CN109793731A - 二甲基胺4-o-乙酰基线叶旋覆花内酯a及其盐在制备预防/治疗慢阻肺药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种如式Ⅰ所示的二甲基胺4‑O‑乙酰基线叶旋覆花内酯A及其盐在制备预防/治疗慢阻肺药物中的应用。

Description

二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A及其盐在制备预防/治 疗慢阻肺药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物制备与应用，具体涉及二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A及其盐在制药中的应用，尤其涉及二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A 及其盐与在制备预防/治疗慢阻肺药物中的应用。

背景技术

慢阻肺(慢性阻塞性肺病chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。该疾病与有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，全球40岁以上发病率已高达9％～10％。COPD的确切病因不清楚，一般认为与慢性支气管炎和阻塞性肺气肿发生有关的因素都可能引起 COPD的发病。已经发现的危险因素大致分为外因(即环境因素)与内因(即个体易患因素)两类。外因包括吸烟、粉尘和化学物质的吸入、空气污染、呼吸道感染及其他因素。内因包括遗传因素、气道反应性增高、在怀孕期、新生儿期、婴儿期或儿童期由各种原因导致肺发育或生长不良的个体。迄今为止，COPD的确切发病机制仍不清楚，但随着对COPD发病机制认识的深入，发现COPD主要与肺部的炎性反应、蛋白酶系统失衡、氧化应激反应有关。

目前临床上用于治疗COPD的药物有支气管舒张药，常用的短效β2肾上腺素受体激动剂为沙丁胺醇和特布他林，常用的长效β2肾上腺素受体激动剂有沙美特罗和福莫特罗，另外还有抗胆碱类药物和茶碱类药物。支气管扩张药可以改善COPD的症状，稳定肺功能，但对肺部的炎性症状无治疗作用。针对COPD 病因的药物有抗炎类，如糖皮质激素，目前临床常用的有布地奈德、二丙酸倍氯米松、曲安奈德、丙酸氟替卡松、氟尼缩松、糠酸莫米松和环索奈德等，联合支气管扩张药，吸入治疗COPD和支气管哮喘，但效果不及治疗哮喘理想。另外选择性的磷酸二酯酶抑制剂西洛司特能有效减轻患者气道炎症，改善肺功能和提高生命质量，延缓COPD的恶化。其他还有抗氧化类药物N乙酰半胱氨酸、辛伐他汀和蛋白酶抑制剂类药物，对COPD都有一定的作用。COPD是不可逆的慢性进行性疾病，药物治疗是必须的，在COPD发展过程中可能存在激素抵抗现象，因此开发新的抗炎药物成为研究的方向，具有抗炎作用的中草药是寻找和开发这类药物的良好途径。

线叶旋覆花内酯A来源于具有抗炎作用的中药线叶旋覆花，在多种炎症模型上显示出良好的预防和治疗效果，本发明人前期已经申请了其在制备治疗慢阻肺药物中的应用(申请号：20120208157.4)、在制备治疗心肌炎药物中的应用 (申请号：20120208172.9)、在制备预防/治疗慢性阻塞性肺药物中的应用(申请号：201610960393.X)。二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A，是线叶旋覆花内酯A的衍生物，相比线叶旋覆花内酯A具有更高的生物利用度，本发明人前期申请了该化合物或其盐的制备及其在制备治疗慢阻肺药物中的应用(申请号：201510549327.9，PCT/CN2016/097481)。

经进一步研究发现二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A及其盐在小鼠 COPD模型上亦有较好的预防和治疗作用，具有预防治疗慢阻肺的功效，因而，可以研究开发其慢阻肺药物的制备。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A及其盐在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的用途。

本发明提供了二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A及其盐在制备预防/治疗慢阻肺药物中的应用。

本发明所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A的结构如式Ⅰ所示：

本发明所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接受的盐，以式Ⅱ所示：

所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接受的盐由二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A与HX制成。

其中HX选自盐酸、硫酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、亚硫酸、硝酸、碳酸、硼酸、亚硒酸、磷钼酸、亚磷酸、柠檬酸、马来酸、D-苹果酸、L-苹果酸、 DL-苹果酸、D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸、草酸、磺酸，苯磺酸、取代苯磺酸、 1-萘磺酸、2-萘磺酸、酞酸、酒石酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、枸橼酸、苯甲酸或取代苯甲酸。

所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接受的盐，优选为二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A盐酸盐Ⅲ、二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A富马酸盐Ⅳ、硝酸盐V、氢溴酸盐VI、硫酸盐VII、乳清酸盐 VIII、柠檬酸盐IX、对甲苯磺酸盐X、丁二酸盐XI，最优选为二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A盐酸盐Ⅲ或富马酸盐Ⅳ。如下式所示：

本发明人采用脂多糖(LPS)滴注联合吸烟所致小鼠COPD模型，将二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ及其富马酸盐化合物Ⅳ进行COPD动物模型药效试验。试验结果表明：化合物Ⅰ和Ⅳ灌胃给药，可显著改善小鼠肺功能(见表1)；显著降低肺组织灌洗液中的中性粒细胞百分比、炎性细胞因子的表达和蛋白酶MMP2的表达(见表2)；显著降低肺肺泡间隔指数，降低肺泡融合(见表3)；模型组小鼠肺组织炎症细胞浸润，支气管增生，肺泡融合明显，给药组炎性浸润、支气管增生和肺泡融合均明显减少(见图1)。化合物Ⅰ和Ⅳ灌胃给药对香烟烟雾合并LPS所致COPD小鼠的肺功能低下有显著改善作用，可显著抑制由香烟烟雾合并LPS暴露所致COPD小鼠炎症细胞的浸润、促炎细胞因子的表达。说明二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ或其盐Ⅱ可用于制备预防/治疗慢阻肺的药物。

本发明所述制备预防/治疗慢阻肺的药物为由二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ或其盐Ⅱ作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。

本发明所述制备治疗慢阻肺的药物为由二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ或其盐Ⅳ作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。

所述药物组合物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。

本发明为预防治疗慢阻肺提供了新的药物，有较好的临床应用前景，有较大的社会效益。

附图说明

图1灌胃给予化合物Ⅰ和Ⅳ后，小鼠显微镜下观察得到的肺组织及支气管HE 染色病理切片，其中A为空白对照组、B为模型组、C为化合物Ⅰ(30mg/kg)、 D为化合物Ⅳ低剂量组(15mg/kg)、E为化合物Ⅳ高剂量组(30mg/kg)。

具体实施方式

以下实施例使用原料和试剂除另有说明外均市售得到。

实施例1线叶旋覆花内酯A的制备(按中国专利201510549327.9公开的方法制备)

将线叶旋覆花干燥全草50Kg粉碎，以90％乙醇750L回流提取2次，每次 2小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含线叶旋覆花1.0g，流浸膏加水50L稀释后，以石油醚每次50L萃取5次，得到石油醚部分。将石油醚部分应用硅胶柱层析，以体积比为100：0～1：1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，收集含线叶旋覆花内酯A的流分，再经C₁₈反相柱层析，以重量比为50：100-70：100的甲醇/水进行洗脱，薄层层析检测，得线叶旋覆花内酯A纯品45.3g。

(得到的化合物先采用质谱测定分子量366，分子式C₁₉H₂₆O₇，再进行核磁共振分析得到碳谱、氢谱以及二维谱数据，进行结构解析，与已知化合物线叶旋覆花内酯A的数据一致得到确证)。

实施例2 4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A的制备(按中国专利201510549327.9公开的方法制备)

取线叶旋覆花内酯A(10.0g,0.027mol，1.0eq)，对二甲氨基吡啶(DMAP) (4.0g,0.033mol,1.2eq)和乙酸酐(Ac₂O)(3.34g,0.033mol,1.2eq)置于500 mL茄形瓶中，加入200mL无水二氯甲烷(CH₂Cl₂)，室温(25℃)搅拌12h。薄层层析监测反应情况，待原料反应完全后，加水200mL淬灭，置分液漏斗中，弃去水层，有机层再加水100mL萃取，弃去水层，重复此步骤，直至有机层中检测不出DMAP(对二甲氨基吡啶)(TLC法)，有机层再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠(Na₂SO4)干燥，40℃减压蒸除溶剂，硅胶柱层析，以体积比为15:1～5:1 的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，得4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A(10.5g,0.026mol)，产率94％。检测证实为该化合物：

¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.14(dt,J＝3.8,1.1Hz,1H),5.51(dd,J＝ 3.2,1.6Hz,1H),5.26–5.19(m,1H),5.15(dt,J＝8.6,1.6Hz,1H),4.91(t,J＝7.8 Hz,1H),4.49–4.42(m,1H),3.01–2.93(m,1H),2.43–2.36(m,1H),2.08–2.06 (m,3H),2.03(q,J＝1.2Hz,3H),2.00–1.93(m,6H),1.89(dd,J＝12.0,5.9Hz,1H), 1.48–1.38(m,1H),1.08(d,J＝1.2Hz,3H),0.97(dd,J＝6.4,1.4Hz,3H)；¹³C NMR (125MHz,Chloroform-d)δ170.7,170.3,169.7,168.9,137.9,121.2,76.1,75.0,73.7, 73.6,52.4,50.3,50.3,43.9,34.2,29.8,21.2,21.1,20.9,20.3,17.3.。

实施例3二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ的制备(按中国专利201510549327.9公开的方法制备)

取上述4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A(10.0g,0.024mol,1.0eq)，二甲胺盐酸盐(CH₃NHCH₃·HCl)(3.0g,0.037mol,1.5eq)置于500mL茄形瓶中，加入200mL 乙醇溶解，反应瓶置于低温冷却槽中，0℃时，慢慢滴加三乙胺(NEt₃)(5.1mL, 0.037mol,1.5eq)，然后将反应体系慢慢升至室温(25℃)，搅拌，薄层层析监测反应，4h后，原料反应完全，减压蒸除溶剂，得粗品，粗品加200mL二氯甲烷溶解，加水100mL萃取，弃去水层，重复此步骤，直至有机层检测不出二甲胺盐酸盐。有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠(Na₂SO4)干燥，硅胶柱层析，以体积比为15:1～1:1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，得到二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ(10.0g,0.022mol)，产率 90％。

¹H-NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.27(dd,J＝10.7,8.6Hz,1H),5.04(d,J ＝9.5Hz,1H),4.92(ddd,J＝9.2,6.8,2.1Hz,1H),4.40(ddd,J＝11.7,10.1,2.8Hz, 1H),2.69–2.61(m,2H),2.53(dd,J＝9.3,6.5Hz,1H),2.45(dd,J＝13.1,5.3Hz, 1H),2.36(ddd,J＝13.2,4.5,2.8Hz,1H),2.18(s,6H),2.08–2.05(m,1H),2.03(s, 4H),2.01(s,3H),1.97(s,3H),1.96–1.87(m,2H),1.40(dt,J＝13.1,11.9Hz,1H), 1.12(s,3H),0.97(d,J＝6.5Hz,3H)；¹³C-NMR(125MHz,Chloroform-d)δ176.6, 170.4,170.3,169.5,77.2,76.2,76.1,74.9,74.3,57.4,50.0,50.0,48.7,46.9,46.3, 43.8,34.3,29.4,21.1,21.1,20.8,20.16,18.5。

实施例4二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A的富马酸盐Ⅳ的制备(按中国专利201510549327.9公开的方法制备)

将实施例3制得的化合物Ⅰ(10.0g，0.022mol)，溶于200mL无水甲醇中，加入分析纯富马酸(2.6g，0.022mol)，室温(25℃)搅拌反应半小时，40℃， 0.03～0.1MPa减压浓缩除去甲醇得化合物Ⅳ(12.6g，0.022mol)。

¹H-NMR(500MHz,D₂O)δ6.72(d,J＝1.1Hz,2H),5.23–5.16(m,2H),5.00 (td,J＝6.8,4.5Hz,1H),4.90–4.84(m,1H),3.66(dd,J＝13.4,11.5Hz,1H),3.44 (td,J＝11.4,4.0Hz,1H),3.36(s,1H),2.98(dd,J＝13.3,4.0Hz,7H),2.72(d,J＝ 11.5Hz,1H),2.42–2.36(m,1H),2.17(s,3H),2.14(d,J＝6.7Hz,1H),2.12(d,J＝ 1.0Hz,3H),2.11–2.07(m,2H),2.06(s,3H),1.50(q,J＝12.2Hz,1H),1.20(s,3H), 0.98(d,J＝6.5Hz,3H)；¹³C-NMR(125MHz,D₂O)δ177.18,173.61,173.50,172.41, 170.9(2×C),134.8(2×C),79.0,77.0(2×C),75.7,75.0,57.2,49.6,49.6(2×C),49.2, 42.1,41.7,33.3,28.3,20.7,20.5,20.4,19.3,17.2.

按实施例4的方法，用相应的其它盐可以制备二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A盐酸盐Ⅲ、硝酸盐V、氢溴酸盐VI、硫酸盐VII、乳清酸盐VIII、柠檬酸盐IX、对甲苯磺酸盐X或丁二酸盐X。

化合物V：

¹H NMR(400MHz,(CD₃)₂SO)8.92(s,1H),5.03-5.10(m,2H),4.89-4.94(m,1H),4.65-4.71(m,1H),3.46-3.52(m,1H),3.36-3.39(m,1H),2.81-2.87(m,4H),2.73(s, 3H),2.63(q,J＝10.0Hz,1H),2.18-2.21(m,1H),2.05(s,3H),2.02(s,3H), 1.83-1.99(m,7H),1.41(q,J＝11.6Hz,1H),1.09(s,3H),0.89(d,J＝5.6Hz,3H).

化合物VI：

¹H NMR(400MHz,(CD3)2SO)8.96(br,1H),5.01-5.09(m,2H),4.91-4.94(m,1H),4.66-4.72(m,1H),3.32-3.40(m,2H),2.59-2.85(m,8H),2.18-2.21(m,1H),2.05(s, 3H),2.02(s,3H),1.83-1.99(m,7H),1.41(q,J＝12.0Hz,1H),1.10(s,3H),0.89(d,J ＝5.6Hz,3H).

化合物VII：

¹H NMR(400MHz,(CD3)2SO)8.92(s,1H),5.01-5.09(m,2H),4.91-4.94(m,1H),4.66-4.72(m,1H),4.52(br,1H),3.47-3.53(m,1H),3.34-3.40(m,1H),2.79-2.88(m, 4H),2.73(s,3H),2.63(q,J＝10.0Hz,1H),2.18-2.21(m,1H),2.05(s,3H),2.02(s, 3H),1.83-1.99(m,7H),1.41(q,J＝11.6Hz,1H),1.10(s,3H),0.89(d,J＝5.6Hz, 3H).

化合物VIII：

¹H NMR(400MHz,(CD3)2SO)11.05(s,1H),9.93(s,1H),5.83(s,1H),5.02-5.07(m,2H),4.90-4.93(m,1H),4.61-4.67(m,1H),3.68(br,1H),3.06-3.14(m,2H),2.79 (d,J＝11.6Hz,1H),2.65(q,J＝10.0Hz,1H),2.56(s,6H),2.18-2.22(m,1H),2.02 (s,3H),2.00(s,3H),1.82-1.98(m,7H),1.38(q,J＝12.0Hz,1H),1.09(s,3H),0.88 (d,J＝6.0Hz,3H).

化合物IX：

1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)11.44(br,1H),8.33(br,1H),5.97(d,J＝3.2Hz, 1H),5.35(d,J＝2.8Hz,1H),5.01-5.10(m,2H),4.91-4.95(m,1H),4.64-4.70(m, 1H),3.22-3.29(m,2H),2.55(s,6H),2.54(dd,J＝31.2,15.2Hz,4H),2.17-2.22(m, 1H),2.11(s,2H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),1.91-2.01(m,7H),1.52(q,J＝12.0Hz, 1H),1.07(s,3H),0.89(d,J＝6.4Hz,3H).

化合物X：

¹H NMR(400MHz,(CD3)2SO)8.92(s,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),7.12(d,J＝8.0Hz,2H),5.01-5.09(m,2H),4.91-4.94(m,1H),4.66-4.72(m,1H),3.47-3.53(m,1H), 3.33-3.40(m,1H),2.81-2.88(m,4H),2.73(s,3H),2.63(q,J＝10.0Hz,1H),2.29(s, 3H),2.17-2.20(m,1H),2.04(s,3H),2.02(s,3H),1.83-1.98(m,7H),1.41(q,J＝11.6 Hz,1H),1.09(s,3H),0.88(d,J＝5.6Hz,3H)。

实施例5化合物Ⅰ和Ⅳ的动物药效试验

5.1LPS呼吸道滴注联合吸烟所致小鼠COPD模型的建立

将香烟放入烟雾发生器(20支/次)，将小鼠放置于雾化吸入箱中，雾化箱尺寸为60厘米×60厘米×80厘米，点燃香烟后，通过注射器自动抽吸作用将烟雾注射进染毒箱内，五分钟内全部燃完。每天早晚两次，每次30min，间隔4 小时以上，连续60天。

第29及58天，除空白对照组外，其余组小鼠均采用10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，待麻醉后暴露气管，并使用1ml注射器向气管中快速注入 15ug/20ul/20g体重，完成后迅速将小鼠直立旋转10-20s，使LPS溶液均匀分布于肺叶中。

布地耐德混悬液用生理盐水稀释后放入雾化杯中给药30min，雾化液浓度为0.5mg/ml，每次2毫升。布地奈德雾化吸入给药，每天一次，从第31天到第60 天。

5.2给药方式

化合物Ⅰ(45mg)用研钵研碎后，分散于30ml注射用水中给药，给药剂量 30mg/kg；化合物Ⅳ(150mg)直接溶于100ml注射用水中用于给药剂量30mg/kg，另取10ml，用注射用水稀释至20m，用于给药剂量15mg/kg，给药体积为0.2ml/10g 体重。化合物Ⅰ和Ⅳ均每三天配制一次。

化合物Ⅰ和Ⅳ从造模的第31天开始给药，至第60天结束，每天给药一次。

5.3样品采集及测定

所有受试动物于第60天给药后1h，用1％的戊巴比妥钠溶液按0.1ml/10g体重的剂量腹腔注射，待动物麻醉后，迅速剪开颈部皮肤，分离气管，在气管上剪一小口，插入套管，连上肺功能测试仪，进行肺功能检测；检测完毕后摘眼球取血后打开胸腔，进行肺灌流，取灌流液后取出肺脏保存。

(1)肺功能的测定

以戊巴比妥钠麻醉小鼠后，行气管插管术，用AniRes2005肺功能测试仪对每只动物进行用力肺通气(FVC)相关指标的测量，包括小鼠肺活量(FVC)、小鼠用力肺通气(FEV0.15/FVC％，指在0.15s内小鼠呼出的气体体积，既在第一个0.15秒内，小鼠呼出的气体体积占总呼气气体的百分比，该值越大，说明呼气越通畅，气流流速越大，单位时间内呼出的气体就多)、用力中期呼气流速(FEF)25_75/FVC％，即在小鼠占大部分呼气体积分数段25％-75％内的呼气流速和肺活量之比，该值越大，说明呼气越通畅，气流流速越大)、小鼠用力最大呼气流速(PEF)，测试小鼠的相关肺功能指标。

(2)支气管肺泡灌流液中性粒细胞百分比及细胞因子测定

用4℃无菌生理盐水0.4ml、0.4ml、0.2ml静脉留置针气管插管灌洗3次，回收率大于80％为合格标本。1500r/min离心10min后取上清液分装置于－80℃冻存。用ELISA试剂盒测定小鼠肺组织灌洗液中IL-6、IL-17、TNF-α、IL-1β、蛋白酶MMP2的水平。

离心后的沉淀用PBS(磷酸缓冲液)悬浮后，涂片，用瑞氏-吉姆斯染色，以显微镜对中性粒细胞等炎性细胞进行观察计数，观察100个有核细胞中中性粒细胞的个数，计算中性粒细胞的百分比。

(3)肺病理观察

将小鼠右肺组织取出，4％甲醛固定、石蜡包埋、切片、H&E染色后进行病理观察。测量计算平均内衬间隔(mean linear intercept，MLI)。

5.4数据处理

数据均以Mean±SD(平均值±标准偏差)表示，显著性分析采用One way ANOVA，以p＜0.05为具有统计学意义。

5.5实验结果

(1)对COPD小鼠肺功能的影响

如表1所示，和空白对照组小鼠的FVC比较，模型组小鼠FVC、 FEV0.15/FVC％、FEF25_75/FVC％、PEF均显著下降，(p<0.01)；各给药组小鼠的肺功能指标与模型组相比均显著上升(p<0.01)，且化合物Ⅳ15、30mg/kg 存在量效关系。

表1化合物Ⅰ和Ⅳ对COPD小鼠肺功能的影响

注：^##p<0.05vs空白组。^*p<0.05,^**p<0.01vs模型组

(2)对小鼠肺组织灌洗液中的中性粒细胞百分比、炎性细胞因子及蛋白酶 MMP2的表达。

如表2所示，相比空白组，模型组小鼠肺组织灌洗液中的中性粒细胞百分比显著升高(p<0.05)，炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17及蛋白酶MMP2 均显著升高(p<0.05)，相比模型组，化合物Ⅰ(30mg/kg)和Ⅳ(15、30mg/kg) 均显著降低上述指标(p<0.05)。

表2化合物Ⅰ和Ⅳ对COPD小鼠肺组织灌洗液中的中性粒细胞百分比、炎性细胞因子和蛋白酶MMP2表达的影响。

注：^##p<0.05vs空白组，^**p<0.01vs模型组

(3)肺组织病理及形态学测量

H&E染色显示模型组小鼠肺支气管壁增厚、肺组织炎性浸润、肺泡融合，各给药组炎性浸润和肺泡融合均明显减少(见附图1)。

平均内衬间隔(mean linear intercept,MLI)的测量：每张切片随机选取视野，测量时避开支气管及血管，在每个视野正中划“十”字交叉线，计数与十字线相交的肺泡隔数(Ns)，同时测出十字线总长(L)，按公式MLI＝L/Ns计算平均内衬间隔，以表示肺泡平均内径；该指标反映平均肺泡直径大小。

如表3所示，烟熏联合LPS气道感染导致小鼠平均内衬间隔显著升高，与模型组相比，化合物Ⅰ(30mg/kg)和Ⅳ(30mg/kg)均可显著降低小鼠平均内衬间隔水平，化合物Ⅳ15mg/kg有降低的趋势，但作用不显著。

表3化合物Ⅰ和Ⅳ对COPD小鼠肺组织平均内衬间隔的影响

注：^##p<0.05vs空白组，^**p<0.01vs模型组

5.6毒性

小鼠分别以200、600、1800、5400单次灌胃给药化合物Ⅰ，每个剂量组6 只，雌雄各半。200mg/kg、600mg/kg组小鼠无明显毒性反应，1800mg/kg组死亡一只雌性小鼠，5400mg/kg组死亡5只小鼠。结果显示化合物Ⅰ安全性较好。

SD大鼠单次灌胃给药化合物Ⅳ500、1000、2000mg/kg，每个剂量组10只，雌雄各半，除最高剂量组死亡2只动物外，其他组未见明显异常，显示化合物Ⅳ安全性较好。

5.6结论

化合物Ⅰ和Ⅳ灌胃给药对香烟烟雾合并脂多糖所致COPD小鼠的肺功能低下有显著改善作用，可显著抑制由香烟烟雾合并LPS暴露所致COPD小鼠炎症细胞的浸润、促炎细胞因子的表达。说明化合物Ⅰ和Ⅳ可用于制备预防治疗慢阻肺的药物。

实施例6片剂制备

制备方法：化合物Ⅰ、乳糖和玉米淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛(60目)，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重300mg，含式化合物Ⅰ25mg。

实施例7：注射液制备

实施例4制得的化合物Ⅳ 5g

葡萄糖 50g

制备方法：将式化合物Ⅳ和葡萄糖溶解于100L注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入输液瓶(每瓶100ml)中，每瓶含化合物Ⅳ5mg。

实施例8：注射用冻干粉针剂制备

实施例4制得的化合物Ⅳ 10g

甘露醇 30g

制备方法：将化合物Ⅳ和甘露醇溶解于2L的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入西林瓶(10ml西林瓶，每瓶2ml)中，冻干，每支含化合物Ⅳ10mg。

Claims (9)

1.二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A及其盐在制备预防/治疗慢阻肺药物中的应用，其特征在于，所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A的结构以式Ⅰ所示：

所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接受的盐，以式Ⅱ所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接受的盐由二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A与HX制成。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述HX选自盐酸、硫酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、亚硫酸、硝酸、碳酸、硼酸、亚硒酸、磷钼酸、亚磷酸、柠檬酸、马来酸、D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸、D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸、草酸、磺酸，苯磺酸、取代苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、酞酸、酒石酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、枸橼酸、苯甲酸或取代苯甲酸。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接受的盐选自二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A7、硝酸盐V、氢溴酸盐VI、硫酸盐VII、乳清酸盐VIII、柠檬酸盐IX、对甲苯磺酸盐X或丁二酸盐XI；以下式所示：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接受的盐选自二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A盐酸盐Ⅲ或富马酸盐Ⅳ。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ在制备预防/治疗慢阻肺药物中的应用。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为由二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物的盐Ⅱ作为活性成分与药用载体制成的药物组合物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为由二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物的富马酸盐Ⅳ作为活性成分与药用载体制成的药物组合物。

9.根据权利要求7-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。