WO2008049317A1 - Biphenyl acetate, preparation and uses thereof - Google Patents

Biphenyl acetate, preparation and uses thereof Download PDF

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WO2008049317A1
WO2008049317A1 PCT/CN2007/002830 CN2007002830W WO2008049317A1 WO 2008049317 A1 WO2008049317 A1 WO 2008049317A1 CN 2007002830 W CN2007002830 W CN 2007002830W WO 2008049317 A1 WO2008049317 A1 WO 2008049317A1
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tromethamine
injection
biphenyl
biphenyl acetate
test
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PCT/CN2007/002830
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Wenzhan Chen
Wei Wang
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Wenzhan Chen
Wei Wang
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/41—Preparation of salts of carboxylic acids
    • C07C51/412—Preparation of salts of carboxylic acids by conversion of the acids, their salts, esters or anhydrides with the same carboxylic acid part
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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Definitions

  • the invention relates to a biphenyl acetate salt and a preparation method and application thereof, in particular to a biphenyl acetic acid tromethamine salt and a preparation method and application thereof.
  • Biphenylacetic acid as an anti-inflammatory analgesic drug was marketed in Japan, Italy and other countries in 1993. It is used for analgesic and anti-inflammatory effects such as osteoarthritis, frozen shoulder, tenosynovitis, periorbital inflammation, muscle pain and soft tissue injury, and after alleviating trauma. Swelling pain.
  • biphenylacetic acid is insoluble in water, it can only be used as a topical drug, which seriously affects the promotion and use of the drug.
  • One of the objects of the present invention is to provide a novel biphenyl acetate, i.e., a biphenyl acetate tromethamine salt.
  • the biphenyl acetic acid tromethamine salt provided by the invention has the chemical formula:
  • Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of a benzacetic acid tromethamine salt.
  • the biphenylacetate tromethamine salt provided by the present invention is prepared by reacting biphenylacetic acid and tromethamine in an organic solvent to obtain a biphenyl acetate tromethamine salt.
  • the reaction process is as follows: In the above method, the benzacetic acid and tromethamine may be simultaneously added to the organic solvent, or the biphenylacetic acid may be first dissolved in the organic solvent, and then the tromethamine is added. Alternatively, the tromethamine may be first placed in an organic solvent, and then biphenylacetic acid may be added to carry out a reaction to obtain a biphenylacetate tromethamine salt.
  • the molar ratio of the benzacetic acid to the tromethamine is preferably 1:1.
  • any organic solvent capable of dissolving diphenylacetic acid can be used, such as an alcohol or a benzene solvent, of which methanol, absolute ethanol, acetone, n-butanol, benzene or toluene is preferred.
  • the reaction time may be 0. 5-2 hours.
  • the reaction time may be 0. 5-2 hours.
  • the step of purifying the biphenyl acetate tromethamine salt may also be included in the method.
  • the purification method is various, and the existing feasible purification methods can be used.
  • the powder was vacuum dried to give biphenyl acetate tromethamine salt.
  • the crystals were cooled below 0 ° C, and the crystals obtained were vacuum dried to obtain a biphenyl acetic acid tromethamine salt.
  • the second mode is preferred, and the purity and crystal form of the compound obtained by the method are good.
  • the yield of the biphenyl acetate tromethamine salt prepared by the above method is 85. 6-96%, and the purity is
  • a third object of the present invention is to provide a pharmaceutical use of biphenyl acetate tromethamine salt.
  • studies have shown that the biphenyl acetate tromethamine salt of the present invention has anti-inflammatory and/or analgesic and/or antipyretic effects.
  • the drug containing the biphenylacetate tromethamine as an active ingredient is a protective range of the present invention.
  • One or more pharmaceutically acceptable carriers may also be added to the above drugs as needed.
  • the carrier includes conventional diluents, excipients, fillers, binders, wetting agents, disintegrating agents, absorption enhancers, surfactants, adsorption carriers, lubricants, etc. in the pharmaceutical field, and may also be added if necessary. Agents, sweeteners, etc.
  • the medicament of the present invention can be prepared into various forms such as an injection (injection, lyophilized powder for injection or sterile powder for injection), tablets, powders, granules, capsules, oral liquids, ointments, creams and the like.
  • the above various dosage forms of the drug can be prepared according to a conventional method in the pharmaceutical field.
  • the amount of the above drug is generally 0. 8-3.
  • Figure 1 is the 'H-NMR spectrum of biphenyl acetate tromethamine salt
  • Figure 2 is an infrared spectrum of benzacetic acid tromethamine salt
  • Figure 3 is a mass spectrum of biphenyl acetate tromethamine salt
  • the melting point (mp ) of biphenyl acetate tromethamine was measured at 162-163 ° C (Gongyi City Yuhua Instrument X- 5 microscopic digital melting point tester, heating program: 2 ° C / min, determined by conventional methods) , yield (ratio of the actual amount of the final product to the theoretical yield in terms of the amount of the biphenylacetic acid) 91.6%.
  • the product was subjected to elemental analysis (theoretical value: C 64.9% H 6.9% N 4. 2% 0 24%; measured value: C 64. 1% H 7.3% N 3. 6% 0 25%).
  • the coupling of the nucleus is manifested as a unimodal signal.
  • 5 3. The 43 ppm 6H singlet should be mapped to 3 equivalent isolated CH 2 groups. In the molecular structure of the benzethene tromethamine salt, the CH 2 of the 18th, 19th, and 20th carbons are all attached to the 17th carbon, and the three CH 2 are in a completely equivalent position, so A peak; and because it is not coupled by other hydrogen nuclei, it only appears as a single-peak signal.
  • the broad peak of S 3. 43 ppm should correspond to three hydroxyl groups and protonated amino groups. Because these active hydrogens may combine with the water in the solvent, they show a broad peak. The integral value is not representative due to the presence of water.
  • the peak area is known to correspond to 3, 2, 2, and 2 hydrogens, respectively, from the high field to the low field.
  • Their peak shape can only be seen clearly in the three groups of peaks on the left: they are double, double and triple. Since the chemical shift determines that they are hydrogen on the aromatic ring, the splitting distance of the doublet peak is 8. 0 Hz.
  • the 7th and 8th peaks indicate that it is on the side of the benzene ring and there is hydrogen on the other side.
  • the position of the substituent, in the molecular structure is hydrogen at the position of H2/H6, H3/H5, H8/H12; the hydrogen of the triplet with a split spacing of 7.6 Hz is two on the benzene ring.
  • the side has a hydrogen position, and in the molecular structure is the hydrogen at the position of H9/H10/H11.
  • a medium-strong peak of the out-of-plane vibration ( ⁇ ) of the 10 0 -disubstituted benzene ring appears in the combined peak pattern of the overall peak pattern of a single substituted benzene ring in the 823. 4 cm"O 2000-1666 cm- 1 domain. It coincides with the superposition of a combined peak pattern of a disubstituted benzene ring.
  • the biphenyl acetate tromethamine salt was investigated in acetone, formamide, acetonitrile and methanol. , Solubility in ethanol, aqueous solution. Take the biphenyl acetate tromethamine salt, grind into fine powder, accurately weigh it, add solvent, observe at 25 ⁇ 2 °C for 5 min, shake for 30 seconds, observe the dissolution within 30 min. The experiment was repeated three times.
  • the melting point (mp) of biphenyl acetate tromethamine salt was measured at 163-164 ° C (Gongyi City Yuhua Instrument X-5 microscopic digital melting point tester, heating program: 2 ° C / min, conventional method determination ), yield (ratio of the actual amount of final product to theoretical yield based on the amount of biphenylacetic acid): 96.0%, elemental analysis of the product (theoretical value: C 64.9% H 6.9% N 4.2% 024%; measured value) : C 64.1% H 7.3% N 3.6% 025%) , the product is biphenyl acetate tromethamine salt, the purity is 99.2%.
  • biphenyl acetate tromethamine salt 28.5 g of biphenyl acetate tromethamine salt.
  • the mp of biphenyl acetate tromethamine was measured to be 163-164 ⁇ (Gongyi City Yuhua Instrument X-5 microscopic digital melting point tester, heating program: 2 ° C / min, determined by conventional methods), yield ( Based on the amount of biphenylacetic acid, the ratio of the actual amount of the final product to the theoretical yield is 85.6%.
  • the product is analyzed by elemental analysis (theoretical value: C64.9% H 6.9% N 4.2% 024%; measured value: C64.1%) H 8% ⁇ 3% N 3. 6% 0 25%), the product is biphenyl acetate tromethamine salt, the purity is 99.8%.
  • Example 4 Preparation of biphenyl acetate tromethamine injection
  • Example 2 1000 tablets of biphenyl acetate tromethamine prepared in Example 2 were accurately weighed according to the prescription amount, passed through a 100 mesh sieve, and added to a prescription amount of lactose which was dried at 80 ° C and passed through a 80 mesh sieve, and mixed. The content is checked, and after passing the test, the capsule No. 1 is obtained.
  • mice Female Kunming mice weighing 20-22 g were used. The pain sensitivity screening was first performed, and the mice were placed on a hot plate at 50.5 ° C ⁇ 0.5 ° C. The time experienced by the mouse hind paw was used as a pain counter. The thresholds were taken, and the jumpers and non-responders within 30 seconds were screened out. Sixty mice with pain-responsiveness were screened and randomly divided into five groups according to body weight, with 12 rats in each group. The experiment was carried out using the biphenyl acetate tromethamine injection of Example 4.
  • mice in each test group were given the corresponding drugs by tail vein injection, and the administration volume was 0.1 ml/lOg body weight, and the blank control group was given an equal volume of physiological saline.
  • the hairs of the mice were removed from the ankle joints of the hind paws with a depilatory agent and dried.
  • the pre-dose pain response threshold was determined in the same manner for each mouse.
  • the pain response threshold after each rat administration was measured, and the mouse was immediately removed from the hot plate after the hind paw.
  • the threshold of the pain response was measured again 2 h and 3 h after the administration, and the threshold of the pain response between the groups was subjected to t test to evaluate the analgesic effect.
  • mice in each dose group of the biphenyl acetate tromethamine injection are at lh.
  • the time of hindfoot in 2h and 3h was significantly longer than that in the blank control group, which increased the threshold of pain response, indicating that the biphenyl acetate tromethamine injection can significantly prolong the pain threshold time of the hot plate in mice, with significant analgesia. effect.
  • the low, medium, and high dose groups represent the low, medium, and high dose groups of biphenyl acetate tromethamine injection, respectively.
  • the corresponding drug was administered to the tail vein.
  • the dosage volume 0. lml/lOg
  • the model group was given an equal volume of physiological saline.
  • the mice were sacrificed by cervical vertebrae.
  • the area of the same part of the ears was cut with a hole punch of 8 mm in diameter, and the weight was weighed by a precision electronic balance.
  • the difference between the weight of the right ear piece and the weight of the left ear piece was For the degree of swelling.
  • NIH mice SPF grade, male and female, 15- 17g, 110, provided by Guangdong Medical Laboratory Animal Center, license number: SCXK (Yue) 2003-0002, Guangdong Supervisory Certificate 2006A017.
  • mice 110 NIH mice, male, weighing 15-17 g.
  • the body weight was randomly divided into 11 groups, 10 in each group, namely: model group, biphenyl acetate tromethamine injection No. 1, 2, 3, 4, 5 ( The dose of biphenyl acetate tromethamine salt was: 3, 6, 12, 24, 48 mg/kg), flupirtine injection No. 1, 2, 3, 4, 5 (fluorine The doses of pirfenac ester are: 3, 6, 12, 24, 48 mg/kg).
  • each mouse was given the corresponding drug in the tail vein, and the administration volume was 0. lml/10 g body weight, and the model group was given an equal volume of physiological saline.
  • HAc 0.5% (0.7g/100ml) was induced by intraperitoneal injection of 10mL/kg body weight 0.5 hours after administration, and then the writhing reaction of each mouse within 15 minutes was observed immediately, and the number of writhing was recorded, and the inhibition rate was calculated.
  • the ED50 and 95% confidence limits were: 6.3 (4.3-9.3) mg/ Kg; However, there was no significant difference in the number of writhing in mice between the corresponding dose groups of biphenyl acetate tromethamine injection and flupirtine injection. The results showed that the strength of the phenoxyacetate tromethamine injection and flupirtine injection against the writhing of NIH mice was similar to that of glacial acetic acid. These results suggest that the biphenyl acetate tromethamine injection has anti-ice. The effect of acetic acid on the writhing of NIH mice is similar to that of flupirtine injection. Effect of biphenylacetate tromethamine injection on writhing of NIH mice induced by glacial acetic acid
  • Preliminary clinical plan usage Intravenous infusion, 94mg/time, diluted to 100-200ml with 0.9% sodium chloride injection, 1-2 times a day.
  • Negative control 0.9% (0.9 g/100 ml) Sodium chloride injection.
  • Guinea pig a, grade, germline Ordinary FMMU guinea pig.
  • Weight and sex at the time of purchase 280-330g, male and female.
  • Source Certificate of conformity: Purchased from the Experimental Animal Center of Southern Medical University, animal production license number: SCXK (Yue) 2006-0015, Guangdong Supervisory Certificate 2006B007.
  • Guinea pig is one of the first choice animals for allergy test. Guidelines for Toxicity Research in China The technical guidelines for chemical irritant, allergic and hemolysis research are recommended.
  • test animals are quarantined before the test. During this period, the animals' appearance signs, behavioral activities, fecal traits and food intake were observed, and the diseased animals were removed in time. Animals are inspected and approved by the project leader and laboratory animal management personnel before use.
  • Marking method Using the dyeing method of the coat, use a saturated picric acid solution to coat the spots on different parts of the animal's body surface to show different numbers. Three guinea pigs per cage, grouped, and each cage was labeled with a cage.
  • Weight and sex at the time of purchase 2. 0-2. 2kg, half male and half female.
  • test animals New Zealand rabbits are one of the first choice animals for irritant testing. The guidelines for the study of toxicity in our country are recommended in the Technical Guidelines for Chemical Drug Irritant, Allergic and Hemolytic Research.
  • Quarantine process The same as the quarantine process of guinea pigs.
  • identification method The same method as guinea pig identification. Rabbits were housed separately and caged.
  • a. Word management Animals are raised and managed by personnel who have obtained the qualifications for the management of experimental animals.
  • Facility conditions, grades, and certificates Guinea pigs and rabbits are housed in the guinea pig room and rabbit room of the common animal room. The feeding conditions are in accordance with the requirements of the general-level animal experimental facilities, and the ventilation and light are good. Temperature 16- 26 ° C, humidity 40-70%, animal test environmental facilities certificate number is Guangdong inspection certificate: 2005C133, experimental animal use license number: SYXK (Yue) 2003- 0003 (2005 annual inspection qualified).
  • Feed and drinking water The feed is a general-purpose rabbit (guinea pig) compound feed, purchased from the Guangdong Medical Experimental Animal Center, and the preparation standards and nutritional requirements are in accordance with GB- 14924. 4-2001. Drinking water is tap water and free to ingest.
  • FMMU guinea pigs were randomly divided into 4 groups according to gender and body weight, and 6 males and 6 females in each group.
  • the negative control group, the positive control group and the biphenyl acetate tromethamine injection prepared in Example 4 were given low and high dose groups (7.5 and 22. , 1 ⁇ , the equivalent dose is approximately equivalent to 1 times and 3 times the clinical dose, respectively.
  • the drug was administered by intraperitoneal injection, and the administration volume was 0.5 ml/mouse, once every other day, three times in succession.
  • Sensitization dose negative control group, sodium chloride injection (0.9 g/100 ml); positive control group, 2% (2g/100ml) albumin solution; low dose group, 7.
  • Omg of biphenyl acetate tromethamine salt / mL The low concentration group of the drug is prepared as follows: Take the above concentration of 1. 0 mg / mL of the solution 2. 0mL, add 0. 9% (0. 9g / 100ml) sodium chloride solution to 6. 0raL, diluted to a concentration of 5. A solution of Omg biphenyl acetate tromethamine salt / mL.
  • the animals in each group were challenged on the 12th day after the last intraperitoneal injection, and administered intravenously.
  • the dose was 1.0 ml/mouse, and the challenge dose was 2 times the sensitizing dose. And observe the animal's reaction.
  • Dl, D5 and D17 represent the initial sensitization, the last sensitization and the body weight on the day of challenge.
  • D17 weight change value D17- Dl, "positive number” represents weight gain.
  • rabbit blood was taken and shaken for 10 minutes in a triangular flask containing glass beads to remove fibrinogen and defibrillated. Then, it is divided into several centrifuge tubes, each tube is added with about 10 times the amount of 0.9% sodium chloride injection, shaken, centrifuged (1500 rpm, 15 minutes), the supernatant is removed, and the precipitated red blood cells are reused. Wash 0.9% sodium chloride injection 2-3 times until the supernatant does not appear red. The obtained red blood cells were mixed with a 0.9% sodium chloride injection to prepare a 2% suspension for testing.
  • 1-5 tubes are for the test tube, the sixth tube is the negative control tube, and the seventh tube is the positive control tube.
  • the condensate is evenly dispersed after shaking in the test tube, or the aggregate is placed on the slide, add 2 drops of 0.9% sodium chloride injection on the edge of the cover slip, and observe under the microscope, the condensed red blood cells can be washed
  • the scattered person is a false agglomeration; if the aggregate is not shaken or not scattered on the slide, it is true.
  • test substance can be injected; if the test tube is in the tube The solution is hemolyzed and/or agglomerated within 3 hours, and the test substance is not suitable for injection.
  • Rabbit vascular irritation test 8 healthy New Zealand rabbits were used for the test.
  • the left and right ear veins were injected with the test drug at the left ear margin, and the administration volume was 5 ml/kg body weight.
  • the biphenyl acetate tromethamine injection prepared in Example 4 was administered at a dose of 3.15 mg/kg*bw and 9.4 mg/kg*bw, respectively, in the low-dose group and the high-dose group, respectively. 0.63 mg/mL and 1.88 mg/mL, which are 0.7-1.4 times and 2- 4 times the concentration of clinical intravenous infusion, and 0.9% (0.9g/100ml) sodium chloride injection in the right ear. For comparison, once a day for 3 consecutive days.
  • the low-dose group 30 mL of the above solution having a concentration of 1.88 mg/mL, diluted with 0.9% sodium chloride injection to 90. OmL, and diluted to a concentration of 0.63 mg/mL.
  • the reaction between the animal and the vascular injection site was observed and recorded before daily administration.
  • two New Zealand rabbits of high and low concentrations of the test drug were exsanguinated, and the vascular tissue reaction was visually observed and recorded.
  • Cut the rabbit ears from the root of the ear (cut the left ear first, then cut the right ear, and mark), and then cut a section of rabbit ear specimens and fix them in 10% neutral formaldehyde solution (the specimen is about 8cm long and about 1cm wide; The distal end cut is about 0. 5cm away from the first needle eye, the proximal end cut is about 2cm away from the third needle eye, and the hanging end is near the heart end).
  • the reaction of the vascular injection site of the animal was visually observed and recorded before daily administration.
  • the high and low concentrations of the test drug were observed to be red and the area of the inner and outer side of the vascular epithelium of the rabbit ear. From 0. lcm X O. 2cm to 0. 2cm X 1. 0cm.
  • the contours of the bilateral rabbit ear vessels of the four rabbits with high concentration and low concentration of the test drug were clear, and the thickness of the rabbit ears was uniform and there was no significant change. See Table 12 and Table 13 for details.
  • Four rabbits with high concentration and low concentration of the test drug were dissected 14 days after the last administration. The contours of the bilateral rabbit ear vessels were clear, and the thickness of the rabbit ears was uniform and there was no significant change.
  • the skin inside and outside the blood vessel at the needle site is red.
  • the blood vessel contour is clear, and the rabbit ears are even and thin.
  • the blood vessel contour is clear, the rabbit ears are evenly thin, and the blood vessel contour is not clear. The rabbit ears are even and thin, and no obvious changes are observed. Significant change.
  • the skin inside and outside the needle at the needle site was red.
  • the contour of the blood vessel was clear.
  • the thickness of the rabbit ear was even and thin. No (0. lcmX O. 2cm).
  • the contour of the blood vessel was clear and obviously changed.
  • Rabbit ears were evenly thick and showed no significant changes. 8
  • the skin inside and outside the needle at the needle site showed a clear red blood vessel contour, and the rabbit ears were even and thin.
  • the healthy white New Zealand white rabbits were injected into the left quadriceps muscle of the rabbits in the high concentration and low concentration, respectively, in the right quadriceps muscle injection of an equal volume of 0.9% Sodium chloride injection was used as a control.
  • the reaction between the animal and the intramuscular injection site was observed and recorded before daily administration. After the last administration for 48 hours, 2 animals of high and low concentrations of the test drug were taken, sacrificed by bloodletting, and the quadriceps were dissected and exposed longitudinally. Visually observe and record the irritative response at the injection site, The muscle at the injection site was then examined for histopathology. Two animals with high and low concentrations of each test drug were continuously observed until 14 days after the last administration, and the injection site pathological examination was performed.
  • Test results The test results are shown in Table 14, Table 15, Table 16 and Table 17 and pathological diagnosis report.
  • Injection site table deep muscle tissue texture rich injection site table, deep muscle tissue texture full of bombs
  • Example 4 This example demonstrates that the biphenyl acetate tromethamine salt injection of Example 4 (7.5 and 22.5 mg / kg, bw) is negative for the guinea pig systemic active allergy test; the biphenyl acetate tromethamine of Example 4 The alkoxide injection (0.63 and 1.88 mg/mL) was not irritating to the rabbit ear vein and surrounding tissues; the biphenyl acetate tromethamine injection of Example 4 (0.63 and 1.88 mg) /mL) No irritation to the muscle tissue of the rabbit injection site; the biphenyl acetate tromethamine injection (0.66 and 1.88 mg/mL) of Example 4 was negative for the rabbit hemolysis test in vitro.
  • Example 9 Acute toxicity test of biphenyl acetate tromethamine injection in mice
  • mice 19-21 g, male and female, were randomly divided into two groups: the drug-administered group and the adjuvant control group.
  • the administration volume 0.
  • the value should be much greater than 940 m g / kg (based on biphenyl acetate: 598 mg / kg), and ethyl biphenyl acetate (based on biphenyl acetate) intravenously injected mouse LD 5 .
  • ethyl biphenyl acetate based on biphenyl acetate intravenously injected mouse LD 5 .
  • males 337mg/kg, female 433mg/kg, biphenyl acetate tromethamine injection acute toxicity is greatly reduced, acute toxicity is also lower than similar aryl citrate non-inflammatory anti-inflammatory analgesics.
  • Example 10 Stability test of biphenyl acetate tromethamine injection
  • test results show that: This product is placed in high temperature (60 ° C), high humidity (relative humidity 92.5% ⁇ 5%) and light (4500 ⁇ 5001x) for 10 days, the indicators have no significant changes, indicating the quality of this product stable.
  • NIH mice were randomly divided into 2 groups according to body weight. After fasting for 24 hours, 333 mg/kg of biphenyl acetate tromethamine salt and 212 mg/kg of biphenylacetic acid were administered respectively. After 48 hours, the stomach was taken and fixed with 10% formaldehyde solution. The appetite was cut along the stomach and the incidence of ulcers was observed.
  • the experimental results are as follows:
  • the biphenylacetic acid tromethamine salt of the present invention is soluble in water, solving the problem of insoluble water in the presence of diphenylacetic acid. While solving the solubility, the present invention verifies the equivalence and anti-inflammatory effects of biphenylacetate tromethamine salt and ethyl phenylacetate, and the acute toxicity of the biphenyl acetate tromethamine salt Too much less than ethyl phenylacetate (see Example 9), the oral stimulating biphenyl acetate tromethamine salt was less than biphenylacetic acid (see Example 11).
  • the allergic reaction test was further carried out in accordance with the GLP test rules, no allergic reaction was found, and no shock caused by allergies was produced.
  • it is subjected to hemolysis and irritation test, and no hemolysis and muscle and vascular irritation are found, so it can be used as an injection.
  • the above experiments were carried out at the Guangzhou Institute of Pharmaceutical Industry, the key laboratory for the evaluation of new drug safety in the country, to ensure the reliability of the data.
  • As an injection application the use of macromolecular excipients in the production of emulsions is avoided.
  • Ethyl bromide injection is an emulsion, and the stability of the emulsion has always been a problem difficult for pharmacists to solve, such as rancidity, etc.
  • the present invention carried out a stability test of biphenyl acetate tromethamine injection for 3 months, The biphenyl acetate tromethamine injection was found to be stable.
  • the production process of the emulsion is complicated, and the production of biphenyl acetate tromethamine salt has been The process and the accessories used are simple and easy.
  • the preparation process of the biphenylacetic acid tromethamine salt of the invention is simple and feasible, the raw materials are easy to obtain, the reaction conditions are stable, the reaction yield is high, the product purity is high, and the medicinal biphenyl acetate tromethamine salt can be directly obtained. There is no serious "three wastes" pollution in the reaction.
  • Pharmacological experiments show that biphenyl acetate tromethamine injection has analgesic and anti-inflammatory effects and has no sensitizing effect on guinea pigs. Under the conditions of in vitro test, the biphenyl acetate tromethamine injection had no hemolysis effect on the red blood cells of Japanese white rabbits.
  • biphenyl acetate tromethamine injection acute toxicity is greatly reduced, acute toxicity is also lower than similar aryl phthalic acid non-steroidal anti-inflammatory analgesics.
  • Biphenyl acetate tromethamine salt is less irritating to the gastrointestinal tract than biphenylacetic acid, which is beneficial for taking.

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Description

一种联苯乙酸盐及其制备方法与应用 技术领域
本发明涉及一种联苯乙酸盐及其制备方法与应用， 特别涉及联苯乙酸 氨丁三醇盐及其制备方法与应用。
背景技术
联苯乙酸作为消炎镇痛药物 1993年在日本、 意大利等国上市， 用于变 形性关节炎、 肩周炎、 腱鞘炎、 腱周炎、 肌肉痛和软组织损伤等的镇痛消 炎， 及缓解外伤后肿胀疼痛。 但由于联苯乙酸不溶于水， 一般只能作为外 用药， 严重影响了该药物的推广使用。
在日本曾经有联苯乙酸乙酯注射乳剂 （不溶于水） 临床用于镇痛， 最 近由于曾经在临床上产生过休克现象， 生产厂家已经从市场上撤回了该品 种， 重新进行临床研究表明， 过敏是休克的主要原因之一，注射用乳剂的 辅料大豆磷脂可能是过敏原之一。而且， 作为乳剂， 该产品还有稳定性差、 生产工艺复杂、 大分子辅料容易带来不安全因素等缺点。
发明公开
本发明的目的之一是提供一种新的联苯乙酸盐， 即联苯乙酸氨丁三醇 盐。
本发明所提供的联苯乙酸氨丁三醇盐， 其化学式为：
Figure imgf000002_0001
CHOH
2 ( I ) 。 它的分子式为 C18H23N05， 分子量为 333. 14。
本发明的另一个目的是提供联苯乙酸氨丁三醇盐的制备方法。
本发明所提供的联苯乙酸氨丁三醇盐的制备方法， 是将联苯乙酸和氨 丁三醇在有机溶剂中反应， 得到联苯乙酸氨丁三醇盐。
该反应过程如下：
Figure imgf000003_0001
上述方法中， 所述联苯乙酸和氨丁三醇可同时加入所述有机溶剂中， 也可先将所述联苯乙酸溶于所述有机溶剂中， 再加入所述氨丁三醇， 当然 也可以先将氨丁三醇置于有机溶剂中， 然后再加入联苯乙酸， 进行反应得 到联苯乙酸氨丁三醇盐。
为了提高收率， 所述联苯乙酸和氨丁三醇的摩尔比最好为 1 : 1。
对于有机溶剂来说， 只要是能够溶解联苯乙酸的有机溶剂均可以使 用， 如醇类或苯类溶剂， 其中优选的为甲醇、 无水乙醇、 丙酮、 正丁醇、 苯或甲苯。
上述方法中， 对温度和时间并没有特殊要求， 一般反应温度在 0 - 80 °C之间均可， 优选为 50-70°C ; 反应时间可为 0. 5-2小时。
所述方法中还可包括纯化联苯乙酸氨丁三醇盐的步骤。
纯化的方法是多种多样的， 现有可行的纯化方式均可以使用， 下面是 两种典型的纯化方法， 其中一种是， 反应结束后， 浓縮蒸干溶剂得白色粉 末， 将所述白色粉末真空干燥得到联苯乙酸氨丁三醇盐。 另一种是， 反应 结束后， 0'C以下冷却结晶， 所得晶体真空干燥得到联苯乙酸氨丁三醇盐。 其中第二种方式是优选的， 利用该方法得到的化合物纯度及晶形较好。
上述方法制备的联苯乙酸氨丁三醇盐产率为 85. 6-96%, 纯度为
99. 2-99. 8%, 溶于水， 熔点 162- 163° (：。
本发明的第三个目的是提供联苯乙酸氨丁三醇盐在制药中的应用。 研究表明， 本发明的联苯乙酸氨丁三醇盐具有抗炎和 /或镇痛和 /或解 热作用。 以该联苯乙酸氨丁三醇盐为活性成分的药物为本发明的保护范 围。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体、 润滑剂等， 必要时还可以加 入香味剂、 甜味剂等。 本发明的药物可以制成注射剂 （注射液、 注射用冻干粉或注射用无菌粉 针） 、 片剂、 粉剂、 粒剂、 胶囊、 口服液、 膏剂、 霜剂等多种形式。 上述各 种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为 0. 8-3. Omg联苯乙酸氨丁三醇盐 /kg体重 /天。
附图说明
图 1为联苯乙酸氨丁三醇盐 'H- NMR图谱
图 2为联苯乙酸氨丁三醇盐红外谱图
图 3为联苯乙酸氨丁三醇盐质谱图
实施发明的最佳方式 下述实验方法， 如无特别说明， 均为常规方法。
实施例 1、 联苯乙酸氨丁三醇盐的制备
在一个干燥洁净的 250ml三口圆底烧瓶中， 加入联苯乙酸 （购自武汉 远程科技发展有限公司） 21. 2g ( 0. Imol ) 与 210ml甲醇加热至 60°C搅拌 至全溶， 在 60°C加入氨丁三醇 （购自江阴市倪家巷化工有限公司）
12. lg (0. Imol) , 混合溶液至澄清透明， 在此条件下搅拌反应 1小时， TLC 检测反应完全 （展开剂： DMF-乙酸乙酯 （2: 1 ) ， 以联苯乙酸原料点完全 消失为反应终点） 。 于 -5°C冷却 5小时析出大量白色结晶， 抽滤， 于 80 °C真空干燥得到 30. 5g白色结晶性联苯乙酸氨丁三醇盐。 测得联苯乙酸氨 丁三醇盐熔点 （mp ) 是 162-163°C (巩义市予华仪器 X- 5型显微数字熔点 测定仪， 升温程序： 2°C /min， 常规方法测定） ， 收率 （以联苯乙酸投料 量计， 终产品的实际量与理论产量的比值） 91. 6%。 产品经元素分析 （理 论值： C 64. 9% H 6. 9% N 4. 2% 0 24%； 实测值： C 64. 1% H 7. 3% N 3. 6% 0 25%) 。
联苯乙酸氨丁三醇盐 'H-NMR图谱 （图 1 ) 解析如下：
以 DMS0-d6为溶剂的 'H-NMR谱显示联苯乙酸氨丁三醇盐分子具有 8组 峰氢信号。 由 1 H- NMR谱的化学位移知， δ <4 ppm 的峰都是饱和碳上的氢 信号， 计有 14个； δ〉6 ppm的都是芳香环上的氢的信号， 计有 9个氢。 δ 3. 35 ppm的 2H单峰应该对应于孤立 CH2基团。在联苯乙酸氨丁三醇盐的 分子结构中， 第 13号碳 CH2邻接苯环和羧羰基 -COO—, 因为没有受到其它氢 核的偶合， 故表现为单峰信号。 5 3. 43 ppm的 6H单峰应该对映于 3个等 价的孤立的 CH2基团。 在联苯乙酸氨丁三醇盐的分子结构中， 第 18， 19， 20号碳的 CH2都连接到第 17号碳上， 这三个 CH2处于完全等价的位置， 故 只表现为一个峰；又因为没有受到其他氢核的偶合，故只表现为单峰信号。 S 3. 43 ppm表现的宽峰应该对应于三个羟基和质子化的氨基， 因为这些活 泼氢可能和溶剂中的水份结合， 故表现为宽大的峰， 由于水的存在使得积 分数值不能代表这些活泼氢的真实个数。 低场的互相分离的四组信号峰 中， 由峰面积知自高场到低场分别对应于 3、 2、 2、 2个氢。 它们的峰形 只有左边的三组峰可以看得很清楚： 分别为二重、 二重、 三重峰。 由于化 学位移决定了它们是芳香环上的氢，故二重峰的裂分间距为 8. 0 Hz的第 7、 第 8号峰表明它是处于苯环上一侧有氢另一侧无氢而是取代基的位置， 在 分子结构中则是 H2/H6、 H3/H5、 H8/H12的位置的氢； 裂分间距为 7. 6 Hz 的三重峰的氢则是处于苯环上的两侧都有氢的位置， 在分子结构中则是 H9/H10/H11的位置的氢.
联苯乙酸氨丁三醇盐红外 （IR ) 谱图 （图 2 ) 解析：
( 1 ) 从 1560. 13 cm—1的 C00—伸縮振动宽强峰和 2927. 41-2113. 60 cm 1 的 +NH3伸縮振动宽、 强、 发散的特征峰，可以判断分子结构中含有羧酸的铵 盐。 它能够以自由单体 -C00— ·Ν+Η3-的分子结构形式存在， 羧酸根阴离子、 铵盐阳离子也容易生成二聚体至多聚体分子之间的氢键， 其铵基 Ν+Η3和羧 羟基 0Η的伸缩振动频率出现于 2927. 41-2113. 60 cm" , 成为多重峰迭加、 峰形发散的强峰。
( 2 ) 3241. 94 cm—'的宽强峰是 0H的伸缩振动。 与 0H基团的相关联的 其它振动是 M23. 21和 1278. 57 cm"1的变形振动 （ δ 0H ) 、 690. 39 cm"1附 近的平面摇摆振动 （rOH) 。 1083. 80cm—1的强宽峰解释为 C-0的伸缩振动 ( vC-0) ， 表明羟基是直接连接于伯碳 CH2上的。
( 3 ) 2987〜2896 cm— '—系列的谱峰， 表明分子结构中存在有饱和碳 氢基团， 这些都是 CH3、 CH2等基团的不对称和对称伸縮振动。 同时， CH3、 CH2的变形振动吸收应该出现于 1467〜1367 cm— '区域。 尽管 NMR谱推导其 分子结构中不含有甲基， 但 IR的能够表明甲基缺失的 2965士、 1375± cnf' 附近区域都存在有其它峰的干扰， 即 IR不能明确排除甲基的存在。 ( 4) βΙΟΟ ΖθβΟ ιΓ1—系列的谱峰表明分子结构中存在有不饱和碳 的碳氢基团， 它们可能是苯环、 杂芳环或烯类结构。 1650〜1423 ιΓ'域内 的多个谱峰表明不饱和官能团 C=C、 C=N等的存在。 1201-977 crif'范围内 有苯环上=(¾基团的面内弯曲振动 （β ) 。 单取代苯环面外弯曲振动 （γ) 的两个强峰出现在 738. 6和 690. 39cm"1 0 对二取代苯环的面外振动 （γ) 的 一个中强峰出现在 823. 4 cm"O 2000-1666 cm—1域内的谱峰整体花样与一个 单取代苯环的组合峰花样和一个对二取代苯环的组合峰花样的叠加相吻 合。
( 5 ) 铵盐中的 C-N单键伸缩振动出现于 1045. 201^处。 铵盐 +NH3的 面外弯曲振动 （γ) 出现于 605. 5 cm—'处。
联苯乙酸氨丁三醇盐质谱 （MS ) (图 3 ) 解析：
该联苯乙酸氨丁三醇盐的分子带正电荷后的分子离子 C18H23N05+*检 测到的是 m/z 332. 2 , 相对强度 20; 精确质量理论计算是 333. 16， 5x10— 4 的质量相对误差是由低分辩质谱仪的低测量精度引起的。 理论上， M - H准 分子离子 C18H22N05+碎片质量的计算值是 m/z 332. 15， 检测的与理论的 相对误差只有 0. 6xl0—4。
综上述：该联苯乙酸氨丁三醇盐的化学式为式（1 )，测得纯度为 99. 5%。 联苯乙酸氨丁三醇盐样品溶解度的测定：
根据 《中国药典》 2005年版二部凡例， 依据联苯乙酸氨丁三醇盐合 成工艺及精制方法，并考虑常用溶剂，考察了联苯乙酸氨丁三醇盐在丙酮、 甲酰胺、 乙腈、 甲醇、 乙醇、 水溶液中的溶解度。 取联苯乙酸氨丁三醇盐， 研成细粉， 精密称定， 加入溶剂， 在 25 ±2°C条件下， 每间隔 5min， 振荡 30秒观察，观察 30min内溶解情况。实验重复三次。试验结果如表 1所示， 表明结论： 联苯乙酸氨丁三醇盐在甲酰胺、 甲醇中溶解； 在水、 乙醇中微 溶， 在丙酮、 乙腈中几乎不溶或不溶。 表 1中的数值为三次重复实验的平 均值。 溶解度试验
联苯乙酸氨
溶质 溶剂 丁三醇盐量 溶剂量（ml ) 溶解情况 结论
( g) 甲醇 0.1135 3 完全溶解 溶解 水 14.1 10 完全溶解 微溶 乙醇 14.3 10 完全溶解 微溶 联苯乙
不溶或几乎不 酸氨丁 丙酮 8.9 150 完全溶解
溶
三醇盐
不溶或几乎不 乙腈 9.1 150 完全溶解
溶
甲酰胺 0.2137 6 完全溶解 溶解 实施例 2、 联苯乙酸氨丁三醇盐的制备
在一个干燥洁净的 250ml单口圆底烧瓶中， 加入 21.2g (0. Imol) 联 苯乙酸与 12. lg (0. Imol) 氨丁三醇， 向其中加入 150ml无水乙醇， 振摇 加热使完全溶解至澄清， 保持温度 （50Ό) 30min, 旋转蒸发仪减压浓缩 至干， 得白色粉末。 真空 80Ό干燥， 得联苯乙酸氨丁三醇盐 32.0g。 测得 联苯乙酸氨丁三醇盐的熔点 （mp) 是 163- 164°C (巩义市予华仪器 X-5型 显微数字熔点测定仪， 升温程序： 2°C/min， 常规方法测定） ， 收率 （以 联苯乙酸投料量计， 终产品的实际量与理论产量的比值） ： 96.0%， 产品 经元素分析 （理论值： C 64.9% H 6.9% N 4.2% 024%； 实测值： C 64.1% H 7.3% N 3.6% 025%) ， 产品为联苯乙酸氨丁三醇盐， 纯度 为 99.2%。
实施例 3、 联苯乙酸氨丁三醇的制备
在一个干燥洁净的 250ml三口圆底烧瓶中， 加入 21.2g (0. Imol) 联 苯乙酸与 200ml苯， 加热搅拌至溶解， 然后向其中加入 12. lg (0. Imol) 氨丁三醇， 混合至澄清， 在 70Ό搅拌反应 2小时， TLC鉴别反应终点， 反 应完毕后充分冷却析出大量结晶性固体， 抽滤， 用少量无水乙醚洗涤白色 固体， 于 80°C真空干燥箱中真空干燥， 得 28.5g联苯乙酸氨丁三醇盐。 测 得联苯乙酸氨丁三醇盐的 mp是 163-164Ό (巩义市予华仪器 X- 5型显微数 字熔点测定仪， 升温程序： 2°C/min， 常规方法测定） ， 收率 （以联苯乙 酸投料量计， 终产品的实际量与理论产量的比值） 85.6%， 产品经元素分 析 （理论值： C64.9% H 6.9% N 4.2% 024%； 实测值： C64.1% H 7. 3% N 3. 6% 0 25% ) ， 产品为联苯乙酸氨丁三醇盐， 纯度为 99. 8%。 实施例 4、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液的制备
处方： 联苯乙酸氨丁三醇盐 94g
碳酸钠 l-2g
1000支
按处方量准确称取实施例 1制备的联苯乙酸氨丁三醇盐置一容器中， 加适量注射用水， 在搅拌下加入 0. 1% ( 0. lg/100ml )碳酸钠溶液至联苯乙 酸氨丁三醇盐全溶， 并调节 pH至 8. 5- 8. 8， 加注射用水至 4000ml， 加入 2g针用活性炭， 煮沸 15min， 抽滤脱碳， 溶液经 0. 22 μ m微孔滤膜过滤， 溶液灌封于玻璃安瓿内 （每支含联苯乙酸氨丁三醇盐 94mg ) 制剂经 115°C 加压灭菌 30min即可。
实施例 5、 联苯乙酸氨丁三醇盐冻干粉的制备
处方： 联苯乙酸氨丁三醇盐 94g
甘露醇 20g
1000支
准确称取处方量的实施例 1制备的联苯乙酸氨丁三醇盐 94g， 置一容 器中， 加入 20g甘露醇与适量注射用水溶解， 补充注射用水至 3000ml， 加 入 2g针用活性炭， 煮沸 15min， 抽滤脱碳， 过 0. 22 μ πι微孔滤膜， 分装于 西林瓶中 （每支含联苯乙酸氨丁三醇 94mg ) ， 冻干即得。
实施例 6、 联苯乙酸氨丁三醇盐胶囊的制备
处方: 联苯乙酸氨丁三醇盐 188g
乳糖 105g
1000粒 按处方量准确称取恒重的实施例 2制备的联苯乙酸氨丁三醇盐，过 100 目筛， 加入于 80°C烘干并过 80 目筛的处方量乳糖， 混匀， 检测含量， 合 格后装入 1号胶囊即得。
实施例 7、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液药效学试验研究
一、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对小鼠热板法致痛的影响
选用体重 20-22g 雌性昆明种小鼠。 首先进行痛觉敏感性筛选， 将小 鼠置于 55. 0°C ± 0. 5°C的热板上， 以小鼠舔后足所经历的时间作为疼痛反 应的阈值， 剔出喜跳者及 30秒中内无反应者， 筛选出 60只痛觉反应敏感 的小鼠， 按体重随机分成五组， 每组 12只。 采用实施例 4的联苯乙酸氨 丁三醇盐注射液进行实验。 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液低、 中、 高剂量组 (联苯乙酸氨丁三醇盐的剂量分别为 4、 12、 36mg /kg体重， 按等效剂量 折算分别相当于临床拟用剂量的 1/3、 1、 3倍）和阳性对照组（赖氨匹林）。 测定给药前痛阈值后， 各试验组小鼠尾静脉注射给予相应的药物， 给药容 积 0. Iml/lOg体重， 空白对照组给予等容积的生理盐水。 用脱毛剂将小鼠 双后足踝关节以下脱毛， 擦干。 每只小鼠以同样的方法测定给药前疼痛反 应阈值， 然后各受试组给药 lh 后， 测定每鼠给药后的疼痛反应阈值， 小 鼠舔后足后， 立即移离热板， 于给药后的 2h、 3h 再测定一次疼痛反应的 阈值， 对各组间疼痛反应的阈值进行 t检验， 以评价的镇痛作用。
试验结果如表 2所示， 表明各试验组小鼠给药前对热板法疼痛反应的 阈值相近，经给药后，联苯乙酸氨丁三醇盐注射液各剂量组小鼠在 lh、 2h、 3h舔后足的时间均较空白对照组显著延长， 提高了疼痛反应的阈值， 表明 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液能明显延长小鼠热板痛阈时间， 具有显著的镇 痛作用。 表 2中， 低、 中、 高剂量组分别表示联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 低、 中、 高剂量组。
联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对小鼠热板法的镇痛作用 （ ± s )
Figure imgf000009_0001
*P<0. 05 ， **P<0. 01
二、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对二甲苯致昆明种小鼠耳肿胀的影响
1、 材料与试剂
1. 1 实验动物：
昆明种小鼠： SPF 级， 雄性， 15- 17g， 110 只， 广东省医学实验动物 中心， 许可证号： SCXK (粤） 2003-0002， 粤监证字 2005A012。
1.2药品
实施例 4的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液。
氟吡洛芬酯注射液 （广东中科药物研究有限公司提供） 。
2、 试验方法和结果
110只昆明种小鼠， SPF级， 雄性， 15- 17g。 检疫 3天， 检疫结束后按体 重随机分成 11组， 每组 10只， g|3: 模型组、 联苯乙酸氨丁三醇注射液 1号、 2号、 3号、 4号、 5号组 （联苯乙酸氨丁三醇盐的剂量依次为： 3、 6、 12、 24、 48mg/kg) ， 氟吡洛芬酯注射液 1号、 2号、 3号、 4号、 5号组 （氟吡洛 芬酯的剂量依次为： 3、 6、 12、 24、 48mg/kg) 。 实验时于各鼠右耳廓涂二甲 苯（0.03mL/只）致耳廓肿胀， 以左耳作对照， 涂二甲苯 30min后尾静脉给予 相应的药物， 给药容积： 0. lml/lOg 体重， 模型组给予等容积的生理盐水。 给药后 1小时脱颈椎处死小鼠， 用直径 8mm的打孔器将双耳同部位等面积切 下， 用精密电子天平称重， 右耳片重减去左耳片重的重量之差即为肿胀度。
试验结果如表 3所示， 表明联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 1号、 2号、 3 号、 4 号、 5 号组各剂量组与模型组比较均能显著减轻二甲苯导致的昆明 种小鼠耳肿胀的肿胀度 （p〈0.05或 p<0.01) ， 氟吡洛芬酯注射液 2号、 3 号、 4 号、 5 号组各剂量组与模型组比较也能显著减轻二甲苯导致的昆明 种小鼠耳肿胀的肿胀度 （p<0.05 或 p<0.01) ， 联苯乙酸氨丁三醇盐注射 液与氟吡洛芬酯注射液各对应剂量组组间比较小鼠的耳肿胀度无显著性 差异， 这些结果提示， 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液具有对抗二甲苯致昆明 种小鼠耳肿胀的作用， 并且与氟吡洛芬酯注射液作用强度相似。 表 3 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对二甲苯致昆明种小鼠耳肿胀的影响 组别 剂量（mg/kg) 动物数 （只） 肿胀度（mg) 模型组 一 10 17.1±3.8
1号 3 10 13.9±2.6* 联苯乙 2号 6 10 13.5±2.9* 酸氨丁三醇 3号 12 10 13.0±2.7* 盐注射液 4号 24 10 12.7±2.9*
5号 48 10 10.9±2.5** 1号 3 10 14.2±2.7
2号 6 10 13.2±2.5* 氟吡洛
3号 12 10 11.7±3.6** 芬酯注射液
4号 24 10 11.4±4.7**
5号 48 10 10.9±3.3** 与模型组比较： *p<0.05, ** p<0.01。
三、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对冰醋酸致 NIH小鼠扭体的影响 1、 材料与试剂
1.1 实验动物：
NIH小鼠： SPF级， 雌雄各半， 15- 17g， 110只， 由广东省医学实验动 物中心提供， 许可证号： SCXK (粤） 2003-0002， 粤监证字 2006A017。
1.2药品
实施例 4的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液。
氟吡洛芬酯注射液 （北京泰德制药有限公司生产） 。
2、 实验方法和结果
NIH小鼠 110只， 雄性， 体重 15- 17g。 检疫 3天， 检疫结束后按体重 随机分成 11组， 每组 10只， 即： 模型组、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 1 号、 2号、 3号、 4号、 5号组 （联苯乙酸氨丁三醇盐的剂量依次为： 3、 6、 12、 24、 48mg/kg) ， 氟吡洛芬酯注射液 1号、 2号、 3号、 4号、 5号组 (氟吡洛芬酯的剂量依次为： 3、 6、 12、 24、 48mg/kg) 。 实验时各小鼠 尾静脉给予相应的药物， 给药容积： 0. lml/10g体重， 模型组给予等容积 的生理盐水。给药后 0.5小时按 10mL/kg体重腹腔注射 0.7%(0.7g/100ml) HAc致痛， 然后立即观察 15min内各鼠的扭体反应， 并记录扭体次数， 计 算抑制率。
试验结果如表 4所示， 表明联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 1号、 2号、 3 号、 4号、 5号组各剂量组与模型组比较均能显著抑制冰醋酸致 NIH小鼠 的扭体次数（p<0.05或 p<0.01) ， ED50及 95%可信限为: 7.9 (4.7-13.5) mg/kg; 氟吡洛芬酯注射液 1号、 2号、 3号、 4号、 5号组各剂量组与模 型组比较也能显著抑制冰醋酸致 NIH小鼠的扭体次数（p<0.01) ， ED50及 95%可信限为： 6.3 (4.3-9.3) mg/kg; 但是联苯乙酸氨丁三醇盐注射液与 氟吡洛芬酯注射液各对应剂量组组间比较小鼠的扭体次数无显著性差异， 表明联苯乙酸氨丁三醇盐注射液与氟吡洛芬酯注射液对抗冰醋酸致 NIH小 鼠扭体的作用强度相近， 这些结果均提示联苯乙酸氨丁三醇盐注射液具有 对抗冰醋酸致 NIH小鼠扭体的作用，其作用强度与氟吡洛芬酯注射液相近。 联苯乙酸氨丁三醇注射液对冰醋酸致 NIH小鼠扭体的影响
Figure imgf000012_0001
与模型组比较： *p<0.05, ** p<0.01。
实施例 8、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液安全性实验
本安全性实验执行 2003年 8月国家食品药品监督管理局颁布的《药 物非临床研究质量管理规范》 （GLP)。
1、 受试药物
(1) 实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液。
初步临床计划用法用量： 静脉滴注， 94mg/次， 用 0.9%氯化钠注射 液稀释至 100- 200ml， 一日 1-2次。
(2) 阳性对照物： 白蛋白 （鸡蛋） ， 批号： 050114， 由上海伯奥 生物科技有限公司生产。
(3) 阴性对照物： 0.9% (0.9g/100ml) 氯化钠注射液。
2、 试验动物及饲养条件
(1) 豚鼠 a、 级别、 种系： 普通级 FMMU豚鼠。
b、 年龄： 10〜12周龄。
c、 购入时体重、 性别： 280- 330g， 雌雄各半。
d、 来源、 合格证明： 向南方医科大学实验动物中心购买， 动物生产 许可证号： SCXK (粤） 2006-0015， 粤监证字 2006B007。
e、 试验动物选择说明： 豚鼠是过敏试验首选的动物之一， 我国毒性 研究指导原则 《化学药物刺激性、 过敏性和溶血性研究技术指导原则》 推 荐使用该种动物。
f、 检疫过程： 试验动物在试验前检疫观察。 在此期间， 观察动物的 外观体征、 行为活动、 粪便性状及摄食量等指征， 及时剔除有病动物。 动 物在使用前经专题负责人和试验动物管理人员检查认可。
g、 标识方法： 采用被毛染色法， 用饱和苦味酸溶液， 在动物体表不 同部位的被毛涂染斑点， 以示不同号码。 每笼 3只豚鼠， 群养， 各笼进行 笼标记。
( 2 ) 兔
a、 级别、 种系： 普通级新西兰兔。
b、 年龄： 3月龄。
c、 购入时体重、 性别： 2. 0-2. 2kg， 雌雄各半。
d、 来源、 合格证明： 购自广东省医学实验动物中心， 动物质量合格 证号： 粤监证字 2006A001。
e、 试验动物选择说明： 新西兰兔是刺激性试验首选的动物之一， 我 国毒性研究指导原则 《化学药物刺激性、 过敏性和溶血性研究技术指导原 则》 推荐使用该种动物。
f、 检疫过程： 与豚鼠检疫过程相同。
g、 标识方法： 与豚鼠标识方法相同。 将家兔分笼单独饲养， 各笼进 行笼标记。
( 3 ) 饲养条件
a、 词养管理： 动物由取得实验动物管理资格认可的人员饲养管理。 b、 设施条件、 级别、 合格证： 豚鼠和兔分别饲养于普通级动物房豚 鼠室和兔室内， 饲养条件符合普通级动物实验设施要求， 通风光照良好， 温度 16- 26°C， 湿度 40-70%， 动物实验环境设施合格证号为粤检证字： 2005C133 , 实验动物使用许可证号： SYXK (粤） 2003- 0003 (2005年年检合 格）。
c、 饲料和饮水： 饲料为普通级用兔 （豚鼠） 配合饲料， 向广东省医 学实验动物中心购买， 配制标准及营养要求符合 GB- 14924. 4-2001标准。 饮水为自来水， 自由摄取。
根据 《药品注册管理办法》 （国家食品药品监督管理局 2005年 2月 28曰颁布）要求， 对实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液进行以下 安全性试验。 一、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液豚鼠全身主动过敏试验 （ASA ) 1、 试验方法
试验用 FMMU豚鼠 24只， 按性别和体重随机分为 4组， 每组雌雄各 6 只。 设阴性对照组、 阳性对照组和实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注 射液低、 高剂量组（7. 5和22.
Figure imgf000014_0001
，1^， 按等效剂量折算约分别相当于 临床拟用剂量的 1倍和 3倍）。 腹腔注射给药， 给药体积 0. 5ml/只， 隔日 一次，连续三次。致敏剂量：阴性对照组，给予氯化钠注射液（0. 9g/100ml) ; 阳性对照组， 给予 2% ( 2g/100ml ) 的白蛋白溶液； 低剂量组， 7. 5 mg联 苯乙酸氨丁三醇盐 /kg*bw;高剂量组， 22. 5mg联苯乙酸氨丁三醇盐 /kg，bw。 药物浓度： 低剂量组， 5. Omg联苯乙酸氨丁三醇盐 /mL; 高剂量组： 15. Omg 联苯乙酸氨丁三醇盐 /mL。 其中， 高剂量组的药物按照如下方法配制： 取 实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液（4ml : 94mg /瓶） 1瓶， 吸出 4. OmL后用 0. 9%氯化钠注射液稀释至 6. 3mL，使成浓度为 15. Omg联苯乙酸 氨丁三醇盐 /mL的溶液。 低剂量组的药物按照如下方法配制： 取上述浓度 为 15. 0mg/mL的溶液 2. 0mL， 加 0. 9% (0. 9g/100ml)氯化钠溶液至 6. 0raL， 稀释成浓度为 5. Omg联苯乙酸氨丁三醇盐 /mL的溶液。
各组动物分别于末次腹腔注射后第 12天激发， 静脉注射给药， 给药 体积 1. 0ml/只， 激发剂量： 2倍致敏剂量。 并观察动物的反应。
2 观察指标：
2. 1 致敏期间： 每次致敏前称体重， 每天观察动物的反应状态并详细 记录。
2. 2激发： 激发前称体重， 激发后按表 5立即详细观察每只豚鼠的反 应症状至 30分钟， 并详细记录。
表 5 过敏反应症状
Figure imgf000015_0001
3结果评价
按表 6判断过敏反应发生的程度，计算过敏反应发生率。激发注射后， 若发现有过敏反应症状时， 即取健康未致敏豚鼠 2只， 静脉注射激发剂量 的受试药物 lraL， 观察有无由于受试物作用引起的类似过敏反应症状。
表 6 豚鼠全身致敏性评价标准
Figure imgf000015_0002
4 试验结果
4. 1 一般状况观察
在试验期间， 阴性对照组、 阳性对照组和给药组动物的外观特征， 行为活动， 呼吸及粪便性状等未见明显异常。 体重变化情况详见表 7。 表 7 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液豚鼠主动超敏试验动物体重变化情况
Figure imgf000016_0001
注： 1. Dl、 D5和 D17分别代表初次致敏、 末次致敏和激发当天的体 重。 2. D17体重变化值 =D17- Dl， "正数" 代表增重。
4. 2 激发反应
对各组豚鼠进行激发， 具体过敏反应详见表 8。 表明阴性对照组未 出现过敏反应症状， 过敏反应阴性； 阳性对照组出现明显的过敏反应症 状， 6 例豚鼠均呼吸困难、 喘息、 步态不稳、 跳跃、 死亡， 过敏反应极 强阳性； 低剂量组 6 例豚鼠激发后， 均未出现过敏反应症状。 高剂量组 6例豚鼠激发后， 均未出现过敏反应症状。 联苯乙酸氨丁三醇注射液全身主动过敏试验过敏反应情况
Figure imgf000017_0001
注： 过敏反应发生率= (过敏反应例数÷动物数） X 100% 结果阴性对照组豚鼠未出现明显过敏反应症状， 阳性对照组豚鼠全 部死亡。 低、 高剂量组 12例豚鼠激发后， 均未出现明显过敏反应症状。 说明实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对豚鼠全身主动过敏试验 阴性。
二、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液溶血性试验
体外溶血试验： 向盛有 2%红血球混悬液的各支药液管中分别加入不等 量的实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液的低浓度和高浓度（0.63 mg/mL 和 1.88mg/mL) ， 各支药液管在 3小时内不产生溶血作用。 说明实 施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液体外溶血性试验阴性。 具体的实 验方法和实验结果如下：
1、 受试药物的配制：
(1) 高剂量组： 取实施例 4 制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 (4mL:94mg/瓶） 1瓶， 吸出 0.5mL后用 0.9% (0.9g/100ml) 氯化钠注射液 稀释至 6.25mL, 使成浓度为 1.88mg/mL的溶液。
(2) 低剂量组： 取上述浓度为 1.88mg/mL 的溶液 2mL， 用 0.9% (0.9g/100ml) 氯化钠注射液稀释至 6mL， 稀释成浓度为 0.63mg/mL的溶 液。
2、 给药方法：
(1) 2%红血球混悬液的制备：
取兔血数毫升， 放入盛有含玻璃珠的三角瓶中振摇 10 分钟， 除去纤 维蛋白原， 使成脱纤血液。 然后分装在数支离心管中， 每管加约 10 倍量 的 0.9%氯化钠注射液， 摇匀， 离心（1500转 /分， 15分钟） ， 除去上清液， 沉淀的红血球再用 0.9%氯化钠注射液洗涤 2-3次，直至上清液不显红色为 止。 将所得红血球用 0.9%氯化钠注射液配成 2%的混悬液， 供试验用。
取口径大小均勾的洁净试管 7只 （每管均设平行管） ， 编号后， 用移 液管按表 9所示配比量依次加入 2%红血球混悬液、 0.9%氯化钠注射液、注 射用水和受试药液， 混匀后立即置 37Ό恒温箱中进行温育， 开始每隔 15 分钟观察一次， 1小时后， 每隔 1小时观察一次， 共观察 3小时。
表 9: 2%红血球混悬液的制备编号 试 管 编 号
1 2 3 4 5 6 7
2%红血球混悬液 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
0.9%氯化钠注射液 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 1 注射用水 1 1 1 1 1 1 2. 5 受试药液 0. 5 0. 4 0. 3 0. 2 0. 1 1 1
注： 其中 1-5管为供试品管， 第 6管为阴性对照管， 第 7管为阳性对 照管。
( 2 ) 结果观察：
如试验中溶液呈澄明红色， 管底无细胞残留或有少量红细胞残留， 即 表示有溶血发生； 如红细胞全部下沉， 上清液体无色澄明， 表明无溶血发 生。 如溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀， 振摇后不分散， 表明有红细胞 凝聚发生。 如有红细胞凝聚的现象， 需进一步判定是真凝聚还是假凝聚。 若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散， 或将聚集物放在载波片上， 在盖玻 片边缘滴加 2滴 0. 9%氯化钠注射液， 在显微镜下观察， 凝聚红细胞能被冲 散者为假凝聚； 若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
3、 结果判定
当阴性对照管无溶血和凝聚发生， 阳性对照管有溶血发生时， 若受试 物管中的溶液在 3小时内不产生溶血和凝聚， 则受试物可以注射使用； 若 受试物管中的溶液在 3小时内产生溶血和 （或） 凝聚， 则受试物不宜注射 使用。
4、 试验结果
分别加入低浓度为 0. 63mg/mL和高浓度为 1. 88mg/mL 的联苯乙酸氨 丁三醇盐注射液溶液的各支药液管在 3小时内均不产生溶血作用， 体外溶 血性试验阴性。 详见下表 10和表 11。
表 10 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液（高剂量组）溶血性试验结果（肉眼观 察）
Figure imgf000019_0001
果 37Ό保温 30分钟后结果 - ― - 一 ― - + 判 37°C保温 45分钟后结果 ― - - ― ― + 断 37eC保温 1小时后结果 - ― ― - - - +
37°C保温 2小时后结果 - - - ― - - +
37°C保温 3小时后结果 - - - ― 一 - + 注： "+"表示全溶血， "-"表示？ 溶血； 第 6管为阴性对照管， 第 7管 为阳性对照管。 表 11 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 （低剂量组） 溶血性试验结果 （肉眼观 察）
Figure imgf000020_0001
为阳性对照管。 三、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液血管刺激性试验
兔血管刺激性试验： 试验选用健康新西兰兔 8只， 采用同体左右侧耳 朵自身对比法， 左侧耳缘静脉注射受试药物， 给药体积 5ml/kg体重， 各 给药组给予相应剂量的实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液， 低 剂量组和高剂量组剂量分别是 3.15mg/kg*bw和 9.4mg/kg*bw， （按浓度 计算其低浓度和高浓度分别为 0.63 mg/mL 和 1.88mg/mL， 是临床一次 静脉滴注拟用浓度的 0.7-1.4倍和 2- 4倍）， 右耳给予等体积 0.9% (0.9g/100ml) 氯化钠注射液作对照， 每天一次， 连续 3天。 8只兔依次 给予受试药的高浓度和低浓度后， 再分别给予 0.9%氯化钠注射液。各取低 剂量和高剂量的 2只兔于末次给药后 48小时剖检，余下低浓度和高浓度 的 4只兔在末次给药 2周恢复期结束后剖检。结果 8只动物双耳血管轮廓 较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见明显改变； 病理组织学检査， 动物双耳血管 未见有毒理学意义的改变。 说明实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射 液血管刺激性试验符合规定。 具体的实验方法和实验结果如下：
1、 受试物的配制：
( 1 ) 高剂量组： 取实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 (4mL : 94mg/瓶) 2瓶， 吸出 8mL后用 0. 9% ( 0. 9g/100ml ) 氯化钠注射液稀 释至 100. OmL, 使成浓度为 1. 88mg/mL的溶液。
( 2 ) 低剂量组： 取上述浓度为 1. 88mg/mL的溶液 30mL， 用 0. 9%氯 化钠注射液稀释至 90. OmL, 稀释成浓度为 0. 63mg/mL的溶液。
2、 动物称重： 给药前及末次给药后 48小时和 14天各称重一次。
3、 一般观察与动物取材：
每天给药前观察并记录动物和血管注射部位的反应，末次给药后 48 小时， 分别放血处死受试药物的高浓度和低浓度的 2只新西兰兔， 肉眼 观察并记录血管组织的反应后， 从耳根部剪下双兔耳 （先剪左耳， 后剪 右耳， 并标记） ， 然后分别剪取一段兔耳标本固定在 10%中性甲醛溶液中 (标本长约 8cm， 宽约 lcm; 远心端切口距第一针眼约 0. 5cm处， 近心端 切口距第三针眼约 2cm处， 挂线端为近心端） 。 各留下受试药物的高浓度 和低浓度 2只动物继续观察至末次给药后 14天， 进行如下病理检查： 以 第一针眼为界， 远端切一段； 以第三针眼为界， 近端切二段； 制片时血管 横切， 常规石蜡制片， 切片厚度约 4- 5 m， H-E染色， 然后进行病理组织 学检査。
4、 结果判定
根据肉眼观察和病理检查的结果进行综合判断。
5、 试验结果
5. 1肉眼观察：
每天给药前肉眼观察并记录动物血管注射部位的反应， 给药期间肉 眼可见受试药物高浓度和低浓度的部分动物给药侧和对照侧兔耳进针部 位血管表皮内外侧呈红色， 面积由 0. lcm X O. 2cm至 0. 2cm X 1. 0cm。 在末 次给药后 48小时， 受试药物的高浓度和低浓度的 4只兔的双侧兔耳血管 轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见明显改变， 详见表 12和表 13。 末次给 药后 14天剖检受试药物的高浓度和低浓度的 4只兔， 双侧兔耳血管轮廓 较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见明显改变。
5. 2病理检査：
受试药物的高浓度和低浓度的 4只兔于末次给药后 48小时剖检， 余下受试药物的高浓度和低浓度的 4只兔在 2周恢复期结束后剖检。 病 理组织学检查均未见血管组织有变性或坏死等显著剌激性反应。
表 12 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 （高剂量组） 对兔耳血管刺激反应 （末 次给药后 48小时肉眼观察结果）
兔号 左耳 （给药侧） 右耳 （对照侧）
1 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 明显改变。 明显改变。
3 进针部位血管内外侧的皮肤呈红色 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见
( 0. lcmX O. 5cm) ， 血管轮廓较清晰， 明显改变。
兔耳厚薄均匀， 未见明显改变。
4 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 进针部位血管内外侧的皮肤呈红色 明显改变。 ( 0. 2cm X 0. 5cm) ， 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见明显改变。
6 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 明显改变。 明显改变。
表 13 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 （低剂量组） 对兔耳血管刺激反应
(末次给药后 48小时肉眼观察结果）
兔号 左耳 （给药侧） 右耳 （对照侧）
2 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 明显改变。 明显改变。
5 进针部位血管内外侧的皮肤呈红色 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见 ( 0. lcmX O. 2cm) , 血管轮廓较清晰， 明显改变。
兔耳厚薄均匀， 未见明显改变。
7 进针部位血管内外侧的皮肤呈红色 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见
( 0. lcm X O. 2cm) ， 血管轮廓较清晰， 明显改变。
兔耳厚薄均匀， 未见明显改变。 8 进针部位血管内外侧的皮肤呈红色 血管轮廓较清晰， 兔耳厚薄均匀， 未见
( 0. lcm X O. 2cm) ， 血管轮廓较清晰， 明显改变。
兔耳厚薄均匀， 未见明显改变。
四、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液肌肉刺激性试验
试验用 8只新西兰兔， 采用同体左右侧肌肉股四头肌自身对比法， 每 侧股四头肌内注射给药 l. OmL/只， 每日一次， 连续 3天， 各给药组给予 相应浓度的实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液， 低浓度和高浓 度分别为 0. 63 mg/mL 和 1. 88mg/mL (是临床一次静脉滴注拟用浓度的 0. 7-1. 4倍和 2- 4倍）， 右侧给予等体积 0. 9% ( 0. 9g/100ml ) 氯化钠注 射液作对照。各取低浓度和高浓度的 2只兔于末次给药后 48小时剖检， 余下低浓度和高浓度的 4只兔在末次给药 2周恢复期结束后剖检。 肉眼 观察 8只兔的双侧注射部位深层肌肉组织质地富有弹性、光泽，未见红肿、 充血等刺激反应症状； 病理组织学检查， 8只兔的双侧注射部位深层肌肉 组织均未见变性或坏死等显著刺激性反应。 说明实施例 4制备的联苯乙酸 氨丁三醇盐注射液肌肉刺激性试验符合规定。 具体实验方法和实验结果如 下：
1、 受试物的配制：
( 1 ) 高剂量组： 取实施例 4 制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液
(4mL : 94mg/瓶) 1瓶， 吸出 1. OmL后用 0. 9%氯化钠注射液稀释至 12. 5mL， 使成浓度为 1. 88mg/mL的溶液。
( 2 ) 低剂量组： 取上述浓度为 1. 88mg/mL的溶液 2mL， 用 0. 9%氯化 钠注射液稀释至 6mL， 稀释成浓度为 0. 63mg/mL的溶液。
2、 动物称重： 给药前及末次给药后 48小时和 14天各称重一次。
3、 给药方法：
取健康的新西兰白兔 8只， 以无菌操作法分别于兔左侧股四头肌内 注射受试物的高浓度和低浓度，于右侧股四头肌内注射等体积 0. 9%氯化 钠注射液作对照。
4、 试验观察：
每天给药前观察并记录动物和肌肉注射部位的反应， 末次给药 48 小时后， 各取受试药物的高浓度和低浓度 2只动物， 放血处死， 解剖暴 露股四头肌， 纵向切开， 肉眼观察并记录注射部位的刺激反应情况， 然 后将注射部位肌肉作病理组织学检査。 各留下受试药物的高浓度和低浓 度 2只动物继续观察至末次给药后 14天进行注射部位病理检査。
5、 结果判定
根据肉眼观察和组织病理的检査结果进行综合判断。
6、 试验结果： 试验结果详见表 14、 表 15、 表 16和表 17及病理图文 诊断报告。
表 14 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液（高剂量组）对兔肌肉刺激反应（肉 眼观察结果）
Figure imgf000024_0001
注： 1、 3号 2只兔的肉眼观察时间为末次给药后 48小时， 4、 6号 2只兔的肉 眼观察时间为末次给药后 14天。
表 15 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液（低剂量组）对兔肌肉刺激反应（肉 眼观察结果） 动物号 左股四头肌 （给药侧） 右股四头肌 （对照侧）
注射部位表、深层肌肉组织质地富有 注射部位表、深层肌肉组织质地富有弹
2
弹性、 光泽， 无明显变化。 性、 光泽， 无明显变化。 注射部位表、深层肌肉组织质地富有 注射部位表、深层肌肉组织质地富有弹
5
弹性、 光泽， 无明显变化。 性、 光泽， 无明显变化。 注射部位表、深层肌肉组织质地富有 注射部位表、深层肌肉组织质地富有弹
7
弹性、 光泽， 无明显变化。 性、 光泽， 无明显变化。 注射部位表、深层肌肉组织质地富有 注射部位表、深层肌肉组织质地富有弹
8
弹性、 光泽， 无明显变化。 性、 光泽， 无明显变化。 注： 2、 5号 2只兔的肉眼观察时间为末次给药后 48小时， 7、 8号 2只兔的肉眼观 察时间为末次给药后 14天。 表 16 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液（高剂量组）对兔肌肉刺激反应（病理观察）
Figure imgf000025_0001
表 17 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液（低剂量组）对兔肌肉刺激反应（病理观察）
Figure imgf000025_0002
末次给药后 48小时和 14天， 肉眼观察和病理报告结果表明联苯乙酸氨 丁三醇盐注射液对新西兰兔注射部位肌肉未见变性坏死等明显刺激性变 化。
本实施例表明实施例 4 的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液（7. 5 和 22. 5mg/kg，bw)对豚鼠全身主动过敏试验阴性； 实施例 4的联苯乙酸氨丁 三醇盐注射液（0. 63和 1. 88mg/mL )对兔耳缘静脉血管及周围组织无刺激 性； 实施例 4 的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 （0. 63和 1. 88mg/mL ) 对兔 注射部位肌肉组织无刺激性； 实施例 4 的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液 ( 0. 63和 1. 88mg/mL ) 对兔体外溶血试验阴性。
实施例 9、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液小鼠急性毒性试验
根据预试结果判断无法测出联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对 NIH小鼠的 LD50 (半数致死量） ， 因此选用最大给药量法研究联苯乙酸氨丁三醇盐注 射液对 NIH小鼠的急性毒性， 方法及结果如下： NIH小鼠 40只， 19- 21g， 雌雄各半， 随机均衡分为两组： 给药组与辅 料对照组。 给药组 NIH小鼠尾静脉注射给予最大浓度的联苯乙酸氨丁三醇 盐注射液 （94mg/½l， 以联苯乙酸氨丁三醇盐计） ， 给药容积： 0. 2ml/次 /10g体重， 一日两次， 两次给药时间间隔为 6小时， 即一日给药剂量为： 940mg/kg, 辅料对照组给予等量的空白辅料 （0. 1%碳酸钠溶液） ， 观察记 录给药后小鼠急性毒性反应及累积死亡数。 试验结果表明： 给药后给药组 全部小鼠少动， 部分小鼠呼吸困难， 每次给药 2-4小时后都逐渐恢复， 辅 料对照组全部小鼠未见异常反应， 给药后 14天内， 给药组及辅料对照组动 物均未见死亡例， 体重增长良好， 给药 14天后全部小鼠进行尸体解剖， 肉 眼未见异常变化， 这些研究结果提示联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对 NIH小 鼠的最大耐受量应该大于 940mg/kg。 这一结果提示联苯乙酸氨丁三醇盐注 射液的 LD5。值应该远大于 940mg/kg (以联苯乙酸计为： 598mg/kg ) ， 而联 苯乙酸乙酯 （以联苯乙酸计） 的静脉注射小鼠 LD5。为雄性 337mg/kg， 雌性 433mg/kg, 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液急性毒性大幅度降低， 急性毒性也 低于同类芳基垸酸类非 体抗炎镇痛药。
实施例 10、 联苯乙酸氨丁三醇盐注射液稳定性实验
依据中国药典 2005年版二部附录 XI X C (药物稳定性试验指导原则） 确定了实施例 4制备的联苯乙酸氨丁三醇盐注射液稳定性考察项目包括： 影响因素试验 （包括高温、 高湿、 强光照射） 、 加速试验、 长期试验等， 目的是考察本品在温度、 湿度、 光线的影响下随时间变化的规律， 为药品 的生产、包装、运输条件提供科学依据， 同时通过试验建立药品的有效期。 并根据中国药典 2005年版二部附录 XI X C (药物稳定性试验指导原则）与 《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则》 中的 "原料药及药物制剂稳 定性重点考查项目表 "确定了重点考察项目， 其中包括性状、 PH值、 有关 物质、 无菌、 热源、 含量测定等。 试验结果如下：
1、 影响试验
试验结果表明： 本品在高温 （60°C ) 、 高湿 （相对湿度 92. 5%± 5%) 和光照 （4500 ± 5001x ) 条件放置 10天， 各项指标无明显变化， 说明本品 质量稳定。
2、 加速试验 加速试验结果表明： 本品放置在温度为 40 ± 2°C、 相对湿度为 75 ± 5% 的条件下 3个月， 于每个月末取样检测， 各项指标无明显变化， 说明本品 质量稳定。
3、 长期试验
长期试验结果表明： 本品在温度为 25°C、 相对湿度为 60%的条件下放 置 3个月， 于每个月取样检测， 各项指标无明显变化， 说明本品质量稳定。
实施例 11、 联苯乙酸氨丁三醇盐口服胃肠道刺激性实验
NIH小鼠按体重随机分成 2组， 禁食 24小时后， 分别灌胃联苯乙酸氨 丁三醇盐 333mg/kg， 联苯乙酸 212 mg/kg, 48小时后取胃， 10%甲醛溶液 固定， 沿胃大弯剪开胃， 观察溃疡发生率， 实验结果如下：
Figure imgf000027_0001
工业应用
本发明的联苯乙酸氨丁三醇盐溶于水， 解决了联苯乙酸存在的不溶于水 的问题。 在解决溶解度的同时， 本发明验证了联苯乙酸氨丁三醇盐与联苯乙 酸乙酯在镇痛及抗炎作用上的等效性， 并且联苯乙酸氨丁三醇盐在急性毒性 上要远小于联苯乙酸乙酯（见实施例 9 )，口服刺激性联苯乙酸氨丁三醇盐小 于联苯乙酸 （见实施例 11 )。 在此基础上进一步按照 GLP试验规则进行过敏 反应试验， 没有发现过敏反应， 不会产生有过敏而引起的休克。 同时， 根据 注射液的一般要求， 对其作了溶血和刺激性试验， 未发现溶血和肌肉、 血管 刺激性， 所以可以作为注射液使用。 以上实验均在国家新药安全评价研究重 点实验室广州医药工业研究所进行， 保证了数据的可靠性。作为注射剂应用， 避免了生产乳剂时大分子辅料的使用。 联苯乙酸乙酯注射液为乳剂， 乳剂的 稳定性一直是药学人员难于解决的一个问题， 例如酸败等， 本发明进行了联 苯乙酸氨丁三醇盐注射液 3个月的稳定性试验， 发现联苯乙酸氨丁三醇盐注 射液是稳定的。 乳剂的生产过程是复杂的， 而联苯乙酸氨丁三醇盐的生产过 程及所用辅料简单易行。
本发明联苯乙酸氨丁三醇盐的制备工艺简单可行， 原料易得， 反应条 件稳定， 反应产率高， 产品纯度高， 可以直接得到药用的联苯乙酸氨丁三 醇盐。 反应没有严重的 "三废"污染。 药理实验证明联苯乙酸氨丁三醇盐 注射液具有镇痛、 抗炎作用， 对豚鼠无致敏作用。 体外试验条件下， 联苯 乙酸氨丁三醇盐注射液对日本大耳白兔红细胞无溶血作用， 多次给药对家 兔静脉血管及单次给药对家兔肌肉均无明显刺激作用， 说明联苯乙酸氨丁 三醇盐注射液适用于肌肉或静脉注射。 单次静脉注射给药， 急性毒性试验 结果表明联苯乙酸氨丁三醇盐注射液对 NIH小鼠的最大耐受量大于 940mg/kg, 这一结果提示联苯乙酸氨丁三醇盐注射液的 LD5。值远大于
940mg/kg (以联苯乙酸计为： 598mg/kg ) ， 而联苯乙酸乙酯 （以联苯乙酸 计） 的静脉注射小鼠 LD5。为雄性 337mg/kg， 雌性 33mg/kg, 联苯乙酸氨 丁三醇盐注射液急性毒性大幅度降低， 急性毒性也低于同类芳基垸酸类非 甾体抗炎镇痛药。 联苯乙酸氨丁三醇盐的口腹胃肠道刺激性小于联苯乙 酸， 利于服用。

Claims

权利要求
1、 式 I所示的联苯乙酸氨丁三醇盐：
Figure imgf000029_0001
2 (式 I ) 。
2、 权利要求 1 所述的联苯乙酸氨丁三醇盐的制备方法， 是将联苯乙 酸和氨丁三醇在有机溶剂中反应， 得到联苯乙酸氨丁三醇盐。
3、 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于： 所述方法中， 所述联 苯乙酸先溶于所述有机溶剂中， 再加入所述氨丁三醇， 进行反应得到联苯 乙酸氨丁三醇盐。
4、 根据权利要求 2或 3所述的方法， 其特征在于： 所述联苯乙酸和 氨丁三醇的摩尔比为 1 : 1。
5、 根据权利要求 2或 3所述的方法， 其特征在于： 所述有机溶剂是 醇类或苯类溶剂。
6、 根据权利要求 5所述的方法， 其特征在于： 所述醇类溶剂是甲醇、 无水乙醇、 丙酮或正丁醇； 所述苯类溶剂为苯或甲苯。
7、 根据权利要求 2或 3所述的方法， 其特征在于： 所述反应温度为 0-80 °C， 反应时间为 0. 5-2小时。
8、 根据权利要求 7所述的方法， 其特征在于： 所述反应温度为 50-70 °C。
9、 根据权利要求 2或 3所述的方法， 其特征在于： 所述方法中还包 括纯化联苯乙酸氨丁三醇盐的步骤。
10、 根据权利要求 9所述的方法， 其特征在于： 所述纯化方法为反应 结束后， 浓缩蒸干溶剂得白色粉末， 将所述白色粉末真空干燥得到联苯乙 酸氨丁三醇盐。
11、 根据权利要求 9所述的方法， 其特征在于： 所述纯化方法为反应 结束后， o°c以下冷却结晶， 所得晶体真空干燥得到联苯乙酸氨丁三醇盐。
12、 一种抗炎和 /或镇痛和 /或解热药， 它的活性成分是权利要求 1所 述的联苯乙酸氨丁三醇盐。
13、 根据权利要求 12 所述的药物， 其特征在于： 所述抗炎镇痛药的 剂型为注射剂或胶囊。
14、 根据权利要求 13 所述的药物， 其特征在于： 所述注射剂为注射 液、 注射用冻干粉或注射用无菌粉针。
15、 权利要求 1所述的联苯乙酸氨丁三醇盐在制备镇痛和 /或抗炎和 / 或解热药物中的应用。
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