BR112019020167A2 - Métodos para melhoramento dos traços das plantas - Google Patents
Métodos para melhoramento dos traços das plantas Download PDFInfo
- Publication number
- BR112019020167A2 BR112019020167A2 BR112019020167-0A BR112019020167A BR112019020167A2 BR 112019020167 A2 BR112019020167 A2 BR 112019020167A2 BR 112019020167 A BR112019020167 A BR 112019020167A BR 112019020167 A2 BR112019020167 A2 BR 112019020167A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- seq
- plants
- plant
- fact
- transgene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 250
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 170
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 66
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 500
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 66
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 59
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 59
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 49
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 45
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 44
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 40
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 35
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 28
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 28
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 27
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 claims description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 25
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 claims description 24
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 24
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 claims description 20
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 16
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 16
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 14
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 claims description 14
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 claims description 14
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 claims description 14
- 230000005074 turgor pressure Effects 0.000 claims description 14
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 13
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 claims description 13
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 13
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 11
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 10
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 230000005080 plant death Effects 0.000 claims description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 9
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 claims description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 8
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 7
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 7
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 7
- 244000038559 crop plants Species 0.000 claims description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 7
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 claims description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 7
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 claims description 7
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 claims description 6
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 claims description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 15
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 12
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 11
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000034994 death Effects 0.000 description 8
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 101150092880 DREB1A gene Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 101100166255 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CEP3 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 6
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 101150093335 KIN1 gene Proteins 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 3
- 101150091492 mtlD gene Proteins 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 2
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101100082457 Arabidopsis thaliana PBL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000428 Mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241001414989 Thysanoptera Species 0.000 description 1
- 101100494966 Trypanosoma brucei brucei CRK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000000060 biotrophic pathogen Species 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 235000012762 dietary quality Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000002865 local sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 230000015378 stomatal closure Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
a presente invenção divulga um método de triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta desejável, dito método compreende etapas de: (a) obter material genético a partir de uma amostragem de uma fonte predefinida e (b) construir uma biblioteca de expressão a partir do dito material genético. o método supracitado compreende adicionalmente as etapas de: (c) produzir plantas transformadas com dita biblioteca de expressão em uma eficiência de transformação de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes; (d) realizar triagem para plantas transformadas expressando o dito traço desejável; e (e) identificar dito transgene de ditas plantas transformadas expressando dito traço desejável.
Description
MÉTODOS PARA MELHORAMENTO DOS TRAÇOS DAS PLANTAS
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] O pedido atual contém uma listagem de sequências que foi enviada eletronicamente em ASCII no formato txt. e é incorporada por referência na íntegra. A dita cópia ASCII é nomeada seq.listing 1754-P-01PCT_ST25 e é de 491 KB em tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção geralmente se relaciona com o campo de melhoramento dos traços das plantas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se ao melhoramento traços nas plantas por transformação de bibliotecas de expressão de fontes predefinidas em plantas e triagem para traços desejáveis.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
[0003] Estima-se que a população mundial seja de 9,2 bilhões em 2050. Para alimentar suficientemente esta população, a produção total de alimentos terá de aumentar em 60%-70%. Os modelos climáticos preveem que temperaturas mais quentes e aumentos na frequência e duração da seca durante o presente século terão impacto negativo na produtividade agrícola. Por exemplo, a produção de milho na África pode estar em risco de perdas significativas de rendimento, uma vez que os investigadores preveem que cada grau-dia em que a safra passa acima de 30 °C reduz os rendimentos em 1% se as plantas receberem água suficiente. Estas predições são semelhantes àquelas relatadas para o rendimento de milho nos Estados Unidos. Demonstrou-se adicionalmente que o rendimento de milho na África diminuiu em 1,7% para cada grau-dia em que a safra passou a temperaturas superiores a 30 °C sob seca. A produção de trigo na Rússia diminuiu quase um terço em 2010, em grande parte devido à onda de calor do verão. Similarmente, a produção do trigo declinou significativamente na China e na índia em 2010, pela maior parte
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 7/103
2/83 devido à seca e ao aumento repentino na temperatura respectivamente, causando desse modo a maturidade forçada. Estes novos desafios mundiais requerem uma agricultura integrada mais complexa.
[0004] Além disso, o aquecimento global leva à concorrência de um número de estresses abióticos e bióticos, afetando assim a produtividade agrícola. A ocorrência de estresses abióticos pode alterar as interações planta-pragas, realçando a susceptibilidade da planta hospedeira a organismos patogênicos, insetos e reduzindo a capacidade competitiva com ervas daninhas. Pelo contrário, algumas pragas podem alterar a resposta da planta a fatores de estresse abióticos.
[0005] Fatores de estresse bióticos são causados por patógenos, insetos, pragas, ervas daninhas, ou competição intraespecífica para recursos. A capacidade dos fatores de estresse biótico de causar rendimento ou perda de qualidade depende do meio ambiente e, portanto, pode variar de região para região ou de uma Agroecologia para outra. Por exemplo, na Austrália, as doenças foliares de cevada são alguns dos principais fatores de estresse biótico que causam perdas substanciais de rendimento e qualidade. Embora se saiba que algumas espécies de plantas têm resistência a várias doenças, elas são difíceis ou mesmo impossíveis de se reproduzir em métodos convencionais.
[0006] O desafio é criar safras que sejam resistentes a fatores de estresse bióticos e sejam flexíveis e adaptáveis a diversos ambientes e populações. Existem atualmente duas principais formas aceitáveis de adaptar as safras a novos ambientes: desenvolver novas safras através de reprodução convencional (esforço a longo prazo a partir da domesticação) e introduzir traços alvo em safras existentes através da reprodução de plantas, o que inclui a engenharia genética. Para manter a produtividade face ao aumento da variabilidade climática, tanto a população como as cultivares de plantas precisarão ser continuamente desenvolvidas para resistirem a novos extremos climáticos e outros estresses, como doenças,
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 8/103
3/83 patógenos, insetos, pragas etc. Além disso, há uma necessidade constante de encontrar novos genes de tolerância ou resistência à herbicidas para novos produtos químicos e novos modos de ação herbicidas.
[0007] A engenharia genética tem o potencial de abordar algumas das mais desafiadoras restrições bióticas e abióticas enfrentadas pelos agricultores, que não são facilmente abordadas através da reprodução de plantas convencionais sozinha.
[0008] Resultados vantajosos dessas modificações genéticas incluem aumento da produção de alimentos, confiabilidade e rendimentos; sabor e valor nutricional realçados; e diminuição das perdas devidas a vários estresses bióticos e abióticos, como patógenos fúngicos e bacterianos. Estes objetivos continuam a motivar os criadores modernos e os cientistas alimentares, que procuram novos métodos de modificação genética para identificar, selecionar e analisar organismos individuais que possuem características geneticamente realçadas.
[0009] A opção de transformar plantas com genes estrangeiros e/ou genes da mesma espécie ou gênero, que são difíceis ou impossíveis de reproduzir, supera as barreiras de espécies, tornando possível a exploração de supertraços poderosos que não são atingíveis através de métodos tradicionais. No entanto, as interações moleculares e os resultados dos transgenes introduzidos e dos genes endógenos não são previsíveis.
[0010] Quando os genes que codificam para determinados traços são transferidos, tipicamente de uma espécie de planta a outra, os traços desejados não são sempre expressos a menos que o ambiente interaja com os genes de maneira antecipada desencadeando a resposta desejada, que depende das sequências de regulação inseridas com o gene. Isso significa que novas cultivares transgênicas, desenvolvidas sob condições laboratoriais em um clima controlado, devem ser testadas sob condições de campo, como em métodos de reprodução mais tradicionais,
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 9/103
4/83 portanto, atualmente, há pouca diferença na velocidade com que qualquer método resultará no lançamento de novas cultivares.
[0011] O conhecimento adquirido a partir de pesquisa básica de plantas irá apoiar futuras melhorias de safras, mas mecanismos eficazes para a tradução rápida e eficaz de descobertas de pesquisa em boa agricultura pública continuam a ser desenvolvidos.
[0012] A patente US 6030779 e a patente US 6368798 divulgam um processo para identificar clones com uma atividade enzimática especificada seletivamente isolando o ácido nucleico alvo da população de DNA genômica, por meio do uso de sonda de polinucleotídeo identificando a sequência de ácido nucleico codificando uma enzima com a atividade enzimática especificada; e transformando um hospedeiro com o ácido nucleico alvo isolado para produzir uma biblioteca de clones que são triados para a atividade enzimática especificada.
[0013] A patente US 6972183 divulga um processo para a triagem de uma biblioteca de expressão para identificar clones expressando enzimas tendo uma atividade desejada. O processo envolve gerar a partir de amostras de DNA genômicas de um ou mais microrganismos uma biblioteca de expressão compreendendo uma pluralidade de clones de células recombinantes e, em seguida, introduzir em capilares em uma matriz capilar um substrato e um subconjunto dos clones. A interação do substrato e um clone expressando uma enzima com a atividade desejada produz um sinal opticamente detectável, que pode ser detectado espacialmente para identificar capilares contendo clones produzindo tal sinal. Os clones produtores de sinais podem então ser recuperados dos capilares identificados.
[0014] O pedido de patente EP 1025262 e o pedido de patente US 20020150949 ensinam um processo de identificação de clones com uma atividade de interesse especificada, por (i) geração de bibliotecas de expressão derivadas de ácido nucleico diretamente isolados do ambiente;
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 10/103
5/83 (II) expor as ditas bibliotecas a um substrato particular ou substratos de interesse; e (III) triagem das ditas bibliotecas expostas utilizando um classificador de células ativadas por fluorescência para identificar clones que reagem com o substrato ou substratos.
[0015] O pedido de patente US 20100152051 refere-se a um método para a identificação e/ou caracterização de clones conferindo uma propriedade biológica desejada a partir de uma biblioteca de expressão. O método compreende a etapa de triagem para a expressão de pelo menos um (poli)peptídeo, como uma marca expressa como uma proteína de fusão, juntamente com uma inserção recombinante de um clone da dita biblioteca de expressão. O dito (poli)peptídeo pode ser fundido N-terminalmente ou Cterminalmente a dita inserção. O método compreende adicionalmente as etapas de contatar um ligante que interage especificamente com o (poli)peptídeo expressado pela inserção de um clone que confere a dita propriedade biológica desejada.
[0016] Todos os métodos acima são baseados na triagem de uma biblioteca de DNA (produzida a partir de microrganismos ou de amostra ambiental) para uma sequência específica ou atividade bioquímica por meio da interação com uma sonda predeterminada. Além disso, a triagem e seleção de um clone com a sequência ou atividade predeterminada é realizada antes da transformação em células vegetais e pode ser expressa em células vegetais (culturas de tecidos), mas não em plantas inteiras. Assim, pelos métodos atualizados usados, apenas o clone pré-selecionado é expresso em plantas e a expressão e efeito da sequência selecionada nas plantas é imprevisível. Além disso, nos métodos descritos acima, um pode triar apenas para atividades conhecidas com base no conhecimento prévio. Assim, estes métodos são limitados sob o escopo de atividades enzimáticas conhecidas e famílias enzimáticas e função prévia conhecida.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 11/103
6/83
[0017] Em vista do exposto, há uma necessidade muito sentida de métodos eficientes para triagem e identificação de sequências desconhecidas conferindo traços de melhoramento de plantas desejáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0018] É, portanto, um objetivo da presente invenção divulgar um método de triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta desejável, o método compreendendo as etapas de: (a) obter material genético a partir de uma amostragem de uma fonte predefinida; (b) construir uma biblioteca de expressão a partir do dito material genético; em que o dito método compreende adicionalmente as etapas de: (c) produzir plantas transformadas com a dita biblioteca de expressão em uma eficiência de transformação de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes; (d) realizar triagem para plantas transformadas expressando o dito traço desejável; e (e) identificar dito transgene de ditas plantas transformadas expressando dito traço desejável.
[0019] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido acima, compreendendo adicionalmente uma etapa de editar um gene alvo em uma planta de safra desejável de acordo com a informação genética obtida a partir do dito transgene.
[0020] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita edição do dito gene alvo é realizada usando qualquer sistema de edição de genoma ou método, incluindo sistemas usando nucleases modificadas selecionadas a partir do grupo constituído por: sistema de meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e qualquer combinação dos mesmos.
[0021] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita fonte
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 12/103
7/83 predefinida compreende planta, microbiano, fúngicos ou outros organismos ou partes do mesmo de um nicho ambiental.
[0022] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa de triagem compreende medições das ditas plantas transformadas em comparação com as plantas de controle, ditas medições são selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco de brotos de planta, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, rendimento de flores, rendimento de vagens ou frutos, clorose, danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos.
[0023] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita planta de controle é uma planta do mesmo gênero como dita planta transgênica e falta dito transgene ou uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica, faltando dito transgene e transformada com um gene conhecido conferindo dito traço de melhoramento de planta.
[0024] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa (a) compreende adicionalmente as etapas de enriquecimento do dito material genético pelo crescimento em meios ricos ou em meios seletivos.
[0025] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa (a) compreende adicionalmente as etapas de realçar expressão do dito traço desejável, cultivando dito material genético em meios seletivos para o dito traço desejável.
[0026] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa (b) compreende etapas de produção de biblioteca de cDNA procariótica ou biblioteca de cDNA eucariótica ou ambas.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 13/103
8/83
[0027] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa (b) compreende adicionalmente etapas de clonagem da dita biblioteca de cDNA em pelo menos um vetor binário.
[0028] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito vetor binário compreende um promotor constitutivo ou um promotor induzido por estresse.
[0029] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, o dito vetor binário compreende marcador de seleção bacteriana e marcador de seleção de transformação de plantas.
[0030] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de transformar ditos vetores binários clonados em células hospedeiras.
[0031] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima compreendendo adicionalmente etapas de transformar ditos vetores binários clonados em Agrobacterium tumefaciens.
[0032] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima compreendendo adicionalmente etapas de introduzir a dita Agrobacterium tumefaciens transformada em pelo menos um dentre: planta inteira, tecido vegetal e célula vegetal.
[0033] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo etapas de introduzir a dita Agrobacterium tumefaciens transformada pulverizando ditas plantas com um inóculo que compreende Agrobacterium transformada.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 14/103
9/83
[0034] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que dita etapa (d) compreende cultivar ditas plantas transformadas sob condições seletivas para dito traço desejável.
[0035] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de: (f) coletar sementes T1 a partir das ditas plantas transformadas da etapa (d); (g) determinar a eficiência da transformação da biblioteca de sementes das ditas sementes T1; (h) semear as ditas sementes T1 da etapa (e) sob condições seletivas permitindo a triagem e a seleção das plantas transformadas que expressam o dito traço desejável; (i) testar ditas plantas selecionadas expressando o dito traço desejável da etapa (g) para a presença do dito transgene; e (j) isolar e sequenciar o dito transgene de ditas plantas transformadas selecionadas positivamente testadas para o dito transgene da etapa (h).
[0036] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de (k) coletar sementes T2 das ditas plantas de (h), que são positivas para a presença do dito transgene; (I) cultivar plantas das ditas sementes T2 sob condições seletivas permitindo a triagem e a seleção de plantas transformadas expressando o dito traço desejável em comparação com as plantas de controle transformadas com genes conhecidos conferindo o dito traço desejável; e (m) opcionalmente, isolar e sequenciar o dito transgene das ditas plantas selecionadas da etapa (j).
[0037] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo etapas de (a) reclonar e sequenciar dito transgene isolado da etapa (i) e/ou (I); (b) transformar o dito transgene reclonado em plantas; (c) realizar triagem das ditas plantas transformadas da etapa (b) para seleção de plantas transformadas expressando o dito traço desejável; (d) isolar o dito
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 15/103
10/83 transgene das ditas plantas selecionadas da etapa (c); e (e) opcionalmente, repetir as etapas (a) a (d).
[0038] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito nicho ambiental compreende nicho ecológico, populações, habitats, pools de genes, cultura procariótica, cultura eucariótica e qualquer combinação dos mesmos.
[0039] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito nicho ambiental compreende microbioma, microbiota, cultura microbiana, planta, levedura, algas, nematódeos ou qualquer outro organismo ou combinações dos mesmos.
[0040] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito nicho ambiental compreende fatores bióticos predefinidos, fatores abióticos e uma combinação dos mesmos.
[0041] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita amostragem compreende amostra do solo, amostra da água, amostra da matéria orgânica e qualquer combinação dos mesmos.
[0042] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito traço desejável é selecionado a partir do grupo que consiste na resistência ou na tolerância a pelo menos um estresse biótico, resistência ou tolerância a pelo menos um estresse abiótico, rendimento melhorado, biomassa melhorada, qualidades e valores alimentares melhorados, rendimento de grãos melhorado, resistência ou tolerância à herbicidas ou químicos e qualquer combinação dos mesmos.
[0043] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito estresse
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 16/103
11/83 abiótico é selecionado a partir do grupo constituído por: seca, salinidade, calor, frio, absorção de fertilizantes, eficiência do uso de fertilizantes e qualquer combinação dos mesmos.
[0044] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito estresse biótico é selecionado a partir do grupo constituído por: doenças de plantas, patógenos, bactérias, vírus, fungos, parasitas, insetos benéficos e prejudiciais, ervas daninhas, plantas cultivadas ou nativas ou qualquer combinação dos mesmos.
[0045] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que dita etapa (a) compreende etapas de extrair o RNA da dita amostragem do dito nicho ambiental predefinido.
[0046] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita extração de RNA é executada de acordo com kits comerciais padrão ou de acordo com qualquer outro protocolo para a extração de RNA da amostragem ambiental.
[0047] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito protocolo para extração de RNA da amostragem ambiental compreende as etapas de: (a) obter uma amostra de solo; (b) misturar a dita amostra de solo com um tampão de extração compreendendo 500mM de tampão fosfato pH 8 e 5% p/v brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) com fenol (pH 8)/clorofórmio/IAA razão de 25:24:1; (c) sujeitar a dita mistura à etapa (b) a 15 minutos de agitação a 37 QC ou a um disruptor de células por 1 minuto; (d) centrifugar a dita mistura da etapa (c) em 2.500 g por cerca de 10 minutos à temperatura ambiente para obter uma fase aquosa; (e) transferir a dita fase aquosa para um novo tubo; (f) acrescentar à dita fase aquosa dentro do dito tubo da etapa (e) uma quantidade igual de iso-propanol
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 17/103
12/83 suplementado com 20 mg/ml de solução de cristal violeta para obter solução colorida de violeta; (g) misturar a dita solução invertendo o dito tubo da etapa (f) e então incubando dito tubo por cerca de 30 minutos na temperatura ambiente; (h) centrifugar o dito tubo da etapa (g) em 2.500g por aproximadamente 30 minutos na temperatura ambiente para obter uma camada colorida de violeta; (i) transferir dita camada colorida de violeta em um novo tubo e centrifugar o dito tubo por cerca de 5 min na velocidade máxima para obter pelete e sobrenadante; (j) lavar o dito pelete com 80% v/v etanol gelado e centrifugar por 5 min adicionais para obter pelete e sobrenadante; (k) remover dito sobrenadante da etapa (j) e permitir que o dito pelete seque; e (I) suspender dito pelete seca em água em uma razão de 100 pl de água para 2gr de solo da etapa (a).
[0048] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma planta compreendendo dito transgene identificado pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[0049] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar a planta como definida acima, em que a dita planta tem pelo menos um traço de melhoramento de planta em comparação com uma planta do mesmo gênero faltando o dito transgene.
[0050] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polinucleotídeo obtível pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[0051] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o polinucleotídeo como definido em qualquer um dos acima, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-148 e qualquer combinação da mesma.
[0052] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polinucleotídeo que tem pelo menos 80% de similaridade
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 18/103
13/83 de sequência com a sequência de polinucleotídeo como definida em qualquer um dos acima.
[0053] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polipeptideo obtível pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[0054] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar a sequência de polipeptideo como definida em qualquer um dos acima, em que o dito polipeptideo compreende uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polipeptideo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 149-321 e qualquer combinação da mesma.
[0055] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polipeptideo que tem pelo menos 60% de similaridade de sequência com a sequência de polipeptideo como definida em qualquer um dos acima.
[0056] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o uso do método como definido em qualquer um acima para identificar genes conferindo traços de melhoramento de planta selecionados a partir do grupo que consiste na resistência ou na tolerância a estresse abiótico, resistência ou tolerância a estresse biótico, rendimento melhorado, biomassa melhorada, qualidades e valores alimentares melhorados, rendimento de grãos melhorado, resistência ou tolerância à herbicidas ou químicos e qualquer combinação dos mesmos.
[0057] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o uso como definido em qualquer um dos acima, em que o dito estresse abiótico é selecionado a partir do grupo constituído por: seca, salinidade, calor, frio, absorção de fertilizantes, eficiência do uso de fertilizantes e qualquer combinação dos mesmos.
[0058] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o uso como definido em qualquer um dos acima, em que o dito estresse
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 19/103
14/83 biótico é selecionado a partir do grupo constituído por: doenças de plantas, patógenos, bactérias, vírus, fungos, parasitas, insetos benéficos e prejudiciais, ervas daninhas, plantas cultivadas ou nativas ou qualquer combinação dos mesmos.
[0059] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar um método para triagem e identificação de um traço de melhoramento de resistência ou tolerância à seca ou salinidade em plantas, dito método compreende etapas de: (a) obter material genético derivado de uma amostra de fonte de baixa umidade ou de salinidade elevada; (b) construir biblioteca de expressão a partir do dito material genético; em que o dito método compreende adicionalmente as etapas de: (c) produzir plantas transformadas com a dita biblioteca de expressão em uma eficiência de transformação de pelo menos 0,5%-30%, representando pelo menos 1021O10 transgenes; (d) realizar triagem para plantas transformadas resistentes ou tolerantes a condições predeterminadas de seca ou salinidade; e (e) identificar o dito transgene das ditas plantas transformadas resistentes ou tolerantes à seca ou à salinidade da etapa (d).
[0060] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente uma etapa de editar um gene alvo em uma planta de safra desejável de acordo com a informação genética obtida a partir do dito transgene.
[0061] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita edição do dito gene alvo é realizada usando qualquer sistema de edição de genoma ou método, incluindo sistemas usando nucleases modificadas selecionadas a partir do grupo constituído por: sistema de meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e qualquer combinação dos mesmos.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 20/103
15/83
[0062] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita fonte predefinida compreende planta, microbiano, fúngicos ou outros organismos ou partes do mesmo de um nicho ambiental.
[0063] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa de triagem compreende medições das ditas plantas transformadas em comparação com as plantas de controle, ditas medições são selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco de brotos de planta, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, rendimento de flores, rendimento de vagens ou frutos, clorose, danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos.
[0064] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita planta de controle é uma planta do mesmo gênero como dita planta transgênica e falta dito transgene ou uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica, faltando dito transgene e transformada com um gene conhecido conferindo dito traço de melhoramento de planta.
[0065] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa (b) compreende adicionalmente etapas de clonagem da dita biblioteca de expressão em pelo menos um vetor binário.
[0066] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de: (f) coletar sementes T1 das ditas plantas transformadas da etapa (c); (g) semear ditas sementes T1 em solo seletivo para plantas transformadas, com teor de água de cerca de 100% de capacidade; (h) cultivar plantas das ditas sementes T1 em condições de seca ou salinidade e/ou sem irrigação até a maioria das plantas morrerem,
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 21/103
16/83 para produzir plantas transformadas que sobrevivem às ditas condições de seca ou salinidade; (i) cultivar ditas plantas transformadas que sobrevivem à seca ou salinidade para produzir sementes T2; (j)realizar triagem das ditas plantas transformadas que sobrevivem à seca ou salinidade da etapa (i) para presença de um transgene; e (k) isolar e sequenciar dito transgene de plantas tríadas positivamente da etapa (j);
[0067] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de (I) coletar sementes T2 de cada uma das ditas plantas transformadas que sobrevivem à seca ou salinidade tríadas positivamente contendo transgene da etapa (j); (m) cultivar plantas T2 de cada uma das ditas sementes T2 contendo transgene da etapa (I) sob condições predeterminadas de seca ou salinidade, em comparação com as plantas de controle do mesmo gênero e a que faltam o dito transgene ou transformadas com genes conhecidos conferindo tolerância à seca ou à salinidade ou resistência à seca ou à salinidade; (n) realizar medições de triagem de tolerância ou resistência à seca para cada das ditas plantas T2 contendo transgene em comparação com as ditas plantas de controle, ditas medições são selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, produção de flores e vagens, clorose e danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos; (o) isolar o transgene das ditas plantas T2 que realizam resistência à seca ou salinidade tríadas da etapa (n); (p) opcionalmente, reclonar dito transgene em um vetor binário; (q) opcionalmente, transformar dito vetor binário clonado em plantas e cultivar ditas plantas transformadas sob condições predeterminadas de seca ou salinidade; e (r) opcionalmente, repetir as etapas (I) a (q).
[0068] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que dita etapa do
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 22/103
17/83 cultivo de plantas T2 compreende etapas de: (a) semear ditas sementes T2 em solo seletivo para plantas transformadas, com teor de água de cerca de 100% de capacidade; e (b)b) irrigar ditas plantas quando o teor de água no solo alcança cerca de 5-10%.
[0069] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que ditas condições predeterminadas de seca ou de salinidade são selecionadas a partir do grupo que consiste de baixa umidade, alta salinidade, solo seco e calor.
[0070] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polinucleotídeo obtível pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[0071] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o polinucleotídeo como definido em qualquer um dos acima, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a SEQ ID NO:148 e qualquer combinação da mesma.
[0072] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polinucleotídeo que tem pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de polinucleotídeo como definida em qualquer um dos acima.
[0073] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polipeptideo obtível pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[0074] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar a sequência de polipeptideo como definida em qualquer um dos acima, compreende uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polipeptideo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID Nos: 149-321 e qualquer combinação dos mesmos.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 23/103
18/83
[0075] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos 60% de similaridade de sequência com a sequência de polipeptídeo como definida em qualquer um dos acima.
[0076] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar um método para extração de RNA a partir de uma amostra de solo compreendendo etapas de: (a) obter uma amostra de solo; (b) misturar a dita amostra de solo com um tampão de extração compreendendo 500mM de tampão fosfato pH 8 e 5% p/v brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) com fenol (pH 8)/clorofórmio/IAA razão de 25:24:1; (c) sujeitar a dita mistura à etapa (b) a 15 minutos de agitação a 37 QC ou a um disruptor de células por 1 minuto; (d) centrifugar a dita mistura da etapa (c) em 2.500 g por cerca de 10 minutos à temperatura ambiente para obter uma fase aquosa; (e) transferir a dita fase aquosa para um novo tubo; (f) acrescentar à dita fase aquosa dentro do dito tubo da etapa (e) uma quantidade igual de isopropanol suplementado com 20 mg/ml de solução de cristal violeta para obter solução colorida de violeta; (g) misturar a dita solução invertendo o dito tubo da etapa (f) e então incubando dito tubo por cerca de 30 minutos na temperatura ambiente; (h) centrifugar o dito tubo da etapa (g) em 2.500g por aproximadamente 30 minutos na temperatura ambiente para obter uma camada colorida de violeta; (i) transferir dita camada colorida de violeta em um novo tubo e centrifugar o dito tubo por cerca de 5 min na velocidade máxima para obter pelete e sobrenadante; (j) lavar o dito pelete com 80% v/v etanol gelado e centrifugar por 5 min adicionais para obter pelete e sobrenadante; (k) remover dito sobrenadante da etapa (j) e permitir que o dito pelete seque; e (I) suspender dito pelete seca em água em uma razão de 100 μΙ de água para 2gr de solo da etapa (a).
[0077] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar um método de para triagem e identificação de uma planta desejável melhorando o traço, dito método compreende etapas de: (a) obter uma
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 24/103
19/83 amostragem de uma fonte predefinida; (b) extrair RNA da dita amostragem de acordo com o método de reivindicação 60; (c) construindo uma biblioteca de expressão a partir do referido RNA da etapa (b); em que o dito método compreende adicionalmente as etapas de: (d)produzir plantas transformadas com a dita biblioteca de expressão em uma eficiência de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes; (e) realizar triagem das plantas transformadas expressando dito traço desejável; e (f) identificar dito transgene de ditas plantas transformadas expressando dito traço desejável.
[0078] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente uma etapa de editar um gene alvo em uma planta de safra desejável de acordo com a informação genética obtida a partir do dito transgene.
[0079] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima , em que a dita edição do dito gene alvo é realizada usando qualquer sistema de edição de genoma ou método, incluindo sistemas usando nucleases modificadas selecionadas a partir do grupo constituído por: sistema de meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e qualquer combinação dos mesmos.
[0080] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita fonte predefinida compreende planta, microbiano, fúngicos ou outros organismos ou partes do mesmo de um nicho ambiental.
[0081] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita etapa de triagem compreende medições das ditas plantas transformadas em comparação com as plantas de controle, ditas medições são selecionadas a
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 25/103
20/83 partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco de brotos de planta, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, rendimento de flores, rendimento de vagens ou frutos, clorose, danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos.
[0082] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a dita planta de controle é uma planta do mesmo gênero como dita planta transgênica e faltando dito transgene ou uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica, faltando dito transgene e transformada com um gene conhecido conferindo dito traço de melhoramento de planta.
[0083] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar um polinucleotídeo isolado com pelo menos 80% de similaridade de sequência com uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 1 a SEQ ID NO: 148 e qualquer combinação dos mesmos.
[0084] É um objetivo adicional da presente invenção divulgar um polipeptídeo isolado que tem pelo menos 60% de similaridade de sequência com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo constituído por SEQ. ID Nos: 149-321 e qualquer combinação dos mesmos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0085] A fim de compreender a invenção e ver como ela pode ser implementada na prática, várias modalidades serão agora descritas, por meio de um exemplo não limitante, com referência ao desenho que acompanha, no qual:
[0086] Figs. 1A-D apresentam ilustrações esquemática de vetores binários usados para a inserção de clones amplificados de cDNA entre o promotor(es) (35S, CBF3, Erd10 e Kin1) e o terminador HSP. Fig. 1A ilustra o vetor pPA-35H, que tem um promotor de CaMV 35S constitutivo. Figs. 1B-D apresentam vetores que contêm promotores
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 26/103
21/83 induzidos por estresse de Arabidopsis thaliana: pPA-CH com promotor CBF3 (Fig. 1B), pPA-EH com promotor Erd10 (Fig. 1C) e pPA-KH com promotor Kin1 (Fig. 1 D)
[0087] Fig. 2 apresenta uma ilustração fotográfica da biblioteca de agrobacterium contando para 3 bibliotecas diferentes em pratos petri LB;
[0088] Fig. 3 apresenta uma ilustração fotográfica da cultura do tecido de tabaco transformada com uma biblioteca, 7 dias após a transformação (Fig. 3A), 40 dias após a transformação (Fig. 3B) e 6-8 semanas após a transformação (Fig. 3C);
[0089] Fig. 4 apresenta uma ilustração fotográfica demonstrando a seleção para a resistência à fosfinotricina de Arabidopsis de 10 dias de idade expressando mudas de biblioteca. As plantas verdes são resistentes a fosfinotricina enquanto as plantas amarelas pequenas são ausentes do transgene e, portanto, suscetíveis;
[0090] Fig. 5 apresenta uma ilustração fotográfica de experimentos T2 e T3 controlados na estufa;
[0091] Fig. 6 apresenta resultados fotográficos de triagem para a resistência de plantas transgênicas à seca;
[0092] Fig. 7 apresenta uma ilustração gráfica demonstrando perda da pressão de turgor em plantas expressando genes usados como controle em relação ao conteúdo de água do solo (cinza escuro), dias após a cessação da irrigação;
[0093] Fig. 8 apresenta uma ilustração gráfica mostrando a escala de morte normalizada das plantas transgênicas expressando controle positivo em comparação com plantas expressando GFP;
[0094] Fig. 9 mostra graficamente os resultados de vários genes de resistência à seca identificados pelo método da presente invenção; e
[0095] Fig. 10 mostra graficamente a análise da área foliar de várias linhagens de plantas transgênicas expressando genes novos
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 27/103
22/83 identificados conferindo resistência à seca após a reclonagem em comparação aos controles positivos e negativos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS
[0096] A seguinte descrição é provida, juntamente com todos os capítulos da presente invenção, de modo que para permitir que qualquer pessoa versada na técnica faça uso da invenção e estabeleça os melhores modos contemplados pelo inventor da realização desta invenção. Várias modificações, no entanto, continuarão a ser aparentes para aqueles versados na técnica, uma vez que os princípios genéricos da presente invenção foram definidos especificamente para prover meios e métodos para triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta desejável.
[0097] Sabe-se que algumas espécies de plantas têm resistência a várias doenças. No entanto, tais espécies são geralmente difíceis ou impossíveis de se reproduzir em técnicas e métodos convencionais.
[0098] A presente invenção provê um método e plataforma para descobrir e identificar genes a partir de plantas que têm características únicas e valiosas, tais como resistência à doença, resistência ou tolerância ao estresse abiótico, qualidades alimentares melhoradas (por exemplo, óleos melhorados, teor de proteína, aminoácidos, vitaminas etc.) e, então, para inseri-los ou expressá-los em safras desejadas através de edição genética ou outra técnica de transformação.
[0099] É, portanto, dentro do escopo da presente invenção introduzir traços alvo em safras existentes através da reprodução de plantas, o que inclui a engenharia genética e edição de gene (genoma).
[00100] A presente invenção provê um novo método para triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta desejável. O método compreende etapas de: (a) obter material genético a partir de uma amostragem de um nicho ambiental predefinido ou material genético
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 28/103
23/83 extraído de outras fontes, como plantas do mesmo ou de outro gênero; e (b) construir uma biblioteca de expressão a partir do dito material genético. De acordo com aspectos centrais, a presente invenção compreende adicionalmente as etapas de: (c) produzir plantas transformadas com dita biblioteca de expressão em uma eficiência de transformação de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 1O2-1O10 transgenes; (d) realizar triagem para plantas transformadas expressando o dito traço desejável; e (e) identificar dito transgene de ditas plantas transformadas expressando dito traço desejável.
[00101] A presente invenção provê pela primeira vez um método de triagem e seleção de sequências desconhecidas derivadas de fontes predefinidas (por exemplo, nichos ecológicos e/ou plantas) que conferem traços melhorados em plantas de safra valiosas. O método atual é eficaz e vantajoso sobre os métodos comuns e convencionais de triagem pelos seguintes aspectos:
[00102] 1. Uma biblioteca da expressão é preparada a partir do material genético ou do pool genético (isto é, RNA) que se origina a partir das fontes predefinidas, tais como o ambiente extremo, o material de planta e outro. Desta forma, apenas genes que são expressos nas condições ambientais pré-selecionadas são usados para o procedimento de triagem em plantas.
[00103] 2. Toda a biblioteca de expressão é transformada em plantas com uma eficiência de 0,05%-30% e representação de pelo menos 102-1010 transgenes únicos.
[00104] 3. No método da presente invenção, a triagem da biblioteca expressa para o fenótipo desejável é realizada no organismo alvo, que é a planta. Desta maneira não há nenhuma pré-seleção e os genes novos e únicos para o fenótipo desejado, que são expressíveis nas plantas, são revelados.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 29/103
24/83
[00105] Nos métodos convencionais, a primeira etapa é selecionar genes para um traço predefinido em um material genético fonte, por exemplo, através de sondagem de uma biblioteca de DNA com sequências conhecidas em células procarióticas ou eucarióticas, e somente então o gene pré-selecionado é expresso em plantas. O resultado de um método tão convencional é limitado e tem as seguintes desvantagens:
[00106] 1. A triagem é realizada em uma célula hospedeira/organismo que não é o organismo alvo (geralmente em organismo procariótico ou unicelular).
[00107] 2. A triagem é limitada, uma vez que é realizada com sequências ou sondas ou atividade conhecidas. Demonstrou-se que os métodos de triagem funcionais requerem níveis detectáveis de atividade enzimática que não podem ser sempre alcançados, por exemplo, apenas cerca de 40% das atividades enzimáticas são susceptíveis de serem detectadas em sistemas de expressão baseados em E. coli (Gabor et al., 2004). Além disso, é apontado neste documento que, apesar das técnicas avançadas de sequenciamento disponíveis, -35-60% dos genes de codificação de proteínas totais exibem similaridades elevadas com proteínas hipotéticas, proteínas previstas ou proteína de função desconhecida (Culligan, et al., 2014; Venter, et al., 2004).
[00108] 3. Somente o clone pré-selecionado é transformado em plantas.
[00109] 4. A expressão e o efeito de um clone pré-selecionado na planta alvo é imprevisível.
[00110] Para as razões mencionadas acima, o método novo da presente invenção de triagem de plantas transformadas com uma biblioteca da expressão para um fenótipo desejável é vantajoso.
[00111] É reconhecido neste documento que a seca e a salinidade são consideradas como dois estresses abióticos que têm efeitos importantes no crescimento e desenvolvimento das plantas.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 30/103
25/83
[00112] No que diz respeito à seca, é considerado o estresse ambiental mais devastador, que diminui o crescimento e a produtividade das safras. A seca afeta severamente o crescimento e o desenvolvimento das plantas com reduções substanciais na taxa de crescimento e acumulação de biomassa. As principais consequências da seca nas plantas são a redução da taxa de divisão celular e expansão, tamanho das folhas, alongamento da haste e proliferação radicular, e oscilações estomáticas perturbadas, e eficiência no uso da água (WUE) (Farooq et al. 2009). Este fenômeno envolve eventos genéticos, fisiológicos e ambientais e suas interações complexas. A taxa e a quantidade de crescimento da planta dependem desses eventos, que são afetados pelo déficit de água. O crescimento celular é um dos processos fisiológicos mais sensíveis à seca devido à redução da pressão de turgor e da disponibilidade de água (Taiz e Zeiger, 2006). Sob deficiências da água, o alongamento celular de plantas mais elevadas pode ser inibido pela interrupção do fluxo de água do xilema às células alongadas circundantes. A mitose prejudicada, alongamento celular reduzido e a resultado de expansão em altura de planta reduzida, área foliar e crescimento da safra (Nonami, 1998).
[00113] A salinidade também é considerada um dos principais fatores abióticos severos que afetam o crescimento da safra e a produtividade. Durante o estresse salino, todos os principais processos como fotossíntese, síntese de proteína e metabolismo energético e lipídico são afetados (Parida & Das, 2005). Durante a exposição inicial à salinidade, as plantas experimentam o estresse de água, que por sua vez reduz a expansão foliar. Os efeitos osmóticos do estresse de salinidade podem ser observados imediatamente após a aplicação de sal e acredita-se que continuam pela duração da exposição, resultando em inibição da expansão celular e divisão celular, bem como o fechamento estomático. Durante a exposição a longo prazo à salinidade, as plantas experimentam o estresse iônico, que pode levar à senescência prematura de folhas adultas, e assim
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 31/103
26/83 a uma redução na área fotossintética disponível para suportar o crescimento continuado. Na verdade, o excesso de sódio e, mais importante, cloreto tem o potencial de afetar negativamente as enzimas das plantas, resultando em redução da produção de energia e outras alterações fisiológicas. Reconhece-se adicionalmente que o estresse iônico resulta em senescência prematura de folhas mais velhas e em sintomas de toxicidade (clorose, necrose) em folhas maduras. Sem querer ser vinculado pela teoria, os íons ricos em sódio afetam as plantas, interrompendo a síntese de proteína e interferindo com a atividade enzimática (Carillo et al., 2011).
[00114] A presente invenção provê um método para a triagem eficiente para novos genes conferindo resistência ou tolerância à seca e/ou à salinidade melhorada em plantas e, especialmente, em safras valiosas.
[00115] O método da presente invenção supera as desvantagens acima, usando o material genético expresso (como RNA ou mRNA) que representa os genes que estão sendo expressos em organismos selecionados, por exemplo, como resultado de condições ambientais (como seca ou alto sal), e produzindo uma biblioteca de cDNA que represente o status da meta-expressão ou do metatranscriptoma de um determinado nicho biológico ou de outra fonte genética. A biblioteca de cDNA inteira é então transformada em plantas e expressa e tríada para o fenótipo desejável nas plantas.
[00116] Um aspecto central da presente invenção é que uma biblioteca de expressão é produzida a partir de várias fontes (incluindo plantas) e ambientes. A biblioteca de expressão é transformada em plantas, que é o organismo alvo, a fim de melhorar seus traços ou funções. A biblioteca de expressão de planta é então tríada para o traço desejável, como resistência ou tolerância ao sal ou à seca, produção de biomassa e rendimento melhorados, estresses bióticos (doenças e patógenos) resistência ou tolerância, valor nutricional melhorado ou utilização de fertilizantes melhorada.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 32/103
27/83
[00117] É reconhecido neste documento que os ambientes (como solos) em que as plantas crescem são habitados por comunidades microbianas, por exemplo, um grama de solo contém cerca de 107-109 células microbianas (estimativas do número de espécies de bactérias por grama do solo variam entre 2000 e 8,3 milhões, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2970868/) que compreendem aproximadamente um gigabase de informação da sequência, ou mais. As comunidades microbianas que habitam ambientes em que as plantas crescem (como solos) são complexas e permanecem mal compreendidas apesar de sua importância econômica. Tais consórcios microbianos proveem o ecossistema necessário para o crescimento das plantas, incluindo a fixação de nitrogênio atmosférico, ciclagem de nutrientes, supressão de doenças e sequestro de ferro e outros metais.
[00118] Está dentro do escopo da presente invenção usar abordagens metagenômicas e metatranscriptômicas funcionais para explorar novos genes que conferem traços melhorados às plantas.
[00119] A referência é agora feita para abordagens metagenômicas, empregadas pela presente invenção de acordo com alguns aspectos. Metagenômica é o estudo do material genético derivado a partir de amostras ambientais. Refere-se geralmente como genômica ambiental, eco-genômica ou genômica comunitária. Enquanto a microbiologia tradicional e sequenciamento de genoma microbial e a genômica dependem de culturas clonais cultivadas, do sequenciamento genético do gene ambiental clonou genes específicos para produzir um perfil de diversidade em uma amostra natural. Em alguns aspectos, a metagenômica usa o estudo dos genomas em uma comunidade microbiana para constituir a primeira etapa para o estudo do microbioma. Seu principal objetivo é inferir o perfil taxonômico de uma comunidade microbiana. O sequenciamento de metagenoma completo (WMS) provê dados sobre o perfil funcional de uma comunidade microbiana. Tal trabalho revelou que a
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 33/103
28/83 grande maioria da biodiversidade microbiana tinha sido perdida por métodos baseados em cultivo. Na verdade, estima-se que mais de 99% de todos os microrganismos em quase todos os ambientes na terra não podem ser cultivados em laboratório.
[00120] Metagenômica é neste documento também se refere a metatranscriptômica, que estuda e correlaciona os transcriptomas de um grupo de organismos ou espécies interagindo. Metatranscriptomicina envolve sequenciamento de (meta)transcriptoma completo da comunidade microbiana. Em alguns aspectos, metatranscriptômica informa os genes que são expressos pela comunidade como um todo. Com o uso de anotações funcionais de genes expressos, é possível inferir o perfil funcional de uma comunidade sob condições específicas, que são geralmente dependentes dos status do hospedeiro. Enquanto a metagenômica provê dados sobre a composição de uma comunidade microbiana sob diferentes condições, a metatrascriptômica provê dados sobre os genes que são expressos coletivamente sob diferentes condições. Metatranscriptômica envolve a criação de perfis de expressão gênica em toda a comunidade (RNA-seq). Em aspectos específicos, metatranscriptomicina descreve os genes que são expressos em um ambiente microbiano específico. Assim, metatranscriptômica é o estudo da função e atividade do conjunto completo de transcrições (RNA-seq) a partir de amostras ambientais.
[00121] Observa-se que a expressão gênica é distribuída como log, por exemplo, 100 principais genes de maior expressão pode cobrir até 30% de todas as transcrições. Mesmo um único gene pode cobrir até 10%. Assim, uma profundidade de sequenciamento muito alta é necessária para ver também os genes expressos mais baixos.
[00122] Usando métodos tais como o shotgun ou o sequenciamento dirigido por PCR, as amostras pela maior parte imparciais dos genes dos membros de comunidades amostradas podem ser obtidas. É
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 34/103
29/83 reconhecido neste documento que as abordagens metagenômicas proveem uma ferramenta poderosa para a utilização da ecologia microbiana para melhorar os traços em plantas, por exemplo, mecanismos biológicos que podem ser aproveitados para a agricultura e traços de plantas melhorados.
[00123] Conforme usado neste documento, o termo cerca de denota ± 25% da quantidade ou medida ou valor definido.
[00124] Conforme usado neste documento, o termo similar denota uma correspondência ou faixa de semelhança de cerca de ± 20%, particularmente ± 15%, mais particularmente sobre ± 10% e ainda mais particularmente sobre ± 5%.
[00125] Conforme usado neste documento, o termo média refere-se ao valor médio obtido medindo um parâmetro predeterminado em cada planta de uma certa população de planta e calculando o valor médio de acordo com o número de plantas da dita população.
[00126] Conforme usado nesta especificação e as reivindicações anexadas, as formas singulares um, uma e a/o incluem plurais referentes, a menos que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, a referência a uma planta inclui uma ou mais plantas, referência a um traço inclui um ou mais traços e referência a uma célula inclui misturas de células, tecidos e semelhantes.
[00127] Uma planta como usada neste documento refere-se a qualquer planta em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo uma semente de planta.
[00128] O termo planta inclui toda a planta ou quaisquer partes ou derivados do mesmo, tais como células de planta, protoplastos de plantas, cultura de tecidos de células de plantas a partir da qual as plantas podem ser regeneradas, calo ou calos vegetais, células meristemáticas, microporos, germe, germe imaturo, pólen, óvulos, anteras, frutas, flores, folhas, cotiledonas, pistilo, sementes, revestimento de semente, raízes, pontas de raiz e semelhantes.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 35/103
30/83
[00129] O termo célula de planta usado neste documento refere-se a uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. A célula vegetal pode estar em uma forma de uma única célula isolada ou uma célula cultivada, ou como uma parte da unidade organizada superior, como, por exemplo, o tecido de planta, um órgão de planta ou uma planta inteira.
[00130] O termo cultura de células de plantas ou cultura de tecido como usado neste documento significa culturas de unidades de plantas como, por exemplo, protoplastos, células regeneráveis, cultura celular, células, células em tecidos de plantas, pólen, tubos de pólen, óvulos, sacos de germe, zigotos e germe em vários estágios de desenvolvimento, folhas, raízes, pontas de raiz, anteras, células meristemáticas, microporos, flores, cotiledonas, pistilo, frutas, sementes, revestimento de semente ou qualquer combinação dos mesmos.
[00131] O termo material de planta ou parte de planta usado neste documento refere-se a folhas, hastes, raízes, pontas de raiz, flores ou partes de flor, frutas, pólen, óvulos, zigotos, sementes, revestimento de semente, estacas, culturas de células ou tecidos ou qualquer outra parte ou produto de uma planta ou qualquer combinação dos mesmos.
[00132] Um órgão de planta como usado neste documento significa uma parte distinta e visivelmente estruturada e diferenciada de uma planta tal como uma raiz, haste, folha, flor, botão de flor ou germe.
[00133] Tecido de planta como usado neste documento significa um grupo de células de planta organizadas em uma unidade estrutural e funcional. Qualquer tecido de uma planta em planta ou em cultura está incluído. Este termo inclui, mas não se limita a, plantas inteiras, órgãos de plantas, sementes de plantas, cultura de tecidos, protoplastos, células meristemáticas, calo de planta e qualquer grupo de células de planta organizados em unidades estruturais e/ou funcionais. O uso deste termo em conjunto com, ou na ausência de, qualquer tipo
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 36/103
31/83 específico de tecido vegetal como listado acima ou de outra forma abrangido por esta definição não se destina a ser exclusivo de qualquer outro tipo de tecido vegetal.
[00134] Como usado nisto, o termo traço refere-se a uma característica ou fenótipo, particularmente, a uma característica ou fenótipo de melhoramento de uma planta. Um traço fenotípico pode referir-se à aparência ou a outra característica detectável de um indivíduo, resultante da interação de seu genoma, proteoma e/ou metaboloma com o meio ambiente. Por exemplo, no contexto da presente invenção um traço de melhoramento de planta ou um traço de melhoramento de planta desejável refere-se a resistência ou tolerância a pelo menos um estresse biótico, resistência ou tolerância a pelo menos um estresse abiótico, rendimento melhorado ou biomassa, rendimento de grãos melhorado, absorção de fertilizantes e eficiência de uso melhorado e qualquer combinação dos mesmos.
[00135] Um traço pode ser herdado de maneira dominante ou recessiva, ou de maneira parcial ou incompleta-dominante. Um traço pode ser monogênica (ou seja, determinada por um único locus) ou poligênica (ou seja, determinada por mais de um locus) ou pode também resultar da interação de um ou mais genes com o meio ambiente. Um traço dominante resulta em uma manifestação fenotípica completa no estado heterozigoto ou homozigoto; convencionalmente, um traço recessivo manifesta-se somente quando presente no estado homozigoto.
[00136] O termo fenótipo é entendido no escopo da presente invenção para se referir a uma característica(s) distinguível(is) de um traço geneticamente controlado.
[00137] Conforme usado neste documento, a frase traço fenotípico refere-se à aparência ou a outra característica detectável de um indivíduo, resultante da interação de seu genoma, proteoma e/ou metaboloma com o meio ambiente.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 37/103
32/83
[00138] É dentro do escopo da invenção atual que estresse pode ser definido como qualquer fator externo que tem uma influência negativa sobre o crescimento da planta, função e/ou reprodução
[00139] O termo estresse abiótico” é definido neste documento geralmente como o impacto negativo de fatores não vivos na planta em um ambiente específico. A variável não viva deve influenciar o ambiente além do seu intervalo normal de variação para afetar negativamente o desempenho ou a fisiologia da população de plantas ou da planta de forma significativa. Exemplos não limitantes de fatores de estresse abióticos, ou estressores, ou fatores ambientais podem abranger fatores como luz solar, vento, temperatura (frio, calor), salinidade, excesso de rega (inundações), seca e fatores como a captação de fertilizantes e eficiência de uso de fertilizantes e qualquer combinação dos mesmos. A resistência ou tolerância ao estresse abiótico pode aumentar o crescimento e a produtividade de plantas e, especificamente, as safras. Tem sido demonstrado que os estressores abióticos são mais prejudiciais e podem resultar em efeitos sinergéticos quando ocorrem juntos, em combinações de fatores de estresse abióticos.
[00140] O termo seca refere-se doravante a um fenômeno físico geralmente causado por um período prolongado de precipitação ou irrigação abaixo da média. Por exemplo, umidade baixa ou não suficiente (no solo ou no ar), escassez de abastecimento de água, solo seco, regimes de umidade, alta salinidade, calor e qualquer combinação destes. As condições secas podem se desenvolver por diferentes razões. Ele pode ter um impacto substancial sobre o ecossistema e agricultura, por exemplo, redução no rendimento e danos na safra.
[00141] Muitos organismos têm adaptações fisiológicas e genéticas de tolerância à seca.
[00142] Estresse biótico é definido neste documento como estresse que ocorre como resultado de danos causados a plantas por
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 38/103
33/83 outros organismos vivos, tais como bactérias, vírus, fungos, mosca branca, tripes, aranhas, nematodas, parasitas, insetos benéficos e prejudiciais, ervas daninhas e plantas nativas ou cultivadas. Os tipos de estresses bióticos impostos a uma planta podem depender tanto da geografia como do clima e da planta hospedeira e de sua capacidade de resistir a estresses particulares.
[00143] Conforme usado neste documento, a frase resistência refere-se à habilidade de uma planta em restringir o crescimento e desenvolvimento de um patógeno específico e/ou dos danos causados à planta quando comparado a plantas suscetíveis sob condições ambientais semelhantes. As plantas resistentes podem exibir alguns sintomas de doença ou dano sob a pressão de patógenos ou pragas ou sob a condição de estresse abiótico.
[00144] É adicionalmente dentro do escopo da presente invenção que resistência significa que uma planta se imuniza completamente de um estresse particular, por exemplo, uma infecção por patógeno biotrófico. De acordo com as modalidades específicas da invenção, por transformação de uma biblioteca de expressão para uma planta hospedeira, o hospedeiro transformado adquire um gene de resistência que impede a proliferação do patógeno e/ou confere resistência a um estresse abiótico particular (por exemplo, seca).
[00145] De acordo com alguns aspectos, a resistência é um termo absoluto onde a planta se imuniza completamente a um estresse particular. Deve-se notar que isso não significa que a tolerância não pode ser obtida em caso de estresse biótico ou abiótico.
[00146] O termo tolerância refere-se doravante à característica de uma planta que permite que uma planta para evitar, tolerar ou recuperar de estressores bióticos ou abióticos, sob condições que normalmente causariam uma maior quantidade de prejuízo para outras plantas da mesma espécie. Estas características herdáveis influenciam o grau de
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 39/103
34/83 dano causado à planta. Em termos de tolerância à produção agrícola significa que a planta pode estar sob estresse (doente/infectada/ou fisiologicamente desafiada), mas a extensão da perda não excede o nível de limiar econômico (uma extensão de perda que não dificulte a economia potencial do produto). De acordo com outros aspectos da presente invenção, a tolerância é um termo relativo. Exemplos de tolerância podem ser encontrados em caso de patógenos de plantas e todas os estresses abióticos, especialmente no caso de traços complexos que são regidos por múltiplos fatores.
[00147] Em geral, 'resistência' e 'tolerância' são os termos usados para denotar a capacidade da planta para administrar o estresse, seja ele biótico ou abiótico.
[00148] O termo transformação usado neste documento referese à alteração genética ou modificação induzida pela introdução de DNA exógeno em uma célula. Isso inclui a integração tanto do DNA exógeno no genoma do hospedeiro e/ou a introdução do DNA plasmídeo contendo o DNA exógeno na célula de planta. Tal processo de transformação resulta na captação, incorporação e expressão de exógeno material genético (DNA exógeno, por exemplo, biblioteca de expressão preparada a partir de amostragem de nicho ecológico). A transformação da planta pode se referir à introdução de genes exógenos em células de planta, tecidos ou órgãos, empregando meios diretos ou indiretos desenvolvidos pela biologia molecular e celular.
[00149] O termo nicho ambiental ou nicho ecológico geralmente se refere ao comportamento de uma espécie vivendo sob condições ambientais específicas. Inclui os micróbios, fungos, plantas ou outros organismos que habitam uma determinada localização ambiental (extremófilos). O nicho ecológico descreve como um organismo ou população responde à distribuição de recursos e concorrentes e como ele, por sua vez, altera esses mesmos fatores. O tipo e o número de variáveis
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 40/103
35/83 compreendendo as dimensões de um nicho ambiental variam de uma espécie para outra e a importância relativa de determinadas variáveis ambientais para uma espécie pode variar de acordo com os contextos abióticos e bióticos geográficos.
[00150] De acordo com outros aspectos, o termo nicho ambiental ou nicho ecológico descreve a posição relacionai de uma espécie ou população em um ecossistema. Mais especificamente, descreve como uma população responde à abundância de seus recursos e concorrentes e como afeta esses mesmos fatores. O ambiente abiótico ou físico também faz parte do nicho, pois influencia como as populações afetam e são afetadas por recursos e concorrência. A descrição de um nicho pode incluir descrições da história de vida do organismo, habitat e lugar na cadeia alimentar. No contexto da presente invenção nicho ambiental ou nicho ecológico pode ser definido de acordo com fatores bióticos ou fatores abióticos, como alta salinidade, condições de seca, calor elevado, condições frias, pH ou quaisquer outras condições ambientais extremas.
[00151] É dentro do escopo da invenção atual que o material genético é derivado a partir de uma amostragem de um nicho ambiental predefinido, incluindo a partir de solo, água, biomassa de planta, microrganismos, levedura, algas, nematódos etc.
[00152] O termo microbioma ou microbiota como usado neste documento refere-se a uma comunidade ecológica de microrganismos comensais, simbióticos e patogênicos encontrados dentro e sobre todos os organismos multicelulares de plantas a animais. Uma microbiota inclui bactérias, archaea, protistas, fungos e vírus. A microbiota foi encontrada para ser crucial para a homeostase imunológica, hormonal e metabólica de seu hospedeiro. O termo sinônimo de microbioma descreve tanto os genomas coletivos dos microrganismos que residem em um nicho ambiental ou os próprios microrganismos. O microbioma e o hospedeiro
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 41/103
36/83 emergiram durante a evolução como uma unidade sinérgica das características epigenéticas e genômicas, às vezes referida coletivamente como um holobionte.
[00153] O termo material genético ou pool genético refere-se doravante à soma do material genético de uma população em um determinado momento. Inclui todos os genes e combinações de genes (soma dos alelos) na população.
[00154] O termo isolado como usado doravante significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural, se ele está ocorrendo naturalmente). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural que é separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural é isolado.
[00155] O ácido nucleico isolado ou derivado de microrganismos ou qualquer organismo pode preferencialmente ser inserido em um vetor ou um plasmídeo. Tais vetores ou plasmídeos são preferencialmente aqueles que contêm sequências regulatórias de expressão, incluindo promotores, potenciadores e semelhantes adequados para expressão em plantas. Particularmente os plasmídeos e os métodos preferidos para a introdução e a transformação neles são descritos em detalhe no protocolo estabelecido neste documento.
[00156] O termo biblioteca de expressão conforme usado doravante refere-se a uma coleção de vetores ou vírus (como vírus de plantas usados como vetores-vírus) ou plasmídeos ou fagos contendo uma amostra representativa de cDNA ou fragmentos genômicos que são construídos em tal forma que eles serão transcritos e ou traduzidos pelo organismo hospedeiro (no contexto da presente invenção, plantas). A técnica usa vetores de expressão para gerar uma biblioteca de clones, com cada clone transcrevendo um RNA e ou expressando uma proteína. Esta biblioteca de expressão é então tríada para a propriedade de interesse e clones de interesse recuperados para análise adicional. Um exemplo e não
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 42/103
37/83 limitante seria usar uma biblioteca de expressão para isolar genes que pudessem conferir resistência ou tolerância à seca.
[00157] É dentro do escopo da presente invenção que a biblioteca de expressão (geralmente derivada de material genético microbiano) pode ser construída em um vetor binário (ou sistema binário de transferência de DNA (T-DNA) ou um vetor de transporte) capaz de replicar em vários hospedeiros (por exemplo, E. coli e Agrobacterium tumefaciens) para a produção de plantas geneticamente modificadas. Estes são vetores artificiais que foram criados a partir do plasmídeo de Ti de ocorrência natural em Agrobacterium tumefaciens. Em alguns aspectos, as bibliotecas de expressão são transferidas a partir de Agrobacterium tumefaciens para plantas.
[00158] O termo “edição” ou “edição de gene” ou “edição de genoma” refere-se doravante a qualquer sistema de edição de genoma convencional ou conhecido ou método, incluindo sistemas usando nucleases modificadas selecionadas a partir do grupo constituído por: sistema de meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e qualquer combinação dos mesmos. No contexto da presente invenção, as técnicas de edição de genes mencionadas acima são usadas para editar um gene alvo em uma safra desejável de acordo com as informações obtidas a partir do transgene identificado pelo método da presente invenção.
[00159] O termo correspondente à seguência refere-se doravante a homologia de sequência ou similaridade de sequência. Estes termos referem-se a duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas, que são iguais ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotideos que são iguais, quando comparados e alinhados para a correspondência máxima, conforme
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 43/103
38/83 medido usando um dos algoritmos de comparação de sequência disponíveis ou por inspeção visual.
[00160] De acordo com aspectos adicionais da invenção, o termo correspondente à sequência de nucleotídeo refere-se a variantes, homólogos e fragmentos da sequência de nucleotídeo indicada que possuem ou executam a mesma função biológica ou correlacionam com a mesma característica fenotípica da sequência de nucleotídeo indicada.
[00161] Outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente semelhantes ou que uma sequência é correspondente à sequência de nucleotídeo é que as duas moléculas hibridizam umas às outras sob condições rigorosas. As condições alta rigidez, tais como a temperatura de hibridação elevada e o baixo teor de sal em amortecedores da hibridação, permitem somente a hibridação entre as sequências de ácido nucleico que são altamente similares, visto que as condições de baixa rigidez, tais como temperatura mais baixa e alto teor de sal, permite a hibridação quando as sequências são menos semelhantes.
[00162] O termo similaridade ou similaridade de sequência refere-se doravante ao grau de semelhança entre duas sequências quando comparadas. Isto é dependente de sua identidade e mostra a extensão a que os resíduos são alinhados. A similaridade de sequência refere-se a um problema de correspondência ideal (ou seja, para alinhamentos de sequência). O algoritmo de correspondência ideal localiza o número mínimo de operações de edição (inserções, exclusões e substituições) a fim de alinhar uma sequência a outra sequência. As buscas por similaridade de sequências podem identificar proteínas ou genes homólogos, detectando excesso de similaridade, significado, similaridade estatisticamente significante que reflita a ascendência comum.
[00163] É dentro do escopo da invenção atual que a busca de similaridade é uma estratégia ou ferramenta eficaz e confiável para identificar homólogos (ou seja, sequências que compartilham um ancestral
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 44/103
39/83 evolucionário comum). Exemplos não limitantes de programas de pesquisa de similaridade, incluem BLAST (por exemplo, Altschul et al. 1997) ; unidades 3,3 e 3,4), PSI-BLAST (por exemplo Altschul et al., 1997 ), SSEARCH (por exemplo, Smith e Waterman, 1981) ; Pearson, 1991 , unidade 3,10), FASTA (por exemplo, Pearson e Lipman, 1988, unidade 3,9) e o HMMER3 (por exemplo, Johnson et al., 2010 ). Tais programas produzem estimativas estatísticas exatas e podem garantir que as sequências de proteínas ou ácidos nucleicos que compartilham similaridade significativa também possam ter estruturas semelhantes. A busca por similaridade é efetiva e confiável, pois sequências que compartilham similaridade significativa podem ser inferidas como homólogas; ou seja, compartilhando um ancestral comum.
[00164] A similaridade é compreendida dentro do escopo da presente invenção para se referir a uma similaridade de sequência de pelo menos 60%, particularmente uma similaridade de pelo menos 70%, preferencialmente mais de 80% e ainda mais preferencialmente mais de 90%. O termo substancialmente similar refere-se a um ácido nucleico, que é pelo menos 50% idêntico em sequência à referência quando a ORF inteira (fase de leitura aberta) é comparada em que a similaridade da sequência é preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, especialmente mais do que cerca de 90%, mais preferencialmente 95% ou maior, particularmente 98% ou maior.
[00165] Em algumas modalidades da invenção, tais sequências substancialmente similares referem-se a sequências de polinucleotídeo ou aminoácidos que compartilham pelo menos cerca de 60% de similaridade, preferencialmente pelo menos cerca de 80% de similaridade, alternativamente, cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com a/s sequência/s de polinucleotídeo ou aminoácido indicada/s.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 45/103
40/83
[00166] A presente invenção engloba sequências de nucleotídeo com pelo menos 60% de similaridade, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferível 90% e especialmente mais preferível a similaridade de 95% com as sequências de polinucleotídeo identificadas pelo método da presente invenção ou a uma sequência de referência.
[00167] A presente invenção engloba ainda sequências de aminoácidos com pelo menos 60% de similaridade, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferível 90% e especialmente mais preferível a similaridade de 95% com as sequências de polipeptideos identificadas pelo método da presente invenção ou a uma sequência de referência.
[00168] Conforme usado neste documento, sequência de referência é uma sequência definida usada como base para a comparação de sequência. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA de sequência completa ou sequência genética, ou o cDNA completo ou sequência de genes ou proteínas.
[00169] Como usado neste documento, identidade de sequência ou identidade no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptideo faz referência aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para a correspondência máxima ao longo de uma janela de tempo de comparação especificada. Quando a porcentagem da identidade da sequência é usada em referência às proteínas, reconhece-se que as posições do resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substituições conservadoras de aminoácido, onde os resíduos de aminoácido são substituídos para outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 46/103
41/83
[00170] O termo identidade ou sequência de identidade refere-se doravante adicionalmente à quantidade de caracteres que correspondem exatamente entre duas sequências diferentes. Por este meio, lacunas não são contadas e a medição é relacionai para a menor das duas sequências.
[00171] Em outras palavras, se duas sequências, que devem ser comparadas entre si, diferem em comprimento, a identidade de sequência, preferencialmente, relaciona-se com a percentagem dos resíduos de nucleotídeo da sequência mais curta, que são idênticos com os resíduos de nucleotídeo da sequência mais longa. Como usado neste documento, a percentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que tem de ser introduzido para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de percentual de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático como conhecido no estado da técnica.
[00172] É adicionalmente dentro do escopo que os termos similaridade e identidade referem-se adicionalmente à homologia local, identificando domínios que são homólogos ou similares (em sequência de aminoácidos e/ou nucleotídeo). Reconhece-se que as ferramentas de bioinformática, tais como BLAST, SSEARCH, FASTA e HMMER calculam alinhamentos de sequência locais que identificam a região mais semelhante entre duas sequências. Para domínios que são encontrados em diferentes contextos de sequência em diferentes proteínas, o alinhamento deve ser limitado ao domínio homólogo, uma vez que a homologia do domínio está provendo a similaridade de sequência capturada na pontuação. De acordo com alguns aspectos, o termo similaridade ou identidade inclui ainda um motivo de sequência, que é um nucleotídeo ou um padrão de sequência de aminoácidos que é generalizado e tem, ou é conjecturado para ter, um
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 47/103
42/83 significado biológico. As proteínas podem ter um motivo de sequência e/ou um motivo estrutural, um motivo formado pelo arranjo tridimensional de aminoácidos que pode não ser adjacente.
[00173] De acordo com modalidades adicionais, as sequências de proteína ou de polinucleotídeo com posição específica ou similaridade da sequência do domínio são identificadas pelo método da presente invenção. Ao comparar os resíduos sem conservação, a baixa similaridade é insignificante, portanto, sequências de similaridade mais baixas em geral com alta conservação na região conservada serão ainda consideradas como semelhantes em uma determinada faixa, por exemplo, de >60% (ou seja, sequências mostrando baixa similaridade de -37% para o homólogo mais próximo, mas possuem todos os resíduos de ligação de substrato conservado de uma família de proteínas específicas) que podem ser encontrados em algoritmos de pesquisa baseados em hmm, como HMMER3.
O termo banco de dados de domínio conservado (CDD) refere-se a uma coleção de alinhamentos de sequência e perfis que representam domínios de proteínas. Ele também inclui alinhamentos dos domínios para estruturas de proteínas conhecidas de 3-dimensionais no banco de dados (ou seja, base de dados de modelagem molecular (MMDB).
[00174] Em algumas modalidades da invenção, tais sequências substancialmente idênticas referem-se a sequências de polinucleotídeo ou aminoácidos que compartilham pelo menos cerca de 60% de identidade, preferencialmente pelo menos cerca de 80% de identidade, alternativamente, cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a/s sequência/s de polinucleotídeo ou aminoácido indicada/s.
[00175] Os polipeptideos no escopo da presente invenção são pelo menos 50% idênticos à proteína identificada pelo método da presente invenção; ou pelo menos 55% idênticos, ou pelo menos 60% idênticos, ou
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 48/103
43/83 pelo menos 65% idênticos, ou pelo menos 70% idênticos, ou pelo menos 75% idênticos, ou pelo menos 80% idênticos, ou pelo menos 85% idênticos ou pelo menos 90% idênticos ou pelo menos 95% idênticos à proteína identificada pelo método da presente invenção ou a uma sequência de referência.
[00176] Conforme usado neste documento, porcentagem de identidade de sequência significa o valor determinado comparando duas sequências otimamente alinhadas em uma janela de tempo de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de tempo de comparação pode incluir adições ou exclusões (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou exclusões) para o alinhamento ideal das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir o percentual de identidade de sequência.
[00177] O termo identidade substancial de sequências de polinucleotídeo significa que um polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento descritos usando parâmetros padrão. Um versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeo, levando em conta a degeneração do códon, a similaridade do aminoácido, o
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 49/103
44/83 posicionamento da fase de leitura, e assim por diante. A identidade substancial de sequências de aminoácidos para estes propósitos normalmente significa identidade de sequência de pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente pelo menos 95%. Preferencialmente, o alinhamento ideal é conduzido usando-se o algoritmo de alinhamento homológico de Needleman et al. (1970. J. Mol. Biol. 48:443).
[00178] O termo homólogo como usado neste documento, refere-se a uma sequência de DNA ou aminoácido com um grau de similaridade de sequência em termos de sequências de aminoácidos ou nucleotídeo compartilhados. Pode haver similaridade parcial ou similaridade completa (ou seja, identidade). Para sequências de proteínas, matrizes de similaridade de aminoácidos podem ser usadas como são conhecidas em diferentes programas de bioinformática (por exemplo, BLAST, FASTA, programa BestFit - Pacote de análise de sequência de Wisconsin, versão 8 para Unix, Grupo de computação genética, Parque Universitário de pesquisa, 575 Science Drive Madison, Wl 53711, Smith Waterman). Resultados diferentes podem ser obtidos ao realizar uma pesquisa específica com uma matriz diferente. Graus de similaridade para sequências de nucleotídeo baseiam-se em correspondências de identidade com penalidades feitas para lacunas ou inserções necessárias para otimizar o alinhamento, como é bem conhecido na técnica (por exemplo, Altschul S. F. et al., 1990, J Mol Biol 215 (3): 403-10; Altschul S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). As orientações para determinar quais os resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou eliminados sem abolir o biológico ou a atividade podem ser encontrados usando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, software DNASTAR.
[00179] O termo polimorfismo é entendido dentro do escopo da invenção para se referir à presença em uma população de duas ou mais
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 50/103
45/83 formas diferentes de um gene, marcador genético, ou traço herdado ou um produto gênico obtenível, por exemplo, através de splicing alternativo, metilação de DNA, etc.
[00180] A presente invenção abrange a técnica de triagem de alta produtividade ou HTS, que se refere neste documento a um método para identificar rapidamente genes que modulam uma determinada via ou função biomolecular. Inclui a expressão genética metatranscriptômica e metagenômica.
[00181] A presente invenção delineia um procedimento para a produção de bibliotecas de expressão a partir de material genético isolado de nichos ecológicos, que as bibliotecas de expressão podem ser transformadas na planta-alvo para triagem de um traço desejável tal como tolerância ou resistência ao estresse biótico ou abiótico e rendimento melhorado ou produção de biomassa.
[00182] De acordo com uma modalidade, a presente invenção provê um método de triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta desejável, o método compreende etapas de: (a) obter material genético a partir de uma amostragem de um nicho ambiental predefinido e (b) construir uma biblioteca de expressão a partir do material genético. De acordo com modalidades centrais, a presente invenção compreende adicionalmente as etapas de: (c) produzir plantas transformadas com a biblioteca de expressão em uma eficiência de transformação de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes, criando, assim a biblioteca de expressão dentre as plantas ou sementes; (d) realizar triagem para plantas transformadas expressando o traço desejável; e (e) identificar o transgene de ditas plantas transformadas expressando dito traço desejável.
[00183] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a etapa (a) compreende
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 51/103
46/83 adicionalmente as etapas de enriquecimento do material genético pelo crescimento em meios ricos ou em meios seletivos.
[00184] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a etapa (a) compreende adicionalmente as etapas de realçar expressão do traço desejável, cultivando o material genético em meios seletivos para o traço desejável.
[00185] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a etapa (b) compreende etapas de produção de biblioteca de cDNA procariótica ou biblioteca de cDNA eucariótica ou ambas.
[00186] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a etapa (b) compreende adicionalmente etapas de clonagem da biblioteca de cDNA em pelo menos um vetor binário.
[00187] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o vetor binário compreende um promotor constitutivo ou um promotor induzido por estresse.
[00188] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o vetor binário compreende marcador de seleção bacteriana e marcador de seleção de transformação de plantas.
[00189] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o marcador de seleção bacteriana é resistência de kanamicina, ou qualquer outro gene que confere resistência a antibióticos, e o marcador de seleção de transformação da planta é o gene da barra, conferindo resistência à fosfinotricina contendo herbicidas (por exemplo, herbicida Basta).
[00190] A referência é feita agora a Glufosinato (também conhecido como fosfinotricina e frequentemente um sal de amônio) é um
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 52/103
47/83 herbicida sistemático de largo espectro e de ocorrência natural produzido por diversas espécies de bactérias do solo de Streptomyces. Glufosinato é um herbicida de largo espectro que é usado para controlar as ervas daninhas. É vendido em formulações sob marcas, incluindo Basta, Rely, Finale, Challenge e Liberty. O gene de barra confere resistência ao herbicida Basta (contendo fosfinotricina).
[00191] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de transformar os vetores binários clonados em células hospedeiras.
[00192] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de transformar os vetores binários clonados em Agrobacterium tumefaciens.
[00193] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima compreendendo adicionalmente etapas de introduzir a Agrobacterium tumefaciens transformada em pelo menos um dentre: planta inteira, tecido de planta e célula de planta.
[00194] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo etapas de introdução da Agrobacterium tumefaciens transformada pulverizando as plantas com um inóculo compreendendo Agrobacterium transtornado.
[00195] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a etapa (d) compreende o crescimento das plantas transformadas sob condições seletivas para o traço desejável.
[00196] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de:
f. coletar sementes T1 a partir das plantas transformadas da etapa (d);
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 53/103
48/83
g. determinar a eficiência da biblioteca de semente das sementes T1 calculando a razão de plantas resistentes a fosfinotricinaao número total de plantas;
h. semear as sementes T1 da etapa (e) sob condições seletivas permitindo a triagem e a seleção das plantas transformadas que expressam o traço desejável;
i. testar as plantas selecionadas que expressam o traço desejável da etapa (g) para a presença do transgene; e
j. isolar e sequenciar o transgene das plantas transformadas selecionadas positivamente testadas para o transgene da etapa (h).
[00197] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de:
k. coletar sementes T2 a partir das plantas de (h), que são consideradas positivas para a presença do transgene;
l. cultivar plantas das sementes T2 sob condições seletivas permitindo a triagem e a seleção de plantas transformadas expressando o traço desejável em comparação com as plantas de controle transformadas com genes conhecidos conferindo o traço desejável; e
m. opcionalmente, isolar e sequenciar o transgene das plantas selecionadas da etapa (j).
[00198] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo etapas de:
a. reclonar e sequenciar o transgene isolado da etapa (i) e/ou (I);
b. transformar o transgene reclonado em plantas;
c. realizar triagem das plantas transformadas da etapa (b) para seleção de plantas transformadas expressando o traço desejável;
d. isolar o transgene das plantas selecionadas da etapa (c); e
e. opcionalmente, repetir as etapas (a) a (d).
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 54/103
49/83
[00199] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o nicho ambiental compreende amostras derivados dos nichos ecológicos, fontes, populações, habitats, pools de genes, cultura procariótica, cultura eucariótica e qualquer combinação dos mesmos.
[00200] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a amostragem de nicho ambiental compreende microbioma, cultura microbiota ou microbiana, planta, levedura, algas, nematódeos ou qualquer outro organismo ou combinações dos mesmos.
[00201] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o nicho ambiental é definido de acordo com fatores bióticos, fatores abióticos e uma combinação dos mesmos.
[00202] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a amostragem de nicho ambiental compreende amostra de solo, amostra de água, amostra de matéria orgânica, qualquer organismo vivo (tais como plantas, leveduras, bactérias, microrganismo, alga, nematoda) e quaisquer combinações dos mesmos.
[00203] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o traço desejável é selecionado a partir do grupo constituído por resistência ou tolerância a pelo menos um estresse biótico, resistência ou tolerância a pelo menos um estresse abiótico, rendimento ou biomassa melhorados, rendimento de grãos melhorado, absorção de fertilizantes melhorada e eficiência de uso melhorada e uma combinação dos mesmos.
[00204] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o estresse abiótico é selecionado a partir do grupo constituído por: seca, salinidade, calor, frio,
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 55/103
50/83 absorção de fertilizantes, eficiência da utilização de fertilizantes e qualquer combinação dos mesmos.
[00205] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o dito estresse biótico é selecionado a partir do grupo constituído por: doenças de plantas, patógenos, bactérias, vírus, fungos, parasitas, insetos benéficos e prejudiciais, ervas daninhas, plantas cultivadas ou nativas ou qualquer combinação dos mesmos.
[00206] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o método compreende etapas de extrair o RNA da amostragem do nicho ambiental predefinido.
[00207] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a extração de RNA é executada de acordo com kits comerciais padrão ou de acordo com qualquer outro protocolo para a extração de RNA da amostragem ambiental.
[00208] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que o protocolo para extração de RNA a partir de amostragem ambiental compreende etapas de:
a. obter uma amostra de solo;
b. misturar a amostra de solo com um tampão de extração compreendendo 500mM de tampão de fosfato pH 8 e 5% p/v brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) com fenol (pH 8)/clorofórmio/IAA razão de 25:24:1;
c. sujeitar a mistura à etapa (b) a 15 minutos de agitação a 37QC ou a um disruptor de células por 1 minuto;
d. centrifugar a mistura da etapa (c) em 2.500 g por cerca de 10 minutos à temperatura ambiente para obter uma fase aquosa;
e. transferir a fase aquosa para um novo tubo;
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 56/103
51/83
f. acrescentar a fase aquosa dentro do tubo da etapa (e) uma quantidade igual de iso-propanol suplementado com 20 mg/ml de solução de cristal violeta para obter solução colorida de violeta;
g. misturar a solução invertendo o dito tubo da etapa (f) e então incubando o tubo por cerca de 30 minutos na temperatura ambiente;
h. centrifugar o tubo da etapa (g) em 2.500g por aproximadamente 30 minutos na temperatura ambiente para obter uma camada colorida de violeta;
i. transferir a camada colorida de violeta em um novo tubo e centrifugar o tubo por cerca de 5 min na velocidade máxima para obter pelete e sobrenadante;
j. lavar o pelete com 80% v/v etanol gelado e centrifugar por 5 min adicionais para obter pelete e sobrenadante;
k. remover o sobrenadante da etapa (j) e permitir que o pelete seque;e
l. suspender o pelete seco em água em uma razão de 100 μΙ de água para 2 gr de solo da etapa (a).
[00209] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar sequências de polinucleotídeo obteníveis pelo método como definido acima.
[00210] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o polinucleotídeo como definido acima, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-148 e qualquer combinação da mesma.
[00211] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar uma sequência de polinucleotídeo que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de similaridade da sequência a uma sequência de polinucleotídeo obtenível pelo método como definido acima.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 57/103
52/83
[00212] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar uma sequência de polipeptideo obtenível pelo método como definido acima.
[00213] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar a sequência de polipeptideo como definida acima, em que o polipeptideo compreende uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polipeptideo selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 149-321 e qualquer combinação da mesma.
[00214] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de similaridade da sequência a uma sequência de aminoácido obtenível pelo método como definido acima.
[00215] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o uso do método como definido acima para identificar genes conferindo resistência ou tolerância ao estresse abiótico ou biótico.
[00216] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o uso do método, tal como definido acima, para identificar os genes que conferem um rendimento e biomassa melhorados, ou seja, um rendimento de grãos melhorado, em plantas, por exemplo, reforçando o crescimento, com ou sem exposição a condições de estresse.
[00217] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o uso do método como definido acima para identificar genes conferindo rendimento melhorado.
[00218] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o uso como definido em qualquer um dos acima, em que o estresse abiótico é selecionado a partir do grupo constituído por: seca, salinidade, calor, frio, utilização de fertilizantes, absorção de fertilizantes e qualquer combinação dos mesmos.
[00219] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o uso como definido em qualquer um dos acima, em que o estresse biótico é
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 58/103
53/83 selecionado a partir do grupo constituído por: patógenos, bactérias, vírus, fungos, parasitas, insetos benéficos e prejudiciais, ervas daninhas, plantas cultivadas ou nativas ou qualquer combinação dos mesmos.
[00220] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar um método de triagem e identificação de um traço de melhoramento de resistência ou tolerância à seca em plantas, o método compreende etapas de: (a) obter material genético derivado a partir de uma amostra de nicho ambiental de baixa umidade ou alta salinidade; e (b) construir biblioteca de expressão a partir do material genético. De acordo com as modalidades centrais, o método compreende adicionalmente etapas de: (c) produzir plantas transformadas com a biblioteca de expressão a uma eficiência de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes; (d) realizar triagem de plantas transformadas que sobrevivem a condições de seca predeterminadas; e (e) identificar o transgene das plantas transformadas que sobrevivem à seca da etapa (d).
[00221] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido acima, em que a etapa (b) compreende adicionalmente etapas de clonagem da biblioteca de expressão em pelo menos um vetor binário.
[00222] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de:
f. coletar sementes T1 a partir das plantas transformadas da etapa (c);
g. semear as sementes T1 em solo seletivo para plantas transformadas, com teor de água de cerca de 100% de capacidade;
h. cultivar plantas das sementes T1 em condições de seca e/ou sem irrigação até a maioria das plantas morrerem, para produzir plantas transformadas que sobrevivem às condições de seca;
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 59/103
54/83
i. cultivar as plantas transformadas que sobrevivem à seca para produzir sementes T2;
j. realizar triagem das plantas transformadas que sobrevivem à seca da etapa (i) para a presença de um transgene;
k. isolar e sequenciar o transgene de plantas tríadas positivamente da etapa (j);
[00223] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, compreendendo adicionalmente etapas de:
l. coletar sementes T2 de cada uma das plantas transformadas que sobrevivem à seca tríadas positivamente contendo transgene da etapa (j);
m. cultivar plantas T2 de cada uma das sementes T2 contendo transgene da etapa (I) sob condições predeterminadas de seca em comparação com as plantas de controle transformadas com genes conhecidos conferindo tolerância à seca resistência à seca;
n. realizar medições de triagem de tolerância ou resistência à seca para cada uma das plantas T2 contendo transgenes em comparação com as plantas de controle selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de turgor, número de mortes de plantas, estado de plantas e qualquer combinação dos mesmos;
o. isolar o transgene das plantas T2 que realizam resistência à seca tríadas da etapa (n);
p. opcionalmente, reclonar o transgene em um vetor binário;
q. opcionalmente, transformar o vetor binário clonado em plantas e cultivar as plantas transformadas sob condições predeterminadas de seca;e
r. opcionalmente, repetir as etapas (I) a (q).
[00224] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que a etapa do cultivo de
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 60/103
55/83 plantas T2 compreende etapas de: (a) semear as sementes T2 em solo seletivo para plantas transformadas, com teor de água de cerca de 100% de capacidade; e (b) irrigar as plantas quando o teor de água no solo alcançar cerca de 5-10%.
[00225] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o método como definido em qualquer um dos acima, em que as condições predeterminadas de seca são selecionadas a partir do grupo que consiste de baixa umidade, alta salinidade, solo seco e calor.
[00226] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar sequências de polinucleotídeo obteníveis pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[00227] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar o polinucleotídeo como definido acima, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a SEQ ID NO: 148 e qualquer combinação da mesma.
[00228] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar sequências de polinucleotídeos que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de similaridade da sequência a sequências de polinucleotídeo obtenível pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[00229] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar uma sequência de polipeptídeo obtenível pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[00230] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar a sequência de polipeptídeo como definida acima, em que a sequência de polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polipeptídeo selecionada a partir do grupo constituído por SEQ. ID Nos: 149-321 e qualquer combinação dos mesmos.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 61/103
56/83
[00231] Está adicionalmente dentro do escopo divulgar sequências de polipeptideo que tem pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% de similaridade da sequência a sequências de polipeptideo obteníveis pelo método como definido em qualquer um dos acima.
[00232] Está adicionalmente dentro do escopo da presente invenção divulgar um método para extração de RNA a partir de uma amostra de solo compreendendo etapas de:
m. obter uma amostra de solo;
n. misturar a dita amostra de solo com um tampão de extração compreendendo 500 mM de tampão de fosfato pH 8 e 5% p/v brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) com fenol (pH 8)/clorofórmio/IAA razões de 25:24:1;
o. sujeitar a dita mistura à etapa (b) a cerca de 15 minutos de agitação a 37 QC ou a um disruptor de células por 1 minuto;
p. centrifugar a dita mistura da etapa (c) em 2.500 g por cerca de 10 minutos à temperatura ambiente para obter uma fase aquosa;
q. transferir a dita fase aquosa para um novo tubo;
r. acrescentar a dita fase aquosa dentro do dito tubo da etapa (e) uma quantidade igual de iso-propanol suplementado com 20 mg/ml de solução de cristal violeta para obter solução colorida de violeta;
s. misturar a dita solução invertendo o dito tubo da etapa (f) e então incubando dito tubo por cerca de 30 minutos na temperatura ambiente;
t. centrifugar o dito tubo da etapa (g) em 2.500g por aproximadamente 30 minutos na temperatura ambiente para obter uma camada colorida de violeta;
u. transferir dita camada colorida de violeta da etapa (h) em um novo tubo e centrifugar o dito tubo por cerca de 5 min na velocidade máxima para obter pelete e sobrenadante;
v. lavar o dito pelete com 80% v/v etanol gelado e centrifugar por cerca de 5 min adicionais para obter pelete e sobrenadante;
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 62/103
57/83
w. remover o dito sobrenadante da etapa (j) e o pelete é deixado para secar; e
x. suspender dito pelete seco em água em uma razão de 100 μΙ de água para 2gr de solo da etapa (a).
[00233] Está adicionalmente dentro do escopo da presente invenção divulgar um método de triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta desejável, dito método compreende etapas de:
y. obter uma amostragem de um nicho ambiental predefinido;
z. extrair RNA a partir da amostragem de acordo com o método de extração de RNA de uma amostra de solo, conforme definido acima;
aa. construir uma biblioteca de expressão a partir do RNA da etapa (b);
O método compreende adicionalmente as etapas de:
bb. produzir plantas transformadas com a biblioteca de expressão a uma eficiência de pelo menos 0,05%-30% representando pelo menos 102101° transgenes;
cc. realizar triagem das plantas transformadas expressando o traço desejável; e dd. identificar o transgene das plantas transformadas expressando o traço desejável.
[00234] Está adicionalmente dentro do escopo da presente invenção divulgar um polinucleotideo isolado tendo uma sequência de nucleotídeo que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polinucleotideo selecionada a partir do grupo que constituído por SEQ ID NOs: 1 a SEQ ID NO: 148 e qualquer combinação da mesma.
[00235] Está adicionalmente dentro do escopo da presente invenção divulgar um polipeptideo isolado tendo uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência como estabelecida na sequência de polipeptideo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID Nos: 149-321 e qualquer combinação dos mesmos.
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 63/103
58/83
[00236] A fim de compreender a invenção e ver como ela pode ser implementada na prática, uma pluralidade de modalidades preferenciais serão agora descritas, por meio de um exemplo não limitante, com referência aos exemplos seguintes.
EXEMPLO 1
Um processo para traços de melhoramento em plantas por transformação de bibliotecas de expressão a partir de nichos ecológicos em plantas e triagem para os traços desejados
1. Amostra de coleta e processamento
[00237] Na primeira etapa, foram isolados pools genéticos de amostras e fontes ambientais variadas tais como solo, água ou matéria orgânica de diferentes habitats. A fonte é selecionada de acordo com os traços específicos desejados do alvo. Por exemplo, quando a triagem para o gene resistente à seca ou salinidade, uma terra seca, como a terra do deserto ou uma terra de alta salinidade ou outra aplicação será usada, mas não necessariamente.
[00238] O microbioma encontrado em cada amostra pode opcionalmente ser enriquecido pelo cultivo em meios ricos ou cultivado seletivamente com antibióticos. Para aumentar a expressão de genes potencialmente desejados, a cultura é cultivada em condições de estresse ou meios semelhantes, associadas ou afetando o traço alvo, tais como sal ou meio rico em PEG para o traço de resistência à seca ou salinidade.
[00239] O enriquecimento da amostra é realizado em meios de cultivo ricos (por exemplo, YPD) por vários dias a 28Q C-37°C na incubadora agitadora. Se as bibliotecas eucarióticas são preparadas, antibióticos antibacterianos tais como penicilina-estreptomicina e spectinomicina são adicionados.
[00240] Para induzir genes resistentes ao estresse, a amostra é cultivada sob qualquer condição de estresse ambiental desejada. Por exemplo, para induzir genes de resistência à seca, a amostra é cultivada
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 64/103
59/83 sob estresse osmótico elevado, adicionando PEG aos meios de cultivo (10%-30% p/v). Os meios de concentração de sal elevado tais como NaCI (5%-10% p/v) foram usados para induzir estresse de salinidade elevada. Além disso, as amostras são expostas a diferentes concentrações de nitrogênio (de 0-100mM KNO3 em água suplementada com 6mM KH2PO4 e micro elementos, ver tabela 1, http://www.gatfertilizers.com/properties-ofsolid-and-liquid-fertilizers/ como recomendado pelo fabricante), temperaturas extremas (50-60 QC) e qualquer estresse ambiental desejado.
Tabela 1:
| Elemento | Porcentagem gr/Lt | |
| Ferro | 1,09 | 12,20 |
| Manganês | 0,48 | 5,47 |
| Zinco | 0,15 | 1,75 |
| Cobre | 0,05 | 0,55 |
| Molibdênio | 0,02 | 0,16 |
| Boro | 0,20 | 2,00 |
2. Extração de RNA
[00241] A extração de RNA total foi executada de acordo com os kits comerciais padrão tais como RNeasy PowerSoil Total RNA Kit (Qiagen) e Quick-RNA (pesquisa de Zymo). Além disso, um protocolo único é usado para a extração de RNA a partir das amostras de solo, como segue:
[00242] Em um tubo de 7ml, 2g de solo é interrompido com tampão de extração (500mM tampão de fosfato pH 8 e 5% p/v CTAB com fenol (pH 8), clorofórmio, IAA (25:24:1)). O tubo é submetido a 15 minutos de agitação a 37 QC ou a um disruptor de células por 1 min. O tubo é centrifugado então a 2.500g por 10 minutos em temperatura ambiente. A fase aquosa é transferida para um novo tubo e uma quantidade igual de iso-propanol suplementado com 5ul de solução de cristal violeta (20mg/ml) é adicionado. Os tubos são misturados invertendo e deixados para suportar por 30 minutos na temperatura ambiente, então centrifugados a 2.500g por 30 minutos em temperatura ambiente. A camada colorida de violeta é
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 65/103
60/83 transferida em um tubo novo de 1,5 ml e centrifugada por 5 min na velocidade máxima. O pelete é lavado com 500 pL de 80% v/v de etanol gelado e centrifugado por 5 min adicionais. Após a centrifugação, o líquido é removido e o pelete é deixado para secar. O pelete seco está suspenso em 100 pl de água.
3. Construção de bibliotecas de cDNA
3.1. Bibliotecas de cDNA eucarióticas
[00243] As bibliotecas de cDNA eucarióticas do RNA total e do mRNA são construídas com base em métodos de template switching, transcrição reversa de poli-A mRNA (SMART) ou rápida amplificação de extremidades de cDNA e métodos de (5'-RACE) oligo capeamento métodos. Os primers de transcrição reversa de poli-A mRNA usados são 5'ATTCTAGAGCGATCGCACATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV N-3' (referido como SEQ. ID NO: 321) e 5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCGCGCCrGrGG-3' (referido como SEQ. ID NO: 322). Os primers de rápida amplificação de extremidade de cDNA de oligo capeamento são usados 5'ATTCTAGAGCGATCGCACATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV N-3' (referido como SEQ. ID NO: 321) e 5'-lnvddT (5 ' Dideoxi-T lnvertido)-r (AAGCAGUGGUAUCAACGCAGAGUGGCGCGCCG)-3' (referido como SEQ. ID NO: 323). O cDNA amplificado é inserido em vetores binários (ver Figs. 1-4) entre o(s) promotor(es) (35S, KIN1, erd10 e/ou CBF3) e o terminador HSP ou NOS. Fig. 1A ilustra o vetor pPA-35H, que tem um promotor CaMV 35S constitutivo com o gene GFP clonado entre o promotor e o terminador como um exemplo. Figs. 1B-D apresentam vetores que contêm promotores de estresse induzido a partir de Arabidopsis thaliana: vetor pPA-CH com promotor CBF3 com uma sequência de nucleotídeo como estabelecido em SEQ. ID NO: 330 (Fig. 1B), pPA-EH com promotor Erd10 com uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecido no SEQ. ID NO: 331 (Fig. 1C) e pPA-KH com promotor Kin1 com uma sequência de
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 66/103
61/83 nucleotídeo conforme estabelecido no SEQ. ID NO: 332 (Fig. 1D) com o gene GFP clonado entre o promotor e o terminador como exemplo (Plant Physiol.1997 Oct; 115 (2): 327 - 334., Plant Journal (2004) 38, 982-993 incorporada neste documento por referência).
[00244] Estes vetores contêm kanamicina como uma seleção bacteriana e o gene de barra como uma seleção de planta transgênica que confere a resistência ao herbicida do fosfinotricina. Pelo menos um dos exemplos não limitantes da montagem de Gibson, restrição-ligadura, restrição livre ou métodos da em-fusão é usado e então os produtos de ligação são transformados em células E. coli competentes para crescer sob a seleção de kanamicina. O tamanho da biblioteca é estimado pela contagem viva de bactérias transformadas semeadas em pratos LB petri (geralmente 10Λ5 - 10Λ7) (Fig. 5). Vetores da biblioteca cDNA são purificados a partir de bactérias E. coli com kits de mini-prep padrão e transformado em células GV3101 Agrobacterium tumefaciens eletrocompetentes. O transformado Agrobacterium é cultivado em meios de LB sob a seleção de kanamicina e rifampicina (50 pg/ml cada) durante a noite a 28Q C, (250 ml por 1m2 da área de cultivo de planta alvo). O cultivo prendeu no gelo para na lista 30 min e centrifugado então por 10 minutos em 8000 rpm a 4QC. A Agrobacterium peletizada está suspensa em tampão de suspensão (5% de sacarose e 0,03% L-77 Silwet, Momentive, US).
3.2. Bibliotecas de cDNA procariontes
[00245] As bibliotecas de cDNA procarionte a partir de um RNA total são construídas baseadas no padrão 5' e 3' modificações de RNA com ScriptSeq™ kit completo (epicentro). Os primers usados são 5'ATTCTAGAGCGATCGCACATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV N-3' (referido como SEQ. ID NO: 321) e 5'-lnvddT (5 ' Dideoxi-T lnvertido)-r (AAGCAGUGGUAUCAACGCAGAGUGGCGCGCCG)-3' (referido como SEQ. ID NO: 324). O cDNA amplificado inserido em vetores portadores impedindo a resistência a kanamicina e a fosfinotricina e então
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 67/103
62/83 transformado em células E. coli competentes para cultivar sob a seleção de kanamicina (50 pg/ml). O tamanho da biblioteca é estimado pela contagem viva de hospedeiras transformadas (geralmente 10Λ5 - 10Λ7). Os vetores da biblioteca de cDNA são purificados a partir das células hospedeiras com o kit mini-prep padrão (50 μΙ_) e transformados em células GV3103 (100 μΙ_) de Agrobacterium eletrocompetente. A Agrobacterium transformada é cultivada em meios de LB sob a seleção de kanamicina e rifampicina (50 pg/ml) durante a noite a 28° C, (100 ml por 1 m2 da área de cultivo de planta alvo). O cultivo é preso no gelo por pelo menos 30 min e então centrifugado por 5 minutos em 8000 rpm a 4QC. A Agrobacterium peletizada está suspensa em tampão de suspensão (5% de sacarose e 0,03% L-77 Silwet).
4. Cultivo e transformação de plantas
4.1. Plantas de Arabidopsis
[00246] As plantas são cultivadas em estufas controladas como uma preparação para a transformação. As plantas são cultivadas em solo composto por 75% de turfa, 25% de perlita e são irrigadas rotineiramente com água suplementada com fertilizante (por exemplo, Shefer 5.3.8, ICL Israel) de acordo com as instruções do fabricante, conforme necessário. As plantas começam a florescer após 3-4 semanas e então estão prontas para a transformação. Agrobacterium transformada com bibliotecas de expressão são cultivadas como mencionado acima e suspensas em tampão de suspensão (5% sacarose e 0,03% L-77 Silwet) e são pulverizados por 2 litros pulverizadores (por exemplo, Solo, Alemanha) sobre as flores. Após 56 semanas de crescimento continuado quando as plantas se tornam secas, as sementes são coletadas e mantidas em um lugar seco fresco por 2 semanas ou até ser usado.
4.2. Plantas de tabaco
[00247] Folhas de tabaco são cortadas em peças de 1-2 cm2 e esterilizadas por 70% etanol seguido por 0,3% tratamentos de lixívia por 5
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 68/103
63/83 minutos. As peças de folha são misturadas com as bibliotecas transformadas Agrobacterium (ou com um gene qualquer identificado de SEQ ID 1-148 a partir da Tabela 4), suspendido no meio de regeneração (RM) líquido suplementado com o MS que inclui vitaminas de Gamborg B5, 3% sacarose, 2 mg/L BAP (6-Benzilaminopurina) e 0,2 mg/L NAA (ácido naftaleno acético) (por exemplo, Duchefa, Netherland) durante 30 minutos. As bactérias são então lavadas e peças de folha são colocadas em placas da planta-ágar do RM por um dia no escuro. As peças de folha são transferidas para novas placas de RM de planta-ágar suplementadas com 300 pg/ml de antibiótico timentina para matar a Agrobacterium e 1,5 pg/ml de fosfoinotricina (por exemplo, Duchefa, Netherland) para a seleção de plantas transgênicas. Fig. 3A-B apresenta uma ilustração fotográfica da cultura do tecido de tabaco transformada com uma biblioteca, 7 dias após a transformação (Fig. 3A), e 40 dias após a transformação (Fig. 3B)· Após 6-8 semanas, as plântulas começam a aparecer e são transferidas para novos vasos contendo a mesma seleção de RM de planta-ágar, mas BAP é excluída (ver Fig 30· Após o enraizamento, as plantas são transferidas para o solo na estufa.
EXEMPLO 2
Um processo de identificação de traços de resistência à seca em plantas
A. Triagem para plantas/genes resistentes à seca e/ou salinidade
[00248] As sementes T1 de Arabidopsis abrigando a biblioteca de expressão desejada estão sendo usadas para a triagem. No primeiro estágio, a eficiência de transformação é definida para uma biblioteca de sementes específica. 1 ml de sementes (-50.000 sementes) está sendo semeada no solo irrigado com água suplementada com Basta (por exemplo, Bayer, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Sete dias após a semeadura, o número de plantas resistentes à fosfinotricina é contado e comparado com as plantas suscetíveis à
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 69/103
64/83 fosfinotricina (Fig. 4)· Como demonstrado na Fig. 4, as plantas maiores são resistentes a fosfinotricina enquanto pequenas plantas estão ausentes do transgene e, portanto, suscetíveis e morrerão. A eficiência da biblioteca de sementes é representada pela razão do número de plantas resistentes ao número de plantas totais.
[00249] A biblioteca é então semeada de acordo com o número desejado de plantas destinadas a serem representadas no experimento específico e que representa melhor o tamanho da biblioteca. Por exemplo, se uma biblioteca de expressão consistir em 5X104 genes, e a eficiência de transformação for 1%, > 5 milhões sementes devem ser semeadas. Neste caso, em ~ 20m2 do solo, 50.000 plantas resistentes Basta serão cultivadas para o experimento.
[00250] O solo é irrigado uma vez, quando as sementes são semeadas, com água suplementada com fosfinotricina e fertilizante (por exemplo, Shefer 5.3.8, ICL Israel) de acordo com as instruções do fabricante e o conteúdo de água do solo atinge 100% de capacidade. As plantas são cultivadas em estufas controladas ar-condicionadas, e o solo não é irrigado até que a maioria das plantas morra da falta de água. Plantas sobreviventes, ~ 0,1% das plantas resistentes a fosfinotricina inicial, estão sendo resgatadas por irrigação até que produzam sementes que estão sendo coletadas para experimentos T2. Durante o seu cultivo, as plantas sobreviventes são testadas para o seu transgene, por extração de gDNA de uma de suas folhas e PCR usando primers para os promotores específicos do gene (CaMV 35S, CBF3, Erd10 e Kin1) e terminadores (NOS, HSP) (ver tabela 2). Os produtos PCR estão sendo sequenciados e a sequência resultante é explodida versus bases de dados de sequências como NCBI, tanto para comparações de DNA (ou seja, BLASTn) quanto para comparações de sequências de aminoácidos (ou seja, BLASTx).
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 70/103
65/83
[00251] Agora é feita referência à tabela 2 que apresenta o SEQ ID NOs das sequências de primer do promotor usadas na presente invenção:
[00252] Tabela 2: SEQ IP NOs de sequências de primers
| SEQ ID NO. | Descrição |
| SEQ ID NO: 321 | Primer reverso para transcrição de poliAmRNA |
| SEQ ID NO: 322 | Primer dianteiro para transcrição de poli-A mRNA |
| SEQ ID NO: 323 | Primer dianteiro para a amplificação de extremidades de cDNA por oligocapeamento |
| SEQ ID NO: 324 | Primer dianteiro para a amplificação da biblioteca de cDNA procarionte (por exemplo, derivado do RNA total) |
| SEQ ID NO: 325 | Primer dianteiro para o promotor CaMV 35S |
| SEQ ID NO: 326 | Primer dianteiro para promotor CBF3 |
| SEQ ID NO: 327 | Primer dianteiro para promotor Erd10 |
| SEQ ID NO: 328 | Primer dianteiro para promotor Kin 1 |
| SEQ ID NO: 329 | Primer reverso para o terminador NOS/HSP |
| SEQ ID NO: 330 | Promotor CBF3 |
| SEQ ID NO: 331 | Promotor Erd10 |
| SEQ ID NO: 332 | Promotor Kin 1 |
B. Experimentos de gerações subsequentes (T2, T3)
[00253] As sementes coletadas das plantas sobreviventes da seca estão sendo testadas outra vez em experimentos adicionais incluindo repetições e controles para testar sua resistência/tolerância à seca (veja
Fig. 5)·
[00254] Vários genes foram escolhidos para servir como controles nos experimentos de seca:
1) EGFP- proteína fluorescente verde de água-viva, clonado sob 0 controle dos vários promotores usados e terminador HSP (ver mapas vetoriais de Figs 1A-D), está sendo servido como um controle negativo para a seca, uma vez que não foi demonstrado estar associado com melhoramento de resistência de plantas à seca (Yang T-T, et al., 1996).
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 71/103
66/83
2) mtID - manitol-1-fosfato desidrogenase de Escherichia coli, clonado sob o controle dos vários promotores usados e terminador HSP (ver mapas vetoriais de Figs 1A-D), está sendo servido como um controle positivo, uma vez que foi mostrado para estar associado ao melhoramento da resistência das plantas à seca e ao sal (Hema R. et al., 2014).
3) HRD - o gene HARDY de Arabidopsis thaliana clonado sob o controle dos vários promotores usados e terminador HSP (ver mapas vetoriais de Figs 1A-D), está sendo servido como um controle positivo uma vez que se demonstrou estar associado com o melhoramento da resistência das plantas à seca e ao sal (Karaba A, et al., 2007).
[00255] Plantas identificadas como expressando genes únicos nos experimentos de triagem, incluindo todos os controles, são semeadas em bandejas 38x28 cm com 16 inserções plásticas em cada bandeja (por exemplo, Desch Plantpak, Netherland), preenchido com o solo suplementado com fertilizante e fosfinotricina como acima. Em cada inserto diversas sementes são semeadas e após 10 dias uma única planta resistente de fosfinotricina está sendo mantida para experimentos adicionais. Cada experimento contém 20-40 repetições de cada planta, representando os genes únicos expressos, que se espalham aleatoriamente nas mesas de estufa. A irrigação do solo é semelhante ao experimento de tela; Ele é feito quando as sementes são semeadas, exceto quando o solo está completamente seco e atinge peso inferior, em seguida, peso inicial do solo antes da irrigação (~ 5%-10% do teor de água), em seguida, as plantas são irrigadas novamente para verificar o desempenho de reavivamento.
[00256] A referência é agora feita para Fig. 6 mostrando resultados fotográficos de triagem para a resistência de plantas transgênicas à seca cultivada sob as condições descritas acima. Esta figura mostra que as plantas transgênicas que transportam genes de resistência à seca 10, 20 e 30 sobrevivem em condições severas de seca, enquanto
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 72/103
67/83 outras plantas transgênicas que não abrigam genes que conferem resistentes à seca não sobrevivem a condições de estresse. Observa-se que dentro da pequena área mostrada nesta figura (~ 15x25 cm), cerca de 300 plantas foram tríadas enquanto 3 sobreviveram às condições de seca.
[00257] Quando as condições de seca começam a se desenvolver, várias medições são tomadas, como mostrado na Tabela 3:
[00258] 1) a observação do turgor, medida pela escala de 1-10, quando 1 é turgor elevado e 10 é perda total de turgor (veja Fig. 7)·
[00259] 2) peso da planta e do pote, pela escala em gramas.
[00260] 3) morte da observação das plantas, 10 = Morta e 1 =
Viva (ver Fig. 8)
[00261] 4) estado de observação de plantas em uma escala de 110, quando 1 é em bom estado e 10 é ruim.
Tabela 3: Medições tomadas em experimentos de seca
| medição peso do pote | unidades j Gramas | tempo de mediçãp Começo ao fim do experimento |
| Turgor | ( Unidades de ( observação 1-10, em que 1 é 0 perda de turgor e 10 é 100% de ( perda de turgor | A partir do começo da perda do turgor (-15-27 dias da última irrigação) |
| Morte | ( Unidades de ( observação 1-10 | A partir da primeira morte observada |
| Estado das plantas | | Unidades de observação 1-10 | Durante as primeiras 2 semanas e um dia após o reavivamento |
[00262] Refere-se agora à Fig. 7, mostrando perda da pressão de turgor em plantas expressando genes usados como controle em relação ao conteúdo de água do solo (cinza escuro), dias após a cessação da irrigação. Esta figura mostra curvas de plantas de Arabidopsis, expressando diferentes genes (indicados), como resposta ao cultivo sob condições de seca. A linha escura indica o teor de água do solo de 40% no dia 15 depois que a irrigação de água cessou, para fechar a 0% no dia 22 depois que a irrigação de água cessou. A perda da planta de GFP de controle negativo da resposta da pressão do turgor é similar àquela de plantas expressando
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 73/103
68/83 de HRD, quando o mtID que expressa a pressão do turgor das plantas, parece ser menos efetuado pela seca até o dia 20 depois que a irrigação de água cessou.
[00263] É demonstrado nesta figura que as plantas que expressam os genes do controle positivo mtlD e HRD mostraram a resistência melhorada à seca mostrando a perda significativamente reduzida de efeitos da pressão do turgor, quando as plantas transgênicas que expressam o gene GFP de controle negativo mostram a perda elevada de efeito da pressão do turgor quando exposta à mesma perda de teor de água.
[00264] Refere-se agora à Fig. 8 mostrando a escala de morte normalizada das plantas transgênicas expressando controle positivo em comparação com plantas expressando GFP; como pode ser visto plantas expressando os genes de controle positivo de resistência à seca HRD e mtlD mostraram taxa de mortalidade significativamente reduzida em comparação com o controle negativo GFP expressando plantas.
[00265] Refere-se agora à Fig. 9 mostrando graficamente os resultados fenótipos de vários genes de resistência à seca identificados pelo método da presente invenção.
[00266] O gráfico mostra os resultados médios da pressão do turgor (Tu) e da taxa de mortalidade (Dr) para diversos genes identificados (ver tabela 4) sob circunstâncias de seca severa. A escala para a morte e a perda do turgor são 1-10 quando 10 são consideradas plantas secasmarrons e mortas, ou perda total de turgor, respectivamente. Os resultados no gráfico representam o dia 23 (1), dia 28 (6) e dia 30 (8) da semeadura. Cada coluna para cada um dos diferentes genes expressos representa a média de 5 repetições com 4 plantas em cada repetição. Plantas expressando GFP serviram como controle negativo e HRD como controle positivo. Como se pode observar, todos os genes testados identificados pelo método da presente invenção mostraram redução significativa da
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 74/103
69/83 perda de turgor (pelo menos duas vezes após cerca de 23 dias a partir da semeadura) e redução da taxa de mortalidade (na faixa de 9 a 2 vezes após 30 dias a partir da semeadura) em comparação com plantas que expressam o gene de controle negativo de GFP. Além disso, as plantas que expressam os genes recentemente descobertos (ver tabela 4) demonstraram uma morte significativamente reduzida avaliados em comparação a plantas HRD que expressam controle positivo. Esses resultados indicam que, pelo método da presente invenção, novos genes de resistência à seca são identificados, o que confere maior tolerância à seca nas plantas.
[00267] Outro método usado para avaliar o desempenho das plantas em condições de seca é medir sua área foliar durante a fase de crescimento quando as condições de seca se tornam proeminentes. Aproximadamente 10-14 dias a partir da semeadura das plantas, as imagens da planta foram tomadas cada 2-3 dias junto com uma superfície branca de 50 mm2. A análise da imagem foi realizada em fotos retiradas dos experimentos de seca e a área foliar foi calculada. A área foliar de várias linhagens de plantas expressando genes novos identificados conferindo resistência à seca após a reclonagem foi comparada aos controles positivos e negativos (ver Tabela 5 e Fig. 10)·
[00268] O gráfico de Fig. 10 mostra a análise da imagem da área foliar das linhas de plantas transformadas. Dois eventos de transformação independentes do gene identificado com SEQ ID NO: 16 (Fig. 10A) e dois eventos de transformação independentes do gene identificado com SEQ ID NO: 25 (Fig. 10B) são mostrados em linhas mais escuras em cima de cada uma das Figs. 10A e 10B. Essas plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle negativo expressando GFP, e as plantas de controle positivas expressando mtlD, mostradas em linhas cinzentas mais claras na parte de baixo de cada uma das Figs. 10A e 10B. O desempenho melhorado sob a seca é mostrado como a porcentagem das plantas de
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 75/103
70/83 controle no temporal medido indicado (TP) (setas e porcentagens mostradas na figura).
[00269] Como pode ser observado nesta figura, a área foliar total de plantas que expressam os genes testados recém-identificados foi aumentada entre cerca de 10% e cerca de 82% (por exemplo, por cerca de 45%) em relação às plantas que expressam genes de controle negativo.
[00270] Para concluir, a presente invenção provê genes recémidentificados demonstrados para conferir tolerância às condições de seca nas plantas.
C. Reclonaqem e retransformacão de genes selecionados em plantas
[00271] Os genes selecionados a partir da seção B são reclonados nos vetores binários como descrito acima (isto é, Fig. 1A-D) e sequenciados para confirmar que tem a mesma sequência que o gene original dos experimentos T1 e T2. As plantas são transformadas com o gene reclonado e as sementes são coletadas. Os experimentos são repetidos como em B, exceto para cada gene 3-5 plantas transgênicas individuais com diferentes eventos de transformação não relacionados são testadas. Cada planta/evento transgênico individual é sujeito a 5-10 vezes das repetições nos experimentos, daqui para cada evento para cada gene 20-40 as plantas são testadas, e para cada gene diferente 60-200 plantas são testadas.
EXEMPLO 3
Sequências de polinucleotideo identificadas como melhoramento da resistência à seca e/ou salinidade em plantas
[00272] O processo descrito acima da triagem de sementes transgênicas T1 revelou aproximadamente 1000 transgenes como sequências do polinucleotideo do candidato para melhorar a resistência da seca nas plantas. Desses candidatos, a triagem de sementes T2 revelou cerca de 140 transgenes de melhor desempenho, potencialmente
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 76/103
71/83 melhorando a resistência ou tolerância à seca em plantas. Estas sequências do transgene são sujeitas a uns testes adicionais de validação.
[00273] A referência agora é feita na Tabela 4, apresentando exemplos de sequências de polinucleotídeo e polipeptídeos inéditos e únicos codificados por essas sequências, encontradas pelo método da presente invenção. Estas sequências são metatranscriptomas purificadas de nichos ambientalmente desafiados,
[00274] SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 148 representam sequências de polinucleotídeo encontradas pelo método da presente invenção como candidatas para melhoramento da resistência à seca nas plantas (Tabela 4).
[00275] SEQ ID NO: 149 a SEQ ID NO: 321 representam sequências de polipeptideo codificadas pela sequência de polinucleotídeo correspondente encontrada pelo método da presente invenção como candidatos para melhoramento da resistência à seca em plantas (ver Tabela 4).
[00276] Note que as sequências de DNA SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 , SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 , SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 codificam mais de uma fase de leitura aberta (ORF) (referida como SEQ. ID NO X. 1p e X. 2p etc.), dependendo de diferentes codões de partida.
Tabela 4: SEQ IP Nos de sequências de polinucleotídeo e de polipeptídeos
| Polinucleotídeo SEQ ID NO | Nome de polinucleotídeo | Polipeptideo SEQ ID NO. | Nome de polipeptideo |
| SEQ ID NO:1 | A454 | SEQ ID NO:149 | A454p |
| SEQ ID NO:2 | A456 | SEQ ID NQ:150 | A456p |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 77/103
72/83
| SEQ ID NO:3 | A458.1 | SEQ ID NO:151 | A458.1p |
| SEQ ID NO:4 | A458.2 | SEQ ID NO:152 | A458.2p |
| SEQ ID NO:5 | A460 | SEQ ID NO:153 | A460p |
| SEQ ID NO:6 | A462 | SEQ ID NO:154 | A462p |
| SEQ ID NO:7 | A463 | SEQ ID NO:155 | A463p |
| SEQ ID NO:8 | A466 | SEQ ID NO:156 | A466p |
| SEQ ID NO:9 | A468 | SEQ ID NO:157 SEQ ID NO:158 | A468.1p A468.2p |
| SEQ ID NO:10 | A470 | SEQ ID NO:159 | A470p |
| SEQ ID NO:11 | A475 | SEQ ID NO:160 SEQ ID NO:161 | A475.1p A475.2p |
| SEQ ID NO:12 | A477 | SEQ ID NO:162 | A477p |
| SEQ ID NO:13 | A480 | SEQ ID NO:163 | A480p |
| SEQ ID NO:14 | A481 | SEQ ID NO:164 | A481p |
| SEQ ID NO:15 | A483 | SEQ ID NO:165 | A483p |
| SEQ ID NO:16 | A484 | SEQ ID NO:166 | A484p |
| SEQ ID NO:17 | A485a | SEQ ID NO:167 | A485ap |
| SEQ ID NO:18 | A485b | SEQ ID NO:168 | A485bp |
| SEQ ID NO:19 | A486 | SEQ ID NO:169 | A486p |
| SEQ ID NO:20 | A498 | SEQ ID NO:170 SEQ ID NO:171 | A498.1p A498.2p |
| SEQ ID NO:21 | A499 | SEQ ID NO:172 SEQ ID NO:173 | A499.1p A499.2p |
| SEQ ID NO:22 | A501 | SEQ ID NO:174 | A501p |
| SEQ ID NO:23 | A504.1 | SEQ ID NO:175 | A504.1p |
| SEQ ID NO:24 | A504 | SEQ ID NO:176 | A504.2p |
| SEQ ID NO:25 | A506 | SEQ ID NO:177 | A506p |
| SEQ ID NO:26 | A507.1 | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:27 | A507.2 | SEQ ID NO:178 | A507.2p |
| SEQ ID NO:28 | A510a | SEQ ID NO:179 SEQ ID NO:180 | A510a.1p A510a.2p |
| SEQ ID NO:29 | A510b | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:30 | A512 | SEQ ID NO:181 | A512p |
| SEQ ID NO:31 | A513a | SEQ ID NO:182 | A513ap |
| SEQ ID NO:32 | A513b | SEQ ID NO:183 | A513bp |
| SEQ ID NO:33 | A518 | SEQ ID NO:184 | A518p |
| SEQ ID NO:34 | A520a | SEQ ID NO:185 | A520ap |
| SEQ ID NO:35 | AC2510 | SEQ ID NO:186 | AC2510ap |
| SEQ ID NO:36 | AD2607.1 | SEQ ID NO:187 SEQ ID NO:188 | AD2607.1p AD2607.2p |
| SEQ ID NO:37 | AD2607.3 | SEQ ID NO:189 | AD2607.3p |
| SEQ ID NO:38 | D860a | SEQ ID NO:190 | D860ap |
| SEQ ID NO:39 | D860b | SEQ ID NO:191 | D860bp |
| SEQ ID NO:40 | D862 | SEQ ID NO:192 | D862p |
| SEQ ID NO:41 | D863 | SEQ ID NO:193 | D863p |
| SEQ ID NO:42 | D881 | SEQ ID NO:194 | D881p |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 78/103
73/83
| SEQ ID NO:43 | D890 | SEQ ID NO:195 SEQ ID NO:196 | D890.1p D890.2p |
| SEQ ID NO:44 | De203 | SEQ ID NO:197 | De203p |
| SEQ ID NO:45 | De214a | SEQ ID NO:198 | De214ap |
| SEQ ID NO:46 | De215a | SEQ ID NO:199 | De215ap |
| SEQ ID NO:47 | De215b.1 | SEQ ID NQ:200 SEQ ID NO:201 SEQ ID NQ:202 | De215b.1p De215b.2p De215b.3p |
| SEQ ID NO:48 | De215b.4 | SEQ ID NQ:203 | De215b.4p |
| SEQ ID NO:49 | De215c | SEQ ID NQ:204 | De215cp |
| SEQ ID NQ:50 | De217 | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:51 | De223a | SEQ ID NO: 205 SEQ ID NO: 206 | De223a.1p De223a.2p |
| SEQ ID NO:52 | De223b | SEQ ID NO: 207 | De223bp |
| SEQ ID NO:53 | De227 | SEQ ID NO: 208 | De227p |
| SEQ ID NO:54 | De239a | SEQ ID NO: 209 SEQ ID NO: 210 | De239a.1p De239a.2p |
| SEQ ID NO:55 | De245 | SEQ ID NO: 211 SEQ ID NO: 212 | De245.1p De245.2p |
| SEQ ID NO:56 | De250.1 | SEQ ID NO: 213 | De250p |
| SEQ ID NO:57 | De250.2 | SEQ ID NO: 214 | De250.2p |
| SEQ ID NO:58 | De251 | SEQ ID NO:215 | De251p |
| SEQ ID NO:59 | De313 | SEQ ID NO:216 | De313p |
| SEQ ID NQ:60 | F1022a | SEQ ID NO: 217 SEQ ID NO: 218 | F1022a.1p F1022a.2p |
| SEQ ID NO:61 | F1022b | SEQ ID NO: 219 | F1022bp |
| SEQ ID NO:62 | G1085a | SEQ ID NO: 220 | G1085ap |
| SEQ ID NO:63 | G1181 | SEQ ID NO: 221 | G1181 p |
| SEQ ID NO:64 | G1190 | SEQ ID NO: 222 | G1190p |
| SEQ ID NO:65 | H1301.1 | SEQ ID NO: 223 | H1301.1 p |
| SEQ ID NO:66 | H1301.2 | SEQ ID NO: 224 | H1301.2p |
| SEQ ID NO:67 | K1464 | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:68 | K1475 | SEQ ID NO: 225 | K1475p |
| SEQ ID NO:69 | M603 | SEQ ID NO: 226 | M603p |
| SEQ ID NQ:70 | M606.1 | SEQ ID NO: 227 | M606.1p |
| SEQ ID NO:71 | M606.2 | SEQ ID NO:228 | M606.2p |
| SEQ ID NO:72 | M607.1 | SEQ ID NO:229 | M607.1p |
| SEQ ID NO:73 | M607.2 | SEQ ID NQ:230 | M607.2p |
| SEQ ID NO:74 | M609a.1 | SEQ ID NO:231 SEQ ID NO:233 | M609a.1p M609a.3p |
| SEQ ID NO:75 | M609a.2 | SEQ ID NO:232 | M609a.2p |
| SEQ ID NO:76 | M609b | SEQ ID NO:234 | M609bp |
| SEQ ID NO:77 | M619a | SEQ ID NO:235 | M619ap |
| SEQ ID NO:78 | M619b | SEQ ID NO:236 SEQ ID NO:237 | M619b.1p M619b.2p |
| SEQ ID NO:79 | M622a | SEQ ID NO:238 | M622ap |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 79/103
74/83
| SEQ ID NO:80 | M622b | SEQ ID NO:239 SEQ ID NO:240 | M622b.1p M622b.2p |
| SEQ ID NO:81 | M623a | SEQ ID NO:241 SEQ ID NO:242 | M623a.1p M623a.2p |
| SEQ ID NO:82 | M623b.1 | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:83 | M623b.3 | SEQ ID NO:243 | M623b.3p |
| SEQ ID NO:84 | M623c | SEQ ID NO:244 | M623cp |
| SEQ ID NO:85 | M624 | SEQ ID NO:245 SEQ ID NO:246 | M624.1p M624.2p |
| SEQ ID NO:86 | M625a.3 | SEQ ID NO:249 | M625a.3p |
| SEQ ID NO:87 | M625a | SEQ ID NO:247 SEQ ID NO:248 | M625a.1p M625a.2p |
| SEQ ID NO:88 | M625b | SEQ ID NO:250 | M625bp |
| SEQ ID NO:89 | M631 | SEQ ID NO:251 | M631p |
| SEQ ID NO:90 | M632a | SEQ ID NO:252 | M632ap |
| SEQ ID NO:91 | M635.1 | SEQ ID NO:253 | M635.1p |
| SEQ ID NO:92 | M635.2 | SEQ ID NO:254 | M635.2p |
| SEQ ID NO:93 | M638 | SEQ ID NO:255 | M638p |
| SEQ ID NO:94 | M643 | SEQ ID NO:256 | M643p |
| SEQ ID NO:95 | M649 | SEQ ID NO:257 | M649p |
| SEQ ID NO:96 | M650a.3 | SEQ ID NO:260 | M650a.3p |
| SEQ ID NO:97 | M650a | SEQ ID NO:258 SEQ ID NO:259 | M650a.1p M650a.2p |
| SEQ ID NO:98 | M650b | SEQ ID NO:261 SEQ ID NO:262 | M650b.1p M650b.2p |
| SEQ ID NO:99 | M657 | SEQ ID NO:263 | M657p |
| SEQ ID N0:100 | M659a | SEQ ID NO:264 | M659ap |
| SEQ ID NO:101 | M661 | SEQ ID NO:265 | M661p |
| SEQ ID NO:102 | M663 | SEQ ID NO:266 | M663p |
| SEQ ID NO:103 | M664.1 | SEQ ID NO:267 | M664.1p |
| SEQ ID NO:104 | M664.2 | SEQ ID NO:268 | M664.2p |
| SEQ ID NO:105 | M666 | SEQ ID NO:269 SEQ ID NO:270 | M666.1p M666.2p |
| SEQ ID NO:106 | M671 | SEQ ID NO:271 SEQ ID NO:272 | M671.1p M671.2p |
| SEQ ID NO:107 | M673 | SEQ ID NO:273 SEQ ID NO:274 | M673.1p M673.2p |
| SEQ ID NO:108 | M676.3 | SEQ ID NO:277 | M676.3p |
| SEQ ID NO:109 | M676 | SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:276 | M676.1p M676.2p |
| SEQ ID NO:110 | M677a | SEQ ID NO:278 | M677ap |
| SEQ ID NO:111 | M677b.1 | SEQ ID NO:279 SEQ ID NO:280 | M677b.1p M677b.2p |
| SEQ ID NO:112 | M677b.3 | SEQ ID NO:281 SEQ ID NO:282 | M677b.3p M677b.4p |
| SEQ ID NO:113 | M680 | SEQ ID NO:283 | M680p |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 80/103
75/83
| SEQ ID NO:114 | M691a.1 | SEQ ID NO:284 | M691a.1p |
| SEQ ID NO:115 | M691a.2 | SEQ ID NO:285 | M691a.2p |
| SEQ ID NO:116 | M691b | SEQ ID NO:286 | M691bp |
| SEQ ID NO:117 | M693 | SEQ ID NO:287 | M693p |
| SEQ ID NO:118 | M697 | SEQ ID NO:288 | M697p |
| SEQ ID NO:119 | M698 | SEQ ID NO:289 | M698p |
| SEQ ID NQ:120 | M705 | SEQ ID NQ:290 SEQ ID NO:291 | M705.1p M705.2p |
| SEQ ID NO:121 | M706 | SEQ ID NO:292 | M706p |
| SEQ ID NO:122 | M715a | SEQ ID NO:293 | M715ap |
| SEQ ID NO:123 | M715b | SEQ ID NO:294 | M715bp |
| SEQ ID NO:124 | M719 | SEQ ID NO:295 | M719p |
| SEQ ID NO:125 | M724 | SEQ ID NO:296 | M724p |
| SEQ ID NO:126 | N1503a | SEQ ID NO:297 | N1503ap |
| SEQ ID NO:127 | N1527.1 | SEQ ID NO:298 | N1527.1p |
| SEQ ID NO:128 | N1527.2 | SEQ ID NO:299 | N1527.2p |
| SEQ ID NO:129 | N1529 | SEQ ID NQ:300 | N1529p |
| SEQ ID NQ:130 | N1530 | SEQ ID NQ:301 | N1530p |
| SEQ ID NO:131 | P1611 | SEQ ID NQ:302 | P1611p |
| SEQ ID NO:132 | P1620.1 | SEQ ID NQ:303 SEQ ID NQ:304 | P1620.1p P1620.2p |
| SEQ ID NO:133 | P1620.3 | SEQ ID NQ:305 | P1620.3p |
| SEQ ID NO:134 | P1623a | SEQ ID NQ:306 SEQ ID NQ:307 | P1623a.1p P1623a.2p |
| SEQ ID NO:135 | P1623b | SEQ ID NQ:308 SEQ ID NQ:309 | P1623b.1p P1623b.2p |
| SEQ ID NO:136 | P1625a | SEQ ID NQ:310 | P1625ap |
| SEQ ID NO:137 | P1625b | SEQ ID NO:311 | P1625bp |
| SEQ ID NO:138 | P1731 | SEQ ID NO:312 | P1731p |
| SEQ ID NO:139 | P1744 | SEQ ID NO:313 | P1744p |
| SEQ ID NQ:140 | P1747.1 | SEQ ID NO:314 SEQ ID NO:315 | P1747.1 p P1747.2p |
| SEQ ID NO:141 | P1747.3 | SEQ ID NO:316 SEQ ID NO:317 | P1747.3p P1747.4p |
| SEQ ID NO:142 | SN8 | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:143 | V1906b | SEQ ID NO:318 | V1906bp |
| SEQ ID NO:144 | V1906c | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:145 | V1907a | SEQ ID NO:319 | V1907ap |
| SEQ ID NO:146 | V1907b | Sem ORF identificado | Sem ORF identificado |
| SEQ ID NO:147 | X2005 | SEQ ID NQ:320 | X2005p |
| SEQ ID NO:148 | X2026 | SEQ ID NO:321 | X2026p |
[00277] A referência é feita agora à Tabela 5 que apresenta resultados fenotípicos de diversos dos genes identificados nos experimentos da tolerância da seca. As plantas foram cultivadas no solo em
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 81/103
76/83 estufas controladas e testadas para tolerância à seca nas condições acima mencionadas. Durante o crescimento, foram realizadas medições e imagens (ver tabela 3) e a análise de imagem foi aplicada convertendo as imagens em área foliar por planta. Os resultados são mostrados como a porcentagem de medições de plantas que expressão GFP que serviram como um controle negativo durante a fase da seca.
Tabela 5: Resultados de experimentos de seca conduzidos com plantas de Arabidopsis T2
| Sea IP | DR | íSD | Sea IP | DR | ±SD | Sea IP | DR | ±SD | Sea IP | DR | ±SD | Sea IP | DR | ±SD |
| SEQ ID NO:1 | 116,00 | 3,13 | SEQ ID NO:25 | 137, | 7,05 | SEQ ID | 144,00 | 5,56 | SEQ | 143,23 | 7,26 | SEQ ID | 120,00 | 10,25 |
| 14 | NO:55 | ID NO:91 /92 | NO:122 | |||||||||||
| SEQ ID NO:2 | 132,86 | 6,68 | SEQ ID | 135, | 7,64 | SEQ ID | 134,00 | 3,28 | SEQ | 133,33 | 6,84 | SEQ ID | 130,73 | 5,93 |
| NO:26/27 | 00 | NO:56/ | ID | NO:124 | ||||||||||
| 57 | NO:93 | |||||||||||||
| SEQ ID | 151,43 | 10,52 | SEQ ID NO:28 | 187, | 11,00 | SEQ ID | 151,6 | 20,7 | SEQ | 102,50 | 7,08 | SEQ ID | 139,10 | 9,76 |
| ΝΟΊ7/18 | 64 | NO:58 | ID NO:94 | NO:125 | ||||||||||
| SEQ ID NO:5 | 146,9 | 20,6 | SEQ ID NQ:30 | 118, | 1,88 | SEQ ID | 134,08 | 4,45 | SEQ | 133,41 | 7,61 | SEQ ID | 119,09 | 4,03 |
| 57 | NQ:60 | ID | NO:127 | |||||||||||
| NO:97 | /128 | |||||||||||||
| SEQ ID NO:6 | 118,57 | 5,26 | SEQ ID NO:31 | 112, | 4,97 | SEQ ID | 99,72 | 4,71 | SEQ | 137,50 | 8,80 | SEQ ID | 135,01 | 7,89 |
| 56 | NO:62 | ID NO:99 | NO:129 | |||||||||||
| SEQ ID NO:7 | 156,7 | 23,4 | SEQ ID NO:33 | 167, | 7,20 | SEQ ID | 277,71 | 16,80 | SEQ | 160,11 | 20,12 | SEQ ID | 196,80 | 9,06 |
| 57 | NO:63 | ID NQ:10 0 | NQ:130 | |||||||||||
| SEQ ID NO:8 | 162,1 | 17,1 | SEQ ID NO:34 | 118, | 5,31 | SEQ ID | 136,83 | 6,62 | SEQ | 182,50 | 10,00 | SEQ ID | 113,98 | 7,65 |
| 92 | NO:64 | ID NQ:10 | NO:131 | |||||||||||
| SEQ ID NO:9 | 138,24 | 20,36 | SEQ ID NO:35 | 115, | 6,60 | SEQ ID | 107,77 | 10,82 | SEQ | 136,67 | 8,72 | SEQ ID | 110,33 | 6,64 |
| 20 | NO:65/ | ID | NO:132 | |||||||||||
| 66 | NQ:10 2 | /133 | ||||||||||||
| SEQ ID | 116,00 | 3,19 | SEQ ID | 109, | 7,79 | SEQ ID | 131,25 | 7,04 | SEQ | 121,79 | 7,45 | SEQ ID | 107,54 | 9,76 |
| NQ:10 | NO:36/37 | 71 | NO:67 | ID NQ:10 3/104 | NO:134 | |||||||||
| SEQ ID | 107,14 | 2,93 | SEQ ID NO:38 | 124, | 6,74 | SEQ ID | 186,67 | 9,85 | SEQ | 126,73 | 6,48 | SEQ ID | 114,17 | 5,84 |
| NO:11 | 59 | NO:68 | ID NQ:10 5 | NO:137 | ||||||||||
| SEQ ID | 122,86 | 4,53 | SEQ ID NQ:40 | 154, | 10,83 | SEQ ID | 132,64 | 8,96 | SEQ | 125,00 | 5,94 | SEQ ID | 139,80 | 9,87 |
| NO:12 | 29 | NO:69 | ID NQ:10 6 | NO:138 | ||||||||||
| SEQ ID | 160,00 | 12,32 | SEQ ID NO:41 | 117, | 5,71 | SEQ ID | 145,00 | 7,07 | SEQ | 130,00 | 6,64 | SEQ ID | 115,04 | 6,38 |
| NO:13 | 14 | NQ:70/ | ID | NO:139 | ||||||||||
| 71 | NQ:10 7 | |||||||||||||
| SEQ ID | 142,86 | 8,37 | SEQ ID NO:42 | 118, | 3,56 | SEQ ID | 134,08 | 7,08 | SEQ | 175,00 | 7,38 | SEQ ID | 105,73 | 8,08 |
| NO:14 | 27 | NO:72/ | ID | NQ:140 | ||||||||||
| 73 | NQ:10 9 | /141 | ||||||||||||
| SEQ ID | 145,71 | 7,24 | SEQ ID NO:43 | 141, | 8,03 | SEQ ID | 187,50 | 10,00 | SEQ | 118,92 | 5,89 | SEQ ID | 141,43 | 3,65 |
| NO:15 | 69 | NO:74/ | ID | NO:142 | ||||||||||
| 75/76 | NO:11 0 | |||||||||||||
| SEQ ID | 136,13 | 8,55 | SEQ ID NO:44 | 144, | 6,36 | SEQ ID | 125,00 | 8,29 | SEQ | 113,14 | 8,47 | SEQ ID | 115,50 | 7,96 |
| NO:16 | 00 | NO:77 | ID NO:11 3 | NO:143 | ||||||||||
| SEQ ID | 108,33 | 2,73 | SEQ ID NO:45 | 142, | 9,33 | SEQ ID | 123,73 | 6,78 | SEQ | 108,04 | 5,44 | SEQ ID | 112,59 | 7,32 |
| NO:17 | 70 | NO:79 | ID NO:11 4/115/ 116 | NO:145 | ||||||||||
| SEQ ID | 121,67 | 5,66 | SEQ ID NO:46 | 119, | 9,40 | SEQ ID | 159,79 | 8,45 | SEQ | 167,50 | 9,13 | SEQ ID | 121,66 | 8,81 |
| NO:19 | 36 | NO:81 | ID NO:11 7 | NO:147 | ||||||||||
| SEQ ID | 118,68 | 2,48 | SEQ ID NQ:50 | 110, | 7,81 | SEQ ID | 180,00 | 7,07 | SEQ | 131,68 | 8,77 | SEQ ID | 121,07 | 5,86 |
| NQ:20 | 51 | NO:85 | ID | NO:148 |
NO:11
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 82/103
77/83
| SEQ ID | 116,67 | 4,01 | SEQ ID NO:51 | 158, | 13,73 | SEQ ID | 267,03 | 16,40 | SEQ | 121,04 | 6,30 | GFP 100,00 6, |
| NO:21 | 00 | NO:87 | ID NO:11 9 | |||||||||
| SEQ ID | 131,67 | 8,00 | SEQ ID NO:53 | 119, | 8,70 | SEQ ID | 173,33 | 4,58 | SEQ | 104,85 | 7,51 | |
| NO:22 | 42 | NO:89 | ID NO:12 0 | |||||||||
| SEQ ID | 124,29 | 6,45 | SEQ ID NO:54 | 145, | 11,92 | SEQ ID | 135,00 | 9,29 | SEQ | 113,85 | 6,36 | |
| NO :23/24 | 00 | NQ:90 | ID NO:12 1 | |||||||||
| DR - | desempenho (área foliar) sob seca | mostrado em% | de plantas |
expressando GFP
SD - valor mostrado ± desvio padrão
[00278] Como mostrado na Tabela 5, todas as plantas que expressam os genes testados identificados pelo método da presente invenção revelaram aumento da área foliar em cerca de 15% a cerca de 90% sob em condições de seca em relação às plantas que expressam o gene de controle negativo (GFP). Estes resultados demonstram que o método da presente invenção provê novos genes conferindo maior tolerância à seca em plantas.
[00279] Agora é feita referência à Tabela 6 apresentando resultados de experimentos de seca conduzidos com plantas de Arabidopsis T2 reclonadas com os relevantes Seq. IDs. Seq diferentes. As IDs foram reclonadas e retransformadas em plantas de Arabidopsis gerando vários eventos independentes (representados por E1-3 na Tabela 6). As plantas foram cultivadas no solo em estufas controladas e testadas para tolerância à seca nas condições acima mencionadas. Durante o crescimento, foram realizadas imagens e a análise de imagem foi aplicada convertendo as imagens em área foliar por planta. Os resultados são mostrados na Tabela 6 como a porcentagem de plantas que expressam GFP que serviram como um controle negativo durante a fase da seca.
Tabela 6: Resultados de experimentos de seca conduzidos com plantas de Arabidopsis T2 reclonadas com os relevantes Seq. IDs
| Sea ID | DR RC E1 | E1 ±SD | DR RC E2 | E2±SD | DR RC E3 | E3±SD |
| SEQ ID NO:2 | 114,05 | 12,00 | 126,33 | 6,27 | 94,42 | 14,75 |
| SEQ ID NO:7 | 125,74 | 7,50 | 118,43 | 12,40 | 82,39 | 17,20 |
| SEQ ID NO:8 | 126,96 | 10,73 | 110,07 | 13,09 | 132,74 | 5,34 |
| SEQ ID NO:9 | 159,34 | 19,75 | 151,99 | 27,05 | 113,97 | 18,65 |
| SEQ ID NQ:10 | 185,23 | 19,29 | 165,97 | 30,99 | 90,04 | 9,27 |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 83/103
78/83
| SEQ ID NO:11 | 116,91 | 9,54 | 106,90 | 10,41 | 106,32 | 10,87 |
| SEQ ID NO:12 | 178,80 | 24,09 | 107,57 | 14,72 | 157,66 | 15,22 |
| SEQ ID NO:14 | 162,78 | 14,10 | 151,93 | 9,90 | 123,68 | 10,10 |
| SEQ ID NO:16 | 144,23 | 8,42 | 141,32 | 7,03 | 127,03 | 8,31 |
| SEQ ID NO:18 | 176,30 | 26,57 | 126,24 | 11,63 | 138,53 | 23,03 |
| SEQ ID NO:22 | 113,00 | 12,14 | 109,38 | 9,14 | 105,16 | 12,38 |
| SEQ ID NO:25 | 150,56 | 7,57 | 153,02 | 9,91 | 120,25 | 13,63 |
| SEQ ID NO:28 | 193,32 | 28,79 | ||||
| SEQ ID NQ:30 | 123,33 | 11,83 | 113,97 | 8,18 | 112,53 | 16,34 |
| SEQ ID NO:33 | 141,20 | 10,90 | 127,98 | 13,30 | 112,63 | 11,50 |
| SEQ ID NO:34 | 167,25 | 12,60 | 150,19 | 13,30 | 138,48 | 10,20 |
| SEQ ID NO:41 | 160,43 | 11,60 | 153,92 | 14,10 | 112,83 | 10,80 |
| SEQ ID NO:43 | 229,50 | 18,12 | 136,33 | 32,37 | 106,83 | 26,53 |
| SEQ ID NO:51 | 178,07 | 13,10 | 170,57 | 14,60 | 146,17 | 11,20 |
| SEQ ID NO:54 | 169,39 | 15,50 | 131,72 | 11,30 | 120,10 | 16,70 |
| SEQ ID NO:55 | 126,72 | 16,39 | 122,48 | 18,62 | 111,94 | 17,92 |
| SEQ ID NO:56/57 | 138,08 | 8,64 | 134,76 | 9,21 | 127,74 | 10,65 |
| SEQ ID NO:58 | 115,36 | 11,52 | 117,79 | 13,24 | 93,16 | 11,94 |
| SEQ ID NQ:60 | 151,90 | 12,80 | 137,24 | 11,90 | 93,80 | 5,60 |
| SEQ ID NO:61 | 140,14 | 12,10 | 116,31 | 14,70 | 114,09 | 10,30 |
| SEQ ID NO:74/75/76 | 175,07 | 13,50 | 160,92 | 12,30 | 105,95 | 11,30 |
| SEQ ID NO:77 | 210,21 | 18,03 | 174,80 | 18,44 | 160,93 | 29,97 |
| SEQ ID NO:78 | 182,00 | 15,30 | 175,52 | 16,80 | 115,61 | 11,10 |
| SEQ ID NO:85 | 132,73 | 10,80 | 119,86 | 11,50 | 114,46 | 9,90 |
| SEQ ID NO:89 | 167,95 | 21,26 | 154,64 | 21,46 | 142,21 | 29,65 |
| SEQ ID NQ:90 | 141,50 | 24,45 | 137,53 | 17,22 | 110,29 | 32,15 |
| SEQ ID NO:91/92 | 219,30 | 29,16 | 192,51 | 22,47 | 92,77 | 20,90 |
| SEQ ID NO:93 | 127,73 | 16,50 | 122,99 | 11,32 | 119,54 | 17,08 |
| SEQ ID NO:94 | 123,64 | 13,85 | 120,32 | 9,86 | 107,77 | 15,59 |
| SEQ ID NO:95 | 129,53 | 9,05 | 108,36 | 9,42 | 98,43 | 14,09 |
| SEQ ID NQ:101 | 161,68 | 14,10 | 141,20 | 11,30 | 134,68 | 13,60 |
| SEQ ID NQ:105 | 204,51 | 27,93 | 188,14 | 5,31 | 156,19 | 17,89 |
| SEQ ID NQ:106 | 153,33 | 12,60 | 143,91 | 10,80 | 130,47 | 11,50 |
| SEQ ID NQ:109 | 141,18 | 14,20 | 134,15 | 11,60 | 124,80 | 10,30 |
| SEQ ID NQ:110 | 118,66 | 10,30 | 113,58 | 8,40 | 104,01 | 7,60 |
| SEQ ID NO:111/112 | 228,16 | 35,62 | 202,43 | 18,73 | 132,98 | 18,32 |
| SEQ ID NO:113 | 158,59 | 24,54 | 155,03 | 21,36 | 135,44 | 17,44 |
| SEQ ID NO:126 | 185,07 | 13,40 | 147,37 | 16,20 | 131,05 | 10,80 |
DR - desempenho (área foliar) sob seca mostrado em% de plantas expressando GFP
RC E1-3 - desempenho com evento 1-3 de Seq. ID. relevante reclonado
SD - valor mostrado ± desvio padrão
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 84/103
79/83
[00280] Como mostra a Tabela 6, as plantas que expressam os genes reclonados identificados pelo método da presente invenção apresentaram área foliar melhorada comparadas às plantas expressando o gene de controle negativo, em plantas de Arabidopsis submetidas a condições de seca.
[00281] Agora é feita referência à Tabela 7 apresentando resultados de experimentos de seca conduzidos com plantas de tabaco T2. Diferentes genes identificados pela presente invenção foram reclonados e transformados em plantas de tabaco gerando vários eventos independentes (representados por E1-3 na Tabela 7). As plantas foram cultivadas no solo em estufas controladas e testadas para tolerância à seca nas condições acima mencionadas. Ao final do experimento, foram avaliados o peso fresco, o número de folhas, o comprimento do ramo principal e o peso do ramo principal. Os resultados são mostrados na tabela 7 como percentual de plantas de tipo selvagem (WT) que serviram como controle negativo.
Tabela 7: Resultados de experimentos de seca conduzidos com plantas de tabaco T2
| Sea ID | FW | FW±SD | LN | LN ±SD | BFW | BFW ± SD | BL | BL±SD |
| SEQ ID NO:1 E1 | 104,71 | 11,18 | 73,58 | 11,63 | 106,78 | 14,75 | 122,73 | 9,25 |
| SEQ ID NO:1 E2 | 97,28 | 2,18 | 67,92 | 4,76 | 86,18 | 5,10 | 97,27 | 8,86 |
| SEQ ID NO:1 E3 | 99,22 | 11,21 | 64,15 | 7,70 | 116,72 | 6,30 | 118,18 | 8,90 |
| SEQ ID NO:2 E1 | 122,23 | 2,70 | 116,76 | 4,84 | 115,42 | 3,47 | 97,33 | 4,87 |
| SEQ ID NO:2 E2 | 119,11 | 5,62 | 101,62 | 3,97 | 122,99 | 2,70 | 114,84 | 2,98 |
| SEQ ID NO:2 E3 | 116,69 | 9,00 | 111,35 | 4,58 | 117,50 | 14,45 | 102,67 | 9,91 |
| SEQ ID NO:15 E1 | 111,60 | 4,18 | 98,38 | 7,58 | 113,65 | 4,39 | 102,08 | 4,89 |
| SEQ ID NO:15 E2 | 121,87 | 2,88 | 118,92 | 2,53 | 122,25 | 3,70 | 100,59 | 3,71 |
| SEQ ID NO:15 E3 | 113,93 | 5,39 | 116,76 | 6,42 | 103,32 | 7,79 | 95,25 | 9,41 |
| SEQ ID NO:44 E1 | 124,04 | 4,23 | 118,92 | 6,69 | 130,31 | 5,23 | 94,66 | 6,12 |
| SEQ ID NO:44 E2 | 121,17 | 8,34 | 108,11 | 3,54 | 128,45 | 14,00 | 112,02 | 8,14 |
| SEQ ID NO:44 E3 | 113,80 | 10,36 | 117,84 | 7,28 | 118,83 | 9,15 | 90,80 | 8,89 |
| SEQ ID NO:55 E1 | 120,52 | 3,43 | 123,24 | 5,53 | 122,56 | 5,65 | 102,08 | 5,33 |
| SEQ ID NO:55 E2 | 117,85 | 8,35 | 113,51 | 3,42 | 121,35 | 11,26 | 95,55 | 7,40 |
| SEQ ID NO:55 E3 | 123,13 | 5,02 | 111,35 | 9,31 | 127,92 | 8,75 | 110,09 | 7,81 |
| SEQ ID NO:56/57 E1 | 101,58 | 5,17 | 75,47 | 8,92 | 80,26 | 23,40 | 109,55 | 6,45 |
| SEQ ID NO:56/57 E2 | 106,93 | 9,10 | 79,25 | 8,50 | 101,30 | 10,14 | 103,64 | 7,22 |
| SEQ ID NO:56/57 E3 | 98,16 | 10,90 | 75,47 | 8,92 | 81,97 | 10,54 | 100,91 | 15,84 |
| SEQ ID NO:142 E1 | 110,50 | 5,07 | 94,34 | 15,46 | 109,37 | 7,31 | 116,82 | 16,89 |
| SEQ ID NO:142 E2 | 119,83 | 5,07 | 94,34 | 1,98 | 105,75 | 5,15 | 118,64 | 19,00 |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 85/103
80/83
SEQ ID NO:142 E3 114,89 2,74 98,11 6,86 101,90 5,94 95,45 19,44
WT 100,00 2,43 100,00 1,67 100,00 9,84 100,00 11,65
FW - peso fresco medido em gramas
LN - número de folha
BFW - ramo de peso fresco medido em gramas
BL - comprimento do tronco principal medido em cm
SD -valor mostrado +/- desvio padrão em % do traço medido
E1-3 - diferentes eventos independentes
[00282] Os resultados apresentados na tabela 7 mostram que a maioria dos genes identificados pela presente invenção conferem melhor tolerância às condições de seca em plantas de tabaco, como mostrado pelos parâmetros testados (por exemplo, peso fresco, número de folhas, peso fresco do ramo, comprimento do ramo) em comparação com as plantas de controle negativo.
[00283] Faz-se referência à Tabela 8 apresentando resultados de experimentos de salinidade de plantas de tabaco transgênicas em comparação com as plantas de controle do WT. Diferentes linhagens de tabaco expressando vários genes identificados pelo método da presente invenção (ver tabela 4), foram germinadas no solo. Sete dias após a germinação; as plantas foram irrigadas com água fertilizada contendo 400 mM de NaCl. As imagens foliares foram realizadas 14 dias após a irrigação com sal e analisadas para a área foliar para os diferentes eventos independentes. Os resultados são mostrados na tabela 8 como porcentagem de diferença de área foliar de plantas de WT.
Tabela 8: Resultados de experimentos de salinidade em plantas de tabaco
| Sea ID | HST | ±SD |
| SEQ ID NO:1 | 225,12 | 12,65 |
| SEQ ID NO:2 | 240,63 | 28,91 |
| SEQ ID NO:15 | 505,52 | 17,57 |
| SEQ ID NO:44 | 767,46 | 7,48 |
| SEQ ID NO:55 | 206,71 | 26,27 |
| SEQ ID NO:56/57 | 286,19 | 4,86 |
| SEQ ID NQ:70/71 | 1366,07 | 4,70 |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 86/103
81/83
SEQIDNO:142 318,54 29,75 WT 100,00 13,22
HST -alta tolerância à salinidade mostrada como % diferença da área foliar em relação ao WT
SD - valor mostrado +/- desvio padrão entre 4 eventos independentes
[00284] Os resultados da tabela 8 mostram claramente que as plantas que expressam os genes novos de tolerância da salinidade identificados pela presente invenção revelaram uma área foliar significativamente mais elevada em comparação às plantas de controle do WT.
[00285] A referência é feita agora à Tabela 9 que apresenta os experimentos da salinidade conduzidos em plantas de Arabidopsis que expressam genes novos que têm Seq. IDs como indicado. Dez plantas por evento por pote foram cultivadas em solo na estufa controlada. Após a germinação, todos os potes com plantas foram irrigados submergindo-os com 100 mM de NaCI. Os resultados da tabela 9 representam dados médios de 4 eventos diferentes por Seq. ID e plantas do tipo selvagem (WT).
Tabela 9: Resultados de experimentos de salinidade conduzidos em plantas de Arabidopsis expressando novos genes identificados
| Seq ID | Produção de flores & vagens | FP Á | Çlorose | Cloro ±SD |
| SEQ ID NO:1 | 2,50 | 0,50 | 4,17 | 0,00 |
| SEQ ID NO:2 | 3,75 | 0,48 | 4,58 | 0,00 |
| SEQ ID NO:5 | 1,00 | 0,41 | 2,33 | 1,00 |
| SEQ ID NO:6 | 3,25 | 0,25 | 4,42 | 0,00 |
| SEQ ID NO:7 | 3,50 | 0,50 | 4,42 | 0,25 |
| SEQ ID NO:8 | 4,00 | 0,41 | 4,67 | 0,00 |
| SEQ ID NO:9 | 3,25 | 0,25 | 4,33 | 0,25 |
| SEQ ID NQ:10 | 2,25 | 0,48 | 3,42 | 0,41 |
| SEQ ID NO:11 | 1,50 | 0,50 | 3,00 | 0,50 |
| SEQ ID NO:12 | 2,75 | 0,63 | 3,83 | 0,63 |
| SEQ ID NO:13 | 2,75 | 0,25 | 3,58 | 0,00 |
| SEQ ID NO:16 | 2,75 | 0,63 | 4,08 | 0,00 |
| SEQ ID NO:18 | 1,50 | 0,29 | 2,92 | 0,25 |
| SEQ ID NO:22 | 2,50 | 0,87 | 3,33 | 0,41 |
| SEQ ID NO:23/24 | 3,50 | 0,29 | 4,50 | 0,00 |
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 87/103
82/83
| SEQ ID NO:25 | 2,25 | 0,75 | 3,08 | 0,29 |
| SEQ ID NO:26/27 | 1,75 | 0,48 | 3,00 | 0,25 |
| SEQ ID NO:29 | 2,50 | 0,29 | 3,83 | 0,25 |
| SEQ ID NQ:30 | 3,25 | 0,48 | 4,25 | 0,29 |
| SEQ ID NQ:30 | 3,00 | 0,71 | 4,33 | 0,00 |
| SEQ ID NO:33 | 2,50 | 0,87 | 3,42 | 0,25 |
| SEQ ID NO:94 | 2,50 | 0,29 | 3,67 | 0,29 |
| SEQ ID NQ:40 | 1,25 | 0,48 | 2,33 | 1,25 |
| SEQ ID NO:43 | 2,00 | 0,41 | 3,75 | 0,25 |
| SEQ ID NO:44 | 3,50 | 0,29 | 4,42 | 0,25 |
| SEQ ID NO:55 | 2,00 | 0,41 | 3,67 | 0,00 |
| SEQ ID NO:56/57 | 2,50 | 0,29 | 3,58 | 0,25 |
| SEQ ID NO:58 | 1,75 | 0,85 | 2,67 | 1,04 |
| SEQ ID NO:59 | 3,00 | 0,41 | 3,75 | 0,48 |
| SEQ ID NO:70/71 | 1,75 | 0,63 | 2,67 | 1,00 |
| SEQ ID NO:77 | 2,00 | 0,00 | 3,50 | 0,29 |
| SEQ ID NO:89 | 1,75 | 0,63 | 2,50 | 1,11 |
| SEQ ID NQ:90 | 3,00 | 0,71 | 3,83 | 0,25 |
| SEQ ID NO:91/92 | 1,00 | 0,00 | 3,17 | 0,58 |
| SEQ ID NO:93 | 2,75 | 0,25 | 4,17 | 0,25 |
| SEQ ID NO:95 | 3,75 | 0,25 | 4,50 | 0,25 |
| SEQ ID NO:99 SEQ ID | 2,00 | 0,41 | 3,00 | 0,25 |
| 1X10:103/104 | 2,00 | 0,00 | 3,67 | 0,29 |
| SEQ ID NO:106 | 1,00 | 0,00 | 2,25 | 0,29 |
| SEQ ID NO:107 | 1,75 | 0,25 | 3,00 | 0,25 |
| SEQ ID NQ:110 SEQ ID | 1,75 | 0,25 | 2,83 | 0,25 |
| NO:111/112 | 1,00 | 0,00 | 3,08 | 0,25 |
| SEQ ID NO:113 | 1,25 | 0,75 | 1,83 | 1,44 |
| SEQ ID NO:118 | 2,50 | 0,29 | 3,25 | 0,50 |
| SEQ ID NO:119 | 2,25 | 1,03 | 2,75 | 1,19 |
| SEQ ID NO:120 | 2,00 | 0,41 | 3,08 | 0,29 |
| SEQ ID NO:124 | 1,75 | 0,25 | 3,00 | 0,00 |
| HRD | 1,25 | 0,25 | 2,83 | 0,48 |
| WT | 1,00 | 0,00 | 1,83 | 0,55 |
FP - Produção de flores e vagens
1- Nenhuma flor
2- Formação de poucas flores com hastes de florescência curtas
3- Formação de algumas flores quase sem vagens
4- Formação de flores e vagens
Clorose - Clorose e danos às folhas
1- Folhas completamente secas
2- Bordas de folha seca
Petição 870190122106, de 22/11/2019, pág. 88/103
83/83
3- Amarelo
4- Meio amarelo
5- Verde ± SD-desvio padrão
[00286] Como mostrado na tabela 9, as plantas que expressam genes identificados pelo método da presente invenção como conferindo tolerância à salinidade, demonstraram rendimento de flores e vagens significativamente maior e os efeitos de dano e a clorose às folhas reduziram significativamente em comparação com as plantas de controle do WT submetidas às mesmas condições de estresse de salinidade.
[00287] Para concluir, os resultados experimentais apresentados acima demonstram claramente que, pelo método único da presente invenção, podem ser identificados genes de tolerância ao estresse (por exemplo, seca, salinidade) altamente valiosos em plantas. Os genes recémidentificados conferem maior tolerância ou resistência ao estresse préselecionado em plantas em vários parâmetros importantes como área foliar, pressão de turgor, rendimento aéreo e qualidade, produção de flores e frutos, etc. Esses resultados mostram que a presente invenção provê um novo método de triagem que identifica genes de plantas de tolerância ao estresse que podem ser expressos em safras desejáveis e importantes para possibilitar seu crescimento e aumentar seu rendimento sob várias condições de estresse abiótico ou biótico.
Claims (67)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para a triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende etapas de:a. obter material metagenômico ou material metatranscriptômico a partir de uma amostragem de nicho ecológico;b. construir uma biblioteca de expressão a partir do dito material metagenômico ou metatranscriptômicoc. produzir plantas transformadas com a dita biblioteca de expressão em uma eficiência de transformação de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes;d. realizar triagem das plantas transformadas expressando dito traço de melhoramento de planta; ee. identificar dito transgene de ditas plantas transformadas expressando dito traço de melhoramento de planta.
- 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de editar um gene alvo em uma planta de safra desejável de acordo com a informação genética obtida do dito transgene.
- 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita edição do dito gene alvo é realizada usando qualquer sistema de edição de genoma ou método, incluindo sistemas usando nucleases modificadas selecionadas a partir do grupo constituído por: sistema de meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e qualquer combinação dos mesmos.
- 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito nicho ecológico compreende planta, microbiano, fúngico ou outros organismos ou partes dos mesmos.Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 7/212/15
- 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de triagem compreende medições das ditas plantas transformadas em comparação com as plantas de controle, ditas medições são selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco de brotos de planta, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, rendimento de flores, rendimento de vagens ou frutos, clorose, danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos.
- 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita planta de controle é uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica e faltando dito transgene, ou uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica, faltando dito transgene e transformada com um gene conhecido conferindo à dita planta o traço de melhoramento.
- 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (a) compreende adicionalmente etapas de enriquecer o dito material genético pelo crescimento em meios ricos ou em meios seletivos.
- 8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (a) compreende adicionalmente etapas de realçar a expressão do dito traço cultivando o dito material metagenômico ou metatranscriptômico em meio seletivo para o dito traço.
- 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (b) compreende etapas de produzir a biblioteca de cDNA procariótico ou a biblioteca de cDNA eucariótico ou ambos.
- 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (b) compreende adicionalmente etapas de clonagem da dita biblioteca de cDNA em pelo menos um vetor binário.Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 8/213/15
- 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito vetor binário compreende um promotor constitutivo ou um promotor induzido por estresse.
- 12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito vetor binário compreende marcador de seleção bacteriana e marcador de seleção de transformação de plantas.
- 13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de transformar ditos vetores binários clonados em células hospedeiras.
- 14. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de transformar ditos vetores binários clonados em Agrobacterium tumefaciens.
- 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de introduzir a dita Agrobacterium tumefaciens transformada em pelo menos um dentre: planta inteira, tecido vegetal e célula vegetal.
- 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende etapas de introduzir a dita Agrobacterium tumefaciens transformada pulverizando ditas plantas com um inóculo que compreende Agrobacterium transformada.
- 17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (d) compreende cultivar ditas plantas transformadas sob condições seletivas para dito traço.
- 18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de:f. coletar sementes T1 a partir das ditas plantas transformadas da etapa (d);g. determinar a eficiência da transformação da biblioteca de sementes das ditas sementes T1;Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 9/214/15h. semear as ditas sementes T1 da etapa (e) sob condições seletivas permitindo a triagem e a seleção das plantas transformadas que expressam o dito traço;i. testar ditas plantas selecionadas expressando o dito traço da etapa (g) para a presença do dito transgene; ej. isolar e sequenciar o dito transgene de ditas plantas transformadas selecionadas positivamente testadas para o dito transgene da etapa (h).
- 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de:k. coletar sementes T2 das ditas plantas de (h), que são positivas para a presença do dito transgene;l. cultivar plantas das ditas sementes T2 sob condições seletivas permitindo a triagem e a seleção de plantas transformadas expressando o dito traço em comparação com as plantas de controle transformadas com genes conhecidos conferindo o dito traço; em. opcionalmente, isolar e sequenciar o dito transgene das ditas plantas selecionadas da etapa (j).
- 20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 e 19, caracterizado pelo fato de que compreende etapas dea. reclonar e sequenciar dito transgene isolado da etapa (i) e/ou (I);b. transformar o dito transgene reclonado em plantas;c. realizar triagem das ditas plantas transformadas da etapa (b) para seleção de plantas transformadas expressando o dito traço;d. isolar o dito transgene das ditas plantas selecionadas da etapa (c);ee. opcionalmente, repetir as etapas (a) a (d).
- 21. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito nicho ecológico compreende populações, habitats, poolsPetição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 10/215/15 de genes, cultura procariótica, cultura eucariótica e qualquer combinação dos mesmos.
- 22. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito nicho ecológico compreende microbioma, microbiota, cultura microbiana, planta, levedura, algas, nematódeos ou qualquer outro organismo ou combinações dos mesmos.
- 23. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito nicho ecológico compreende fatores bióticos predefinidos, fatores abióticos e uma combinação dos mesmos.
- 24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita amostragem compreende amostra do solo, amostra da água, amostra da matéria orgânica e qualquer combinação dos mesmos.
- 25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito traço de melhoramento de planta é selecionado a partir do grupo que consiste na resistência ou na tolerância a pelo menos um estresse biótico, resistência ou tolerância a pelo menos um estresse abiótico, rendimento melhorado, biomassa melhorada, qualidades e valores alimentares melhorados, rendimento de grãos melhorado, resistência ou tolerância à herbicidas ou químicos e qualquer combinação dos mesmos.
- 26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o dito estresse abiótico é selecionado a partir do grupo constituído por: seca, salinidade, calor, frio, absorção de fertilizantes, eficiência do uso de fertilizantes e qualquer combinação dos mesmos.
- 27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o dito estresse biótico é selecionado a partir do grupo constituído por: doenças de plantas, patógenos, bactérias, vírus, fungos, parasitas, insetos benéficos e prejudiciais, ervas daninhas, plantas cultivadas ou nativas ou qualquer combinação dos mesmos.Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 11/216/15
- 28. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende etapas de extrair o RNA da dita amostragem do dito nicho ecológico.
- 29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a dita extração de RNA é executada de acordo com kits comerciais padrão ou de acordo com qualquer outro protocolo para a extração de RNA da amostragem ambiental.
- 30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o dito protocolo para extração de RNA da amostragem ambiental compreende as etapas de:a. obter uma amostra de solo;b. misturar a dita amostra de solo com um tampão de extração compreendendo 500mM de tampão fosfato pH 8 e 5% p/v brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) com fenol (pH 8)/clorofórmio/IAA razão de 25:24:1;c. sujeitar a dita mistura à etapa (b) a 15 minutos de agitação a 37 QC ou a um disruptor de células por 1 minuto;d. centrifugar a dita mistura da etapa (c) em 2.500 g por cerca de 10 minutos à temperatura ambiente para obter uma fase aquosa;e. transferir a dita fase aquosa para um novo tubo;f. acrescentar à dita fase aquosa dentro do dito tubo da etapa (e) uma quantidade igual de iso-propanol suplementado com 20 mg/ml de solução de cristal violeta para obter solução colorida de violeta;g. misturar a dita solução invertendo o dito tubo da etapa (f) e então incubando dito tubo por cerca de 30 minutos na temperatura ambiente;h. centrifugar o dito tubo da etapa (g) em 2.500g por aproximadamente 30 minutos na temperatura ambiente para obter uma camada colorida de violeta;Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 12/217/15i. transferir dita camada colorida de violeta em um novo tubo e centrifugar o dito tubo por cerca de 5 min na velocidade máxima para obter pelete e sobrenadante;j. lavar o dito pelete com 80% v/v etanol gelado e centrifugar por 5 min adicionais para obter pelete e sobrenadante;k. remover dito sobrenadante da etapa (j) e permitir que o dito pelete seque; el. suspender dito pelete seca em água em uma razão de 100 μΙ de água para 2gr de solo da etapa (a).
- 31. Planta caracterizada pelo fato de que compreende o dito transgene identificado pelo método conforme qualquer uma das reivindicações de 1 a 30.
- 32. Planta, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a dita planta tem pelo menos um traço de melhoramento de planta em comparação com uma planta do mesmo gênero que falta o dito transgene.
- 33. Sequência de polinucleotideo caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método conforme qualquer uma das reivindicações de 1 a 30.
- 34. Polinucleotideo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotideo compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polinucleotideo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-148 e qualquer combinação da mesma.
- 35. Sequência de polinucleotideo caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de polinucleotideo conforme qualquer uma das reivindicações de 33 e 34.
- 36. Sequência de polipeptideo caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método conforme a reivindicação 1.
- 37. Sequência de polipeptideo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o dito polipeptideo compreende umaPetição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 13/218/15 sequência de aminoácido que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polipeptídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 149-321 e qualquer combinação da mesma.
- 38. Sequência de polipeptídeo caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 60% de similaridade de sequência com a sequência de polipeptídeo conforme qualquer uma das reivindicações de 36 e 37.
- 39. Uso do método conforme a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é para identificar genes conferindo traços de melhoramento de planta selecionados a partir do grupo que consiste na resistência ou na tolerância a estresse abiótico, resistência ou tolerância a estresse biótico, rendimento melhorado, biomassa melhorada, qualidades e valores alimentares melhorados, rendimento de grãos melhorado, resistência ou tolerância à herbicidas ou químicos e qualquer combinação dos mesmos.
- 40. Uso, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o dito estresse abiótico é selecionado a partir do grupo constituído por: seca, salinidade, calor, frio, utilização de fertilizantes e qualquer combinação dos mesmos.
- 41. Uso, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o dito estresse biótico é selecionado a partir do grupo constituído por: doenças de plantas, patógenos, bactérias, vírus, fungos, parasitas, insetos benéficos e prejudiciais, ervas daninhas, plantas cultivadas ou nativas ou qualquer combinação dos mesmos.
- 42. Método para a triagem e identificação de um traço de melhoramento de resistência ou tolerância à seca ou salinidade em plantas, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende etapas de:a. obter material metagenômico ou material metatranscriptômico derivado de uma amostra de fonte de baixa umidade ou de salinidade elevada;b. construir uma biblioteca de expressão a partir do dito material metagenômico ou metatranscriptômico;Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 14/219/15c. produzir plantas transformadas com a dita biblioteca de expressão em uma eficiência de transformação de pelo menos 0,5%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes;d. realizar triagem para plantas transformadas resistentes ou tolerantes a condições predeterminadas de seca ou salinidade;e. identificar o dito transgene das ditas plantas transformadas resistentes ou tolerantes à seca ou à salinidade da etapa (d).
- 43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de editar um gene alvo em uma planta de safra desejável de acordo com a informação genética obtida do dito transgene.
- 44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a dita edição do dito gene alvo é realizada usando qualquer sistema de edição de genoma ou método, incluindo sistemas usando nucleases modificadas selecionadas a partir do grupo constituído por: sistema de meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e qualquer combinação dos mesmos.
- 45. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a dita amostra de fonte compreende planta, microbiana, fúngica ou outros organismos ou partes dos mesmos.
- 46. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de triagem compreende medições das ditas plantas transformadas em comparação com as plantas de controle, ditas medições são selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco de brotos de planta, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, rendimento de flores, rendimento de vagens ou frutos, clorose, danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos.Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 15/2110/15
- 47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a dita planta de controle é uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica e faltando dito transgene ou uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica, faltando dito transgene e transformada com um gene conhecido conferindo à dita planta o traço de melhoramento.
- 48. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (b) compreende adicionalmente etapas de clonagem da dita biblioteca de expressão em pelo menos um vetor binário.
- 49. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de:f. coletar sementes T1 das ditas plantas transformadas da etapa (c);g. semear ditas sementes T1 em solo seletivo para plantas transformadas, com teor de água de cerca de 100% de capacidade;h. cultivar plantas das ditas sementes T1 em condições de seca ou salinidade e/ou sem irrigação até a maioria das plantas morrerem, para produzir plantas transformadas que sobrevivem às ditas condições de seca ou salinidade;i. cultivar ditas plantas transformadas que sobrevivem à seca ou salinidade para produzir sementes T2;j. realizar triagem das ditas plantas transformadas que sobrevivem à seca ou salinidade da etapa (i) para presença de um transgene;k. isolar e sequenciar dito transgene de plantas tríadas positivamente da etapa (j);
- 50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de:Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 16/2111/15l. coletar sementes T2 de cada uma das ditas plantas transformadas que sobrevivem à seca ou salinidade tríadas positivamente contendo transgene da etapa (j);m. cultivar plantas T2 de cada uma das ditas sementes T2 contendo transgene da etapa (I) sob condições predeterminadas de seca ou salinidade, em comparação com as plantas de controle do mesmo gênero e a que faltam o dito transgene ou transformadas com genes conhecidos conferindo tolerância à seca ou à salinidade ou resistência à seca ou à salinidade;n. realizar medições de triagem de tolerância ou resistência à seca para cada das ditas plantas T2 contendo transgene em comparação com as ditas plantas de controle, ditas medições são selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, produção de flores e vagens, clorose e danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos.o. isolar o transgene das ditas plantas T2 que realizam resistência à seca ou salinidade tríadas da etapa (n);p. opcionalmente, reclonar dito transgene em um vetor binário;q. opcionalmente, transformar dito vetor binário clonado em plantas e cultivar ditas plantas transformadas sob condições predeterminadas de seca ou salinidade; er. opcionalmente, repetir as etapas (I) a (q).
- 51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a dita etapa do cultivo de plantas T2 compreende etapas de:a. semear ditas sementes T2 em solo seletivo para plantas transformadas, com teor de água de cerca de 100% de capacidade; ePetição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 17/2112/15b. irrigar ditas plantas quando o teor de água no solo alcança cerca de 5-10%.
- 52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que as ditas condições predeterminadas de seca ou de salinidade são selecionadas a partir do grupo que consiste de baixa umidade, alta salinidade, solo seco e calor.
- 53. Sequência de polinucleotideo caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método conforme a reivindicação 42.
- 54. Polinucleotideo, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotideo compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polinucleotideo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a SEQ ID NO:148 e qualquer combinação da mesma.
- 55. Sequência de polinucleotideo caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de polinucleotideo conforme qualquer uma das reivindicações de 53 e 54.
- 56. Sequência de polipeptideo caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método conforme a reivindicação 42.
- 57. Sequência de polipeptideo, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de polipeptideo compreende uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência como estabelecida em uma sequência de polipeptideo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID Nos: 149-321 e qualquer combinação dos mesmos.
- 58. Sequência de polipeptideo caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 60% de similaridade de sequência com a sequência de polipeptideo conforme qualquer uma das reivindicações de 56 e 57.
- 59. Método para extrair o RNA de uma amostra de solo caracterizado pelo fato de que compreende etapas de:Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 18/2113/15a. obter uma amostra de solo;b. misturar a dita amostra de solo com um tampão de extração compreendendo 500mM de tampão fosfato pH 8 e 5% p/v brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) com fenol (pH 8)/clorofórmio/IAA razão de 25:24:1;c. sujeitar a dita mistura à etapa (b) a 15 minutos de agitação a 37 QC ou a um disruptor de células por 1 minuto;d. centrifugar a dita mistura da etapa (c) em 2.500 g por cerca de 10 minutos à temperatura ambiente para obter uma fase aquosa;e. transferir a dita fase aquosa para um novo tubo;f. acrescentar a dita fase aquosa dentro do dito tubo da etapa (e) uma quantidade igual de iso-propanol suplementado com 20 mg/ml de solução de cristal violeta para obter solução colorida de violeta;g. misturar a dita solução invertendo o dito tubo da etapa (f) e então incubando dito tubo por cerca de 30 minutos na temperatura ambiente;h. centrifugar o dito tubo da etapa (g) em 2.500g por aproximadamente 30 minutos na temperatura ambiente para obter uma camada colorida de violeta;i. transferir dita camada colorida de violeta em um novo tubo e centrifugar o dito tubo por cerca de 5 min na velocidade máxima para obter pelete e sobrenadante;j. lavar o dito pelete com 80% v/v etanol gelado e centrifugar por 5 min adicionais para obter pelete e sobrenadante;k. remover dito sobrenadante da etapa (j) e permitir que o dito pelete seque; el. suspender dito pelete seco em água em uma razão de 100 μΙ de água para 2gr de solo da etapa (a).Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 19/2114/15
- 60. Método para a triagem e identificação de um traço de melhoramento de planta desejável, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende etapas de:a. obter uma amostragem de uma fonte predefinida;b. extrair RNA da dita amostragem de acordo com o método de reivindicação 60;c. construir uma biblioteca de expressão a partir do dito RNA da etapa (b);em que o dito método compreende adicionalmente as etapas de:d. produzir plantas transformadas com a dita biblioteca de expressão em uma eficiência de pelo menos 0,05%-30%, representando pelo menos 102-1010 transgenes;e. realizar triagem das plantas transformadas expressando dito traço desejável; ef. identificar dito transgene de ditas plantas transformadas expressando dito traço desejável.
- 61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de editar um gene alvo em uma planta de safra desejável de acordo com a informação genética obtida do dito transgene.
- 62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a dita edição do dito gene alvo é realizada usando qualquer sistema de edição de genoma ou método, incluindo sistemas usando nucleases modificadas selecionadas a partir do grupo constituído por: sistema de meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e qualquer combinação dos mesmos.Petição 870190122960, de 25/11/2019, pág. 20/2115/15
- 63. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a dita fonte predefinida compreende planta, microbiana, fúngica ou outros organismos ou partes dos mesmos de um nicho ambiental.
- 64. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de triagem compreende medições das ditas plantas transformadas em comparação com as plantas de controle, ditas medições são selecionadas a partir do grupo constituído por: medições de pressão de turgor, morte de planta, área foliar, peso fresco de brotos de planta, número de folhas, peso fresco de ramo, comprimento do ramo principal, rendimento de flores, rendimento de vagens ou frutos, clorose, danos às folhas, estado ou desempenho das plantas e qualquer combinação dos mesmos.
- 65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a dita planta de controle é uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica e faltando dito transgene ou uma planta do mesmo gênero que a dita planta transgênica, faltando dito transgene e transformada com um gene conhecido conferindo à dita planta o traço de melhoramento.
- 66. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 80% de similaridade de sequência com uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a SEQ ID NO: 148 e qualquer combinação dos mesmos.
- 67. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 60% de similaridade da sequência com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID Nos: 149-321 e qualquer combinação dos mesmos.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762477517P | 2017-03-28 | 2017-03-28 | |
| US62/477,517 | 2017-03-28 | ||
| US201862644600P | 2018-03-19 | 2018-03-19 | |
| US62/644,600 | 2018-03-19 | ||
| PCT/IL2018/050349 WO2018178975A1 (en) | 2017-03-28 | 2018-03-27 | Methods for improving traits in plants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112019020167A2 true BR112019020167A2 (pt) | 2020-06-02 |
Family
ID=63674330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112019020167-0A BR112019020167A2 (pt) | 2017-03-28 | 2018-03-27 | Métodos para melhoramento dos traços das plantas |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US11111491B2 (pt) |
| EP (1) | EP3599829B1 (pt) |
| CN (1) | CN110691509A (pt) |
| AU (2) | AU2018242633B2 (pt) |
| BR (1) | BR112019020167A2 (pt) |
| CA (1) | CA3057004A1 (pt) |
| CL (1) | CL2019002757A1 (pt) |
| CO (1) | CO2019010530A2 (pt) |
| ES (1) | ES2964023T3 (pt) |
| MX (2) | MX2019011579A (pt) |
| PH (1) | PH12019502244A1 (pt) |
| WO (1) | WO2018178975A1 (pt) |
| ZA (1) | ZA201906391B (pt) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113584076B (zh) * | 2021-08-31 | 2023-09-15 | 西南大学 | 沉默桑实杯盘菌G蛋白β亚基编码基因CsGβ2的沉默载体及其应用和方法 |
| CN115948426B (zh) * | 2022-12-19 | 2024-02-20 | 海南大学 | 一种炭疽菌CsATLP基因及应用 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6030779A (en) | 1995-07-18 | 2000-02-29 | Diversa Corporation | Screening for novel bioactivities |
| US6057103A (en) | 1995-07-18 | 2000-05-02 | Diversa Corporation | Screening for novel bioactivities |
| US20030215798A1 (en) | 1997-06-16 | 2003-11-20 | Diversa Corporation | High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes |
| US6972183B1 (en) | 1997-06-16 | 2005-12-06 | Diversa Corporation | Capillary array-based enzyme screening |
| US6368798B1 (en) | 1995-12-07 | 2002-04-09 | Diversa Corporation | Screening for novel bioactivities |
| CR5828A (es) * | 1997-07-30 | 1999-10-25 | Wisconsin Alumni Res Found | Plasma de germen y marcadores moleculares para resistenciaen enfermedades de papas |
| AU770540B2 (en) | 1998-04-30 | 2004-02-26 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Novel method for the identification of clones conferring a desired biological property from an expression library |
| US7723110B2 (en) * | 2005-06-17 | 2010-05-25 | Arborgen, Llc | Plant cell signaling genes |
| US20110252501A1 (en) * | 2006-08-17 | 2011-10-13 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
| CL2007002532A1 (es) | 2006-08-31 | 2008-01-11 | Monsanto Technology Llc Soc Organizada Bajo Las Leyes Del Estado De Delaware | Procedimiento para identificar genes que confieren rasgos mejorados de una población de plantas. |
| US7867459B2 (en) | 2008-07-15 | 2011-01-11 | Sidney Leroy Born | Compact, tiered sulfur recovery unit |
| US8937215B2 (en) | 2009-08-04 | 2015-01-20 | Evogene Ltd. | Polynucleotides and polypeptides for increasing desirable plant qualities |
| WO2012143865A1 (en) * | 2011-04-22 | 2012-10-26 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and method for making the same |
| BR112015015415B1 (pt) * | 2012-12-25 | 2022-08-16 | Evogene Ltd. | Métodos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, taxa de crescimento, biomassa, rendimento da semente, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, para produzir de uma cultura, para cultivar uma colheita, e, para selecionar uma planta |
| CN103382476B (zh) * | 2013-06-06 | 2015-04-08 | 江苏省农业科学院 | 赋予植物耐寒性的一个棉花P型ATP酶基因Gbpatp的应用 |
| WO2016095124A1 (en) | 2014-12-17 | 2016-06-23 | Kunming Institute Of Botany, The Chinese Academy Of Sciences | Compositions and methods for increasing drought tolerance in plants |
-
2018
- 2018-03-27 ES ES18777864T patent/ES2964023T3/es active Active
- 2018-03-27 AU AU2018242633A patent/AU2018242633B2/en active Active
- 2018-03-27 EP EP18777864.2A patent/EP3599829B1/en active Active
- 2018-03-27 BR BR112019020167-0A patent/BR112019020167A2/pt unknown
- 2018-03-27 CN CN201880034473.XA patent/CN110691509A/zh active Pending
- 2018-03-27 MX MX2019011579A patent/MX2019011579A/es unknown
- 2018-03-27 CA CA3057004A patent/CA3057004A1/en active Pending
- 2018-03-27 US US16/496,445 patent/US11111491B2/en active Active
- 2018-03-27 WO PCT/IL2018/050349 patent/WO2018178975A1/en unknown
-
2019
- 2019-09-26 CO CO2019010530A patent/CO2019010530A2/es unknown
- 2019-09-26 CL CL2019002757A patent/CL2019002757A1/es unknown
- 2019-09-27 ZA ZA2019/06391A patent/ZA201906391B/en unknown
- 2019-09-27 PH PH12019502244A patent/PH12019502244A1/en unknown
- 2019-09-27 MX MX2023004224A patent/MX2023004224A/es unknown
-
2021
- 2021-07-29 US US17/388,310 patent/US11905512B2/en active Active
-
2023
- 2023-03-07 US US18/118,283 patent/US12054709B2/en active Active
-
2024
- 2024-01-09 US US18/407,953 patent/US20240209351A1/en active Pending
- 2024-01-09 US US18/407,975 patent/US20240141329A1/en active Pending
- 2024-01-18 AU AU2024200329A patent/AU2024200329A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210388340A1 (en) | 2021-12-16 |
| US20240141329A1 (en) | 2024-05-02 |
| EP3599829A4 (en) | 2020-07-29 |
| CN110691509A (zh) | 2020-01-14 |
| EP3599829B1 (en) | 2023-10-04 |
| US20240209351A1 (en) | 2024-06-27 |
| US11905512B2 (en) | 2024-02-20 |
| MX2023004224A (es) | 2023-04-21 |
| WO2018178975A1 (en) | 2018-10-04 |
| US20200115704A1 (en) | 2020-04-16 |
| ES2964023T3 (es) | 2024-04-03 |
| CL2019002757A1 (es) | 2020-03-06 |
| AU2018242633B2 (en) | 2024-02-08 |
| US12054709B2 (en) | 2024-08-06 |
| EP3599829A1 (en) | 2020-02-05 |
| AU2024200329A1 (en) | 2024-02-15 |
| EP3599829C0 (en) | 2023-10-04 |
| CO2019010530A2 (es) | 2019-10-31 |
| ZA201906391B (en) | 2020-09-30 |
| US11111491B2 (en) | 2021-09-07 |
| WO2018178975A9 (en) | 2018-11-29 |
| PH12019502244A1 (en) | 2020-06-29 |
| AU2018242633A1 (en) | 2019-10-17 |
| CA3057004A1 (en) | 2018-10-04 |
| MX2019011579A (es) | 2020-01-20 |
| US20230313179A1 (en) | 2023-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2398465T3 (es) | Procedimientos para potenciar la tolerancia a la sequía en plantas y procedimientos de los mismos | |
| ES2550364T3 (es) | Plantas que tienen incrementada la tolerancia al estrés térmico | |
| US12054709B2 (en) | Methods for improving traits in plants | |
| US20200095600A1 (en) | Corn genes zmspl1 and zmspl2 and uses thereof | |
| CN108368515A (zh) | 耐旱玉米 | |
| WO2005071083A1 (fr) | Facteur de transcription arabidopis thaliana, gene le codant et utilisation correspondante | |
| CN110128514A (zh) | 水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4b及编码基因与应用 | |
| CN109797157A (zh) | 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用 | |
| CN106967728B (zh) | 一种南瓜抗逆基因CmNAC1及其应用 | |
| CN109879944A (zh) | 一种与植物抗旱性相关的ear1蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN106414742A (zh) | 玉米调节元件及其用途 | |
| US20230054349A1 (en) | Application of EMBP1 Gene or Protein Thereof | |
| CN108070600A (zh) | 种子活力的调节 | |
| Li et al. | Analysis of physiological characteristics of abscisic acid sensitivity and salt resistance in Arabidopsis ANAC mutants (ANAC019, ANAC072 and ANAC055) | |
| CN116445446B (zh) | 野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用 | |
| CN108841837A (zh) | 拟南芥剪接因子SR45a剪接体的编码基因在负调控植物盐胁迫应答中的应用 | |
| CN110922464B (zh) | 花楸树小热激蛋白的应用和提高植物非生物胁迫耐受性的方法 | |
| CN105132428B (zh) | 一种与植物根系性状相关的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用 | |
| CN109706154A (zh) | CsPR3基因及其在黄瓜抗枯萎病中的应用 | |
| US10563219B2 (en) | Corn genes ZmSPL1 and ZmSPL2 and uses thereof | |
| CN109121420A (zh) | 耐寒植物 | |
| CN109422804B (zh) | ZmMKK10蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN106811448B (zh) | 棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTP1及其编码基因和应用 | |
| PHILOSOPY | Characteristics of Plasmodiophora brassicae causing clubroot disease on the cruciferous weed Cardamine occulta in post-harvest paddy fields in Japan | |
| Perkins | Engineering Improved Seed Degreening in Brassica napus (canola) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] | ||
| B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] |