ES2302627A1 - Metodo de evaluacion de la eficacia de genes de tolerancia a estres abiotico en plantas transgenicas. - Google Patents
Metodo de evaluacion de la eficacia de genes de tolerancia a estres abiotico en plantas transgenicas. Download PDFInfo
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Abstract
Método de evaluación de la eficacia de genes de tolerancia a estrés abiótico en plantas transgénicas. La presente invención se refiere a un método de evaluación de la eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico mediante el análisis fenotípico de su expresión en plantas transgénicas que comprende a) obtención de una construcción que comprende un gen de tolerancia a estrés y un promotor específico de polen incluidos en un vector de transformación genética de plantas; b) transformación de una especie vegetal con dicha construcción para obtener una planta transgénica; c) aislamiento del polen maduro de dicha planta; d) obtención de un cultivo de germinación in vitro del polen aislado mediante su incubación en un medio líquido; e) aplicación de tratamientos de estrés abiótico al cultivo; y f) análisis de la tolerancia al estrés aplicado a dicho cultivo de polen en comparación con un cultivo de polen procedente de una planta control no transformada sometida a las mismas condiciones de estrés.
Description
Método de evaluación de la eficacia de genes de
tolerancia a estrés abiótico en plantas transgénicas.
La presente invención se refiere, en sentido
amplio, al campo de las plantas transgénicas, más concretamente,
esta invención se refiere a la utilización de cultivos de
germinación in vitro de polen en un método para evaluar la
tolerancia a distintas condiciones de estrés abiótico en plantas
transgénicas que expresan en el polen maduro posibles genes de
tolerancia a estrés.
Distintas condiciones de estrés abiótico, como
temperaturas extremas (frío o calor), suelos excesivamente ácidos o
alcalinos o, sobre todo, sequía y alta salinidad, son las causas
principales de la disminución del rendimiento en la producción
agrícola a nivel mundial; de hecho, son cuantitativamente mucho más
importantes que las debidas a estrés biótico, como las enfermedades
causadas por organismos patógenos de las plantas (Boyer JS
(1982). Plant productivity and environment. Science 218: 443–448;
Owens S. (2001). Salt of the Earth. Genetic engineering may help to
reclaim agricultural land lost due to salinisation. EMBO Reports 2:
877-879; Munns R (2002). Comparative physiology of
salt and water stress. Plant, Cell and Environment 25:
239-250; Zhu J-K (2002). Salt and
drought stress signal transduction in plants. Annual Review of
Plant Biology 53: 247-273; Flowers TJ (2004).
Improving crop salt tolerance. Journal of Experimental Botany 55:
307-319).
Los efectos previsibles del cambio climático
global, con un aumento de la desertificación en muchas zonas del
planeta, y la progresiva salinización de las tierras de cultivo,
sobre todo de aquellas en principio más fértiles, las cultivadas
bajo irrigación en regiones áridas y semi-áridas, ponen en riesgo
el incremento en la producción agrícola, que será necesario para
alimentar una población humana que seguirá creciendo al menos
durante las próximas décadas (Yeo A (1999). Predicting the
interaction between the effects of salinity and climate change on
crop plants. Scientia Horticulturae 78:
159-174). A ello hay que unir la limitación en
la disponibilidad de agua para regadíos, la pérdida de terrenos
agrícolas debido a la urbanización, y la imposibilidad de extender
los cultivos a zonas aún no utilizadas, bien por la baja fertilidad
del suelo o por su alto valor ecológico (Tilman D. (2000). Global
environmental impacts of agricultural expansion: the need for
sustainable and efficient practices. Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 96: 5995-6000).
Por todo ello, la mejora genética de la
tolerancia a estas condiciones de estrés abiótico es una necesidad
urgente para el futuro de la agricultura, pues permitiría
incrementar la producción agrícola sin aumentar el área de los
cultivos.
La mejora genética de la tolerancia a estrés ha
constituido uno de los objetivos principales de los programas de
mejora por métodos tradicionales, con cierto éxito en algunos casos
concretos. Sin embargo, la utilización de estas técnicas clásicas,
dadas sus limitaciones intrínsecas y la complejidad genética y
fisiológica de los caracteres de tolerancia (Flowers TJ (2004).
Improving crop salt tolerance. Journal of Experimental
Botany 55: 307-319), no supone una
solución al complejo problema planteado actualmente.
Por otra parte, las técnicas de ingeniería
genética desarrolladas en los últimos veinte años, en base a los
avances de la biología molecular, permiten la transferencia rápida
y eficaz a especies cultivadas de genes de cualquier origen,
incluyendo aquellos que al expresarse en el organismo receptor
puedan conferirle un incremento en su tolerancia a estrés. Estas
plantas transgénicas, sin duda, constituirán una de las bases de la
agricultura en un futuro inmediato. Este abordaje, sin embargo,
requiere un conocimiento profundo de los mecanismos moleculares de
respuesta de las plantas a distintos tipos de estrés abiótico y,
obviamente, el aislamiento previo y la caracterización de esos
genes putativos de tolerancia. En este campo se ha centrado una
parte importante de la investigación en biología molecular y
biotecnología de plantas en los últimos años. Actualmente se
dispone de varios genes cuya expresión en plantas transgénicas
confiere a las mismas niveles variables de tolerancia (aunque
generalmente modestos), por ejemplo a frío, calor, estrés hídrico o
sal (Kishor PBK, Hong Z, Miao G-H, Hu
C-AA and Verma DPS (1995). Overexpression of
\Delta^{1}-pyrroline-5-carboxilase
synthetase increases proline production and confers osmotolerance in
transgenic plants. Plant Physiology 108: 1387-1394;
Romero C, Bellés JM, Vayá JL, Serrano R and
Culiañez-Maciá FA (1997). Expression of the yeast
trehalose-6-phosphate synthase gene
in transgenic tobacco plants: pleiotropic phenotypes include
drought tolerance. Planta 201: 293-297; Sakamoto A,
Murata A and Murata N (1998). Metabolic engineering of rice leading
to biosynthesis of glycinebataine and tolerance to salt and cold.
Plant Molecular Biology 38: 1011-1019; Kasuga M, Liu
Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K and Shinozaki K
(1999). Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by
gene transfer of a single stress-inducible
transcription factor. Nature Biotechnology 17:
287-291; Zhang HX and Blumwald E (2001). Transgenic
salt-tolerant tomato plants accumulate salt in
foliage but not in fruit. Nature Biotechnology 19:
765-768).
La evaluación de estos genes como posibles
herramientas biotecnológicas para la mejora genética molecular de
la tolerancia a estrés requiere, como primer paso, el análisis
fenotípico de los efectos de su expresión en las plantas
transgénicas. Normalmente, al menos en los estudios iniciales, se
utilizan, como receptores, especies modelo, como Arabidopsis
thaliana, y los genes a ensayar se expresan en toda la planta
bajo control de un promotor constitutivo apropiado. Para realizar
este análisis, las plantas transgénicas y plantas control no
transformadas, se crecen y son sometidas en paralelo a condiciones
específicas de estrés: temperaturas bajas o elevadas, estrés salino
(añadiendo distintas concentraciones y tipos de sales al sustrato
de las macetas), estrés hídrico (suprimiendo el riego), etc. A lo
largo del tratamiento se determinan distintos parámetros de
crecimiento y desarrollo (peso fresco, peso seco, número de hojas,
de flores o de semillas) para establecer si, y en qué medida, la
expresión del gen heterólogo en efecto confiere tolerancia al estrés
particular ensayado.
Este tipo de análisis supone una importante
carga económica y de trabajo. Variaciones individuales en las
respuestas de las plantas exigen utilizar un número elevado de
ejemplares para obtener resultados estadísticamente significativos,
sobre todo cuando los fenotipos son débiles. En muchos casos,
además, es difícil asegurar la homogeneidad de los tratamientos a
toda la población ensayada Por otra parte, para un análisis
exhaustivo de la tolerancia, que puede ser variable en las distintas
fases del desarrollo de las plantas (e.g., Johnson DW, Smith SE
and Dobrenz AK (1992). Genetic and phenotypic relationships in
response to NaCl at different developmental stages in alfalfa.
Theoretical and Applied Genetics 83: 833-838),
los tratamientos deben extenderse durante todo su ciclo vital,
durante semanas o meses, dependiendo de la especie. Todo ello supone
ocupar amplios espacios de invernadero durante tiempos
prolongados.
La utilización de sistemas de cultivo in
vitro de células vegetales, en general, supone una alternativa
a los ensayos in vivo, en numerosos estudios bioquímicos y
moleculares. Estos sistemas permiten un control mucho más riguroso
de las condiciones experimentales y los distintos tratamientos a
aplicar, el requerimiento de espacio para realizar los experimentos
es mucho menor. Sin embargo, estos sistemas in vitro no son
apropiados para el análisis de los efectos de la expresión de
posibles genes de tolerancia a estrés. Las células vegetales,
cuando se ponen en cultivo, se desdiferencian y, aunque en las
condiciones apropiadas pueden mantenerse dividiéndose in
vitro durante tiempos prolongados, se trata de una situación
artificial que no se corresponde con ningún proceso fisiológico
natural de las plantas. Así pues, la respuesta a estrés de las
células en cultivo in vitro puede no reflejar, y en la
mayoría de los casos no refleja, la respuesta de las plantas
completas, por lo que los posibles resultados obtenidos no serían
relevantes en la práctica.
En plantas existe, sin embargo, un tipo muy
particular de sistema in vitro, los cultivos de germinación
en medio líquido de polen aislado, que han sido utilizados en un
gran número de estudios básicos especializados, sobre aspectos
fisiológicos, bioquímicos y moleculares de la biología del polen o
los mecanismos de germinación y crecimiento del tubo polínico (e.g.
Wilson C, Voronin V, Touraev A, Vicente O,
Heberle-Bors E (1997). A developmentally regulated
MAP kinase activated by hydration in tobacco pollen. Plant Cell 9:
2093-2100; Obermeyer G, Klaushofer H, Nagl M,
Höftberger M, Bentrup F-W (1998).
In-vitro germination and growth of lily
pollen tubes is affected by protein phosphatase inhibitors. Planta
207: 303-312; Zonia L, Cordeiro S, Tupý J, Feijó JA
(2002). Oscillatory Chloride Efflux at the Pollen Tube Apex Has a
Role in Growth and Cell Volume Regulation and Is Targeted by
Inositol 3,4,5,6-Tetrakisphosphate. Plant Cell 14:
2233-2249; Kaothien P, Ok SH, Shuai B, Wengier D,
Cotter R, Kelley D, Kiriakopolos S, Muschietti J, McCormick S
(2005). Kinase partner protein interacts with the LePRK1 and LePRK2
receptor kinases and plays a role in polarized pollen tube growth.
The Plant Journal 42: 492-503). Como se deduce de
estos artículos, el sistema de germinación in vitro de polen
no ha sido nunca empleado para la evaluación de los efectos de la
expresión de posibles genes de tolerancia a estrés en plantas
transgénicas.
Estos cultivos de germinación de polen in
vitro presentan varias ventajas prácticas, comunes a todos los
sistemas in vitro, como son:
- -
- la posibilidad de disponer de poblaciones muy numerosas, en un espacio muy limitado. Por ejemplo, una flor de tabaco contiene unos 200.000 granos de polen, que pueden germinarse en una única placa Petri.
- -
- el control estricto de las condiciones experimentales y uniformidad de los tratamientos. Por ejemplo, si estudiamos la respuesta a estrés salino, añadiendo NaCl al medio líquido de germinación, la concentración de Na al que están sometidas las células será la presente en el medio, y exactamente la misma para todos los granos de polen de la placa (lo que obviamente no sucede añadiendo NaCl al medio de riego de plantas en macetas).
Además, el sistema de germinación in
vitro de polen aislado presenta importantes ventajas
particulares (tanto en comparación con las plantas completas
crecidas en macetas como con otros sistemas de células en cultivo),
que lo hacen idóneo para este tipo de estudios:
- -
- los granos de polen maduro se aíslan muy fácil y eficientemente de anteras en antesis, o inmediatamente antes o después de la antesis. Por el contrario, la preparación de otros sistemas in vitro de células vegetales (cultivos de callos en medios con agar, cultivos de células en suspensión en medio líquido) son muy laboriosos, en tiempo y carga de trabajo.
- -
- los cultivos son fáciles de preparar y no requieren ninguna infraestructura complicada, simplemente placas Petri, un autoclave para la esterilización del medio de cultivo, un incubador con temperatura regulable, y un microscopio apropiado para la observación de los cultivos.
- -
- los ensayos son muy rápidos: en unas pocas horas se detecta la formación de los tubos polínicos, que demuestra la viabilidad y funcionalidad del polen.
- -
- los posibles efectos de los distintos tratamientos aplicados son fáciles de cuantificar, simplemente determinando la variación en los porcentajes de germinación y en el crecimiento de los tubos polínicos, en comparación con los cultivos control no tratados, y con cultivos de polen de plantas no transformadas.
- -
- al contrario que en los sistemas in vitro de células vegetales desdiferenciadas, la germinación del polen in vitro es un proceso fisiológico en el que el grano de polen es perfectamente funcional, iniciando la formación del tubo polínico de forma similar a cómo lo hace en condiciones naturales, al ser depositado y rehidratarse en el estigma. Por otra parte, el alto grado de solapamiento de los patrones de expresión génica que se da entre las generaciones esporofítica y gametofítica supone que un porcentaje muy elevado de todos los genes que se expresan en la planta, probablemente incluyendo la mayoría de los "genes de tolerancia a estrés abiótico", se expresa también en polen y con la misma función biológica. Por ello, los resultados obtenidos en el sistema de germinación in vitro de polen serán fisiológicamente relevantes y extrapolables a la planta completa.
- -
- el hecho de que los granos de polen sean células haploides, supone una ventaja adicional. En plantas transgénicas homocigotas para el transgen, todos los granos de polen lo expresarán, pero si se utilizan plantas hemicigotas con una sola copia integrada en un locus determinado, el 50% de los granos de polen contendrán y expresará el gen de tolerancia, pero el otro 50% no, constituyendo así un control interno perfecto en los ensayos in vitro posteriores.
Así, en base a las necesidades del estado de la
técnica, los autores de la presente invención han desarrollado
un procedimiento para la evaluación de la tolerancia de plantas
transgénicas a distintas condiciones de estrés abiótico, conferida
por expresión de posibles genes de tolerancia, basado en la
utilización de cultivos de germinación in vitro de polen
como alternativa (y/o complemento) a los métodos empleados
actualmente. Los genes de interés se expresan, de forma específica,
en granos de polen de las plantas transgénicas, que son germinados
in vitro en distintas condiciones de estrés, cuantificándose
los efectos del estrés aplicado en cada caso sobre los porcentajes
de germinación, en comparación con cultivos control preparados a
partir de polen de plantas no transformadas.
El desarrollo del polen, aunque ha sido
estudiado desde hace muchos años por los botánicos, constituye un
campo muy especializado de la biología molecular de plantas, en el
que trabajan muy pocos grupos de investigación, a nivel
internacional, como por ejemplo los de David Twell (Universidad de
Leicester, UK), Sheila McCormick (Universidad de California,
Berkeley, USA), Christian Dumas (Escuela Normal Superior de Lyon),
Jaroslav Tupý (Instituto de Botánica Experimental de la Academia de
Ciencias de la República Checa, Praga), o Erwin
Heberle-Bors (Universidad de Viena); sin embargo,
ninguna de las publicaciones de estos u otros laboratorios tiene
relación alguna con el procedimiento objeto de la presente
invención. Por otra parte, el estudio de los mecanismos moleculares
de respuesta a estrés sí representa una línea fundamental de
investigación en biología molecular de plantas, existiendo un gran
número de grupos de investigación que trabajan es este campo. En
cualquier caso, el número de personas expertas simultáneamente en
ambas materias (biología del polen y biología molecular de la
respuesta a estrés en plantas) es muy limitado.
El estudio del desarrollo del polen, utilizando
abordajes de biología y genética molecular, está muy retrasado con
respecto a la investigación de otros procesos en plantas. Como
consecuencia, el número de genes (y sus promotores) específicos de
polen, aislados y caracterizados hasta el momento, es también muy
limitado.
El desarrollo del polen, incluyendo su
germinación, es un proceso muy específico de la biología de las
plantas. Por otra parte, el polen maduro es muy simple
estructuralmente, al estar constituido tan sólo por dos o tres
células, por lo que intuitivamente no parece probable que estudios
realizados durante la germinación del polen in vitro, y en
concreto las respuestas a estrés en este sistema, sean
extrapolables y relevantes fisiológicamente para la planta
completa.
completa.
Sin embargo, de forma sorprendente, los
autores de la presente invención han demostrado que los cultivos de
germinación in vitro de polen sí constituyen un sistema
experimental apropiado para evaluar la eficiencia de genes de
tolerancia a estrés expresados en plantas transgénicas,
proporcionando resultados fácilmente cuantificables,
fisiológicamente relevantes y extrapolables a la planta completa.
Como se ha indicado anteriormente, el método objeto de la invención
permite disponer de poblaciones de individuos a analizar (granos de
polen) muy numerosas en un espacio muy limitado, disminuyendo el
tiempo, el coste y la carga de trabajo. Además, garantiza el control
estricto de las condiciones experimentales y uniformidad de los
tratamientos aplicados a los cultivos. Estos cultivos son
fáciles de preparar y no requieren ninguna infraestructura
complicada.
Fig. 1. Mapa del plásmido
pLAT52-7
Fig.2. Mapa del vector binario pBIN19
Fig.3. Construcción
pBIN-LAT52::C-SRL1. Detalle
del subclonaje del fragmento C-SRL1 junto al
promotor lat52 en el vector binario pBIN19.
Fig. 4. Comprobación de la actividad del
promotor LAT52 en polen de plantas transgénicas de tabaco a) Ensayo
histoquímico de la actividad GUS en polen transgénico que
sobreexpresa el gen \beta-glucuronidasa bajo el
control del promotor LAT52 y b) Resultados en gel de agarosa del
análisis por RT-PCR de RNA aislado de polen de
tabaco transgénico que sobreexpresa C-SRL1 bajo el
control del promotor LAT52 (Transgénica), en comparación con RNA
aislado de polen de las plantas control tipo silvestre (WT).
Fig.5. Porcentajes de germinación del polen de
tabaco transgénico expresando C-SRL1 (SRL1 L2 y
SRL1 L3), de polen de tabaco silvestre (wt) y de polen de tabaco
transgénico GUS (línea L1), en presencia de concentraciones 0, 50 y
75 mM de NaCl.
Fig. 6. Imágenes al microscopio de granos de
polen de la planta de tabaco de la línea silvestre (wt) y las
transgénicas GUS L1 y SRL1 L3 germinando en ausencia de sal
(control) y en presencia de NaCl (75 mM) y LiCl (50 mM).
En primer lugar, es objeto de la invención un
método de evaluación de la eficacia de genes de tolerancia al
estrés abiótico en plantas transgénicas, basado en la
utilización de cultivos de germinación de polen in vitro como
sistema experimental para el análisis fenotípico de la expresión de
dichos genes en plantas transgénicas.
Por otra parte, es también objeto de la
invención el empleo de un cultivo de germinación in vitro de
polen maduro aislado para evaluar la eficacia de genes de
tolerancia a estrés abiótico expresados en plantas transgénicas.
La mejora genética de la tolerancia a estrés en
plantas requiere de métodos de evaluación homogéneos, que
garanticen resultados fisiológicamente relevantes y
estadísticamente significativos para poder avanzar en las técnicas
de ingeniería genética de plantas, dadas las deficiencias que
muestran los programas de mejora por métodos
tradicionales.
tradicionales.
En base a esta necesidad, en un aspecto
principal de la invención se contempla un método de evaluación de
la eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico basado en la
utilidad de los cultivos de germinación in vitro de polen
para evaluar fenotipos de tolerancia a distintos tipos de estrés
conferidos por expresión de genes de tolerancia en polen de plantas
transgénicas. Este método comprende las siguientes fases:
- a)
- la obtención de una construcción que comprende un gen de tolerancia a estrés y un promotor específico de polen incluidos en un vector específico para la expresión de dicho gen en plantas transgénicas;
- b)
- la transformación de una especie vegetal con la construcción obtenida en a) para la obtención de una planta transgénica;
- c)
- el aislamiento del polen maduro de la planta transgénica obtenida en b);
- d)
- la obtención de un cultivo de germinación in vitro del polen maduro aislado en c) mediante la incubación de dicho polen en un medio líquido;
- e)
- la aplicación de tratamientos de estrés abiótico al cultivo obtenido en d); y
- f)
- el análisis de la tolerancia al estrés aplicado en e) al cultivo del polen de la planta transgénica en comparación con un cultivo de polen procedente de una planta control no transformada sometida a las mismas condiciones de estrés.
En la presente invención, se define gen de
tolerancia a estrés como aquel gen que confiere un incremento en la
tolerancia a un tipo determinado de estrés al sobreexpresarse en
plantas transgénicas.
Para obtener la construcción de la etapa a), el
gen de interés (gen de tolerancia a estrés) se clona bajo control
de un promotor específico de polen, en un vector apropiado para la
transformación genética de plantas.
El método propuesto no se limita a la
utilización de genes concretos, ya que podría emplearse cualquier
gen de tolerancia a estrés abiótico previamente caracterizado (para
confirmar o complementar resultados obtenidos utilizando otros
métodos de evaluación), o genes putativos de tolerancia aún no
caracterizados (para evaluar los fenotipos de tolerancia en polen,
como alternativa al uso de otros métodos).
Asimismo, se puede emplear cualquier promotor
específico de polen que permita la expresión de la proteína
correspondiente y su acumulación en el polen maduro, tanto los
aislados hasta ahora (LAT52 de tomate, PA2 de petunia, DC3 de
zanahoria, etc) como cualquier otro que pueda aislarse y
caracterizarse en el futuro. Como ejemplo, el promotor LAT52
aislado originalmente del tomate (Twell D, Wing R, Yamaguchi J
and McCormick S (1989). Isolation and expression of an
anther-specific gene from tomato. Molecular and
General Genetics 217: 240-245) (n° acceso
Gene Bank: X15855), se expresa de forma totalmente específica
en polen bicelular, y más concretamente en la célula vegetativa del
polen, activándose después de la mitosis de las microsporas, tanto
en tomate como en plantas transgénicas de distintas especies.
Igualmente, en la presente invención se
contempla cualquier vector de transformación genética de plantas,
asequible actualmente (pBIN19, pBI121 (Clontech), la serie de
vectores pCAMBIA, etc) o que pueda generarse en el futuro. La
elección de uno u otro depende, principalmente, de la estrategia de
clonación del gen a expresar.
La etapa b) de transformación de la especie
vegetal elegida se lleva a cabo, por cualquiera de los métodos
estándar del estado de la técnica, en una especie para la cual se
haya establecido, o puedan establecerse en el futuro, medios de
cultivo eficientes para la germinación in vitro del polen
maduro.
En una realización preferida de la invención, la
especie modelo elegida es Nicotiana tabacum (planta del
tabaco), para la cual se han establecido medios de cultivo
eficientes para la germinación de polen maduro in vitro
(Wilson C, Voronin V, Touraev A, Vicente O and
Heberle-Bors E (1997). A developmentally regulated
MAP kinase activated by hydration in tobacco pollen. Plant Cell
9: 2093-2100; Brewbaker JL and Kwack BH
(1963). The essential role of calcium ion in pollen germination and
pollen tube growth. American Journal of Botany 50:
859-865).
En una realización preferida, la etapa c) de
aislamiento del polen maduro puede llevarse a cabo por un método
que comprende:
- i.
- la recolección de anteras maduras de la planta transgénica obtenida en b);
- ii.
- la suspensión de las anteras maduras recolectadas en i) en el medio líquido de germinación,
- iii.
- la extracción del polen de la suspensión de anteras obtenidas en ii); y
- iv.
- la purificación por filtración del polen extraído en iii).
El polen debe recolectarse una vez ha madurado
en el interior de las anteras. Así, el periodo de recolección puede
extenderse desde unas horas antes de la antesis, que es el proceso
por el cual la antera madura se abre para liberar el polen, hasta
horas después de la antesis, siempre que los granos de polen
permanezcan adheridos a la antera. Los tiempos concretos pueden
variar dependiendo de la especie.
En una realización preferida, la suspensión de
las anteras se lleva a cabo en una concentración de
2-10 anteras por mililitro de medio líquido de
germinación.
En una realización particular, la etapa iii) de
extracción se puede llevar a cabo por agitación. En este caso, la
extracción se produce por separación de los tejidos de la antera
por lo que, para una extracción eficiente, la antera debe estar ya
abierta. En esta realización particular, el método de aislamiento
del polen comprendería la recolección de anteras maduras abiertas
(en antesis o inmediatamente después de la antesis), la suspensión
de las mismas en un volumen apropiado del medio de germinación, en
un tubo de ensayo, y finalmente la extracción del polen por
agitación vigorosa en un agitador de tubos (vortex).
En otra realización particular, la extracción se
puede llevar a cabo por métodos mecánicos. En este caso, la antera
se rompe mecánicamente, pudiendo incluirse anteras maduras pero aún
cerradas, previamente a la antesis. Así, en esta realización
particular el método de aislamiento del polen comprendería la
recolección de anteras maduras, en antesis o inmediatamente antes
de la antesis, la suspensión de las mismas en un volumen apropiado
del medio de germinación, en una placa cóncava de vidrio (o
recipiente similar), y la extracción del polen por métodos
mecánicos, como por ejemplo, por aplastamiento suave de las anteras
con una varilla.
En ambos casos, el polen extraído se purifica
por filtración de la suspensión a través de una malla de nylon con
un tamaño de poro comprendido entre 50 y 150 \mum,
preferiblemente 100 \mum, dependiendo del diámetro del grano de
polen, para eliminar restos de las anteras.
En realizaciones particulares de la invención,
si bajo observación microscópica se observa que, tras la
filtración, la suspensión de polen no está suficientemente limpia,
la etapa c) de aislamiento del polen puede comprender
adicionalmente:
- v.
- el lavado por centrifugación del polen obtenidos en iv); y
- vi.
- la resuspensión del polen en el mismo medio líquido de germinación.
El medio empleado para el aislamiento y lavado
del polen es el mismo que el utilizado para su cultivo in
vitro.
Así, en una realización particular de la
invención, el medio líquido del cultivo de germinación in
vitro comprende una mezcla de sales de potasio y magnesio, una
fuente de energía, iones calcio y ácido bórico, ambos requeridos
para la germinación del polen). En una realización preferida, la
fuente de energía empleada es sacarosa, en una concentración
comprendida entre 0.15 y 0.3 M.
Este medio líquido, optimizado para polen de
tabaco, también permite la germinación in vitro de polen de
otras plantas, incluso silvestres, como Plantago crassifolia,
por lo que es relativamente simple la aplicación del procedimiento
a otras especies, especialmente, pero no limitadas a aquellas de la
misma familia del tabaco (Solanaceas): patata, tomate, pimiento,
petunia, etc..
Una vez finalizada la etapa de aislamiento, el
polen maduro aislado de las plantas transgénicas y el polen maduro
aislado de las plantas control no transformadas se incuba de forma
paralela en placas Petri, en el medio líquido de germinación,
preferiblemente a una concentración comprendida entre 1 x 10^{5} y
2 x 10^{5} granos de polen por ml de medio.
La incubación (d) se lleva a cabo en un
intervalo de tiempo comprendido entre 2 y 5 horas, suficiente para
observar la formación de los tubos polínicos, y a una temperatura
comprendida entre 22°C y 28°C.
Durante la incubación se somete a los cultivos a
distintos tratamientos de estrés abiótico, químico o físico:
incubación a bajas temperaturas o en condiciones de choque térmico
adición al medio de concentraciones elevadas de distintas sales
(NaCl, LiCl, NaNO_{3}, LiNO_{3}...) (estrés salino), de
compuestos oxidantes (estrés oxidativo), etc., incluyendo cultivos
control no sometidos al tratamiento de estrés.
El análisis de la posible tolerancia al estrés
aplicado del polen de las plantas transgénicas, en comparación con
el polen control, se lleva a cabo cuantificando la viabilidad y
funcionalidad del polen mediante la determinación de porcentajes de
germinación y crecimiento del tubo polínico en cada caso.
Así, en cultivos control (polen de plantas no
transformadas), la aplicación del tratamiento de estrés debe
originar una disminución de los porcentajes de germinación y de la
velocidad de crecimiento del tubo polínico in vitro, con
respecto al polen no sometido a estrés. En cultivos de polen de las
plantas transgénicas, si el gen ensayado en efecto confiere
tolerancia al estrés, esta disminución debe ser relativamente
menor.
De esta manera, la evaluación de la tolerancia
al estrés abiótico se basa en la medida de porcentajes de
germinación y formación de tubos polínicos, pero determinando en
concreto las diferencias en la inhibición de la germinación entre el
polen de las plantas transgénicas y no transgénicas, sometidos a
las mismas condiciones de estrés en los cultivos in
vitro.
En otro aspecto principal de la invención se
contempla el empleo de un cultivo de germinación in vitro de
polen maduro aislado para evaluar la eficacia de genes de
tolerancia a estrés abiótico expresados en plantas
transgénicas.
El ejemplo que sigue a continuación ilustra la
presente invención, pero no debe ser considerado como limitación a
los aspectos esenciales del objeto de la misma, tal como han sido
expuestos en los apartados anteriores de esta descripción.
Ejemplo
Como ejemplo de la utilización del procedimiento
descrito en esta solicitud de patente, para la evaluación de la
eficacia de genes de tolerancia al estrés abiótico mediante el
análisis fenotípico de su expresión en plantas transgénicas,
utilizando cultivos de germinación de polen in vitro, se
seleccionó un clon parcial del gen de halotolerancia SRL1 de
Arabidopsis thaliana, que codifica un fragmento
carboxi-terminal de la proteína
(C-SRL1). C-SRL1 (n° acceso
Gene Bank: AF249733) fue expresado en polen maduro de plantas
transgénicas de tabaco, y dicho polen se sometió a estrés salino,
en presencia de distintas sales, y a estrés térmico (incubación a 37
°C) en cultivos de germinación en medio líquido.
Un clon de cDNA de C-SRL1
fue aislado (junto con otros genes de Arabidopsis), en base
al fenotipo de tolerancia a sal (LiCl y NaCl) que confería su
sobreexpresión en células de levadura. También se obtuvieron
evidencias de que la sobreexpresión del mismo cDNA, bajo control
del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV), confería tolerancia a estrés salino en plantas transgénicas
de Arabidopsis (Forment J, Naranjo MA, Roldan M, Serrano R and
Vicente 0 (2002). Expression of Arabidopsis SR-like
splicing proteins confers salt tolerance to yeast and transgenic
plants. The Plant Journal 30:
511-519).
Posteriormente, se confirmó que dichas plantas
transgénicas eran efectivamente más tolerantes a estrés salino que
las plantas control no transformadas, realizando un análisis
cuantitativo de distintos parámetros de crecimiento y desarrollo de
plantas adultas de una de las líneas transgénicas.
Para la expresión de C-SRL1 en
polen se seleccionó el promotor LAT52. Este promotor se extrajo del
plásmido pLAT52-7, un plásmido pBluescript
(Stratagene) en cuyo polylinker se ha introducido el gen GUS
de E. coli flanqueado por el promotor LAT52 y el terminador
nos, y que fue proporcionado por el Dr. David Twell (Universidad de
Leicester, UK). (Fig. 1). Como vector binario para la transformación
genética de plantas de tabaco se eligió el pBIN19 (Bevan M
(1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.
Nucleic Acid Research 12: 8711-8721) (Fig.
2).
Utilizando técnicas rutinarias de clonación y
manipulación de DNA (Sambrook J, Fritsch E and Maniatis T
(1989). Molecular cloning. A laboratory Manual. 2^{nd} ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press New York), las secuencias
correspondientes al gen GUS (que codifica la enzima
\beta-glucuronidasa de Escherichia coli)
(Jefferson RA, Burgess SM and Hirsh D (1986).
\beta-glucuronidasa from Escherichia coli
as a gen-fusion marker. Proceedings of the National
Academy of Sciences, USA 83: 8447-8451) (n°
acceso Gene Bank: M14641) del plásmido pLAT52-7
fueron sustituidas por el cDNA de C-SRL1; el
plásmido resultante contenía por tanto C-SRL1
flanqueado por el promotor LAT52 y el terminador nos.
Posteriormente, el conjunto
LAT52-C-SRL1-nos
fue subclonado en el sitio múltiple de clonaje ("polylinker")
de pBIN19, dando lugar a la construcción pBIN - LAT52 ::
C-SRL1. La figura 3 muestra los elementos del
vector flanqueados por los bordes izquierdo y derecho del
T-DNA (LB y RB, respectivamente). En la figura se
puede ver por un lado, la casete constituida por el cDNA de
C-SRL1 y sus secuencias reguladoras [el
promotor del gen lat52 y el terminador del gen de la nopalin
sintasa (nos)], previamente preparada, clonada en los sitios Sal I
y Eco RI del "polylinker" de pBIN 19, y por otro lado, el gen
de selección nptll (neomicin fosfotransferasa), que confiere
resistencia al antibiótico kanamicina, flanqueado por el promotor
(Pnos) y el terminador (nosA) del gen de la nopalin
sintasa.
En paralelo, y para ser utilizado como control
adicional en nuestros experimentos, el conjunto
LAT52-GUS-nos fue extraído
del plásmido pLAT52-7 y clonado en pBIN19, dando
lugar a la construcción pBIN - LAT52 :: GUS, que permite la
expresión de la \beta-glucuronidasa en el polen
de las plantas transgénicas.
Los plásmidos pBIN - LAT52 ::
C-SRL1 y pBIN - LAT52 :: GUS fueron
transferidos a bacterias de la cepa LBA4044 de Agrobacterium
tumefaciens por electroporación (Dower WJ, Miller JF,
Ragsdale CW (1988). High efficiency transformation of
Escherichia coli by high voltage electroporation. Nucleic
Acids Research 16: 6127).
Ambos cultivos bacterianos se utilizaron para la
transformación genética, mediada por A. tumefaciens, de
plantas de tabaco. Tanto en la transformación, por la técnica del
"disco de hoja" ("leaf-disk"), como en la
regeneración y análisis de las plantas transgénicas, se utilizaron
métodos estándar. Las plantas transgénicas, al igual que las
plantas control no transformadas, fueron crecidas en invernadero
hasta su etapa adulta, momento en el cual se seleccionaron flores
con el polen maduro, para realizar los estudios que se describen a
continuación.
Polen de la línea transgénica transformada con
la construcción LAT52 :: GUS fue sometido a un ensayo
histoquímico de actividad \beta-glucuronidasa;
este ensayo, si es positivo, debe dar una coloración azul que,
superpuesta al color natural amarillo del polen de tabaco, da lugar
al color verdoso del polen observado en la figura 4a. Por otra
parte, se comprobó también la expresión de
C-SRL1 en polen de la línea transformada con
la construcción LAT52 :: C-SRL1, mediante un
ensayo de RT-PCR realizado con RNA aislado de polen
y oligonucleótidos "primer" específicos del gen
C-SRL1, en comparación con RNA aislado de polen de
plantas control tipo silvestre (wt) (Fig. 4b). La figura muestra el
gel de agarosa con las bandas amplificadas a partir de los
correspondientes RNAs y, en el canal de la izquierda, un marcador de
tamaño. Estos datos demostraron que el promotor LAT52 es activo en
el polen de las plantas transgénicas de tabaco de la invención.
Las anteras se aislaron de las plantas de tabaco
en antesis o durante las horas siguientes a la antesis (anteras
abiertas en mayor o menor extensión, con polen en su interior y/o
adherido a la antera). Veinte anteras (provenientes de 4 flores) se
depositaron en 5 ml de medio líquido de germinación compuesto por
3,2 mM H_{3}BO_{3}, 0,8 mM MgSO_{4}, 1 mM KNO_{3}, 1,3 mM
Ca(NO_{3})_{2} y 0,29 M sacarosa. Las anteras se
agitaron vigorosamente con el vórtex para favorecer el
desprendimiento del polen. A continuación, se filtró el medio de
germinación que contenía el polen en suspensión a través de una
malla de nylon de 100 \mum de diámetro de poro (Millipore) para
eliminar restos de antera o de otros tejidos de la flor.
Los cultivos de polen, preparados con una
densidad de 10^{5} granos de polen por ml, se incubaron en el
medio de germinación, en placas Petri, durante 2 horas en oscuridad,
a 22°C (salvo en los tratamientos de choque térmico, en los que la
incubación se realizó a 37°C). Para estudiar el efecto de distintas
sales sobre la germinación del polen, soluciones concentradas de
las mismas se añadieron previamente al medio de cultivo, para dar
las concentraciones finales indicadas en la tabla 1.
Finalmente, el porcentaje de granos de polen
germinados en cada cultivo se determinó observando las muestras con
un microscopio de contraste de fases (Nikon) y se fotografiaron
utilizando un microscopio Nikon Eclipse E600, usando campo claro.
Por cada muestra se contaron, al menos 400 granos de polen. Un
grano de polen se consideró germinado cuando la longitud de su tubo
polínico alcanzó, al menos, dos veces su diámetro.
\global\parskip0.950000\baselineskip
En primer lugar, para investigar la posible
tolerancia a NaCl del polen de plantas transgénicas de tabaco que
expresa la proteína C-SRL1, se utilizaron dos líneas
independientes, SRL1 L2 y SRL1 L3. Como controles, se utilizó polen
de plantas no transformadas (wt, tipo silvestre), y de
plantas transgénicas que expresan en polen el gen GUS, que
no confiere tolerancia (línea GUS L1). En ausencia de sal, los
porcentajes de germinación fueron similares en todos los casos y
superiores al 90%. En presencia de 75 mM NaCl, la germinación del
polen de los controles (plantas wt y GUS) está totalmente inhibida,
mientras que el polen que expresa C-SRL1 muestra
una evidente tolerancia al estrés salino, con porcentajes de
germinación superiores al 60% (para la línea SRL1 L3) o de
aproximadamente el 40% (para la línea SRL1 L2) (Fig. 5).
A continuación, investigamos el efecto de otras
sales (LiCl, NaNO_{3} y LiNO_{3}) sobre la germinación del
polen, utilizando los mismos controles (plantas wt y GUS, línea L1)
y la línea SRL1 L3 incubados durante dos horas en el medio de
germinación en ausencia de sal o en presencia de diferentes
concentraciones de LiCl, NaNO_{3} o LiNO_{3}.
De nuevo, en todos los casos, los porcentajes de
germinación en ausencia de sal fueron superiores al 90%. En
presencia de LiCl (50 mM) o de NaNO_{3} o LiNO_{3} (25 mM), la
germinación del polen de los controles está inhibida prácticamente
por completo. Por el contrario, el polen de la línea transgénica
SRL1 L3 es capaz de germinar en presencia de estas sales, con
porcentajes aproximados del 30, 60 y 50%, respectivamente (tabla
1).
La figura 6 muestra fotos de los cultivos de
polen de los controles (wt y GUS, L1) y la línea SRL1 L3, en
ausencia de sal (control) o en presencia de 75 mM NaCl o 50 mM
LiCl. Puede observarse cómo los granos de polen de todas las líneas
germinaron normalmente en ausencia de sal, pero que sin embargo,
cuando tratamos con NaCl o LiCl, sólo la línea L3 que sobreexpresa
C-SRL1 (SRL1-L3) fue capaz de
desarrollar tubos polínicos.
Para investigar si la expresión de
C-SRL1 también confiere al polen de las plantas
transgénicas un aumento en su tolerancia a temperaturas elevadas, el
polen de los controles (plantas wt y GUS, línea 1) y de la línea
SRL1 L3 se incubó durante dos horas en el medio de germinación
in vitro, a 22°C y en condiciones de choque térmico (37°C).
En este caso, el tratamiento con 37°C no produjo una inhibición de
la germinación tan acusada como la que se observó en presencia de
distintas sales, puesto que aproximadamente el 50% del polen de las
líneas no transformadas y GUS fueron capaces de desarrollar el tubo
polínico. Sin embargo, el polen de la línea transgénica SRL1 L3
mostró de todas formas una tolerancia mejorada al estrés térmico,
dando porcentajes de germinación superiores al 75% en estas
condiciones (tabla 2).
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran la utilidad de los
cultivos de germinación in vitro de polen para evaluar
fenotipos de tolerancia a distintos tipos de estrés conferidos por
expresión de genes de tolerancia en polen de plantas
transgénicas.
Los resultados obtenidos son extrapolables a las
plantas completas. Así, si un gen confiere tolerancia a un estrés
determinado en los cultivos de germinación cuando se expresa en
polen, dicho gen conferirá también tolerancia a la planta completa
cuando se exprese de forma constitutiva en la misma, en todos sus
órganos y tejidos (como se demostró en el ejemplo, al comprobar que
la expresión de C-SRL1 en el polen de tabaco
le confiere tolerancia a sal, habiendo demostrado previamente que
dicho gen confiere la misma tolerancia a las plantas transgénicas
completas de Arabidopsis, cuando se expresa bajo control de
un promotor constitutivo).
Claims (8)
1. Método para evaluar la eficacia de un gen de
tolerancia a estrés abiótico caracterizado por el empleo de
un cultivo de germinación in vitro de polen maduro aislado
de una planta transformada con dicho gen, bajo control de un
promotor específico de polen, aplicación de tratamientos de estrés
abiótico al cultivo de germinación in vitro y comparación de
la tolerancia al estrés de dicho cultivo con la de un cultivo de
polen procedente de una planta control no transformada sometido a
las mismas condiciones de estrés.
2. Método según la reivindicación 1
caracterizado porque el cultivo de germinación in
vitro se obtiene por incubación del polen aislado en un medio
líquido de germinación, a una concentración comprendida entre
1x10^{5} y 2x10^{5} granos de polen por ml de medio, durante un
intervalo de tiempo comprendido entre 2 y 5 horas y a una
temperatura comprendida entre 22 y 28°C.
3. Método, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el medio líquido de germinación
comprende una mezcla de sales de potasio y magnesio, una fuente de
energía, iones calcio y ácido bórico.
4. Método según la reivindicación 3
caracterizado porque el medio líquido del cultivo de
germinación in vitro comprende sacarosa como fuente de
energía, a una concentración comprendida entre 0.15 y 0.3 M.
5. Método según la reivindicación 4
caracterizado porque el medio líquido del cultivo de
germinación in vitro comprende iones calcio en una
concentración 1,3 mM, ácido bórico en una concentración 3,2 mM y
sacarosa en una concentración 0,29 M.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque la planta
transformada es la planta del tabaco.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque la
comparación se lleva a cabo determinando las diferencias en la
inhibición de la germinación y del crecimiento del tubo polínico
entre el cultivo del polen de la planta transformada con el gen de
tolerancia a estrés abiótico y el cultivo del polen de la planta
control no transformada.
8. Empleo de un cultivo de germinación in
vitro de polen maduro aislado para evaluar la eficacia de genes
de tolerancia a estrés abiótico expresados en plantas
transgénicas.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602583A ES2302627B2 (es) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Metodo de evaluacion de la eficacia de genes de tolerancia a estres abiotico en plantas transgenicas. |
| PCT/ES2007/070166 WO2008040834A1 (es) | 2006-10-03 | 2007-10-03 | Método de evaluación de la eficacia de genes de tolerancia a estrés abiótico en plantas transgénicas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602583A ES2302627B2 (es) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Metodo de evaluacion de la eficacia de genes de tolerancia a estres abiotico en plantas transgenicas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2302627A1 true ES2302627A1 (es) | 2008-07-16 |
| ES2302627B2 ES2302627B2 (es) | 2009-07-09 |
Family
ID=39268121
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2302627B2 (es) |
| WO (1) | WO2008040834A1 (es) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| SU1692377A1 (ru) * | 1989-04-11 | 1991-11-23 | Институт экологической генетики АН МССР | Способ оценки исходного материала кукурузы на холодоустойчивость |
| WO1999003326A1 (en) * | 1997-07-15 | 1999-01-28 | United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Pollen-based transformation system using solid media |
| WO1999066034A1 (en) * | 1998-06-19 | 1999-12-23 | Advanta Technology Limited | Process for conversion of germplasm |
| US20030221212A1 (en) * | 2002-02-19 | 2003-11-27 | Tomes Dwight T. | Methods for large scale functional evaluation of nucleotide sequences in plants |
-
2006
- 2006-10-03 ES ES200602583A patent/ES2302627B2/es active Active
-
2007
- 2007-10-03 WO PCT/ES2007/070166 patent/WO2008040834A1/es active Application Filing
Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BASE DE DATOS WPI en EPOQUE, Recuperado: EPOQUE [en linea], [recuperado el 15.01.2008] & SU 1692377 A1 (INST EKOLOGICHESKOJ GENETIKI A) 23.11.1991, resumen * |
| LACOUX P. et al. "{}Activity of a flax pectin methylesterase promoter in transgenic tobacco pollen". Journal of Plant Physiology. Agosto 2003. Vol. 160, Nº. 8, páginas 977-979; ISSN 0176-1617. * |
| LACOUX P. et al. "Activity of a flax pectin methylesterase promoter in transgenic tobacco pollen". Journal of Plant Physiology. Agosto 2003. Vol. 160, Nº. 8, páginas 977-979; ISSN 0176-1617. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008040834A1 (es) | 2008-04-10 |
| ES2302627B2 (es) | 2009-07-09 |
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