WO2008010296A1 - Micro-organisme doté d'un gène remplacé et procédé de production de polyester à l'aide dudit micro-organisme - Google Patents

Micro-organisme doté d'un gène remplacé et procédé de production de polyester à l'aide dudit micro-organisme Download PDF

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WO2008010296A1
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gene
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strain
polyester
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Hiroyuki Maruyama
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Kaneka Corporation
Meredian, Inc.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to an improved microbial strain useful for the commercial production of polyhydroxyalkanoic acid (PHA), which is a biodegradable polyester, and a method for producing PHA using the same.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • Polyhydroxyalkanoic acid is a polyester-type organic polymer produced by a wide range of microorganisms. Since these polymers are biodegradable, are thermoplastic polymers, and are produced with renewable resources, they are industrially produced as environmentally conscious materials or biocompatible materials, and are used in a variety of ways. Attempts to use it in industry are being made.
  • the monomer constituting this polyester is the general name 3-hydroxyalkanoic acid, specifically 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, or Polymer molecules are formed by mono- or copolymerization of 3-hydroxyalkanoic acid having a longer alkyl chain.
  • Poly 3-hydroxybutyric acid hereinafter abbreviated as P (3HB)
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • 3HB a homopolymer of 3-hydroxybutyric acid
  • medium chain P composed of 3-hydroxyalkanoic acid having 6 to 16 carbon atoms in the alkyl chain.
  • HA is known to be less elastic than P (3HB) and P (3HB-co-3HV) (see Non-Patent Document 1), and is expected to be used in different fields.
  • Research on the production of medium-chain PHA has been conducted by introducing the PHA synthase gene of Pseudomonas into Pseudomonas, Ralstonia, and Escherichia coli, but none of these are suitable for industrial production because of low productivity. (See Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4)
  • P (3HB-CO-3HH) a two-component copolymer polyester
  • 3HH 3-hydroxyhexanoic acid
  • the method for producing P (3HB-co-3HH) in these reports is the production of fermented oil and fat such as fatty acid such as oleic acid using Aeromonas caviae isolated from soil. there were. Studies on the properties of P (3HB-co-3HH) have also been made (see Non-Patent Document 5).
  • Aeromonas canabiae was cultured using fatty acids with 12 or more carbon atoms as the sole carbon source, and 3HH yarn and 11 to 19 mol% P (3HB-co-3HH) was produced by fermentation. Yes.
  • This P (3HB—co—3HH) becomes harder, more brittle, and more flexible than P (3HB) as the 3HH composition increases. Flexibility exceeds P (3HB-co-3HV) It was revealed that In other words, P (3HB-co-3HH) has a wide range of physical properties that can be applied up to hard polyester strength and soft polyester by changing the 3HH yarn composition. Can be expected to be applied to a wide range of fields, from film to films that require flexibility.
  • Aeromonas hydrophila using glucose and lauric acid as carbon sources Cultivated and achieved bacterial cell production of 50gZL and polyester content of 50% see Non-Patent Document 7
  • Aeromonas hydrophila is pathogenic to humans (see Non-Patent Document 8) It is not a suitable species for industrial production.
  • an expensive carbon source is used in these culture productions, the use of an inexpensive carbon source is also required from the viewpoint of manufacturing cost.
  • PHA Polyhydroxyalkanoic acid synthase gene was cloned from Aeromonas japonica (see Patent Document 5 and Non-Patent Document 9).
  • Production of P (3HB-co-3HH) using a transformant in which this gene was introduced into Ralstonia eutropha (formerly Alkagenes eutropha) resulted in a cell productivity of 4 gZL and a polyester content.
  • the production of bacterial cells was 4gZL and the polyester content was 80% (see Non-Patent Document 10).
  • research on the culture method was conducted so that the cell production was improved to 45 gZL, the polyester content 62.5%, and the 3HH composition 8.1% by improving the culture conditions (see Patent Document 6).
  • a P (3HB-co-3HH) production strain using E. coli as a host was also constructed. Strains were constructed by introducing the PHA synthase gene of Aeromonas and the NADP-acetocetyl Co-A reductase gene of Ralstonia utoptophasis into E. coli. As a result of culturing the same Escherichia coli using dodecane as a carbon source, the cell mass was 79 gZL, the polyester content was 27.2%, and the 3HH composition was 10.8% after 40.8 hours of cultivation (see Non-Patent Document 12).
  • E. coli strain prepared by randomly inserting a gene encoding a PHA biosynthetic enzyme into the chromosome of E. coli disclosed in Patent Document 8 is P (at a level exceeding 85% of the cell dry weight. 3HB) was produced.
  • P at a level exceeding 85% of the cell dry weight. 3HB
  • P 3HB-co 3HH
  • random on the chromosome Depending on the site of integration, there may be situations where the gene expression on or around that site may be affected, and as a PHA-producing strain, the ability to exhibit sufficient capacity is not present. To do.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-150393
  • Patent Document 2 JP 59-220192 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 5-93049
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 7-265065
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 10-108682
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-340078
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 59-205983
  • Patent Document 8 US Patent No. 6593116
  • Non-Patent Document 1 Madison et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63: 21-53 (1999)
  • Non-Patent Document 2 Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180: 6459-6467 (1998)
  • Non-Patent Document 3 Matsusaki et al., Appl. Micrbiol. Biotechnol., 53: 401-409 (20
  • Non-Patent Document 4 Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150: 303—309 (1997)
  • Non-Patent Document 5 Doi et al., Macromolecules, 28: 4822-4828 (1995)
  • Non-Patent Document 6 Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 67: 240-244 (2000)
  • Non-patent document 7 Cher ⁇ , Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 50-55 (2001)
  • Non-patent document 8 National Institute of Infectious Diseases Safety management regulations for pathogens, etc.Appendix 1 Appendix 1 (1999)
  • Non-patent document 9 Fukui et al., J. Bacteriol., 179: 4821-4830 (1997)
  • Non-patent literature 10 Fukui et al., Appl. Microbiol. Biotecnol., 49: 333—336 (1998)
  • Non-patent literature ll Fukui et al., Biomacromolecules, 3: 618—624
  • Non-patent literature 12 Park et al., Biomacromolecules , 2: 248—254 (2001)
  • Non-Patent Document 13 Kichise et al., Appl. Environ. Microbiol., 68: 2411— 2419 (20
  • Non-Patent Document 14 Amara et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 59: 477-482 (200 2)
  • Non-Patent Document 15 Lee et al., J. Biotechnol., 32: 203—211 (1994)
  • Non-Patent Document 16 Kranz et al., Appl. Environ. Microbiol., 63: 3003-3009 (1997
  • Non-Patent Document 17 York et al., J. Bacteriol., 183: 4217-4226 (2001)
  • Non-patent literature 18 Schlegel et al., Arch. Mikrobiol., 71: 283-294 (1970)
  • Non-patent literature 19 Schubert et al., J. Bacteriol., 170: 5837-5847 (1988)
  • Non-patent literature 20 Peoples et al. Biol. Chem., 264: 15298-15303 (1989) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a recombinant microbial strain that stably accumulates a high level of a copolyester that can be expected to be used in a wide range of applications in an industrial scale culture process, and a copolyester using the copolyester. It is to provide a manufacturing method.
  • the microbial strain in which the polyhydroxyalkanoate synthase gene on the chromosome of Ralstonia 'eutropha H16 strain was replaced with a polyhydroxyalkanoate synthase mutant gene derived from Aeromonas' canae is 48 Pour (3HB-co-3HH) with a cell production of 10.4 gZL and a polyester content of 73.8 wt% was produced by incubation over time. This productivity greatly exceeded that of P (3HB-co-3HH) reported so far.
  • This strain also does not require antibiotics or any other selective pressure at all steps of the culture, and virtually all cells accumulate P (3HB-co-3HH) at the end of the culture! / I found out.
  • the present invention is as follows.
  • [0022] [2] The microorganism according to [1], wherein the copolyester is composed of a monomer unit of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid. [3] The microorganism according to [1] or [2], wherein the microorganism originally having a polyhydroxyalkanoate synthase gene on a chromosome is Ralstonia eutropha.
  • microorganism according to any one of [1] to [4], which encodes an enzyme derived from exogenous polyhydroxyalkanoic acid synthase, Aeromonas japonica, or a variant thereof.
  • copolyester in the present invention has the following general formula:
  • R 1 and R 2 represent an alkyl group having 1 or more carbon atoms, and may be the same or different in the polymer.
  • M and n represent the number of monomer units of the polymer, and 1 or more.
  • copolyester those composed of monomer units of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid are preferable.
  • the microorganism used in the present invention can be used without particular limitation as long as it is a microorganism that originally has a polyhydroxyalkanoate synthase gene as a biological species in its chromosomal DNA, and another carbon source can be used.
  • Microorganisms modified in this way microorganisms modified in the production and incorporation of substrate monomers, or microorganisms modified to increase production.
  • ii Ralstonia eutropha (taxonically, Wautersia eutropna, Cupriavidus necator and P Examples include bacteria such as Pseudomonas genus such as putida, etc. From the viewpoint of safety and productivity, Ralstonia genus is preferable, Ralstonia eutropha is more preferable, and Ralstonia eutropha HI 6 strain is more preferable.
  • the exogenous polyhydroxyalkanoate synthase gene used in the present invention may be any gene derived from various PHA accumulating organisms as long as it can accumulate a copolyester.
  • examples of such genes include Aeromonas caviae (Non-Patent Document 9), Nocardia corallina (GenBank accession number AF019964), Pseudomonas aeruginosa (Timm et al., Eur. J. Biochem., 209: 15-30 (1992) ), Pseudomonas oleovorans (Huisman et al., J. Biol.
  • polyester synthase gene (N 149S mutant gene) derived from Aeromonas canabiae in which the 149th amino acid asparagine is replaced with serine, as described in Ref. 13, and the 171st amino acid aspartic acid is glycine.
  • Polyester synthase gene (D171G mutant gene) derived from Aeromonas sp. Substituted for or from Aeromonas spp. Shown in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, which is a combination of the above two amino acid substitutions
  • the polyester synthase gene etc. which are can be used preferably.
  • the above gene is not necessarily required to have a promoter and a Z or ribosome binding site.
  • the polyester synthase gene replacement mode is such that the enzyme activity encoded by the polyester synthase gene (substitute gene) originally present on the chromosome is lost and the exogenous polyester synthase gene (substitution gene) is present. Any replacement method may be used as long as it is replaced so that it is expressed. After replacement, all the genes to be replaced may be lost from the chromosome, or some of them may be present or separated. As one embodiment of the replacement, when the replacement gene has a ribosome binding site and does not have a promoter, a replacement method can be selected that is connected downstream of the promoter of the replacement gene.
  • a replacement method in which the replacement gene is connected downstream of the ribosome binding site of the replacement gene can be selected.
  • Polyester synthase protein expressed after substitution can be replaced either as a single protein encoded by the replacement gene or as a fusion protein with the protein encoded by the replacement gene. ⁇ ⁇ .
  • the mode of substitution of the polyester synthase gene used in the present invention is not limited to the above examples, but as a preferred mode, the start codon of the replacement gene is terminated from the start codon to the stop codon. Replaces codons
  • the PHA synthase gene (phaC) of Ralstonia eutropha is shown below as Aeromonas ca
  • the replacement fragment is the coding sequence of phaC (
  • CDS including the start codon to the stop codon
  • Sequences and downstream sequences are homologous sequences necessary for homologous threading and exchange with genes on the chromosome. Generally, the longer the length, the higher the frequency of recombination, but even homologous recombination occurs. The length can be arbitrarily set.
  • a gene that serves as a selection marker at the time of gene replacement can be added to the replacement fragment.
  • a gene serving as a selection marker for example, a resistance gene of an antibiotic such as kanamycin, chloramphechol, streptomycin, ampicillin, a gene that complements various auxotrophy, and the like can be used. When using Ralstonia eutropha, the kanamycin resistance gene is preferred.
  • a gene for facilitating selection of a microorganism strain in which the region containing the selection marker gene has been eliminated by the second-stage homologous recombination can be added.
  • An example of such a gene is a sacB gene derived from Bacillus subtilis (Schweizer, Mol. Microbiol., 6: 1195—1204 (1992)). It is known that the microbial strain that expresses this gene force cannot grow on a medium containing sucrose, and it is easy to select a strain that has lost this gene due to its loss by growth on a medium containing sucrose. Become.
  • the replacement fragment composed of these is not replicated in the host microorganism strain, and is connected to a vector to produce a plasmid for gene replacement.
  • vectors that can be used in the genus Ralstonia include the pUC vector, the pBluescript vector, and the pBR322 vector, and vectors having the same origin of replication.
  • the plasmid DNA for gene replacement prepared in such a configuration can be introduced into microorganisms such as Ralstonia eutropha by known methods such as the electopore position method and the conjugation transfer method, and homologous recombination is performed. Can do.
  • a strain in which the plasmid DNA for gene replacement is inserted on the chromosome by homologous recombination is selected. Selection can be performed by a method based on a selection gene coexisting with plasmid DNA for gene replacement. When a kanamycin resistance gene is used, the strain that has grown in a medium containing kanamycin can also be selected.
  • a strain in which the region containing the chromosomal strength selection marker gene has been eliminated by the second homologous recombination is selected. Based on the selection gene used at the time of insertion, for example, you can select a strain that can no longer grow on a medium containing kanamycin! In the case where the sacB gene coexists in the gene replacement plasmid, the strain that grows in the medium containing sucrose can be easily selected. In order to confirm whether the strain obtained in this way is a strain in which the gene has been replaced as desired, a known method such as PCR, Southern hybridization method, or determination of DNA base sequence is used. it can. As described above, PHA synthase gene (phaC) power of Ralstonia eutropha PHA synthesis of SAeromonas caviae
  • the copolyester can be accumulated in the microorganism body by growing the microorganism of the present invention in the presence of a carbon source.
  • a carbon source sugar, fat or fatty acid can be used.
  • Nitrogen sources, inorganic salts, and other organic nutrient sources can be arbitrarily used as nutrient sources other than carbon sources.
  • the sugar include carbohydrates such as glucose and fructose.
  • the fats and oils include fats and oils containing a large amount of saturated and unsaturated fatty acids having 10 or more carbon atoms, such as coconut oil, palm oil, and palm kernel oil.
  • Fatty acids include saturated and unsaturated fatty acids such as hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid, and myristic acid! And fatty acid derivatives.
  • nitrogen sources include ammonia salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract and the like.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, and the like.
  • Examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline; vitamins such as vitamin Bl, vitamin B12, and vitamin C.
  • the culture temperature may be any temperature at which the fungus can grow, but is preferably 20 ° C to 40 ° C.
  • the culture time is not particularly limited, but may be about 1 to 10 days.
  • the obtained polyester accumulated in the cultured cells can be recovered by a known method.
  • the polyester can be recovered, for example, by the following method. After completion of the culture, the cells are separated from the culture solution with a centrifuge, and the cells are washed with distilled water and methanol, and dried. Polyester is extracted from the dried cells using an organic solvent such as black mouth form. Cellular components are removed from the organic solvent solution containing the polyester by filtration or the like, and a polyester is precipitated by adding a poor solvent such as methanol or hexane to the filtrate. Furthermore, the supernatant can be removed by filtration or centrifugation and dried to recover the polyester.
  • a recombinant microbial strain capable of stably and highly producing polyhydroxyalkanoic acid (PHA) in an industrial fermentation process is provided, and high-purity polyhydroxyalkanoic acid (PHA) is provided. ) Can be produced simply and in large quantities, and at low cost.
  • Ralstonia eutropha HI strain 6 was used as the source of the truncated DNA, PCR reaction was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and the polyhydroxyalkanoate synthase gene (phaC) A DNA fragment containing the structural gene was obtained. PCR conditions are (1) 94
  • the N149SZ D171G mutant which is a polyester synthase mutant gene derived from Aeromonas caviae, was prepared as follows. First, pBluescriptllKS (—) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was treated with Pstl, blunt-ended using DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and ligated to delete the Pstl site. Next, this plasmid was treated with Xhol, and blunt-ended using DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and ligated to prepare plasmid pBlue-New lacking the Xhol site.
  • pBluescriptllKS (—) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was treated with Pstl, blunt-ended using DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and ligated to prepare plasmid pBlue-New lacking the Xhol site.
  • the conditions are (1) 94 ° C for 2 minutes, (2) 94 ° C for 30 seconds, (3) 55 ° C for 30 seconds, (4) 72 ° C for 2 minutes, (2) to (4) 25 cycles, (5) 72 ° C for 5 minutes.
  • the two amplified fragments were mixed in an equimolar amount and the PCR reaction was performed again to bind the two fragments.
  • the conditions are (1) 96 ° C for 5 minutes, (2) 95 ° C for 2 minutes, (3) 72 ° C for 1 minute, and (2) to (3) for 12 cycles. Pyrobest polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
  • a DNA fragment of the desired size was excised from an agarose electrophoresis gel, treated with Pstl and Xhol, and cloned into pBlue—dl 3 treated with the same enzyme (pBlue—N 149S / D171G).
  • the base sequence was determined using DNA Sequencer 310 Genetic Analyzer from PERKIN ELMER APPLIED BIOSYS TEMS. It was confirmed that the mutant gene was replaced. This amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 9.
  • pBlue—A PCR reaction was performed using N149SZD171G as a saddle and the primers shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 to amplify the structural gene DNA of the N149SZD171G mutant.
  • PCR conditions are (1) 94 ° C for 2 minutes, (2) 94 ° C for 30 seconds, (3) 45 ° C for 30 seconds, (4) 72 ° C for 2 minutes, (2) to (4) (5) 5 minutes at 72 ° C, TaKa Ra LA Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was used as the polymerase.
  • pBlue— phaC was added to the restriction enzyme Sbfl
  • plasmid pJRD215 (ATCC37533) was treated with restriction enzymes Xhol and Dral to isolate a DNA fragment of about 1.3 kb containing a kanamycin resistance gene, and then DNA branding kit (manufactured by Takara Bio Inc.) ) To smooth the ends and pBlue-phaC :: N149S / D17
  • 1G was cleaved with the restriction enzyme Sail and then inserted into the blunt end site (pBlue—pha C :: N149S / D171G-Km) 0
  • plasmid pMT5071 (Tsuda, GENE, 207: 33-41 (1998)) was treated with restriction enzyme Notl to isolate an approximately 8 kb DNA fragment containing the sacB gene, and pBlue-phaC:
  • N149S / D171G— Km was inserted into the site cleaved with the same enzyme to prepare a gene replacement plasmid pBlue-phaC :: N149S / D171G—KmSAC.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the KmSAC configuration.
  • S17-1 strain (ATCC47005) was transformed and mixed and cultured on Ralstonia eutropha H16 strain and Nutrient Agar medium (manufactured by Difco) for conjugation transfer. Power of 250mgZL Simmons agar containing namycin (sodium taenoate 2gZL, sodium chloride 5gZ L, magnesium sulfate 7hydrate 0.2g / ammonium dihydrogen phosphate lgZL, dipotassium hydrogen phosphate lgZL, A strain that had grown on agar 15gZL, pH 6.8) was selected to obtain a strain in which the plasmid was integrated on the chromosome of Ralstonia eutropha HI 6 strain (first-stage homologous recombination).
  • This strain is cultured in Nutrient Broth medium (Difco) for 2 generations, then diluted and applied to Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, and the strain that has grown is selected to contain the selectable marker gene.
  • phaC gene was found to be N149SZ by PCR analysis.
  • a strain substituted with the D 171 G mutant gene was isolated.
  • This gene arrangement ⁇ 3 ⁇ 4 is named KNK-005, and the nucleotide sequence is determined using DNA Sequencer 310 Genetic Analyzer manufactured by PERKIN ELMER APPLIED BIOSYSTE MS. From the start codon of the phaC gene on the chromosome to the stop codon. Until N149SZD171G mutant remains
  • the gene replacement procedure performed in this example is schematically shown in FIG.
  • the gene replacement plasmid is inserted into the chromosome by the homologous recombination in the first step, and the portion corresponding to the plasmid becomes circular again and the force on the chromosome is released by the homologous recombination in the second step.
  • the gene to be replaced is replaced with the original replacement gene (phaC :: N149SZD171G) ( ⁇ 1) depending on the position where homologous recombination occurs.
  • Threads of seed medium are lwZv% Meat -extract, lw / v% Bacto— Trypton, 0.2 w / v% Yeast-extract, 0.9 w / v% Na PO-12H 0, 0.15 w / v % KH P
  • composition of the pre-culture medium is 1. lw / v% Na ⁇ 12 ⁇ 0, 0.19 w / v% KH PO, 1
  • Olein oil 0.5vZv% trace metal salt solution (1.6W / v% FeCl ⁇ 6 ⁇ in 0.1N hydrochloric acid)
  • composition of the polyester production medium is 0.385 w / v% Na PO ⁇ 12 ⁇ 0, 0.067 w / v%
  • palm kernel oil olein which is a low melting point fraction obtained by separating palm kernel oil, is used as a single carbon source.
  • the specific substrate supply rate is 0.08 to 0.1 l (g fat) X ( g net dry cell weight) _ 1 X (h) _1 fed
  • KNK- 005 glycerol stock (50 ⁇ 1) was inoculated into seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours.
  • 3 L jar mentor (Maruhishi Biotechnology) with 8 L of preculture medium MDL-300 model) was inoculated with 1.0 vZv%.
  • the operating conditions were a culture temperature of 30 ° C., a stirring speed of 500 rpm, an aeration rate of 1.8 LZmin, and a pH of 6.7 to 6.8 while controlling for 28 hours.
  • a 7% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • Polyester production culture was inoculated with 5.0 vZv% of the preculture seed in a 10 L jar mentor (MDL-1000 model manufactured by Maruhishi Bayonji Co., Ltd.) containing 6 L of production medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 28 ° C., a stirring speed of 400 rpm, an aeration rate of 3.6 LZmin, and a pH controlled between 6.7 and 6.8.
  • a 7% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • Cultivation was carried out for about 48 hours, and after culturing, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the dry cell weight was measured. As a result, it was 10.4 gZL.
  • the culture broth at the end of polyester production culture in Example 3 was diluted and seeded on a Nutrient Agar medium, and the grown colonies were cultured in a Nilered-containing medium (2 g of sodium hydrogen phosphate and 12 g of 12 phosphate, 2 potassium potassium phosphate) 1.
  • a recombinant microorganism strain capable of stably and highly producing polyhydroxyalkanoic acid (PHA) in an industrial fermentation process, and a highly pure polyhydroxyalkanoic acid (PHA). ) Can be produced simply and in large quantities, and at low cost.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the configuration of 1G-KmSAC.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the gene replacement procedure performed in Example 2.

Description

明 細 書
遺伝子置換微生物およびそれを用いたポリエステルの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸 (PHA)の商業的生 産に有用な、改良された微生物株と、それを利用する PHAの製造方法に関する。 背景技術
[0002] ポリヒドロキシアルカン酸は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分 子ポリマーである。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、 また、再生可能資源力 産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素 材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。
[0003] このポリエステルを構成するモノマーは、一般名 3 ヒドロキシアルカン酸であって、 具体的には 3—ヒドロキシ酪酸、 3—ヒドロキシ吉草酸、 3—ヒドロキシへキサン酸、 3— ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い 3—ヒドロキシアルカン酸が単重 合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成されている。 3—ヒドロキシ酪酸 ( 以下 3HBと略す）のホモポリマーであるポリ 3—ヒドロキシ酪酸（以下、 P (3HB)と 略す）は、 1925年にバチルス 'メガテリゥム（Bacillus megaterium)で最初に発見 されたが、この P (3HB)は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っており、実用的 には応用範囲が限られている。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされて きた。
[0004] その中で、 3 ヒドロキシ酪酸（3HB)と 3 ヒドロキシ吉草酸（3HV)と力もなる共重合 体 (以下 P (3HB- CO- 3HV)と略す)の製造方法が開示されて!、る（例えば、特許 文献 特許文献 2参照)。この？ ！^ ^ー !^)は P (3HB)に比べると柔軟性 に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。し力しながら、実際には P (3HB - CO- 3HV)は 3HVモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しぐ特 に柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成 型体の分野にし力利用されな力つた。
[0005] また、アルキル鎖の炭素数が 6から 16の 3 ヒドロキシアルカン酸で構成される中鎖 P HAは、 P (3HB)や P (3HB— co— 3HV)よりも結晶性が低ぐ弾力に富むことが知ら れており（非特許文献 1参照）、異なる分野への用途が期待されている。中鎖 PHAの 製造研究は、シユードモナス属の PHA合成酵素遺伝子を、シユードモナス属、ラルス トニア属、大腸菌に導入することによって行われてきたが、いずれも生産性が低くェ 業生産に適したものではな力つた (非特許文献 2、非特許文献 3、非特許文献 4参照
) o
[0006] 近年、 3HBと 3—ヒドロキシへキサン酸（以下、 3HHと略す）との 2成分共重合ポリェ ステル（以下 P (3HB- CO - 3HH)と略す）およびその製造方法にっ 、て研究がなさ れた (特許文献 3、特許文献 4参照)。これら報告の P (3HB— co— 3HH)の製造方 法は、土壌より単離されたァエロモナス 'キヤビエ（Aeromonas caviae)を用いてォ レイン酸等の脂肪酸ゃォリーブオイル等の油脂力 発酵生産するものであった。また 、 P (3HB— co— 3HH)の性質に関する研究もなされている（非特許文献 5参照)。こ の報告では、炭素数が 12個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてァエロモナス ·キヤ ビエを培養し、 3HH糸且成が 11〜 19mol%の P (3HB— co— 3HH)を発酵生産して いる。この P (3HB— co— 3HH)は 3HH組成の増加にしたがって、 P (3HB)の硬く て脆 、性質力 次第に柔軟な性質を示すようになり、 P (3HB -co- 3HV)を上回る 柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち P (3HB— co— 3HH)は 3HH糸且成を 変えることで、硬質ポリエステル力 軟質ポリエステルまで応用可能な幅広 、物性を 持っため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものからフィルム等のように柔軟 性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。し力しながら、本製造 方法では菌体生産量 4gZL、ポリエステル含量 30%とポリエステル生産性は低 、も のであり、本ポリエステルの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分と言わざる を得な力つたため、実用化に向けて更に高い生産性が得られる方法が探索された。
[0007] P (3HB— co— 3HH)の工業生産を目指した取組みもなされている。ァエロモナス' ハイドロフイラ（Aeromonas hydrophila)を用いた培養では、ォレイン酸を炭素源と した 43時間の流加培養において、菌体生産量 95. 7g/L、ポリエステル含量 45. 2 %、 3HH組成 17%の P (3HB— co— 3HH)が生産された (非特許文献 6参照）。ま た、ァエロモナス.ハイドロフイラを、炭素源としてグルコース及びラウリン酸を用いて 培養し、菌体生産量 50gZL、ポリエステル含量 50%を達成した (非特許文献 7参照 ) oし力しながら、ァエロモナス'ハイドロフイラはヒトに対して病原性を有する（非特許 文献 8参照）ことから、工業生産に適した種とはいえない。また、これらの培養生産で は高価な炭素源を使用するため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用も求めら れている。
[0008] このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指した取組みが行なわれた。
ァエロモナス .キヤビエよりポリヒドロキシアルカン酸（PHA)合成酵素遺伝子がクロー ユングされた (特許文献 5、非特許文献 9参照)。本遺伝子をラルストニア'ユートロフ ァ（Ralstonia eutropha,旧アルカリゲネス ·ユートロファス）に導入した形質転換体 を用いて P (3HB— co— 3HH)の生産を行った結果、菌体生産性は 4gZL、ポリエ ステル含量は 30%であった。更に本形質転換体を炭素源として植物油脂を用いて 培養した結果、菌体生産量 4gZL、ポリエステル含量 80%が達成された (非特許文 献 10参照)。更に培養条件の改善により、菌体生産量 45gZL、ポリエステル含量 62 . 5%、3HH組成 8. 1%にまで向上したように、培養方法に関する研究もなされた（ 特許文献 6参照)。
[0009] また、フラクトースを炭素源として P (3HB— co— 3HH)を生産できるラルストニア 'ュ 一トロファも構築された力 本菌株のポリエステル生産性は低ぐ実生産に適している とはいえな力つた (非特許文献 11参照)。
大腸菌を宿主とした P (3HB— co— 3HH)生産株も構築された。ァエロモナス属の P HA合成酵素遺伝子及びラルストニア'ユート口ファの NADP—ァセトァセチル Co— A還元酵素遺伝子等を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として 同大腸菌を培養した結果、 40. 8時間培養で菌体量 79gZL、ポリエステル含量 27. 2%、 3HH組成 10. 8%という生産性であった (非特許文献 12参照)。
[0010] P (3HB— co— 3HH)の生産性向上並びに 3HH組成制御を目指して、 PHA合成 酵素の人為的な改変が行なわれた。ァエロモナス'キヤビエ由来の PHA合成酵素変 異体のなかで、 149番目のアミノ酸のァスパラギンがセリンに置換された変異体酵素 や、 171番目のァスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内で の PHA合成酵素活性や 3HH組成が向上していることが示された (非特許文献 13参 照)。また、同酵素の 518番目のフエ二ルァラニン力イソロイシンに置換された変異体 酵素や 214番目のパリンがグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌での PHA合 成酵素活性やポリエステル含量が向上したことが報告されている（非特許文献 14参 照)。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており未だポリエステル含量は 低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活力した工業的生産に向けた更なる改 良が必要であった。
[0011] 組換え DNA技術を応用して作製された菌株を用いて、 PHAを工業的規模で培養 する際に最も重要な課題の一つは、導入した遺伝子の安定性である。遺伝子の導入 にはプラスミドを用いる方法や宿主染色体へ組み込む方法などが利用されて!ヽる。し 力しながら、プラスミドは組換え菌が増殖、分裂する際に脱落することが知られている (特許文献 7参照)。このためプラスミドが脱落した菌体は PHA生産能を失うので商 業的生産性を低下させることにつながる。従来、組換え菌体の培養では抗生物質を 培地に添加することでプラスミド保持菌体のみを選択的に生育保持させる対応が一 般的であるが、抗生物質使用によるコストアップ、培養廃液中の残留抗生物質による 環境への影響などが問題となっている。また、プラスミドの安定ィ匕のために R1プラスミ ド由来の parB遺伝子を P (3HB)生産プラスミドに組み入れた組換え大腸菌が作製さ れた (非特許文献 15参照)。この大腸菌は、 110— 120世代の培養後もほぼ 100% プラスミドを保持していた。し力しながら、なお、プラスミドは脱落の危険性を含んでい る。
[0012] 一方、染色体上に組み込まれた遺伝子は安定であると考えられ、 PHAの合成に関 する遺伝子を染色体に組み込んだ微生物が報告されている (特許文献 8、非特許文 献 16、非特許文献 17参照)。
[0013] 特許文献 8が開示している、 PHA生合成酵素をコードする遺伝子を大腸菌の染色体 にランダムに挿入することによって作製された大腸菌株は細胞乾燥重量の 85%を超 えるレベルで P (3HB)を産生した。しかしながら、実用的物性に優れた P (3HB— co 3HH)を大腸菌に産生させるためには、基質モノマー供給のための遺伝子をさら に共存させる必要や、または高価な脂肪酸などを培地へ供給させる必要があり、なお 、高い生産効率を達成するための妨げになっている。さらには、染色体上にランダム に遺伝子を組み込む場合には、組み込まれた部位によっては、その部位上の、ある いはその部位周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼし、 PHA生産株として充分な能力 を発揮できな ヽ状況が存在する。
[0014] 外因性の PHA合成酵素遺伝子を宿主にプラスミド状で導入する場合や、染色体上 に組み込む場合、ラルストニア属ゃシユードモナス属のような、元来 PHAを生産する 微生物種を宿主として使用するときは、その元来の PHAが生産できなくなった菌株 が利用されてきた。そのような菌株は変異操作を経て作製されているので、その親株 と比べて増殖能力や生物活性が劣っており（非特許文献 18、非特許文献 19、非特 許文献 20等参照）、 PHA生産株として充分な生産能力を発揮しているとは言い難い
[0015] 一方で、ラルストニア.ユート口ファの染色体上の PHA合成酵素遺伝子をクロマチウ ム ·ビノッサム（Chromatium vinosum)由来の PHA合成酵素遺伝子と置換した報 告では、野生株を上回る細胞乾燥重量の 91%の P(3HB)を蓄積した (非特許文献 1 7)。しカゝしながら、菌体量が 1.8gZLと低ぐ生産ポリエステルも堅くてもろい P(3H B)であって広範な用途が期待できる P (3HB-CO-3HH)ではなかったことから、ポ リエステルの商業的生産には未だ課題を抱えていた。
[0016] 特許文献 1:特開昭 57— 150393号公報
特許文献 2：特開昭 59— 220192号公報
特許文献 3：特開平 5— 93049号公報
特許文献 4：特開平 7— 265065号公報
特許文献 5：特開平 10— 108682号公報
特許文献 6：特開 2001— 340078号公報
特許文献 7：特開昭 59 - 205983号公報
特許文献 8：米国特許 6593116号明細書
非特許文献 1: Madison等、 Microbiol. Mol. Biol. Rev. , 63:21-53(1999) 非特許文献 2:Matsusaki等、 J. Bacteriol. , 180:6459-6467(1998) 非特許文献 3:Matsusaki等、 Appl. Micrbiol. Biotechnol. , 53:401-409(20
00) 非特許文献 4:Langenbach等、 FEMS Microbiol. Lett. , 150:303— 309(19 97)
非特許文献 5:Doi等、 Macromolecules, 28:4822-4828(1995)
非特許文献 6:Lee等、 Biotechnol. Bioeng. , 67:240-244(2000)
非特許文献 7:Cher^、Appl. Microbiol. Biotechnol. , 57:50-55(2001) 非特許文献 8:国立感染症研究所 病原体等安全管理規定 別表 1付表 1(1999) 非特許文献 9:Fukui等、 J. Bacteriol. , 179:4821-4830(1997)
非特許文献 10:Fukui等、 Appl. Microbiol. Biotecnol. , 49:333— 336(1998) 非特許文献 ll:Fukui等、 Biomacromolecules, 3:618— 624(2002) 非特許文献 12: Park等、 Biomacromolecules, 2:248— 254(2001)
非特許文献 13:Kichise等、 Appl. Environ. Microbiol. , 68:2411— 2419(20
02)
非特許文献 14:Amara等、 Appl. Microbiol. Biotechnol. , 59:477—482(200 2)
非特許文献 15: Lee等、 J. Biotechnol. , 32:203— 211(1994)
非特許文献 16:Kranz等、 Appl. Environ. Microbiol. , 63:3003-3009(1997
)
非特許文献 17: York等、 J. Bacteriol. , 183:4217-4226(2001)
非特許文献 18:Schlegel等、 Arch. Mikrobiol. , 71:283-294(1970) 非特許文献 19: Schubert等、 J. Bacteriol. , 170:5837-5847(1988) 非特許文献 20: Peoples等、 Biol. Chem. , 264:15298-15303(1989) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
以上のように、 ΡΗΑの商業生産には未だ多くの課題が存在した。
本発明の目的は、工業的規模の培養プロセスにおいて、広範な用途が期待できる共 重合ポリエステルを安定的に高レベルで蓄積する組換え微生物株を提供すること、 およびそれを利用した共重合ポリエステルの製造方法を提供することである。
課題を解決するための手段 [0018] 本発明者は、上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、染色体上に存在す るポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成 酵素遺伝子に置換したポリエステル生産微生物力 安定的に高レベルの PHAを蓄 積できることを見いだした。
[0019] PHAの合成を安定にするためには、染色体上に遺伝子を導入することが有効である ことが示唆されていたが、野生株を用いその PHA合成酵素遺伝子を部位特異的に 他の PHA合成酵素遺伝子に置換することで、既存遺伝子の破壊と導入遺伝子の発 現を同時に行って共重合ポリエステルを蓄積させた場合の効果は知られておらず、 また、従来知られていた技術力も単純には予測することもできな力つた。
[0020] 実施例に示したように、ラルストニア'ユートロファ H16株の染色体上のポリヒドロキシ アルカン酸合成酵素遺伝子をァエロモナス'キヤビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸 合成酵素変異体遺伝子に置換した微生物株は、 48時間の培養で菌体生産量 110. 4gZL、ポリエステル含量 73. 8wt%の P (3HB— co— 3HH)を生産した。この生産 性はこれまで報告された P (3HB— co— 3HH)の生産性を大きく上回っていた。また この株は培養のすべての工程で抗生物質やその他のいかなる選択圧も必要とせず、 培養の終了時には実質的にすベての細胞が P (3HB -co- 3HH)を蓄積して!/、る ことを見いだした。
[0021] 即ち本発明は以下の通りである。
[1]ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有する微生物であ つて、かつ該ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の少なくとも一部が外因性の ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子に置換されている、 3-ヒドロキシ酪酸、 3- ヒドロキシへキサン酸、 3—ヒドロキシヘプタン酸、 3—ヒドロキシオクタン酸、 3—ヒドロ キシノナン酸、 3—ヒドロキシデカン酸、 3—ヒドロキシゥンデカン酸、 3—ヒドロキシドデ カン酸、 3—ヒドロキシトリデカン酸、 3—ヒドロキシテトラデカン酸、 3—ヒドロキシペン タデカン酸及び 3—ヒドロキシへキサデカン酸力もなる群より選択されるモノマーュ- ットの 2種以上力 構成される共重合ポリエステルを生産する微生物。
[0022] [2]共重合ポリエステルが 3—ヒドロキシ酪酸と 3—ヒドロキシへキサン酸のモノマーュ ニットで構成されることを特徴とする、 [1]に記載の微生物。 [3]ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有する微生物がラ ルストニア ·ユートロファであることを特徴とする、 [ 1]または [2]に記載の微生物。
[0023] [4]ラルストニア ·ユート口ファがラルストニア ·ユートロファ H16株であることを特徴と する、 [3]に記載の微生物。
[5]外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子力 ァエロモナス ·キヤビエ由 来の酵素又はその変異体をコードするものである、 [1]〜 [4]の 、ずれか 1項に記載 の微生物。
[6]変異体が、以下の（a)、（b)いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行った ものである、 [5]に記載の微生物。
(a) 149番目のアミノ酸のァスパラギンをセリンに置換
(b) 171番目のアミノ酸のァスパラギン酸をグリシンに置換
[0024] [7]外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、 149番目のアミノ酸のァス パラギンをセリンに置換し、かつ 171番目のアミノ酸のァスパラギン酸をグリシンに置 換した、配列番号 9のアミノ酸配列で示されるァエロモナス'キヤビエ由来の変異体酵 素をコードするものである、 [1]〜 [4]の 、ずれか 1項に記載の微生物。
[8]KNK— 005株である微生物。
[9] [1]〜 [8]の 、ずれか 1項に記載の微生物を用いたポリエステルの製造方法。
[0025] 本発明における共重合ポリエステルとは、以下の一般式：
[0026] [化 1]
H H
Figure imgf000009_0001
[0027] (式中、 R1及び R2は炭素数 1以上であるアルキル基を表し、ポリマー中同一でも異な つていてもよい。 mおよび nは該ポリマーのモノマー単位数を表し、 1以上である。）で 表される 3—ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位とする重合体のうち、 3—ヒドロキシ 酪酸、 3—ヒドロキシへキサン酸、 3—ヒドロキシヘプタン酸、 3—ヒドロキシオクタン酸、 3—ヒドロキシノナン酸、 3—ヒドロキシデカン酸、 3—ヒドロキシゥンデカン酸、 3—ヒド 口キシドデカン酸、 3—ヒドロキシトリデカン酸、 3—ヒドロキシテトラデカン酸、 3—ヒドロ キシペンタデカン酸及び 3—ヒドロキシへキサデカン酸力もなる群より選択されるモノ マー単位の 2種または 3種以上力も構成される共重合ポリマーである。
上記共重合ポリエステルとしては、 3—ヒドロキシ酪酸と 3—ヒドロキシへキサン酸のモ ノマーユニットで構成されるものが好ましい。
[0028] 本発明で用いる微生物は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を生物種として 原初的にその染色体 DNAに有する微生物であれば特に制限なく使用することがで き、別の炭素源が利用できるように改変された微生物、基質モノマーの生成や取り込 みが改変された微生物、または生産を増大するように改変された微生物を含む。例と し一し ii、 Ralstonia eutropha (分類学上、 Wautersia eutropna、 Cupriavidus necatorと |P]——ノ等の Ralstonia 、 Aeromonas caviae等の Aeromonas属、 Ale aligenes tus等の Aicaiigenes為、 Pseudomonas aeruginosa ^ Pseudomona s putida等の Pseudomonas属等の細菌類が含まれる。安全性及び生産性の観点 から好ましくは Ralstonia属であり、より好ましくは Ralstonia eutrophaであり、更に 好ましくは Ralstonia eutropha HI 6株である。
[0029] 本発明で用いる外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は、各種の PHA 蓄積生物に由来する遺伝子のうち共重合ポリエステルを蓄積させるものであればど のようなものでもよい。そのような遺伝子としては例えば、 Aeromonas caviae (非特 許文献 9)、 Nocardia corallina (GenBankァクセッション番号 AF019964)、 Pse udomonas aeruginosa (Timm 等、 Eur. J. Biochem. , 209 : 15— 30 (1992) ) 、 Pseudomonas oleovorans (Huisman等、 J. Biol. Chem. , 266 : 2191— 219 8 (1991) )、 Thiocystis violaceae (Liebergesell等、 Appl. Micro Diol. Biotech nol. , 38 : 493— 501 (1993) )などから単離されているポリヒドロキシアルカン酸合 成酵素遺伝子がある。好ましくは、ァエロモナス'キヤビエ由来の酵素又はその変異 体をコードするものである。
[0030] また、 目的とする酵素活性が失われない範囲内でアミノ酸配列が改変するようにそれ らの遺伝子の塩基配列の一部を改変したものも使用することができる。例えば、非特 許文献 13に記載されている、 149番目のアミノ酸のァスパラギンがセリンに置換され たァエロモナス ·キヤビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子 (N 149S変異体遺 伝子）、 171番目のアミノ酸のァスパラギン酸がグリシンに置換されたァエロモナス'キ ャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子 (D171G変異体遺伝子）、または、上 記の 2つのアミノ酸置換が組み合わされた、配列番号 9のアミノ酸配列で示されるァ エロモナス.キヤビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子等を好ましく用いること ができる。
上記の遺伝子はプロモーターおよび Zまたはリボソーム結合部位を有し得る力 必 ずしも必要ではない。
[0031] ポリエステル合成酵素遺伝子の置換の態様は、染色体上に本来存在するポリエステ ル合成酵素遺伝子 (被置換遺伝子)のコードする酵素活性が無くなり、かつ外因性の ポリエステル合成酵素遺伝子 (置換遺伝子）が発現されるように置き換わっていれば どのような置き換わり方でもよい。置換後に、被置換遺伝子が染色体上からすべて失 われていてもよいし、一部が存在していてもよぐ分断されて存在していてもよい。置 換の一つの態様として、置換遺伝子がリボソーム結合部位を有し、かつプロモーター を有しない場合は被置換遺伝子のプロモーターの下流に接続されるような置き換わ り方が選択できる。また、置換の別の一つの態様として、置換遺伝子がプロモーター およびリボソーム結合部位を有しない場合は被置換遺伝子のリボソーム結合部位の 下流に接続されるような置き換わり方が選択できる。置換後に発現するポリエステル 合成酵素蛋白は、置換遺伝子のコードする単独の蛋白であるような置き換わり方であ つても、被置換遺伝子がコードする蛋白との融合蛋白であるような置き換わり方であ つてもょ ヽ。本発明で用いるポリエステル合成酵素遺伝子の置換の態様は以上の例 示に限定されるものではないが、好ましい態様としては被置換遺伝子の開始コドンか ら終止コドンまでを、置換遺伝子の開始コドン力 終止コドンまで置換するものである
[0032] 染色体上の遺伝子を部位特異的に置換する方法は当業者に周知である。代表的な 方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法 (Ohman等、 J. Ba cteriol. , 162 : 1068— 1074 (1985) )や相同組換えの機構によって起こる部位特 異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法 (Noti等、 M ethods Enzymol. , 154 : 197— 217 (1987) )など力あり、また、 Bacillus subtil is由来の sacB遺伝子を置換遺伝子に共存させて、第二段階の相同組換えによって s acB遺伝子が脱落した微生物株をシユークロース添加培地耐性株として容易に単離 する方法（Schweizer、 Mol. Microbiol. , 6： 1195— 1204 (1992)、 Lenz等、 J. Bacteriol. , 176 : 4385— 4393 (1994) )も禾 lj用すること力できる力 染色体上の 遺伝子を置換できればその方法は特に制限されない。
以下に Ralstonia eutrophaの PHA合成酵素遺伝子（phaC )を Aeromonas ca
Re
viaeの PHA合成酵素遺伝子 (phaC )に置換する場合の置換方法を、より具体的
Ac
に例示する。
[0033] まず、置換フラグメントを作製する。置換フラグメントは、 phaC のコーディング配列（
Re
CDS：開始コドンから終止コドンまでを含む）直前の上流配列に phaC の CDSがつ
Ac
ながり、その後に phaC の CDS直後の下流配列がつながった形とする。すなわち、
Re
CDSのみ力 ¾haC のものに置き換わった phaC の DNAフラグメントである。上流
Ac Re
配列と下流配列は染色体上の遺伝子と相同糸且換えを起こすために必要な相同配列 であって、一般的にはその長さが長いほど組換え頻度は高くなるが、相同組換えさえ 起こればよぐその長さは任意に設定できる。
[0034] 置換フラグメントには遺伝子置換の際に選択マーカーとなる遺伝子を付加することが できる。選択マーカーとなる遺伝子は例えばカナマイシン、クロラムフエ-コール、スト レブトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相 補する遺伝子等が使用できる。 Ralstonia eutrophaで行う場合にはカナマイシン の耐性遺伝子が好適である。
[0035] さらにそれらに加えて、第二段階の相同組み換えによって選択マーカー遺伝子を含 む領域が脱落した微生物株の選択を容易にするための遺伝子が付加できる。そのよ うな遺伝子としては Bacillus subtilis由来の sacB遺伝子が例示できる（Schweizer 、 Mol. Microbiol. , 6 : 1195— 1204 (1992) )。この遺伝子力発現して ヽる微生物 株はシユークロースを含む培地で生育できないことが知られており、シユークロースを 含む培地での生育によりこの遺伝子を脱落によって失った株を選択することが容易と なる。
[0036] これらで構成された置換フラグメントは宿主微生物株中で複製しな ヽベクターに接続 することによって遺伝子置換用のプラスミドが作製される。ラルストニア属ゃシユード モナス属等で利用できるこのようなベクターには例えば、 pUCベクター、 pBluescrip tベクター、 pBR322ベクターある 、はそれらと同じ複製起点を持つベクター等が挙 げられる。さらには、接合伝達を可能にする mob、 oriTなどの DNA配列を共存させ ることち可會である。
[0037] このような構成で作製された遺伝子置換用のプラスミド DNAはエレクト口ポレーシヨン 法や接合伝達法などの公知に方法により Ralstonia eutropha等の微生物に導入 することができ、相同組換えを行うことができる。
次に相同組換えによって染色体上に遺伝子置換用のプラスミド DNAが挿入された 株の選択を行う。選択は遺伝子置換用のプラスミド DNAに共存させた選択用の遺伝 子に基づ 、た方法によって行うことができる。カナマイシン耐性遺伝子を用いた場合 にはカナマイシンを含む培地で生育してきた株力も選ぶことができる。
[0038] 次の段階で第二の相同組換えによって染色体上力 選択マーカー遺伝子を含む領 域が脱落した株を選択する。挿入時に利用した選択用の遺伝子に基づいて、例えば カナマイシンを含む培地で生育できなくなった株を選択してもよ！/、が、 sacB遺伝子を 遺伝子置換用プラスミドに共存させて 、る場合は、シユークロースを含む培地で生育 してくる株力も容易に選択できる。このようにして得られた株が所望するように遺伝子 が置換された株かどうか確認するには、 PCR法ゃサザンノヽイブリダィゼーシヨン法、 DNA塩基配列の決定など、公知の方法が使用できる。以上のようにして Ralstonia eutrophaの PHA合成酵素遺伝子（phaC )力 SAeromonas caviaeの PHA合成
Re
酵素遺伝子 (phaC )に置換された株を取得することができる。このような株としては
Ac
、以下の実施例で作製した KNK— 005株等が挙げられる。
[0039] 本発明において、本発明の微生物を炭素源存在下で増殖させることにより、微生物 体内に共重合ポリエステルを蓄積させることができる。炭素源としては、糖、油脂また は脂肪酸を用いることができる。炭素源以外の栄養源として、窒素源、無機塩類、そ のほかの有機栄養源を任意に用いることができる。 [0040] 糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂として は、炭素数が 10以上である飽和'不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パ ーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、へキサン酸、オクタン酸、デカ ン酸、ラウリン酸、ォレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の 飽和 ·不飽和脂肪酸、ある!ヽはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙 げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、リン酸ァ ンモ -ゥム等のアンモ-ゥム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシゥ ム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム等が挙げられる。
[0041] そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、ァラニン、セリン、スレオニン、プロ リン等のアミノ酸；ビタミン Bl、ビタミン B12、ビタミン C等のビタミン等が挙げられる。 培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、 20°Cから 40°Cが好ましい。 培養時間は、特に制限はないが、 1〜10日間程度で良い。
得られた該培養菌体に蓄積されたポリエステルは公知の方法により回収することがで きる。
[0042] ポリエステルの回収は、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、 培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等に より洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロ口ホルム等の有機溶剤を用いてポリ エステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって 菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやへキサン等の貧溶媒をカ卩えてポリエステ ルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポ リエステルを回収することができる。
ポリエステル生産確認の簡易法としては、 Nileredを用いた染色法を利用できる。す なわち、組換え菌が生育する寒天培地に Nileredを加え、組換え菌を 1〜7日間培養 し、組換え菌が赤変するカゝ否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確 認できる。 発明の効果
[0043] 本発明によれば、産業用発酵過程にお!、てポリヒドロキシアルカン酸 (PHA)を安定 的に高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度のポリヒドロキシアルカン酸 (P HA)が簡便かつ大量に、し力も安価に製造することが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0044] 以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限され るものではない。
(実施例 1)遺伝子置換用プラスミドの作製
Ralstonia eutropha HI 6株の菌体を铸型 DNAの供給源として、配列番号 1と配 列番号 2で示されるプライマーを用いて PCR反応を行 、、ポリヒドロキシアルカン酸合 成酵素遺伝子 (phaC )の構造遺伝子を含む DNA断片を得た。 PCR条件は（1) 94
Re
°Cで 2分、（2) 94°Cで 30秒、（3) 45°Cで 30秒、（4) 72°Cで 3分、（2)から（4)を 25サ イタル、（5) 72°Cで 5分であり、ポリメラーゼとしては TaKaRa LA Taq (タカラバイ ォ社製)を用いた。 PCRで得た DNA断片を制限酵素 BamHIで切断し、ベクター pB luescriptllKS (-) (東洋紡社製)を同酵素で切断した部位にサブクローユングした (pBlue-phaC ；)。
Re
[0045] Aeromonas caviae由来のポリエステル合成酵素変異体遺伝子である N149SZ D171G変異体は、次のように作製した。まず、 pBluescriptllKS (—）（東洋紡社製） を Pstl処理し、 DNA Blunting Kit (タカラバイオ社製)を用いて平滑末端ィ匕しライ ゲーシヨンすることにより Pstlサイトを欠失させた。次いでこのプラスミドを Xhol処理し 、 DNA Blunting Kit (タカラバイオ社製)を用いて平滑末端ィ匕しライゲーシヨンす ることにより Xholサイトを欠失したプラスミド pBlue— Newを作製した。このプラスミド の EcoRIサイトに pJRD215— EE32dl3 (特許文献 5)より同酵素で切り出した dl3 断片をクローユングした (pBlue— dl3)。次に、理化学研究所より分与されたクロー ン E2— 50由来のプラスミド (非特許文献 13)を铸型とし、配列番号 3と 4に記載のプ ライマーのセット及び配列番号 5と 6に記載のプライマーのセットを用いてそれぞれ P CR法により増幅、 2断片を得た。その条件は（1) 94°Cで 2分、（2) 94°Cで 30秒、（3) 55°Cで 30秒、（4) 72°Cで 2分、（2)から（4)を 25サイクル、（5) 72°Cで 5分である。 増幅された 2断片を等モル混合し再び PCR反応を行 ヽ 2断片を結合させた。その条 件は（1) 96°Cで 5分、（2) 95°Cで 2分、（3) 72°Cで 1分、（2)から（3)を 12サイクルで あり、ポリメラーゼとしては Pyrobestポリメラーゼ (タカラバイオ社製)を用いた。 目的 サイズの DNA断片をァガロース電気泳動ゲルより切り出し Pstlと Xholで処理し、同 酵素で処理した pBlue— dl 3に断片を入れ替える形でクローユングした (pBlue— N 149S/D171G)。塩基配列決定を、 PERKIN ELMER APPLIED BIOSYS TEMS社製の DNAシークェンサ一 310 Genetic Analyzerを用いて行い、 PHA 合成酵素の 149番目のアミノ酸であるァスパラギンがセリンに、 171番目のアミノ酸で あるァスパラギン酸がグリシンに置換された変異遺伝子であることを確認した。このァ ミノ酸配列を配列番号 9に示す。
[0046] pBlue— N149SZD171Gを铸型として配列番号 7と配列番号 8で示されるプライマ 一を用いて PCR反応を行い、 N149SZD171G変異体の構造遺伝子 DNAを増幅 させた。 PCR条件は（1) 94°Cで 2分、（2) 94°Cで 30秒、（3) 45°Cで 30秒、 (4) 72°C で 2分、（2)から（4)を 25サイクル、（5) 72°Cで 5分であり、ポリメラーゼとしては TaKa Ra LA Taq (タカラバイオ社製）を用いた。次に、 pBlue— phaC を制限酵素 Sbfl
Re
と Csp45Iで処理し、同酵素で処理した上記増幅 DNA断片を phaC 構造遺伝子と
Re
入れ替える形でクローユングした（pBlue—phaC ：： N149SZD171G)。
Re
[0047] 次に、プラスミド pJRD215 (ATCC37533)を制限酵素 Xholと Dralで処理してカナ マイシン耐性遺伝子を含む約 1. 3kbの DNA断片を単離後、 DNAブランティングキ ット（タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑ィ匕し、 pBlue-phaC ：： N149S/D17
Re
1Gを制限酵素 Sailで切断後同様に平滑末端ィ匕した部位に挿入した (pBlue— pha C ：： N149S/D171G-Km) 0
Re
[0048] 続いて、プラスミド pMT5071 (Tsuda、 GENE, 207 : 33— 41 (1998) )を制限酵素 Notlで処理して sacB遺伝子を含む約 8kbの DNA断片を単離し、 pBlue-phaC ：
Re
： N149S/D171G— Kmを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子置換用プラス ミド pBlue— phaC ：： N149S/D171G— KmSACを作製した。
Re
本実施例で構築した遺伝子置換用プラスミド pBlue— phaC ：： N149S/D171G
Re
KmSACの構成の模式図を図 1に示す。 [0049] (実施例 2)遺伝子置換株の作製
遺伝子置換用プラスミド pBlue— phaC ：： N149SZD171G— KmSACで大腸菌
Re
S17— 1株（ATCC47005)を形質転換し、 Ralstonia eutropha H16株と Nutri ent Agar培地（Dif co社製）上で混合培養して接合伝達を行った。 250mgZLの力 ナマイシンを含むシモンズ寒天培地 (タエン酸ナトリウム 2gZL、塩ィ匕ナトリウム 5gZ L、硫酸マグネシウム · 7水塩 0. 2g/ リン酸二水素アンモ-ゥム lgZL、リン酸水 素二カリウム lgZL、寒天 15gZL、 pH6. 8)上で生育してきた菌株を選択して、ブラ スミドが Ralstonia eutropha HI 6株の染色体上に組み込まれた株を取得した（第 一段階の相同組換え）。この株を Nutrient Broth培地（Difco社製）で 2世代培養 した後、 15%のシユークロースを含む Nutrient Agar培地上に希釈して塗布し、生 育してきた菌株を選択して選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を取得した (第二段階の相同組換え)。さらに PCRによる解析により phaC 遺伝子が N149SZ
Re
D 171 G変異体遺伝子に置換された菌株を単離した。この遺伝子置^ ¾を KNK - 0 05株と命名し、塩基配列決定を、 PERKIN ELMER APPLIED BIOSYSTE MS社製の DNAシークェンサ一 310 Genetic Analyzerを用いて行い、染色体 上の phaC 遺伝子の開始コドンから終止コドンまでが N149SZD171G変異体遺
Re
伝子の開始コドンから終止コドンまでに置換された株であることを確認した。
本実施例で行った遺伝子置換の手順を図 2に模式的に示す。第一段階の相同組換 えによって遺伝子置換用プラスミドは染色体中に挿入され、第二段階の相同組換え により、そのプラスミドに相当する部分が再び環状になって染色体上力 離脱する。 第二段階の相同組換えの際、相同組換えを起こす位置により元と同じ置換遺伝子（ 図中の phaC ：： N149SZD171G)を伴って離脱する場合（Δ 1)と、被置換遺伝子
Re
(図中の phaC )を伴って離脱する場合（Δ 2)があり、本発明の KNK— 005株は、
Re
Δ 2の位置で第二段階の相同組換えが行われたことにより得られる菌である。
[0050] (実施例 3)ポリエステルの生産および精製
種母培地の糸且成は、 lwZv% Meat -extract, lw/v% Bacto— Trypton、 0 . 2w/v% Yeast - extract, 0. 9w/v%Na PO - 12H 0、 0. 15w/v%KH P
2 4 2 2
O、 pH6. 8とした。 前培養培地の組成は 1. lw/v% Na ΡΟ · 12Η 0、 0. 19w/v% KH PO、 1
2 4 2 2 4
. 29w/v% (NH ) SO 、0. lw/v% MgSO - 7H 0、 2. 5w/v%パーム W
4 2 4 4 2
ォレイン油、 0. 5vZv% 微量金属塩溶液（0. 1N塩酸に 1. 6w/v% FeCl · 6Η
3 2
0、 lw/v% CaCl · 2Η 0、 0. 02w/v% CoCl - 6H 0、 0. 016w/v% CuS
2 2 2 2
O · 5Η 0、 0. 012w/v% NiCl - 6H Oを溶かしたもの。）とした。
4 2 2 2
[0051] ポリエステル生産培地の組成は 0. 385w/v% Na PO · 12Η 0、 0. 067w/v%
2 4 2
KH PO、 0- 291w/v% (NH ) SO 、0. lw/v% MgSO - 7H 0、 0. 5v/
2 4 4 2 4 4 2 v% 微量金属塩溶液（0. IN塩酸に 1. 6w/v% FeCl · 6Η 0、 lw/v% CaCl
3 2
•2H 0、 0. 02w/v% CoCl - 6H 0、 0. 016w/v% CuSO - 5H 0、 0. 012
2 2 2 2 4 2 w/v% NiCl - 6H Oを溶かしたもの。）、 0. 05wZv%BIOSPUREX200K (消
2 2
泡剤：コグニスジャパン社製)とした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分で あるパーム核油ォレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速 度が 0. 08〜0. l (g油脂） X (g正味乾燥菌体重量) _ 1 X (h) _1となるように流加した
[0052] KNK— 005株のグリセロールストック（50 μ 1)を種母培地（10ml)に接種して 24時 間培養し、 1. 8Lの前培養培地を入れた 3Lジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ 社製 MDL— 300型）に 1. 0vZv%接種した。運転条件は、培養温度 30°C、攪拌速 度 500rpm、通気量 1. 8LZminとし、 pHは 6. 7〜6. 8の間でコントロールしながら 28時間培養した。 pHコントロールには 7%水酸ィ匕アンモ-ゥム水溶液を使用した。
[0053] ポリエステル生産培養は 6Lの生産培地を入れた 10Lジャーフアーメンター（丸菱バイ ォェンジ社製 MDL— 1000型）に前培養種母を 5. 0vZv%接種した。運転条件は、 培養温度 28°C、攪拌速度 400rpm、通気量 3. 6LZminとし、 pHは 6. 7力 6. 8の 間でコントロールした。 pHコントロールには 7%水酸ィ匕アンモ-ゥム水溶液を使用し た。培養は約 48時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノール で洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した結果、 110. 4gZLであった。
[0054] 得られた乾燥菌体約 lgに 100mlのクロ口ホルムをカ卩え、室温で一昼夜攪拌して、菌 体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約 3 0mlになるまで濃縮後、約 90mlのへキサンを徐々〖こ加え、ゆっくり攪拌しながら、 1 時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、 50°Cで 3時間真空乾燥した。乾燥ポ リエステルの重量を測定し、菌体内のポリエステル含量を算出した。その結果、 KNK — 005株によるポリエステル含量は 48時間で 73. 8 (wt%)という高含量であった。
[0055] (実施例 4)ポリエステル生産能の安定性評価
実施例 3のポリエステル生産培養終了時の培養菌液を希釈して Nutrient Agar培 地に播種し、生育してきたコロニーを Nilered含有培地（リン酸水素 2ナトリウム · 12水 塩 9g、リン酸 2水素カリウム 1. 5g、塩化アンモ -ゥム 0. 05g、硫酸マグネシウム •7水塩 0. 02g、フルクトース 0. 5g、塩ィ匕コノ ルト · 6水塩 0. 25ppm、塩ィ匕鉄（Π Ι) · 6水塩 16ppm、塩化カルシウム · 2水塩 10. 3ppm、塩化ニッケル · 6水塩 0. 12ppm、硫酸銅 · 5水塩 0. 16ppm、 Nilered 0. 5mg、寒天 15gZlL)に接種 した。 30°C、 3日間の培養後、コロニーが赤色を呈しているものがポリエステルを生産 していると判定できる。 100コロニーを調べた結果、すべてのコロニーがポリエステル 生産能を保持していた。
産業上の利用可能性
[0056] 本発明によれば、産業用発酵過程にお!、てポリヒドロキシアルカン酸 (PHA)を安定 的に高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度のポリヒドロキシアルカン酸 (P HA)が簡便かつ大量に、し力も安価に製造することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0057] [図 1]実施例 1で構築した遺伝子置換用プラスミド pBlue— phaC ：: N149S/D17
Re
1G—KmSACの構成を示した模式図である。
[図 2]実施例 2で行った遺伝子置換の手順を模式的に示した図である。

Claims

請求の範囲
[1] ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有する微生物であって、 かつ該ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の少なくとも一部が外因性のポリヒド ロキシアルカン酸合成酵素遺伝子に置換されている、 3-ヒドロキシ酪酸、 3-ヒドロ キシへキサン酸、 3—ヒドロキシヘプタン酸、 3—ヒドロキシオクタン酸、 3—ヒドロキシノ ナン酸、 3—ヒドロキシデカン酸、 3—ヒドロキシゥンデカン酸、 3—ヒドロキシドデカン 酸、 3—ヒドロキシトリデカン酸、 3—ヒドロキシテトラデカン酸、 3—ヒドロキシペンタデ カン酸及び 3—ヒドロキシへキサデカン酸力 なる群より選択されるモノマーユニットの 2種以上力 構成される共重合ポリエステルを生産する微生物。
[2] 共重合ポリエステルが 3—ヒドロキシ酪酸と 3—ヒドロキシへキサン酸のモノマーュ-ッ トで構成されることを特徴とする、請求項 1に記載の微生物。
[3] ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を染色体上に本来有する微生物がラルスト ユア 'ユートロファであることを特徴とする、請求項 1または 2に記載の微生物。
[4] ラルストニア ·ユート口ファがラルストニア ·ユートロファ H16株であることを特徴とする、 請求項 3に記載の微生物。
[5] 外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子力 ァエロモナス'キヤビエ由来の 酵素又はその変異体をコードするものである、請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の 微生物。
[6] 変異体が、以下の（a)、（b)いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行ったもの である、請求項 5に記載の微生物。
(a) 149番目のアミノ酸のァスパラギンをセリンに置換
(b) 171番目のアミノ酸のァスパラギン酸をグリシンに置換
[7] 外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子力 149番目のアミノ酸のァスパ ラギンをセリンに置換し、かつ 171番目のアミノ酸のァスパラギン酸をグリシンに置換 した、配列番号 9のアミノ酸配列で示されるァエロモナス ·キヤビエ由来の変異体酵素 をコードするものである、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の微生物。
[8] KNK— 005株である微生物。
[9] 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の微生物を用いたポリエステルの製造方法。
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