WO2008040834A1 - Método de evaluación de la eficacia de genes de tolerancia a estrés abiótico en plantas transgénicas - Google Patents

Método de evaluación de la eficacia de genes de tolerancia a estrés abiótico en plantas transgénicas Download PDF

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WO2008040834A1
WO2008040834A1 PCT/ES2007/070166 ES2007070166W WO2008040834A1 WO 2008040834 A1 WO2008040834 A1 WO 2008040834A1 ES 2007070166 W ES2007070166 W ES 2007070166W WO 2008040834 A1 WO2008040834 A1 WO 2008040834A1
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pollen
plant
germination
tolerance
stress
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PCT/ES2007/070166
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Oscar Vicente Meana
Miguel Angel Naranjo Olivero
Lucrecia Catalina Bourgon Baquedano
Original Assignee
Universidad Politécnica De Valencia
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Definitions

  • the present invention relates, in a broad sense, to the field of transgenic plants, more specifically, this invention relates to an in vitro system of pollen germination tests in liquid medium for the evaluation of the tolerance to different conditions of abiotic stress. in transgenic plants.
  • Botany 55: 307-319 is not a solution to the complex problem currently posed.
  • model species such as Arabidopsis thaliana
  • the genes to be tested are expressed throughout the plant under the control of an appropriate constitutive promoter.
  • transgenic plants and non-transformed control plants are grown and subjected in parallel to specific stress conditions: low or high temperatures, saline stress (adding different concentrations and types of salts to the potting substrate), stress water (suppressing irrigation), etc.
  • different growth and development parameters fresh weight, dry weight, number of leaves, flowers or seeds
  • Plant cells when placed in culture, become dedifferentiated and, although under the appropriate conditions they can be kept dividing in vitro for prolonged times, it is an artificial situation that does not correspond to any natural physiological process of plants.
  • the stress response of cells in vitro culture may not reflect, and in most cases does not reflect, the response of whole plants, so that the possible results obtained would not be relevant in practice.
  • the authors of the present invention have developed a particular type of in vitro system, pollen germination tests in liquid medium, as an alternative (and / or complement) for the evaluation of The tolerance to different conditions of abiotic stress in transgenic plants.
  • the genes of interest are expressed, specifically, in pollen grains of transgenic plants that are germinated in vitro under different stress conditions.
  • Pollen development is a very specific process of plant biology.
  • mature pollen is very simple structurally, being constituted only by two or three cells, so that intuitively it does not seem likely that studies carried out during germination of pollen in vitro, and in particular the stress responses in this system, are extrapolated and physiologically relevant for the entire plant.
  • the authors of the present invention have shown that the results obtained in the in vitro germination tests of pollen of the invention are easily quantifiable, physiologically relevant and extrapolated to the entire plant.
  • the method object of the invention allows to have populations of individuals to be analyzed (pollen grains) very numerous in a very limited space, reducing time, cost and workload.
  • it guarantees strict control of experimental conditions and uniformity of treatments applied to crops. These crops are easy to prepare and do not require any complicated infrastructure.
  • FIG. 1 Map of plasmid pLAT52-7
  • Construction pBIN-LAT52 :: C-Sf? /. L Detail of the subcloning of the C-SRL 1 fragment next to the Iat52 promoter in the binary vector pBIN19.
  • Fig. 4 Verification of the activity of the LAT52 promoter in pollen of transgenic tobacco plants a) Histochemical test of the GUS activity in transgenic pollen that overexpresses the ⁇ -glucuronidase gene under the control of the LAT52 promoter and b) Results in agarose gel of the RT-PCR analysis of RNA isolated from Transgenic tobacco pollen that overexpresses C-SRL1 under the control of the LAT52 (Transgenic) promoter, compared to RNA isolated from pollen from wild-type control plants (WT).
  • WT wild-type control plants
  • Fig. 5 Germination percentages of transgenic tobacco pollen expressing C- SRL1 (SRL1 L2 and SRL1 L3), wild tobacco pollen (wt) and GUS transgenic tobacco pollen (line L1), in the presence of 0, 50 and 75 mM concentrations of NaCI.
  • Fig. 6 Microscopic images of pollen grains of the tobacco plant of the wild line (wt) and the transgenic GUS L1 and SRL1 L3 germinating in the absence of salt (control) and in the presence of NaCI (75 mM) and LiCI (50 mM).
  • a method of evaluating the efficacy of abiotic stress tolerance genes in transgenic plants is based on the invention based on the phenotypic analysis of their expression in in vitro germination cultures of the pollen of said transgenic plants.
  • a method of evaluating the efficacy of abiotic stress tolerance genes by means of phenotypic analysis of their expression in transgenic plants comprises the following phases: a) the obtaining of a construction comprising a stress tolerance gene and a specific pollen promoter included in a specific vector for the expression of said gene in transgenic plants; b) the transformation of a plant species with the construction obtained in a) to obtain a transgenic plant; c) the isolation of mature pollen from the transgenic plant obtained in b); d) Ia obtaining an in vitro germination culture of the mature pollen isolated in c) by incubating said pollen in a liquid medium; e) the application of abiotic stress treatments to the crop obtained in d); and f) the analysis of the stress tolerance applied in e) to the pollen culture of the transgenic plant in comparison with a pollen culture from a non-transformed control plant subjected to the same stress conditions.
  • stress tolerance gene is defined as that gene that confers an increase in tolerance to a certain type of stress when overexpressed in transgenic plants.
  • stage a the gene of interest (stress tolerance gene) is cloned under the control of a specific pollen promoter, in an appropriate vector for the genetic transformation of plants.
  • the proposed method is not limited to the use of specific genes, since any previously characterized abiotic stress tolerance gene could be used (to confirm or complement results obtained using other evaluation methods), or putative tolerance genes not yet characterized (for evaluate pollen tolerance phenotypes, as an alternative to using other methods).
  • any specific pollen promoter that allows the expression of the corresponding protein and its accumulation in mature pollen can be used, both isolated so far (tomato LAT52, petunia PA2, carrot DC3, etc.) and any other can be isolated and characterized in the future.
  • the LAT52 promoter originally isolated from tomato Twell D, Wing R, Yamaguchi J and
  • any plant genetic transformation vector is contemplated, currently available (pBIN19, pBI121 (Clontech), the series of pCAMBIA vectors, etc.) that may be generated in the future.
  • the choice of one or the other depends, mainly, on the cloning strategy of the gene to be expressed.
  • stage b) of transformation of the chosen plant species is carried out, by any of the standard methods of the state of the art, in a species for which efficient means of cultivation have been established, or may be established in the future.
  • the in vitro germination of mature pollen is carried out, by any of the standard methods of the state of the art, in a species for which efficient means of cultivation have been established, or may be established in the future.
  • the model species chosen is Nicotiana tabacum (tobacco plant), for which efficient culture media have been established for the germination of mature pollen in vitro (Wilson C, Voronin V, Touraev A, Vicente O and Heberle-Bors E (1997) .A developmentally regulated MAP kinase activated by hydration in tobáceo pollen. Plant CeII 9: 2093-2100; Brewbaker JL and Kwack BH (1963). The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth American Journal of Botany 50: 859-865).
  • the in vitro germination culture liquid medium comprises a mixture of potassium and magnesium salts, a source of energy, calcium ions and boric acid (both required for the germination of pollen).
  • the energy source used is sucrose, in a concentration between 0.15 and 0.3 M.
  • step c) of isolation of mature pollen can be carried out by a method comprising:
  • Pollen should be collected once it has matured inside the anthers. Thus, the collection period can be extended from a few hours before the antecedent, which is the process by which the mature anther opens to release the pollen, until hours after the precedent, provided that the pollen grains remain attached to the anther. The specific times may vary depending on the species.
  • the suspension of the anthers is carried out in a concentration of 2-10 anthers per milliliter of liquid germination medium.
  • the extraction stage iii) can be carried out by stirring.
  • the extraction is produced by separating the tissues of the anther by which, for efficient extraction, the anther must already be open.
  • the pollen isolation method would comprise the collection of open mature anthers (in antecedents or immediately after the anthesis), the suspension thereof in an appropriate volume of the germination medium, in a test tube, and finally, the extraction of pollen by vigorous agitation in a tube agitator (vortex).
  • the extraction can be carried out by mechanical methods.
  • the anther is mechanically broken, and mature but still closed anthers may be included, prior to the antecedent.
  • the pollen isolation method would comprise the collection of mature anthers, before or immediately before the antecedent, the suspension thereof in an appropriate volume of the germination medium, in a concave plate of glass (or similar container), and the extraction of pollen by mechanical methods, such as, for example, by gentle crushing of the anthers with a rod.
  • the extracted pollen is purified by filtration of the suspension through a nylon mesh with a pore size between 50 and 150 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m, depending on the pollen grain diameter, to remove remnants of the anthers
  • the pollen isolation stage c) may additionally comprise:
  • the medium used for pollen isolation and washing is the same as that used for in vitro culture.
  • the mature pollen isolated from the transgenic plants and the mature pollen isolated from the non-transformed control plants are incubated in parallel in Petri dishes, in the liquid germination medium, preferably at a concentration between 1 x 10 5 and 2 x 10 5 grains of pollen for my medium.
  • the incubation (d) is carried out in a time interval between 2 and 5 hours, sufficient to observe the formation of the pollen tubes, and at a temperature between 22 0 C and 28 0 C.
  • the crops are subjected to different treatments of abiotic, chemical or physical stress: incubation at low temperatures or in conditions of thermal shock, addition to the medium of high concentrations of different salts (NaCI, LiCI, NaNO 3 , LiNO 3 . ..) (saline stress), of oxidizing compounds (oxidative stress), etc., including control cultures not subjected to stress treatment.
  • the analysis of the possible stress tolerance applied to the pollen of the transgenic plants, in comparison with the pollen control is carried out by quantifying the viability and functionality of the pollen by determining the germination and growth percentages of the pollen tube in each case.
  • the evaluation of the tolerance to abiotic stress is based on the measurement of germination percentages and the formation of pollen tubes, but in particular determining the differences in the inhibition of germination between pollen from transgenic and non-transgenic plants, subjected to the same stress conditions in in vitro cultures.
  • the method of the present invention has several practical advantages, common to all in vitro systems, such as:
  • a tobacco flower contains about 200,000 grains of pollen, which can be germinated in a single Petri dish. Strict control of experimental conditions and uniformity of treatments. For example, if we study the response to saline stress, adding NaCI to the liquid germination medium, the concentration of Na to which the cells are subjected will be the one present in the medium, and exactly the same for all pollen grains of the plate ( Which obviously does not happen by adding NaCI to the potting plant watering medium).
  • the in vitro germination system of isolated pollen has important advantages, which make it ideal for this type of study:
  • the mature pollen grains are very easily and efficiently isolated from anthers in the antecedents, or immediately before or after the anthesis.
  • the preparation of other in vitro systems of plant cells are very laborious, in time and workload.
  • the cultures are easy to prepare and do not require any complicated infrastructure, simply Petri dishes, an autoclave for sterilization of the culture medium, an incubator with adjustable temperature, and an appropriate microscope for the observation of the cultures, the tests are very fast : in a few hours the formation of the pollen tubes is detected, which demonstrates the viability and functionality of the pollen.
  • the possible effects of the different treatments applied are easy to quantify, simply by determining the variation in the germination percentages and in the growth of the pollen tubes, in comparison with the untreated control cultures.
  • the germination of pollen in vitro is a physiological process in which the pollen grain is perfectly functional, forming the pollen tube in a similar way to what it does in natural conditions, at be deposited and rehydrate in stigma.
  • the high degree of overlapping of gene expression patterns that occurs between the sporophytic and gametophytic generations means that a very high percentage of all the genes that are expressed in the plant, probably including most of the "genes of tolerance to abiotic stress ", is also expressed in pollen and with the same biological function. Therefore, the results obtained in the pollen in vitro germination system will be physiologically relevant and extrapolar to the whole plant, the fact that the pollen grains are haploid cells, represents an additional advantage.
  • C-SRL1 (No access Gene Bank: AF249733) was expressed in mature pollen of transgenic plants of snuff, and said pollen was subjected to salt stress in the presence of various salts, and thermal stress (incubation at 37 0 C) in cultures of germination in liquid medium.
  • a C-SRL1 cDNA clone was isolated (along with other Arabidopsis genes), based on the salt tolerance phenotype (LiCI and NaCI) that conferred its overexpression in yeast cells.
  • Evidence was also obtained that the overexpression of the same cDNA, under the control of the constitutive 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), conferred tolerance to saline stress in transgenic Arabidopsis plants (Forment J, Naranjo MA, Roldan M, Serrano R and Vicente O (2002) .Expression of Arabidopsis SR-like splicing proteins confers salt tolerance to yeast and transgenic plants.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • transgenic plants were effectively more tolerant to saline stress than the non-transformed control plants, performing a Quantitative analysis of different growth and development parameters of adult plants of one of the transgenic lines.
  • the promoter LAT52 was selected. This promoter was extracted from plasmid pLAT52-7, a plasmid pBluescript (Stratagene) in whose polylinker the E. coli GUS gene flanked by the LAT52 promoter and the terminator nos was introduced, and which was provided by Dr. David Twell ( University of Leicester, UK). (Fig. 1). PBIN19 (Bevan M (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acid Research 12: 8711-8721) (Fig. 2) was chosen as the binary vector for the genetic transformation of tobacco plants.
  • the nptll selection gene neomycin phosphotransferase
  • the LAT52-GUS-set was extracted from plasmid pLAT52-7 and cloned into pBIN19, giving rise to the construction pBIN - LA T52 :: GUS, which allows expression of ⁇ -glucuronidase in the pollen of transgenic plants.
  • Plasmids pBIN - LAT52 :: C-SRL1 and pBIN - LAT52 :: GUS were transferred to bacteria of the LBA4044 strain of Agrobacterium tumefaciens by electroporation (Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW (1988). High efficiency transformation of Escherichia coli by high voltage electroporation Nucleic Acids Research 16: 6127).
  • Both bacterial cultures were used for the genetic transformation, mediated by A. tumefaciens, of tobacco plants. Both standard methods were used in the transformation (by the technique of the "leaf disk") and in the regeneration and analysis of the transgenic plants. Transgenic plants, as well as the non-transformed control plants, They were grown in the greenhouse until adulthood, at which time flowers with mature pollen were selected, to carry out the studies described below.
  • the figure shows the agarose gel with the bands amplified from the corresponding RNAs and, in the left channel, a size marker.
  • the anthers were isolated from the tobacco plants before or during the hours following the antecedent (anthers open to a greater or lesser extent, with pollen inside and / or adhered to the anther). Twenty anthers (from 4 flowers) were deposited in 5 ml of liquid germination medium composed of 3.2 mM H 3 BO 3 , 0.8 mM MgSO 4 , 1 mM KNO 3 , 1, 3 mM Ca (NO 3 ) 2 and 0.29 M sucrose. The anthers were vigorously shaken with the vortex to favor pollen shedding. Next, the germination medium containing the pollen in suspension was filtered through a nylon mesh of 100 ⁇ m in pore diameter (Millipore) to eliminate remains of anther or other tissues of the flower.
  • liquid germination medium composed of 3.2 mM H 3 BO 3 , 0.8 mM MgSO 4 , 1 mM KNO 3 , 1, 3 mM Ca (NO 3 ) 2 and 0.29 M sucrose.
  • the percentage of germinated pollen grains in each culture was determined by observing the samples with a phase contrast microscope (Nikon) and photographed using a Nikon Eclipse E600 microscope, using clear field. For each sample, at least 400 grains of pollen were counted. A pollen grain was considered germinated when the length of its pollen tube reached at least twice its diameter.
  • Figure 6 shows photos of the pollen cultures of the controls (wt and GUS, L1) and the SRL1 L3 line, in the absence of salt (control) or in the presence of 75 mM NaCI or 50 mM LiCI. It can be seen how pollen grains of all lines normally germinated in the absence of salt, but that however, when we deal with NaCI or LiCI, only the L3 line that overexpresses C-SRL1 (SRL1-L3) was able to develop pollen tubes.
  • C-SRL1 also gives the pollen of the transgenic plants an increase in their tolerance to high temperatures
  • the pollen of the controls (wt and GUS plants, line 1) and of the line SRL1 L3 was incubated for two hours in the germination medium in vitro, at 22 0 C and under conditions of thermal shock (37 0 C).
  • the treatment with 37 0 C did not produce an inhibition of the germination as pronounced as that observed in the presence of different salts, since approximately 50% of the pollen of the non-transformed lines and GUS were able to develop the pollen tube
  • the pollen of the transgenic line SRL1 L3 showed an improved tolerance to thermal stress, giving germination percentages greater than 75% in these conditions (table 2).

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de evaluación de la eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico mediante el análisis fenotípico de su expresión en plantas transgénicas que comprende a) obtención de una construcción que comprende un gen de tolerancia a estrés y un promotor específico de polen incluidos en un vector de transformación genética de plantas; b) transformación de una especie vegetal con dicha construcción para obtener una planta transgénica; c) aislamiento del polen maduro de dicha planta; d) obtención de un cultivo de germinación in vitro del polen aislado mediante su incubación en un medio líquido; e) aplicación de tratamientos de estrés abiótico al cultivo; y f) análisis de la tolerancia al estrés aplicado a dicho cultivo de polen en comparación con un cultivo de polen procedente de una planta control no transformada sometida a las mismas condiciones de estrés.

Description

TITULO
MÉTODO DE EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE GENES DE TOLERANCIA A
ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS TRANSGÉNICAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere, en sentido amplio, al campo de las plantas transgénicas, más concretamente, esta invención se refiere a un sistema in vitro de ensayos de germinación de polen en medio líquido para Ia evaluación de Ia tolerancia a distintas condiciones de estrés abiótico en plantas transgénicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Distintas condiciones de estrés abiótico, como temperaturas extremas (frío o calor), suelos excesivamente ácidos o alcalinos o, sobre todo, sequía y alta salinidad, son las causas principales de Ia disminución del rendimiento en Ia producción agrícola a nivel mundial; de hecho, son cuantitativamente mucho más importantes que las debidas a estrés biótico, como las enfermedades causadas por organismos patógenos de las plantas (Boyer JS (1982). Plant productivity and environment. Science 218: 443-448; Owens S. (2001). SaIt of the Earth. Genetic engineering may help to reclaim agricultural land lost due to salinisation. EMBO Reports 2: 877-879; Munns R (2002). Comparative physiology of salt and water stress. Plant, CeII and Environment 25: 239- 250; Flowers TJ (2004). Improving crop salt tolerance. Journal of Experimental Botany 55: 307-319).
Los efectos previsibles del cambio climático global, con un aumento de Ia desertificación en muchas zonas del planeta, y Ia progresiva salinización de las tierras de cultivo, sobre todo de aquellas en principio más fértiles, las cultivadas bajo irrigación en regiones áridas y semi-áridas, ponen en riesgo el incremento en Ia producción agrícola, que será necesario para alimentar una población humana que seguirá creciendo al menos durante las próximas décadas (Yeo A (1999). Predicting the interaction between the effects of salinity and climate change on crop plants. Scientia Horticulturae 78: 159-174). A ello hay que unir Ia limitación en Ia disponibilidad de agua para regadíos, Ia pérdida de terrenos agrícolas debido a Ia urbanización, y Ia imposibilidad de extender los cultivos a zonas aún no utilizadas, bien por Ia baja fertilidad del suelo o por su alto valor ecológico (Tilman D. (2000). Global environmental impacts of agricultura! expansión: the need for sustainable and efficient practices. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 5995-6000).
Por todo ello, Ia mejora genética de Ia tolerancia a estas condiciones de estrés abiótico es una necesidad urgente para el futuro de Ia agricultura, pues permitiría incrementar Ia producción agrícola sin aumentar el área de los cultivos.
La mejora genética de Ia tolerancia a estrés ha constituido uno de los objetivos principales de los programas de mejora por métodos tradicionales, con cierto éxito en algunos casos concretos. Sin embargo, Ia utilización de estas técnicas clásicas, dadas sus limitaciones intrínsecas y Ia complejidad genética y fisiológica de los caracteres de tolerancia (Flowers TJ (2004). Improving crop salt tolerance. Journal of Experimental
Botany 55: 307-319), no supone una solución al complejo problema planteado actualmente.
Por otra parte, las técnicas de ingeniería genética desarrolladas en los últimos veinte años, en base a los avances de Ia biología molecular, permiten Ia transferencia rápida y eficaz a especies cultivadas de genes de cualquier origen, incluyendo aquellos que al expresarse en el organismo receptor puedan conferirle un incremento en su tolerancia a estrés. Estas plantas transgénicas, sin duda, constituirán una de las bases de Ia agricultura en un futuro inmediato. Este abordaje, sin embargo, requiere un conocimiento profundo de los mecanismos moleculares de respuesta de las plantas a distintos tipos de estrés abiótico y, obviamente, el aislamiento previo y Ia caracterización de esos genes putativos de tolerancia. En este campo se ha centrado una parte importante de Ia investigación en biología molecular y biotecnología de plantas en los últimos años. Actualmente se dispone de varios genes cuya expresión en plantas transgénicas confiere a las mismas niveles variables de tolerancia (aunque generalmente modestos), por ejemplo a frío, calor, estrés hídrico o sal (Kishor PBK, Hong Z, Miao G-H, Hu C-AA and Verma DPS (1995). Overexpression of Δ1 -pyrroline-5- carboxilase synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiology 108: 1387-1394; Romero C, Bellés JM, Vaya JL, Serrano R and Culiañez-Maciá FA (1997). Expression of the yeast trehalose-6- phosphate synthase gene in transgenic tobáceo plants: pleiotropic phenotypes include drought tolerance. Planta 201: 293-297; Sakamoto A, Murata A and Murata N (1998). Metabolic engineering oí rice leading to biosynthesis of glycinebataine and tolerance to salt and cold. Plant Molecular Biology 38: 1011-1019; Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K and Shinozaki K (1999). Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nature Biotechnology 17: 287-291; Zhang HX and Blumwald E (2001). Transgenic salt- tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nature Biotechnology 19: 765-768).
La evaluación de estos genes como posibles herramientas biotecnológicas para Ia mejora genética molecular de Ia tolerancia a estrés requiere, como primer paso, el análisis fenotípico de los efectos de su expresión en las plantas transgénicas.
Normalmente, al menos en los estudios iniciales, se utilizan, como receptores, especies modelo, como Arabidopsis thaliana, y los genes a ensayar se expresan en toda Ia planta bajo control de un promotor constitutivo apropiado. Para realizar este análisis, las plantas transgénicas y plantas control no transformadas, se crecen y son sometidas en paralelo a condiciones específicas de estrés: temperaturas bajas o elevadas, estrés salino (añadiendo distintas concentraciones y tipos de sales al sustrato de las macetas), estrés hídrico (suprimiendo el riego), etc. A Io largo del tratamiento se determinan distintos parámetros de crecimiento y desarrollo (peso fresco, peso seco, número de hojas, de flores o de semillas) para establecer si, y en qué medida, Ia expresión del gen heterólogo en efecto confiere tolerancia al estrés particular ensayado.
Este tipo de análisis supone una importante carga económica y de trabajo. Variaciones individuales en las respuestas de las plantas exigen utilizar un número elevado de ejemplares para obtener resultados estadísticamente significativos, sobre todo cuando los fenotipos son débiles. En muchos casos, además, es difícil asegurar Ia homogeneidad de los tratamientos a toda Ia población ensayada. Por otra parte, para un análisis exhaustivo de Ia tolerancia, que puede ser variable en las distintas fases del desarrollo de las plantas {e.g., Johnson DW, Smith SE and Dobrenz AK (1992).
Genetic and phenotypic relationships in response to NaCI at different developmental stages in alfalfa. Theoretical and Applied Genetics 83: 833-838), los tratamientos deben extenderse durante todo su ciclo vital, durantes semanas o meses, dependiendo de Ia especie. Todo ello supone ocupar amplios espacios de invernadero durante tiempos prolongados. La utilización de sistemas de cultivo in vitro de células vegetales, en general, supone una alternativa a los ensayos in vivo, en estudios bioquímicos y moleculares. Estos sistemas permiten un control mucho más riguroso de las condiciones experimentales y los distintos tratamientos a aplicar, y el requerimiento de espacio para realizar los experimentos es mucho menor. Sin embargo, estos sistemas in vitro no son apropiados para el análisis de los efectos de Ia expresión de posibles genes de tolerancia a estrés. Las células vegetales, cuando se ponen en cultivo, se desdiferencian y, aunque en las condiciones apropiadas pueden mantenerse dividiéndose in vitro durante tiempos prolongados, se trata de una situación artificial que no se corresponde con ningún proceso fisiológico natural de las plantas. Así pues, Ia respuesta a estrés de las células en cultivo in vitro puede no reflejar, y en Ia mayoría de los casos no refleja, Ia respuesta de las plantas completas, por Io que los posibles resultados obtenidos no serían relevantes en Ia práctica.
Así, en base a las necesidades del estado de Ia técnica, los autores de Ia presente invención han desarrollado un tipo particular de sistema in vitro, ensayos de germinación de polen en medio líquido, como alternativa (y/o complemento) para Ia evaluación de Ia tolerancia a distintas condiciones de estrés abiótico en plantas transgénicas. Los genes de interés se expresan, de forma específica, en granos de polen de plantas transgénicas que son germinados in vitro en distintas condiciones de estrés.
El desarrollo del polen, aunque ha sido estudiado desde hace muchos años por los botánicos, constituye un campo muy especializado de Ia biología molecular de plantas, en el que trabajan muy pocos grupos de investigación, a nivel internacional, como por ejemplo los de David Twell (Universidad de Leicester, UK), Sheila McCormick (Universidad de California, Berkeley, USA), Christian Dumas (Escuela Normal Superior de Lyon), Jaroslav Tupy (Instituto de Botánica Experimental de Ia Academia de Ciencias de Ia República Checa, Praga), o Erwin Heberle-Bors (Universidad de Viena). Aunque el estudio de los mecanismos moleculares de respuesta a estrés sí representa una línea fundamental de investigación en biología molecular de plantas, el número de personas expertas simultáneamente en ambas materias es muy limitado. El estudio del desarrollo del polen, utilizando abordajes de biología y genética molecular, está muy retrasado con respecto a Ia investigación de otros procesos en plantas. Como consecuencia, el número de genes (y sus promotores) específicos de polen, aislados y caracterizados hasta el momento, es también muy limitado.
El desarrollo del polen, incluyendo su germinación, es un proceso muy específico de Ia biología de las plantas. Por otra parte, el polen maduro es muy simple estructuralmente, al estar constituido tan sólo por dos o tres células, por Io que intuitivamente no parece probable que estudios realizados durante Ia germinación del polen in vitro, y en concreto las respuestas a estrés en este sistema, sean extrapolables y relevantes fisiológicamente para Ia planta completa.
Sin embargo, de forma sorprendente, los autores de Ia presente invención han demostrado que los resultados obtenidos en los ensayos de germinación in vitro de polen de Ia invención son fácilmente cuantificables, fisiológicamente relevantes y extrapolables a Ia planta completa. De este modo, el método objeto de Ia invención permite disponer de poblaciones de individuos a analizar (granos de polen) muy numerosas en un espacio muy limitado, disminuyendo el tiempo, el coste y Ia carga de trabajo. Además, garantiza el control estricto de las condiciones experimentales y uniformidad de los tratamientos aplicados a los cultivos. Estos cultivos son fáciles de preparar y no requieren ninguna infraestructura complicada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Mapa del plásmido pLAT52-7
Fig.2. Mapa del vector binario pBIN19
Fig.3. Construcción pBIN-LAT52::C-Sf?/.l Detalle del subclonaje del fragmento C- SRL 1 junto al promotor Iat52 en el vector binario pBIN19.
Fig. 4. Comprobación de Ia actividad del promotor LAT52 en polen de plantas transgénicas de tabaco a) Ensayo histoquímico de Ia actividad GUS en polen transgénico que sobreexpresa el gen β-glucuronidasa bajo el control del promotor LAT52 y b) Resultados en gel de agarosa del análisis por RT-PCR de RNA aislado de polen de tabaco transgénico que sobreexpresa C-SRL1 bajo el control del promotor LAT52 (Transgénica), en comparación con RNA aislado de polen de las plantas control tipo silvestre (WT).
Fig.5. Porcentajes de germinación del polen de tabaco transgénico expresando C- SRL1 (SRL1 L2 y SRL1 L3), de polen de tabaco silvestre (wt) y de polen de tabaco transgénico GUS (línea L1 ), en presencia de concentraciones 0, 50 y 75 mM de NaCI.
Fig. 6. Imágenes al microscopio de granos de polen de Ia planta de tabaco de Ia línea silvestre (wt) y las transgénicas GUS L1 y SRL1 L3 germinando en ausencia de sal (control) y en presencia de NaCI (75 mM) y LiCI (50 mM).
OBJ ETO DE LA INVENCIÓN
En primer lugar, es objeto de Ia invención un método de evaluación de Ia eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico en plantas transgénicas basado en el análisis fenotípico de su expresión en cultivos de germinación in vitro del polen de dichas plantas transgénicas.
Por otra parte, es también objeto de esta invención el uso de dicho método para Ia evaluación de Ia tolerancia a distintas condiciones de estrés abiótico en plantas transgénicas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La mejora genética de Ia tolerancia a estrés en plantas requiere de métodos de evaluación homogéneos, que garanticen resultados fisiológicamente relevantes y estadísticamente significativos para poder avanzar en las técnicas de ingeniería genética de plantas, dadas las deficiencias que muestran los programas de mejora por métodos tradicionales.
En base a esta necesidad, en un aspecto principal de Ia invención se contempla un método de evaluación de Ia eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico mediante el análisis fenotípico de su expresión en plantas transgénicas. Este método comprende las siguientes fases: a) Ia obtención de una construcción que comprende un gen de tolerancia a estrés y un promotor específico de polen incluidos en un vector específico para Ia expresión de dicho gen en plantas transgénicas; b) Ia transformación de una especie vegetal con Ia construcción obtenida en a) para Ia obtención de una planta transgénica; c) el aislamiento del polen maduro de Ia planta transgénica obtenida en b); d) Ia obtención de un cultivo de germinación in vitro del polen maduro aislado en c) mediante Ia incubación de dicho polen en un medio líquido; e) Ia aplicación de tratamientos de estrés abiótico al cultivo obtenido en d); y f) el análisis de Ia tolerancia al estrés aplicado en e) al cultivo del polen de Ia planta transgénica en comparación con un cultivo de polen procedente de una planta control no transformada sometida a las mismas condiciones de estrés.
En Ia presente invención, se define gen de tolerancia a estrés como aquel gen que confiere un incremento en Ia tolerancia a un tipo determinado de estrés al sobreexpresarse en plantas transgénicas.
Para obtener Ia construcción de Ia etapa a), el gen de interés (gen de tolerancia a estrés) se clona bajo control de un promotor específico de polen, en un vector apropiado para Ia transformación genética de plantas.
El método propuesto no se limita a Ia utilización de genes concretos, ya que podría emplearse cualquier gen de tolerancia a estrés abiótico previamente caracterizado (para confirmar o complementar resultados obtenidos utilizando otros métodos de evaluación), o genes putativos de tolerancia aún no caracterizados (para evaluar los fenotipos de tolerancia en polen, como alternativa al uso de otros métodos).
Asimismo, se puede emplear cualquier promotor específico de polen que permita Ia expresión de Ia proteína correspondiente y su acumulación en el polen maduro, tanto los aislados hasta ahora (LAT52 de tomate, PA2 de petunia, DC3 de zanahoria, etc) como cualquier otro que pueda aislarse y caracterizarse en el futuro. Como ejemplo, el promotor LAT52 aislado originalmente del tomate (Twell D, Wing R, Yamaguchi J and
McCormick S (1989). Isolation and expression oí an anther-specific gene from tomato. Molecular and General Genetics 217: 240-245) (n° acceso Gene Bank: X15855), se expresa de forma totalmente específica en polen bicelular, y más concretamente en Ia célula vegetativa del polen, activándose después de Ia mitosis de las microsporas, tanto en tomate como en plantas transgénicas de distintas especies.
Igualmente, en Ia presente invención se contempla cualquier vector de transformación genética de plantas, asequible actualmente (pBIN19, pBI121 (Clontech), Ia serie de vectores pCAMBIA, etc) o que pueda generarse en el futuro. La elección de uno u otro depende, principalmente, de Ia estrategia de clonación del gen a expresar.
La etapa b) de transformación de Ia especie vegetal elegida se lleva a cabo, por cualquiera de los métodos estándar del estado de Ia técnica, en una especie para Ia cual se haya establecido, o puedan establecerse en el futuro, medios de cultivo eficientes para Ia germinación in vitro del polen maduro.
En una realización preferida de Ia invención, Ia especie modelo elegida es Nicotiana tabacum (planta del tabaco), para Ia cual se han establecido medios de cultivo eficientes para Ia germinación de polen maduro in vitro (Wilson C, Voronin V, Touraev A, Vicente O and Heberle-Bors E (1997). A developmentally regulated MAP kinase activated by hydration in tobáceo pollen. Plant CeII 9: 2093-2100; Brewbaker JL and Kwack BH (1963). The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth. American Journal of Botany 50: 859-865).
Así, en una realización particular de Ia invención, el medio líquido del cultivo de germinación in vitro comprende una mezcla de sales de potasio y magnesio, una fuente de energía, iones calcio y ácido bórico (ambos requeridos para Ia germinación del polen). En una realización preferida, Ia fuente de energía empleada es sacarosa, en una concentración comprendida entre 0.15 y 0.3 M.
Este medio líquido, optimizado para polen de tabaco, también permite Ia germinación in vitro de polen de otras plantas, incluso silvestres, como Plantago crassifolia, por Io que es relativamente simple Ia aplicación del procedimiento a otras especies, especialmente, pero no limitadas a aquellas de Ia misma familia del tabaco (Solanáceas): patata, tomate, pimiento, petunia, etc.. En otra realización preferida, Ia etapa c) de aislamiento del polen maduro puede llevarse a cabo por un método que comprende:
i. Ia recolección de anteras maduras de Ia planta transgénica obtenida en b);
¡i. Ia suspensión de las anteras maduras recolectadas en i) en el medio líquido de germinación, i¡¡. Ia extracción del polen de Ia suspensión de anteras obtenidas en ii); y iv. Ia purificación por filtración del polen extraído en iii).
El polen debe recolectarse una vez ha madurado en el interior de las anteras. Así, el periodo de recolección puede extenderse desde unas horas antes de Ia antesis, que es el proceso por el cual Ia antera madura se abre para liberar el polen, hasta horas después de Ia antesis, siempre que los granos de polen permanezcan adheridos a Ia antera. Los tiempos concretos pueden variar dependiendo de Ia especie.
En una realización preferida, Ia suspensión de las anteras se lleva a cabo en una concentración de 2-10 anteras por mililitro de medio líquido de germinación.
En una realización particular, Ia etapa iii) de extracción se puede llevar a cabo por agitación. En este caso, Ia extracción se produce por separación de los tejidos de Ia antera por Io que, para una extracción eficiente, Ia antera debe estar ya abierta. En esta realización particular, el método de aislamiento del polen comprendería Ia recolección de anteras maduras abiertas (en antesis o inmediatamente después de Ia antesis), Ia suspensión de las mismas en un volumen apropiado del medio de germinación, en un tubo de ensayo, y finalmente Ia extracción del polen por agitación vigorosa en un agitador de tubos (vortex).
En otra realización particular, Ia extracción se puede llevar a cabo por métodos mecánicos. En este caso, Ia antera se rompe mecánicamente, pudiendo incluirse anteras maduras pero aún cerradas, previamente a Ia antesis. Así, en esta realización particular el método de aislamiento del polen comprendería Ia recolección de anteras maduras, en antesis o inmediatamente antes de Ia antesis, Ia suspensión de las mismas en un volumen apropiado del medio de germinación, en una placa cóncava de vidrio (o recipiente similar), y Ia extracción del polen por métodos mecánicos, como por ejemplo, por aplastamiento suave de las anteras con una varilla.
En ambos casos, el polen extraído se purifica por filtración de Ia suspensión a través de una malla de nylon con un tamaño de poro comprendido entre 50 y 150 μm, preferiblemente 100 μm, dependiendo del diámetro del grano de polen, para eliminar restos de las anteras.
En realizaciones particulares de Ia invención, si bajo observación microscópica se observa que, tras Ia filtración, Ia suspensión de polen no está suficientemente limpia, Ia etapa c) de aislamiento del polen puede comprender adicionalmente:
v. el lavado por centrifugación del polen obtenidos en iv); y vi. Ia resuspensión del polen en el mismo medio líquido de germinación.
El medio empleado para el aislamiento y lavado del polen es el mismo que el utilizado para su cultivo in vitro.
Una vez finalizada Ia etapa de aislamiento, el polen maduro aislado de las plantas transgénicas y el polen maduro aislado de las plantas control no transformadas se incuba de forma paralela en placas Petri, en el medio líquido de germinación, preferiblemente a una concentración comprendida entre 1 x 105 y 2 x 105 granos de polen por mi de medio.
La incubación (d) se lleva a cabo en un intervalo de tiempo comprendido entre 2 y 5 horas, suficiente para observar Ia formación de los tubos polínicos, y a una temperatura comprendida entre 220C y 280C.
Durante Ia incubación se somete a los cultivos a distintos tratamientos de estrés abiótico, químico o físico: incubación a bajas temperaturas o en condiciones de choque térmico, adición al medio de concentraciones elevadas de distintas sales (NaCI, LiCI, NaNO3, LiNO3...) (estrés salino), de compuestos oxidantes (estrés oxidativo), etc., incluyendo cultivos control no sometidos al tratamiento de estrés. El análisis de Ia posible tolerancia al estrés aplicado del polen de las plantas transgénicas, en comparación con el polen control, se lleva a cabo cuantificando Ia viabilidad y funcionalidad del polen mediante Ia determinación de porcentajes de germinación y crecimiento del tubo polínico en cada caso.
Así, en cultivos control (polen de plantas no transformadas), Ia aplicación del tratamiento de estrés debe originar una disminución de los porcentajes de germinación y de Ia velocidad de crecimiento del tubo polínico in vitro, con respecto al polen no sometido a estrés. En cultivos de polen de las plantas transgénicas, si el gen ensayado en efecto confiere tolerancia al estrés, esta disminución debe ser relativamente menor.
De esta manera, Ia evaluación de Ia tolerancia al estrés abiótico se basa en Ia medida de porcentajes de germinación y formación de tubos polínicos, pero determinando en concreto las diferencias en Ia inhibición de Ia germinación entre el polen de las plantas transgénicas y no transgénicas, sometidos a las mismas condiciones de estrés en los cultivos in vitro.
En otro aspecto principal de Ia invención se contempla el uso del método descrito para Ia evaluación de Ia tolerancia a distintas condiciones de estrés abiótico en plantas transgénicas.
El método de Ia presente invención presenta varias ventajas prácticas, comunes a todos los sistemas in vitro, como son:
Ia posibilidad de disponer de poblaciones muy numerosas, en un espacio muy limitado. Por ejemplo, una flor de tabaco contiene unos 200.000 granos de polen, que pueden germinarse en una única placa Petri. el control estricto de las condiciones experimentales y uniformidad de los tratamientos. Por ejemplo, si estudiamos Ia respuesta a estrés salino, añadiendo NaCI al medio líquido de germinación, Ia concentración de Na al que están sometidas las células será Ia presente en el medio, y exactamente Ia misma para todos los granos de polen de Ia placa (Io que obviamente no sucede añadiendo NaCI al medio de riego de plantas en macetas). Además, el sistema de germinación in vitro de polen aislado presenta importantes ventajas particulares, que Io hacen idóneo para este tipo de estudios:
- los granos de polen maduro se aislan muy fácil y eficientemente de anteras en antesis, o inmediatamente antes o después de Ia antesis. Por el contrario, Ia preparación de otros sistemas in vitro de células vegetales (cultivos de callos en medios con agar, cultivos de células en suspensión en medio líquido) son muy laboriosos, en tiempo y carga de trabajo. - los cultivos son fáciles de preparar y no requieren ninguna infraestructura complicada, simplemente placas Petri, un autoclave para Ia esterilización del medio de cultivo, un incubador con temperatura regulable, y un microscopio apropiado para Ia observación de los cultivos, los ensayos son muy rápidos: en unas pocas horas se detecta Ia formación de los tubos polínicos, que demuestra Ia viabilidad y funcionalidad del polen. los posibles efectos de los distintos tratamientos aplicados son fáciles de cuantificar, simplemente determinando Ia variación en los porcentajes de germinación y en el crecimiento de los tubos polínicos, en comparación con los cultivos control no tratados. al contrario que en los sistemas in vitro de células vegetales desdiferenciadas, Ia germinación del polen in vitro es un proceso fisiológico en el que el grano de polen es perfectamente funcional, formando el tubo polínico de forma similar a cómo Io hace en condiciones naturales, al ser depositado y rehidratarse en el estigma. Por otra parte, el alto grado de solapamiento de los patrones de expresión génica que se da entre las generaciones esporofítica y gametofítica supone que un porcentaje muy elevado de todos los genes que se expresan en Ia planta, probablemente incluyendo Ia mayoría de los "genes de tolerancia a estrés abiótico", se expresa también en polen y con Ia misma función biológica. Por ello, los resultados obtenidos en el sistema de germinación in vitro de polen serán fisiológicamente relevantes y extrapolares a Ia planta completa, el hecho de que los granos de polen sean células haploides, supone una ventaja adicional. En plantas transgénicas homocigotas para el transgen, todos los granos de polen Io expresarán, pero si se utilizan plantas hemicigotas con una sola copia integrada en un locus determinado, el 50% de los granos de polen contendrán y expresará el gen de tolerancia, pero el otro 50% no, constituyendo así un control interno perfecto en los ensayos in vitro posteriores.
El ejemplo que sigue a continuación ilustra Ia presente invención, pero no debe ser considerado como limitación a los aspectos esenciales del objeto de Ia misma, tal como han sido expuestos en los apartados anteriores de esta descripción.
EJEMPLO
Como ejemplo de Ia utilización del procedimiento descrito en esta solicitud de patente, para Ia evaluación de Ia eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico mediante el análisis fenotípico de su expresión en plantas transgénicas, utilizando cultivos de germinación de polen in vitro, se seleccionó un clon parcial del gen de halotolerancia SRL 1 de Arabidopsis thaliana, que codifica un fragmento carboxi-terminal de Ia proteína (C-SRL1 ). C-SRL1 (n° acceso Gene Bank: AF249733) fue expresado en polen maduro de plantas transgénicas de tabaco, y dicho polen se sometió a estrés salino, en presencia de distintas sales, y a estrés térmico (incubación a 37 0C) en cultivos de germinación en medio líquido.
Clonación del gen C-SRL 1
Un clon de cDNA de C-SRL1 fue aislado (junto con otros genes de Arabidopsis), en base al fenotipo de tolerancia a sal (LiCI y NaCI) que confería su sobreexpresión en células de levadura. También se obtuvieron evidencias de que Ia sobreexpresión del mismo cDNA, bajo control del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de Ia coliflor (CaMV), confería tolerancia a estrés salino en plantas transgénicas de Arabidopsis (Forment J, Naranjo MA, Roldan M, Serrano R and Vicente O (2002). Expression of Arabidopsis SR-like splicing proteins confers salt tolerance to yeast and transgenic plants. The Plant Journal 30: 511-519).
Posteriormente, se confirmó que dichas plantas transgénicas eran efectivamente más tolerantes a estrés salino que las plantas control no transformadas, realizando un análisis cuantitativo de distintos parámetros de crecimiento y desarrollo de plantas adultas de una de las líneas transgénicas.
Preparación de Ia construcción para Ia expresión de C-SRL1 en polen
Para Ia expresión de C-SRL1 en polen se seleccionó el promotor LAT52. Este promotor se extrajo del plásmido pLAT52-7, un plásmido pBluescript (Stratagene) en cuyo polylinker se ha introducido el gen GUS de E. coli flanqueado por el promotor LAT52 y el terminador nos, y que fue proporcionado por el Dr. David Twell (Universidad de Leicester, UK). (Fig. 1 ). Como vector binario para Ia transformación genética de plantas de tabaco se eligió el pBIN19 (Bevan M (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acid Research 12: 8711-8721) (Fig. 2).
Utilizando técnicas rutinarias de clonación y manipulación de DNA (Sambrook J, Fritsch E and Maniatis T (1989). Molecular cloning. A laboratory Manual. 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press New York), las secuencias correspondientes al gen GUS (que codifica Ia enzima β-glucuronidasa de Escherichia coli) (Jefferson RA, Burgess SM and Hirsh D (1986). β-glucuronidasa from Escherichia coli as a gen-fusion marker. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83: 8447-845\ ) (n° acceso Gene Bank: M14641 ) del plásmido pLAT52-7 fueron sustituidas por el cDNA de C-SRL1; el plásmido resultante contenía por tanto C-SRL1 flanqueado por el promotor LAT52 y el terminador nos. Posteriormente, el conjunto LAT52-C-SRL1 -nos fue subclonado en el sitio múltiple de clonaje ("polylinker") de pBIN19, dando lugar a Ia construcción pB IN - LAT52 :: C-SRL 1. La figura 3 muestra los elementos del vector flanqueados por los bordes izquierdo y derecho del T-DNA (LB y RB, respectivamente). En Ia figura se puede ver por un lado, Ia cásete constituida por el cDNA de C-SRL1 y sus secuencias reguladoras [el promotor del gen Iat52 y el terminador del gen de Ia nopalin sintasa (nos)], previamente preparada, clonada en los sitios Sal I y Eco Rl del "polylinker" de pBIN 19, y por otro lado, el gen de selección nptll (neomicin fosfotransferasa), que confiere resistencia al antibiótico kanamicina, flanqueado por el promotor (Pnos) y el terminador (nosA) del gen de Ia nopalin sintasa. En paralelo, y para ser utilizado como control adicional en nuestros experimentos, el conjunto LAT52-GUS-nos fue extraído del plásmido pLAT52-7 y clonado en pBIN19, dando lugar a Ia construcción pBIN - LA T52 :: GUS, que permite Ia expresión de Ia β- glucuronidasa en el polen de las plantas transgénicas.
Transformación genética de plantas de tabaco
Los plásmidos pBIN - LAT52 :: C-SRL1 y pBIN - LAT52 :: GUS fueron transferidos a bacterias de Ia cepa LBA4044 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación (Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW (1988). High efficiency transformation of Escherichia coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research 16: 6127).
Ambos cultivos bacterianos se utilizaron para Ia transformación genética, mediada por A. tumefaciens, de plantas de tabaco. Tanto en Ia transformación (por Ia técnica del "disco de hoja" ("leaf-disk") como en Ia regeneración y análisis de las plantas transgénicas, se utilizaron métodos estándar. Las plantas transgénicas, al igual que las plantas control no transformadas, fueron crecidas en invernadero hasta su etapa adulta, momento en el cual se seleccionaron flores con el polen maduro, para realizar los estudios que se describen a continuación.
Comprobación de Ia actividad del promotor LAT52 en polen transgénico de tabaco.
Polen de Ia línea transgénica transformada con Ia construcción LAT52 :: GUS fue sometido a un ensayo histoquímico de actividad β-glucuronidasa; este ensayo, si es positivo, debe dar una coloración azul que, superpuesta al color natural amarillo del polen de tabaco, da lugar al color verdoso del polen observado en Ia figura 4a. Por otra parte, se comprobó también Ia expresión de C-SRL1 en polen de Ia línea transformada con Ia construcción LAT52 :: C-SRL1, mediante un ensayo de RT-PCR realizado con RNA aislado de polen y oligonucleótidos "primer" específicos del gen C- SRL1 , en comparación con RNA aislado de polen de plantas control tipo silvestre (wt) (Fig. 4b). La figura muestra el gel de agarosa con las bandas amplificadas a partir de los correspondientes RNAs y, en el canal de Ia izquierda, un marcador de tamaño. Estos datos demostraron que el promotor LAT52 es activo en el polen de las plantas transgénicas de tabaco de Ia invención. Aislamiento de polen, cultivo in vito y determinación de porcentajes de perminación
Las anteras se aislaron de las plantas de tabaco en antesis o durante las horas siguientes a Ia antesis (anteras abiertas en mayor o menor extensión, con polen en su interior y/o adherido a Ia antera). Veinte anteras (provenientes de 4 flores) se depositaron en 5 mi de medio líquido de germinación compuesto por 3,2 mM H3BO3, 0,8 mM MgSO4, 1 mM KNO3, 1 ,3 mM Ca(NO3)2 y 0,29 M sacarosa. Las anteras se agitaron vigorosamente con el vórtex para favorecer el desprendimiento del polen. A continuación, se filtró el medio de germinación que contenía el polen en suspensión a través de una malla de nylon de 100 μm de diámetro de poro (Millipore) para eliminar restos de antera o de otros tejidos de Ia flor.
Los cultivos de polen, preparados con una densidad de 105 granos de polen por mi, se incubaron en el medio de germinación, en placas Petri, durante 2 horas en oscuridad, a 220C (salvo en los tratamientos de choque térmico, en los que Ia incubación se realizó a 370C). Para estudiar el efecto de distintas sales sobre Ia germinación del polen, soluciones concentradas de las mismas se añadieron previamente al medio de cultivo, para dar las concentraciones finales indicadas en Ia tabla 1.
Finalmente, el porcentaje de granos de polen germinados en cada cultivo se determinó observando las muestras con un microscopio de contraste de fases (Nikon) y se fotografiaron utilizando un microscopio Nikon Eclipse E600, usando campo claro. Por cada muestra se contaron, al menos 400 granos de polen. Un grano de polen se consideró germinado cuando Ia longitud de su tubo polínico alcanzó, al menos, dos veces su diámetro.
Ensayos de tolerancia a sal en cultivos de germinación de polen in vitro
En primer lugar, para investigar Ia posible tolerancia a NaCI del polen de plantas transgénicas de tabaco que expresa Ia proteína C-SRL1 , se utilizaron dos líneas independientes, SRL1 L2 y SRL1 L3. Como controles, se utilizó polen de plantas no transformadas (wt, tipo silvestre), y de plantas transgénicas que expresan en polen el gen GUS, que no confiere tolerancia (línea GUS L1 ). En ausencia de sal, los porcentajes de germinación fueron similares en todos los casos y superiores al 90%. En presencia de 75 mM NaCI, Ia germinación del polen de los controles (plantas wt y GUS) está totalmente inhibida, mientras que el polen que expresa C-SRL1 muestra una evidente tolerancia al estrés salino, con porcentajes de germinación superiores al 60% (para Ia línea SRL1 L3) o de aproximadamente el 40% (para Ia línea SRL1 L2) (Fig. 5).
A continuación, investigamos el efecto de otras sales (LiCI, NaNC>3 y LÍNO3) sobre Ia germinación del polen, utilizando los mismos controles (plantas wt y GUS, línea L1 ) y Ia línea SRL1 L3 incubados durante dos horas en el medio de germinación en ausencia de sal o en presencia de diferentes concentraciones de LiCI, NaNC>3 o
LiNO3.
De nuevo, en todos los casos, los porcentajes de germinación en ausencia de sal fueron superiores al 90%. En presencia de LiCI (50 mM) o de NaNO3 o LiNO3 (25 mM), Ia germinación del polen de los controles está inhibida prácticamente por completo. Por el contrario, el polen de Ia línea transgénica SRL1 L3 es capaz de germinar en presencia de estas sales, con porcentajes aproximados del 30, 60 y 50%, respectivamente (tabla 1 ).
Tabla 1. Tolerancia a distintas sales de polen de tabaco transgénico SRL1 L3 y control (wt y GUS L1). Porcentajes de germinación tras 2 h de cultivo in vitro en presencia de las concentraciones indicadas de cada sal
Figure imgf000018_0001
La figura 6 muestra fotos de los cultivos de polen de los controles (wt y GUS, L1 ) y Ia línea SRL1 L3, en ausencia de sal (control) o en presencia de 75 mM NaCI o 50 mM LiCI. Puede observarse cómo los granos de polen de todas las líneas germinaron normalmente en ausencia de sal, pero que sin embargo, cuando tratamos con NaCI o LiCI, sólo la línea L3 que sobreexpresa C-SRL1 (SRL1-L3) fue capaz de desarrollar tubos polínicos.
Ensayos de tolerancia a choque térmico en cultivos de germinación de polen in vitro
Para investigar si Ia expresión de C-SRL1 también confiere al polen de las plantas transgénicas un aumento en su tolerancia a temperaturas elevadas, el polen de los controles (plantas wt y GUS, línea 1 ) y de Ia línea SRL1 L3 se incubó durante dos horas en el medio de germinación in vitro, a 220C y en condiciones de choque térmico (370C). En este caso, el tratamiento con 370C no produjo una inhibición de Ia germinación tan acusada como Ia que se observó en presencia de distintas sales, puesto que aproximadamente el 50% del polen de las líneas no transformadas y GUS fueron capaces de desarrollar el tubo polínico. Sin embargo, el polen de Ia línea transgénica SRL1 L3 mostró de todas formas una tolerancia mejorada al estrés térmico, dando porcentajes de germinación superiores al 75% en estas condiciones (tabla 2).
Tabla 2. Tolerancia a choque térmico de polen de tabaco transgénico SRL1 L3 y controles (wt y GUSL1). Porcentajes de germinación tras 2 h. de cultivo in vitro a las temperaturas indicadas.
Figure imgf000019_0001
Estos resultados demuestran Ia utilidad de los cultivos de germinación in vitro de polen para evaluar fenotipos de tolerancia a distintos tipos de estrés conferidos por expresión de genes de tolerancia en polen de plantas transgénicas.
Los resultados obtenidos son extrapolares a las plantas completas. Así, si un gen confiere tolerancia a un estrés determinado en los cultivos de germinación cuando se expresa en polen, dicho gen conferirá también tolerancia a Ia planta completa cuando se exprese de forma constitutiva en Ia misma, en todos sus órganos y tejidos (como se demostró en el ejemplo, al comprobar que Ia expresión de C-SRL1 en el polen de tabaco Ie confiere tolerancia a sal, habiendo demostrado previamente que dicho gen confiere Ia misma tolerancia a las plantas transgénicas completas de Arabidopsis, cuando se expresa bajo control de un promotor constitutivo).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de evaluación de Ia eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico mediante el análisis fenotípico de su expresión en plantas transgénicas caracterizado porque comprende:
a) Ia obtención de una construcción que comprende un gen de tolerancia a estrés y un promotor específico de polen incluidos en un vector específico para Ia expresión de dicho gen en plantas transgénicas; b) Ia transformación de una especie vegetal con Ia construcción obtenida en a) para Ia obtención de una planta transgénica; c) el aislamiento del polen maduro de Ia planta transgénica obtenida en b); d) Ia obtención de un cultivo de germinación in vitro del polen maduro aislado en c) mediante Ia incubación de dicho polen en un medio líquido; e) Ia aplicación de tratamientos de estrés abiótico al cultivo obtenido en d); y f) el análisis de Ia tolerancia al estrés aplicado en e) al cultivo del polen de Ia planta transgénica en comparación con un cultivo de un polen procedente de una planta control no transformada sometida a las mismas condiciones de estrés.
2. Método según las reivindicación 1 caracterizado porque el medio líquido del cultivo de germinación in vitro comprende una mezcla de sales de potasio y magnesio, una fuente de energía, iones calcio y ácido bórico.
3. Método según Ia reivindicación 2 caracterizado porque el medio líquido del cultivo de germinación in vitro comprende sacarosa como fuente de energía, a una concentración comprendida entre 0.15 y 0.3 M.
4. Método según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque Ia especie vegetal transformada en b) es Ia planta del tabaco.
5. Método según Ia reivindicación 1 caracterizado porque Ia etapa c) de aislamiento del polen maduro comprende:
i. Ia recolección de anteras maduras de Ia planta transgénica obtenida en b);
¡i. Ia suspensión de las anteras maduras recolectadas en i) en el medio líquido de germinación; i¡¡. Ia extracción del polen de Ia suspensión de anteras obtenidas en
¡O; y iv. Ia purificación por filtración del polen extraído en iii).
6. Método según Ia reivindicación 5 caracterizado porque Ia suspensión en ii) tiene una densidad de 2-10 anteras por mililitro de medio líquido de germinación.
7. Método según Ia reivindicación 5 caracterizado porque Ia etapa iii) de extracción se lleva a cabo por agitación o por métodos mecánicos.
8. Método según Ia reivindicación 5 caracterizado porque Ia filtración en iv) se lleva a cabo a través de una malla de nylon con un tamaño de poro comprendido entre 50 y 150 μm.
9. Método según Ia reivindicación 8 caracterizado porque Ia malla de nylon tiene un tamaño de poro de 100 μm.
10. Método según Ia reivindicación 5 caracterizado porque Ia etapa c) de aislamiento del polen comprende adicionalmente:
v. el lavado por centrifugación del polen obtenidos en iv); y vi. Ia resuspensión del polen en el mismo medio líquido de germinación.
1 1. Método según Ia reivindicación 1 caracterizado porque Ia etapa d) de incubación del polen obtenido en c) se lleva a cabo a una concentración comprendida entre 1x105 y 2x105 granos de polen por mi de medio, durante un intervalo de tiempo comprendido entre 2 y 5 horas y a una temperatura comprendida entre 22 y 280C.
12. Método según Ia reivindicación 1 caracterizado porque el análisis de Ia tolerancia en f) se lleva a cabo determinando las diferencias en Ia inhibición de
Ia germinación y del crecimiento del tubo polínico entre el cultivo del polen de Ia planta transgénica y el cultivo del polen de Ia planta control no transformada.
13. Uso del método, según las reivindicaciones 1-12, para Ia evaluación de Ia tolerancia a distintas condiciones de estrés abiótico en plantas transgénicas.
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