WO2008044611A1 - Ipv-dpt vaccine - Google Patents

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WO2008044611A1
WO2008044611A1 PCT/JP2007/069509 JP2007069509W WO2008044611A1 WO 2008044611 A1 WO2008044611 A1 WO 2008044611A1 JP 2007069509 W JP2007069509 W JP 2007069509W WO 2008044611 A1 WO2008044611 A1 WO 2008044611A1
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WO
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poliovirus
cells
solution
virus
vaccine
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PCT/JP2007/069509
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shinobu Abe
Bunsichi Simizu
Original Assignee
Japan Poliomyelitis Research Institute
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a combination vaccine, particularly a combination vaccine containing an inactivated Sabin strain poliovirus (s IPV), and a method for producing the same.
  • s IPV Sabin strain poliovirus
  • Polio is an infection caused by poliovirus. Poliovirus infects humans orally, grows in the intestine, and enters the central nervous system through the blood. Poliovirus that has entered the central nervous system proliferates in large motor neurons, causing the detouring of the trajectory neurons, and acute flaccid paralysis in the extremities. Also, if the poliovirus invades the respiratory center of the medulla, it can lead to death from respiratory paralysis. Poliovactin is widely used to suppress the development of polio that causes such severe symptoms.
  • Oral live polio vaccine is a vaccine using an attenuated strain of poliovirus (sebin strain). Orally administered attenuated poliovirus causes normal infection. Polioviruses derived from an oral live polio vaccine grow well in the human intestinal tract and, as a result, form local immunity. Furthermore, poliovirus derived from an oral live polio vaccine enters the blood and causes viremia, thereby promoting the production of antibodies in the blood. However, the ability of the attenuated strain of poliovirus to grow in the central nervous system is so weak that it usually does not cause paralysis.
  • poliovirus derived from oral polio vaccine grows and is discharged from the stool about 4 to 6 weeks after inoculation. This evacuated virus infects humans with weak or non-immunity against polio around the recipient and shows the same immunizing or enhancing effect as in the recipient.
  • an attenuated poliovirus derived from an oral live polio vaccine is likely to become more virulent while repeatedly multiplying in the recipient's body or repeatedly growing in the human body infected with the shed virus. May cause mutation. Depending on the mutant In rare cases, vaccine-related paralysis may occur.
  • An inactivated polio vaccine is a vaccine in which poliovirus is inactivated by formalin to lose its infectivity. Inactivated polio vaccines do not propagate in the recipient's body or infect the human surrounding the recipient, and thus do not cause vaccine-related paralysis.
  • highly virulent strains have been used, but in recent years the development of attenuated strains (Sabin strains) has also been promoted (Biologicals 34 (2006) 151-154, Dev Bi l. Basel. Karger, 2001, vol. 105, pp 163-169, Clinical and Viruses Vol. 30 No. 5 (2002. 12) 336-343).
  • the disadvantage was that the growth of the attenuated strain (Sabin strain) was slightly worse than that of the highly virulent strain.
  • Vaccines containing pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid are widely used as pertussis diphtheria tetanus mixed vaccines.
  • a multivalent vaccine comprising an acellular pertussis vaccine, diphtheria toxoid, tetanus toxoid and inactivated poliovirus is known (Japanese Patent Publication No. 2000-504032).
  • Vero cells are passage cells derived from the kidneys of green monkeys and are widely used for virus culture because of their broad sensitivity to various viruses. Vero cells are cultured on microcarriers, and the ability to produce enterovirus 71 vaccines, including propagating enterovirus 71 using the cultured V ero cells, has been reported. Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development: Suh— Chin Wu, etc., Vaccine, 22, 3858-3864, 2004). General cell culture conditions using microcarriers have also been reported (Microcarrier cell culture principles & methods: Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988). Disclosure of the invention
  • inactivated Sabin strain poliovirus including the process of producing high titer Sabin strain poliovirus, and pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid (DPT)
  • s IPV inactivated Sabin strain poliovirus
  • DPT tetanus toxoid
  • a method for producing a combination vaccine comprising
  • microcarrier is a dextran microcarrier.
  • Step (a) The method according to (1) above, characterized in that it is carried out at a scale of about 3 L or more.
  • Step (a) The method according to (1) above, which is performed at a scale of about 30 L or more force;
  • Step (a) The step of culturing Vero cells (Step (a)) The method according to (1) above, characterized by being performed at a force S and a scale of about 3 L or more;
  • Step (a) The step of culturing Vero cells (Step (a)) The method according to (1) above, characterized in that it is carried out at a scale of about 30 L or more.
  • High-titer Sabin strain poliovirus can be obtained by culturing Vero cells inoculated with Sabin strain poliovirus in the presence of about 4 g, L to about 6 gZL of microcarriers. By using a high titer Sabin strain poliovirus, an inactivated Sabin strain poliovirus can be efficiently produced.
  • the method for producing a mixed vaccine comprising the step of culturing Vero cells inoculated with the Sabin strain poliovirus in the presence of about 4 gZL to about 6 gZL microcarriers (the production method of the present invention) is an inactivated Sabin strain. It is useful as an efficient method for producing a mixed vaccine containing poliovirus.
  • FIG. 1 is a graph showing a growth curve of V ero cells in culture of V ero cells by the microcarrier method.
  • 3L shows a microcarrier 3 g / L in starting cell number of about 2xl0 5 ce ll S / mL (low concentration).
  • 3H shows a microphone Rokya Li Ah 3 g / L in starting cell number of about 10xl0 5 cells / mL (high concentration).
  • 5L is about the number of starting cells 2xl0 5 cells / mL (low concentration) indicates microcarrier 5g / L.
  • 5H indicates a microcarrier of 5 g / L with a starting cell number of about 10xl0 5 cells / mL (high concentration).
  • Fig. 2 is a graph showing the infectivity titer (virus titer) of type I poliovirus obtained from Vero cells cultured under various conditions.
  • 3L is, V er cultured micro Kiyari ⁇ over 3 g / L at about 2xl0 5 cells / mL starting cell number (low density). It shows type I poliovirus obtained in cells.
  • 5L shows a type I Porio virus obtained in V ero cells cultured in the micro Kiyari ⁇ over 5 g / L at about 2xl0 5 cell S / mL starting cell number (low concentration).
  • 5H shows a type I poliovirus obtained in the V ero cells cultured in microcavity Yaria one 5 g / L in starting cell number of about 10xl0 5 cells / raL (high concentration).
  • Ref. refers to a type I poliovirus that was propagated using kidney monkey cells.
  • the present invention relates to an inactivated Sabin strain poliovirus (s IPV), and a pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and 3 ⁇ 4 ⁇ ′ tetanus, comprising a step capable of producing a high titer Sabin strain poliovirus.
  • a method for producing a combination vaccine containing toxoid (DPT) is provided.
  • the Sabin strain poliovirus means a poliowinoles strain derived from an attenuated strain of poliovirus isolated by Dr. Albert B. Sabin (Sabin AB, Boulger LR. History of 3 ⁇ 4abin attenuated po ⁇ lovirus oral live vaccine strains. See J. Biol. Standard 1973, 1, 115-118, etc.).
  • Sabin strain polioviruses include Sabin type I poliovirus, Sabin type II poliovirus and Sabin type III poliovirus.
  • Sebin 1 type I poliovirus include LS c, 2 ab strain.
  • Examples of the Sabin type II strain poliovirus include the P 7 12, Ch, 2 ab strain and the like.
  • Examples of the Sabin type III strain poliovirus include Leon, 12 ab strain and the like.
  • inactivation of a virus means that the infectious ability of the virus is lost.
  • inactivation methods include physical methods (eg, methods using X-ray irradiation, heat, ultrasonic waves, etc.), chemical methods (eg, methods using formalin, mercury, alcohol, chlorine, etc.), etc. However, it is not limited to these.
  • Poliovirus can be inactivated by a known method (for example, see Biologicals 34 (2006) 151-154). Specifically, for example, it can be inactivated by treating polyol with formalin.
  • Inactivated Sabin strain polioviruses usually contain a mixture of two viral antigens called D and C antigens.
  • D antigen is a complete viral particle. Antibodies against the D antigen have the ability to neutralize the infectivity of live viruses and function as protective antibodies.
  • the C antigen is called a defective particle, which is a particle obtained by multiplying a complete virus particle by the central nucleic acid RNA and a part of the virus protein, and is a hollow particle. Antibodies against the C antigen have little or no ability to neutralize live virus infectivity. Therefore, D antigen is required when using an inactivated Sabin strain poliovirus as a vaccine.
  • poliovirus There are three types of poliovirus: type I, type I I, and type I I I. Immunity against poliovirus infection is specific to three types of viruses, type I, type I I, and type I I type I, with little if any cross-immunity between the types. D-antigen of type I, type II and type III inactivated Sabin strain poliovirus can produce neutralizing antibodies against poliovirus of type I, type II and type III wild strains (immunity strains) respectively It has originality.
  • D antigen of inactivated Sabin strain poliovirus has different immunogenicity in each of type I, type II and type III, and neutralizes wild type (strongly virulent) type I, type II and type III poliovirus The amount of D antigen required to produce sufficient antibody to do this varies depending on the virus type.
  • inactivated poliovirus As mentioned above, there are three types of poliovirus, type I, type II, and type III, and all types cause the same polio. Therefore, when inactivated Sabin strain poliovirus is used as a vaccine (inactivated polio vaccine), it is necessary to neutralize poliovirus of wild type (strongly virulent) type I, II and III. It is necessary to have an immunogenicity capable of producing sufficient antibodies, and it is preferable that the immunogenicity is close to the immunogenicity of an inactivated polio vaccine derived from a virulent strain conventionally used. .
  • vaccines can be used to inactivate type I, type II and type III inactivated Sabin strain polioviruses in amounts of D antigen of 2-4: 80 to 120: 800. It is preferably contained in a ratio of ⁇ 1 20, and in particular, it is preferably contained in a ratio of about 3: about 100: about 100.
  • the inactivated Sabin strain poliovirus used in the present invention has an inactivated polio vaccine (eg, soak vaccine) derived from a highly virulent strain by having the specific ratios of type I, type II and type III as described above. Shows similar immunogenicity.
  • the inactivated Sabin strain poliovirus used in the present invention can be produced by the following method.
  • Vero cells are cultured in the presence of about 4 g / L to about 6 g ZL of microcarriers to obtain poliovirus culture cells.
  • the obtained poliovirus culture cells are inoculated with a seed virus (Sabin strain poliovirus), and the virus is cultured to obtain a Sabin strain poliovirus grown.
  • the obtained Sabin strain poliovirus is inactivated to obtain an inactivated Sabin strain poliovirus.
  • the species virus used Sabin I strain, Sabin I I strain or Sabin I I strain
  • the corresponding inactivated Sabin strain poliovirus can be obtained.
  • the virus may be concentrated and / or purified before or after virus inactivation.
  • inactivated polio vaccines must have immunogenicity that can produce sufficient antibodies to neutralize wild-type (strongly virulent) strains of type I, type II and type III. It is.
  • the D antigen of inactivated Sabin strain poliovirus has different immunogenicity in each of type I, type I I and type I I I. Therefore, inactivated polio vaccines with immunogenicity capable of producing sufficient antibodies to neutralize wild-type (strongly virulent) strains of type I, type II and type III contain I It can be obtained by regulating the amount of inactivated poliovirus of type II, type II and type III.
  • Vero cells are passage cells derived from the kidneys of green monkeys (Cercopi thecus aethiops) and are registered in the ATCC (American Type Culture Collection). Vero cells have a fibroblast-like morphology, have a wide range of susceptibility to various viruses, and are easily used for subculture and maintenance. Ver available from ATCC. Examples of cells include ATCC number CCL_81, CRL-
  • microcarrier means a carrier that allows cells to adhere to the surface and that can be cultured in a suspended state in a liquid medium. There are no particular restrictions on the material, shape, size, etc., as long as the carrier can attach cells to the surface and cultivate cells in a liquid medium in a suspended state.
  • microcarrier material examples include dextran, gelatin, collagen, polystyrene, polyethylene, polyacrylamide, glass, and cellulose.
  • dextran is preferable.
  • shape of the microcarrier examples include a spherical shape (bead) and a disk shape. The shape of the microcarrier is preferably spherical.
  • the size of the spherical microcarrier is, for example, about 0.1 to 1 mm, preferably about 0.05 to 0.5 mm, and more preferably about 0.1 to 0.3 mm.
  • the microcarrier may be porous.
  • Examples of the spherical microcarrier used in the present invention include Cytodex 1 (trade name), Cytodex 3 (trade name), and Cytopore (trade name) (hereinafter, manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • Examples of the disk-shaped microcarrier 1 include Cytol ine 1 (trade name), Cytol ine 2 (trade name) (above, manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • Examples of the porous microcarrier include Cytopore (trade name), Cytol ine 1 (trade name), and Cytol ine 2 (trade name) (above, manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • a spherical dextran micro-mouth carrier is particularly preferable.
  • Cytodex 1 (trade name), Cytodex 3 (trade name) and Cytopore (trade name) are preferred as spherical dextran microcarriers, and Cytodex 1 (trade name) and Cytodex 3 (trade name) are more preferred. Cytodex 1 (trade name) is particularly preferable.
  • Vero cells are grown by culturing in the presence of about 4 g / L to about 6 gZL of microcarriers.
  • the microcarrier concentration is preferably about 4.5 g, L to about 5.5 gZL, more preferably about 5 gZL.
  • the above-mentioned step of growing Vero cells is performed on a scale of preferably 3 L or more, more preferably 30 L or more, and particularly preferably 150 L or more as a liquid volume.
  • the process of growing Vero cells is usually performed on a scale of 1 000 L or less.
  • the medium When cultivating Vero cells in the presence of a microcarrier, the medium may be, for example, an ME medium containing about 5 to 20 V o 1% fetal bovine serum or fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 ( 1952)], DME medium [Virology, Vol. 8, 396 (1959)], RPMI 1 6 4 0! 3 ⁇ 4 ⁇ he Journal of the American Medical Association 199 ⁇ , 519 (1967)], 1 9 9 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 ⁇ , 1 (1950)), etc.
  • DME medium is preferable, and DME medium containing pup sera is particularly preferable, about 5 vol%.
  • DME medium containing pup sera of chick is preferred
  • the medium is replaced as needed during the cell culture period, preferably at a pH of about 6-8, and more preferably at about 6.5-7.5. It is preferably about 7, especially about 7.
  • the culture is usually carried out at about 35 ° C to 40 ° C for about 5 to 9 days, and if necessary, aerated or aerated.
  • Dissolved oxygen concentration during cell culture (D0) is preferably from about 60 to 90%, more preferably in the range of about 70 to 80%, is preferably in particular about 75%.
  • the cell number (starting cell number) of the Vero cells in the medium at the start of culture in the presence of microcarriers can be appropriately set according to the type of medium, microcarriers, culture scale, and the like.
  • the number of starting cells is preferably 2 10 4 cells / ( ⁇ ⁇ 10 10 5 cells, particularly 2 10 5 cells / ⁇ 10 10 5 cells / 111 cells.
  • Poliovirus is cultured by inoculating the cultured cells of Vero cells with Sabin strain poliovirus (seed virus) and culturing poliovirus in the cells. Can be done by. Infected cells can be cultured in the same manner as described above for Vero cells.
  • the medium used for culturing poliovirus is preferably 19.9 medium, more preferably 19.9 medium supplemented with sodium hydrogen carbonate, especially 19.9 medium supplemented with 0.3 w / v% sodium carbonate. preferable.
  • the culture temperature during virus cultivation is preferably about 30 ° C to 38 ° C, more preferably about 32 ° C to 36 ° C, and particularly about 33 ° C to 35 ° C. It is preferred to be at ° C.
  • the duration of virus culture is preferably about 1-5 days, more preferably about 2-4 days, particularly preferably about 3 days. Viral culture can be terminated using the cytopathic effect of poliovirus (poliovirus-infected cells cause cell rounding and detachment from the microcarrier) as an index.
  • poliovirus poliovirus-infected cells cause cell rounding and detachment from the microcarrier
  • a seed virus a Sabin strain poliovirus that has been cultured in advance using cultured primary monkey kidney cells may be used.
  • a virus solution containing the poliovirus (sometimes called a poliovirus solution) is collected.
  • the removal of the microcarrier can be performed using, for example, a Teflon mesh (for example, a pore diameter of 120 ⁇ m). Since the poliovirus remains (attaches) to the microcarriers remaining on the mesh, the poliovirus may be recovered by washing with a virus culture solution or the like.
  • the resulting poliovirus solution may be filtered through a filtration membrane (for example, a 0.2 / m filtration membrane) to remove cell debris.
  • a filtration membrane for example, a 0.2 / m filtration membrane
  • the poliovirus solution may be concentrated and / or purified before or after inactivation.
  • Concentration methods include ultrafiltration, ultracentrifugation, and dialysis. Concentration methods are preferably ultrafiltration and ultracentrifugation, more preferably ultrafiltration and ultracentrifugation, and ultrafiltration after ultrafiltration. It is preferable.
  • an ultrafiltration membrane usually used for virus concentration can be used.
  • the molecular weight cutoff of the ultrafiltration membrane is preferably about lOOkDa.
  • the material of the ultrafiltration membrane is polyethersulfone. Is preferred.
  • Concentration of poliovirus by ultracentrifugation can be performed, for example, by pelletizing poliovirus solution by ultracentrifugation at 100,000g for 4 hours at 4 ° C.
  • the pellet may be resuspended in phosphate buffer or the like.
  • the aggregates can also be loosened by sonicating the resuspended pellet.
  • the ultrasonic treatment can be performed using a commercially available apparatus such as INSONATOR MODEL 200M (KUBOTA).
  • the sonication conditions need only be such that the agglomerates are loosened, and can be appropriately set according to the container used for sonication, the ultrasonic output, the concentration of the resuspended liquid, and the like.
  • sonication conditions include sonication at 200 W for 3 to 10 minutes. Even if such sonication is performed, the immunogenicity of the Sabin strain poliovirus is not lost, and it can be suitably used as a poliovirus vaccine.
  • purification methods include methods that use physical properties such as the size, density, and sedimentation coefficient of the object to be purified, and methods that use chemical or physicochemical reactions (such as adsorption and desorption).
  • purification methods include, for example, density gradient centrifugation, filtration (including ultrafiltration), ion exchange column chromatography, affinity mouthmatography, gel filtration chromatography, and salting out. Law.
  • a column chromatography method is preferable, an ion exchange column chromatography method is more preferable, and a DEAE-ion exchange power column chromatography method is particularly preferable.
  • the number of purifications by column chromatography may be carried out until the required purity is reached, and there is no particular limitation, but it is preferable to carry out it with the minimum number of steps in terms of production efficiency.
  • Concentration and purification are preferably carried out by pelletizing the poliovirus solution by ultracentrifugation, sonicating the resuspended solution of the pellet, and purifying by column chromatography. Furthermore, purification by column chromatography is preferably performed only once in terms of production efficiency.
  • the poliovirus solution can be efficiently and fully concentrated by pelletizing the poliovirus solution by ultracentrifugation, sonication of the pellet resuspension liquid and purification by column chromatography only once. Can be purified.
  • Poliovirus can be inactivated by a commonly used method. More specifically, for example, poliovirus can be inactivated by adding an inactivating agent to the poliovirus solution and reacting the poliovirus with the inactivating agent. As an inactivating agent, formalin is preferred.
  • the inactivation condition is not particularly limited as long as the poliovirus is inactivated.
  • the period of the inactivation treatment is usually about 2 to 4 times, preferably about 2.5 to 3.5 times the period in which inactivation of poliovirus is confirmed, in order to avoid inadequate inactivation of poliovirus. Double, more preferably about 3 times.
  • the amount added is preferably about 0.001 wZv% to 0.1 l wZv%, more preferably about 0.05 wZ v% to 0.05 wZv%, Particularly preferred is about 0.01 wZv%.
  • the inactivation temperature is particularly preferably about 37 ° C.
  • the inactivation period varies depending on the type of inactivation agent, the concentration of the inactivation agent, the inactivation temperature, and the like. For example, when about 0.01 wZv% formalin is used as the inactivating agent and the inactivation temperature is about 37 ° C, the inactivation period is preferably about 8 to 16 days, more preferably about 10 days. ⁇ 14 days, especially about 12 days.
  • the pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid used in the present invention are not particularly limited.
  • Pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid are available as a pertussis diphtheria tetanus combination vaccine (eg Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka Univ.). (Made by Microbial Disease Research Association, Chemistry and Serum Therapy Research Institute). Further, pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid can be obtained by known methods. Specifically, the protective antigen of Bordetella pertussis can be obtained by, for example, physicochemical methods such as the ammonium sulfate fractionation method or the sucrose density gradient centrifugation method.
  • Diphtheria toxoid can be obtained by, for example, purifying and concentrating toxins produced by diphtheria (Park-Williams No. 8) by physicochemical methods such as column chromatography and detoxifying them with formalin. You can also. Tetanus toxoid can be obtained, for example, by purifying and concentrating toxins produced by tetanus bacteria (Harvard strain) by physicochemical methods such as column chromatography and then detoxifying with formalin.
  • Pertussis toxin PT antigen
  • filamentous hemagglutinin FHA antigen
  • outer membrane protein 69KD antigen
  • pili FB antigen, agglutinogen (FGG)
  • the combination vaccine of the present invention contains an inactivated Sabin strain poliovirus, a pertussis-preventing antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid.
  • pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid can be obtained as a commercially available pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine. Therefore, the combination vaccine of the present invention can also be produced by mixing inactivated Sabin strain poliovirus and pertussis diphtheria tetanus combination vaccine.
  • Inactivated Sabin strain poliovirus can be produced by mixing inactivated Sabin type I poliovirus, inactivated Sabin I type I poliovirus, and inactivated Sabin I I type I poliovirus.
  • the inactivated Sabin strain poliovirus is a type I, type II and type III inactivated Sabin strain poliovirus in terms of the D antigen amount 2-4: 80-1120: 80- It is preferably contained in a ratio of 1 20, and particularly preferably in a ratio of about 3: about 100: about 100.
  • the content of tetanus toxoid may be an amount effective for prevention of pertussis, diphtheria and tetanus. More specifically, the content may be the same as the content in the pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine available as a commercial product described above. If the inactivated Sabin strain poliovirus and other components affect the pertussis protective antigen, diphtheria toxoid or the immunogenicity of Z and tetanus toxoid, adjust the content as appropriate. It is possible to produce a combination vaccine effective in preventing each disease.
  • the combination vaccine of the present invention can be produced and used according to conventional means. Specifically, it can be produced and used as described below.
  • the combination vaccine of the present invention can be formulated as an injection according to conventional means.
  • the injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above substance in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • an aqueous liquid for injection for example, isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants is used.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampule or syringe.
  • the combination vaccine of the present invention may contain formulation additives such as a preservative, an antioxidant, and a chelating agent, if necessary.
  • preservatives include thimerosal and 2-phenoxyethanol.
  • chelating agents include ethylenediamine tetrasuccinic acid and daricol ether diamine tetraacetic acid.
  • the combination vaccine of the present invention may further contain an adjuvant.
  • the adjuvant include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and aluminum chloride.
  • the combination vaccine of the present invention may further contain immunogenic components other than inactivated Sabin strain poliovirus, pertussis protective antigen, diphtheria toxoid, and tetanus toxoid.
  • immunogenic components include, for example, immunogenic components against viruses or fungi other than Polyvirus, Bordetella pertussis, Diphtheria, and Tetanus.
  • immunogenic components include toxoids, attenuated viruses, inactivated viruses, proteins, peptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, lipopeptides, or combinations thereof.
  • viruses or fungi include, for example, influenza virus, measles virus, parotitis virus, rubella virus, herpes virus, varicella virus, madness virus, human immunodeficiency virus, hepatitis virus, pneumococcus, marrow Examples include Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, and Influenza b.
  • the combination vaccine of the present invention can be administered parenterally, for example, by subcutaneous injection or intramuscular injection, preferably by subcutaneous injection.
  • the single dose of the combination vaccine of the present invention can be appropriately selected according to various conditions such as the age and weight of the subject.
  • the protective antigen of B. pertussis is 4 international units or more
  • the diphtheria toxoid is about 15 Lf
  • the tetanus toxoid is about 2.5 Lf
  • the inactivated sabin type I poliovirus is about 2 D antigen.
  • the frequency of administration of the combination vaccine of the present invention may be administered 2 to 3 times at intervals of 3 to 8 weeks, for example, as the first immunization.
  • the mixed lucin of the present invention is administered twice as the first immunization, it is preferable to administer a pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine (DPT vaccine) once every 3 to 8 weeks.
  • DPT vaccine pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine
  • booster immunization it may be administered once more at an interval of 6 months or more after the first immunization (for example, between 12 and 18 months after the completion of the first immunization).
  • a stock cell bank for vaccine virus production was prepared from V ero cells obtained from ATCC according to the following procedure.
  • One ampule (134 cells) of the stored cell bank for manufacturing (MWCB) prepared and stored in Reference Example 1 above is stored in the seed cell bank (MCB) and the stored cell bank for manufacturing (MWCB) of Reference Example 1 above.
  • MWCB seed cell bank
  • MWCB stored cell bank for manufacturing
  • the culture scale was expanded to static culture.
  • the stationary culture and its passage were performed in the same manner as the preparation of the seed cell bank (MCB) of Reference Example 1 and the preparation of the preserved cell bank for manufacturing (MWCB).
  • the cells were statically cultured for 7 days in a 40-stage cell factory (Nunk, catalog No. 139446) (137th generation). On the 7th day after the start of static culture, the cells were subcultured for 7 days (138 generations) in 4 units of 40-stage cell factories.
  • the 138 cells obtained in the static culture step (i) above were trypsinized and centrifuged in the same manner as the subculture (i) above, and the sedimented cells were collected in a 1, OOO mL microphone.
  • Cell culture medium for oral carrier culture (5 vo 1% baby sera (Thermo Trace), 0.11% sodium bicarbonate, 0.1% fructose, 20 / Z g / mL erythromycin, 100 mu g / mL kanamycin (final concentration) added DME (Dulbecco 's Modified Eagle' s Medium, sigma, catalog No.
  • the polio vaccine virus-producing cells obtained in Example 1 were allowed to settle immediately before seeding with the seed virus, and the cells were allowed to settle, and 0.075% sodium bicarbonate, 20 ⁇ g / mL erythromycin 100 // g / mL Kanamycin (final concentration) added Washed once with EBSS (Earl's Balanced Salt Solution). Remove 5 mL of cell culture supernatant collected from each microcarrier, add 0.25% trypsin solution to make 5 mL again, remove the cells from the beads, allow them to float, count the number of cells, and measure the entire 50 L volume incubator. Cell number was estimated.
  • Per cell I type of attenuated Sabin strains (LSc, 2ab strains) were inoculated at a concentration of about 10- 3 CCID 5Q seed virus.
  • 50 L of a virus culture solution (0.3% sodium hydrogen carbonate, 20 g / mL erythromycin, lOO ⁇ g / mL kanamycin (final concentration) added M199 (Medium 199)) was injected into the incubator.
  • the seed virus was pre-cultured at about 33.3 ° C using primary cultured cells of African green monkeys, then subdivided and stored frozen at -70 ° C.
  • Viral culture is 34 ° C ⁇ 1. C for 3 days.
  • the cytopathic effect of poliovirus (poliovirus-infected cells round off the cell and then detach from the microcarrier) is used as an index.
  • the virus culture is terminated. It was.
  • the microcarrier was removed through a Teflon mesh (pore size 120 / im), and the virus suspension was recovered.
  • One microcarrier remaining on the mesh was washed once with about a virus culture solution per 50 L volume incubator. This washing solution was added to the collected virus suspension to obtain a “type I poliovirus solution”.
  • PB Phosphate Buffer, 0 ⁇ lmol / L
  • a small pellet of one centrifuge tube (about lOOmL) was resuspended in 5 mL of PB).
  • KUBOTA, INS0NAT0R MODEL 200M was sonicated at 200W for 8 minutes (KUBOTA, INS0NAT0R MODEL 200M) to loosen up the aggregates.
  • the supernatant was collected after centrifugation at 15,000 rpm for 30 minutes.
  • the obtained supernatant was purified by DEAE Sepharose CL-6B (trade name, GE Healthcare Bioscience, GE 17-0710-05).
  • PB Phosphate Buffer: 0.1 mol / L
  • the absorbance of the collected peak was calculated to be 260/280 nm, and it was confirmed that it was 1.5 or more (260/280 nm of a poliovirus complete particle is 1.6 to 1.7).
  • the purified type I poliovirus solution obtained in (ii) above was diluted with the pre-inactivation dilution solution (M199 without Ca, Mg, Phenol Red, and sodium bicarbonate with 5% aminoacetic acid (final concentration) added). It was diluted about 10 times and filtered through a 0.2 / xm filter membrane (Pall, SLK7002NRP) to remove virus clumps. After preparing the filtrate, inactivation was started immediately to prevent the virus from aggregating again. One hour before the start of inactivation, the filtrate and 1: 200 diluted formalin were separately heated at 37 ° C.
  • the amount of D antigen is measured by an indirect ELISA method using an antibody highly specific for the type and D antigen.
  • a D antigen-specific monoclonal antibody derived from a mouse
  • the test antigen is diluted and placed.
  • the second antibody is loaded with the same type of rabbit antibody, which is the same type as the test antigen, and then further reacted with HRPO-labeled anti-rabbit IgG antibody.
  • color is developed using an orthodiylenediamine solution, and then the absorbance at 492 nm is measured. Determine the amount of D antigen of the test antigen by comparing the measured value of the absorbance of the test antibody with the measured value of the control antigen by the parallel line quantification method.
  • Example 3 Production of inactivated polio vaccine type II
  • Bordetella pertussis I phase bacteria (Higashihama strain) were cultured with stirring in Cohenwiller medium at 30 to 34 ° C for 20 to 24 hours. Bordetella pertussis cultured in the Cohenwiller medium was further cultured at 30 to 34 ° C. for 48 to 68 hours in the steiner salt medium.
  • the culture solution was concentrated to 1/10 volume by ultrafiltration, and separated into supernatant and cells by centrifugation.
  • a solution containing pertussis toxin is applied to the gel column.
  • the cells separated in (1) above were dissolved in 0.05 mol / L phosphate buffer (PH8.0) added with lmol / L sodium chloride, and then re-separated into supernatant and cells by centrifugation. 25wZv in the re-separated supernatant. /.
  • a calcium acetate solution was added to a concentration of 0.1 to 2.0 wZv%, and a solution containing fibrous hemagglutinin (infection protective antigen) was obtained by filtration.
  • the filtrate was concentrated with ammonium sulfate and purified by density gradient centrifugation to fractionate purified fibrous hemagglutinin (FHA antigen).
  • the cells re-isolated in (3) above are dissolved in 0.01 mol / L phosphate buffer (pH 7.0) supplemented with 0.145 mol / L sodium chloride, heated at 60 ° C for 90 minutes, and then centrifuged. It was separated again into supernatant and cells.
  • the solution containing the outer membrane protein (infection protective antigen) was collected by SP column chromatography (equilibrium solution: 0.1 lmol / L phosphate buffer (pH 6.0)). Tsugire, in gel strength ram chromatography: after passing through the column by (equilibration solution 0.25 mol / L sodium phosphate added pressure 0.025 mol / L sodium phosphate solution (P H8.7)), filtered (pore The purified outer membrane protein (69K antigen) was obtained with a diameter of 0.2 / xm.
  • the PT antigen, FHA antigen, 69KD antigen and FB antigen obtained in (2) to (5) above are prepared as described in Example 8 below.
  • DPT combination vaccine prepared in Example 8 PTAF 1.89 / ig, FHA antigen 3.00 / ig 69K antigen 0.76; ug and FB antigen 0.36 / zg antigen ratio mixed with target quality
  • the combined solution was used as a purified infection protective antigen solution.
  • Example 6 Provide of diphtheria toxoid
  • Diphtheria (Park Williams No.8) is 32.0-34.0 in refrell medium. C. Cultivated for 5 days.
  • the supernatant obtained after adding ammonium sulfate to the culture solution obtained in (1) above is filtered (pore size 0.45 / im), and the obtained filtrate is subjected to phenyl hydrophobic column chromatography (equilibration solution: 1.25 mol).
  • Tetanus bacteria (Harvard47-A) were cultured in liver and liver broth at 34.5 ° C to 36.5 ° C for 5 days.
  • Ammonium sulfate was added to 1.25 mol / L per 1 L of the culture solution obtained in (1) above. Next, the solution was passed through the column by phenyl hydrophobic column chromatography (equilibrated solution: 1.25 mol / L ammonium sulfate-added 0.01 mol / L sodium phosphate solution (pH 6.5)).
  • Formalin is added to the purified toxin solution obtained in (2) above.
  • the pH was adjusted to 7.0, and the mixture was heated at 39 for 15 to 23 days.
  • 199 medium (M199), final concentration of 0.5 vo 1% 2-phenoxyethanol, and final concentration of 0.09 w / v% aluminum chloride were mixed.
  • the obtained mixed solution was adjusted to pH 7 with sodium hydroxide or hydrochloric acid to obtain a mixed inactivated polio vaccine.
  • the obtained mixed solution was adjusted to pH 7 with sodium hydroxide and hydrochloric acid to obtain a DPT mixed vaccine.
  • Example 8 The combined vaccine obtained in Example 8 was subjected to an accelerated test at 25 ° C., and its stability was measured. Stability was assessed by a titer test against each virus.
  • Use specimen, standard pertussis vaccine, and pertussis 18323 strain Dilute the sample and the standard solution, respectively, and make a total of three or more dilutions based on this by a factor of 4 or another appropriate logarithmic interval.
  • a single injection of 0.5raL of dilution solution per mouse is given.
  • 21 days after immunization 0.025 mL of the challenge bacterial suspension per mouse is injected into the brain and observed for 14 days to calculate the number of dead animals.
  • the sample titer should be at least 8 units / mL.
  • sample titer should be at least 47 units / mL.
  • test specimen Use specimen, reference sedimentation tetanus toxoid and appropriate toxin solution. Dilute specimen and reference sample in physiological saline, and dilute toxin solution with 0.2 w / v% gelatin in 0.017 mol / L phosphate buffered sodium chloride ( ⁇ 7.0). Dilute the specimen and the reference material, respectively, to make logarithmically spaced serial dilutions.
  • a group consists of 10 or more 5-week-old mice. Use one group for each dilution of specimen and reference, and for each mouse 0. Inject 5 mL once subcutaneously. Approximately 100LD 5 of each mouse 4-6 weeks after immunization. Attack for 4 days and observe for 4 days. When statistically processing and comparing test results, the sample titer should be at least 27 units / mL.
  • Specimen, reference product for IPV titer test, each type of standard serum and neutralization test attack Sabin strain poliovirus (types i, n, m) are used. Dilute the specimen and reference material respectively to make logarithmically spaced dilutions. Wister 8-week-old, 10 female rats or more are used as 1 group, and 1 group is used for each dilution. Intramuscularly inoculate 0.5 mL of hind limb thigh per animal. 21 days after inoculation, collect blood from all animals by individual, collect serum, and heat at 56 ° C for 30 minutes. Add 2 or more sera of individual serum and standard serum for each serum, and dilute 2-fold in MEM medium.
  • each type of neutralizing virus suspension for each well. Inoculate so that it becomes. Then, after placing 3 hours C0 2 in Kyubeta of all plates 36 ⁇ 1 ° C, to about 4 ° C De ⁇ reaction. The next day, add cell suspension to each well so that IX 10 4 cells, and incubate in a C0 2 incubator at 36 ⁇ 1 ° C for 7 days. After incubation, observe the CPE of each well, calculate the serum dilution at the 50% neutralization point, and use the inverse as the neutralizing antibody titer. When statistically processing and comparing test results, the sample titer should be equal to or greater than the reference.
  • Table 1 shows the results of the acceleration test.
  • lot 0 4 C manufactured by Nippon Polio Laboratories was used.
  • table 1 .
  • the microcarrier (Cytodex 1 (trade name)) was swollen with PBS (-), sterilized by autoclaving at 121 ° C for 15 minutes, and replaced with a cell growth medium.
  • the culture apparatus uses New Brunswick Scientific's Selizien Plus and Serigen. After adding microcarriers and cell suspension, the cell growth medium is brought to a final volume of 4.8 L (3.5 L in the case of Serigen). : 37.0 ° C, dissolved oxygen concentration (D0): 15%, PH: 7.15, rotation speed: 35-50 rpm. Medium exchange, NaHCO 3 using the medium for cell growth and 0.15% concentrations, was continuous amount of about 4L / day from day 2 cultured (in the case of Serijen daily as a replacement culture locations Every other amount). The number of cells was measured using a Coulter counter (trade name).
  • the total number of cells in the carrier 5g / L was superior on day 10 compared to 3g / L, but the difference was not significant.
  • high concentration of starting cells 5H, approx. 10 X 10 5 cells / mL
  • the number of cells is still increasing at 9th day.
  • the cell count is approx. 2.8xl0 6 cells / mL, growing about 2.7 times the starting cell number.
  • the seed virus used was type 1 poliovirus (IS-90C).
  • the cells were washed with 4 volumes of 0. 075% NaHC0 3 added EBSS culture volume, 0.3% NaHC0 3, 20 ⁇ g / mL erythromycin and 100 g / mL kanamycin M- 199 (E) medium (medium for virus culture) 1L seed virus was diluted. This was inoculated into the washed cells, and the virus culture medium was added to the culture volume of each culture apparatus.
  • Virus culture was performed at a culture temperature of 33.3 ° C, DO: 15%, pH: 7.40, and rotation speed: 35-50 rpm. When the cells completely detached from the microcarrier due to the viral CPE (cytopathic effect), the virus culture was stopped and the virus solution was harvested. Harvested virus solution was stored frozen at -80 ° C.
  • virus culture was started on the last measurement day of the cell growth curve shown in Fig. 1.
  • the virus titer was measured as follows. And cultured for 3 days in a roller tube GMK- 2 Cells 0. 075% NaHC0 3, 200u / mL penicillin, washed twice with 200 / zg / mL stress Putomaishin added HBSS LML, cell maintenance fluid (0.1% ⁇ Shi serum albumin, 0. 225% NaHC0 3, 200u / mL penicillin, was added 200 / zg / mL scan streptomycin added M- 199 medium) LML a.
  • the test virus solution is a cell maintenance solution of 0.51 o gl .
  • the cells were cultured in a 36 ° C franc room for 7 days, and the infectivity titer (CCID 5 / 0.2 mL) was calculated by the Reed & Muench method based on the judgment of CPE observation on the 7th day.
  • Figure 2 shows the infectivity titer (Wildska titer) of type I poliovirus obtained from Vero cells cultured under each condition.
  • the highest infectious titer was obtained in the system (5H) having a high starting cell number of 5 g / L carrier, which had a cell density of about 2.8xl0 6 cells / mL on the 9th day.
  • the infectious titer was 5H, 5L 3L in this order, which was consistent with the total cell count.
  • the infectivity titer was more than 10 times higher in the 5H system than in the virus solution obtained by culturing in the control monkey kidney cells.
  • Virus titers shown in FIG. 2 (log ⁇ CCID. N / 0. 2mL) , specifically, 3 L is 8. 18, 5 L is 8. 51, 5 H is 8 ⁇ 59, R ef.
  • the (control) is 7.50.
  • a method for producing a mixed vaccine comprising a step of culturing V ero cells inoculated with Sabin strain poliovirus in the presence of about 4 g ZL to about 6 g ZL microcarriers, It is useful as an efficient method for producing a mixed vaccine containing inactivated Sabin strain poliovirus.
  • the mixed vaccine of the present invention can effectively suppress the onset of polio, pertussis, diphtheria and tetanus, and thus is useful as a vaccine against polio, pertussis, diphtheria and tetanus.

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Description

明細書
I P V— D P Tワクチン 技術分野
本発明は、 混合ワクチン、 特に不活化セービン株ポリオウイルス （s I P V) を含有する混合ワクチン、 およびその製造方法に関する。 発明の背景
ポリオは、 ポリオウイルスによる感染症である。 ポリオウイルスは、 ヒ トには 経口的に感染し、 腸管で増殖し、 血液を介して中枢神経系に進入する。 中枢神経 系に進入したポリオウイルスが大型運動神経細胞で増殖することによって、 運軌 神経細胞が変性 '壊死を起こし、 四肢に急性弛緩性麻痺を起こす。 また、 ポリオ ウィルスが延髄の呼吸中枢を侵した場合、 呼吸麻痺から死に至る場合がある。 こ のような重篤な症状を引き起こすポリオの発症を抑制するために、 ポリオワクチ ンが広く使用されている。
ポリオワクチンとしては、 経口生ポリオワクチンと不活化ポリオワクチンの 2 種類が用いられている。 経口生ポリオワクチンは、 ポリオウイルスの弱毒株 （セ 一ビン株） を用いたワクチンである。 経口投与された弱毒株ポリオウイルスは、 通常の感染を起こす。 経口生ポリオワクチン由来のポリオウイルスは、 ヒ トの腸 管でよく増殖し、 その結果腸管局所での免疫を形成する。 さらに、 経口生ポリオ ワクチン由来のポリオウイルスが血液中に進入してウィルス血症を起こすことに よって、 血中抗体の産生も促す。 しかし、 弱毒株ポリオウイルスの中枢神経系で の増殖能は非常に弱いため、 通常は麻痺を起こすことはない。 また、 被接種者の 体内では、 接種後約 4〜6週間、 経口生ポリオワクチン由来のポリオウイルスが 増殖し、 便より排出される。 この排出ウィルスが、 被接種者の周囲のポリオに対 する免疫が弱いか又は免疫がないヒ トに感染し、 被接種者の場合と同様に免疫賦 与または増強効果を示す。
ところが、 経口生ポリオワクチン由来の弱毒株ポリオウイルスが、 被接種者の 体内で増殖を繰り返す間、 または前記の排出ウィルスに感染したヒ トの体内で増 殖を繰り返す間に、 強毒性方向への変異を起こすことがある。 その変異株によつ て、 極稀にワクチン関連麻痺を起こすことがある。
不活化ポリオワクチンは、 ポリオウイルスをホルマリンにより不活化し、 感染 力を失わせたワクチンである。 不活化ポリオワクチンは、 被接種者の体内での増 殖も、 被接種者の周囲のヒ トへの感染もしないので、 ワクチン関連麻痺を起こす ことはない。 不活化ポリオワクチンの製造には、 従来より強毒株が用いられてい るが、 近年では弱毒株 （セービン株） の開発もすすめられてきた （Biologicals 34 (2006) 151—154、 Dev Bi l. Basel. Karger, 2001, vol. 105， pp 163—169、 臨床とウィルス Vol. 30 No. 5 (2002. 12) 336-343) 。 弱毒株 （セービン株） の 増殖性は強毒株の増殖性よりもやや悪いことが、 デメリットと考えられていた。 百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイド、 および破傷風トキソイ ドを含 有するワクチンは、 百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとして広く用いられ ている。
無細胞性百日咳ワクチン、 ジフテリアトキソイド、 破傷風トキソイドおよび不 活性化ポリオウイルスからなる多価ワクチンが知られている （特表 2000-504032 号公報） 。
V e r o細胞は、 ミ ドリザルの腎臓由来の継代細胞であり、 各種ウィルスに対 して幅広い感受性を有することから、 ウィルス培養に広く使用されている。 V e r o細胞をマイクロキャリアー上で培養し、 培養した V e r o細胞を用いてェン テロウィルス 71を増殖させることを含むェンテロウィルス 71 ワクチンの製造方 法力、報告 れ レヽ (Optimization of microcarrier cel l culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development : Suh— Chin Wu, etc. , Vaccine, 22, 3858-3864， 2004) 。 マイクロキャリアーを用いた一般的な 細胞培養条件も報告されてレヽる (Microcarrier cel l culture principles & methods : Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988) 。 発明の開示
上記状況において、 高力価のセービン株ポリオウイルスを製造する工程を含む、 不活化セービン株ポリオウイルス （ s I P V ) 、 並びに百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイド、 およひ皮傷風トキソイド （D P T ) を含有する混合ワク チンの製造方法が望まれていた。 本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 セービン 株ポリオウイルスを接種する V e r o細胞を、 約 4 g,L〜約 6 g,Lのマイク 口キヤリァー存在下で培養することによって、 高力価のセービン株ポリオウィル スを製造することができることを見出した。 これらの知見に基づいて検討を重ね た結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) (A) 不活化セービン株ポリオウイルス、
(B) 百日せき菌の防御抗原、
(C) ジフテリアトキソイ ド、 および
(D) 破傷風トキソィ ド、
を含有する混合ワクチンの製造方法であって、
(a) セービン株ポリオウイルスを接種する V e r o細胞を、 約 4 gZL〜約 6 gZLのマイクロキヤリァー存在下で培養する工程、
を含むことを特徴とする方法；
(2) さらに、
(b) 前記 Ve r o細胞にセービン株ポリオウイルスを感染させる工程、
(c) 該ポリオウイルスを増殖させる工程、
(d) 該ポリオウイルスを含有するウィルス液を回収する工程、 および
(e) 該ポリオウイルスを不活化させる工程、
を含む、 上記 （ 1 ) 記載の方法；
(3) 前記マイクロキャリアーの濃度が、 約 5 gZLである、 上記 （1) 記載 の方法；
(4) 前記マイクロキャリアーが、 デキストラン製マイクロキャリアーである、 上記 （ 1 ) 記載の方法；
(5) V e r o細胞を増殖させる工程 （工程 （a) ) 力 約 3 L以上のスケー ルで行われることを特徴とする、 上記 （1) 記載の方法；
(6) V e r o細胞を増殖させる工程 （工程 （a) ) 力 約 30 L以上のスケ ールで行われることを特徴とする、 上記 （1) 記載の方法；
(7) さらに、
(d-2) 前記ウィルス液を精製する工程、 を含む、 上記 （2) 記載の方法；
(8) 前記精製工程 （工程 （d— 2) ) 力
(i) 前記工程 （d) で回収したウィルス液の超遠心によるペレット化、
(ii) 該ペレッ トの再浮遊液に対する超音波処理、
(iii) カラムクロマトグラフィーによる精製、
を含むことを特徴とする、 上記 （7) 記載の方法；
(9) 前記 （iii) カラムクロマトグラフィーによる精製が、 1回だけ行われ ることを特徴とする、 上記 （8) 記載の方法；
(1 0) 上記 （1) 記載の方法で製造されるワクチン
(1 1) V e r o細胞を培養する工程 （工程 （a) ) 力 S、 約 3 L以上のスケー ルで行われることを特徴とする、 上記 （1) 記載の方法；
(1 2) Ve r o細胞を培養する工程 （工程 （a) ) 力 約 30 L以上のスケ ールで行われることを特徴とする、 上記 （1) 記載の方法； などを提供する。 セービン株ポリオウイルスを接種する V e r o細胞を、 約 4 g,L〜約 6 gZ Lのマイクロキヤリァー存在下で培養することによって、 高力価のセービン株ポ リオウィルスを得ることができる。 高力価のセービン株ポリオウイルスを用いる ことによって、 不活化セービン株ポリオウイルスを効率的に製造することができ る。 よって、 セービン株ポリオウイルスを接種する Ve r o細胞を、 約 4 gZL 〜約 6 gZLのマイクロキャリアー存在下で培養する工程を含む混合ワクチンの 製造方法 （本発明の製造方法） は、 不活化セービン株ポリオウイルスを含有する 混合ワクチンの効率的な製造方法として有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 マイクロキャリア一法による V e r o細胞の培養における、 V e r o 細胞の増殖曲線を示すグラフである。 3Lは、 出発細胞数約 2xl05 cellS/mL (低濃 度） でマイクロキャリアー 3g/L を示す。 3H は、 出発細胞数約 10xl05cells/mL (高濃度） でマイ ク ロキャ リ アー 3g/L を示す。 5L は、 出発細胞数約 2xl05cells/mL (低濃度） でマイクロキャリアー 5g/Lを示す。 5Hは、 出発細胞数 約 10xl05cells/mL (高濃度） でマイクロキヤリァー 5g/Lを示す。
図 2は、 種々の条件で培養した Ve r o細胞で得られた I型ポリオウイルスの 感染価 （ウィルス力価） を示すグラフである。 3L は、 出発細胞数約 2xl05cells/mL (低濃度） でマイクロキヤリァー 3g/L で培養した V e r 。細胞で 得られた I型ポリオウイルスを示す。 5Lは、 出発細胞数約 2xl05cellS/mL (低濃 度） でマイクロキヤリァー 5g/L で培養した V e r o細胞で得られた I型ポリォ ウィルスを示す。 5H は、 出発細胞数約 10xl05cells/raL (高濃度） でマイクロキ ャリア一 5g/L で培養した V e r o細胞で得られた I型ポリオウイルスを示す。 Ref.は、 ミ ドリザル腎臓細胞を用いて増殖した I型ポリオウイルスを示す。 本発明は、 高力価のセービン株ポリオウイルスを製造しうる工程を含む、 不活 化セービン株ポリオウイルス （s I PV) 、 並びに百日せき菌の防御抗原、 ジフ テリアトキソイ ド、 および ¾ι '傷風トキソイ ド （DPT) を含有する混合ワクチン の製造方法を提供する。
以下、 本発明について詳細に説明する。
1. 不活化セービン株ポリオウイルス
( 1) セービン株ポリオウイルス
本明細書において、 セービン株ポリオウイルスとは、 アルバート B. セービ ン博士 （Dr. Albert B. Sabin) によって単離されたポリオウイルスの弱毒株に 由来するポリオウイノレス株を意味する（Sabin AB， Boulger LR. History of ¾abin attenuated po丄 lovirus oral live vaccine strains. J. Biol. Standard 1973, 1, 115- 118など参照）。
セービン株ポリオウイルスには、 セービン I型株ポリオウイルス、 セービン I I型株ポリオウイルスおよびセービン I I I型株ポリオウイルスが含まれる。 セ 一ビン I型株ポリオウイルスとしては、 例えば、 L S c, 2 a b株などが挙げら れる。 セービン I I型株ポリオウイルスとしては、 例えば、 P 7 1 2, C h, 2 a b株などが挙げられる。 セービン I I I型株ポリオウイルスとしては、 例えば、 L e o n, 1 2 a b株などが挙げられる。 ( 2 ) 不活化
本明細書において、 ウィルスの 「不活化」 とは、 ウィルスの感染能力を失わせ ることを意味する。 不活化方法としては、 物理的方法 （例えば、 X線照射、 熱、 超音波などを用いた方法） 、 化学的方法 （例えば、 ホルマリン、 水銀、 アルコー ル、 塩素などを用いた方法） などが挙げられるが、 これらに限定されない。
ポリオウイルスの不活化は、 公知の方法により行うことができる （例えば、 Biologicals 34 (2006) 151-154 など参照） 。 具体的には、 例えば、 ポリオウイ ルスをホルマリンで処理することによつて不活化することができる。
( 3 ) 不活化セービン株ポリオウイルスの免疫原性
不活化されたセービン株ポリオウイルスには、 通常、 D抗原および C抗原と呼 ばれる 2つのウィルス抗原が混在している。 D抗原は完全ウィルス粒子である。 D抗原に対する抗体は生きたウィルスの感染性を中和する能力があり、 防御抗体 として機能する。 C抗原は欠損粒子と呼ばれ、 完全ウィルス粒子から中心の核酸 R N Aとウィルスたん白の一部がかけた粒子であり、 中空状粒子である。 C抗原 に対する抗体には生きたウィルスの感染性を中和する能力はないかあつても非常 に低い。 したがって、 不活化セービン株ポリオウイルスをワクチンとして使用す る場合には、 D抗原が必要である。
ポリオウイルスには、 I型、 I I型、 I I I型の 3つの型がある。 ポリオウイ ルスの感染に対する免疫は、 I型、 I I型、 I I I型の 3つのウィルス型に特異 的で、 型間で交差免疫があつたとしてもわずかである。 I型、 I I型および I I I型の不活化セービン株ポリオウイルスの D抗原は、 それぞれ I型、 I I型およ び I I I型の野生株 （強毒株） ポリオウイルスに対する中和抗体を産生させうる 免疫原性を有している。 不活化セービン株ポリオウイルスの D抗原は、 I型、 I I型および I I I型それぞれに免疫原性に差があり、 I型、 I I型および I I I 型の野生株 （強毒株） ポリオウイルスを中和するのに十分な抗体を産生させるた めに必要な D抗原量はウィルス型によって異なる。
上述のように、 ポリオウイルスには I型、 I I型、 I I I型の 3つの型があり、 どの型でも同じポリオを引き起こす。 したがって、 不活化セービン株ポリオウイ ルスをワクチン （不活化ポリオワクチン） として使用する場合には、 I型、 I I 型および I I I型それぞれの野生株 （強毒株） のポリオウイルスを中和するのに 十分な抗体を産生させうる免疫原性を有することが必要であり、 また従来から用 いられている強毒株由来の不活化ポリオワクチンの免疫原性に近い免疫原性であ ることが好ましい。 このような免疫原性を示すためには、 ワクチンは、 I型、 I I型および I I I型の不活化セービン株ポリオウイルスを、 D抗原量で、 2〜 4 : 8 0〜 1 2 0 : 8 0〜 1 2 0の割合で含有するのが好ましく、 特に、 約 3 . : 約 1 0 0 ：約 1 0 0の割合で含有するのが好ましい。 本発明で用いられる不活化 セービン株ポリオウイルスは、 I型、 I I型および I I I型が上記のような特定 の比率を有することによって、 強毒株由来の不活化ポリオワクチン （例、 ソーク ワクチン） と同様の免疫原性を示す。
2 . 不活化セービン株ポリオウイルスの製造
本発明で用いられる不活化セービン株ポリオウイルスは、 下記の方法によって 製造することができる。
まず、 V e r o細胞を約 4 g / L〜約 6 g Z Lのマイクロキヤリァー存在下で 培養し、 ポリオウイルス培養用細胞を得る。 得られたポリオウイルス培養用細胞 に種ウィルス （セービン株ポリオウイルス） を接種し、 ウィルスを培養すること によつて増殖させたセービン株ポリオウィルスを得る。 得られたセービン株ポリ ォウィルスを不活化し、 不活化セービン株ポリオウイルスを得る。 用いられる種 ウィルス （セービン I型株、 セービン I I型株またはセービン I I I型株） によ つて、 対応する不活化セービン株ポリオウイルスを得ることができる。 ウィルス の不活化の前または後に、 ゥィルスを濃縮および/または精製してもよい。
上述のように、 不活化ポリオワクチンにおいては、 I型、 I I型および I I I 型それぞれの野生株 （強毒株） を中和するのに十分な抗体を産生させうる免疫原 性を有することが必要である。 しかしながら、 不活化セービン株ポリオウイルス の D抗原は、 I型、 I I型および I I I型それぞれで免疫原性に差がある。 した がって、 I型、 I I型および I I I型それぞれの野生株 （強毒株） を中和するの に十分な抗体を産生させうる免疫原性を有する不活化ポリオワクチンは、 含有す る I型、 I I型および I I I型の不活化ポリオウイルス量を調節することによつ て得ることができる。
(V e r o細胞） V e r o細胞は、 ミ ドリザル （Cercopi thecus aethiops) の腎臓由来の継代細 胞であり、 ATCC (American Type Culture Col lection)に登録されている。 V e r o細胞は、 線維芽細胞様の形態を示し、 各種ウィルスに対して幅広い感受性を有 し、 継代培養と維持が容易であるため、 ウィルス培養に広く使用されている。 ATCC から入手可能な V e r 。細胞としては、 例えば、 ATCC 番号 CCL_81、 CRL-
1587などが知られている。
(マイクロキヤリァー）
本明細書において、 「マイクロキャリアー」 とは、 表面に細胞を付着させ、 液 体培地中で懸濁状態で細胞培養ができる担体を意味する。 表面に細胞を付着させ、 液体培地中で懸濁状態で細胞培養ができる担体であれば、 材質、 形状、 大きさな どに特に制限はない。
マイクロキャリアーの材質としては、 デキストラン、 ゼラチン、 コラーゲン、 ポリスチレン、 ポリエチレン、 ポリアクリルアミ ド、 ガラス、 セルロースなどが 挙げられる。 マイクロキャリアーの材質としては、 デキストランが好ましい。 マイクロキャリアーの形状としては、 球状 （ビーズ） 、 円盤状などが挙げられ る。 マイクロキャリアーの形状としては、 球状が好ましい。
球状のマイクロキャリアーの大きさは、 例えば約 0 . 0 1〜l mm、 好ましく は約 0 . 0 5〜0 . 5 mm、 より好ましくは約 0 . 1〜0 . 3 mmである。
マイクロキヤリァ一は多孔性であってもよい。
本発明で用いられる球状のマイクロキャリア一としては、 例えば、 Cytodex 1 (商品名） 、 Cytodex 3 (商品名） 、 Cytopore (商品名） （以上、 GE ヘルスケア バイオサイエンス社製） などが挙げられる。 円盤状のマイクロキャリア一として は、 例えば、 Cytol ine 1 (商品名） 、 Cytol ine 2 (商品名） （以上、 GE ヘルス ケア バイオサイエンス社製） などが挙げられる。 多孔性のマイクロキャリアー としては、 例えば、 Cytopore (商品名） 、 Cytol ine 1 (商品名） 、 Cytol ine 2 (商品名） （以上、 GE ヘルスケア バイオサイエンス社製） などが挙げられる。 本発明で用いられるマイクロキャリア一としては、 特に球状のデキストラン製マ イク口キャリアーが好ましい。 球状のデキストラン製マイクロキャリア一として は、 Cytodex 1 (商品名） 、 Cytodex 3 (商品名） および Cytopore (商品名） が 好ましく、 さらに Cytodex 1 (商品名） および Cytodex 3 (商品名） が好ましく、 特に Cytodex 1 (商品名） が好ましい。
(V e r o細胞の培養）
本発明においては、 Ve r o細胞を、 約 4 g/L〜約 6 gZLのマイクロキヤ リァー存在下で培養することによって増殖させる。 マイクロキヤリァー濃度は、 好ましくは約 4. 5 g,L〜約 5. 5 gZLであり、 より好ましくは、 約 5 gZ Lである。
上記の V e r o細胞を増殖させる工程は、 液量として、 好ましくは 3 L以上、 より好ましくは 30 L以上、 特に好ましくは 1 50 L以上のスケールで行われる。 また、 Ve r o細胞を増殖させる工程は、 通常 1 000 L以下のスケールで行わ れる。
V e r o細胞をマイクロキャリアー存在下で培養する場合、 培地としては、 例 えば、 約 5〜 2 0 V o 1 %の仔ゥシ血清または胎児牛血清を含む ME培地 [Science, 122巻， 501(1952)〕 、 DME培地 [Virology, 8巻， 396 (1959)〕 、 RP M l 1 6 4 0 !¾·地 し he Journal of the American Medical Association 199 卷， 519(1967)〕 、 1 9 9培地 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 卷， 1(1950)〕 などが用いられる。 培地としては、 DME培地が好ま しく、 さらに仔ゥシ血清を含む DME培地が好ましく、 特に約 5 v o l %の仔ゥ シ血清を含む DME培地が好ましい。 培地は、 細胞培養期間中、 必要に応じて交 換する。 pHは約 6〜 8であるのが好ましく、 さらに約 6. 5〜7. 5であるの が好ましく、 特に約 7であるのが好ましい。 培養は通常約 3 5 °C〜 40 °Cで約 5 〜9日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 細胞培養時の溶存酸素濃度 (D0)は、 約 60〜 90 %であるのが好ましく、 さらに約 70〜 80 %であるのが 好ましく、 特に約 75%であるのが好ましい。
マイクロキャリアー存在下での培養開始時における培地中の Ve r o細胞の細 胞数 （出発細胞数） は、 培地やマイクロキャリアーの種類、 培養スケール等に応 じて適宜設定することができる。 出発細胞数は 2 104個/(^〜10 105個 し で あるのが好ましく、 特に 2 105個/ 〜10 105個/111しが好ましレ、。
(ポリオウイルスの培養）
ポリオウイルスの培養は、 V e r o細胞の培養細胞にセービン株ポリオウィル ス （種ウィルス） を接種して感染させ、 ポリオウイルスを細胞内で培養すること によって行うことができる。 感染細胞の培養は、 上述の V e r o細胞の培養と同 様にして行うことができる。 ポリオウイルスの培養に用いられる培地としては、 1 9 9培地が好ましく、 さらに炭酸水素ナトリゥムを添加した 1 9 9培地が好ま しく、 特に 0. 3w/ v %炭酸ナトリゥムを添加した 1 9 9培地が好ましい。
ウィルス培養時の培養温度は、 約 3 0 °C〜 3 8 °Cであるのが好ましく、 さらに 約 3 2 °C〜3 6 °Cであるのが好ましく、 特に約 3 3 °C〜3 5 °Cであるのが好まし レ、。 ウィルス培養の期間は、 好ましくは約 1〜5日間、 より好ましくは約 2〜4 日間、 特に好ましくは約 3日間である。 なお、 ウィルス培養は、 ポリオウイルス による細胞変性効果 （ポリオウイルス感染細胞が、 細胞の円形化をおこし、 マイ クロキャリアーから離脱すること） を指標として、 終了させることができる。 種ウィルスとしては、 予めミ ドリザル初代腎培養細胞を用いて培養したセービ ン株ポリオウイルスを用いてもよい。
(ポリオウイルスを含有するウィルス液の回収）
ウィルス培養終了後、 マイクロキャリアーを除き、 ポリオウイルスを含有する ウィルス液 （ポリオウイルス液と称することがある。 ） を回収する。
マイクロキャリアーの除去は、 例えば、 テフロンメッシュ （例えば、 孔径 120 ^ m) などを用いて行うことができる。 メッシュに残ったマイクロキャリアーに はポリオウイルスが残存 （付着） しているので、 ウィルス培養液などで洗浄して ポリオウイルスを回収してもよい。
得られたポリオウイルス液は、 ろ過膜 （例えば 0. 2 / m のろ過膜） などでろ過 し、 細胞屑を除いてもよい。
ポリオウイルス液は、 不活化の前または後に、 濃縮および または精製しても よい。
濃縮方法としては、 限外ろ過法、 超遠心法、 透析法などが挙げられる。 濃縮方 法としては、 限外ろ過法、 超遠心法が好ましく、 さらに限外ろ過法と超遠心法を 行なうのが好ましく、 さらに、 限外ろ過法を行った後、 超遠心法を行なうのが好 ましい。
限外ろ過法に用いられる限外ろ過膜としては、 ウィルスの濃縮に通常用いられ る限外ろ過膜を使用することができる。 限外ろ過膜の分画分子量としては、 lOOkDa 程度が好ましい。 限外ろ過膜の材質としては、 ポリエーテルスルホンな どが好ましい。
超遠心法によるポリオウイルスの濃縮は、 例えば、 ポリオウイルス液を、 4°C で、 100，000g、 4 時間の超遠心によりペレッ ト化することにより行なうことがで きる。 ペレッ トは、 リン酸緩衝液などに再浮遊させてもよい。 ペレッ トの再浮遊 液を超音波処理することによって、 凝集塊をほぐすこともできる。 超音波処理は、 市販されている装置、 例えば、 INSONATOR MODEL 200M (クボタ） などを使用して 行うことができる。 超音波処理の条件は、 凝集塊がほぐれる程度であればよく、 超音波処理に使用する容器、 超音波出力、 再浮遊液の濃度、 などに応じて適宜設 定することができる。 超音波処理の条件としては、 例えば、 200W で 3〜10 分間 の超音波処理などが挙げられる。 このような超音波処理を行なっても、 セービン 株ポリオウイルスの免疫原性は失われず、 ポリオウイルスワクチンとして好適に 使用することができる。
精製方法としては、 例えば、 精製対象物の大きさ、 密度、 沈降係数などの物理 的性質を利用する方法、 化学または物理化学的反応 （吸脱着など） を利用する方 法などが挙げられるが、 特に限定されない。 精製方法としては、 より具体的には、 例えば、 密度勾配遠心法、 ろ過 （限外ろ過を含む） 、 イオン交換カラムクロマト グラフ法、 ァフィ二ティーク口マトグラフ法、 ゲルろ過クロマトグラフ法、.塩析 法などが挙げられる。 精製方法としては、 カラムクロマトグラフ法が好ましく、 さらにイオン交換カラムクロマトグラフ法が好ましく、 特に DEAE-イオン交換力 ラムクロマトグラフ法が好ましい。 カラムクロマトグラフィーによる精製回数は、 必要な純度になるまで行なえばよく、 特に制限はないが、 生産効率などの点で、 最小限の工程で行うのが好ましい。
濃縮および精製としては、 ポリオウイルス液の超遠心によるペレット化、 該ぺ レツトの再浮遊液に対する超音波処理、 およびカラムクロマ トグラフィ一による 精製を行なうのが好ましい。 さらに、 カラムクロマトグラフィーによる精製は、 1回だけ行われるのが、 生産効率などの点で好ましい。 ポリオウイルス液の超遠 心によるペレツト化、 該ペレツトの再浮遊液に対する超音波処理およびカラムク 口マトグラフィ一による精製を 1回だけ行うことによって、 ポリオウイルス液を、 効率的に、 かつ十分に濃縮および精製することができる。
(ポリオウイルスの不活化） ポリオウイルスの不活化は、 通常用いられている方法によって行うことができ る。 より具体的には、 例えば、 ポリオウイルス液に不活化剤を添加し、 ポリオゥ ィルスと不活化剤を反応させることによってポリオウイルスを不活化することが できる。 不活化剤としては、 ホルマリンが好ましレ、。 不活化条件は、 ポリオウイ ルスが不活化されればよく、 特に制限はない。 不活化処理の期間は、 不活化不十 分なポリオウイルスの残存を避けるため、 通常、 ポリオウイルスの不活化が確認 された期間の約 2〜 4倍、 好ましくは約 2. 5〜3. 5倍、 より好ましくは約 3 倍とする。
例えば、 不活化剤としてホルマリンを用いる場合、 その添加量は、 好ましくは 約 0. 00 1 wZv%〜0. l wZv%、 さらに好ましくは約 0. 0 05 wZ v%〜0. 05 wZv%、 特に好ましくは約 0. 01 wZv%である。 不活化温 度は、 特に好ましくは約 37°Cである。 不活化期間は、 不活化剤の種類、 不活化 剤の濃度、 不活化温度などによっても異なる。 例えば、 不活化剤として約 0. 0 1 wZv%のホルマリンを使用し、 不活化温度が約 37 °Cの場合、 不活化期間 は、 好ましくは約 8日〜 16日、 より好ましくは約 10日〜 14日、 特に好まし くは約 12日である。 約 0.01 wZv%のホルマリンを使用し、 不活化温度が 約 37°Cである場合、 セービン株ポリオウイルスは、 通常 4日までに不活化され る。 3. 百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイ ド、 および破傷風トキソイ ド (D PT)
本発明で用いられる百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイド、 および破 傷風トキソィ ドは、 特に限定されるものではない。
百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイド、 およひ皮傷風トキソイ ドは、 百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとして、 市販品として入手することがで きる （例えば、 武田薬品工業株式会社製、 阪大微生物病研究会製、 化学及血清療 法研究所製など） 。 また、 百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイド、 およ び破傷風トキソイドは、 公知の方法によって得ることができる。 具体的には、 百 日せき菌の防御抗原は、 例えば、 百日せき菌 I相菌 （東浜株） の培養液を硫安分 画法 ·蔗糖密度勾配遠心分画法などの物理化学的方法で感染防御抗原画分を抽 出 ·分離 ·精製したのち、 残存する毒性をホルマリンで減毒することによって得 ることもできる。 ジフテリアトキソイ ドは、 例えば、 ジフテリア菌 （Park - Wi lliams No. 8 株） の産生する毒素をカラムクロマトグラフ法などの物理化学的 方法で精製濃縮した後、 ホルマリンで無毒化することによって得ることもできる。 破傷風トキソィ ドは、 例えば、 破傷風菌 （Harvard株） の産生する毒素をカラム クロマトグラフ法などの物理化学的方法で精製濃縮した後、 ホルマリンで無毒化 することによって得ることもできる
百日せき菌の防御抗原には、 百日せき毒素 （PT 抗原） 、 繊維状赤血球凝集素 (FHA抗原） 、 外膜たん白 （69KD抗原） 、 線毛 （FB抗原、 凝集原 (FGG)とも呼ば れる） が含まれる。 百日せき菌の防御抗原としては、 必ずしも上記各抗原の全て を含んでいる必要はなく、 これらの抗原のうち 1種以上、 好ましくは 2種以上、 より好ましくは 3種以上を含んでいればよい。 前記防御抗原に対する抗体は、 百 日せきから宿主を防御する。 4 . 混合ワクチン
本発明の混合ワクチンは、 不活化セービン株ポリオウイルス、 百日せき菌の防 御抗原、 ジフテリアトキソイ ド、 および破傷風トキソイ ドを含有する。 百日せき 菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイド、 および破傷風トキソイドは、 上述のよう に、 百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとして、 市販品として入手すること ができる。 したがって、 本発明の混合ワクチンは、 不活化セービン株ポリオウイ ルスと、 百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとを混合することによって製造 することもできる。
不活化セービン株ポリオウイルスは、 不活化セービン I型株ポリオウイルス、 不活化セービン I I型株ポリオウイルス、 および不活化セービン I I I型株ポリ ォウィルスを混合することによって製造することができる。 上述のように、 不活 化セービン株ポリオウイルスは、 I型、 I I型および I I I型の不活化セービン 株ポリオウイルスを、 D抗原量で、 2〜4 ： 8 0〜 1 2 0 ： 8 0〜1 2 0の割合 で含有するのが好ましく、 特に、 約 3 ：約 1 0 0 ：約 1 0 0の割合で含有するの が好ましい。
本発明の混合ワクチンにおける百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイ ド、 および破傷風トキソイドの含有量は、 百日せき、 ジフテリアおよび破傷風の予防 に有効な量であればよい。 より具体的には、 上述した、 市販品として入手可能な 百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンにおける含有量と同様の含有量としても よい。 なお、 不活化セービン株ポリオウイルスその他の成分によって百日せき菌 の防御抗原、 ジフテリアトキソィドまたは Zおよび破傷風トキソィドの免疫原性 が影響をうける場合には、 適宜含有量を調節することにより、 各疾患の予防に有 効な混合ワクチンを製造することができる。
本発明の混合ワクチンは、 常套手段に従って製造し、 使用することができる。 具体的には、 以下に記載するようにして製造し、 使用することができる。
本発明の混合ワクチンは、 常套手段に従って、 注射剤として製剤化することが できる。 注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記物質を通常注射剤に 用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって 調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液などが用いられる。 調製された注射液は、 通常、 適当なアン プル、 シリンジなどに充填される。
本発明の混合ワクチンは、 必要に応じて、 保存剤、 抗酸化剤、 キレート剤など の製剤添加剤を含有していてもよい。 保存剤としては、 例えば、 チメロサール、 2—フエノキシエタノールなどが挙げられる。 キレート剤としては、 エチレンジ ァミン 4醉酸、 ダリコールエーテルジァミン四酢酸などが挙げられる。
本発明の混合ワクチンは、 さらにアジュバントを含有していてもよい。 アジュ バント化剤としては、 例えば、 水酸化アルミニウム、 リン酸アルミニウム、 塩化 アルミニウムなどが挙げられる。
本発明の混合ワクチンは、 さらに不活化セービン株ポリオウイルス、 百日せき 菌の防御抗原、 ジフテリアトキソイド、 および破傷風トキソイド以外の免疫原性 成分を含んでいてもよい。 そのような免疫原性成分としては、 例えば、 ポリオゥ ィルス、 百日せき菌、 ジフテリア菌および破傷風菌以外のウィルスまたは菌に対 する免疫原性成分が挙げられる。 免疫原性成分としては、 例えば、 トキソイド、 弱毒化ウィルス、 不活化ウィルス、 タンパク質、 ペプチド、 ポリサッカライド、 リポポリサッカライド、 リポペプチド、 またはこれらの組み合わせなどが挙げら れる。 ポリオウイルス、 百日せき菌、 ジフテリア菌および破傷風菌以外のウィル スまたは菌としては、 例えば、 インフルエンザウイルス、 麻疹ウィルス、 耳下腺 炎ウィルス、 風疹ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 水疱瘡ウィルス、 狂大病ウィル ス、 ヒ ト免疫不全ウィルス、 肝炎ウィルス、 肺炎双球菌、 髄膜炎菌、 チフス菌、 インフルェンザ b菌などが挙げられる。
本発明の混合ワクチンは、 例えば、 皮下注射もしくは筋肉注射によって、 好ま しくは皮下注射によって、 非経口的に投与することができる。 - 本発明の混合ワクチンの 1回投与量は、 投与対象者の年齢、 体重など種々の条 件に応じて適宜選択することができる。 具体的には、 例えば、 百日せき菌の防御 抗原を 4 国際単位以上、 ジフテリアトキソィドを約 15Lf、 破傷風トキソィ ドを 約 2. 5Lf、 不活化セービン I型ポリオウイルスを D抗原として約 2〜4 単位 （好 ましくは約 3 単位） 、 不活化セービン I I型ポリオウイルスを D抗原として約 80〜120単位 （好ましくは約 100単位） 、 不活化セービン I I I型ポリオウィル スを D抗原として約 80〜120単位 （好ましくは約 100単位） 含有していてもよレ、。 本発明の混合ワクチンの投与回数は、 例えば、 初回免疫として、 3〜8 週の間 隔で、 2〜3 回投与してもよい。 初回免疫として本発明の混合ゥクチンを 2 回投 与した場合には、 さらに 3〜8 週の間隔で百日せきジフテリア破傷風混合ワクチ ン （DPT ワクチン） を 1回投与するのが好ましい。 追加免疫として、 初回免疫後 6ヶ月以上の間隔をおいて （例えば、 初回免疫終了後 12ヶ月から 18ヶ月までの 間に） 、 さらに 1回投与してもよレ、。 実施例
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例に何ら 限定されるものではない。 参考例 1 (ポリオワクチンウイルス製造用保存細胞バンクの樹立）
ワクチンウィルス製造用の保存細胞バンクは、 A T C Cから入手した V e r o 細胞から、 下記の手順により作製した。
( i ) 種細胞バンク （MCB: Master Cell Bank) の調製
A T C Cより受領したアンプル入り凍結細胞 （CCL 81 Vero, F- 6573、 継代 数： 124代） を融解し、 空の 4オンス瓶 （容量 154mL、 細胞増殖面積 54cm2の培 養瓶） に移した。 細胞入り 4オンス瓶に細胞増殖液 （5 v o 1 %仔ゥシ血清、 0. 075%炭酸水素ナトリウム、 20 g/mLエリスロマイシン、 100 /z g/mLカナマイシ ン （最終濃度） 添加 DME (Dulbecco ' s Modif ied Eagle ' s Medium, シグマ、 力 タログ No. D5523) ) を滴下で、 約 5分位かけて 15mL加えた。 細胞と細胞増殖液 を入れた瓶を 36°Cで静置培養した （4オンス瓶 1本、 125代） 。 翌朝細胞増殖液 を新たな 15mL と交換し、 更に 36°Cで静置培養した。 静置培養を開始してから 6 日目に継代を行った （4オンス瓶 1本から 4オンス瓶 4本、 126代） 。 継代方法 は、 以下の手順に従って行った。 継代方法
(1) 培養液を捨てる。
(2) 継代用 0. 25%トリプシン液 5mLを 4オンス瓶に入れる。
(3) 約 1分間細胞面を浸して継代用 0. 25%トリプシン液を捨てる。
(4) 4オンス瓶を 36°Cに静置し、 細胞のガラス面よりの剥離を待つ。
(5) 細胞が剥がれだしたら、 細胞増殖液を 5mL 入れ、 ピペッティングで全ての 細胞を剥離させる。
(6) 更にピペッティングで細胞を均一に浮遊させ、 細胞増殖液を遠心管に移す。
(7) 600rpm、 5 分間の遠心を行い、 上清を捨て、 沈渣となった細胞を新たな約 8mLの細胞増殖液にピベッティングで均一に浮遊させる。
(8) 新たな 4本の 4オンス瓶 （新たな細胞増殖液を 13mLずつ分配してある） に 1本当たり 2mLの細胞浮遊液を加える。
(9) 4本の 4オンス瓶を 36°Cに静置し細胞培養を行う。 継代用 0. 25%トリプシン液の組成は以下の通りであった。
5%トリプシン " 50 mL/L
5%Polyvinyl pyrrol idone (90K) 20 mL/L
0. 247 mol ェデト酸ナトリウム *2 56 mL/L
EK*3 2 mL/L
トリプシン希釈液 *4 872 mL/L *1： トリプシンは、 ブタ膝臓由来 1 : 300活性のものを使用した。
*2： 0. 247 mol ェデト酸ナトリゥムの組成は以下の通りであった。
ェデト酸ナトリゥム _2Na · 2H20 91. 95 g/L
NaOH 9. 88 g/L
*3 : EKの組成は以下の通りであった。
Erythromycin Lactobionate 10，000 z g/mし
Kanamycin Sulfate 50, 000 μ g/mL
*4： トリプシン希釈液の組成は以下の通りであった。
NaCl 8, 000 mg/L
KC1 400 mg/L
Na2HP04 · 12H20 150 mg/L
KH2P04 60 mg/L 以降も同様の方法 （培養面積比で 1回の継代で約 3〜4倍とするので、 培養瓶 と扱う液量は異なる） 3〜6 日間隔で継代を行い、 129代の細胞を作製した （1回 継代につき継代数は 1 つ多くなる） 。 SR瓶 （Smal l Roux瓶：容量 727mL、 細胞 增殖面積 156cm2の培養瓶） 33本に、 培養した 129代の細胞を継代時と同様にト リ プシン処理、 遠心を行い、 沈渣を凍結保存培地 （ 10%DMS0 (Dimethyl Sulfoxide)、 10 v o 1 %仔ゥシ血清、 0. 075%炭酸水素ナトリウム、 20 μ g/mL エリ スロマイシン、 100 // g/mL カナマイシン （最終濃度） 添加 DME (Dulbecco， s Modified Eagle ' s Medium, シグマ、 カタログ No. D5523) ) に約 1. 5 X 107個/ mL となるように再浮遊させた。 アンプルに上記細胞浮遊液を lmL分注し、 スローフ リーザ一 （約 1 分で 1°C低下する） で- 32°Cまで温度を下げた後、 液体窒素中に 移し保存した。 上記のようにして得た 129 代の細胞を種細胞バンク （MCB) とし て使用した。
( i i ) 製造用保存細胞バンク （MWCB : Manufacture ' s Working Cel l Bank) の 調製
上記 （ i ) で調製し、 保存した種細胞バンク （MCB) を使用して、 上記 （ i ) の種細胞バンク （MCB) の調製方法と基本的には全く同じ方法で、 アンプル中の 細胞の融解から細胞の継代による増殖を 134代まで行った （出発細胞数が多いた め、 取扱い液量、 培養瓶種と数は異なる） 。 前記の 134代の細胞も、 種細胞バン ク （MCB) と同様に液体窒素中で保存した。 上記のようにして得た 134 代の細胞 を製造用保存細胞バンク （MWCB) として使用した。 実施例 1 (ポリオワクチンウィルス製造用細胞の作製）
( i ) 静置培養工程
上記参考例 1で調製し、 保存した製造用保存細胞バンク （MWCB) の 1アンプル (134 代の細胞） を、 上記参考例 1の種細胞バンク （MCB) 及び製造用保存細胞 バンク （MWCB) の調製の場合と同様の方法で解凍し、 細胞を LR瓶 （Large Roux 瓶、 容量約 1540mL、 細胞増殖面積約 274cm2の培養瓶） X 3本にて 7 日間静置培 養した （135 代） 。 静置培養を開始してから 7 日目に継代を行い、 LR 瓶 18 本
(136 代） へと培養スケールを拡大して静置培養した。 静置培養とその継代は、 上記参考例 1の種細胞バンク （MCB) の調製及び製造用保存細胞バンク （MWCB) の調製と同様の方法で行った。
次に、 40段セルファク トリー （ヌンク、 カタログ No. 139446) で 7 日間静置 培養した （137代） 。 静置培養を開始してから 7 日目に継代し、 更に 40段セル ファク トリー 4台で 7日間静置培養した （138代） 。
( i i ) マイクロキャリアー培養工程
次に、 上記 （ i ) の静置培養工程で得た 138代の細胞を、 上記 （ i ) の継代時 と同様にトリプシン処理、 遠心し、 沈渣となった細胞を 1， O O O mL のマイク 口キヤリア一培養用細胞増殖液 （5 v o 1 %仔ゥシ血清（Thermo Trace 社製）、 0. 11%炭酸水素ナトリウム、 0. 1%フルク ト一ス、 20 /Z g/mL エリスロマイシン、 100 μ g/mL カナマイシン （最終濃度） 添加 DME (Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium, シグマ、 カタログ No. D5523) ) にピペッティングで均一に浮遊させた c 細胞浮遊液を、 予め PBS (Phosphate Buffered Saline)で膨潤させ、 マイクロキ ャリア一培養用細胞増殖液で平衡化したマイクロキャリアー （Cytodex 1 (商品 名） 、 GE ヘルスケア バイオサイエンス社） と混合 （Cytodex 1 (商品名） は、 膨潤前の重量で 5g/Lを使用した） し、 50L容量培養器 3台で、 37°C、 PH7. 15で 撹拌しながら培養した。 培養 2日目より 1 日にっき細胞増殖液の半量を新たな細 胞増殖液と継続的に交換した。 7 日間培養した細胞を、 ポリオワクチンウィルス 製造用細胞 （139代） として使用した。 実施例 2 (不活化ポリオワクチン I型の製造）
( i ) ウィルス培養工程
実施例 1で得たポリオワクチンウィルス製造用細胞 （139 代） は、 種ウィルス を接種する直前に撹拌を止めて細胞を沈殿させ、 0. 075%炭酸水素ナトリウム、 20 μ g/mL エリ スロマイ シン、 100 // g/mL カナマイシン （最終濃度） 添加 EBSS (Earl' s Balanced Salt Solution)で 1 回洗浄した。 マイクロキャリアーご と採取した細胞培養液 5mL の上清を除いた後、 0. 25%トリプシン液を加え再び 5mL とし、 細胞をビーズから剥がし浮遊させ、 細胞数を計測し、 50L容量培養器 全体の細胞数を推定した。 細胞 1個当たり、 弱毒 Sabin株の I型 （LSc，2ab株） の種ウィルスを約 10— 3CCID5Qの濃度で接種した。 種ウィルス接種後、 直ちにウイ ルス培養液 （0. 3%炭酸水素ナトリウム、 20 g/mL エリスロマイシン、 lOO ^ g/mL カナマイシン （最終濃度） 添加 M199 (Medium 199) ) 50Lを培養器に注入した。 なお、 種ウィルスは、 予めアフリカミ ドリザル初代腎培養細胞を用いて約 33. 3°Cで培養した後、 小分けして- 70°Cで凍結保存したものを用いた。
ウィルス培養は、 34°C ± 1。Cで 3 日間行った。 ポリオウイルスによる細胞変性 効果 （ポリオウイルス感染細胞は細胞の円形化をおこし、 その後マイクロキヤリ ァ一から離脱する） を指標とし、 細胞がマイクロキャリアーから 95〜100%離脱 した時点でウィルス培養を終了させた。 ウィルス培養終了後、 テフロンメッシュ (孔径 120 /i m) を介してマイクロキャリアーを除き、 ウィルス浮遊液を回収し た。 メッシュに残ったマイクロキャリア一は、 50L容量培養器 1 台につき約 のウィルス培養液で 1回洗浄した。 回収したウィルス浮遊液にこの洗浄液を加え て 「I型ポリオウイルス液」 とした。
( i i ) ウィルス濃縮 '精製工程
上記 （ i ) で得た I型ポリオウイルス液約 150Lを、 0. 2 // mのろ過膜 （ポール、 SLK7002NRP) でろ過し、 細胞屑を除いた。 ろ液を限外ろ過膜 （ザルトリウス、 PESU (Polyethersulfone) 100kDa、 0. lm2、 3051466801E— SG) で 1. 2Lまで濃縮し た。 濃縮されたウィルス液を 6°Cで 100，000g、 4時間の超遠心によりペレツト化 し、 PB (Phosp h ate Buffer, 0· lmol/L)に再浮遊した （1本の遠心管 （約 lOOmL) のペレツ小を 5mLの PBに再浮遊した） 。 ペレツトの再浮遊液を 4°Cでー晚振と うした後、 200W で 8 分間超音波処理 （クボタ、 INS0NAT0R MODEL 200M) を行つ て凝集塊をほぐした。 そして、 15，000rpm、 30 分間の遠心後、 上清を採取した。 得られた上清を DEAE Sepharose CL-6B (商品名、 GE ヘルスケア バイオサイエ ンス社、 GE 17-0710-05) により精製した。 溶出液として PB (Phosp h ate Buffer: 0. lmol/L)を用いた。 280nm の吸光度でモニターして、 初めのピークを回収し、
「精製 I型ポリオウイルス液」 とした。 採取したピークについては、 吸光度の値 で 260/280nmを計算し、 1. 5以上であることを確認した （ポリオウイルス完全粒 子の 260/280nmは 1. 6〜1. 7である） 。
( i i i ) 不活化工程
上記 （ i i ) で得た精製 I型ポリオウイルス液を不活化前希釈液 （5%アミノ酢 酸 （最終濃度） を添加した、 Ca、 Mg、 Phenol Red, 炭酸水素ナトリウムを含まな い M199) で約 10倍希釈し、 0. 2 /x mのろ過膜 （ポール、 SLK7002NRP) でろ過し、 ウィルス凝集塊を除いた。 ろ液を調製後、 再度ウィルスが凝集しないよう速やか に不活化を開始した。 不活化開始 1時間前に、 ろ液と 1 : 200に希釈されたホルマ リンを別々に 37°Cで加温しておいた。 ろ液を十分撹拌しながら、 ホルマリンを 最終濃度 1 : 4, 000になるように添加し、 37°Cに加温し不活化を開始した。 ホルマ リン処理中、 液の撹拌を毎日午前及び午後の 2回行うことによりウィルスの不活 化を一様に進行させた。 不活化不十分なウィルスが、 容器の栓ゃ容器のある特定 の場所に付着する場合を想定して、 不活化開始 2、 4 日目には栓の交換を、 6 日 目には容器の交換を行った。 また、 不活化工程中にウィルスが凝集する可能性を 考慮して、 不活化 6 日目に 0. 2 /z mのろ過膜 （ポール、 SLK7002NRP) でろ過を行 つた。 ホルマリン処理工程は 12 日間で終了とした。 12 日目にホルマリン処理ゥ ィルス液の遊離ホルマリンを亜硫酸ナトリウム （0. 0264mol/L となるように添 力 で中和後、 安定剤としてェデト酸ナトリウムを添加 （0. 0009mol/L) し、 「不活化ポリオワクチン I型」 の原液とした。
( i V ) D抗原量の測定は型及び D抗原に特異性の高い抗体を用いた間接 E L I S A法よつて行う。 間接 E L I S A法は、 先ず、 1次抗体として被検抗原と同型 の D抗原特異的モノクロナ一ル抗体 （マウス由来） をマイクロプレートにコーテ イングする。 次に、 被検抗原を希釈して乗せる。 次に、 2次抗体として被検抗原 と同型のゥサギポリクロナール抗体を乗せ、 更に、 H R P O標識抗ゥサギ I g G 抗体を乗せ反応させる。 反応後、 オルトフ 二レンジァミン溶液を用いて発色さ せた後、 4 9 2 n mの吸光度を測定する。 被検抗体の吸光度の測定値と対照抗原 の測定値との平行線定量法による比較により、 被検抗原の D抗原量を求める。 実施例 3 (不活化ポリオワクチン I I型の製造）
種ウィルスとして、 弱毒 Sabin株の I型 （LSc, 2ab株） に代えて弱毒 Sabin株 の I I型 （P712, Ch， 2ab株） を使用した他は、 実施例 2と同様にして、 「不活化 ポリオワクチン I I型」 の原液を製造した。 実施例 4 (不活化ポリオワクチン I I I型の製造）
種ウィルスとして、 弱毒 Sabin株の I型 （LSc，2ab株） に代えて弱毒 Sabin株 の I I I型 （Leon, 12aib株） を使用した他は、 実施例 2と同様にして、 「不活 化ポリオワクチン I I I型」 の原液を製造した。 実施例 5 (百日せき菌の防御抗原の製造）
( 1 ) 百日せき菌の培養
百日せき菌 I相菌 （東浜株） をコーェンウィラー培地で 30〜34°C、 20〜24 時 間撹拌培養した。 コーェンウィラー培地で培養した百日せき菌を更に、 スティナ ーショルト培地で 30〜34°C、 48〜68時間培養した。
培養液を、 限外ろ過法により 1/10 量まで濃縮を行い、 遠心分離により上澄液 と菌体に分離した。
( 2 ) 百日せき毒素の調製
上記 （1 ) で得た上澄液に lmol/L リン酸塩緩衝液 (pH8. 0)を 1/10量になるよ うに添カ卩し、 25 wZ v %酢酸カルシウム溶液を 0. 1〜2. OwZ v こなるよう加え、 ろ過により百日せき毒素 （感染防御抗原） を含むろ液を得た。 ろ液を SP カラム クロマトグラフ法 （平衡化溶液： 0· lmol/L リン酸塩緩衝液（ρΗ6· 0) ) によりカラ ムを通し、 吸着した百日せき毒素を 0. 415mol/Lリン酸塩緩衝液 (pH7. 0)で溶出し、 百日せき毒素を含む液を分画した。 次いで、 百日せき毒素を含む液をゲルカラム クロマトダラフ法 （平衡化溶液： 0.25mol/L塩化ナトリゥム添加 0.025mol/L リ ン酸ナトリウム液 (pH8.7)) によりカラムを通した後、 ろ過 （孔径 0.2 im) した ものを精製百日せき毒素 （PT抗原） 液とした。
(3) 繊維状赤血球凝集素の調製
上記 （ 1 ) で分離した菌体を lmol/L塩化ナトリゥム添加 0.05mol/L リン酸塩 緩衝液 (PH8.0)で溶解し、 次いで遠心分離により上澄液と菌体に再分離した。 再 分離した上澄液に 25wZv。/。酢酸カルシウム溶液を 0. l〜2.0wZv%になるよう 加え、 ろ過により繊維状赤血球凝集素 （感染防御抗原） を含む液を得た。 ろ液を 硫酸アンモニゥム濃縮した後、 密度勾配遠心法で精製し、 精製繊維状赤血球凝集 素 （FHA抗原） を分画した。
(4) 外膜たん白の調製
上記 （3) で再分離した菌体を 0.145mol/L塩化ナトリゥム添加 0.01mol/L リ ン酸塩緩衝液 (pH7.0)で溶解し、 60°Cで 90分間加熱し、 次いで遠心分離により上 澄液と菌体に再々分離した。 再々分離した上澄液に lmol/L リン酸塩緩衝液 (ΡΗ8·0)を 1/10 量になるように添加し、 25 wZv%酢酸カルシウム溶液を 0.1〜 2.0wZv%になるよう加え、 ろ過し、 外膜たん白 （感染防御抗原） を含むろ液を 得た。 外膜たん白 （感染防御抗原） を含む液を SP カラムクロマトグラフ法 （平 衡化溶液： 0. lmol/L リン酸塩緩衝液 (pH6.0) ) により素通り液を回収した。 次レ、 で、 ゲル力ラムクロマトグラフ法 （平衡化溶液： 0.25mol/L リン酸ナトリウム添 加 0.025mol/Lリン酸ナトリウム液 (PH8.7)) によりカラムを通した後、 ろ過 （孔 径 0.2/xm) したものを精製外膜たん白 （69K抗原） とした。
(5) 線毛 （凝集原 (AGG)) の調製
上記 （4) で外膜たん白を含む液を採取した後の残渣に lmol/L塩化ナトリウ ム添加 0. lmol/L リン酸塩緩衝液 (pH8.0)を上澄液の 1/10量加え、 ろ過し、 線毛 (感染防御抗原） を含むろ液を得た。 得られた線毛を含む液を硫酸アンモニム濃 縮後、 密度勾配遠心法で精製し、 精製線毛 （FB抗原） を分画した。
(6) 防御抗原の調製 （減毒）
上記 （2) 〜 （5) で得た PT抗原、 FHA抗原、 69KD抗原および FB抗原を、 下 記実施例 8で調製する D P T混合ワクチン 0.5mLあたり PT抗原 1.89/i g、 FHA抗 原 3.00 /i g、 69K抗原 0.76;ugおよび FB抗原 0.36/zgの抗原比率を目標品質に混 合した液を精製感染防御抗原液とした。 精製感染防御抗原液にホルマリンを 0.2 〜0.5v o 1 %および必要に応じて塩酸リジンを lwZv。/。以下になるように加え、 37〜41°Cで 7日間以上加温して減毒したものを百日せきの防御抗原液とした。 限 外ろ過法を用いて余分なホルマリンおよび塩酸リジンを取り除き、 百日せきの防 御抗原の原液とした。 実施例 6 (ジフテリアトキソイ ドの製造）
(1) ジフテリア菌の培養
ジフテリァ菌 （Park Williams No.8) をレフレル培地で 32.0〜34.0。C、 5日間培 養した。
(2) ジフテリア毒素の調製
上記 （1 ) で得られた培養液に硫酸アンモニゥムを加えた後の上澄液をろ過 (孔径 0.45/im) し、 得られたろ液をフエニル疎水性カラムクロマトグラフ法 (平衡化溶液： 1.25mol/L硫酸アンモニゥム添加 0.01mol/L リン酸ナトリウム液 (pH6.5) ) によりカラムを通し、 得られた毒素液を DEAEイオン交換カラムクロマ トダラフ法 （平衡化溶液： 0.01mol/L リン酸塩緩衝液 (PH7.0) ) によりカラムに 通し、 次いでゲルカラムクロマトグラフ法 （平衡化溶液： 0.145raol/L塩化ナト リウム添加 0. lmol/Lリン酸塩緩衝液（pH7.0) ) によりカラムに通してジフテリア 毒素を分画し、 これを精製毒素液とした。
(3) ジフテリア毒素のトキソイド化
上記 （2) で得られた精製毒素液に、 塩酸リジンを lwZvy。以下、 ホルマリ ンを 0·3ν ο 1 %になるように加え 38.0〜40.0°Cで 21 日間加温してトキソイ ド 化した。
(4) ジフテリアトキソイ ドの調製
上記 （3) でトキソイド化した後、 限外ろ過法を用いて余分なホルマリンおよ び塩酸リジンを取り除き、 ジフテリアトキソィ ド液とした。 実施例 7 (破傷風トキソィ ドの製造）
(1) 破傷風菌の培養
破傷風菌 （Harvard47-A) を肝肝ブイヨンで 34.5°C〜36.5°C、 5日間培養した。 (2) 破傷風毒素の調製
上記 （1) で得られた培養液 1Lあたり 1.25mol/Lになるよう硫酸アンモニゥ ムを加えた。 次いで、 フエニル疎水性カラムクロマトグラフ法 （平衡化溶液： 1.25mol/L 硫酸アンモニゥム添カ卩 0.01mol/L リン酸ナトリウム液（pH6.5) ) によ りカラムに通し、 得られた毒素液を DEAE イオン交換クロマトグラフ法 （平衡化 溶液： O.Olmol/L リン酸塩緩衝液（ρΗ7· 5) ) によりカラムに通し、 次いでゲル力 ラムクロマ トグラフ法 （平衡化溶液 ： 0.145raol/L 塩化ナ ト リ ゥム添加 0.004mol/L リン酸塩緩衝液（pH7.0) ) によりカラムに通して破傷風毒素を分画し、 これを精製毒素液とした。
(3) 破傷風毒素のトキソイ ド化
上記 （2) で得られた精製毒素液に、 ホルマリンを o.3v o iy。になるように 加え、 pH7.0に修正し、 39でで 15〜23日間加温してトキソィ ドィヒした。
(4) 破傷風トキソィ ドの調製
上記 （3) でトキソイド化した後、 限外ろ過法を用いて余分なホルマリンおよ び塩酸リジンを取り除き、 破傷風トキソイド液とした。 実施例 8 (混合ワクチンの製造）
( i) 混合不活化ポリオワクチンの調製
上記実施例 2、 3および 4で得た不活化ポリオワクチン I型、 不活化ポリオワ クチン I I型および不活化ポリオワクチン I I I型の原液を、 D抗原量がそれぞ れ 3、 100、 100 となるように、 199培地 （M199) 、 最終濃度 0.5 v o 1 %の 2-フ エノキシエタノール、 および最終濃度 0.09w/v%の塩化アルミニウムを混合し た。 得られた混合液を、 水酸化ナトリウム又は塩酸で pHを 7に調整し、 混合不 活化ポリオワクチンとした。
( i i ) DPT混合ワクチンの調製
上記実施例 5、 6および 7で得た百日せき菌の防御抗原、 ジフテリアトキソィ ドおよび破傷風トキソイ ドの原液を、 199培地 （M199) 、 最終濃度 0.5v o 1 %の 2 -フエノキシエタノール、 および最終濃度 0.24w/v%の塩化アルミニウムと混 合した。 得られた混合液を、 水酸化ナトリウムおよび塩酸で pHを 7に調整し、 D PT混合ワクチンとした。 ( i i i ) 混合ワクチンの製造
上記 （ i ) で得た混合不活化ポリオワクチンと、 上記 （ i i ) で得た D P T混 合ワクチンとを等量混合し、 混合ワクチンを製造した。 実施例 9 (混合ワクチンの安定性）
実施例 8で得た混合ワクチンにっき、 25°Cで加速試験を行ない、 安定性を測定 した。 安定性は、 各ウィルスに対する力価試験によって評価した。
( 1 ) 沈降精製百日せきワクチンの力価試験
検体、 標準百日せきワクチン及び百日せき菌 18323株を用いる。 検体及び標準 液をそれぞれ希釈し、 これをもととしてそれぞれ 4倍又は他の適当な対数的等間 隔で合計 3段階希釈以上の希釈を作る。 4週齢のマウス 16匹以上を 1群とし、 各希釈に 1群ずつを用いる。 1匹当たり希釈液 0. 5raLを 1回腹腔内に注射する。 免疫注射の 21 日後に、 1 匹当たり攻撃用菌浮遊液 0. 025mL を脳内に注射して、 14 日間観察し、 死亡匹数を算出する。 試験の成績を統計学的に処理して比較す るとき、 検体の力価は 8単位/ mL以上でなければならない。
( 2 ) 沈降ジフテリアトキソイ ドの力価試験
検体、 参照沈降ジフテリアトキソイド及び適当な毒素液を用いる。 検体及び参 照品の希釈は、 生理食塩液に、 また、 毒素液の希釈は、 0. 2w/v %ゼラチン加 0. 017mol/L リン酸塩緩衝塩化ナトリウム溶液 （ρΗ7· 0) による。 検体及び参照品 をそれぞれ希釈し、 対数的等間隔の段階希釈を作る。 5 週齢のマウス 10 匹以上 を 1群とし、 検体及び参照品の各希釈に 1群ずつを用い、 1匹当たり 0. 5mLを皮 下に注射する。 免疫注射の 4〜6 週間後にそれぞれの動物から採血し、 血中抗毒 素価を測定する。 試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、 検体の力価は 47単位/ mL以上でなければならない。
( 3 ) 沈降破傷風トキソィ ドのカ価試験
検体、 参照沈降破傷風トキソイ ド及び適当な毒素液を用いる。 検体及び参照品 の希釈は、 生理食塩液に、 また、 毒素液の希釈は、 0. 2w/v %ゼラチン加 0. 017mol/L リン酸塩緩衝塩化ナトリウム （ρΗ7· 0) による。 検体及び参照品をそ れぞれ希釈し、 対数的等間隔の段階希釈を作る。 5 週齢のマウス 10 匹以上を 1 群とする。 検体及び参照品の各希釈に 1 群ずつを用い、 1 匹当たりマウスでは 0. 5mLを 1 回皮下に注射する。 免疫注射の 4〜6週後に、 それぞれのマウスを約 100LD5。の毒素で攻撃して、 4 日間観察する。 試験の成績を統計学的に処理して比 較するとき、 検体の力価は 27単位 /mL以上でなければならない。
( 4 ) ラット免疫原性試験
検体、 IPV力価試験用参照品、 各型の標準血清及び中和試験攻撃用セービン株 ポリオウイルス （i、 n、 m型） を用いる。 検体及び参照品をそれぞれ希釈して、 対数的等間隔の希釈を作る。 Wister系 8週齢、 雌ラット 10匹以上を 1群とし、 各希釈に 1群ずつを用いる。 1匹当たり 0. 5mLを後肢大腿部に筋肉内接種する。 接種の 21 日後に、 個体別に全ての動物から採血し、 血清を採り 56°C30分間加熱 する。 個体別血清及び標準血清を各血清につき 2 ゥエル以上添加し、 MEM培地で 2 倍段階希釈する。 更に、 各ゥエルに各型の中和用ウィルス浮遊液を約 100CCID5。となるように接種する。 その後、 全てのプレートを 36± 1°Cの C02イン キュベータに 3時間置いた後、 約 4°Cでー晚反応させる。 翌日、 各ゥエルに I X 104cells となるように細胞浮遊液を添加し、 36± 1°Cの C02インキュベータで 7 日間培養する。 培養終了後、 各ゥエルの CPEを観察し、 50%中和点の血清希釈倍 数を算出し、 その逆数を中和抗体価とする。 試験の成績を統計学的に処理して比 較するとき、 検体の力価は参照品と同等以上でなければならない。
加速試験の結果を表 1に示す。 参照 IPVとしては、 ロット 0 4 C (日本ポリオ 研究所製） を用いた。 表 1 .
Figure imgf000027_0001
実施例 1 0 (マイクロキャリア一法による V e r o細胞の培養及びポリオウィル スの培養）
( i ) V e r o細胞の培養
Vero 細胞のワーキングバンク （MWCB93) から出発し、 静置培養で継代培養し た細胞をトリプシン一 EDTA 溶液 （0. 25%トリプシン、 0. 014M EDTA) を用い剥離 した後、 600rpm、 10 分間の遠心後、 細胞増殖用培地 （5 v o 1 %仔ゥシ血清、 0. 11%炭酸水素ナトリウム （NaHC03) 、 0. 1%フルクトース、 20 μ g/mL エリスロマ イ シンおよび 100 μ g/mL カナマイシン添カ卩 Dulbecco' s modified Eagle Medium (DME) ) に浮遊させた。
マイクロキャリアー （Cytodex 1 (商品名） ） は、 PBS (-) で膨潤後、 121°C、 15分間ォートクレーブ滅菌し、 細胞増殖用培地に置換して使用した。
培養装置は New Brunswick Scientific 社製セリジエンプラス及びセリジェン を使用し、 マイクロキャリアー、 細胞浮遊液を加えた後、 細胞増殖用培地で最終 4. 8L (セリジェンの場合は 3. 5L) とし、 培養温度 ： 37. 0°C、 溶存酸素濃度 (D0) ： 15%、 PH： 7. 15、 回転数： 35〜50rpm で行った。 培地交換は、 交換用培 地として NaHC03濃度を 0. 15%とした細胞増殖用培地を用い、 培養 2 日目から約 4L/day の量を連続的に行った （セリジェンの場合は 1 日おきに全量） 。 また、 細胞数の測定はコールターカウンター （商品名） を用いて行った。
細胞培養の結果を図 1に示す （ 3 Hの実験のみセリジェンを使用した） 。 キヤ リア一 3g/Lでは低濃度の出発細胞数 （3L、 約 2 X 105cellS/mL) で 7 日目に、 高 濃度の出発細胞数 （3H、 約 10 X 105 cells/mL) で 8 日目に細胞数が最大となり、 その後低下を示した。 また、 キャリアー 5g/i では低濃度の出発細胞数 （5L、 約 2 X 105cells/mL) では. 11 日間細胞数の増加がみられたが、 12 日目で細胞数は低 下した。 低濃度の出発細胞数の場合、 キャリアー 5g/Lの総細胞数は 3g/L と比べ ると 10 日目で優位となったが、 その差は大きくはなかった。 キャリアー 5g/Lで の高濃度の出発細胞数 （5H、 約 10 X 105cells/mL) では 9 日目ではまだ細胞数の 増加段階にあり、 この時点で細胞数は約 2. 8xl06 cells/mL となり、 出発細胞数 の約 2. 7倍に増殖した。
( i i ) ポリオウイルスの培養
シードウィルスは 1型ポリオウイルス（IS- 90C)を用いた。 細胞数計測の最終日 に、 培養容量の 4 倍量の 0. 075% NaHC03添加 EBSS で細胞を洗浄後、 0. 3 % NaHC03、 20 μ g/mL エリスロマイシンおよび 100 g/mL カナマイシン添加 M- 199 (E) 培地 （ウィルス培養用培地） 1L にシードウィルスを希釈調製した。 これを 洗浄後の細胞に接種し、 ウィルス培養用培地をそれぞれの培養装置の培養容量ま で加えた。 ウィルス培養は、 培養温度： 33. 3°C、 DO： 15%、 p H： 7. 40、 回転数： 35〜50rpm で行った。 ウィルスの CPE (cytopathic effect：細胞変性効果） によ つて細胞が完全にマイクロキヤリァ一から離脱した時点でウィルス培養を中止し、 ウィルス液をハーべストした。 ハーべストしたウィルス液は、 - 80°Cに凍結保存 した。
本試験でウィルス培養は図 1に示した細胞増殖曲線でのそれぞれの最終計測日 に開始した。
ウィルス力価の測定は、 次のようにして行なった。 ローラーチューブに 3日間 培養した GMK- 2細胞を 0. 075% NaHC03、 200u/mLぺニシリン、 200 /z g/mL ストレ プトマイシン添加 HBSS lmLで 2回洗浄後、 細胞維持液 （0. 1%ゥシ血清アルブミ ン、 0. 225% NaHC03、 200u/mL ぺニシリン、 200 /z g/mL ス トレプトマイシン添加 M- 199培地） を lmL加えた。 試験ウィルス液は細胞維持液で 0. 51ogl。階段希釈し、 10— 7〜10_8 5のウィルス液を各チューブ当たり 0. 2mL、 各希釈当たり 5本のチュー ブに接種した。 接種後、 36°Cフラン室で 7 日間培養し、 7 日目の CPE観察の判定 をもとに Reed&Muench法により感染価 （CCID5。/0. 2mL) を算出した。
各条件で培養した V e r o細胞で得られた I型ポリオウイルスの感染価 （ウイ ルスカ価） を図 2に示す。 ウィルス培養の結果、 9 日目で約 2. 8xl06 cells/mL の細胞密度であったキヤリァー 5g/L の高濃度の出発細胞数の系（5H)で最も高い 感染価が得られた。 感染価は 5H、 5レ 3L の順であつたが、 これは総細胞数に一 致する成績であった。 また、 対照においたミ ドリザル腎臓細胞で培養して得られ たウィルス液と比べ、 5Hの系では 10倍以上の感染価が得られた。 図 2に示した ウィルス力価 (log^ CCID.n/0. 2mL) は、 具体的には、 3 Lが 8. 18、 5 Lが 8. 51、 5 Hが 8· 59、 R e f . (対照） が 7. 50である。 産業上の利用可能性
セービン株ポリオウイルスを接種する V e r o細胞を、 約 4 g Z L〜約 6 g Z Lのマイクロキャリアー存在下で培養することによって、 高力価のセービン株ポ リォウィルスを得ることができる。 高力価のセービン株ポリオウイルスを用いる ことによって、 不活化セ一ビン株ポリオウイルスを効率的に製造することができ る。 よって、 セービン株ポリオウイルスを接種する V e r o細胞を、 約 4 g Z L 〜約 6 g Z Lのマイクロキヤリァー存在下で培養する工程を含む混合ワクチンの 製造方法 （本発明の製造方法） は、 不活化セービン株ポリオウイルスを含有する 混合ワクチンの効率的な製造方法として有用である。 また、 本発明の混合ワクチ ンは、 ポリオ、 百日せき、 ジフテリアおよび破傷風の発症を効果的に抑制するこ とができるので、 ポリオ、 百日せき、 ジフテリアおよび破傷風に対するワクチン として有用である。

Claims

請求の範囲
1. (A) 不活化セービン株ポリオウイルス、
(B) 百日せき菌の防御抗原、
(C) ジフテリアトキソイ ド、 および
(D) 破傷風トキソィ ド、
を含有する混合ワクチンの製造方法であって、
(a) セ一ビン株ポリオウイルスを接種する V e r o細胞を、 約 4 g/L〜約 6 gZLのマイクロキャリアー存在下で培養する工程、
を含むことを特徴とする方法。
2. さらに、
(b) 前記 Ve r o細胞にセ一ビン株ポリオウイルスを感染させる工程、
(c) 該ポリオウイルスを増殖させる工程、
(d) 該ポリオウイルスを含有するウィルス液を回収する工程、 および
(e) 該ポリオウイルスを不活化させる工程、
を含む、 請求項 1記載の方法。
3. 前記マイクロキャリアーの濃度が、 約 5 gZLである、 請求項 1記載の方 法。
4. 前記マイクロキャリアーが、 デキストラン製マイクロキャリアーである、 請求項 1記載の方法。
5. Ve r o細胞を培養する工程 （工程 （a) ) 力 約 3 L以上のスケールで 行われることを特徴とする、 請求項 1記載の方法。
6. V e r o細胞を培養する工程 （工程 （a) ) t 約 3 0 L以上のスケール で行われることを特徴とする、 請求項 1記載の方法。
7. さらに、
(d— 2) 前記ウィルス液を精製する工程、
を含む、 請求項 2記載の方法。
8. 前記精製工程 （工程 （d— 2) ) 力
(i) 前記工程 （d) で回収したウィルス液の超遠心によるペレッ ト化、
(ii) 該ペレッ トの再浮遊液に対する超音波処理、 (iii) カラムクロマトグラフィーによる精製、
を含むことを特徴とする、 請求項 7記載の方法。
9. 前記 （iii) カラムクロマトグラフィーによる精製が、 1回だけ行われる ことを特徴とする、 請求項 8記載の方法。
10. 請求項 1記載の方法で製造されるワクチン。
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