ES2461896A2 - Métodos para obtener plantas resistentes a sequía - Google Patents
Métodos para obtener plantas resistentes a sequía Download PDFInfo
- Publication number
- ES2461896A2 ES2461896A2 ES201350005A ES201350005A ES2461896A2 ES 2461896 A2 ES2461896 A2 ES 2461896A2 ES 201350005 A ES201350005 A ES 201350005A ES 201350005 A ES201350005 A ES 201350005A ES 2461896 A2 ES2461896 A2 ES 2461896A2
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- trehalose
- nucleotide
- selection
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 77
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 77
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 108010087472 Trehalase Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 193
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 175
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 124
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 124
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 69
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 64
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 58
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 49
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 42
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 35
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 claims description 25
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 claims description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 18
- 102100029677 Trehalase Human genes 0.000 claims description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 17
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 15
- 230000000426 osmoregulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 12
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 claims description 11
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 11
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 claims description 11
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 claims description 11
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 9
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 6
- -1 trehazoline Natural products 0.000 claims description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 5
- 108020003272 trehalose-phosphatase Proteins 0.000 claims description 5
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- NRKVPNOUINUNKY-UHFFFAOYSA-N Trehazolin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1NC1=NC2C(CO)(O)C(O)C(O)C2O1 NRKVPNOUINUNKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 4
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 3
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000238675 Periplaneta americana Species 0.000 claims description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 3
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 claims description 2
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 claims description 2
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 claims description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000220225 Malus Species 0.000 claims description 2
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 claims description 2
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 claims description 2
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 claims description 2
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 2
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000219823 Medicago Species 0.000 claims 6
- JARYYMUOCXVXNK-UHFFFAOYSA-N Validamycin A Natural products OC1C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)CC1NC1C=C(CO)C(O)C(O)C1O JARYYMUOCXVXNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- JARYYMUOCXVXNK-CSLFJTBJSA-N validamycin A Chemical compound N([C@H]1C[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)CO)[C@H]1C=C(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JARYYMUOCXVXNK-CSLFJTBJSA-N 0.000 claims 3
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims 2
- 108010020589 trehalose-6-phosphate synthase Proteins 0.000 claims 2
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 claims 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 claims 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 claims 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 claims 1
- 235000002262 Lycopersicon Nutrition 0.000 claims 1
- 241001582367 Polia Species 0.000 claims 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 claims 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 10
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 96
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 27
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 21
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 9
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 9
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 description 9
- JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N OOOOOOO Chemical compound OOOOOOO JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 8
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 8
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 7
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 6
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 5
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 5
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 235000007241 Zea diploperennis Nutrition 0.000 description 5
- 235000017556 Zea mays subsp parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 5
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000172407 Zea mays subsp. huehuetenangensis Species 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101000855256 Homo sapiens Uncharacterized protein C16orf74 Proteins 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- DTAFLBZLAZYRDX-UHFFFAOYSA-N OOOOOO Chemical compound OOOOOO DTAFLBZLAZYRDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100026591 Uncharacterized protein C16orf74 Human genes 0.000 description 3
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 3
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 3
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 102100023927 Asparagine synthetase [glutamine-hydrolyzing] Human genes 0.000 description 2
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007132 Carboxyl and Carbamoyl Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108010072957 Carboxyl and Carbamoyl Transferases Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 2
- 244000282866 Euchlaena mexicana Species 0.000 description 2
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 2
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 2
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 2
- 230000021892 response to abiotic stimulus Effects 0.000 description 2
- 230000024428 response to biotic stimulus Effects 0.000 description 2
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 108010031403 zeaxanthin epoxidase Proteins 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108010030526 1-aminocyclopropanecarboxylate synthase Proteins 0.000 description 1
- INAPMGSXUVUWAF-UOTPTPDRSA-N 1D-myo-inositol 1-phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-UOTPTPDRSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 2-cis-abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241001539917 Actina Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000010637 Aquaporins Human genes 0.000 description 1
- 108010063290 Aquaporins Proteins 0.000 description 1
- 101000956243 Arabidopsis thaliana CSC1-like protein HYP1 Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 101100071615 Caenorhabditis elegans hsp-6 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007039 Euchlaena mexicana Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100041034 Glucosamine-6-phosphate isomerase 1 Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710201625 Leucine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000018463 Myo-Inositol-1-Phosphate Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108091000020 Myo-Inositol-1-Phosphate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 229920002593 Polyethylene Glycol 800 Polymers 0.000 description 1
- 102000011195 Profilin Human genes 0.000 description 1
- 108050001408 Profilin Proteins 0.000 description 1
- 101710199886 Protein 0.5 Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 101000611441 Solanum lycopersicum Pathogenesis-related leaf protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100021588 Sterol carrier protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101100095302 Streptococcus gordonii secA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710197404 Trehalose-phosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229930195482 Validamycin Natural products 0.000 description 1
- 235000006582 Vigna radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 241000209127 Zea perennis Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000004458 antinutrient Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003816 axenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005183 environmental health Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 108010022717 glucosamine-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000004116 glycogenolysis Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000001033 osmoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028160 response to osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000025469 response to water deprivation Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150108659 secA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014284 seed dormancy process Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 108010058363 sterol carrier proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000000892 thaumatin Substances 0.000 description 1
- 235000010436 thaumatin Nutrition 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 1
- JARYYMUOCXVXNK-IMTORBKUSA-N validamycin Chemical compound N([C@H]1C[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)CO)[C@H]1C=C(CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JARYYMUOCXVXNK-IMTORBKUSA-N 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
La presente invención provee un método no tóxico para la selección de células transformadas de entre una población que consiste de células transformadas y no transformadas. El método comprende los siguientes pasos: a) introducir a una célula al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una secuencia que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena; b) colocar la población con células transformadas y no transformadas en un medio de cultivo que contiene una sustancia osmoreguladora como el PEG 8000 y c) seleccionar las células transformadas de la población en base a la capacidad de las células transformadas de sobrevivir y desarrollarse en presencia de la sustancia osmoreguladora, confiriendo a las plantas derivadas de estos eventos de transformación genética, por ejemplo de capacidad de tolerancia a sequía y frío.
Description
Métodos para obtener plantas resistentes a sequía
Campo de la invención.
La presente Invención pertenece al área de la ingeniería genética, específicamente a los
5 procesos de transgénesis y cisgénesis de plantas y tejido de origen vegetal y más particularmente a métodos para seleccionar células vegetales genéticamente transformadas evitando utilizar como marcador de selección genes de resistencia a sustancias tóxicas, y sin necesidad de que la célula transformada produzca una proteína y/o un metabolito nuevo o diferente que tenga un efecto negativo potencial en la célula
10 vegetal, en la planta o en sus consumidores finales e intermediarios. De esta manera, en el método de la presente invención se utiliza una secuencia nucleotídica de selección que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena, confiriendo a las plantas derivadas de este método de selección la capacidad de tolerancia a la sequía.
Antecedentes de la invención.
Se sabe que cuando un material genético se introduce en una población celular por medio de transformación, solamente cierto número de células será transformado exitosamente. Después de la transformación, las células transformadas deben de ser identificadas y 20 seleccionadas de entre una población de células transformadas y no transformadas. La identificación y separación de las células transformadas se ha llevado a cabo tradicionalmente utilizando métodos de "selección negativa", donde las células transformadas son capaces de sobrevivir y crecer, mientras que las células no transformadas son sujetas a una inhibición del crecimiento o a su eliminación por una
25 sustancia a la cual, las células transformadas, en virtud de su transformación, son capaces de tolerar. Generalmente para este propósito se introduce también a la célula un gen de selección, además del transgen de interés. Este gen de selección típicamente provee resistencia a un antibiótico o a un herbicida, con la que las células genéticamente transformadas pueden ser identificadas. Después de la
30 transformación, la población de células transformadas y no transformadas se cultivan entonces en un medio de cultivo que contiene el antibiótico o herbicida al cual las células transformadas son resistentes, en virtud del gen de selección, permitiendo así que las
células no transformadas que no contienen el gen de resistencia al antibiótico o herbicida, queden sujetas a la inhibición del crecimiento, y solamente las células transformadas son capaces de sobrevivir y crecer debido a la presencia del gen de selección introducido. Entre estos ejemplos podemos citar las patentes US6174724 y EP0131623 que utilizan
5 como marcador de selección el gen que codifica para la enzima neomicina fosfotransferasa tipo 11 (nptll), la cual confiere resistencia a ciertos antibióticos de la familia de los aminoglicosidos (kanamicina, neomicina, G418, paromomicina), así como la patente US4727028 que utiliza el gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt) para dar resistencia al antibiótico higromicina.
lO A pesar de su efectividad observada, los métodos de selección negativa tienen ciertas desventajas. Por ejemplo, las células no transformadas mueren debido a la presencia de antibióticos o herbicidas en el medio de crecimiento, y como resultado existe el riesgo de que no solamente las células no transformadas sino también las células transformadas puedan morir, debido a que las células no transformadas dañadas o en proceso de
15 eliminación pueden excretar compuestos tóxicos. Otra desventaja de gran importancia es que generalmente el uso de tales genes de selección que proveen la resistencia a un compuesto tóxico no es recomendable, desde el punto de vista ambientalista y de seguridad alimentaria, para los cultivos transgénicos y cisgénicos que son introducidos y liberados a gran escala en el medio ambiente,
20 particularmente los cultivos alimenticios. Una desventaja adicional de la selección negativa es que las células o tejidos vegetales tratados con sustancias tóxicas se vuelven más susceptibles a la infección bacterial. Esto representa un problema cuando se utiliza Agrobacterium como vector de transformación, debido a que los tejidos o células algunas veces pueden tener sobre-crecimiento de la
25 bacteria a pesar de que se utilizan antibióticos para prevenir el crecimiento. Dentro de los métodos de selección positiva podemos citar las patentes US6444878 y US5767378 que emplean genes para el metabolismo de compuestos que resultan tóxicos para la célula. La primera patente describe el uso de una secuencia nucleotídica que codifica para la actividad glucosamina-6-fosfato desaminasa, como gen de resistencia de
30 células genéticamente transformadas que crecen en un medio de cultivo que contiene el metabolito tóxico glucosamina o uno de sus derivados. La segunda patente describe el uso de un grupo de genes que codifican fosfomanoisomerasas, fosfomanomutasas, manosaepimerasas, etc., involucrados en el metabolismo de la manosa, o de sus derivados o precursores; así como la adición de alguno de dichos compuestos tóxicos en el medio de cultivo de selección. En ambos casos, al igual que en el uso de genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, se lleva a que la célula genéticamente transformada produzca una proteína extraña que además de que puede resultar ser un alergeno implica un gasto metabólico para el organismo transformado que ya ha sido seleccionado y no requiere más de este producto. Recientemente, en la patente US7449290 se describe un método de selección de células transformadas genéticamente donde se utiliza como marcador de selección una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína que tiene actividad de trehalasa, la cual cataliza la azúcar trehalosa o de sus derivados metilados o halogenados. En este método se sobreexpresa la enzima trehalasa para permitir a la célula genéticamente transformada sobrevivir a concentraciones tóxicas del metabolito agregado al medio de selección. Al igual que en los casos anteriores, el organismo genéticamente modificado presenta una sobreproducción de una proteína que le es innecesaria después del proceso de selección, e implica también la adición de un compuesto extra al medio de cultivo de selección. Las desventajas mencionadas anteriormente pueden superarse, al menos de manera substancial, mediante una selección positiva con el método de acuerdo a la presente invención, la cual hace posible identificar y aislar células transformadas genéticamente sin eliminar por intoxicación a las células no transformadas de la población y sin la cointroducción de genes de resistencia a antibióticos, herbicidas y otros compuestos, además de suprimir la necesidad de agregar al medio de cultivo un compuesto extra. El método de acuerdo a la presente invención evita también la producción extra de una proteína o polipéptido, que al final del proceso de selección le resulta innecesaria. En las patentes US7214858 y US7560613 se describen fragmentos de ácidos nucleicos que codifican enzimas que intervienen en el metabolismo de la trehalosa en las plantas y semillas con el fin de obtener plantas modificadas genéticamente. Se propone el uso de secuencias de genes como: trehalasa, trehalosa fosfato sintetasa y trehalosa 6-fosfatofosfatasa. En dichos documentos solo se presentan evidencias experimentales en plantas transgénicas que expresan trehalosa 6-fosfato-fosfatasa, sin presentarse evidencias experimentales para el caso del gen que codifica para la trehalasa. A pesar de ello, Perry y colaboradores realizan análisis de alineamientos de secuencias de la enzima trehalasa de G/yeine max, Neurospora erassa, maíz y soya y es a partir de estos estudios computacionales donde proponen el uso del gen de la trehalasa para producir plantas modificadas genéticamente donde el metabolismo de la trehalosa puede ser alterado en las plantas, pero sin sugerir siquiera su uso como un método de selección. Por lo anterior, es necesario proporcionar métodos eficientes que permitan obtener células transformadas genéticamente sin la introducción de genes extraños, evitando con ello la producción innecesaria de proteínas y/o péptidos ajenos a dichas células y que le resultan innecesarias.
Breve descripción de las figuras.
- Figura 1.
- Se observa un mapa de la unidad de expresión génica para transformar
- maíz.
- Figura 2.
- Se observa la estrategia para generar plantas transgénicas de maíz
- tolerantes a PEG 8000 mediante el uso de callos embriogénicos y
- biobalística.
- Figura 3.
- Se observa la selección de semillas tolerantes a PEG 8000 simulador de
- sequía en la T1 y comprobación de la inserción molecular de la unidad
- funcional correspondiente al 35S NPTII. Carril 1 y 2 corresponden a plantas
- de papaya transformadas con el mismo vector, en donde se aprecia la señal
- de 1.8 Kb esperada; carril 3 control negativo de maíz; carril 4 línea de maíz
- T4; carril 5 línea T7; carril 6 línea T12; carril 7 línea T1 ; carril 8 línea 6; carril 9
- DNA de la línea T4 sin digerir.
- Figura 4.
- Se observa la amplificación del cisgen y un segmento del promotor utilizando
- 0ligonucle6tidos específicos, a partir de ONA total de plantas Bt7 GM Y
- control. Se muestra una amplificación representativa, sin embargo, todas las
- semillas que germinaron bajo estrés, dieron señal positiva al PCR.
- Figura 5.
- Se observa la cuantificación por RT -PCR en tiempo real de la acumulación
- del mRNA del gen que codifica para la trehalasa WT, silvestre; T1 y T4, GMs;
- H20, irrigada; SEQ, sequía.
- Figura 6.
- Se observan plántulas crecidas en macetas y tubos para observar un posible
- efecto del contenedor.
- Figura 7.
- Se observan plantas dos meses después de germinadas, en tubos PVC
- diseñados para aplicar sequía a maiz y permitir mediciones fisiológicas y de
- suelo.
- Figura 8.
- Se observan las diferencias de crecimiento entre las variedades de plantas.
- Las plantas 873 GM tienen mayor talla cuando se comparan con la planta
- 873 control (panel izquierdo). Se observa una comparación de la talla,
- nótese que la hoja puede ser más ondulada o exuberante, manteniendo así
- mayor superficie fotosintética (panel derecho).
- Figura 9.
- Se observa la floración masculina en la línea 873 T1 Y T4 GM.
- Figura 10.
- Se observa la apariencia de las mazorcas en ambas plantas GM, teniendo
- cada planta de 3 a 5 mazorcas. El fenotipo es sustancialmente idéntico al de
- las plantas control.
- Figura 11.
- Se observa la medición de crecimiento de la talla desde la siembra en
- cilindro hasta senescencia. Se indica el inicio de la sequía, que duró dos
- semanas para las líneas GM. Los criollos debieron regarse a la semana, por
- los sintomas desarrollados en esta aplicación de sequía severa.
- Figura 12.
- Se observan comparaciónes fisiologicas entre las variedades de plantas.
- Figura 13.
- Se observa el fenotipo de plantas bajo tratamiento de sequía. Cada panel
- muestra a la planta sometida a sequía hacia la izquierda, mientras que a la
- derecha se encuentra la planta control crecida bajo irrigación. Los paneles
- superiores muestran a los criollos, donde las plantas con sequía perdieron
- turgor y talla. En los paneles inferiores se muestra en medio a la planta
- control, con una diferencia significativa de talla. Cabe señalar a la planta GM
- T1 , (extrema izquierda) la cual no mostró una reducción estadísticamente
- significativa respecto de su control bajo irrigación.
- Figura 14.
- Se observa la comparación de la medición de fotosintesis en condiciones de
- humedad y sequía en 873. Tiempo de las mediciones: Día 1: Irrigación
- normal. Día 6: cinco días después del inicio de sequía. Día 13: trece días
- después del inicio de sequía y se suspende la sequía. Día 22: diez días
- después de suspendida la sequía.
- Figura 15.
- Se observa la comparación de la medición de conductancia de agua en
- condiciones de humedad y sequía en 873.
- Figura 16.
- Se observa la comparación de la medición de contenido de agua en
- condiciones de humedad y sequía en B73.
- Figura 17.
- Se observa la comparación de la medición del porcentaje de humedad
- relativa en condiciones de humedad y sequía en B73 tanto en la planta como
- en el suelo.
- Figura 18.
- Se observa la comparación de la medición de contenido de CO2 en
- condiciones de humedad y sequía en B73.
- Figura 19.
- Se observa la comparación de la medición de transpiración en condiciones
- de humedad y sequía en B73.
- Figura 20.
- Se observan los espectros de HPLC de los picos obtenidos de trehalosa en
- las muestras analizadas: (A) B73 control-1, (B) B73 control-2, (C) B73
- control-3, (O) B73 T1-1 , (E) B73 T1-2, (F) B73 T1-3, (G) B73 T 4-1 , (H) B73
- T4-2, (1) B73 T4.
- Figura 21.
- Se observa una gráfica de los porcentajes de trehalosa presentes en las
- muestras vegetales analizadas por HPLC, observándose un aumento en las
- plantas genéticamente modificadas conforme a la invención respecto a lo
- detectado en las muestras de B73 control.
- Figura 22.
- Se observan los niveles de producción de glucosa a partir de hidrólisis de
- trehalosa en un tiempo de incubación de 3 horas.
- Figura 23.
- Se observa el perfil electroforético de LO-PCR (1 % agarosa; 80 volts; 7 JlL de
- muestra) amplificado sin marcaje (sin a32P-dCTP) con el fin de conocer si se
- lograba la amplificación a partir de los cONA con los que se contaba. 1:
- Control negativo NTC (sin ONA); 2: B73 T4 en humedad.
- Figura 24.
- Se observan las senales obtenidas de hibridación de las membranas de
- nylon que contienen los plásmidos con las sondas marcadas
- radioactivamente de B73 control y plantas genéticamente modificadas (T1 y
- T4). (1 ) B73 control en humedad, (2) B73 control en sequía, (3) B73 T1 en
- sequía, (4) B73 T1 en humedad, (5) B74 T4 en humedad y (6) B73 T4 en
- sequía. Los plásmidos fueron colocados por duplicado en renglones y
- columnas. Las letras A, B, C, O y E muestran las columnas con los
- duplicados, mientras que los números 1 al 12 muestran los renglones o
líneas horizontales donde se colocaron por duplicado los genes inducidos por
sequía.
Figura 25. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes involucrados en la respuesta a estrés abiótico detectados en plantas 873 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.
Figura 26. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes involucrados en la fotosíntesis detectados en plantas 873 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.
Figura 27. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes involucrados en la respuesta a estrés biótico detectados en plantas 873 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.
Figura 28. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes asociados al metabolismo de carbohidratos detectados en plantas 873 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.
Figura 29. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes clasificados como desconocidos y/o proteínas hipotéticas, detectados en plantas 873 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.
Descripción detallada de la invención.
La presente invención describe un método para seleccionar células genéticamente transformadas en las que se ha incorporado una secuencia nucleotídica de interés que le da a las células transformadas una ventaja selectiva. La ventaja selectiva que poseen las células transformadas puede deberse a su mejor capacidad, en relación con las células no transformadas, para sobrevivir y desarrollarse en un medio con baja disponibilidad de agua para las células. Uno de los objetivos de la presente invención es proveer un método de selección eficiente de transformantes, por ejemplo plantas, donde se eliminan las desventajas mencionadas anteriormente para los métodos que utilizan genes marcadores de selección. Para alcanzar dicho objetivo la presente invención provee un método para identificar y/o seleccionar células que tienen una ventaja metabólica como resultado de haber sido transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas, que son cultivadas sobre o dentro de un medio de cultivo que contiene un agente
osmoregulador, como por ejemplo polietilenglicol 8000 (PEG8000), manitol, sorbitol, NaCI
o cualquier otro agente osmoregulador, donde el método comprende: a) introducir a una célula al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener una célula genéticamente transformada, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena, b) colocar la población de células transformadas y no transformadas en contacto con un medio de cultivo que comprende una concentración de un agente osmoregulador seleccionado del grupo que comprende polietilenglicol 8000 (PEG8000), manitol, sorbitol, NaCI o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración del 4% y c) seleccionar las células transformadas de la población en base a la capacidad de las células transformadas de sobrevivir y desarrollarse en presencia del agente osmoregulador. Las células que tienen dicha ventaja metabólica son capaces de crecer en presencia del agente osmoregulador simulando estrés hídrico (sequía), mientras que se inhibe el crecimiento de las células no transformadas. El polietilenglicol (PEG) es un polímero producido en un rango de pesos moleculares. En 1961 , Lagerwerff publicó que el PEG puede ser utilizado para modificar el potencial osmótico de una solución nutritiva en cultivo y de esa manera inducir un déficit de agua en las plantas en una manera relativamente controlada y apropiada para protocolos experimentales de sequía. Las células, en particular las células vegetales, no pueden desarrollarse normalmente en un medio de cultivo en el cual está presente una concentración relativamente alta de PEG 8000 (4%) o mayor debido a que se les impide la captura de agua y nutrientes ocasionando la muerte celular. El método de acuerdo a la invención, se utiliza para seleccionar células transformadas. Para este propósito, las células son transformadas con la secuencia nucleotídica que comprende una secuencia que codifica para un producto que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena. La población de células transformadas y no transformadas se coloca entonces en contacto con un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador, como por ejemplo PEG 8000. Las células transformadas pueden distinguirse entonces de las células no transformadas por la presencia en su genoma de una secuencia nucleotídica de selección que codifica para un producto que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena, lo cual le permite sobrevivir y desarrollarse en un medio con un agente osmoregulador como el PEG 8000.
Una secuencia nucleotídica que promueve la inhibición de la función de la enzima trehalasa endógena puede ser una secuencia que codifique para una proteína que tenga un efecto inhibitorio sobre la actividad enzimática de la trehalasa, como por ejemplo, secuencias que codifican para la proteína de 85kD de la cucaracha (Periplaneta americana), o las proteínas involucradas en la síntesis de validamicina, trehazolina, trehalostatina, casteligina, suidatestrina, etc., así como de sus formas modificadas activas. Otra alternativa para alterar la enzima trehalasa endógena en la planta es el empleo de RNA antisentido. Esta estrategia consiste en introducir en las células de planta una construcción genética que produzca un RNA que sea lo suficientemente complementario al RNA endógeno que codifica para la enzima trehalasa, de modo que interactúe con el transcrito endógeno de la propia planta, impidiendo que el mRNA se traduzca en los ribosomas y degradando el RNA por silenciamiento génico post-transcripcional, inhibiendo por lo tanto la traducción de dicho transcrito. Esto se conoce como silenciamiento de genes, ya sea mediante la tecnología del antisentido o de RNA de interferencia (RNAi), los cuales a la fecha son ampliamente conocidos. De este modo, la secuencia nucleotídica que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena puede ser de preferencia una secuencia nucleotídica capaz de transcribirse que produce un RNA cuya secuencia es idéntica o al menos parcialmente complementaria a la del RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena. Dicha secuencia nucleotídica capaz de transcribirse le confiere a la célula una ventaja competitiva en el medio de cultivo con un agente osmoregulador como por ejemplo PEG 8000. La secuencia nucleotfdica capaz de transcribirse puede también ser una secuencia nucleotídica que produce un RNA idéntico al RNA producido por una secuencia nucleotídica que codifica para la trehalasa endógena. De acuerdo con la presente invención, la inhibición de la enzima trehalasa se obtiene transformando una planta con el antisentido del gen de la trehalasa de una secuencia que sea parcial o completamente homóloga al gen endógeno de la trehalasa que se desea silenciar. De este modo, el antisentido o el RNA de interferencia de la secuencia génica de trehalasa que se utilice para la transformación de la célula, la población de células, el tejido o la planta, será parcial o completamente homólogo a su gen o a su RNA mensajero endógeno o a la secuencia de trehalasa descrita en la secuencia de trehalasa de alfalfa, identificada como secuencia del gen MSTRE, así como la secuencia de trehalasa de maíz,
identificada como ZmTRE. Por lo que en la presente invención se describe que la secuencia del gen MSTRE de la trehalasa de alfalfa (Medicago sativa), más específicamente del gen MSTRE1 de la trehalasa de alfalfa, puede utilizarse para inhibir la expresión de la trehalasa en maíz, debido a que la secuencia de alfalfa es homóloga a otras secuencias de trehalasa de origen vegetal. De la misma manera, la secuencia de maíz tiene homología con trehalasa de otras plantas para ser utilizada en eventos de silenciamiento del gen que codifica para la trehalasa. Se vislumbra así que la secuencia de alfalfa o maíz pueden utilizarse en otras especies, considerando el hecho de que no se requiere un 100% de homología para silenciar el gen. Además, es suficiente expresar solo parte del gen homólogo en orientación antisentido o en un RNA de interferencia con el fin de lograr una inhibición efectiva de la expresión de la trehalasa endógena. El cDNA aislado que codifica para la enzima que degrada trehalosa o parte de éste, así como secuencias nucleotídicas que transcriben RNA antisentido o RNA de interferencia, se fusionan subsecuentemente a una secuencia promotora de modo tal que la transcripción resulte en la síntesis de un RNA mensajero (RNAm) antisentido o un RNA de interferencia (RNAi). Se entiende como RNA de interferencia (RNAi) a las moléculas de RNA involucradas en el silenciamiento postranscripcional de un gen mediante este mecanismo a saber, RNAs orquilla (hairpin RNA, por sus siglas en inglés: hpRNA), RNAs pequeños (small RNAs, por sus siglas en inglés: sRNA) y microRNAs (miRNA). Las técnicas de transformación de células vegetales empleadas para llevar a cabo la presente invención, son conocidas por cualquier experto en la materia y pueden ser consultadas en cualquier bibliografía relacionada al tema. El método para introducir a la planta la secuencia expresable que codifica para un inhibidor de la enzima trehalasa no es crucial para la presente invención, siempre que el gen se exprese en la célula vegetal, ya sea en una célula de planta mono o dicotiledónea. Los procesos para introducir dos o más genes en la misma planta pueden alcanzarse con alguno de los siguientes métodos ya conocidos en el estado de la técnica, que comprenden por ejemplo:
- (a)
- transformando la planta con una construcción multicopia que contenga más de un gen a ser introducido,
- (b)
- co-transformando la planta con diferentes construcciones simultáneamente,
- (c)
- mediante rondas subsecuentes de transformación de la misma planta con los genes a ser introducidos,
- (d)
- cruzando dos plantas, donde cada una de las cuales lleva un gen diferente para ser introducido en la misma planta, o
- (e)
- combinaciones de los métodos anteriores. El término "célula" dentro del contexto de la invención incluye también protoplastos, y el término "población de células" incluye también tejidos, órganos o porciones de ellos, una población de células individuales en o dentro de un sustrato, o un organismo completo, por ejemplo, una planta. El término "población de células" se entiende de acuerdo a la invención como una población de células individuales, así como también a células en tejidos, órganos o partes de ellos; o células en organismos completos, como por ejemplo plantas, donde la planta completa o partes de ella pueden consistir de células genéticamente transformadas. El término "planta" se refiere a un organismo multicelular diferenciado capaz de llevar a cabo fotosíntesis, tales como las angiospermas y las algas. El término "célula vegetal" incluye cualquier célula derivada de una planta e incluye tejido indiferenciado, tal como callo o tumor de corona, también como semillas de plantas, propágulos, polen y embriones vegetales. La presente invención también incluye a las células transformadas que han sido seleccionadas utilizando el método de acuerdo a esta invención, en particular células vegetales, y a las plantas regeneradas de ellas, así como sus semillas y su progenie. El método de acuerdo a la invención es usado preferiblemente para seleccionar células vegetales modificadas genéticamente. Ejemplos de plantas para las cuales puede utilizarse el método de acuerdo a la invención incluyen: cultivos frutales tales como tomate (Lyeopersieum eseu/entum L.), mango, durazno, manzana, pera, banana, melón, etc.; cultivos de campo tales como girasol, tabaco, caña de azúcar (Saeeharum offieinarum L.), etc.; cereales de grano pequeño tales como trigo (Tritrieum aestivum L.), soya (G/yeine max L.), cebada, maíz (Zea mays L.), algodón, etc.; vegetales tales como papa (So/anum tuberosum L.), zanahoria, lechuga, calabaza, cebolla etc., plantas leguminosas tales como
frijol, lenteja, haba, así como aquellas plantas que necesiten mejorar su tolerancia a sequía y/ó frío. A través del método de la presente invención, las células transformadas podrán ser capaces de sobrevivir y crecer en condiciones de sequía y/ó frío, a la cual una célula vegetal es incapaz de sobrevivir y desarrollarse. De este modo las células transformadas conforme a la presente invención pueden ser así seleccionadas de entre la población total en base a su capacidad para sobrevivir y desarrollarse. Ya que las plantas genéticamente modificadas son capaces de inhibir en algún nivel a la enzima trehalasa debido a la introducción de la secuencia nucleotídica de selección, la célula obtenida es capaz de modificar su flujo de glucosa y sobrevivir en un medio que carece de una concentración óptima de carbono disponible para la célula. Las plantas genéticamente modificadas podrán por lo tanto desarrollarse mientras que el desarrollo de
las plantas no transformadas se inhibe. Cuando el método de acuerdo a la invención es utilizado para la selección genética de células en plantas, las plantas transformadas pueden ser identificadas visualmente. Por lo tanto, el método de acuerdo a la invención provee un sistema de selección sencillo y ambientalmente amigable de células transformadas, particularmente para las células genéticamente transformadas. La capacidad de las células transformadas de sobrevivir y desarrollarse en un medio con baja disponibilidad de agua anula la necesidad de agregar al medio un compuesto marcador de selección, como antibióticos y herbicidas. De acuerdo a la invención, puede utilizarse como secuencia nucleotídica de selección en las células transformadas genéticamente, cualquier secuencia nucleotídica que codifique para un producto que promueva la inhibición de la enzima trehalasa. Aunque pueden utilizarse secuencias nucleotídicas exógenas, como las pertenecientes a bacterias, levaduras o insectos, también pueden utilizarse secuencias nucleotídicas endógenas; teniendo la ventaja de no estar introduciendo material de otra especie. Presenta una mayor ventaja el hecho de que la secuencia nucleotídica de selección codifique para un RNA homólogo o complementario a la secuencia de trehalasa endógena, debido a que su expresión provocará un mecanismo de silenciamiento postranscripcional del gen ya sea por RNA antisentido, por RNA de interferencia o por cosupresión, el cual al impedir la traducción del RNA mensajero, ya sea el endógeno ó el del transgen, impedirá la producción de una proteína adicional en la planta. A estas ventajas puede añadirse el uso conveniente de promotores inducibles o regulables para limitar el proceso de transcripción de la secuencia de selección al momento en que es requerido para seleccionar las células, cuando éstas se encuentran en cultivo después de habérseles introducido la o las secuencias nucleotídicas de interés junto a la secuencia de selección. Con lo anterior se pueden crear plantas genéticamente modificadas a las que para los fines de la presente invención, denominaremos "cisgénicas", cuando las secuencias de nucleótidos provengan de la misma especie. Para esta invención, la secuencia en antisentido para la enzima trehalasa para el maíz provendrá de esta misma especie. El transgen o cisgen deseado y la secuencia nucleotídica de selección pueden introducirse a la célula por transformación mediante técnicas estándar conocidas de biologra molecular. Aunque no es esencial, el transgen y el gen de selección pueden estar unidos uno al otro, de modo que la presencia del gen de selección signifique que el transgen también está presente. Opcionalmente, el transgen y el gen de selección pueden formar parte de la misma construcción genética y ser introducidas a la célula mediante el mismo vector. Oado que es necesario que las secuencias nucleotídicas introducidas sean expresadas en la célula transformada, una construcción genética que contenga las dos secuencias nucleotídicas contendrá típicamente secuencias regulatorias que posibiliten la expresión de las mismas, por ejemplo, promotores conocidos y terminadores de transcripción. Así la secuencia nucleotídica co-introducida estará típicamente asociada con un promotor, el cual pude ser constitutivo o regulable. Muchas células, en particular las células de las plantas superiores como G/yeine max y Arabidopsis thaliana, tienen en su genoma genes codificantes para la trehalasa endógena. En una modalidad deseable del método de acuerdo a la invención, la secuencia nucleotídica de selección comprende el ONA complementario (cONA) de la enzima MSTRE de trehalasa de alfalfa (Medieago sativa), o una porción de éste, así como el gen ZmTRE de maíz o una porción de éste.
En otra modalidad adecuada de la invención la secuencia nucleotídica de selección comprende una secuencia complementaria al cONA de la enzima MSTRE de trehalasa de alfalfa (Medieago sativa) o una porción de éste, así como el gen ZmTRE de maíz o una porción de éste.
En una modalidad adicional más del método de la invención, las células transformadas pueden ser seleccionadas utilizando una combinación de selección positiva y selección negativa. Para ello la secuencia nucleotídica de interés es co-introducida en las células transformadas con una secuencia nucleotídica, adicional a la secuencia de selección, que codifica para la resistencia a al menos un miembro seleccionado de un grupo que comprende toxinas, antibióticos y herbicidas, y el medio en o sobre el que las células son cultivadas comprende al menos un miembro seleccionado de un grupo que comprende toxinas, antibióticos y herbicidas a los cuales las células transformadas tienen existencia. Aunque por razones técnicas, las unidades de expresión; es decir, el promotor más el gen MSTRE o el promotor más el gen ZmTRE, deben propagarse en un vector bacteriano, por ejemplo en Escherichia coli, la unidad de expresión se aísla del vector a través de obtenerla por PCR o por digestión con enzimas de restricción en sus extremos. Una vez obtenida la unidad de expresión o DNA conteniendo el promotor y gen trehalasa en antisentido, éste se emplea en la transformación genética. De esta manera, las plantas generadas carecen de secuencias no deseables presentes en el vector bacteriano, tales como resistencia a antibióticos, origen de replicación, etc. La presente invención se ilustra en los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden limitar el alcance de la invención, por lo que especialistas en el campo técnico podrán apreciar ciertas modificaciones que se puedan aplicar a la invención sin modificar su alcance y espíritu original.
Ejemplo 1. Materiales y métodos.
a) Manipulación de ácidos nucleicos.
DNA Los procedimientos de aislamiento, restricción, ligación y transformación de DNA plasmídico bacteriano se llevaron a cabo de acuerdo a protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). Para la ligación de productos de PCR en el vector TOPO pCR2.1 MR (Invitrogen, Inc.) se llevaron a cabo las recomendaciones del fabricante. La secuenciación de los fragmentos obtenidos por RT-PCR, 3'RACE y GeneRacerMR, se realizó a partir de una preparación a pequeña escala.
Para la clonación de la secuencia promotora rd29A de Arabidopsis thaliana se llevó a cabo una extracción fenol:cloroformo de ONA genómico a partir de plantas de Arabidopsis de 10 días de germinación en medio MS agar 0.7%.
Para la clonación del cONA del gen de la trehalasa de alfalfa, se procedió a una extracción de RNA total de tejido de plántulas de alfalfa (M. sativa cv. CUF-101) de 7 días de germinadas in vitro en medio MS agar 0.8%, utilizando el reactivo TRI ReagentMR (Molecular Research Center, Inc.), según las indicaciones del fabricante. La síntesis de cONA de maíz se realizó a través de PCR ensamblado con oligonucleótidos
10 complementarios largos. Primers. Los primers utilizados fueron los siguientes:
SEQ. ID. Nombre Secuencia (5'-3') No.
Frd29Hind AAGCTTGGAGGAGCCATAGATGCA 1 Rrd29Xba 2 (SIGMA, Ine.) 3 Tre300 TATTAYTGGGATTCYTATTGG, donde Y es T ó A 4.
CTGTTASTRTATRAWGCTCT, donde S es C ó G, Res T, A ó C y W es G, Tre351 5
CóA 3Tre300 ACCAATCTCATTTCATTGAT 6 5T18HXS GTCGACTCTAGAAGC[T]18 7 3Tre320 CGGGTTTGTGCTTAATGGTG 8 Gene CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA
9 RNAOligo: Gene GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18 10 Oligo dT: CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 11 5Tre350 AAACCCGTATTCCTCAATCA 12 Tre333 TATTACTGGGATTCTTATTGGG TreNsiRw TTGATTTAAATGCATTTCTACCCGGG 14 GUSSmaR CCCGGGTTGTTTGCCTCCCTGCTGCG 15 GUSNsiF ATGCATGATATCTACCCGCTTCGCGT 16
b) Material biológico.
Plásmidos. Para la ligación de productos de PCR se utilizaron los vectores pGEM-T Easy VectorMR (Promega, Inc.) y TOPO TA pCR2.1 MR (Invitrogen, Inc.). Para la construcción de los vectores de expresión en plantas se utilizó el vector pBI-121 MR (Clontech, Inc.).
bacterianas. Los plásmidos obtenidos de la ligación de fragmentos, se introdujeron
por choque térmico a células calcio competentes de E. coli de las cepas DH5a., JM109, o de la cepa comercial One Shoot MR TOP 10F' (Invitrogen, Inc.).
Material Para la extracción de RNA de alfalfa, se germinaron semillas de alfalfa variedad CUF-101, en medio MS agar 0.7%. Para la extracción de DNA de Arabidopsis se germinaron semillas de Arabidopsis, en medio MS agar 0.7%. Para el bombardeo de tabaco se utilizaron explantes de hoja de tabaco Nicotiana tabacum L. cv Xhanti, creciendo de manera axénica en medio MS agar 0.7% suplementado con sacarosa al 2%. Los cultivos se mantuvieron bajo ciclos de 16 hrs. luz/8 hrs. oscuridad a 26°C, y se subcultivaron después de 30-40 días en medio fresco.
Ejemplo 2. Clonación del cDNA del gen MsTRE de alfalfa.
Debido a que no se encuentra reportada la secuencia que codifica para la trehalasa de alfalfa, la cual denominamos MsTRE1 (Ms: Medicago sativa; TRE: trehalasa), y con el fin de obtener el fragmento a utilizar en las construcciones para inhibir dicha enzima, se procedió a obtener la secuencia completa de su cDNA. Para ello se utilizaron protocolos basados en la amplificación de transcritos de este gen (RT) y su posterior amplificación por PCR (RT -PCR).
a) Amplificación de un fragmento interno mediante transcripción reversa RT y PCR (RTPCR).
Para la amplificación de fragmentos internos del cDNA se llevaron a cabo ensayos simples de RT-PCR, utilizando los oligonucleótidos degenerados Tre300 y Tre351 que fueron diseñados en base a una región conservada entre las secuencias codificantes reportadas en el banco de datos (Entrez, NCBI) para la enzima trehalasa de Arabidopsis (Arabidopsis tha/iana; acceso AAF22127), papa (So/anum tuberosum; acceso A67882) y soya (G/ycine max; acceso AA022970). El alineamiento de las secuencias se hizo utilizando el método Clustal (SoftWare ONA Star). Para la reacción de transcripción reversa (RT) se utilizó el sistema Enhanced Avian HS RT-PCR (SIGMA, Inc.) y se requirió de 1g de RNA total de alfalfa de buena calidad, el cual se incubó a 70°C por 10 min con 1 L de Anchored Oligo (dTh3 MR (O.Sg/L) y 1 L de una mezcla de dNTPs (dideoxinucleótidos) (10 mM c/u), en un volumen final de 1 O L con agua bidestilada estéril, según las instrucciones del fabricante. La mezcla se colocó de inmediato en hielo después de la incubación en calor, y se le agregaron 6 L de agua grado reactivo PCR, 2 L de Buffer para AMV-RT 10X, 1 L de inhibidor de RNasa (20U/L) y 1 L de enzima RT Enhanced AMV (20U/L), en un volumen final de 20 L. Esta mezcla se incubó a 42°C por 60 min, para permitir la síntesis de la primera cadena de O NA. Para la amplificación por PCR se utilizaron 3 L de la primera cadena sintetizada por RT, 1 L de ONA Polimerasa JumpStart AccuTaqMR (2.SU/L), 5 L de Buffer AccuTaqMR 10X,
L de mezcla de dideoxinucleótidos (10 mM c/u), 2 L del oligonucleótido sentido degenerado Tre300 (100 ng/L) y 2 L del oligonucleótido reversa degenerado Tre3S1 (100 ng/L), en un volumen final de 50 L con agua grado reactivo PCR. Con esta mezcla de reacción se realizó la polimerización en cadena, para amplificar un fragmento interno del cONA de la trehalasa. El fragmento obtenido por PCR se clonó en el vector pGEM-T Easy VectorMR, el cual se introdujo posteriormente por choque térmico de 45 seg a 42°C a bacterias OHSa calciocompetentes. Las bacterias transformadas se caracterizaron por digestión enzimática EcoRI de su ONA plasmídico y se seleccionaron aquellas que liberaran el fragmento amplificado. La secuenciación de este fragmento nos proporcionó la secuencia nucleotídica sobre la cual se diseñaron los oligonucleótidos utilizados en los protocolos siguientes para la clonación de los extremos 5' y 3' del cONA de la trehalasa de alfalfa.
b) Amplificación del extremo 3' mediante el protocolo de 3'RACE.
Para el protocolo de 3'RACE se utilizó la primera cadena de ONA sintetizada inicialmente por transcripción reversa. Con este cONA se procedió a una primera amplificación por PCR, utilizando los oligonucleótidos específicos 3Tre300 y ST18HXS los cuales se diseñaron a partir de la secuencia obtenida para el fragmento interno. A esta amplificación siguió un PCR semianidado, utilizando los oligonucleótidos ST18HXS y 3Tre320 siendo éste último diseñado a partir de una posición más interna de la secuencia obtenida para el fragmento interno. La secuencia amplificada se clonó en un vector TOPO T A pCR2.1 MR (Invitrogen, Inc.), originando el plásmido TOPO-3Tre, el cual fue purificado para su caracterización enzimática Eco RI y su posterior secuenciación y manipulación. Debido a que en esta región se encuentran la mayoría de las regiones conservadas entre las secuencias de trehalasa de origen vegetal, este fragmento es suficiente para diseñar los vectores para inhibir la enzima trehalasa endógena.
c) Amplificación del extremo 5' por GeneRacer.
Para la obtención del extremo S' del cONA de la trehalasa de alfalfa se utilizó el sistema GeneRacerMR. En este protocolo se partió de 3\-1g del RNA total manejado con anterioridad, siguiendo las indicaciones del fabricante para la desfosforilación del RNA, la remoción de la estructura CAP y su subsiguiente ligación al oligo de RNA proporcionado. A partir de este RNA mensajero modificado, se procedió a la síntesis de la cadena complementaria (cONA) utilizando el sistema AMV-RTMR (SIGMA, Inc.). La cadena complementaria obtenida se utilizó posteriormente como templado en la amplificación por PCR utilizando el oligonucleótido GeneRacerS,MR y el oligonucleótido reverso STre3S0, diseñado a partir de la secuencia del fragmento interno obtenido por RT-PCR. La secuencia amplificada se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 MR, dando lugar al plásmido TOPO-STre, el cual fue purificado para su caracterización enzimática con la endonucleasa Eco RI y para su posterior secuenciación. A partir del alineamiento de los tres fragmentos obtenidos mediante esta estrategia, se obtuvo la secuencia completa del cONA de la trehalasa de alfalfa (MsTRE1).
Ejemplo 3. Diseño de las secuencias TRE antisentido (TREas) y RNA de interferencia (TRE-RNAi).
a) Amplificación y clonación del fragmento interno TRE con mayor homologfa entre especies.
Para expresar en plantas una secuencia de trehalasa en antisentido bajo los promotores 35S y rd29A, se seleccionó primeramente un fragmento (SEQ. ID. No. 18) que comprende un fragmento interno de 560 pb de la secuencia, que incluye pequeñas regiones conservadas entre las diferentes trehalasas de plantas. Para ello se diseñaron un par de
oligonucleótidos específicos Tre333 y TreNsiRw que amplifican el fragmento interno (TRE)
seleccionado a partir de DNA plasmídico del vector TOPO-3Tre. El oligo TreNsiRw
introduce un sitio Xma I seguido de un sitio Nsi I en el extremo 3' de la secuencia. El
5 producto amplificado fue clonado en el vector TOPO TA pCR2.1 MR, dando lugar a los
plásmidos TOPO-tre560s y TOPO-tre560as, debido a la inserción bidireccional del
fragmento en el vector. En estas dos construcciones el inserto queda flanqueado en un
extremo por el sitio Sacl y en el otro lado por los sitios Xba I y Nsi I del vector, lo que nos
permitió determinar la dirección del fragmento mediante digestión en el sitio Nsi I de la 10 secuencia TRE, con respecto a estos sitios (dirección sentido: Sacl-Xbal; dirección
antisentido: Xbal-Sacl).
b) Construcción del vector intermediario TOPO-GUS.
En la construcción del RNA de interferencia para la trehalasa de alfalfa fue necesario
contar con una secuencia "lazo" para unir las dos copias de la secuencia TRE. Para ello se utilizó un fragmento interno de 1,020 pb de la secuencia del gen de la b-glucuronidasa (GUS; gen uidA) de E. coli. Esta secuencia se amplificó por PCR utilizando los primers GUSSmaR y GUSNsiF, a partir de DNA plasmídico del plásmido pBI-121. Los primers utilizados se diseñaron en base a la secuencia GUS incluida en la secuencia del vector
20 pBI-121 (acceso AFA85783), e introducen en los extremos del fragmento amplificado un sitio Xma I y un sitio Nsi 1, respectivamente. El producto de PCR se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 MR, dando lugar a los plásmidos TOPO-GUSs y TOPO-GUSas, debido a la inserción bidireccional del fragmento en el vector, la cual se determinó mediante digestión Nsi 1.
c) Construcción del RNA de interferencia con el fragmento TRE.
Para la construcción del RNA de interferencia para la trehalasa, se colocaron dos copias del fragmento TRE colocadas en dirección opuesta una a la otra (cabeza con cabeza), y ligadas con el fragmento amplificado de 1,020 pb de la secuencia GUS. Para ello 30 inicialmente se liberó el fragmento TRE del plásmido pTOPO-tre560as como fragmento Xba I-Nsi 1, y se insertó en los mismos sitios del plásmido pTOPO-GUSs, dando lugar al plásmido pTOPO-GT (GUS:TRE). Posteriormente, el fragmento GT (GUS:TRE) se liberó
de este plásmido mediante digestión Sacl -Xmal y se clonó en los mismos sitios del plásmido pTOPO-GUS AS, para dar lugar al plásmido pTOPO-TGT (TRE:GUS:TRE). Las clonas positivas para esta construcción se caracterizaron por doble digestión Sac I-Xba 1, y por digestión sencilla Nsil.
Ejemplo 4. Construcción de los vectores de control de expresión.
a) Amplificación de la secuencia promotora rd29A. La secuencia promotora rd29A se amplificó por PCR a partir de DNA genómico extraído de tejido foliar de plántulas de Arabidopsis. Las semillas fueron proporcionadas por el Instituto de Biotecnología de la UNAM-Cuernavaca. Para la amplificación se diseñaron los oligos Frd29Hind y Rrd29Xba, en base a la secuencia promotora reportada (acceso D13044). Este par de oligos amplifican el fragmento comprendido del nucleótido 4563 al 5504, y lo flanquean con los sitios Hind 111 y Xba 1. El producto de PCR se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 MR para dar lugar al plásmido TOPO-rd29.
b) Construcción del vector control de expresión inducible en plantas: prd29A:GUS.
La secuencia promotora rd29A se liberó del vector TOPO-rd29 mediante una doble digestión enzimática con Hind III-Xba 1, y se subclonó en los mismos sitios del vector pBI121 MR (Clontech, Inc.). En esta construcción, la secuencia rd29A sustituye al promotor 35S CaMV, dando lugar al plásmido prd29A:GUS. Este vector constituye el plásmido control de los vectores de expresión inducible para el antisentido y el RNA de interferencia de la trehalasa.
c) Vector control de expresión constitutiva en plantas: pBI-121 (p35S:GUS).
La secuencia promotora rd29A se liberó del vector TOPO-rd29 mediante una doble digestión enzimática con Hind 111 y Xba 1, y se subclonó en los mismos sitios del vector pBI-121 MR (Clontech, Inc.). En esta construcción, la secuencia rd29A sustituye al promotor 35S CaMV, dando lugar al plásmido prd29A:GUS. Este vector constituye el plásmido control de los vectores de expresión inducible para el antisentido y el RNA de interferencia de la trehalasa.
Ejemplo 5. Construcción de los vectores de expresión para el fragmento TRE antisentido (TREas) y RNA de interferencia (TRE-RNAi).
a) Construcción del vector de expresión del fragmento TRE antisentido (TREas) bajo los promotores 35S y rd29A.
Para dirigir la secuencia de trehalasa en orientación antisentido en los plásmidos con los promotores 35S y rd29A, dicho fragmento de trehalasa se liberó del vector TOPO-tre560s mediante digestión Sac I-Xba 1, y se subclonó en los mismos sitios de los plásmidos pBI121 Y prd29A:GUS, dando lugar a los plásmidos p35S:TREas y prd29:TREas, respectivamente. En ambos vectores, el fragmento antisentido sustituye al gen GUS y antecede a la región NOSter (región terminadora y de poliadenilación del gen que codifica a nopalina sintasa).
b) Construcción del vector de expresión del casete RNAi-TRE bajo los promotores 35S y rd29A.
Para la expresión en plantas de RNA de interferencia de la trehalasa (TRE-RNAi), este casete se liberó del vector TOPO-TGT mediante una doble digestión Sac I-Xba 1, y se subclonó en los mismos sitios de los plásmidos pBI-121 y prd29A:GUS, dando lugar a los plásmidos p35S:TRE-RNAi y prd29:TRE-RNAi, respectivamente. En ambos vectores, el casete de RNAi sustituye al gen GUS y antecede a la región NOSter (región terminadora del gen de la nopalina sintasa).
Ejemplo 6. Obtención de plantas GMs de maíz conforme a la invención.
a) Integración en el maíz de las construcciones para la expresión del fragmento TRE
antisentido (TRE AS) bajo los promotores 35S y rd29A.
Para obtener plantas GMs de maíz de las líneas puras B73 y H99 que expresen el antisentido de la enzima trehalasa bajo el control de los promotores 35S o rd29A, los plásmidos p35S-TREas y prd29A:TREas, se integraron mediante biobalística y con el uso de callos embriogénicos creciendo en cultivo axénico.
b) Preparación y bombardeo de micro partículas con DNA.
Para el bombardeo de las partículas/DNA se utilizó el sistema de Helio de alta presión PDS 1000-HeMR. La preparación de las partículas de tungsteno, el recubrimiento con el
DNA Y los parámetros de bombardeo se realizaron según protocolos conocidos utilizando
6 cajas por cada construcción de DNA bombardeada.
Ejemplo 7. Evaluación del sistema como marcador de selección.
Se realizó una selección en medio de cultivo con reguladores de crecimiento para inducir la formación de embriones somáticos (callos embriogénicos) suplementado con PEG-8000 al 4% con callos embriogénicos bombardeados con las construcciones antisentido para la trehalasa y sus controles, mantenidos en medio de cultivo MS suplementado con Dicamba 2 mg/L, adenina 40 mg/L, sacarosa 3% y PEG 8000 al 4% e incubados a 26°C y fotoperiodo de 16 horas luz/8 hrs. oscuridad.
Ejemplo 8. Construcción de una unidad de expresión de trehalasa de maíz.
Se seleccionó al gen que codifica para la enzima trehalasa de maíz, con el fin de generar una planta cisgénica. Este marco abierto de lectura (ORF) fue invertido y obtenido el complementario, para expresarlo bajo la regulación del promotor 35S simple, con la secuencia de poliadenilación del gen que codifica a la enzima nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. La secuencia obtenida fue modificada en dos bases para eliminar dos sitios de restricción EcoRI internos, asimismo, se insertó una secuencia no cad ifica nte, misma que serviría de bandera (Tag) para identificar a este evento de transformación. Cabe señalar que el gen antisentido no contiene ningún marco abierto de lectura, por lo cual no hay síntesis de ninguna proteína al invertir dicho ORF. Existe un sitio de restricción para EcoRV natural asimétrico que nos sirve de referencia en ensayos de detección a través de otros métodos (figura 1).
Esta unidad de expresión se obtuvo por apareamiento de oligonucleótidos largos
complementarios in vitra, asistido por PCR. El fragmento producido de 1802 pb fue clonado en un vector bacteriano pCR8 Topo (Qiagen). La digestión con EcoRI produjo un fragmento de 1.8 Kb, que fue purificado y utilizado en experimentos de biobalística sobre callos embriogénicos de maíz.
Ejemplo 9. Transformación genética de la línea pura de maíz 873 con el uso de callos embriogénicos y la biobalística.
Se indujeron callos embriogénicos de la línea pura de maíz 873 (ver figura 2) a partir de semillas maduras en un medio MS (Murashige y Skoog 1961) suplementado con Dicamba 2 mg/L, adenina 40 mg/L, sacarosa 3%, pH 5.8 Y gelrite 2.5 gIL. Se utilizó una línea de callos embriogénicos con una capacidad de división celular alta, comparada con el resto de las líneas. Callos embriogénicos de maíz se bombardearon con micropartículas de oro conteniendo el plásmido con la unidad de expresión de la trehalasa en antisentido (por ejemplo trehalasa de alfalfa conforme al ejemplo 3 ó trehalasa de maíz 873 conforme al ejemplo 8), y posteriormente fueron seleccionados en presencia de PEG 8000 al 4% durante dos meses (se llevaron a cabo tres subcultivos) hasta generar clonas tolerantes al PEG, mientras que los callos no bombardeados (al que denominamos controles negativos) presentaron muerte celular. Las clonas transgénicas obtenidas se propagaron por un mes en medio con PEG, hasta obtener una masa suficiente para llevar cabo la regeneración de plantas en un medio de cultivo MS (Murashige y Skoog 1962) suplementado con 8AP 0.2 mg/L, Cinetina 0.1 mg/L, sacarosa al 1 %, gelrite 2.5 gIL. Las plántulas regeneradas fueron transferidas a suelo y en condiciones de invernadero para promover su ciclo de vida hasta la obtención de semillas. Las semillas generadas fueron esterilizadas con gases clorinados para evitar futuras contaminaciones con hongos. Para monitorear la capacidad de tolerancia al PEG 8000, las semillas transgénicas, generación T1 , fueron sembradas en frascos conteniendo PEG 8000 al 7% y comparada su capacidad de sobrevivencia con semillas de la línea pura 873 sin transformar (silvestre). Las semillas transgénicas en la generación T1 mostraron una segregación para su capacidad de crecimiento en PEG 800 al 4% (25% tolerantes) mientras que los controles negativos no fueron capaces de germinar bajo estas condiciones. En esta fase las plantas transformadas mostraron su capacidad de sobrevivir en un ambiente con déficit hídrico. Las plantas tolerantes fueron transferidas al invernadero para obtener las generaciones subsecuentes T2, T3, siguiendo los procedimientos de selección en la fase de semillas con el PEG 8000, hasta generar una población que produjera mazorcas con 100% de semillas tolerantes a PEG 8000. Se seleccionaron dos líneas transgénicas a la que denominamos T1 y T4 para someterlas a evaluaciones de tolerancia a sequía. Estas líneas mostraron los mejores comportamientos agronómicos en su ciclo de vida (figura 8).
Las plantas resistentes al PEG 8000 al 7% se transfirieron a condiciones de invernadero para permitirles completar su ciclo de vida. Se aisló DNA de 5 eventos independientes de transformación genética para verificar la inserción de la unidad funcional 35S, gene neomicina fosfotransferasa tipo 11 NPTII presente en el plásmido bombardeado; como se
5 observa en la figura 3, T1 Y T 4 contenían el fragmento esperado. Por su capacidad de crecimiento y su vigor seleccionamos las líneas T1 y T4 para futuros experimentos de tolerancia a sequía.
Ejemplo 10. Caracterización molecular de plantas de maíz tolerantes a sequía.
lO Se usaron para esta fase semillas derivadas de la tercera generación endogámica de las líneas transgénicas T1 y T4. Para esta fase, la selección de plantas para desarrollar el experimento consistió en germinar las semillas en una solución de PEG 8000 al 7%, lo cual representa un medio de estrés hídrico al no dejar el PEG al agua disponible para ser absorbida por la semilla. Las semillas que fueron capaces de germinar bajo este agente
15 selectivo fueron crecidas posteriormente en condiciones de contención en invernadero y cuartos controlados de crecimiento. A las plantas se les tomó un segmento de 2 cm2 de hoja, de la cual se extrajo DNA total con el kit DNeasy de Qiagen. Este DNA fue utilizado como templado para amplificar al marco abierto de lectura del gen y un segmento interno del promotor 35S, utilizando oligonucleótidos específicos. Los productos fueron resueltos
20 en un gel de agarosa al 1 %, donde se observa una banda en las plantas GM de aproximadamente 950 pares de bases, que corresponde al tamaño esperado. Como control se utilizó DNA de plantas control, mientras que como control negativo se realizó una reacción sin la adición del templado de DNA (figura 4).
25 Ejemplo 11. Detección del transcrito de trehalasa por RT-PCR cuantitativo (RT-PCR en tiempo real).
La estrategia molecular de atenuación del gen se realizó a través de la expresión del marco abierto de lectura en antisentido del gen que codifica a la enzima trehalasa. Debido a que esta estrategia no apaga la transcripción del gen de referencia, se calculó la 30 proporción silenciada a través de cuantificar la acumulación de este gen. Como se muestra en la figura 5, en condiciones de sequía es donde se manifiesta la atenuación de la expresión, a través de la menor acumulación del transcrito de referencia en 86% y 76%
del valor más alto que tienen las plantas cuando crecieron bajo irrigación normal. Esta atenuación consistente en la disminución de la acumulación del mRNA entre 14% y 24%, que es suficiente para proveer de un fenotipo de tolerancia a estrés a sequía a las plantas GMs.
Ejemplo 12. Cuantificación de glucosa total como medida de la actividad de la enzima trehalasa.
La trehalasa es una enzima que utiliza como sustrato a la trehalosa y en presencia de agua produce dos moléculas de glucosa. Se utilizó el método descrito por Freydiere et al. (2002) adaptado a maíz. 100 mg de tejido fresco fue macerado en un microtubo utilizando un pistilo. El homogeneizado fue centrifugado y el sobrenadante fue transferido a un tubo limpio. Se utilizó una microcelda con dispositivo electrónico de Accu-chek de Roche, precalibrado para glucosa. Los valores obtenidos de glucosa en plantas silvestres fueron de 64 mg/dL, mientras que las plantas GM expresando trehalasa en antisentido mostraron valores de 51 mg/dL. La trehalasa atenuada por la estrategia molecular impide hidrólisis a glucosa a partir de trehalosa, siendo cuantificada consistentemente en 79% de la concentración determinada en plantas silvestres. Estos resultados son consistentes con la acumulación del mRNA detectado por RT -PCR cuantitativo en tiempo real.
Ejemplo 13. Caracterización fisiológica de plantas de maíz tolerantes a sequía.
a) Crecimiento de Ifneas 873 GMs.
Se colocaron a germinar semillas de las líneas cisgénicas 873-T1 Y 873-T 4 de maíz de la invención y maíces 873 silvestres como control, criollo negro y blanco, así como maíz blanco y cacahuazintle, en cajas petri con agua en una cámara de crecimiento a 26°C por 5 días. Después de la germinación, las plántulas fueron transferidas a un sustrato que contenía turba, suelo arenoso y agrolita, en tubos de PVC de 60 cm. de profundidad y 25 cm de diámetro. La tapa inferior contenía muchas perforaciones para permitir el drenado de agua, donde ésta tapa puede desprenderse para observar la parte radicular. Finalmente se realizó el seguimiento de su crecimiento vegetativo, aparición de anteras y flores femeninas, producción de semillas y senescencia.
b) Medición de parámetros agronómicos en fase vegetativa (figuras 6 y 7).
Se emplearon como control interno de comparación a dos variedades de maíz criollo, conocidos por su capacidad de tolerancia a sequía. A dos meses de haber sembrado los maíces, los criollos mostraron mayor talla con respecto a las líneas transformadas, siendo
5 las más pequeñas las 873 control. Cabe señalar que la talla de los maices criollos es una característica genética de los criollos de referencia, que se manifiesta bajo cualquier hábitat. La figura 8 muestra los fenotipos obtenidos de crecimiento vegetativo bajo condiciones de irrigación. En las imágenes de la figura 8, se ven claras diferencias en el crecimiento entre las
10 variedades criollas que son más grandes, luego en tamaño siguen las transformadas 873 T1 Y T4 Y las más pequeñas las 873 control. Se aplicó la sequía simplemente al detener el suministro de agua y solución mineral. Como se indicó, el sustrato está compuesto de turba y agrolita, que poseen una baja retención de agua, mostrándose los efectos de la sequía sobre la fase de mayor
15 susceptibilidad de la planta, que es la etapa de producción de flores femeninas y masculinas, así como el número de mazorcas y llenado de grano. Se observa en las figuras 8 a 10 el efecto de la sequía sobre esta etapa fenológica.
e) Floración: flor masculina (anteras y polen).
20 Las primeras plantas en producir espigas, que son componentes de la flor masculina fueron 873-T1 Y T 4, respecto a las plantas control 873 que fueron 25 días después. La aparición de espigas de las variedades criollas ocurrió 30 días después. Este retraso en la floración es una característica de plantas que tienen estrés hídrico, así como el aumento del intervalo de aparición de espigas y mazorcas (figura 9).
d) Floración: flor femenina (mazorcas).
Las primeras plantas en inducir la formación de la flor femenina fueron las líneas 873-T1 Y T4, respecto al control que fueron 17 días después. Muy notoriamente, las plantas silvestres criollo blanco y negro aunque produjeron espigas, no ocurrió la formación de
30 flores femeninas o mazorcas, presumiblemente por el estrés al que fueron sometidas. Las plantas después del llenado de grano ingresaron al periodo de senescencia, característico de una disminución de fotosíntesis y turgencia en la planta (figura 10).
e) Producción de semillas.
La producción de semillas se evaluó al colectar las mazorcas de cada una de las plantas analizadas y en las que se desarrollaron estas. Antes de la evaluación se secaron apropiadamente a 37°C por 8 días. Como se puede apreciar en la tabla 1, hay un marcado incremento en las semillas de las plantas transformadas en relación con el control negativo. El número de semillas por hilera así como el de hileras y el peso promedio nos indica la marcada superioridad de las plantas de la invención en la producción de semillas. Los resultados son el promedio de 15 mazorcas por genotipo.
Tabla 1
- Genotipo
- Numero de Numero de Peso promedio de
- hileras
- semillas 100 semillas
- por mazorca
- por hilera (promedio por
- semilla en gramos)
- 873 Control
- 16 16.00 2.56
- 873 T1 GM
- 18 19.43 3.64
- 873 74 GM
- 20 22.27 3.90
f) Senescencia.
El estado de senescencia fue comparable en todos los tratamientos, independientemente de la formación de flores femeninas.
Ejemplo 14. Medición de parámetros agronómicos.
a) Medición de crecimiento.
La figura 11 muestra la talla de la planta, medida desde su base hasta la zona de crecimiento apical, en una cinética desde la germinación de las semillas hasta la senescencia. Los puntos graficados muestran los promedios obtenidos de las plantas de cada tratamiento. Como se puede observar, las plantas de la línea 873, mostraron una menor tasa de crecimiento que las criollas. Sin embargo, la comparación de las 8T73 GM Y control mostraron mayor tasa en las GM. Lo que respecta a las variedades criollas, estas presentaron una mayor crecimiento y entre ellas éste fue muy similar, las cuales llegaron a sobrepasar los 3.5 metros de altura. Hay que resaltar que la línea 873 control aumentó su crecimiento antes de empezar la floración, ya que tuvo un mayor gasto de nutrientes en ese momento y a que los utilizó para crecer y florecer al mismo tiempo, situación contraria a las plantas transformadas que si fueron sincronizadas, creciendo primero y luego de un tiempo florecieron. Como se indicó, las plantas criollas estresadas por sequía fallaron en producir mazorcas, a pesar de haber alcanzado gran altura.
b) Comparaciones fisiológicas.
Respecto a la comparación fisiológica entre las variedades, en la figura 12 podemos observar las diferencias en tamaño, color de las hojas y tallo, donde las variedades criollas presentan un mayor tamaño respecto a las 873 y su coloración es un verde pálido y poco brillante respecto a las 873 que tiene un verde fuerte y lustroso y sus hojas son mas carnosas. Para el caso de la forma y grosor del tallo, las criollas tienen un tallo más delgado y redondo y las 873 su tallo tiende a ser ovalado y grueso, lo cual le brinda una mayor resistencia y posibilidades de tener un crecimiento totalmente erecto al contrario de las criollas que después de los dos metros de altura su tallo se empezaba a arquear. Es necesario realizar una prueba en campo, pues el enraizamiento secundario del maíz se limita por las pruebas controladas en invernadero.
Ejemplo 15. Medición de parámetros fotosintéticos en condiciones de humedad y estrés por sequía.
a) Inducción de sequla.
Las plantas se dividieron en dos grupos y se dejó de regar a un grupo, manteniendo al otro como control. La figura 13 muestra el fenotipo de estrés que mostraron las plantas después del estrés, observándose las características después de 13 dras de haber detenido el riego. En la figura 13 podemos observar la respuesta de las plantas al estrés de sequía respecto a las plantas que no fueron sometidas a este tratamiento. Las que mostraron una mayor afectación a sequía fueron las variedades criollas negras y blancas, donde se observó pérdida de turgor de sus hojas, marchitamiento y clorosis; siendo aun mas fuerte estos efectos en los criollos negros. Cabe aclarar que para las plantas criollas, la sequía se debió suspender a los 6 días de iniciada la sequía dado a que ya mostraban efectos severos de danos por este estrés. Plantas que permanecieron sin regar después de este tiempo alcanzaron su punto de marchitez permanente. Para el caso de las plantas cisgénicas de la invención, solo se observaron efectos entre los 11 y 13 días después de inducida la sequía, en donde se vio un enrollamiento de sus hojas y una ligera clorosis. Las plantas que mostraron un mayor efecto fueron las T4 y estas también retardaron su crecimiento durante la aplicación de la sequía. Respecto a las plantas 873 control, estas no presentaron efectos muy notorios debido a que para ese momento su tamaño longitudinal era notablemente menor respecto a las transformadas, lo que le confiere un menor requerimiento de agua.
b) Parámetros fotosintéticos.
La línea 873-T1 presentó una mayor tasa fotosintética en condiciones de humedad respecto a las variedades control y a la T4; en contraste, durante la sequía todas disminuyeron su fotosíntesis a los 6 días, pero solo la T1 tuvo un ligero aumento a los 13 días, donde se irrigaron las plantas (figura 14). La última barra de cada una de las series mostradas en la figura 14, indica la tasa fotosintética a la que regresan las variedades después de iniciar el riego. La conductancia es una medida de la concentración de iones en las plantas, sea intra o intercelular. Para el caso de la medición de conductancia, la planta GM T1 dio una respuesta de disminución de la conductancia mayor del 50% a los 6 días y más del 100% a los 13 días de sequía. En comparación con la planta T 4 que disminuyó esta conductancia a casi el 50% a los 6 días y el control solo a los 13 días, en donde disminuyó aproximadamente un 40% (figura 15). Lo que nos lleva a deducir que la T1 tiene una mayor respuesta de sobrevivencia y gasto de agua, que la T4 y las criollas. La figura 16 muestra el contenido interno de agua de las plantas bajo ensayo, donde se puede observar que T1 es la que menor contenido de agua tiene respecto a la T4 y al control en la sequía. Las plantas T1 y T4 muestran una respuesta adaptativa notoria, ya que pueden almacenar significativamente más agua que la planta control después del régimen de estrés por sequía. Un parámetro importante lo constituye la humedad relativa del sustrato donde crece la planta. Para corroborar la respuesta de la falta de agua, se midió el porcentaje de humedad relativa en planta y la del suelo, donde se observa que las plantas control iniciaron el periodo de sequía incluso con más agua que las plantas GM. Posteriormente, el contenido relativo de agua fue disminuyendo por efecto del tratamiento. A los 13 días las raíces habían absorbido el 50% del agua en la maceta a diferencia de las plantas control, lo cual pudo deberse a que las plantas control tuvieron un menor tamaño en el momento de la comparación y sus requerimiento de agua son menores (figura 17). La medición de CO2 intracelular refleja la apertura estomática, que es influenciada por la sequía. La apertura de las células encargadas de permitir el intercambio gaseoso es controlada por un mecanismo dependiente de ácido abscísico, el cual se produce por estrés hídrico, entre otros factores de estrés abióticos. En la figura 18 se observa que a pesar de aplicar el estrés, las plantas GM de la invención continúan intercambiando gases, en contraste con el control que permanece con elevadas concentraciones de CO2 interno. La idea anterior se puede corroborar en la figura 19, que muestra la apertura estomática que hay en el momento de la medición, donde observamos que es cierto que la T1 tiene una menor tasa respiratoria ya que cierra sus estomas a más del 50%, mientras que T4 al inicio de la sequía tarda en dar una respuesta, pero después de 6 días disminuye su tasa de transpiración a más del 50%; respecto al 873 control, éste solo disminuye su tasa respiratoria a los 6 días más del 30% y a los 13 días a casi el 50%.
Ejemplo 16. Tolerancia a estrés por frío en las plantas con trehalasa en antisentido.
Plantas de maíz control y con el gen de la trehalasa en antisentido obtenidas conforme a la presente invención fueron germinadas a 4°C por tres días y posteriormente fueron crecidas a 16°C. Las plantas silvestres no pudieron progresar en su crecimiento, en contraste a las genéticamente modificadas de la invención, que fueron transferidas a macetas para la progresión de su crecimiento vegetativo. En condiciones controladas de invernadero, se permitió la oscilación de temperatura en la estación invernal de hasta 2°C como temperatura mínima. Las plantas de la invención con el gen de trehalasa en antisentido progresaron en su crecimiento vegetativo, en contraste con las silvestres. Los datos in vitro y en invernadero son consistentes en que las plantas mejoradas con el gen de trehalasa en antisentido conforme a la presente invención tienen tolerancia al frío. Así mismo, las plantas de la invención obtenidas fueron capaces de desarrollar las primeras espigas bajo dichas condiciones, que son el órgano masculino generador de polen para iniciar su etapa reproductiva.
Existen tres posibles mecanismos que pueden explicar la capacidad protectora de la trehalosa sobre biomoléculas, tales como la disponibilidad de agua, la formación de cristales y la estabilidad química. Estos no son excluyentes y pueden tener efectos aditivos para producir los efectos de tolerancia a sequía y frío observados y generados conforme a la presente invención. Por ejemplo, la capa de hidratación formada por el agua interactuando con la molécula a través de puentes de hidrógeno puede estabilizar las moléculas e inhibir su desnaturalización irreversible (Roser et al., 1993; Clegg, 1985). El enlace glicosídico entre los dos residuos de O-glucosa muestra flexibilidad quiral, probablemente permitiendo a la trehalosa interactuar con otros grupos polares de diferentes moléculas. La trehalosa es el único azúcar que forma cristales amorfos estables en temperaturas extremas. Este disacárido ha sido propuesto como protector de actividad enzimática, estabilizador de enzimas, aditivo de alimentos, criopreservador de células, tejidos y órganos, y mejorador de la vida de almacén de flores (Eroglu et al., 2000; Guo et al., 2000). Este disacárido también se ha descrito como una molécula señalizadora. Nuestra evidencias nos han permitido cuantificar a la trehalosa en la savia del f1oema, siendo que la reacción enzimática para su síntesis está compartamentalizada. Los tejidos productores
o fotosintetizadores contienen a la enzima trehalosa fosfato sintasa, mientras que la trehalosa fosfato fosfatasa se encuentra en tejidos consumidores.
Ejemplo 17. Cuantificación de trehalosa por HPLC.
Las muestras fueron analizadas usando un cromatógrafo de líquidos con detector de índice de refracción, utilizándose tres muestras por tratamiento provenientes de 873 control, 873 T1 Y 873 T4; durante la separación de los componentes en el extracto inyectado, el pico que corresponde a trehalosa es el que se obtiene aproximadamente en el tiempo de retención 17, esto basándonos en lo obtenido en el estándar de trehalosa comercial, aunque en ellas resultan otros picos que no corresponden al disacárido de nuestro interés, algunos de los cuales corresponden a glucosa y sacarosa y otros no identificados (figura 20).
Para la cuantificación de trehalosa, a partir de la figura 20 se calculó el área bajo la curva
(a) y la biomasa en mg [O], tanto de la muestra (mtra) como del estándar (std), donde se utilizó una biomasa del estándar de 0.25 mg y de muestra vegetal de 100 mg, utilizando la fórmula (1) Y obteniéndose los resultados de la tabla 2 para las muestras bajo ensayo:
% Trehalosa = (amtra/ astd)([O]std/[O]mtra)( 1 00) (1 )
Muestra
G-1 J-2 L-3
A-1 8-2 H-3
8-1
M-2
0-3
f1std = 280950
10 [D]std = 0.25 mg [D]Mtra = 100 mg
Tabla 2
Amtra
873-control
1427700
21 38855
1798553
873-T1
3591 651
31 36444
231 0477
873-T4
21 86400
1875777
5560166
% Trehalosa
1.27
1.9
1.6
3.19
2.8
2.05
1.95
1.67
4.94
Conforme a lo anterior, se obtuvieron los valores de trehalosa en peso fresco en las muestras analizadas; en la tabla 3 se comparan estos valores con los reportados de este 15 disacárido en plantas de maíz silvestres.
Tabla 3. Concentración de trehalosa (mg I g de peso fresco) presente en las
muestras de 873 control y genéticamente modificadas conforme a la invención,
analizadas por HPLC
Maíz silvestre 873 control 873 T1 873 T4
5 Como puede observarse, el valor obtenido en las plantas control fue muy similar a lo reportado previamente en plantas controles de maíz y equivaldría al 100% del total que tienen las plantas de maíz 873, por lo que los valores encontrados en las plantas genéticamente modificadas T1 y T4 conforme a la presente invención equivaldrían a una acumulación de al menos 68% y 74% mayor de trehalosa respectivamente en
10 comparación con el control; dichos resultados sobresalen de los rangos reportados e indican que se logró la inhibición de la enzima trehalasa (figura 21).
Ejemplo 18. Medición de la actividad enzimática de trehalasa.
La cuantificación de la actividad enzimática de trehalasa se realizó a través de la
15 cuantificación de glucosa producto de la hidrólisis de la trehalosa. Esto se realizó para comprobar los resultados obtenidos en el ejemplo 17 (tabla 4). Una unidad enzimática es igual a 1IJmol/l de trehalosa.
Tabla 4. Niveles de glucosa y de actividad de trehalasa detectados en los extractos
20 de las plantas 873 control y genéticamente modificados (T1 y T4).
Glucosa (mg/dl) Glucosa (mmol/l) Trehalosa (pmol/l*)
Muestra Tiempo (h) Tiempo (h) Tiempo (h)
2 2.15 2.30 2.45 3 2 2.15 2.30 2.45 3 2 2.15 2.30 2.45 3
B73 Control 21 23 23 25 22 1.16 1.27 1.27 1.38 1.22 1166 1277 1277 1388 1222
B73 T4 O O O O O O O O O O O O O O O
B73 T1 O O 11 12 O O O 0.61 0.66 O O O 611.1 666.6 O
* = 1 U trehalasa
Mediante este experimento se pudo observar que no se originó producción de glucosa en las plantas genéticamente modificadas de la invención respecto a las plantas 873 25 controles (figura 22), indicándonos que si se logró la atenuación de la acción de trehalasa
en trehalosa, corroborándose los datos que se obtuvieron de los niveles de trehalosa
presentes en las plantas genéticamente modificadas (T1 y T4).
Ejemplo 19. LD-PCR de marcaje (Long-Distance PCR).
5 Obtenido el cONA sintetizado previamente a partir de RNA total de hojas de maíz, se procedió a realizar un ensayo LO-PCR de marcaje utilizando 32p_dCTP, utilizando muestras tanto en condiciones de sequía como en humedad de B73 control, T1 y T4, en un total de 6 muestras que serían utilizadas en macroarreglos; al momento de realizar el ensayo, también se realizó una prueba sin marcaje utilizando como molde cONA de T4 (en
10 condición de humedad) con el fin de comprobar que la mezcla de reacción y las condiciones de amplificación fueran las correctas (figura 23), lo cual fue observado por medio de electroforesis en gel al 1 % de agarosa a 80 volts y visualizado en el fotodocumentador Gel Logic 200 (Imaging system),
15 Ejemplo 20. Cuantificación de expresión diferencial usando un macroarreglo. Con el cONA que se utilizó como molde para la síntesis de las sondas radiactivas conforme al ejemplo 19, se hibridaron con los plásmidos que se muestran en la tabla 5, goteados en las membranas de nylon y que contenían los fragmentos de ONA que se muestran en la tabla 5. Los plásmidos mencionados proceden de la construcción de
20 bibliotecas de expresión diferencial de genes de respuesta a sequía reportados por Montalvo-Hernández (2007) y Barrera-Figueroa (2007), así como plásmidos que contienen genes de respuesta a sequía en frijol no publicados.
Tabla 5
N° N° N°
en en en CLAVCLAVE GEN CLAVE GEN CLAVE GEN GENN° en GE GE GE E
GEL L L L
PVl Desconocida
19 PV21 Precursor cloroplasto small
Desconocida I sin
L19 Proteína desconocida R168
2 Hsp
similitud L92 PoHubiquina 2
- 3
- PV2 Desconocida 20 PV22 Proteína hipotética 37 L26 Proteína desconocida 54 R169 Proteína deSCOnocida
- 4
- PV3 Dehidrina 21 PV23 Phaseolus vulgaris esl 38 L54 Factor da elongación lA 55 R188 Proteína de choque térmíco Hsp 70
- 5 6
- PV4 PV5 Respuesta humadad cONA Proteína laumatina 22 23 PV25 PV26 Carboxil transferasa a sublJnidad secA Thioredoxina 39 40 L65 L89 Dehidrina Probable dominio BURP 56 57 R222 R247 Zeaxantina epoxidasa Enzima de glicosiación
- 7
- PV6 Proteína 24 PV27 Desconocida 41 LOO Proteína de 58 R250 Proteína rica en
- intrlnseca de
- transferancia de lipidos leucina
- tonoplasto
- no especifica
- (Phaseolus vulgaris)
(Phaseolus vu/galis)
A Actina
25 PV28PV8 Inducida por frio
Desconocida
8 Profilina
L134 Metalotioneina tipo 2 60 B 268
PV9
Desconocida
(Phaseolus 26 PV29
- 9
- vu/galis)
- Proteína kinase
- 8PK-3
- PV10
- (Phaseolus 27 PV30 Desconocida 44 L175 Proteína desconocida 61 C P-Dve
- 10
- 8Culffolius)
- Protaína
- Factor de inicio de la
28 L2 Beta galactosidasa L185
- -
11 PV11 hipotétiCa traducción 5A
Protelna Probable proteína de 29 L6 46 R4 No derancial 12 PV12 hipotétiCa senescencia --
Fosfoglucomuta Protelna de transporte
sade 30 L8 transmembranal de R16
- -
LEA grupo 3
13 PV13 cloroplasto aminoécidos
Proteína de Protelna hipotética de Desconocida I sin 31 L13 48 R25
-
14 PV14 cloroplasto cloroplasto (Zea mays) similud
- -
Proteína Asparagina sintetasa Desconocida I sin
32 L14 49 R33
15 PV16 hipotética (Phaseolus vu/galis) similud
- -
Protelna Mio4nos01-1-fosfato 33 L15 50 R123 ProIelna desconocída
- -
- 16 PV17 hipotétiCa sintase -
LEA grupo 4 (Phaseolus 34 L17 51 R160 Acetil-CoA carboxilasa
-
17 PV20 Desconocida vu/galis)
Los plásmidos de la tabla 5 fueron goteados en un total de 400 ng (2 !JI: 1 !JI plásmidos + 1!J1 de NaOH), en una membrana de nylon para el respectivo macroarreglo de ONA; estas membranas fueron después hibridadas con las sondas radiactivas obtenidas a partir del
5 marcaje radiactivo de cONA sintetizado de RNA de las condiciones de sequía y humedad, y fueron expuestas a oscuridad en placas de rayos X a -80°C y reveladas un día después visualizando distintas intensidades de señales de hibridación (figura 24). Las señales obtenidas se analizaron con el programa Array Vision (GE), sustrayendo el fondo que rodea a cada señal y obteniéndose finalmente la intensidad asociada a cada una de ellas.
Ejemplo 21. Cuantificación de la inducción de genes.
En la tabla 6 se muestran los valores de intensidad de señal obtenidas en las muestras de 873 controles, T1 y T 4 conforme al ejemplo 20, así como la sustracción de ambos valores respecto a su fondo, indicando el nivel de inducción de las señales; para el caso de los
15 genes en que la sustracción es igual a cero, indica que este gen no se detectó, ya que la sustracción fue para conocer si se presentó una inducción o represión de genes en sequía conforme a la presente invención. Los valores iguales a cero indicaron que estos genes tuvieron una expresión fuera del umbral detectable conforme a la prueba.
Tabla 6. Valores de expresión diferencial calculados de los ensayos de hibridación a partir del coeficiente de sobre-regulación [R= Intensidad Sequla (estreudos) ¡ Intensidad Humedad (regados) * 100] de muestra vegetal a partir de hoja de plantas 873 control, T1 y
- T4, bajo condiciones de sequía.
- CLAVE
- B73 CONTROL B73 T1 B73 T4
- HUM
- SEQ SUSTo HUM SEQ. SUSTo HUM SEQ SUSTo
- PV1 Desconocida
- 75 86 12.8 82 61 .5 -33.3 69.5 51 -36.3
- -
- 100 12.5 55PV2 Desconocida 28.5 28.5 0.0 19
PV3 Dehidrina
- -
- 6.8 79.5 85.5 7.0 66 51 -29.4
PV4 Respuesta a humedad 77.5 78 0.6 81 90 10 67 51 -31.4
74.5 81 8.0 -19.4 81.5 4.3 61.5 51.5
PV5 Taumatlna
- -
- 26.7 2281 78 -3.8
PV6 Acuaporlna
83.5 1.2 77.5 38 -103.9 48
PV8 Inducida por frio
PV9 Proflllna O O O
21.5 10.5 3 23 87.0
PV10 Clnasa SPK3
7.5 -100 O O O 1.5 17.5 91.4
PV11 proteina hipotética
81.5 78.5 -3.8 28 -91.1 40.5 54
PV12 proteina hipotética
- -
- 4.0 62.577.5 82 77 -14.7
PV13 fosfoglucomutasa
33.5 29.5 -1 3.6 10 81 .1 3.5 -185.7 9
PV14 proteina de cloroplasto
12.4 65.575.5 72.5 -4.1 74.5 -18.0
PV16 proteina hipotética
PV17 proteina hipotética 2 O 0.0 O O O O 1.5 O
PV20 proteina hipotética
81 81 .5 0.6 84.5 56 -50.9 68.5 -16. 1
PV21 precursor Hsp -6 O 0.0 O O O O 6.5 O
PV22 proteina hipotética 4 O 0.0 O O O O 21.5 O
PV23 proteina hipotética
84 78.5 81.5 85.5 4.7 58
- PV25 carboxil transferasa a
- -1 O O O O O O O O
- PV26 tloredoxina
- 1 O O O O O O O O
- PV27 proteina hipotética
- 11.5 O O O O O O 8.5 O
- PV28 proteina hipotética
- 7.5 O O O O O O 10.5 O
9 O O 5 62 91.927.5
PV29 proteina hipotética
- -
- 15.3 20 11 -81.8 100 64 72.7
PV30 proteina hipotética
- L2 beta galactosidasa
- 1 O O O O O O 3.5 O
- L14 asparagina sintetasa
- 2.5 O O O O O O 3.5 O
- L90 transferencia de lipidos
- 5.5 4 -37.5 O O O O 14.5 O
- LB9 Prot. Dominio BURP
- O O O O O O O 14 O
- L6 proteina senescencia
- O O O O O O O 4 O
L 13 proteina hipotética
5 7.5
O O O O
21 .5
O
L 19 proteina hipotética 7 O O O O O 100 2
L26 proteina hipotética 7.5 O O O O O 100
L175 proteina hipotética 3 O O O O O O 4 O
LB transporte transmembranal de aa 2 O O O O O O 4 O
L 15mlo-inosltol P04 slntasa 6.5 8 18.8 O O O O 5 O
L17 LEA 4
29 17.5 4 -12.5 100 57.5 94.8
L65Dehidrlna 1.5 O O O O O O 14.5 O L 134 Metalotloneina O O O O O O O 17 O L54 Factor de elongación 1A 1.5 O O O O O O 4 O L185 Factor inicio traducción O O O O O O O 4 O
L92 Pollublqultlna
R4 proteina hipotética 7 6 -16.7 O O O 100
R16 LEA 3 O O O O O O O 2.5 O
R25 proteina hipotética
O O O O O O 6.5 O
R160 actll CoA carboxllasa 1.5 O O O O O O 13 O R33 proteina hipotética O O O O O O O 8.5 O R247 enzima de glicosllaclón 2.5 O O O O O O 6 O R123 proteina hipotética -0.5 O O O O O O 3.5 O R169 proteina hipotética O O O O O O O 8 O R168 proteina hipotética O O O O O O O 2.5 O R188 choque térmico hsp 70 O O O O O O O 5 O R250 proteina rica el leucina O O O O O O O 2 O R222 Zeaxantina epoxidasa O O O O O O O 5 O A Actlna O O O O O O O 5 O B 26 S rlbosomal O O O O O O O 2 O C vector pDRIVE O O O O O O O 5.5 O
HUM Humedad;
SEa Sequía
Sust Sustracción
5 Ejemplo 22. Clasificación de los genes. Entre los genes que presentaron señal inducción o represión en el macroarreglo conforme al ejemplo 21 , fueron clasificados funcionalmente; cabe resaltar que los genes que presentaron valores de cero al realizar la sustracción no se clasificaron porque este valor nos indica que estos genes no se detectaron en las plantas 873 control y genéticamente
10 modificadas en condiciones de estrés por sequía. Conforme a lo anterior, en esta clasificación funcional encontramos varios genes asociados a distintas funciones en la célula, tal es el caso de los asociados o involucrados en la respuesta a estrés abióticos entre ellos a la sequía (tabla 7), tal es el caso de las Dehydrinas, pertenecientes a uno de los grupos de la familia de las proteínas LEA (Proteína abundante de embriogénesis
15 tardía), las cuales son producidas como respuesta a las bajas temperaturas, salinidad y a sequía, para la protección de las membranas a los daños por estrés (Allagulova et al. 2003 and Puhakainen et al. 2004) donde su producción es inducida por el ácido abscísico (ABA); también se observó la expresión de la proteína intrínseca de protoplasto, que es una proteína putativa de la Acuaporina, que está directamente relacionada con el uso del
5 agua (Montalvo et al. 2007), al igual que la Protein cinasa SPK-3 que está involucrada en la inducción de genes en respuesta a ABA, a la activación de proteínas a nivel posttransduccional (Yoon et al. 1997) y a la expresión 'de LEA (Proteína abundante de embriogénesis tardía) del grupo 4 que está involucrado en la protección de los componentes celulares (Montalvo et al. 2007).
Tabla 7. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de respuesta a estrés
abiótico y los niveles de supresión e inducción en 873 control y genéticamente
modificados conforme a la presente invención.
CLAVE GEN 873 CONTROL 873 T1 873 T4
PV3
Oehydrina (dhn1) 7.01 -29.41
PV4 Respuesta humedad cONA 0.64 10 -31 .37
PV6
Proteina intrinseca de tonoplasto -26.74 58.87
PV8 Inducida por frio 1.18 -1 03
PV9
Profilina 0.61 -29.78
PV10 Protein kinase SPK-3 -1 04.76 O 86.95
L90 Proteina de transferencia de lipidos no especifica
O O
L17 LEA grupo 4 -65.71 -12.5 94.78
15 Los genes clasificados como de respuesta a estrés abiótico, presentaron diferentes comportamientos en las plantas de B73; para el caso de los controles, estos presentaron principalmente una supresión de señal de genes asociados a respuesta de estrés por sequía, caso contrario a lo visto en las plantas genéticamente modificadas conforme a la presente invención (figura 25).
20 También se observaron intensidades de señal de genes que tienen funciones en la fotosíntesis, la cual se define como la serie de reacciones en las que se produce la síntesis de ATP por reacciones energizadas por luz y la fijación de CO2 en la conversión de energía lumínica a química; como un ejemplo podemos notar la importancia de la fosfoglucomutasa, que es una enzima que se encarga de convertir la glucosa-1-fosfato a 25 glucosa-6-fosfato, participando así en la glucogenólisis. Al igual que la presencia de
proteínas de cloroplasto, el cual es un organelo citoplasmático encargado de llevar a cabo el proceso de fotosíntesis tanto en las células eucarióticas vegetales, en algas y en algunos protistas. Se observaron diferencias en la expresión de genes a nivel fotosintético, en especial de las plantas genéticamente modificadas respecto al control, donde las señales de estas fueron de baja expresión (tabla 8 y figura 26).
Tabla 8. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de fotosintesis y los niveles
de supresión e inducción en 873 control y genéticamente modificados.
- CLAVE
- GEN 873 CONTROL 873 T) 873 T4
- PVi 3
- Fosfoglucomutasa de cloroplasto -4.02 -6.5 -14.67
- PVi4
- Proteína de cloroplasto -1 3.55 -185.7 81 .05
Li3 Proteina hipotética de cloroplasto
O O
Por otra parte, se obtuvo un solo valor de intensidad de señal en las muestras control y genéticamente modificadas, clasificado en categoría funcional de respuesta a estrés biótico (tabla 9). La taumatina es una proteína que está involucrada en la defensa de las plantas ante patógenos conocida como Proteínas PR (pathogenesis-related) y a respuesta de estrés osmótico.
Tabla 9. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de respuesta a estrés biótico
y los niveles de supresión e inducción en 873 control y genéticamente modificados.
CLAVE GEN 873 CONTROL 873 Ti 873 T4
PV5 Proteína taumatina 8.02 4.29 -19.41
Cabe resaltar que se observó una disminución gradual de la señal de expresión respecto
20 al control y las genéticamente modificadas, donde T4 presentó una supresión de señal, indicando que la planta aun no reconoce totalmente las señales de estrés dado a la modificación genética que presenta en su genoma (figura 27). Las plantas acumulan distintos solutos compatibles, tanto para uso energético como para protección a respuesta a estrés, tal es el caso del mio-inositol clasificado en gen asociado
25 al metabolismo de carbohidratos (tabla 10), que es un azúcar encargada del mantenimiento de la membrana celular y es sintetizado a partir del mio-inositol-1-fosfato
- sintasa; del cual se pudo observar una supresión de la señal de este gen en las plantas de maíz genéticamente modificadas conforme a la presente invención (figura 28).
- 5
- Tabla 10. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de respuesta a estrés biótico y los niveles de supresión e inducción en 873 control y genéticamente modificados.
- CLAVE L1 5
- GEN Mio-inositol-1 -fosfato sintasa 873 CONTROL 18.75 873 T1 o 873 T4 o
- lO 15
- En la tabla 11 y figura 29 se muestran los valores de intensidad de señales obtenidas de proteínas desconocidas o hipotéticas en 873 control y genéticamente modificadas; como se sabe, este tipo de proteínas son proteínas desconocidas de las que no se conoce aún su función e hipotéticamente se les asigna una funcionalidad dependiendo de su secuencia y similitud con otras ya reportadas. Conforme a la presente invención, se detectaron un total 12 proteínas hipotéticas que están involucradas en la respuesta a tolerancia a sequía en maíz y que se han reportado en otras especies del reino vegetal.
- 20
- Tabla 11. Genes clasificados como desconocidos y/o proteínas hipotéticas, al igual que se indican los niveles de supresión e inducción en 873 control y genéticamente modificados. CLAVE GEN 873 CONTROL 873 T1 873 T4
PV1
Proteína hipotética 12.79 -36.27
PV2 Proteína hipotética O -100 77.27 PV1 1 Proteína hipotética -100 O 91 .42 PV1 2 Proteína hipotética -3.82 -91.07 25 PV1 6 Proteína hipotética -4. 13 12.35 -1 8. 101 PV20 Proteína hipotética 0.61 -50.9 -16.1
PV23 Proteína hipotética 4.67 2.58
PV29 Proteína hipotética -43.63 O 91 .93 PV30 Proteína hipotética -15.27 -81.81 72.64 L19 Proteína hipotética O O 75 L26 Proteína hipotética O O 66.66 R4 Proteína hipotética -1 6.66 O 63.63
Conforme a la presente invención, los ensayos de expresión de genes asociados a la respuesta a sequía muestran que las plantas control y genéticamente modificadas despliegan una respuesta diferente. Como se ha reportado, la trehalasa puede ser una molécula multifuncional, primero como osmoprotectora, de ahí la tolerancia a sequía que provee a las plantas y además su capacidad de señalización. Respecto a esta última propiedad, la trehalosa y su versión fosforilada son capaces de inducir una expresión diferencial como lo ha reportado Iturriaga et aL, (2009). Conforme a la presente invención, la identificación de la expresión de algunos de los genes involucrados en la tolerancia a sequía demuestra el carácter cuantitativo de la tolerancia a sequía. Por esta razón, el observar que diversos genes están siendo inducidos apoya la noción de que no solo la trehalosa y/o trehalosa fosfato son suficientes para proveer de tolerancia a estrés abiótico. En este sentido, consideramos que posiblemente el efecto de la acumulación de trehalosa conforme a la presente invención induce la expresión o represión de genes que en su conjunto generan un estado fisiológico de tolerancia a estrés abiótico, en combinación con un aumento de la tasa fotosintética. La capacidad de mantener la autotrofía aun en condiciones de estrés es una propiedad de plantas tolerantes y refleja que la planta todavía tiene un estatus hídrico adecuado para llevar a cabo la fijación de C02.
Referencias.
1 Aguirre-Gomez, J.A., et.al 2000. A regional analysis of maize biological diversity in Southeastern Guanajuato, Mexico. Economic Botany. 54(1):60-72. 2 Allagulova ChR, Gimalov FR, Shakirova FM, Vakhitov VA. 2003. The plant dehydrins: structure and putative functions. Biochemistry (Mosc). 2003 Sep; 68(9): 945-51 . 3 Aylor E.D., et.al. 2005. Sorne physical properties of teosinte (lea mays subsp. parviglumis) pollen. J Exp Bot 56(419): 2401-2407. 4 Baltazar M.B, et.a!. 2001. Maize pollen biology, pollen drift and transgenes. In: Proc 56th Cornand Sorghum Seed Res Conf. Chicago.
5 Baltazar M.B., et.al. 2007. Assessment of potential impact of hybridization between teosinte (lea spp.) and maize (lea mays spp. mays) on dormancy characteristics of teosinte. Gene flow symposium at the North Center.
6 Baltazar M.B., et.al. 2005. Pollination between maize and teosinte: an important determinant of gene flow in Mexico. Theor Appl Genet. 110:519-526.
7 Bassetti P., et.al. 1993a. Emergence, elongation, and senescence of maize silks. Crop Sci. 33:271-275.
8 Bassetti P., et.al. 1993b. Senescence and receptivity of maize silks. Crop Sci. 33:275
278. 9 Benz, B.F. 2001 . Archaeological evidence of teosinte domestication from Guila
Naquitz, Oaxaca. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2104-2106.
10 Bellon M.R., et.al. 1994. Keepers of maize in Chiapas, Mexico. Econ. Bot. 48:196-209.
11 Castillo F (eds) ProcForum: gene flow among maize landraces, improved maize varieties, and teosinte: implications for transgenic maize. CIMMYT, Mexico City, pp 44-53
12 Castillo G.F., et.al. 1997. Research on gene flow between improved land races. In: Serratos J.A., Willcox M.C., Castillo-Gonzalez F. (eds) Proc Forum: gene flow among maize landraces, improved maize varieties, and teosinte: implications for transgenic maize". CIMMYT, El Batan, Mexico, pp 67-72
13 Castro-Gil M. 1970. Frequencies of maize by teosinte crosses in a simulation of a natural association. Maize gen. Coop. Newsletter 44:21-24. Cervantes M.J.E. 1998. Infiltración genética entre variedades locales e introducidas de maíz de sistema tradicional de Cuzalapa, Jalisco. PhD thesis, Colegio de Postgraduados, Montecillo-Texcoco, Edo. De México, México CIMMYT http://www.cimmyt.org/
15 Clegg, J.S. The physical properties and metabolic status of Artemia cysts at low water contents: "The water replacement hypothesis". In Membranes, Metabolism and Dry Organisms; Leopold, A.C., Ed.; Cornell University Press: Ithaca, NY, USA, 1985; pp. 169-187.
16 De la Cruz L. 2007. Sistemas de incompatibilidad genética en maíz y teosinte (Zea spp.) in México.Tesis Doctoral. Universidad de Guadalajara, Zapopan, Jalisco. Enero 30, 2007.
17 Deng, M.Y., et.al. 1999. Molecular Characterization of Roundup Ready Corn Une NK603. Technical Report MSL-16214, Monsanto Company, St. Louis, MO.
18 Di-Giovanni F., et.al. 1991. Factors affecting pollen dynamics and its importance to pollen contamination: a review. Can. J. For. Res. 21:1155-1170. 19 Di-Giovanni F., et.al. 1995. The variability in settling velocities of some pollen and spores. Grana 34:39-44. 20 Doebley, J. F. 1990. Molecular evidence and the evolution of maize. Econ. Bot. 44 (3 supplement): 6-27. 21 Doebley J.F., et.al. 1980. Taxonomy of Zea (Gramineae). 11. A subgeneric c1assification with key to taxa. Amer. J. Botany 67:982-993 22 ElIstrand N.C., et.a\. 2007. Spontaneous hybridization between maize and teosinte. J. of Hered. 98(2):183-187. 23 Eroglu, A; et.a\. 2000. Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved
mammalian cells. Nat. Biotechno\., 18, 163-167.
24 Eubanks M.W. 2001 . The mysterious origin of maize. Econ. Bot. 55:492-514.
25 Evans M.M.S., et.a\. 2001. Teosinte crossing barrier1, a locus governing hybridization of teosinte with maize. Theor. Appl. Genet. 103:259-265.
26 FAO http://www.fao.org/index_es.htm
27 Fink, L.A, et.al. 1983. Expression of bacterial genes in plant cells. Proc Nat Acad Sci U.S.A, 80(15), 4803-07. 28 Fuente AgBios http://www.agbios.coml. 29 Goggi, AS., et.a\. 2006. Statistical analysis of outcrossing between adjacent maize grain production fields, Field Crops research.
30 Gould, F.W. 1968. Grass Systematics. McGraw HiII, N.Y., USA
31 Guadagnuolo R., et.a\. 2006. Relative fitness of transgenic vs. non-transgenic maize x teosinte hybrids: a field evaluation. Ecol. Appl. 16(5):1967-1974. 32 Guo, N.; et.al. 2000. Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells. Nat. Biotech., 18, 168-171. 33 Iturriaga G, Suárez R, Nova-Franco B. 2009. Trehalose metabolism: from osmoprotection to signaling. Int J Mol Sci. 10:3793-810. 34 Jones, J.M., et.a\. 1950. Effectiveness and distance of border rows in preventing outcrossing in corno Oklahoma Agric. Exp. pollen Sta. Tech. Bull. No. T-38. 35 Jugenheimer, R.W. 1976. Maize Improvement, Seed Production, and Uses, John Wiley & Sons, Inc. New York, New York.
36 Kato Y.T.A. 1997. Review of introgression between maize and teosinte. In: Serratos JA, Willcox MC,
37 Kermicle J. 1997. Cross compatibility within the genus Zea. In: Serratos JA, Willcox MC, Castillo F (eds) Proc Forum: Gene flow among maize landraces, improved maize varieties, and teosinte: implications for transgenic maize. CIMMYT, Mexico City, pp 43
38 Kiesselbach, T.A. 1980. The structure and reproduction of corno Re-print of: Research Bulletin No. 161. 1949. Agricultural Experiment Station, Lincoln, Nebraska. University of Nebraska Press. p. 93. 39 Kermicle J .. L. 1997. Tables and pathways, p. 306 in Mutants of Maize, edited by M. G. NEUFFER, E. D. COE and S. R. WESSLER. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
40 Kiesselbach T.A. 1999. The structure and reproduction of corn, 50th anniversary. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
41 Luna V.S., et.al. 2001. Maize pollen longevity and distance isolation requirements for eftective pollen control. Crop Sci 41:1551-1557.
42 Mangelsdorf, P. C., et.al. 1981. The probable origin of annual teosintes. Bussey Inst., Harvard Univ. Publ. 10, 1-69.
43 Martinez-Soriano J.P.R., et.al. 2000. Transgenic maize in Mexico: No need for Concern. Sci. Vo. 278 (5457): 1399.
44 Mondrus-Engle, M. 1981. Tetraploid perennial teosinte seed dormancy and germination. J. of Range Manag. 34(1):59-61.
45 Montalvo-Hernández L, Piedra-Ibarra E, Gómez-Silva L, Lira-Carmona R, AcostaGallegos JA, Vazquez-Medrano J, Xoconostle-Cázares B, Ruíz-Medrano R. 2008. Difterential accumulation of mRNAs in drought-tolerant and susceptible common bean cultivars in response to water deficit. New Phytol. 177:102-13.
46 Nida, D.L., et.al. 1996. Glyphosate-Tolerant Cotton: The Composition of the Cottonseed Is Equivalent to That of Conventional Cottonseed. J. Agric. Food Chem., 44:1967 -1974.
47 Ode J. T., et.al. 1985. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35s promoter. Nature 313, 810-12. 48 OECD. 2002. Consensus document on compositional considerations for new varieties of maize (Zea mays): key food and feed nutrients, anti-nutrients and secondary plant
metabolites. Organisation for Economic Co-operation and Development, Environmental Health and Safety Publications. Paris, France. ENV/JM/MONO(2002)25
49 Puhakainen T, Hess MW, Makela P, Svensson J, Heino P, Palva ET .2004. Overexpression of multiple dehydrin genes enhances tolerance to freezing stress in Arabidopsis. Plant Mol Biol. 2004 Mar;54(5):743-53
50 Purseglove, J.W. (1972). Tropical Crops: Monocotyledons 1. Longman Group Limited., London. Raynor, G.S., Ogden, E.C. & Hayes, J.V. (1972). Dispersion and deposition of corn pollen from experimental sources. Agronomy Journal 64, 420-427.
51 Roser, B.; et.al. 1993. A sweeter way to fresh food. New ScL, 138,25-28. 52 Rossi D. 2009. Maíz tolerante a sequía: el evento esperado. www.engormix.com/MAag ricu Ituralmaizlforos.
53 Watson, L., et.al. 1992. Grass Genera of the World: Descriptions, lIIustrations, Identification, and Information Retrieval; including Synonyms, Morphology, Anatomy, Physiology, Phytochemistry, Cytology, Classification, Pathogens, World and Local Distribution, and References. Version:18th August
54 Watson, S.A. 1982. Maize: Amazing Maize. General Properties. In CRC Handbook of Processing and Utilization in Agriculture, Volume 11: Part 1 Plant Products. Wolff, I.A. Ed.; CRC Press, Inc.: Boca Raton, FL.; pp. 3-29. Watson, S.A. 1987. Structure and composition. In Corn: Chemistry and Technology.
56 Watson, S.A., et.al. Eds.; American Association of Cereal Chemists, Inc.: St. Paul, MN; pp. 53-82. 57 Wilkes H.G. 1967. Teosinte: the closest relative of maize. Bussey Inst. Harvard Univ. 159 p. 58 Wilkes H.G. 1977. Hybridization of maize and teosinte in Mexico and Guatemala and the improvement of maize. Econ Bot 31 :254-293 59 WHO (World Health Organization). 1999. International Program on Chemical Safety (IPCS).
60 Yoon IS, Mori H, Kim JH, Kang BG, Imaseki H. 1997. VR-ACS6 is an auxin-inducible 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene in mungbean (Vigna radiata). Plant Cell Physiol. 1997 Mar;38(3):217-24. 61 1999. http://biodiversity.uno.edu/delta.
Claims (45)
- REIVINDICACIONES1. Un método para seleccionar células vegetales genéticamente transformadas de entre una población de células, sin el uso de genes de selección que codifiquen para la resistencia a antibióticos, herbicidas y/o sustancias tóxicas para la célula, caracterizado por comprender las siguientes etapas:a) introducir a una célula o población de células al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa10 endógena; b) colocar la población de células transformadas y no transformadas en contacto con un medio de cultivo que contenga un agente osmoregulador en cantidad suficiente para que ésta sobreviva; y c) seleccionar en base a la ventaja competitiva al menos una porción de células transformadas genéticamente sobre las células no transformadas, donde dichas células genéticamente transformadas llevan una secuencia nucleotídica que codifica para un inhibidor de la trehalasa dicha secuencia produce un RNA que es complementario a un RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena, en donde el RNA producido por dicha20 secuencia nucleotídica introducida le confiere una ventaja competitiva en el medio de cultivo con el agente osmoregulador.
- 2. El método de acuerdo a la reivindicación 2, donde la secuencia nucleotídica de selección es una secuencia nucleotídica que codifica para una trehalasa, dicha secuencia produce un RNA que es complementario a un RNA producido a partir de25 una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.
-
- 3.
- El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 y 2, donde la secuencia nucleotídica de selección es el gen o una región del gen MSTRE, de SEO ID NO: 18, de la trehalasa de alfalfa (Medicago sativa) y/o una secuencia que codifica para la trehalasa de maíz.
-
- 4.
- El método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia
30 nucleotídica de selección es complementaria, más específicamente, al gen o a una región del gen MSTRE1 , de SEO ID NO: 17, de la trehalasa de alfalfa. - 5. El método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, donde el RNA transcrito a partir de la secuencia nucleotídica de selección es complementaria en forma completao parcialmente al RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.
-
- 6.
- El método de acuerdo a la reivindicación 5, donde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada.
-
- 7.
- El método de acuerdo a la reivindicación 1, dónde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kD de la cucaracha (Perip/aneta americana), para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, la sudatestrina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones, donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida permite a la célula una ventaja competitiva.
-
- 8.
- El método de la reivindicación 1, donde el medio de cultivo comprende un agente osmoregulador seleccionado entre: Polietilenglicol 8000 (PEG8000), manitol, sorbitol, NaCI o cualquier otro agente osmoregulador.
-
- 9.
- El método de la reivindicación 8, donde el medio de cultivo comprende Polietilenglicol 8000 (PEG8000) como agente osmoregulador.
-
- 10.
- El método de la reivindicación 8, donde el medio de cultivo comprende PEG8000 a una concentración del 4 %.
-
- 11.
- El método de las reivindicaciones anteriores, dónde la célula vegetal genéticamente transformada se selecciona de plantas tales como: tomate (Lycopersicum escu/entum L.), mango, durazno, manzana, pera, banana, melón, girasol, tabaco, caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) trigo (Triticum aestivum L), soya (G/ycine max L.), cebada, maíz (Zea mays L.), algodón, papa (So/anum tuberosum L.), zanahoria, lechuga, calabaza, cebolla, entre otras.
-
- 12.
- El método de las reivindicaciones 1-11, dónde la célula seleccionada es una célula vegetal genéticamente transformada que tiene la ventaja competitiva de crecer en un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador por lo que dicha célula es capaz de crecer y sobrevivir en condiciones de sequía.
-
- 13.
- El método de acuerdo a la reivindicación 1, donde la célula o población de células es además transformada con una secuencia nucleotídica de interés.
-
- 14.
- El método de acuerdo a la reivindicación 13, donde la secuencia nucleotídica de interés introducida puede ser una secuencia que codifique para la enzima trehalosa-6fosfato sintasa (TPS), para la enzima trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP), un inhibidor de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP) y/o una secuencia nucleotídica que codifique para la resistencia a toxinas, antibióticos, herbicidas u otros productos de interés biotecnológico.
-
- 15.
- El método de acuerdo la reivindicación 1, donde la transformación de las células vegetales se lleva a cabo mediante una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés Y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.
-
- 16.
- El método de acuerdo a las reivindicación 1 y 15, donde la construcción o vector molecular una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena; una o dos copias de la misma, en un arreglo tal que inhiba la actividad trehalasa endógena, y donde dicha construcción puede comprender elementos adicionales como una secuencia de unión entre las copias de la secuencia introducida sea complementaria a la secuencia del DNA de la trehalasa endógena, como por ejemplo un RNA de interferencia (RNAi).
-
- 17.
- Una célula vegetal genéticamente transformada caracterizada por comprender una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.
-
- 18.
- La célula como se declara en la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, siendo ésta la secuencia del gen de la trehalasa de alfalfa y/o la secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena de maíz, y donde dicha secuencia nucleotídica
introducida produce un RNA que es complementario al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena. -
- 19.
- La célula de acuerdo a la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, preferentemente a la secuencia del gen de la trehalasa de alfalfa MSTRE1, de SEO ID NO: 17.
-
- 20.
- La célula de acuerdo a la reivindicación 19, dónde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada pero produce un RNA que es complementario en forma completa o parcialmente al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena, confiriéndole a la célula transformada una ventaja competitiva en el medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador.
-
- 21.
- La célula según la reivindicación 18, donde la secuencia nucleotídica de selección es el gen o una región del gen MSTRE, de SEO ID NO: 18, de la trehalasa de alfalfa y/o la secuencia nucleotídica o una región del gen de la trehalasa de maíz.
-
- 22.
- La célula según la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kD de la cucaracha (Periplaneta americana) o para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones, donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida permite a la célula una ventaja competitiva.
-
- 23.
- Una planta regenerada a partir de una célula vegetal genéticamente transformada conforme a las reivindicaciones 17-21 , la cual comprende una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.
-
- 24.
- La planta conforme a la reivindicación 22, donde la planta tiene la ventaja competitiva de crecer en un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador por lo que dicha planta es capaz de crecer y sobrevivir en condiciones de sequía y/o frío.
-
- 25.
- Las semillas de una planta conforme a las reivindicaciones 22 y 23.
-
- 26.
- La progenie de una planta conforme a las reivindicaciones 22 y 23.
-
- 27.
- Un vector o construcción molecular para transformar genéticamente una o varias células vegetales, el cual comprende un promotor vegetal operable unido al menos con una secuencia nucleotídica de selección que codifica para un inhibidor de la trehalasa y/o al menos una secuencia nucleotídica de interés.
-
- 28.
- El vector de acuerdo a la reivindicación 27, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, dicha secuencia puede seleccionarse de una secuencia del gen MSTRE, de SEO ID NO: 18, de la trehalasa de alfalfa y/o de la secuencia de ONA que codifica para la trehalasa endógena como por ejemplo una secuencia nucleotídica que codifica para la trehalasa de maíz, y donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida, produce un RNA que es al menos parcialmente complementario al RNA producido por una secuencia de ONA que codifica para la trehalasa endógena.
-
- 29.
- El vector de la reivindicación 28, dónde la secuencia nucleotídica de selección codifica para un inhibidor de la trehalasa, la cuál tiene homología con la secuencia MSTRE1, de SEO ID NO: 17.
-
- 30.
- El vector conforme a la reivindicación 28, dónde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada pero produce un RNA que es complementario en forma completa o parcialmente al RNA producido por una secuencia de ONA que codifica para la trehalasa endógena.
- 31 . El vector conforme a la reivindicación 27, donde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kO de la cucaracha (Periplaneta americana) o para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones.
-
- 32.
- El vector conforme a la reivindicación 27, el cual comprende además una secuencia nucleotídica que codifica genes involucrados a la resistencia a toxinas, antibióticos o herbicidas.
-
- 33.
- El vector de acuerdo a las reivindicaciones 27-31 útil para la transformación de células vegetales, para la selección de células genéticamente transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas y para la producción de plantas genéticamente transformadas.
-
- 34.
- Uso del Polietilenglicol 8000 (PEG 8000) para preparar un medio de cultivo osmoregulado para la selección de células vegetales genéticamente transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas, donde el genoma de las células transformadas comprende al menos una secuencia nucleotídica de selección que comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa.
-
- 35.
- El uso de la reivindicación 33 donde la concentración del Polietilenglicol 8000 es del 4%.
EcoRVPromotor Tre AS PoliA T-gEcoRI EcoRIFIGURA 1Callos embnogemcos de matzSelecctOn de clonas transgentcasde la linea pura 873tolerantes al PEG 8000 al 4%Transforrnacion genetica medianiebiobahsticaePlantas transgenicas en condiciones de invernaderoMazorcas geneticamente modificadas IFIGURA 2Anatists de hibridacion mediante la tecnica del Southern y Blot de lineas transgenicas de maiz tolerantes al PEG 8000Sonda promotor 35S. gene NPTII 1.8 Kb - 11111111.1111111311I lbFIGURA 3
- -
- 950pb
FIGURA 4Datos normalizadosWT H20 93 Ti H20 100T4 H20 95Series'WT SEQ 99Ti SEQ 86 WT Ti 14 WT 11 14 T4 SEQ 76 I-120 H20 H20 SEQ SEQ SEQFIGURA 5FIGURA 12 FIGURA 6FIGURA 7 FIGURA 8FIGURA 9FIGURA 10- 4
- 111111111111111INF--------1 1 I
-
- 4. 4. * — -
- • B73 control
- * B73 T1
- 0est1aweirpteja..4.-—,
- ..s .ir .„ * 4 , -" . -. a So * I 4141 • I Pet, rjr , 1. . a ki I • .... -. ' '" * A.. -- * * * —0-B73 T4 .4.-Criollo negro *Criollo blanco
- 8
- 14 20 26 32 38 44 50 56 62 68 1 96 114 128 InducciOn de sequia Tiempo 143 1.5! (dias)
- FIGURA 11
- II7
- VsT1
- scoulA
- NOSt
- FIGURA 13
7000 60005000 z E 4000 8'4 3000- -
g4 Ac 200087314 1,6,13 y 22 dias873 0:011ROL 87311FIGURA 14 - 0.2
- 0.15
- 0.1a13.•+ 5 —a oz E 0 373 CONTROL B7311 B73T41,6,13 y 22 diasFIGURA 15
- B73 ODNIROL
- B73T1 B7314
- 1,6,13 y22 thas
- FIGURA 16
- 20
- B73 CONTROL
- B73FIGURA 17 T1 873T4 1,6 y 13 dias
400 111111111111111111101111111111F111350 300 250 I200 I150 I100 I50 I.IIII Ell III EIII !!al II III- B 73 CON IRO L
- B73T1
- FIGURA 18
-
- 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
- B73 CONTROL 137311
- FIGURA 19
1,6, 13 y 22 diasI I I II I I IB73T4B73T41,6, 13 y 22 diasr-J12A„=;0, 2ix,— UM3*II ,ABA4 II1FE.,ea4 . ...... - 11.1DO
- 4.otasI IHIG?FIGURA 208 7 6 5 4 3 2 1Ct) 4:bFIGURA 2110 arAir .30 0-Air41111r /'•,7F06B7387314Control 87311FIGURA 221 2FIGURA 23ABCD E ABCDEmomA COE AscoE rABCDEIw. • Ii--.fp... .. ... , to. N iso.cal ,. 21..1. 1a a eta ass .:aMI 14 11.0.1 4eau •.I, I S.4I i esSIs
- 64 .9 4801 OM 1 • $0114 1$“Ii.ISO s9o 9a•Iass us' s0 ' 4. ti
- 649.. .Os1 2 3456FIGURA 24FIGURA 25 FIGURA 26PV5MuestrasFIGURA 27
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
MX2010014428A MX366670B (es) | 2010-12-21 | 2010-12-21 | Método para la selección positiva de células vegetales genéticamente transformadas de maíz y otras especies. |
MX2010014428 | 2010-12-21 | ||
MX2011013595 | 2011-12-15 | ||
MX2011013595A MX350652B (es) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | Metodos para obtener plantas resistentes a sequia. |
PCT/IB2011/055757 WO2012085806A1 (en) | 2010-12-21 | 2011-12-17 | Methods to obtain drought resistant plants |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2461896A2 true ES2461896A2 (es) | 2014-05-21 |
ES2461896R1 ES2461896R1 (es) | 2014-06-02 |
ES2461896B1 ES2461896B1 (es) | 2015-03-18 |
Family
ID=45607776
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES201350005A Active ES2461896B1 (es) | 2010-12-21 | 2011-12-17 | Métodos para obtener plantas resistentes a sequía |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103403168A (es) |
ES (1) | ES2461896B1 (es) |
WO (1) | WO2012085806A1 (es) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103397097B (zh) * | 2013-08-07 | 2014-12-17 | 新疆农垦科学院 | 与小麦抗旱性相关的分子标记及其应用 |
CN105441474B (zh) * | 2014-08-06 | 2019-01-15 | 中国科学院微生物研究所 | 一种受ABA调控的miRNA在提高植物抗旱性中的应用 |
CN105660213A (zh) * | 2015-08-27 | 2016-06-15 | 安徽科技学院 | 一种利用peg-6000鉴定大豆发芽期耐旱性的方法 |
AU2018219173A1 (en) | 2017-02-07 | 2019-08-01 | University Of Kentucky Research Foundation | Method |
CN113151236B (zh) * | 2021-04-20 | 2022-06-28 | 华中农业大学 | 玉米抗旱基因ZmcPGM2及其应用 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0714349B2 (ja) | 1983-01-17 | 1995-02-22 | モンサント カンパニ− | 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子 |
US6174724B1 (en) | 1983-01-17 | 2001-01-16 | Monsanto Company | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
US4727027A (en) | 1983-05-02 | 1988-02-23 | Diamond Scientific Co. | Photochemical decontamination treatment of whole blood or blood components |
GB9304200D0 (en) | 1993-03-02 | 1993-04-21 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
IL116564A0 (en) * | 1995-01-04 | 1996-03-31 | Mogen Int | Process for producing trehalose in plants |
EP0784095A3 (en) * | 1996-01-12 | 1997-12-29 | Mogen International N.V. | Enhanced accummulation of trehalose in plants |
GB9702592D0 (en) | 1997-02-07 | 1997-03-26 | Danisco | Selection method |
US7214858B2 (en) | 1999-03-31 | 2007-05-08 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Plant genes encoding trehalose metabolism enzymes |
US20020137214A1 (en) * | 2001-04-18 | 2002-09-26 | Henry Daniell | Marker free transgenic plants engineering the chloroplast genome without the use of antibiotic selection |
NL1019308C2 (nl) | 2001-11-06 | 2003-05-07 | Stichting Tech Wetenschapp | Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen. |
US6939676B2 (en) * | 2002-12-30 | 2005-09-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Argriculture | Selection procedure for identifying transgenic cells, embryos, and plants without the use of antibiotics |
CN1869240A (zh) * | 2006-05-26 | 2006-11-29 | 上海大学 | 一种提高植物耐盐性能的方法 |
US7994390B2 (en) * | 2006-09-29 | 2011-08-09 | The Chinese University Of Hong Kong | Use of GmRD22-like genes to protect against abiotic stress |
WO2009096900A1 (en) * | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Regeneration and mass propagation of jatropha curcas through somatic embryogenesis |
-
2011
- 2011-12-17 ES ES201350005A patent/ES2461896B1/es active Active
- 2011-12-17 WO PCT/IB2011/055757 patent/WO2012085806A1/en active Application Filing
- 2011-12-17 CN CN2011800650019A patent/CN103403168A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2461896R1 (es) | 2014-06-02 |
ES2461896B1 (es) | 2015-03-18 |
WO2012085806A1 (en) | 2012-06-28 |
CN103403168A (zh) | 2013-11-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2243997T3 (es) | Regulacion del metabolismo por modificacion del nivel de trehalosa-6-fosfato. | |
Wang et al. | Enhanced expression of phospholipase C 1 (ZmPLC1) improves drought tolerance in transgenic maize | |
Yarra et al. | Overexpression of a wheat Na+/H+ antiporter gene (TaNHX2) enhances tolerance to salt stress in transgenic tomato plants (Solanum lycopersicum L.) | |
ES2270869T3 (es) | Plantas transgenicas productoras de fibras, con mayor expresion de sacarosa fosfato sintasa. | |
ES2550364T3 (es) | Plantas que tienen incrementada la tolerancia al estrés térmico | |
Zhang et al. | Enhanced salt tolerance of alfalfa (Medicago sativa) by rstB gene transformation | |
CN101743314A (zh) | 具有增加的胁迫耐受性和产量的转基因植物 | |
US20120042418A1 (en) | Engineering NF-YB Transcription Factors for Enhanced Drought Resistance and Increased Yield in Transgenic Plants | |
CN108368515A (zh) | 耐旱玉米 | |
Hao et al. | Overexpression of AmDUF1517 enhanced tolerance to salinity, drought, and cold stress in transgenic cotton | |
CN107383179A (zh) | 一种与植物耐逆性相关蛋白GsSLAH3及其编码基因与应用 | |
ES2461896A2 (es) | Métodos para obtener plantas resistentes a sequía | |
Habib et al. | Dehydrin responsive HVA1 driven inducible gene expression enhanced salt and drought tolerance in wheat | |
CN101809155A (zh) | 具有增加的胁迫耐受性和产量的转基因植物 | |
ES2376003T3 (es) | Uso de trehalosa-6-fosfato sintasa para modular el crecimiento vegetal. | |
Wu et al. | LcMKK, a novel group A mitogen-activated protein kinase kinase gene in Lycium chinense, confers dehydration and drought tolerance in transgenic tobacco via scavenging ROS and modulating expression of stress-responsive genes | |
CN106591324B (zh) | 谷子SiASR4基因及应用 | |
CN105837671A (zh) | 获自功能型苹果的黄酮醇调控蛋白MsMYB22及其编码基因和应用 | |
ES2820760T3 (es) | Plantas con rendimiento incrementado y método de obtención de dichas plantas | |
CN104945492B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用 | |
CN102449154B (zh) | 植物中用于胁迫耐性的方法和组合物 | |
CN111116721A (zh) | 一种与植物抗逆性相关的转录因子PwNAC30及其编码基因与应用 | |
Ratna Kumar et al. | Adaptation and Mitigation Strategies of Plant under Drought and High‐Temperature Stress | |
MX2011013595A (es) | Metodos para obtener plantas resistentes a sequia. | |
CN104341491B (zh) | 植物耐旱性相关蛋白OsERF62及其编码基因与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NE2A | Request for restoration |
Effective date: 20131212 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2461896 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20150318 |