ml 및 암모늄 아세테이트 1.18 g 의 혼합물을 75 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 물 100 ml 를 첨가하고, 침전된 결정을 여과하여 수집하였다. 생성된 수집한 물질을 헥산: 에틸 아세테이트 = 1:1 의 혼합물에 용해하고, 무수 황산 마그네슘을 사용하여 탈수시키고, 농축하여 표제 화합물 765 mg 을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3): 7.58-7.68 (3H, m), 7.75 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.79-7.83 (2H, m), 7.93 (1H, dd, J = 8.8, 1.7 Hz), 8.17 (1H, br. s), 13.37 (1H, br. s).
전술한 참조 합성예와 동일한 방식으로 제조할 수 있는 화합물의 예를 표 7 에 제시한다 (또한 전술한 참조 합성예로 제조한 화합물을 포함함).
표 7 에서 주석 "a)" 내지 "i)" 는 하기와 같다.
[표 7]
Figure 112009030583530-PCT00022
a) 1H NMR (DMSO-d6): 7.27 (1H, dd, J = 7.7, 1.0 Hz), 7.38 (1H, dd, J = 8.3, 1.1 Hz), 7.43-7.55 (5H, m), 7.69 (1H, t, J = 8.1 Hz), 12.18 (1H, br. s).
b) 1H NMR (DMSO-d6): 7.35 (1H, dd, J = 9.2, 2.7 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 9.2, 4.8 Hz), 7.58-7.74 (6H, m), 12.05 (1H, br. s).
c) 1H NMR (DMSO-d6): 7.35 (1H, d, J = 9.2 Hz), 7.59-7.71 (6H, m), 7.91 (1H, dd, J = 9.2, 2.2 Hz), 12.08 (1H, br. s).
d) 참조 합성예 2 에 기재된 1H NMR
e) 1H NMR (CDCl3): 3.78 (3H, s), 7.25-7.27 (1H, m), 7.36-7.40 (1H, m), 7.54-7.62 (4H, m), 7.81-7.85 (2H, m), 13.37 (1H, br. s).
f) 1H NMR (DMSO-d6): 7.48 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.60-7.68 (3H, m), 7.71-7.74 (2H, m), 8.05 (1H, s), 8.08-8.12 (1H, m), 12.36 (1H, br. s).
g) (분리 및 정제 없음)
h) 참조 합성예 1 에 기재된 1H NMR
i) 1H NMR (DMSO-d6): 7.52-7.72 (6H, m), 8.10-8.12 (1H, m), 11.69 (1H, br. s).
실시예 1 (CER1 클로닝용 애기장대 cDNA 파지 라이브러리의 작성)
애기장대, Wassilewskija 계통의 종자를 70% 에틸 알코올로 1 분 동안, 그 후 1.5% 나트륨 차아염소산염으로 10 분 동안 살균하였다. 상기 종자를 살균수로 잘 세척하고, GM 배지 (4.3 Murashige 및 Skoog's basal salt mixture, 1% 수크로스, 10 ml 의 5% MES-KOH (pH 5.7), 0.3% PhytagelTM (SIGMA)) 에 2 주 동안 배양하여 식물 5 g 을 수득하였다. 상기 식물을 액체 질소로 동결시키고, 모르타르를 이용하여 물리적으로 빻았다. 수득한 가루 생성물에 10 mg 의 추출 완충액 (200mM Tris-HCl (pH 8.5), 100mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% SDS, 14mM β-메르캅토에탄올) 및 10 g 의 페놀의 혼합물을 첨가하였다. 볼텍스 믹서로 혼합물을 교반하였다. 그 후, 클로로포름 10 ml 을 상기 혼합물에 첨가하고, 충분히 교반하 였다. 다음으로, 수득한 혼합물을 20 분 동안 10,000 rpm 의 속도로 원심분리하고, 수성층을 수집하였다. 수집한 수성층에 최종 농도 2 M 로 LiCl 을 첨가하고, -80 ℃ 에서 3 시간 동안 방치하였다. 수득한 동결 생성물을 녹이고, 20 분 동안 10,000 rpm 의 속도로 원심분리 하였다. 침전물을 수집하였다. 수집한 침전물을 2 ml 의 TE (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA)에 용해하였다. 3M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) 0.2 ml 및 5 ml 에탄올을 상기 용액에 첨가한 후, 혼합물을 RNA 침전물을 수집하기 위해 원심분리 하였다. 그 다음으로, OligotexTM dT30super (Roche Japan Co., Ltd.제조)를 이용하여 수집한 침전물 (RNA)로부터 폴리A 를 함유한 RNA 를 추출하였다.
ZAP-cDNA합성 키트 (Stratagene Co., Ltd. 제조)를 사용하여 키트 설명서에 따라 폴리A 를 함유한 추출한 RNA로부터 파지 cDNA 라이브러리를 작성하였다. 구성한 파지 cDNA 라이브러리의 적정농도는 500,000 PFU 이었다.
실시예 2 (CRE1 의 DNA 탐침(probe)의 제조)
주형으로서 실시예 1 에서 제조한 파지 cDNA 라이브러리의 파지 액체(약 1,000,000 PFU) 및 프라이머로서 서열 번호:3 의 DNA 와 서열 번호:4 의 DNA 를 사용하여, TAKARA LA TaqTM 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 이용하여 PCR 반응을 수행하고, DNA 를 증폭하였다. 하기에 상세히 기술한다.
키트 설명서에 따라 dNTP 와 같은 반응 조성물을 파지 1,000,000 PFU 및 프라이머 DNA 각 0.2 μM 에 첨가하여 PCR 반응액를 제조하였다. 94 ℃ 에서 2 분 동안 가온-유지 후, 94 ℃ 에서 30 초간, 55 ℃ 에서 30 초간 및 68 ℃ 에서 5 분간 의 40 사이클을 작동하는 조건하에서 PCR 을 수행하고, 원하는 DNA 단편을 증폭하였다. 다음으로, 주형으로서 증폭된 DNA 단편을 사용하고, Megaprime DNA-표지화 시스템 키트 (Amersham Pharmacia 제조)를 사용하여 32P 로 표지된 탐침을 제조하였다. 여기서, 32PdCTP 2.0 MBq 을 증폭된 DNA 단편 25 ng 에 첨가하고, 여기에 키트에 의해 지정된 반응 조성물을 첨가함으로써 반응액 (25 μl) 을 제조하였다. 표지 반응을 37 ℃ 에서 10 분간 수행하였다.
실시예 3 (CRE1 유전자를 수송하는 파지 cDNA 클론의 수득)
실시예 2 에서 제조한 DNA 탐침을 사용한 플라크 교배에 의해 원하는 DRE1 유전자를 클로닝하였다. 하기에서 상세히 기술한다.
ZAP-cDNAR합성 키트의 설명서에 따라 실시예 1 에서 제조한 cDNA 파지 라이브러리를 사용함으로써 플라크를 형성하였다. 형성된 플라크로부터 니트로셀룰로오스 필터 상에 DNA 가 흡착되고, 자외선 처리에 의해 필터에 고정시켰다. 이와같이 제조한 필터를 이용하여 6 × SSC (0.9M NaCl, 0.09M 나트륨 시트레이트), 5 × 덴하르트 (Denhart) 용액 (0.1% (w/v) 피콜(Ficol) 400, 0.1% (w/v) 폴리비닐 피롤리돈, 0.1% BSA), 0.5% (w/v) SDS, 및 변성된 연어 정자 DNA 100 μg/ml 의 존재에서 또는 변성된 연어 정자 DNA 100 μg/ml 를 함유하는 DIG EASY Hyb 용액 (Boehringer Mannheim Co., Ltd.) 중에 65 ℃ 로 보온한 후, 1 × SSC (0.15M NaCl, 0.015M 나트륨 시트레이트) 및 0.5% SDS 의 존재하에서 15 분 동안 실온에서 두 번 보온하였고, 그 후 0.1 × SSC (0.015M NaCl, 0.0015M 나트륨 시트레이트) 및 0.5% SDS 의 존재하에서 30 분 동안 68 ℃ 로 보온하여 교배 파지 cDNA 클론을 수득하였다.
실시예 4 (CRE1 cDNA의 클로닝)
실시예 3 에서 수득한 파지 cDNA 클론의 cDNA 를 주형으로서 사용하고, 서열 번호:5 의 DNA 및 서열 번호:6 의 DNA 를 프라이머로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 서열 번호:5 의 염기 서열을 갖는 DNA 를 증폭시켰다. 하기에서 상세히 기술한다.
94 ℃ 에서 1 분 동안 가온-유지 후, 94 ℃ 에서 30 초간, 55 ℃ 에서 30 초간 및 72 ℃ 에서 4 분간의 25 사이클을 작동하는 증폭 조건하에서 Herculase Enhanced DNA 중합효소 (TOYOBO Co., Ltd.제조) 를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 키트 설명서에 따라 dNTP 와 같은 반응 조성물을 파지 cDNA 클론의 cDNA 500 ng 및 프라이머 DNA 100 ng 에 첨가하여 PCR 반응액 (50 μl) 를 제조하였다.
전술한 바와 같이, 원하는 DNA 단편을 증폭시켰다.
실시예 5 (CRE1 발현 플라스미드의 구축)
효모 발현 벡터인 p415CYC (Munberg 등, Gene: 156 119-122 (1995), ATCC library 로부터 이용가능함 (No. 87382)) 를 제한 효소 Sma I 로 절단하였다. 그리고 나서, 실시예 4 에서 수득한 DNA 단편 (서열 번호:2 의 염기 서열을 갖는 DNA) 을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 발현 벡터 p415CYC1 의 CYC1 프로모터 서열과 연결한 후 원하는 단백질이 효모에서 발현될 수 있도록 혼입하였다. DNA 단편의 염기 서열을 올바른 방향으로 삽입하고, 서열장치를 이용함으로써 서열 번호: 2 의 염기 서열이었음을 확인하였다. 따라서, 발현 플라스미드 p415CYC-CRE1 를 수득하였다.
실시예 6 (형질전환 세포 TM182-CRE1 및 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 의 제조)
Sln1-유전자 결손주(deficient strain)인 TM182 (sln1△) (Maeda T 등, Nature: 369 242-245 (1994))을 형질전환시키기 위해 실시예 5 에서 수득한 발현 플라스미드 p451CYC-CRE1 및 효모 발현 벡터 p415CYC 각각을 사용하였다. CLONTECH Co., Ltd.: MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual, page 22 에 기재된 VII. Library Transformation & Screening Protocols 에 따라 폴리에틸렌 글리콜/리튬 아세테이트 (PEG/LiAc)-매개 형질전환 방법을 사용하여 형질전환을 수행하였다. 류신의 영양 요구성이 수득한 형질전환 세포에서 사라지기 때문에, DOLU + Gal 배지에서 성장할 수 있는 형질전환 효모를 선별하여 형질전환 세포 TM182-CRE1 및 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 을 수득하였다.
실시예 7 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질을 탐색하는 방법)
실시예 6 에서 수득한 형질전환 세포 TM182-CRE1 및 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 각각을 DOLU + Gal 배지 10 ml 에 넣고, 30 ℃ 에서 18 시간 동안 예비인큐베이션하여 형질전환 세포 각각에 대한 예비인큐베이션액을 수득하였다. 예 비인큐베이션액을 형질전환 세포 TM182-CRE1 에 대한 DOLU + Glu 배지로 또는 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 에 대한 DOLU + Gal 배지로 OD600 = 0.1 에 도달할 때까지 희석하여, 형질전환 세포의 각각에 대한 예비인큐베이션 희석액을 수득하였다.
96-웰 플레이트의 각 웰에 디메틸 설폭시드 (DMSO) 중 시험 물질의 200 ppm 용액 1 μl 씩을 첨가하고, 어세이 플레이트를 제조하였다. 동시에, 대조군으로서 DMSO 1 μl 만을 일부 웰에 첨가하였다. 형질전환 세포 TM182-CRE1 에 대한 어세이 플레이트 및 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 에 대한 어세이 플레이트를 제조하였다.
DMSO 중 트랜스-제아틴 (사이토카이닌) 10,000 ppm 용액을 DOLU + Gul 배지로 50배 희석하여 200 ppm 으로 하였다. 200 ppm 트랜스-제아틴 용액을 3/1,000 부피 양으로 전술한 예비인큐베이션 희석액 각각에 첨가하여, 트랜스-제아틴을 0.6 ppm 으로 포함하는 각각의 예비인큐베이션 희석액을 제조하였다. 0.6 ppm 예비인큐베이션 희석액을 각 형질전환 세포에 대한 어세이 플레이트의 각 웰에 100 μl의 양으로 첨가하였다. 상기 플레이트를 30 ℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 각 웰의 혼탁도 (OD 600) 를 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 측정한 혼탁도를 대조군 웰의 혼탁도와 비교함으로써 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 시험 물질의 활성도를 시험하였다. 결과를 표 8 및 9 에 제시하였다.
형질전환 세포 TM182-CRE1 의 경우, 대조군 웰로 측정한 혼탁도 보다 낮은 혼탁도를 갖는 시험 물질을 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질로서 선택하였다. 그러나 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 의 경우, 혼탁도가 대조군 웰 보다 낮고, 낮은 정도가 형진전환 세포 TM182-CRE1 의 경우와 동등 이상인 시험 물질은 효모에 독성이므로, 따라서 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질로서 선택되지 않았다.
(시험군 대 대조군에서의 상대성장률) [%] = [(시험군의 혼탁도) - (블랭크의 혼탁도)]/ [(대조군의 혼탁도) - (블랭크의 혼탁도)] ×100
(세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성도) [%] = 100 - (시험군 대 대조군에서의 상대성장률)
[표 8]
Figure 112009030583530-PCT00023
모든 경우에 있어, 트랜스-제아틴의 존재 농도를 0.6 ppm으로 조절하고, 화학 물질의 존재 농도를 2 ppm 으로 조절하였다.
[표 9]
Figure 112009030583530-PCT00024
모든 경우에 있어, 트랜스-제아틴의 존재 농도를 0.6 ppm으로 조절하고, 화학 물질의 존재 농도를 2 ppm 으로 조절하였다.
실시예 8 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질의 농도 반응의 시험방법)
실시예 7 에서 선별한 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는) 화학 물질을 실시예 7 과 동일한 방식으로 시험 농도를 변화시켜 시험하였다. 실시예 6 에서 수득한 형질전환 세포 TM182-CRE1 및 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 를, 실시예 7 에서 선별한 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는) 화학 물질의 시험 농도가 0.06 ppm 내지 6 ppm 내에서 변화시키는 것을 제외하고는 실시예 7 과 동일한 조건으로 인큐베이션하였다. 시험한 화학 물질의 농도를 DMSO 로 조절하였다. 인큐베이션을 완료한 후, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성도에 대한 농도 반응을 형질전환 세포 TM182-CRE1 의 증식 상태가 관찰되지 않는 최소 시험 농도, 또는 하기 기술되는 방법으로 수득한 농도응답성 성장 저해 곡선으로부터 검사하였다.
농도응답성 성장 저해 곡선을 구성할 때, 우선 상대성장률을 하기와 같이 연산하였다.
(상대성장률) [%] = (B)/(A) × 100
(A) = [(0.06 ppm 시험군의 혼탁도) - (블랭크의 혼탁도)]/ [(대조군의 혼탁도) - (블랭크의 혼탁도)]
(B) = [(각 시험군의 혼탁도) - (블랭크의 혼탁도)]/ [(대조군의 혼탁도) - (블랭크의 혼탁도)]
그리고 나서, X 축은 시험 화학 물질의 농도를 나타내고, Y 축은 상대성장률을 나타내는 그래프 (도 1, 왼쪽 그림: 형질전환 세포 TM182-CRE1, 오른쪽 그림: 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 참조) 를 만들어 농도응답성 성장 저해 곡선을 얻었다.
실시예 9 (뿌리 성장-촉진 활성 시험)
하기 조성 (표 10 참조) 을 갖는 엔시(Enshi) 표준 배지를 준비하였다. 클러스터 튜브에 화학 물질의 DMSO 용액을 4 μl 씩, 최종 농도가 0.001 ppm 내지 10 ppm 가 되도록 분배하고, 살균한 엔시표준물질 배지를 600 μl 씩 분배하였다. 그 후, 생성된 용액을 잘 혼합하였다. 각 클러스터 튜브에, 애기장대의 종자 10 ~ 20 개를 뿌리고, 22 ℃ 에서 10 일 동안 밝은 곳에서 배양하였다. 그 후, 애기장대 종자로부터 발생한 주근 (평균 주근)의 길이를 측정하였다. 8번 반복한 평균을 측정하고, 뿌리 성장률을 하기식에 따라 측정하였다. 그 결과, 현저한 뿌리 성장률 (예를 들어, 뿌리 성장률이 120% 이상)을 나타낸 화학 물질은 뿌리 성장-촉진 활성이 있는 것으로 판단할 수 있다.
상세한 결과로서, 최고 뿌리 성장률을 나타낸 최종 농도를 표 11 및 표 12 에 나타내었다.
뿌리 성장률 (%) = (화학 물질-처리군의 평균 주근 길이/ (대조군의 평균 주근 길이 ) ×100
[표 10]
Figure 112009030583530-PCT00025
[표 11]
Figure 112009030583530-PCT00026
[표 12]
Figure 112009030583530-PCT00027
실시예 10 (상추(lettuce)를 사용한 사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 평가)
실시예 7 에서 선별한 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는) 화학 물질 Ic3-1 및 화학 물질 Ic7-1 에 관하여, 상추 (Lactuca sativa Red wave)를 사용하여 주근-성장 촉진 활성을 평가하였다. 화학 물질을 갖가지 농도(0.6 ppm, 1.2 ppm, 2.5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 각각 1% DMSO 을 함유함)의 수용액으로 제조하고, 60 Φ 플라스틱 페트리 접시에 직경 50 mm 인 필터 종이 상에 1 ml의 양으로 첨가하였다. 그리고 나서, 플라스틱 페트리 접시에 30 상추 종자를 뿌렸다. 22 ℃ 에서 4 일 동안 밝은 곳에서 배양한 후, 주근의 길이를 측정하였다. 3 번 반복한 평균을 측정하고, 하기 식으로 뿌리 성장률을 측정하였다.
뿌리 성장률 (%) = (화학 물질-처리군의 평균 주근 길이)/ (대조군의 평균 주근 길이) × 100 - 100
결과를 도 2 및 도 3 에 나타냈다. 화학 물질 Ic3-1 의 경우에 있어, 주근 성장은 0.6 ppm 내지 2.5 ppm 에서 대조군에 비해 15 내지 17% 증가하였다 (도 2 참조). 화학 물질 Ic7-1 의 경우에 있서, 주근 신장은 10 ppm 내지 20 ppm 에서 대조군에 비해 10 내지 17% 증가하였다 (도 3 참조). Dunnett's 시험 결과는 모든 처리군에서 5% 의 유의미한 수준에서 현저한 차이가 있어, 놀라운 뿌리 성장 촉진 효과가 있음을 보여준다.
실시예 11 (벼를 이용한 사이토카이닌 신호전달을 저해하는 물질의 뿌리 성장-촉진 활성 평가)
실시예 7 에서 선별한 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는) 화학 물질 Ic3-1 및 화학 물질 Ic7-1 에 관하여, 벼(Oriza sativa L. japonica)를 이용하여 주근-성장 촉진 활성을 평가하였다. 화학 물질을 갖가지 농도 (10 ppm, 25 ppm, 각각 0.1% DMSO 을 함유)의 수용액으로 제조하였다. 화학 용액 17 ml 로 종이 타월을 적시고, 이때 무거운 종이를 뿌리 성장을 관찰하기 위한 파우치 (177 mm × 163 mm, Daiki Rika Kogyo Co., Ltd. 제조) 에 담고, 3 개의 벼 종자를 상기 종이 타월에 뿌렸다. 상기 파우치를 플라스틱 용기에 넣고, 밀봉하였다. 25 ℃ 에서 7 일 동안 밝은 곳에서 배양한 후, 주근의 길이를 측정하였다. 3 번 반복 후 평균을 측정하고, 하기 식으로 뿌리 성장률을 측정하였다.
뿌리 성장률 (%) = (화학 물질-처리군의 평균 주근 길이)/ (대조군의 평균 주근 길이) × 100 - 100
결과를 도 4 및 도 5 에 나타내었다. 화학 물질 Ic3-1 의 경우에 있어, 대조군에 비해 10 ppm 에서 주근 성장은 17% 증가하고, 25 ppm 에서 주근 성장은 20 % 증가하였다(도 4 참조). 화학 물질 Ic7-1 의 경우에 있어, 대조군에 비해 10 ppm 에서 주근 성장은 17% 증가하고, 25 ppm 에서 주근 성장은 19% 증가하였다 (도 5 참조). Dunnett's 시험 결과는 모든 처리군에서 유의미한 수준 5% 에서 현저한 차이가 있어, 놀라운 뿌리 성장 촉진 효과가 있음을 보여준다.
실시예 12 (벼 종자 처리에 의한 사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질의 뿌리 성장-촉진 활성 평가)
실시예 7 에서 선별한 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는) 화학 물질 Ic3-1 및 화학 물질 Ic7-1에 관하여, 종자 처리에 의해 유도된 주근-성장 촉진 활성을 벼(Oriza sativa L. japonica)를 이용하여 평가하였다. 화학 물질을 아세톤에 용해시켜 10,000 ppm 용액을 제조하였다. 이와같이 제조한 아세톤 화학 물질 용액 (300 μl)을 에펜돌프(eppendorf) 튜브에 넣었다. 그 후, 종자 15 개를 에펜돌프 튜브에 넣었다. 생성한 혼 합물을 약 30 초 동안 혼합하였다. 이와같이 화학 처리한 종자를 뿌리고, 필터 종이에서 건조하였다.
바닥에 구멍이 있는 플라스틱 용기 (길이 120 mm, 높이 97 mm)에 배양토 약 820 ml 을 넣었다. 화학 처리된 종자를 플라스틱 용기에 뿌렸다 (플라스틱 용기당 종자 15 개). 종자를 30 ℃ 에서 4 일 동안 어두운 곳에서 배양하고 나서, 35 일 동안 온실에서 배양하였다. 그러한 배양된 식물의 뿌리를 제거하고, 식물에 붙은 토양을 세척하여 버리고 동결 건조하였다. 그리고 나서, 동결 건조 후 뿌리의 무게를 측정하였다. 각 처리 군에 대해 시험을 3 번 반복하고, 평균을 측정하였다. 결과를 도 6 에 나타내었다.
화합물 Ic3-1 의 경우에 있어서, 식물 당 뿌리의 건조 중량은 대조군에 대해 119 %로 증가하였다. 화합물 Ic7-1 의 경우에 있어서, 식물 당 뿌리의 건조 중량은 대조군의 126 % 로 증가하였다. 둘 모두에 있어, 현저한 뿌리 성장 촉진 효과를 발견하였다. 옥신 화합물 IAA의 경우에 있어서, 뿌리 중량은 대조군의 87 % 로 저해되고, 따라서 뿌리 성장 저해 효과를 발견하였다.
실시예 13 (애기장대의 하배축(hypocotyl)을 이용한 사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질의 식물 분화-촉진 활성 평가)
실시예 7 에서 선별한 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는) 화학 물질 Ic3-1 및 화학 물질 Ic7-1 에 관하여, 애기장대 콜롬비아의 하배축을 이용하여 부정근 형성 활성을 검사함으로써 식물 분화-촉진 활성을 평가하였다.
우선, 애기장대를 뿌리기 위해 한천 배지를 제조하였다. 한천 배지는 성분으로서 수용액 1 리터 당, 무라시게-스쿠그(Murashige-Scoog) 식물 배지 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 리터용 혼합염 1 포, 수크로스 10 g, 수산화칼륨을 이용해 pH 5.7 로 조절한 5% MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) 수용액 10 ml, 이노시톨 100 mg, 비타민 저장 용액 (수용액 1 리터 당 티아민 히드로클로라이드 10 g, 피리독신 히드로클로라이드 1 g, 및 니코틴산 1 g) 1 ml 및 한천 8 g 을 함유한다. 그 후, 한천 배지를 120 ℃ 에서 20 분 동안 오토클레이브에 걸고, 원형 페트리 접시에 분배한 다음, 고체화하였다.
애기장대 (약 25 μl) 종자를 1.5 ml 튜브에 넣었다. 여기에 나트륨 차아염소산염 용액 (Nacalai Tesque) 을 살균 증류수로 10 배 희석한 용액 1 ml 가하였다. 튜브 믹서 (TOMY, MT-360, MIXING SPEED10)로 약 1 분 동안 교반하면서 종자를 살균하였다. 휴대용 소형 원심분리기로 종자를 침전시킨 후, 나트륨 차아염소산염 용액의 희석액을 튜브로부터 제거하였다. 살균 증류수 1 ml 를 튜브에 새로 첨가한 후, 종자를 튜브 믹서로 약 1 분 동안 교반하여 세척하였다. 휴대용 소형 원심분리기 종자를 침전시키고 나서, 세척 후 튜브로부터 물을 제거하였다. 세척 작업을 3 회 반복하였다. 세척을 완료한 후, 종자를 원형 페트리 접시의 한천 배지에 뿌려 발아시키고, 22 ℃ 의 어두운 장소에서 성장시켰다.
한편, 화학 물질을 DMSO 중에 용해하여 10,000 ppm 의 용액을 제조하였다. 또한, 용액을 DMSO 로 희석하여 6,000 ppm, 2,000 ppm, 600 ppm 및 200 ppm 의 용액을 제조하였다. 12-웰 멀티-플레이트 (SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) 중 각 웰에, 1 종의 화학 물질을 하나의 농도로 함유한 DMSO 용액을 분배하였다. 대조군의 웰에는, 화학 물질 DMSO 용액 대신에 DMSO 2 μl 를 분배하였다. 그 후, 트랜스-제아틴을 DMSO 에 용해하여 10,000 ppm 의 용액을 제조하였다. 용액을 살균 증류수로 희석하여 10 ppm 의 용액을 제조하였다. 상기 조성물을 갖는 한천 배지를 제조하고, 오토클레이브에 걸고 나서, 약 50 ℃ 까지 냉각하였다. 상기 한천 배지에 10 ppm 의 트랜스-제아틴 용액을 최종 농도 0.01 ppm 이 되도록 첨가하고 혼합하였다. 화학 물질 DMSO 용액 또는 DMSO 를 분배한 12-웰 멀티-플레이트 중 각 웰에 트랜스-제아틴-함유 한천 배지 (각 2 ml) 를 분배하고 나서, 고체화하였다.
22 ℃ 의 어두운 장소에서 발아하고 성장시킨 후 애기장대의 묘목의 하배축 부분을 잘라, 자엽(cotyledon)이 있는 측면의 하배축을 하기 기술하는 바와 같이 부정근 형성 활성을 측정하는데 사용하였다. 뿌리가 있는 측면의 하배축을 버렸다. 구체적으로, 12-웰 멀티-플레이트의 각 웰에서 한천 배지에, 절단 부분으로부터 약 5 mm 까지 자엽이 있는 하배축을 삽입하였다. 멀티-플레이트를 22 ℃ 에서 16 시간 동안 밝은 곳에 (8 시간 동안은 어두운 곳에) 두었다. 결과적으로, (최종 농도가 각각 6 ppm, 2 ppm, 0.6 ppm 또는 0.2 ppm 인 모든 시험군에서) 화학 물질 Ic3-1 를 함유하는 한천 배지에 삽입된 하배축 부분 및 (최종 농도가 각각 6 ppm 또는 2 ppm 인 시험군에서) 화학 물질 Ic7-1 를 함유한 한천 배지에 삽입된 하배축 부분으로부터 부정근이 형성하였다. 화학 물질 DMSO 용액 대신에 DMSO 를 첨가한 대조군에서, 하배축 부분으로부터 부정근의 형성은 발견할 수 없었다. 최종 농도가 0.6 ppm 인 화학 물질 Ic3-1 을 함유하는 한천 배지로 삽입된 배축, 최종 농도가 2 ppm 인 화학 물질 Ic7-1 을 함유하는 한천 배지로 삽입된 하배축, 및 대조군의 한천 배지로 삽입된 하배축의 시험 결과를 도 7 에 나타내었다.
실시예 14 (벼를 이용한 사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질의 뿌리 성장-촉진 활성의 측정)
화학 물질 Ic3-3 에 관하여, 벼 (Oriza sativa japonica Nipponbare) 를 사용하여 뿌리 성장 촉진 활성을 측정하였다.
우선, 화학 물질을 설정 농도로 함유하는 아세톤 용액을 제조한 후, 증류수로 100 배 희석하여 (1% 아세톤를 함유하는) 10 ppm 의 화학 물질 용액을 수득하였다. 종자를 2 일 동안 물에 침지시키고, 발아를 자극하였다. 종자를 288-웰 플러그 트레이에 뿌리고 (웰 당 종자 3 개), 그 후 토양을 웰 당 500 μl 의 양으로 상기 화학 물질 용액으로 흠뻑 적셨다. 토양으로 덮은 후, 플러그 트레이를 플라스틱 백에 넣고 나서, 공조실(air-conditioned room) (30 ℃ 의 어두운 곳)에서 3 일 동안 두었다. 플러그 트레이로부터 플라스틱 백을 제거한 후, 바닥을 항상 관개하면서, 플러그 트레이를 밝은 곳/어두운 곳 = 16 시간/8 시간의 빛 조건으로 4 일 동안 두었다. 벼 종자를 배양하여 성장한 벼를 수득하였다. 생성한 벼 뿌리를 세척하고, 뿌리 길이 측정 이미지 분석기 WinRHIZO (Regent Instruments 제조) 를 사용하여 총 뿌리 길이를 분석하였다. 토양 관개 처리에 아세톤만을 사용한 대조군 (UTC)과 비교하여, 화학 물질 Ic3-3-처리군에서, 뿌리 성장을 현저하게 촉진시켰다. 도 8 에 사진을 나타내었다. 뿌리 길이 측정 이미지 분석기로 수득한 분석 결과는 화학 물질 Ic3-3-처리군에서 총 뿌리 길이의 증가를 보여준다. 결과를 도 9 에 나타내었다.
실시예 15 (CRE1 cDNA 의 클로닝, No. 2)
실시예 5 에서 수득한 발현 플라스미드 p415CYC-CRE1 를 주형으로서 사용하고, 서열 번호: 7 의 DNA 및 서열 번호: 8 의 DNA 를 프라이머로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 DNA 을 증폭하였다. 하기에서 상세히 기술한다.
94 ℃ 에서 1 분 동안 가온한 후, 94 ℃ 에서 15 초 동안, 58 ℃ 에서 30 초 동안 및 68 ℃ 에서 3분 30 초 동안의 30 사이클을 반복하는 증폭 조건하에서 KOD 와 DNA 중합효소 (TOYOBO Co., Ltd. 제조)를 사용함으로써 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 키트 설명서에 따라 dNTP 와 같은 반응 조성물을 플라스미드 p415CYC-CRE1 500 ng 및 각 프라이머 DNA 100 ng 에 첨가함으로써 PCR 반응액 (50 μl)를 제조하였다.
따라서 증폭된 원하는 DNA 단편을 키트에 첨부된 설명서에 따라 pCR-Blunt II-TOPO 벡터 (Invitrogen Corporation)로 클로닝하였다. 이 경우에 있어, 서열 번호: 7 의 염기 서열이 T7 프로모터에 가깝게, 서열 번호: 8 의 염기 서열이 Sp6 프로모터에 가깝게 하는 방향으로 pCR-Blunt II-TOPO 벡터 내로 원하는 DNA 단편을 삽입하였다. DNA 단편의 염기 서열을 올바른 방향으로 삽입하고, 서열기를 사용하여 서열 번호: 2 의 염기 서열임을 확인하였다.
실시예 16 (CRE1 발현 플라스미드의 구축)
효모 발현 벡터, p425GPD (Munberg et al. Gene: 156 119-122 (1995), ATCC 라이브러리 (No. 87359)로부터 입수가능) 를 제한 효소 BamHI 로 절단하였다. 그 후, 실시예 15 에서 수득한 DNA 단편 (서열 번호:2 의 염기 서열을 갖는 DNA) 을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 발현 벡터 p425GPD 의 GPD 프로모터 서열과 연결시켜, 원하는 단백질이 효모에서 발현될 수 있도록 혼입시켰다. DNA 단편의 염기 서열을 올바른 방향으로 삽입하고, 서열기를 사용하여 서열 번호: 2 의 염기 서열임을 확인하였다. 그리하여, 발현 플라스미드 p425GPD-CRE1 를 수득하였다.
실시예 17 (형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 의 제조)
실시예 16 에 수득한 발현 플라스미드를 사용하여, Sln1-유전자 결손주, TM182 (sln1△) (Maeda T et al. Nature: 369 242-245 (1994)) 을 형질전환시켰다. 첨부 매뉴얼에 따라 S. cerevisiae Direct Transformation Kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조) 를 사용함으로써 형질전환을 수행하였다. 류신의 영양 요구성이 수득한 형질전환 세포에서 사라지기 때문에, DOLU + Gal 배지에서 성장할 수 있는 형질전환 효모를 선택하여 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 를 수득하였다.
동일한 방식으로, 효모 발현 벡터 p425GPD 를 사용함으로써 형질전환 세포 TM182-p425GPD 를 수득하였다.
실시예 18 (CRE1 을 함유한 막 단백질 단편의 제조)
실시예 17 에서 수득한 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 을 유리 비드로 파단하고 나서, 초원심분리기로 CRE1 을 함유하는 막 단백질 단편을 제조하였다. 하기에서 상세히 기술한다.
실시예 17 에서 수득한 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 를 DOLU + Gal 배지 100 ml 에 뿌리고 나서, 30 ℃ 에서 16 시간 동안 교반하여 OD600 = 약 1.4 인 인큐베이션액을 수득하였다. 인큐베이션액을 50 ml 원심분리기 튜브에 분배하고, 4 ℃ 에서 7,400xg 로 5 분 동안 원심분리하여 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 의 세포를 수집하였다. 생성한 세포를 (인산이수소나트륨 수용액 50 mM 및 인산수소이나트륨 수용액 50 mM 을 혼합 비율 4:6 으로 혼합하고 pH 7.0 로 조절하여 제조한) 인산염 완충액에 다시 현탁시키고, 4 ℃ 까지 냉각하고, 2 ml 튜브에 분배한 후, 4 ℃ 에서 1,000xg 로 5 분 동안 원심분리하여 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 의 세포를 수득하였다. 생성한 세포를 다시 상기 인산염 완충액에 현탁시키고, 4 ℃ 까지 냉각하고 나서 4 ℃ 에서 1,000xg 로 5 분 동안 원심분리하여 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 의 세포를 수득하였다. 생성한 세포를 DTT (디티오트레이톨) 및 PMSF (페닐메틸설포닐 플루오라이드) (5 mM DTT 및 0.5 mM PMSF 를 전술한 인산염 완충액에 첨가함으로써 제조함)를 함유하는 (세포에 대해) 3 배의 인산염 완충액에 다시 현탁시켰다. 그 후, 미리 4 ℃ 까지 냉각된 250 μl 의 유리 비드 (직경이 0.25 내지 0.5 mm) 를 함유한 1.5 ml 튜브에 현탁액 200 μl 를 분배하였다. 1.5 ml 튜브를 마이크로튜브 믹서 (TOMY 사, MT-360)의 최고 출력으로 30 초 동안 교반한 후, 1 분 동안 얼음으로 냉각하였고, 이 작업을 한번 더 반복하였다. 또한, 1.5 ml 튜브를 멀티-비드 충격기 (MB-200, Yasui Kikai Corporation) 의 출력 (SPEED METER) 2,000 으로 하여 30 초 동안 교반한 후, 얼음으로 1 분 동안 교반하였고, 이 작업을 두 번 더 반복하였다. 그 후, 1.5 ml 튜브를 4 ℃ 에서 1,500xg 로 10 분 동안 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 상기 상청액을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮기고, 4 ℃ 에서 10,000xg 로 3분 동안 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액을 4 ℃ 에서 100,000xg 로 1 시간 동안 초원심분리기를 사용하여 침전물을 수집하였다. 생성한 침전물을 (1% 수크로스 모노카프레이트를 전술한 인산염 완충액에 첨가하여 제조한) 1% 수크로스 모노카프레이트를 함유한 인산염 완충액에 용해하여 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 의 막 단백질 단편을 수득하였다.
동일한 방식으로, 형질전환 세포 TM182-p425GPD 막 단백질 단편을 제조하였다.
실시예 19 (화학 물질에 의해 사이토카이닌과 사이토카이닌 수용체의 결합을 저해하는 것을 검사하는 방법)
실시예 18 에서 수득한 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 의 막 단백질 단편 및 수소의 방사성동위원소인 삼중수소로 표지된 높은 방사능을 갖는 사이토카이닌을 사용하여, 시험물질이 사이토카이닌이 사이토카이닌 수용체에 결합하는 것을 저해하는 것을 검사하였다. 하기에서 상세히 기술한다.
수소의 방사성동위원소, 삼중수소로 표지된 높은 방사활성을 갖는 사이토카이닌으로서, Amersham Biosciences 사제의 [3H]N-6-(이소펜트-2-에닐)아데닌(이후, 방사성표지 2IP로서 언급함)을 사용하였다. 비방사능이 74.0 GBq/mmol 이고, 방사능 농도가 37.0 MBq/ml 이다.
우선, 형질전환 세포 TM182-p415CYC1 의 막 단백질 단편 100 μg, 설정농도가 되도록 인산염 완충액로 희석한 방사표지 2IP 및 설정농도가 되도록 DMSO 로 희석한 시험 물질 1 μl 를 인산염 완충액에 혼합하여 반응액 100 μl 를 수득하였다. 다음으로, 반응액을 1 시간 동안 얼음에 두고나서 유리 필터 GF/B (Whatman 사 제조)로 여과하여 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1 의 막 단백질 단편을 수득하였다. 유리 필터를 액체 섬광 칵테일 Ultima Gold (PerkinElmer Co., Ltd. 사 제조)에 침지하고, 방사능을 액체 섬광 계측기로 측정하였다. 대조군의 경우, 형질전환 세포 TM182-p425GPD 의 막 단백질 단편을 사용하여 동일한 시험을 수행하였다. 방사표지 2IP 비특이적 결합으로 인한 방사능의 영향을 배제하기 위해서, 형질전환 세포 TM182-p425GPD-CRE1의 막 단백질 단편을 사용한 시험으로 수득한 방사능의 값으로부터 형질전환 세포 TM182-p425GPD 의 막 단백질 단편을 사용한 시험으로 수득한 방사능의 값을 뺐다. 시험 결과를 도 10 에 나타내었다.
시험 물질을 첨가하지 않거나 (시험 물질의 용매로서 사용한 DMSO 만을 첨가함) 시험 물질이 아브시스산인 경우와 비교하였을 때, 시험 물질이 트랜스-제아틴 또는 Ic3-4 인 경우에서 방사능이 감소하였다.
실시예 20 (담수직파시험에 있어서 종자처리한 사이토카이닌 신호전달을 저해할 수 있는 물질의 벼 입묘 촉진 활성의 평가)
벼 (Oryza sativa japonica Nipponbare) 의 종자를 실시예 7 에서 선발한 화 학 물질 Ic3-1 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해함) 로 처리하고 직파 조건으로 성장시켰다. 그 후, 입묘율을 검사함에 따라, 화학 물질의 벼 입묘-촉진 활성을 평가하였다.
우선, 5%(v/v) Color Coat Red (BECKER UNDERWOOD 제조), 5%(v/v) CF-Clear (BECKER UNDERWOOD 제조) 및 0.42% (v/v) Maxim-XL (Syngenta 제조) 를 함유하는 블랭크 슬러리 용액을 제조하였다. 1.3 ml 의 블랭크 슬러리 용액에, 화학 물질 Ic3-3 6.25 mg, 12.5 mg, 25 mg 또는 50 mg 을 용해하였다. Hege11 종자 처리 장치 (Hans-Ulrich Hege 제조)를 사용하여, 종자 50 g 당 1.3 ml 의 양의 용액으로 종자를 처리하였다(0.125 mg, 0.25 mg, 0.5 mg 및 1 mg/g 종자에 상응함).
그 후, 야외에 설치된 콘크리트 팟 (50 cm × 50 cm)에, 담수 깊이 5 cm 로 설정하고, 팟 당 종자 50 개를 뿌렸다. 뿌린 후 23 일에, 엽단(leaf apex)이 수면에 나타나는 묘목의 수를 조사하였다. 그 결과, 블랭크 슬러리-처리군에 비해, 입묘율이 종자 처리 농도가 0.125 내지 1 mg/g 종자로 증가하였다. 각 처리군 (4 회 반복) 의 시험 결과 (평균)을 표 13 에 나타내었다.
[입묘율 (%)] = [엽단이 수면에 나타나는 묘목의 수]/ [뿌린 종자의 수] ×100
[표 13]
Figure 112009030583530-PCT00028
실시예 21 (건전직파시험으로 종자 처리한 사이토카이닌 신호전달을 저해하는 물질의 벼 분얼-촉진 활성 평가)
벼 (Oryza sativa japonica Nipponbare) 의 종자를 실시예 7 에서 선별한 (세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는) 화학 물질 Ic3-1 로 처리하고, 건전-조건에서 직파로 성장시켰다. 그 후, 분얼의 수를 조사하여, 화학 물질의 분얼-촉진 활성을 평가하였다.
우선, 5%(v/v) Color Coat Red (BECKER UNDERWOOD 제조), 5%(v/v) CF-Clear (BECKER UNDERWOOD 제조) 및 0.42% (v/v) Maxim-XL (Syngenta 제조) 를 함유하는 블랭크 슬러리 용액을 제조하였다. 1.3 ml 의 블랭크 슬러리 용액에, 화학 물질 Ic3-3 12.5 mg 을 용해하였다. Hege11 종자 처리 장치 (Hans-Ulrich Hege 제조)를 사용하여, 종자 50 g 당 1.3 ml 의 양의 용액으로 종자를 처리하였다 (0.25 mg/g 종자에 상응함).
그 후, 처리한 종자를 1/5000a 와그너팟에 팟 당 20 종자씩, 깊이 1 cm 로 뿌리고, 온실에서 배양하였다. 뿌린 후 10 일에, 담수 깊이 5 cm 로 설정하고 물을 채우고, 계속 배양하였다. 뿌린 후 30 일에, 분얼 수를 조사하였다. 그 결과, 스톡 당 분얼의 수는 블랭크 슬러리-처리군에 비해 증가하였다. 각 처리군 (3 회 반복) 의 시험 결과 (평균)을 표 11 에 나타내었다.
이후, 본 발명에 사용한 화합물 (XI) 을 합성예 및 참조 합성예에서 더욱 구체적으로 기재할 것이나, 화합물 (XI) 이 이에 한정되지 않는다.
합성예 및 참조 합성예에서, "실온" 은 보통 10 내지 30 ℃ 의 온도를 의미한다. "1H NMR" 은 프로톤 자기 공명 분광을 의미한다. 내부표준으로서 테트라메틸실란을 사용하여, 분광계 (400 MHz), Model JNM-AL400 (JEOL Ltd. 제조)으로 측정하고, 화학 이동 (δ) 을 ppm 으로 표현하였다. "Mp" 는 용융점을 의미하고, 용융점 측정계, Model Mettler FP61로 측정하였다.
하기 합성예, 참조 합성예 및 표 2, 3, 4 및 5 에 사용된 약어는 하기 의미를 갖는다. CDCl3: 중수소화 클로로포름, DMSO-d6: 중수소화 디메틸 설폭시드, s: 단일항, d: 이중항, t: 삼중항, q: 사중항, dd: 이중 이중항, m: 다중항, br: 폭넓이, J: 결합 상수, Me: 메틸, Et: 에틸, Pr: 프로필, i-Pr: 이소프로필, t-Bu: 3차 부틸, Ph: 페닐, Ac: 아세틸, THF: 테트라히드로푸란, DMF: N,N-디메틸포름아미드, DMSO: 디메틸 설폭시드 및 MTBE: 메틸 3차 부틸 에테르.
합성예 12 (2-아미노-6,8-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ie-4) 의 제조)
300 mg 의 2,6,8-트리클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. II-5), 30 g 의 28% 암모니아 수용액 및 6 ml 의 아세토니트릴의 혼합물을 내압 반응용기에서 105 ℃ 로 1.5 시간 동안 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 냉각시키고 나서 100 ml 의 물에 부었다. 혼합물을 60 ml 의 에틸 아세테이트로 추출하고 생성된 추출물을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (클로로포름)로 정제하여 표제 화합물 230 mg 을 수득하였다. Mp. 212.7 ℃. 1H NMR (CDCl3): 5.56 (2H, br. s), 7.54-7.60 (3H, m), 7.63-7.68 (2H, m), 7.74 (1H, d, J = 2.3 Hz), 7.79 (1H, d, J = 2.3 Hz).
합성예 13 (6-클로로-2-푸르푸릴아미노-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ib-8)의 제조)
2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. II-2) 275 mg 및 푸르푸릴아민 486 mg 의 혼합물을 85 ℃ 에서 40 분 동안 교반하고 나서, 물 50 ml 에 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 생성된 추출물을 물로 세척하고 농축하였다. 생성된 잔여물을 에탄올로부터 재결정하고 표제 화합물 280 mg 을 수득하였다. Mp.142.0 ℃. 1H NMR (CDCl3): 4.77 (2H, d, J = 5.6 Hz), 5.70 (1H, br. t, J = 5.6 Hz), 6.29-6.32 (2H, m), 7.36 (1H, dd, J = 1.8, 0.9 Hz), 7.53-7.70 (7H, m), 7.78 (1H, d, J = 2.2 Hz).
합성예 14 (6-클로로-2-에톡시카르보닐메틸아미노-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ib-15)의 제조)
2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. II-2) 550 mg 및 글리신 에틸 에 스테르 히드로클로라이드 419 mg 에 DMF 3 ml 및 트리에틸아민 607 mg 을 첨가하고, 85 ℃ 에서 5.5 시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 용액을 물 100 ml 에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고 나서, 추출물을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산: 에틸 아세테이트 = 6:1 내지 3:1) 로 정제하여 표제 화합물 503 mg 을 수득하였다. Mp.146.1 ℃. 1H NMR (CDCl3): 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz), 4.25 (2H, q, J = 7.2 Hz), 4.31 (2H, d, J = 5.2 Hz), 5.97 (1H, br. s), 7.54-7.63 (5H, m), 7.67-7.70 (2H, m), 7.79 (1H, s).
합성예 15 (6-클로로-2-포름아미도-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. Ib-17)의 제조)
건조 포름아미드 54 mg 의 DMF (5 ml) 용액에 수소화나트륨 (60%) 48 mg 을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 275 mg 의 2,6-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. II-2)을 첨가하고, 85 ℃ 까지 가온하고, 3 시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 용액을 100 ml 의 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고 나서, 추출액을 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트: 헥산 = 1:3) 로 정제하여 64 mg 의 표제 화합물을 수득하였다. Mp. 252.1 ℃. 1H NMR: 7.59-7.66 (3H, m), 7.72-7.81 (3H, m), 7.88 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.02 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.37 (1H, br. d, J = 10.4 Hz), 9.71 (1H, d, J = 10.4 Hz).
전술한 합성예와 동일한 방식으로 제조할 수 있는 화합물의 예를 표 14 및 표 15 에 나타냈다 (전술한 합성예에서 제조한 화합물을 포함). 표 14 및 표 15 의 주석 "a)", "b)" 및 "c)" 는 하기와 같다.
a) 1H NMR (CDCl3): 1.66-1.75 (1H, m), 1.86-2.08 (3H, m), 3.57-3.64 (1H, m), 3.75-3.83 (2H, m), 3.89-3.59 (1H, m), 4.13-4.20 (1H, m), 5.70 (1H, br. s), 7.52-7.60 (5H, m), 7.64-7.69 (2H, m), 7.75-7.76 (1H, m).
b) 1H NMR (CDCl3): 1.22 (3H, t, J = 7.0 Hz), 3.55 (2H, q, J = 7.0 Hz), 3.68 (2H, t, J = 5.2 Hz), 3.78 (2H, q-형, J = 5.2 Hz), 5.75 (1H, br. t), 7.53-7.60 (5H, m), 7.65-7.69 (2H, m), 7.75-7.77 (1H, m).
c) 1H NMR (CDCl3): 1.22 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.96 (2H, 오중항, J = 6.3 Hz), 3.50 (2H, q, J = 7.0 Hz), 3.58 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.67 (2H, q-형, J = 6.3 Hz), 5.65 (1H, br. t), 7.53-7.60 (5H, m), 7.65-7.69 (2H, m), 7.74-7.76 (1H, m).
[표 14]
Figure 112009030583530-PCT00029
[표 15]
Figure 112009030583530-PCT00030
참조 합성예 3 (2,8-디클로로-4-페닐퀴나졸린 (화합물 No. II-4)의 제조)
1.24 g 의 8-클로로-4-페닐-2(1H)-퀴나졸리논 (화합물 No. IV-4)에 6.65 의 옥시염화 인을 첨가하고, 95 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 용액을 200 ml 의 얼음물에 넣고, 여기에 나트륨 바이카르보네이트를 첨가하고, pH 9 로 조절하였다. 그 후, 침전된 결정을 여과하여 수집하고, 에탄올로부터 재결정하여 표제 화합물 1.07 g 을 수득하였다. Mp.154.4.℃. 1H NMR (CDCl3): 7.52-7.65 (4H, m), 7.76-7.80 (2H, m), 8.02-8.08 (2H, m).
전술한 바와 같이 참조 합성예 3 와 동일한 방식으로 제조한 화합물의 예를 표 16 에 나타냈다 (또한 참조 합성예 3 에서 제조한 화합물 포함).
[표 16]
Figure 112009030583530-PCT00031
참조 합성예 4 (8-클로로-4-페닐-2(1H)-퀴나졸리논 (화합물 No. IV-4))의 제조)
7.10 g 의 페닐마그네슘 브로마이드 (32% THF 용액)에 2-아미노-3-클로로벤조니트릴 953 mg 의 THF (7 ml) 용액을 실온에서 적가하고, 30 분 동안 환류하면서 가열하였다. 상기 생성된 반응 생성물에 885 mg 의 메틸 클로로카르보네이트를 얼음 냉각하에 적가하고, 40 분 동안 환류하면서 가열하였다. 생성된 반응 용액을 냉각시키고, 40 ml 의 2N-염산에 붓고, 여기에 8 g 의 나트륨 바이카르보네이트 및 20 ml 의 MTBE 를 첨가하고, 교반하였다. 그 후, 침전된 결정을 여과하 고 수집하여 1.30 g 의 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6): 7.24(1H, t, J = 8.0 Hz), 7.57-7.70 (6H, m), 7.90-7.93 (1H, m), 11.45 (1H,br. s).
참조 합성예 5 (4-페닐-6-트리플루오로메틸-2(1H)-퀴나졸리논 (화합물 No. IV-7))의 제조)
10 ml 클로로포름 중의 762 mg 의 2-아미노-5-트리플루오로메틸벤조페논의 용액에, 349 mg 의 트리에틸아민을 적가하고 나서, 627 mg 의 트리클로로아세틸 클로라이드를 얼음 냉각하면서 첨가하였다. 30 분 동안 동일한 온도에서 교반한 후, 50 ml 의 물을 첨가하고, 층을 분리하였다. 유기층을 수집하고, 농축하였다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산: 에틸 아세테이트 = 5:1)로 정제하여 1.08 g 의 2'-벤조일-2,2,2-트리클로로-4'-트리플루오로메틸아세트아닐리드를 수득하였다. 1H NMR (CDCl3): 7.53-7.58 (2H, m), 7.66-7.75 (3H, m), 7.90-7.95 (2H, m), 8.81 (1H, d, J = 8.6 Hz), 12.38 (1H, br. s).
1.08 g 의 2'-벤조일-2,2,2-트리클로로-4'-트리플루오로메틸아세트아닐리드, 10 ml 의 DMSO 및 1.18 g 의 암모늄 아세테이트의 혼합물을 75 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 냉각 후, 100 ml 의 물을 혼합물에 첨가하였다. 침전된 결정을 여과하여 수집하였다. 수집한 물질을 헥산: 에틸 아세테이트 = 1:1 의 혼합물에 용해하고, 무수 황산 마그네슘으로 탈수시키고, 농축하여 표제 화합물 765 mg 을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3): 7.58-7.68 (3H, m), 7.75 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.79-7.83 (2H, m), 7.93 (1H, dd, J = 8.8, 1.7 Hz), 8.17 (1H, br. s), 13.37 (1H, br. s).
전술한 바와 같이 참조 합성예 4 와 동일한 방식으로 제조할 수 있는 화합물의 예를 표 17 에 나타내었다 (또한 전술한 참조 합성예 4 에서 제조한 화합물을 포함함). 표 17 의 주석 "a)" 내지 "g)" 는 하기와 같다.
a) 1H NMR (DMSO-d6): 7.27 (1H, dd, J = 7.7, 1.0 Hz), 7.38 (1H, dd, J = 8.3, 1.1 Hz), 7.43-7.55 (5H, m), 7.69 (1H, t, J = 8.1 Hz), 12.18 (1H, br. s).
b) (분리 및 정제 없음)
c) 참조 합성예 4 에 기재한 1H NMR
d) 1H NMR (DMSO-d6): 7.52-7.72 (6H, m), 8.10-8.12 (1H, m), 11.69 (1H, br. s).
e) 1H NMR (DMSO-d6): 7.35 (1H, d, J = 9.2 Hz), 7.59-7.71 (6H, m), 7.91 (1H, dd, J = 9.2, 2.2 Hz), 12.08 (1H, br. s).
f) 참조 합성예 5 에 기재한 1H NMR
g) 1H NMR (DMSO-d6): 7.48 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.60-7.68 (3H, m), 7.71-7.74 (2H, m), 8.05 (1H, s), 8.08-8.12 (1H, m), 12.36 (1H, br. s).
[표 17]
Figure 112009030583530-PCT00032
실시예 22 (뿌리 성장-촉진 활성 시험)
하기 조성을 갖는 엔시 표준 배지를 제조하였다 (표 18 참조). 클러스터 튜브에 화학 물질의 DMSO 용액을 4 μl 씩, 최종 농도가 0.001 ppm 내지 10 ppm 이 되도록 분배하고, 살균 엔시 표준 배지 600 μl 씩 분배하였다. 그 후, 생성한 용액을 잘 혼합하였다. 각 클러스터 튜브에, 애기장대 종자 10-20 개를 뿌리고, 밝은 곳에서 22 ℃ 로 10 일 동안 배양하였다. 그 후, 애기장대의 종자에서 발생한 주근의 길이 (평균 주근)를 측정하였다. 8 번 반복한 평균을 측정하고, 하기 식에 따라 뿌리 성장률을 측정하였다. 그 결과, 상당한 뿌리 성장률 (예를 들어, 120% 이상의 뿌리 성장률)을 나타낸 화학 물질을 뿌리 성장-촉진 활성을 갖는 것으로 판정할 수 있다.
상세한 결론으로서, 최고 뿌리 성장률을 나타낸 최종 농도를 표 19 에 나타 내었다.
뿌리 성장률 (%) = (화학 물질-처리군의 평균 주근 길이)/ (대조군의 평균 주근 길이) ×100
하기 조성 (표 18) 을 갖는 엔시 표준 배지 제조하였다. 화학 물질의 DMSO 용액을 4 μl 씩 클러스터 튜브에 최종 농도가 0.001 ppm 내지 10 ppm 이 되도록 분배하고 살균한 엔시 표준 배지를 600 μl 씩 분배하여 생성한 용액을 잘 혼합하였다. 클러스터 튜브당 애기장대 종자 10-20 개를 클러스터 튜브에 뿌렸다. 22 ℃ 에서 10 일 동안 밝은 곳에서 배양한 후, 애기장대 종자로부터 얻은 주근의 길이 (평균 주근) 를 측정하였다. 8 번 반복한 평균을 측정하고, 뿌리 성장률을 측정하였다. 그 결과, 상당한 뿌리 성장률 (예를 들어, 뿌리 성장률이 120% 이상)을 나타내는 화학 물질은 뿌리 성장-촉진 활성이 있는 화학 물질인 것으로 평가될 수 있다.
상세한 결론으로서, 상기 최종 농도에서 최고 뿌리 성장률을 나타낸 값을 표 19 에 나타내었다.
뿌리 성장률 (%) = (화학 물질-처리군의 평균 주근 길이)/(대조군의 평균 주근 길이) ×100
[표 18]
Figure 112009030583530-PCT00033
[표 19]
Figure 112009030583530-PCT00034
이하, 본 발명에 사용한 배지의 조성은 하기와 같다.
(a) DOLU + Glu 배지
아미노산이 없는 Bacto-효모 질소 염기 6.7g
글루코스 20 g
SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene 사) 1.66 g
히스티딘 0.076g
증류수 1000 ml
(b) DOLU + Gal 배지
아미노산이 없는 Bacto-효모 질소 염기 6.7g
글루코스 20 g
SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene 사) 1.66 g
히스티딘 0.076g
증류수 1000 ml
본 발명에 따라, 식물의 성장 또는 분화를 제어하는 제제 및 표적이 명확한 유용한 생물활성을 갖는 화학 물질을 탐색하는 방법, 즉 표적부위를 화학적으로 제어하기 위해 지표로서 특정 표적에 대한 활성을 사용하여 화학 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
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Cys Asp Gln 130 135 140 Arg Ala Arg Met Leu Gln Asp Gln Phe Ser Val Ser Val Asn His Val 145 150 155 160 His Ala Leu Ala Ile Leu Val Ser Thr Phe His Tyr His Lys Asn Pro 165 170 175 Ser Ala Ile Asp Gln Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Thr Ala Arg Thr Ala 180 185 190 Phe Glu Arg Pro Leu Leu Ser Gly Val Ala Tyr Ala Glu Lys Val Val 195 200 205 Asn Phe Glu Arg Glu Met Phe Glu Arg Gln His Asn Trp Val Ile Lys 210 215 220 Thr Met Asp Arg Gly Glu Pro Ser Pro Val Arg Asp Glu Tyr Ala Pro 225 230 235 240 Val Ile Phe Ser Gln Asp Ser Val Ser Tyr Leu Glu Ser Leu Asp Met 245 250 255 Met Ser Gly Glu Glu Asp Arg Glu Asn Ile Leu Arg Ala Arg Glu Thr 260 265 270 Gly Lys Ala Val Leu Thr Ser Pro Phe Arg Leu Leu Glu Thr His His 275 280 285 Leu Gly Val Val Leu Thr Phe Pro Val Tyr Lys Ser Ser Leu Pro Glu 290 295 300 Asn Pro Thr Val Glu Glu Arg Ile Ala Ala Thr Ala Gly Tyr Leu Gly 305 310 315 320 Gly Ala Phe Asp Val Glu Ser Leu Val Glu Asn Leu Leu Gly Gln Leu 325 330 335 Ala Gly Asn Gln Ala Ile Val Val His Val Tyr Asp Ile Thr Asn Ala 340 345 350 Ser Asp Pro Leu Val Met Tyr Gly Asn Gln Asp Glu Glu Ala Asp Arg 355 360 365 Ser Leu Ser His Glu Ser Lys Leu Asp Phe Gly Asp Pro Phe Arg Lys 370 375 380 His Lys Met Ile Cys Arg Tyr His Gln Lys Ala Pro Ile Pro Leu Asn 385 390 395 400 Val Leu Thr Thr Val Pro Leu Phe Phe Ala Ile Gly Phe Leu Val Gly 405 410 415 Tyr Ile Leu Tyr Gly Ala Ala Met His Ile Val Lys Val Glu Asp Asp 420 425 430 Phe His Glu Met Gln Glu Leu Lys Val Arg Ala Glu Ala Ala Asp Val 435 440 445 Ala Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro 450 455 460 Met Asn Gly Ile Leu Gly Met Leu Ala Met Leu Leu Asp Thr Glu Leu 465 470 475 480 Ser Ser Thr Gln Arg Asp Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Val Cys Gly Lys 485 490 495 Ala Leu Ile Ala Leu Ile Asn Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu 500 505 510 Ala Gly Lys Leu Glu Leu Glu Ser Val Pro Phe Asp Ile Arg Ser Ile 515 520 525 Leu Asp Asp Val Leu Ser Leu Phe Ser Glu Glu Ser Arg Asn Lys Gly 530 535 540 Ile Glu Leu Ala Val Phe Val Ser Asp Lys Val Pro Glu Ile Val Lys 545 550 555 560 Gly Asp Ser Gly Arg Phe Arg Gln Ile Ile Ile Asn Leu Val Gly Asn 565 570 575 Ser Val Lys Phe Thr Glu Lys Gly His Ile Phe Val Lys Val His Leu 580 585 590 Ala Glu Gln Ser Lys Asp Glu Ser Glu Pro Lys Asn Ala Leu Asn Gly 595 600 605 Gly Val Ser Glu Glu Met Ile Val Val Ser Lys Gln Ser Ser Tyr Asn 610 615 620 Thr Leu Ser Gly Tyr Glu Ala Ala Asp Gly Arg Asn Ser Trp Asp Ser 625 630 635 640 Phe Lys His Leu Val Ser Glu Glu Gln Ser Leu Ser Glu Phe Asp Ile 645 650 655 Ser Ser Asn Val Arg Leu Met Val Ser Ile Glu Asp Thr Gly Ile Gly 660 665 670 Ile Pro Leu Val Ala Gln Gly Arg Val Phe Met Pro Phe Met Gln Ala 675 680 685 Asp Ser Ser Thr Ser Arg Asn Tyr Gly Gly Thr Gly Ile Gly Leu Ser 690 695 700 Ile Ser Lys Cys Leu Val Glu Leu Met Arg Gly Gln Ile Asn Phe Ile 705 710 715 720 Ser Arg Pro His Ile Gly Ser Thr Phe Trp Phe Thr Ala Val Leu Glu 725 730 735 Lys Cys Asp Lys Cys Ser Ala Ile Asn His Met Lys Lys Pro Asn Val 740 745 750 Glu His Leu Pro Ser Thr Phe Lys Gly Met Lys Ala Ile Val Val Asp 755 760 765 Ala Lys Pro Val Arg Ala Ala Val Thr Arg Tyr His Met Lys Arg Leu 770 775 780 Gly Ile Asn Val Asp Val Val Thr Ser Leu Lys Thr Ala Val Val Ala 785 790 795 800 Ala Ala Ala Phe Glu Arg Asn Gly Ser Pro Leu Pro Thr Lys Pro Gln 805 810 815 Leu Asp Met Ile Leu Val Glu Lys Asp Ser Trp Ile Ser Thr Glu Asp 820 825 830 Asn Asp Ser Glu Ile Arg Leu Leu Asn Ser Arg Thr Asn Gly Asn Val 835 840 845 His His Lys Ser Pro Lys Leu Ala Leu Phe Ala Thr Asn Ile Thr Asn 850 855 860 Ser Glu Phe Asp Arg Ala Lys Ser Ala Gly Phe Ala Asp Thr Val Ile 865 870 875 880 Met Lys Pro Leu Arg Ala Ser Met Ile Gly Ala Cys Leu Gln Gln Val 885 890 895 Leu Glu Leu Arg Lys Thr Arg Gln Gln His Pro Glu Gly Ser Ser Pro 900 905 910 Ala Thr Leu Lys Ser Leu Leu Thr Gly Lys Lys Ile Leu Val Val Asp 915 920 925 Asp Asn Ile Val Asn Arg Arg Val Ala Ala Gly Ala Leu Lys Lys Phe 930 935 940 Gly Ala Glu Val Val Cys Ala Glu Ser Gly Gln Val Ala Leu Gly Leu 945 950 955 960 Leu Gln Ile Pro His Thr Phe Asp Ala Cys Phe Met Asp Ile 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gct ttg att gca ttg ata aat gag gtt ctt gat cgc gcc aag att gaa 1536 Ala Leu Ile Ala Leu Ile Asn Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu 500 505 510 gct gga aag ctg gag ttg gaa tca gta cca ttt gat atc cgt tca ata 1584 Ala Gly Lys Leu Glu Leu Glu Ser Val Pro Phe Asp Ile Arg Ser Ile 515 520 525 ttg gat gat gtc ctt tct cta ttc tct gag gag tca agg aac aaa ggc 1632 Leu Asp Asp Val Leu Ser Leu Phe Ser Glu Glu Ser Arg Asn Lys Gly 530 535 540 att gag ctc gcg gtt ttc gtt tca gac aaa gta cca gag ata gtc aaa 1680 Ile Glu Leu Ala Val Phe Val Ser Asp Lys Val Pro Glu Ile Val Lys 545 550 555 560 gga gat tca ggg aga ttt aga cag ata atc ata aac ctt gtt gga aat 1728 Gly Asp Ser Gly Arg Phe Arg Gln Ile Ile Ile Asn Leu Val Gly Asn 565 570 575 tcg gtt aaa ttc aca gag aaa gga cat atc ttt gtt aaa gtc cat ctt 1776 Ser Val Lys Phe Thr Glu Lys Gly His Ile Phe Val Lys Val His Leu 580 585 590 gcg gaa caa tca aaa gat gaa tct gaa ccg aaa aat gca ttg aat ggt 1824 Ala Glu Gln Ser Lys Asp Glu Ser Glu Pro Lys Asn Ala Leu 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Arg Gly Gln Ile Asn Phe Ile 705 710 715 720 agc cgg cct cat att gga agc acg ttc tgg ttc acg gct gtt tta gag 2208 Ser Arg Pro His Ile Gly Ser Thr Phe Trp Phe Thr Ala Val Leu Glu 725 730 735 aaa tgc gat aaa tgc agt gcg att aac cat atg aag aaa cct aat gtg 2256 Lys Cys Asp Lys Cys Ser Ala Ile Asn His Met Lys Lys Pro Asn Val 740 745 750 gaa cac ttg cct tct act ttt aaa gga atg aaa gct ata gtt gtt gat 2304 Glu His Leu Pro Ser Thr Phe Lys Gly Met Lys Ala Ile Val Val Asp 755 760 765 gct aag cct gtt aga gct gct gtg act aga tac cat atg aaa aga ctc 2352 Ala Lys Pro Val Arg Ala Ala Val Thr Arg Tyr His Met Lys Arg Leu 770 775 780 gga atc aat gtt gat gtc gtg aca agt ctc aaa acc gct gtt gtt gca 2400 Gly Ile Asn Val Asp Val Val Thr Ser Leu Lys Thr Ala Val Val Ala 785 790 795 800 gct gct gcg ttt gaa aga aac ggt tct cct ctc cca aca aaa ccg caa 2448 Ala Ala Ala Phe Glu Arg Asn Gly Ser Pro Leu Pro Thr Lys Pro Gln 805 810 815 ctt gat atg atc tta gta gag aaa gat tca tgg att tca act gaa gat 2496 Leu Asp Met Ile Leu Val Glu Lys Asp Ser Trp Ile Ser Thr Glu Asp 820 825 830 aat gac tca gag att cgt tta ttg aat tca aga acc aac gga aac gtt 2544 Asn Asp Ser Glu Ile Arg Leu Leu Asn Ser Arg Thr Asn Gly Asn Val 835 840 845 cat cac aag tct ccg aaa cta gct cta ttc gca aca aac atc aca aat 2592 His His Lys Ser Pro Lys Leu Ala Leu Phe Ala Thr Asn Ile Thr Asn 850 855 860 tcg gag ttc gac aga gct aaa tcc gca gga ttt gca gat acg gta ata 2640 Ser Glu Phe Asp Arg Ala Lys Ser Ala Gly Phe Ala Asp Thr Val Ile 865 870 875 880 atg aaa ccg tta aga gca agc atg att ggg gcg tgt ctg caa caa gtt 2688 Met Lys Pro Leu Arg Ala Ser Met Ile Gly Ala Cys Leu Gln Gln Val 885 890 895 ctc gag ctg aga aaa aca aga caa caa cat cca gaa gga tca tca ccc 2736 Leu Glu Leu Arg Lys Thr Arg Gln Gln His Pro Glu Gly Ser Ser Pro 900 905 910 gca act ctc aag agc ttg ctt aca ggg aag aag att ctt gtg gtt gat 2784 Ala Thr Leu Lys Ser Leu Leu Thr Gly Lys Lys Ile Leu Val Val Asp 915 920 925 gat aat ata gtt aac agg aga gta gct gca gga gct ctc aag aaa ttt 2832 Asp Asn Ile Val Asn Arg Arg Val Ala Ala Gly Ala Leu Lys Lys Phe 930 935 940 gga gca gaa gtg gtt tgt gca gag agt ggt caa gtt gct ttg ggt ttg 2880 Gly Ala Glu Val Val Cys Ala Glu Ser Gly Gln Val Ala Leu Gly Leu 945 950 955 960 ctt cag att cca cac act ttc gat gct tgc ttc atg gat att caa atg 2928 Leu Gln Ile Pro His Thr Phe Asp Ala Cys Phe Met Asp Ile Gln Met 965 970 975 cca cag atg gac gga ttt gaa gca act cgt cag ata aga atg atg gag 2976 Pro Gln Met Asp Gly Phe Glu Ala Thr Arg Gln Ile Arg Met Met Glu 980 985 990 aag gaa gct aaa gag aag acg aat ctc gaa tgg cat tta ccg att cta 3024 Lys Glu Ala Lys Glu Lys Thr Asn Leu Glu Trp His Leu Pro Ile Leu 995 1000 1005 gcg atg act gcg gat gtg ata cac gcg acc tac gag gaa tgt ctg aaa 3072 Ala Met Thr Ala Asp Val Ile His Ala Thr Tyr Glu Glu Cys Leu Lys 1010 1015 1020 agt ggg atg gat ggt tac gtc tcc aaa cct ttt gaa gaa gag aat ctc 3120 Ser Gly Met Asp Gly Tyr Val Ser Lys Pro Phe Glu Glu Glu Asn Leu 1025 1030 1035 1040 tat aaa tcc gtt gcc aaa tca ttc aaa cct aat cct atc tca cct tcg 3168 Tyr Lys Ser Val Ala Lys Ser Phe Lys Pro Asn Pro Ile Ser Pro Ser 1045 1050 1055 tcg taa 3174 Ser <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 3 tcagatatga actgggcact caac 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 4 ctcaatgctt ttgttccttg actc 24 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 5 accatgaact gggcactcaa caatcatcaa g 31 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 6 ggattacgac gaaggtgaga taggattagg 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 7 cgggatccat gaactgggca ctcaacaatc atc 33 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 8 gctctagatt acgacgaagg tgagatagga ttag 34

Claims (50)

  1. 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제.
  2. 제 1 항에 있어서, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제가 식물 성장 조절제인 약제.
  3. 제 1 항에 있어서, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제가 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제인 약제.
  4. 제 1 항에 있어서, 식물의 성장 또는 분화를 제어할 수 있는 약제가 식물 세포의 분화를 제어할 수 있는 약제인 약제.
  5. 제 3 항에 있어서, 식물의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 눈의 성장을 제어할 수 있는 약제인 약제.
  6. 제 5 항에 있어서, 식물의 눈의 성장을 제어하는 것이 겨드랑눈 (axillary bud) 의 성장을 저해하는 것인 약제.
  7. 제 5 항에 있어서, 식물의 눈의 성장을 제어하는 것이 꽃눈 (flower bud) 의 성장을 저해하는 것인 약제.
  8. 제 3 항에 있어서, 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 입묘 (stand establishment) 를 촉진할 수 있는 약제인 약제.
  9. 제 3 항에 있어서, 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 분얼 (tillering) 을 촉진할 수 있는 약제인 약제.
  10. 제 3 항에 있어서, 식물체의 성장을 제어할 수 있는 약제가 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 약제인 약제.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체가 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체인 약제:
    <군 A>
    (a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성이 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포 및 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질의 접촉계에서 하기 군 A 로부터 선택된 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성인 약제:
    <군 A>
    (a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질.
  13. 유효 성분으로서, 세포의 식물-유래 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해할 수 있는 화학 물질, 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 식물 성장 조절제.
  14. 제 13 항에 있어서, 화학 물질이 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질, 및 화학 물질을 포함하는 접촉계에서 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는 식물 성장 조절제:
    <군 A>
    (a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질이 트랜스-제아틴인 식물 성장 조절제.
  16. 제 13 항에 있어서, 화학 물질이 접촉계에 존재하지 않는 경우에 비해, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 0.6 ppm 의 트랜스-제아틴 및 2 ppm 의 상기 화학 물질을 포함하는 접촉계에서 화학 물질이 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 저해하는 활성을 갖는 식물 성장 조절제;
    <군 A>
    (a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아 미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질.
  17. 제 13 항에 있어서, 화학 물질이 접촉계에 존재하지 않는 경우에 비해, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 0.6 ppm 의 트랜스-제아틴 및 2 ppm 의 화학 물질을 포함하는 접촉계에서 화학 물질이 하기의 군 A 로부터 선택된 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달을 90 % 이상 저해하는 활성을 갖는 식물 성장 조절제;
    <군 A>
    (a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질.
  18. 하기를 포함하는, 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질의 탐색 방법:
    (1) 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질 및 시험 물질을 포함하는 접촉계에서, 하기의 군 A 로부터 선택되는 사이토카이닌 수용체로부터의 세포내 신호전달의 양을 측정하는 첫 번째 단계; 및
    (2) 첫 번째 단계에서 측정된 세포내 신호전달의 양을 화학 물질의 부재 하의 세포내 신호전달의 양과 비교하여 수득된 차이를 기준으로 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질을 선택하는 두 번째 단계;
    <군 A>
    (a) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (b) 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환되는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (c) 서열 번호: 1 의 아미노산 서열과 45 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로 작용하는 활성을 갖는 단백질,
    (d) 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (e) 서열 번호: 2 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에 교배하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 사이토카이닌 수용체로서 작용하는 활성을 갖는 단백질.
  19. 제 18 항에 있어서, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포가 서열 번호: 1 의 아 미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환 세포인 탐색 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 사이토카이닌 수용체를 갖는 세포가 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환 효모 세포인 탐색 방법.
  21. 제 18 항, 제 19 항 또는 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카이닌 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질이 트랜스-제아틴인 탐색 방법.
  22. 유효 성분으로서, 제 18 항, 제 19 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 탐색 방법에 의해 선택된 화학 물질 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 식물 성장 조절제.
  23. 제 13 항, 제 14 항, 제 15 항, 제 16 항, 제 17 항 또는 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 식물 성장 조절제의 유효량을 식물 또는 식물의 서식 장소에 적용하는 것을 포함하는 식물 성장 조절 방법.
  24. 제 18 항, 제 19 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 탐색 방법에 의해 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질을 결정하고, 이와 같이 결정된 식물의 뿌리 성장을 촉진할 수 있는 화학 물질을 식물과 접촉시키는 것을 포함하는 식물 성장 조절 방법.
  25. 유효 성분으로서, 하기의 화학식 (I) 에 의해 나타나는 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 식물 성장 조절제:
    Figure 112009030583530-PCT00035
    (식 중, R 및 X 는 동일하거나 상이하고, 임의로 치환된 탄화수소기, NR1R2 에 의해 나타나는 기, OR3 에 의해 나타나는 기, S(O)mR4 에 의해 나타나는 기, 니트로기 또는 할로겐 원자를 나타내고,
    여기서, R1 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
    R2 는 수소 원자, 임의로 치환된 탄화수소기, NR5R6 에 의해 나타나는 기 (식 중, R5 및 R6 은 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 또는 OR7 에 의해 나타나는 기 (식 중, R7 은 수소 원자 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬기를 나타냄) 를 나타내거나, R1 및 R2 는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 시클릭 아미노기를 형성하고,
    R3 및 R4 각각은 임의로 치환된 탄화수소기를 나타내고,
    l 은 0 내지 1 의 정수를 나타내고,
    m 은 0 내지 2 의 정수를 나타내고,
    n 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,
    n 이 2 이상인 경우, 각 X 는 서로 동일하거나 상이하고,
    Ar 은 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 헤테로아릴기를 나타냄).
  26. 제 25 항에 있어서, l 이 1 이고, R 이 임의로 치환된 탄화수소기인 식물 성장 조절제.
  27. 제 25 항에 있어서, l 이 1 이고, R 이 할로겐 원자(들) 또는 옥소기(들) 로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인 식물 성장 조절제.
  28. 제 26 항에 있어서, 임의로 치환된 탄화수소기가 할로겐 원자(들) 또는 옥소기(들) 로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인 식물 성장 조절제.
  29. 제 25 항에 있어서, l 이 1 이고, R 이 NR1R2 에 의해 나타나는 기인 식물 성장 조절제.
  30. 제 29 항에 있어서, R1 이 수소 원자 또는 C1-3 알킬기를 나타내고, R2 가 수소 원자, 아미노기, C1-3 알킬아미노기, 디 C1-3 알킬아미노기, 아미디노기, C1-3 알콕시기, 페닐기, C1-3 아실기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내거나 (여기서 페닐기는 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 C1-3 알킬기로 임의로 치환되고, 상기 페닐기, 아실기, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 할로겐 원자, 히드록실기, C1-3 알콕시기, 히드록시 C1-3 알콕시기, 카르복실기, C1-3 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 아미노기, C1-3 알킬아미노기, 디 C1-3 알킬아미노기, 메르캅토기, C1-3 아실티오기, 시아노기, 푸릴기 및 테트라히드로푸릴기로부터 선택된 1 내지 3 개의 동일하거나 상이한 치환기로 임의로 치환됨), R1 및 R2 는 그들이 부착되는 질소 원자와 함께 피롤리디노기, 피페리디노기 또는 모르폴리노기를 형성하는 식물 성장 조절제.
  31. 제 29 항에 있어서, R1 이 수소 원자를 나타내고, R2 가 수소 원자, 포르밀기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내고, 여기서, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기가 히드록실기, 메톡시기, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 시아노기 및 푸릴기로부터 선택된 치환기(들) 로 임의로 치환되는 식물 성장 조절제.
  32. 제 25 항에 있어서, l 이 1 이고, R 이 OR3 에 의해 나타나는 기인 식물 성장 조절제.
  33. 제 32 항에 있어서, R3 이 아미노기로 임의로 치환된 C1-3 알킬기인 식물 성장 조절제.
  34. 제 25 항에 있어서, l 이 1 이고, R 이 S(O)mR4 에 의해 나타나는 기인 식물 성장 조절제.
  35. 제 34 항에 있어서, R4 가 아미노기 또는 히드록실기로 임의로 치환된 C1-3 알킬기이고, m 이 0 인 식물 성장 조절제.
  36. 제 25 항에 있어서, l 이 1 이고, R 이 할로겐 원자인 식물 성장 조절제.
  37. 제 36 항에 있어서, 할로겐 원자가 염소 원자인 식물 성장 조절제.
  38. 제 25 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, n 이 1 내지 2 이고, X 가 C1-3 알킬기, C1-3 알콕시기, C1-3 할로알킬기, 시아노기, 할로겐 원자 또는 니트 로기인 식물 성장 조절제.
  39. 제 38 항에 있어서, X 가 염소 원자, 브롬 원자 또는 니트로기이고, X 가 6-위치 및/또는 8-위치에 있는 식물 성장 조절제.
  40. 제 25 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, Ar 이 할로겐 원자(들) 또는 C1-3 알킬기(들) 로 임의로 치환된 페닐기인 식물 성장 조절제.
  41. 제 25 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 따른 식물 성장 조절제의 유효량을 식물 또는 식물의 서식 장소에 적용하는 것을 포함하는 식물 성장 조절 방법.
  42. 화학식 (XI) 에 의해 나타나는 화합물, 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112009030583530-PCT00036
    (식 중, Ph 는 페닐기를 나타내고, R11 은 수소 원자, 포르밀기, C1-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내고, 여기서, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 히드록실기, C1-3 알콕시기, C1-3 알콕시카르보닐기, 시아노기, 2-푸릴 기 및 2-테트라히드로푸릴기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고,
    m 은 0 내지 3 의 정수를 나타내고,
    n 은 0 내지 1 의 정수를 나타내고,
    m 및 n 중 하나 이상은 0 이 아니고,
    X1 및 X2 는 동일하거나 상이하고, 염소 원자, 브롬 원자, 트리플루오로메틸기, 시아노기 또는 니트로기를 나타내고,
    m 이 2 이상인 경우, 각 X1 은 서로 동일하거나 상이하고; 단,
    a) m 이 1 이고, X1 이 5-염소 원자 또는 7-염소 원자이고, R11 이 메틸기를 나타내는 경우, n 은 1 의 정수를 나타내거나,
    b) n 이 1 이고, 하기 조건 (1) 내지 (3) 중 어느 하나를 만족하는 경우, m 은 1 내지 3 의 정수를 나타냄:
    (1) X2 는 염소 원자이고, R11 은 수소 원자, 메틸기, 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기, 2,2-디메톡시에틸기 및 시아노메틸기로부터 선택된 기임,
    (2) X2 는 브롬 원자이고, R11 은 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기 및 2-메톡시에틸기로부터 선택된 기임, 및
    (3) X2 는 니트로기이고, R11 은 3-히드록시프로필기임).
  43. 제 42 항에 있어서, R11 이 수소 원자, 포르밀기, 메틸기, 에틸기, 2-히드록시에틸기, 2-메톡시에틸기, 푸르푸릴기, 메톡시카르보닐메틸기 또는 에톡시카르보닐메틸기를 나타내고, m 이 0 이고, n 이 1 이고, X2 가 염소 원자 또는 니트로기인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염.
  44. 제 42 항에 있어서, R11 이 수소 원자, 포르밀기, 메틸기, 에틸기, 2-히드록시에틸기, 3-히드록시프로필기, 2-메톡시에틸기, 푸르푸릴기, 메톡시카르보닐메틸기 또는 에톡시카르보닐메틸기를 나타내고, m 이 1 이고, n 이 1 이고, X1 이 8-염소 원자이고, X2 가 염소 원자 또는 니트로기를 나타내는 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염.
  45. 제 42 항에 있어서, m 이 1 내지 3 의 정수이고, n 이 0 인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염.
  46. 제 42 항에 있어서, R11 이 포르밀기, C4-6 알킬기, C3-6 알케닐기 또는 C3-6 알키닐기를 나타내거나 (여기서, 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기는 히드록실기(들) 또는 C1-3 알콕시기(들)로 임의로 치환됨), R11 이 C1-3 알콕시카르보닐메틸기, C1- 3 알콕시 C1-3 알킬기 또는 푸르푸릴기를 나타내고,
    m 이 0 이고,
    n 이 1 이고,
    X2 가 염소 원자인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염.
  47. 제 42 항에 있어서, n 이 1 인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염.
  48. 제 42 항에 있어서, m 이 1 내지 3 이고, n 이 1 인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염.
  49. 제 42 항, 제 45 항, 제 47 항 또는 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, R11 이 C1-3 알콕시카르보닐메틸기 또는 푸르푸릴기인 화합물 또는 그의 농학적으로 허용가능한 염.
  50. 제 42 항에 있어서, n 이 1 이고, X2 가 트리플루오로메틸기 또는 시아노기인 화합물.
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