WO2008001938A1

WO2008001938A1 - Groupe de cellules renfermant des types diversifiés de cellules dérivées du soma, capables de former une structure primitive de type organique

Info

Publication number: WO2008001938A1
Application number: PCT/JP2007/063333
Authority: WO
Inventors: Shigeyoshi Fujiwara; Jiro Kishimoto; Tsutomu Soma
Original assignee: Shiseido Company, Ltd.
Priority date: 2006-06-27
Filing date: 2007-06-27
Publication date: 2008-01-03
Also published as: EP2034011A1; EP2034011B1; EP2455111A3; EP2455111A2; JP5976172B2; US10344266B2; ES2419232T3; CN101479376A; KR20090021340A; US20090280469A1; EP2455111B1; KR101472594B1; JP2013078344A; JP2013059337A; EP2034011A4; US20160160185A1; US20140106432A1; JP2015165823A; US8563309B2; ES2641528T3

Description

JP2007/063333

体性に由来する複数の細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊

技術分野

本発明は体性に由来する複数の細胞種からなる原始的な器官様を明

なし得る細胞塊の製造方法及びその方法により製造された細胞塊に関する。

書背景技術

近年の医学の目覚しい進歩により、疾患の原因の除去、例えば癌の外科的切除といった対症療法的な治療技術、あるいは組織 · 臓器の生体移植技術などにより、人命の救われる機会は益々高まりつつある。しかしながら、患部切除に伴い、患者は治療後の Q O Lの大幅な低下に悩まされることがある。また、移植ドナーの不足、拒絶反応など、生体移植を頼りとする治療にも限界がある。外科的治療又は不慮の事故で失われた組織、器官、臓器などを再生させることが可能となれば、患者の Q O Lを大幅に改善することができる。また、再生医療は生体移植が抱える問題の解消も図ることが可能である。その観点で再生医療に対する期待度は高い。

再生医療で成功を収めている技術は、主として人工皮膚、人工骨、人工歯といつた形態面及び機能面からして比較的単純な組織が中心である。再構成された人工皮膚や人工骨は細胞に取り込まれ、組織構築に必要なシグナルを供することができるようになることある。しかしながら、再生医療技術による人工皮膚 · 人工骨の分化のレパートリーは限られていた。例えば、同種ケラチノサイトや皮膚繊維芽細胞などは表皮としての構造物に分化し、周囲の器官に組み込まれて、バリア性質をもった角質層や基底膜を有するに至ることはあるが、毛包や脂肪腺、汗腺といった二次的誘導物を派生することはない、とされていた。

生体組織は通常、自己複製をするとともに、分化した細胞にシグナルを送ったり分化した細胞を供給することで組織の恒常性を維持する幹細胞的性質をもった細胞と、そのような細胞から各種信号を受けたり指令を受けたりする、分化状態に既に至った体細胞的性質を有する細胞とが共存し、両者の相互作用により成り立つている。例えば脊椎動物の場合、ほとんどの組織 · 器官形成において間葉系細胞と上皮系細胞との間の相互作用が必須である。毛包の場合、間葉系細胞である毛乳頭細胞が幹細胞的性質を担い、上皮系細胞であるケラチノサイトが毛のシャフト（毛質そのもの）へと分化する意味において、体細胞的性質を有する細胞に相当する。

再生医療による器官の形成の際の難しさは、実際の生体組織内におけるような、未分化状態を保った幹細胞的性質を有する細胞と、分化に至った細胞との共存状態の達成にある。従来技術では、仮に上皮系細胞と間葉系細胞を共培養しても、共に分化に至ってしまうか、あるいは共に未分化状態を保つかのどちらかだけであり、生体組織を模倣するような未分化状態と分化状態の細胞の共存の再現はされていない。発明の開示

本発明は、複数種の分化した体性細胞を組み合わせ、培養することで、原始的な器官様をなし得る細胞塊を提供することを課題とする。

本願は以下の発明を包含する。 ( 1 ) 体性に由来する複数の体性細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊の製造方法であって、

前記複数種の体性細胞を含む培養液を用意し、

前記複数種の体性細胞培養液を混合後、その混合細胞培養液に w n t シグナル活性化剤を添加し、

前記 Wn t シグナル活性化剤を含有する培養液を所定期間にわたり非平面接触性培養に委ね、

前記非平面接触性培養した培養物の培地を Wn t シグナル活性化剤非含有培地と交換し、更に所定期間培養する、

ことを含んでなり、ここで前記複数の体細胞の少なくとも 1種は未分化状態を保っている、方法。

( 2 ) 前記複数種の体性細胞が、上皮系体細胞と間葉系体細胞との組み合わせからなり、当該間葉系体細胞が未分化状態を保っている、 ( 1 ) の方法。

( 3 ) 前記上皮系体細胞がケラチノサイトであり、前記間葉系体細胞が毛乳頭細胞である、（ 2 ) の方法。

( 4 ) 前記細胞塊から、毛包誘導機能を有する毛包が形成される、 ( 3 ) の方法。

( 5 ) 前記 W n t シグナル活性化剤が 6—ブロモインジルビン一 3 ' —ォキシム（B I 〇）である、（ 1 ) 〜（ 4) のいずれかの方法

( 6 ) 前記非平面接触性培養方法がハンギングドロップ方法である、（ 1 ) 〜（ 5 ) のいずれかの方法。

( 7 ) 体性に由来する複数の体性細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊であって、

前記複数種の体性細胞を含む培養液を用意し、

ことを含んでなる方法により製造され、ここで前記複数の体細胞の少なくとも 1種は未分化状態を保っている、細胞塊。

( 8 ) 前記複数種の体性細胞が、上皮系体細胞と間葉系体細胞との組み合わせからなり、当該間葉系体細胞が未分化状態を保っている、 ( 7 ) の細胞塊。

( 9 ) 前記上皮系体細胞がケラチノサイトであり、前記間葉系体細胞が毛乳頭細胞である、（ 8 ) の細胞塊。

( 1 0 ) 前記細胞塊から、毛包誘導機能を有する毛包が形成される、 ( 9 ) の細胞塊。

( 1 1 ) 前記 Wn t シグナル活性化剤が 6—ブロモインジルビン一 3 ' ーォキシム（B I O) である、（ 7 ) 〜（ 1 0 ) のいずれかの細胞塊。

( 1 2 ) 前記非平面接触性培養方法がハンギングドロップ方法である、（ 7 ) 〜（ 1 1 ) のいずれか 1項記載の細胞塊。

( 1 3 ) ( 9 ) 〜（ 1 2 ) のいずれかの細胞塊に候補薬剤を適用し、育毛効果を有する薬剤をスクリーニングする方法。

( 1 4 ) 前記細胞塊の c 一 my c、 BM P 4及び I G F B P 3から成る群から選ばれる 1又は複数の遺伝子の発現量を指標とする、（ 1 3 ) の方法。図面の簡単な説明

図 1 は本発明の方法により作成した細胞塊の免疫染色図（ 1 ) であり、 D P細胞と NHE K細胞の染色を示す。

図 2は本発明の方法により作成した細胞塊の免疫染色図（ 2 ) であり、細胞塊における毛乳頭細胞の局在を示す。

図 3は本発明の方法により作成した細胞塊の免疫染色図（ 3 ) であり、細胞塊における細胞増殖を示す。

図 4は本発明の方法により作成した細胞塊の免疫染色図（ 4 ) であり、 jSカテニンと NHE K細胞の染色を示す。

図 5は本発明の方法により作成した細胞塊の免疫染色図（ 5 ) であり、細胞塊におけるヘアケラチン発現を示す。

図 6は本発明の方法により作成した細胞塊の免疫染色図（ 6 ) であり、細胞塊における毛芽マーカ一発現を示す。

図 7は本発明の細胞塊由来の R N Aにおける各種遺伝子の発現（ 1 ) 。

図 8は本発明の細胞塊由来の R NAにおける Wn t 3 A遺伝子の発現。

図 9は本発明の細胞塊由来の R NAにおける Wn t 1 0 B遺伝子の発現。

図 1 0は本発明の細胞塊由来の RN Aにおける各種遺伝子の発現 ( 2 ) 。発明を実施するための最良の形態

本発明により、複数種の体性細胞種をからなる原始的な器官様をなし得る細胞塊の提供が可能となる。

本発明でいう体性細胞とは、生体の各種器官を構成する細胞へと分化するに至った細胞をいい、未分化状態の幹細胞とは相反する細胞をいう。本発明においては、 2以上の体性細胞を使用することを特徴とし、好ましくは、上皮系細胞系と間葉系細胞との組み合わせ、内皮系細胞と間葉系細胞との組み合わせ、あるいは上皮系細胞と間葉系細胞と内皮系細胞と組み合わせなど、様々であってよい。本発明に係る細胞塊により形成し得る器官としては、特に限定されるものではないが、例えば毛包、肺、腎臓、肝臓、膝臓、脾臓、心臓、胆嚢、小腸、結腸、大腸、関節、骨、歯、血管、リンパ管、角膜、軟骨、嗅覚器官、聴覚器官、など、様々な器官が挙げられる例えば、毛包を形成したい場合、例えば頭部由来の角化表皮細胞を上皮細胞系として、毛乳頭細胞を間葉系細胞として使用すればよい。ここでいう「上皮系細胞」は、皮膚の表皮または上皮の大部分を構成する細胞であり、真皮に接する 1層の基底細胞から生じるものをいう。上皮系細胞としては、新生仔（もしくは胎児）に由来する上皮系細胞、成熟した皮膚、例えば休止期毛の表皮又は成長期毛の表皮に由来する細胞でも、ケラチノサイトの形態にある細胞の培養物であってもよい。かような細胞は、当業者周知の方法により所望のドナー動物の皮膚から調製することができる。「毛乳頭細胞」とは、間葉系細胞として毛包最底部に位置し、毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送る、いわば司令塔の役割を担っている細胞をいう。「毛乳頭細胞」は、例えば皮膚組織から表皮組織を取り除くことで得た真皮組織画分をコラーゲン処理して細胞懸濁物を調製し、次いで当該細胞懸濁物を凍結保存することで毛胞上皮細胞を死滅させることで調製することができる。

また、例えば、嗅覚器官の再構築については以下のようにして調製を行うことができる。哺乳動物、例えばマウスの嗅覚上皮細胞群の存在組織部位を取り出す。コラゲナーゼ処理により組織を消化し

、遠心分離し、沈殿した細胞群を調製する。続いてコラーゲン 1又は 4によってコーティングした細胞培養皿へ細胞懸濁液を入れ、接着性に優れる嗅覚上皮細胞を優先的に接着させるため 5分程度で速やかに懸濁液を吸い取る。同皿に残った上皮系細胞は細胞培養へ移行できる。さらに残った細胞の大部分は上皮系細胞となる。吸い上げた残りの懸濁液には間葉系細胞が存在しているが、フィプロネクチンまたはゲラチンによってコーティングした培養皿へ懸濁液を入れ 4時間以上、適当な雰囲気、例えば 3 7 T 、 9 5 % C〇₂下で静置することにより、間葉系細胞を細胞培養へ供することが可能となる。以上のように調製した上皮および間葉系細胞は、毛包器官の再構築と同様な手法により新たな嗅覚器官構築へ供することができる更に、例えば腎臓糸球体の再構築については、以下のように調製を行うことができる。哺乳動物、例えばマウスの腎臓の存在組織部位を取り出す。コラゲナ一ゼ処理により組織を消化し遠心分離し、 l OOumメッシュにて粗大物を取り除く。続いて 40 メッシュにて糸球体をメッシュに集め、卜リブシン処理にて細胞懸濁液にする。コラーゲン 1又は 4によってコ一ティングした細胞培養皿へ細胞懸濁液を入れ上皮細胞を優先的に接着させる。この処理により、本細胞の大部分は糸球体に由来する上皮系細胞となる。

一方、腎臓の場合、発生時に存在していた間葉系細胞は生体では死滅している。従って、本発明では組織再構築に必要とされる上皮間葉相互作用を再度誘導するため以下のような手法を採ることができる。上皮系細胞は上記の腎臓由来細胞を使用する。さらに失われた間葉系細胞の代替として、同属である毛乳頭細胞または骨髄由来間葉系幹細胞を使用する。以上のような上皮および間葉系細胞は、毛包器官の再構築と同様な手法により新たな腎臓器官構築へ供することができる。

本発明に係る細胞の起源はその目的に応じ、様々な哺乳動物を起源としてよく、限定することなくヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばィヌ、ネコ、畜産動物、例えばゥシ、ブ夕、ゥマ、ヒッジ、ャギ、実験用動物、例えばゥサギ、ラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、 S C I Dマウス、ヌードラットなどに由来する。また、その組み合わせは同種系でも、異種系でもよいが、同種系が好ましい。

本発明に係る体性細胞の培養に有効な培養液は特に限定されるものではなく、細胞培養において慣用されているものが使用できる。例えば、間葉系細胞については、好ましくは D M E M、 MEM, F 1 2、 C h a n gメディウム等の血清含有型培地が使用可能である。この場合、血清濃度は 0— 3 0 %、好ましくは 1 0 %とし、必要不可欠な因子として、 b F GF (塩基性繊維芽細胞増殖因子）及び E G F (上皮増殖因子) 、 2mM L—グルタミンを添加する。上皮系細胞の場合、 E p i 1 i f e (登録商標）、 HuM e d i a (登録商標）（共にクラボウ社）、 I n v i t r o g e n S F M ( I n v i t r o g e n社）など、無血清型のケラチノサイトに対し最適化された培地が好ましい。ケラチノサイトは場合によっては G r e e n法（Cell 1975 NOV; 6 (3) :331-43, Serial cultivatio n of strain of human epidermal kerat inocytes： the format ion o f keratinizing colonies from single cells. Rhe inwal f J. G. , G reen H. ) にて調製することが出来るが、この場合はその培養に上記間葉系で使用した血清含有型培地を使用できる。なお、上皮系細胞、間葉系細胞の培養に共通して使える抗生物質としてはべニシリン。、カナマイシン、ストレプトマイシン、アンフォテリシン Bが挙げられる。

本発明においては、上記複数の体性細胞の混合物に Wn tシグナル活性化剤を添加し、培養を行うことを特徴とする。 Wn tシグナルとは、 |S—カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。本シグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌された W n t 3 Aというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内の ιδ—力テニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。 Wn t シグナルは 3—カテニン経路、 P C P経路、 C a^{2 +}経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。 Wn t シグナルがもつその未分化状態維持機能により、分化を抑制する目的で E S細胞の培養の際に利用されてはいるが（例えば、 Noburo Sato et al. , Nature Medicine Vol. 10, No.1, Jan. 2004)、体性細胞の培養におけるその利用及び効果については全く知られていない。

W n t シグナル活性化剤としては、特に限定されるわけではないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼー 3 (G S K— 3 ) の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス—インド口（インジルビン）化合物（B I O) ( ( 2 ' Z , 3 ' E ) 一 6 — ブロモインジルビン一 3 ' —ォキシム）、そのァセトキシム類似体 B I O—ァセトキシム（ 2 ， Z , 3 ' E ) _ 6 _プロモインジルビンー 3 ，ーァセトキシム）、チアジアゾリジン (TD Z D) 類似体 ( 4一ベンジル— 2—メチルー 1， 2 , 4—チアジアゾリジン一 3 ， 5—ジオン）、ォキソチアジアゾリジン一 3 —チオン類似体（ 2 , 4ージベンジルー 5—才キソチアジアゾリジン一 3 —チオン）、チェニル α—クロロメチルケトン化合物（ 2 —クロ口一 1 一（ 4 , 4—ジブ口モーチォフェン一 2 _ィル）一エタノン）、フエニル CK ブロモメチルケトン化合物（ α— 4一ジブ口モアセトフエノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ν— （ 4ーメトキシベンジル） — Ν，一（ 5 —二トロー 1 , 3 —チアゾ一ルー 2 —ィル）ュレア）や G S K一 3 iSペプチド阻害剤、例えば H— K E A P P A P P Q S p P— NH₂、などが挙げられる。

W n t シグナル活性化剤の添加量は特に制限されるものではなく、 Wn t シグナル活性化、換言すれば、 G S K— 3の阻害が奏され、且つ細胞増殖が停止しない量であればよく、使用する薬剤の種類及び増殖すべき細胞の種類に依存し、当業者により適宜決定されるであろう。例えば、 W n t シグナル活性化剤として B I 〇を毛乳頭細胞に使用する場合、その量は例えば 0. 1 ^ M〜 1 0 M程度が適量であろうが、むろんそのような量に限定されるものではない。

本発明におけるもう一つの特徴は、上記複数の体性細胞の混合物に Wn t シグナル活性化剤を添加したものを非平面接触性培養に委ねることである。非平面接触性培養とは、平面接着性細胞を接着させないように球面を有する界面の上にて細胞を培養する方法である。非平面接触性培養方法の例としては、ハンギングドロップ法がある（Keller G. M. et al. , Curr. Opin. Cell Biol. , 7, 862-869 (1995))。ハンギングドロップ法とは、培養細胞を含む培養液の液滴（一般に 2 5〜 3 5 /i L程度）を培養皿の蓋の天井側に点着し、培養液が落下又は流れ落ちないように注意深く蓋を閉じ、表面張力により培養液内の細胞を逆さの液滴の状態で培養する方法である。このように培養することで、細胞は平面培養など場合における平面との接触により受ける影響を最小限にすることができる。非平面接触性培養方法のその他の例としては、あらかじめ細胞接着ができないよう表面加工された半球状の細胞培養皿（例えば住友べ一クライ卜から販売されている「スフエロイド」）を利用した形成方法（スフエロイド形成方法）、ニトロセルロース培地内での培養により浮遊状態で細胞凝集させる浮遊方法などがある。非平面接触性培養のための温度 · 時間は取り扱う細胞の種類や継代回数に依存して変わりうるが、例えば 3 7 °Cで 1〜 1 0 日間、好ましくは 3〜 7 日間行い、必要であれば適宜培地を同様のもので交換する。

最後に上記培地を、 W n t シグナル活性化剤を含有しない培養液と交換することで細胞を W n t シグナル不在下の状態でさらに非平面接触性培養する。この場合も培養時間及び温度も取り扱う細胞の種類や継代回数に依存して変わりうるが、例えば 3 7 で 1〜 1 0 日間、好ましくは 3〜 7 日間行い、必要であれば適宜培地を同様のもので交換する。

本発明により、例えば毛包移植、各臓器移植、ならびに完全な臓器にはいたらないものの臓器を構成する微小器官、たとえば角膜、腎糸球体、嗅覚上皮組織、軟骨部位の部分移植などに有用な細胞塊を効率良く人工的に作成することが可能となる。また人工的に作成した細胞塊は、薬剤評価に供することで、より正確に生体内器官への薬剤作用を評価することが可能となる。またヌードマウス、 S C I Dマウスのような免疫不全動物への細胞塊移植により、より完成度の高い器官様組織を作成でき、たとえばヒ卜毛包、マウス腎などを異所的に作成することで新規な薬剤評価ならびに遺伝子機能評価を可能とするモデル動物の作成が可能となる。特に細胞塊を作成する際に細胞に遺伝子導入または改変を施すことでレポーターを有する再構築器官を簡便に作成することが可能となり、組織および器官レベルでの生体内分子挙動を正確に把握調査できうる。

本発明に係る細胞塊において、上皮系体細胞がケラチノサイ卜かつ間葉系体細胞が毛乳頭細胞であり、そして毛包誘導機能を有する毛包が形成される場合、その細胞塊は、育毛効果を示す薬剤の評価、例えばそのような薬剤のスクリーニングに使用できる。例えば、育毛薬剤の候補薬剤をこの細胞塊に適用し、コントロールと比較して、細胞塊の成長が顕著となる場合、育毛効果を有する薬剤と判定したり、あるいは毛成長を促進させる遺伝子、例えば c 一 my cの発現の亢進を指標としたり、毛成長を抑制する遺伝子、例えば BM P 4、 I G F B P 3遺伝子などの発現の抑制を指標として、育毛効果の有無を判定することができる。実施例

毛乳頭細胞

ヒ卜由来毛乳頭細胞はドナーより提供された頭皮組織より調製した。真皮組織を除去後、脂肪組織内に存在する毛包部位を実体顕微鏡下にてピンセットおよび眼科はさみを用いて採取した。採取した毛包は抗生剤入りの培養液内に移し、さらに同顕微鏡下にて毛乳頭細胞部位を目視にて分離採取した。分離した毛乳頭細胞は培地内にて 1 0 c m丸型ディッシュ（T R P社製）において、 3 7 °C、 9 5 % C〇₂下にて 1週間以上培養し、後の実験に供した。使用した培地は A d v a n c e d— D ME M ( I n v i t r o g e n) 、 1 5 %牛胎児由来血清、 2 0 n g ^/m l の b F G F、 1 0 n g /m 1 n o E G F、 2 mMの L一グルタミン、ペニシリン · ストレブ卜マイシン · アンフォテリシン混合液《100倍希釈》、 3. 5 u 1 / 5 0 0 m l の ; 6メルカプトエタノールである。細胞は適宜同じ条件下で継代培養した。継代の際には、 0. 5 % トリプシン ZE D TA溶液にて細胞剥離を行い、細胞を新たなディッシュに移し入れ、同じ組成の新鮮培地で継代培養を行った。

B I 0 (C a l b i o c h e m社）を添加する場合、 DM S O ( ジメチルスルホオキサイド）にて 1 0 mM溶解して、 0. l〜 5 ii Mとなるように添加した。ケラチノサイ卜

ヒ卜正常新生児包皮由来ケラチノサイ卜を以下のとおりにして調製した。ドナ一から採取した包皮組織をデイスパーゼ酵素存在下の

P B S (—）内にて一夜程度 4 °Cにて処理した。この処理により表皮のみがシート状で採取でき、それを継代時と同様な方法で 0.25% トリプシン酵素にて消化調製し、コラーゲン処理された培養皿に培地ごと移し換え、培養した。培地として H u m e d i a K G 2 ( クラボウ社）を使用した。細胞は適宜同じ条件下で継代培養した。継代の際には、 0. 5 % トリプシン Z E D T A溶液にて細胞剥離を行い、細胞を新たなディッシュに移し入れ、同じ組成の新鮮培地で継代培養を行った。上記のようにして採取され培養された細胞を、以降の実験に供した。

B I O (C a l b i o c h e m社）を添加する場合、 D M S〇（ジメチルスルホオキサイド）にて 1 0 mM溶解して、 0. 1〜 5 i Mとなるように添加した。

八ンギングドロップ培養

培地構成

A d v a n c e d— DM E M ( I n v i t r o g e n社） 3 0 % 、 2 mMの L一グルタミン、ペニシリン · ストレプトマイシン混合液（ I n v i t r o g e n社）（ 1 0 0倍希釈） 3. 5 x 1 / 5 0 0 m l の jSメルカプトエタノールと H u m e d i a K G - 2 (クラボウ社）を 1 ： 1 にて混合した。

B i o (C a l b i o c h e m社）を添加する場合、 DM S O ( ジメチルスルホオキサイド）にて 1 0 mM溶解して、 0. 1〜 5 Mとなるように添加した。

作成方法

毛乳頭細胞は P 3 (継代数 1 を P 1と表記）以上にて B i o負荷有り又は無しで、表皮角化細胞については P 3以内の細胞を準備した。

各細胞が 1 X 1 0⁵個になるように、トリプシン処理後に各々の培地により希釈した。

B i o (C a l b i o c h e m社）を添加する場合、 D M S〇 ( ジメチルスルホオキサイド）にて 1 0 mM溶解して、 0. l〜 5 ^i Mとなるように添加した。

1 0 c m角の四角い培養皿（フタ）天井側に各培養液 2 5〜 3 5 1 を分注して混合し、適当な大きさのドーム上の水滴を作成した注意深くフタを閉じ、培養液が落下しないようにして、 3 7 °C、

5 % C〇₂雰囲気にて培養した。

3 日後、上記で使用したのと同じ培地にて、培地交換を行った。さらに 4 日間培養後、一部は下記の R T— P C R解析（ 1 ) へ供した。残りは、すべての培地を B i o無しの条件にある培地へ交換した。

3 日目に同様な培地交換をおこない、 7 日目に生成した細胞塊を回収し、下記の免疫染色へ供した。

免疫組織蛍光染色

ハンギングドロップ法で得られた各細胞塊を 0. 1 %パラフオルムアルデヒドにて 5分固定し、その後の染色に供した。また、一部の細胞隗は未固定で〇 C T液に包埋し、クライオス夕ットにて凍結切片を作製して、免疫組織染色を行った。

1 3 %ゥシ血清アルブミン（B S A) を含む P B S (—）内にて 6時間ブロッキングを行った。

下記表に示す各種一次抗体を、上記 1 3 %ゥシ血清アルブミン（ B S A) を含む P B S (—）により 1 Z 2 0 0に希釈し、各サンプ 3 ルに添加し、 4時間、 4 °Cにて反応させた。

0. 0 2 %の Tw e e n 2 0 を含む P B S (—）にて 3回洗浄した。

上記 1 3 %ゥシ血清アルブミン（B S A) を含む P B S (-) により 1 / 2 0 0に希釈した蛍光二次抗体（EXCELフアイル参照）を各サンプルに添加した。また DA P I ( 4 '— 6 —ジアミジノ— 2 一フエニルインド一ル）により、細胞の核を青色に染色した。

蛍光顕微鏡（O L YM P U S ) にて観察した。

表 1

ここで、ピメンチンに対するモノクローナル抗体は毛乳頭細胞を特異的に染色し、 C D 4 9 f ポリクローナル抗体は表皮細胞を特異的に染色するため、ビメンチン抗体及び C D 4 9 f 抗体の免疫細胞染色への適用は、本実験系にて生成した細胞塊内での細胞の属性の評価を可能にする。

図 1 は上記顕微鏡観察結果を示す白黒写真図である。同図のカラ一版では、緑色でのビメンチン抗体による染色、赤色での C D 4 9 f 抗体による染色を見極めることができ、それぞれ毛乳頭細胞、ケラチノサイ卜であることが理解できた。また、図 2に示すように毛乳頭細胞が細胞隗の中心部に凝集していることが確認できた。これらの図の結果、細胞が凝集化した後に規則的に配列したことが観察され、本実験系により上皮細胞と間葉細胞が規則正しく配列していることがわかった。 B I Oを添加して細胞塊を生じさせ後、 B I O 未添加で培養した細胞塊において、赤く染色されたケラチノサイ卜が枝状に規則正しく成長したことが伺えた。さらに図 3は、 B I O を添加して細胞塊を生じさせた場合に、毛乳頭が凝集して存在する中心部と、枝状に進展する細胞隗の先端部が、増殖マーカ一の K i 6 7に陽性であることを分かった。以上の結果、通常凝集させた体細胞は成長せず休眠状態になることが通例であつたが、 B I 〇の効果により細胞塊において細胞の増殖が起こったことは驚くべき知見といえる。

また、 ]6—力テニンモノクローナル抗体を幹細胞的性質のマ一キングのために使用した。 /3カテニンは通常の体細胞において少量にて細胞膜近傍に存在しているため、通常の蛍光免疫抗体染色では微弱にしか検出できない。しかしながら、幹細胞的性質を有する細胞では、 iSカテニンは核内にて転写因子として作用しており、その量も増えている。さらに核内への集積しているため、蛍光免疫抗体染色法でも強く局在している様子を確認できる。本実験においても、細胞塊の一部特異的な部位で ^カテニンが強く染色され、集積している状況が確認されていることから、 jSカテニン抗体による染色は細胞塊内での幹細胞的性質を有する細胞の検出に適しているといえる。

図 4は上記 /3—力テニンモノクローナル抗体染色による顕微鏡観察結果を示す白黒写真図である。同図のカラー版は、；6カテニン抗体による染色部位を緑色、ケラチノサイトを赤色で示している。強く緑色に光る部位の jSカテニン陽性細胞が認められ、細胞の幹細胞的性質が示された。特筆すべきは、細胞塊の球状部位において中心部が黄色に光る部分が存在したことである。この部位は ;8カテニン陽性かつケラチノサイトであることを示す。 /3カテニン陽性細胞は上記のとおり幹細胞的性質を有する細胞といえる。一方で細胞塊から枝状に進展するケラチノサイ卜（赤）の部位には黄色く光る部位はなく、つまり同一細胞塊内で幹細胞的性質と通常の体細胞的性質を有する細胞（ケラチノサイト）が共存していることを観察できている。通常の培養状態においては観察し得ない状況であり、上皮間葉相互作用があたかも i n v i v oのように再現され、未分化および分化した細胞群が自律的に細胞塊を形成し成長していると考察できる。

ここでいう未分化のケラチノサイ卜とは、毛母細胞のように毛を構築するケラチノサイトを恒常的作り出す幹細胞的能力を有する細胞をさす。一方で分化したケラチノサイトは増殖回数が限定的であり、いわゆる毛になりつつある細胞運命が決定されている細胞を指す。同時に図 4のカラー版において緑に光る球体を囲む細胞は毛乳頭細胞と考えられるが、この細胞塊の環境において毛乳頭細胞が /3 カテニン陽性細胞あることは、 i n V i V oにおいて毛包形成および成長開始に W n t シグナルが重要であることと類似しており、重要な点といえる。

表皮角化細胞や外毛根鞘細胞で発現するサイトケラチン 1 4 ( K 1 4 ) に対する抗体を、これらの細胞が毛幹に分化していないことを確認する目的で使用した（赤色）。ヘアケラチン特異的に反応する A E 1 3モノクローナル抗体（Lynch e t a l , J Ce l l B i o l 103 ， 2593, 1986 ) は、 44K/46Kの酸性ヘアケラチン二量体を認識することから、毛幹に分化した状態のマ一キングのために使用した（緑色）。ヘアケラチンは、通常の表皮角化細胞においてほとんど全く存在しない、毛包特異的な構造タンパク質である。図 5はその顕微鏡観察結果を示す白黒写真図である。同図のカラ一版では、毛乳頭細胞と表皮角化細胞で作製した細胞塊では、 AE 1 3抗体によって染色される部分は認められないが、 B I Oで刺激すると、一部に染色が確認される。毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞で作製した細胞塊では、 B I 〇の刺激がない場合での A E 1 3抗体によって染色される部分が確認でき、 B I Oの刺激によって A E 1 3抗体による染色性が著しく高まった。一方、すべての細胞塊で K 1 4抗体（赤）と A E 1 3抗体（緑）の両方で染色される部位（黄色く光る部位）は認められないことから、サイトケラチン 1 4を発現する未分化な細胞からヘアケラチンを産生する細胞への変化が起きたものと考えられる発毛期の毛芽において特異的に発現する（Ogawa et al, Exp Der matol 13, 401, 2004) ヒト上皮抗原に対する B e r — E P 4抗体を、発毛期の毛芽のマ一キングのために使用した（緑色）。図 6はその顕微鏡観察結果を示す白黒写真図である。同図のカラ一版では、毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞で作製した細胞塊において、 B I Oで刺激した場合に、 B e r — E P 4抗体による免疫染色性（緑）が明瞭に観察された。 K 1 4抗体（赤）と B e r — E P 4抗体（緑）の両方で染色される部位（黄色く光る部位）は認められないことから、サイトケラチン 1 4を発現する未分化な細胞から B e r — E P 4 を発現する毛芽に分化した細胞への変化が起きたものと考えられる

R T— P C R解析（ 1 )

各サンプルから T R I Z O L ( I n v i t r o g e n) を用い、 R NAを抽出した。各 R NA 2 0 O n g相当を R e v T r a A C E (T OY O B O) 5 0 1 の反応系にて c D N Aへ逆転写した。得られたサンプル 1 a 1 を下記のプライマーを用い、 5 0 1 の系で P C R反応にかけた。使用した酵素は KOD— D A S H (T〇 Y〇 B〇）、 [ 9 5 °C、 6 0 s e c、（ 9 5 °C、 3 0 s e c ; 6 3 °C、 1 5 s e c ; 7 2 °C、 3 0 s e c )を 4 0サイクル、 Ί 2 °Z、 6 0 s e c ]の反応プロトコ一ルを用いた。

反応液 1 0 l を 2 %ァガロースゲル（C〇 S M〇 B I 〇） / Ί A Εバッファ一内にて 1 0 0 Vで電気泳動をした。使用した D N A サイズマーカ一は 1 0 0 b pラダーマーカー（T O Y O B O) である。

使用したプライマーは下記のとおりであり、 P C Rの結果を図 7 に示す。

表 2

ιδ —ァクチンは実験全体のコントロールとして用いた。

L e f — 1 は Wn t シグナルの下流遺伝子であり、図 7 に示すとおり、 B I Oの存在下及び非存在下のいずれにおいても本実験系で検出された。 L e f — 1の遺伝子発現が認められる場合、細胞に W n t シグナルが作用していることを意味する。従って、本実験系では B I Oの添加により細胞内へ Wn t シグナルが作動していることが理解できる。

S H H ( S o n i c H e d e H o g) は組織形成時に関与する遺伝子であり、図 7に示すとおり、 B I 〇の存在下及び非存在下のいずれにおいても本実験系では検出されなかった。 S HHはW n tならびに L e ί— 1のシグナルを受けて転写発現される遺伝子である。本遺伝子発現は Wn t シグナルが細胞に作用し、更に i n v i v oにおいて起きているような連鎖的な遺伝子発現が起こつていることを示す。同時に S HHは上皮間葉間での細胞間シグナルを担うタンパクであり、上皮間葉相互作用が起きていることも同時に示唆する。

S TAT - 3 (SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIP TION 3) は毛包誘導関連遺伝子であり、図 7に示すとおり、 B I 〇の非存在下に比べ、存在下で顕著に検出された。 S TAT— 3は幹細胞の自己増殖に関与するといわれる細胞内シグナル伝達タンパクである。同遺伝子の宂進は、胚性幹細胞にて自己増殖と万能性維持に必要不可欠な因子であり、その幹細胞的性質を示すマーカーの一つである。同時に論文 Sano, S. et al. , ature Med. 11: 43-49, 2005" St at 3 1 inks activated kerat inocy tes and immunocytes rea u i red for development of psoriasis in a novel transgenic mou se modeL "にあるように、毛の成長期への移行に非常に重要な遺伝子であることからも、本実験系にて S TAT— 3の転写が亢進することは、後に毛包へと成長していく際の正常な段階を踏んでいることが示唆される。同時に S TAT— 3シグナルそのものは B I 〇の影響を直接受けるものではない（Sato N, et al, Nat Med. 2004 Jan; 10 (1) :55-63. Epub 2003 Dec 21. "Maintenance of pluripoie ncy in human and mouse embryonic stem cells through act ivat i on of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-spec i f ic inhi bitor") 。つまり、 S T A T— 3の B I O添加時での亢進は、上皮間葉相互作用により幹細胞維持システムが細胞塊内で生まれていること示す。

TW I S T— 1は胚性間葉系幹細胞のマ一カーであり、毛乳頭細胞が極めて高い幹細胞的性質を有していることを示唆する。 TW I S T - 1は体細胞での発現は骨髄性間葉幹細胞を含む極めて希少な細胞種に限られることから、毛乳頭細胞は体細胞としても高い幹細胞的性質を持つ細胞といえる。図 7 R T— P C Rの実験においては等量の全 RNAを铸型に用いて RT— P C Rをしている。 B I Oの存在下において発現が低下しているように見えるのは、図 1および 2から観察できるように、全細胞数における毛乳頭細胞の数が相対的に低下しているためである。結論として、発現量の多少を考慮したうえでも、 TW I S T— 1遺伝子を発現する細胞が存在し続けていることは、本実験において幹細胞的能力を有しうる毛乳頭細胞が存在し続けていることを示唆している。

バーシカン遺伝子は発毛誘導時に強く毛乳頭細胞にて発現されることで知られる発毛マ一カーである（Kishimoto et al. Pro Nat 1. Acad. Sci. USA(1999), pp.7336-7341) 。図 7 RT— P C Rの実験においては等量の全 RNAを錡型に用いて RT— P C Rをしている。 B I Oの存在下において発現が低下しているように見えるのは、図 1および 2から観察できるように、全細胞数における毛乳頭細胞の数が相対的に低下しているためである。結論として、発現量の多少を考慮したうえでも、バーシカン遺伝子を発現する細胞が存在し続けていることは、本実験において発毛誘導能を有しうる毛乳頭細胞が存在し続けていることを示唆している。各種遺伝子の発現レベルの変化から、細胞塊内で B I Oの直接効果により、上皮および間葉細胞の未分化性が維持され、かつ Wn t シグナルによる上皮間葉相互作用の擬似が起こったといえる。また S T A T— 3のように W n t シグナルとは関連のない幹細胞的性質の出現が認められることから B I 〇の効果は自律的な細胞間相互作用と増殖能を有する細胞塊の創出に寄与しているといえる。

W n t 3 A R T— P C R

毛乳頭細胞は P 3 (継代数 1 を P 1と表記）にて B i o負荷有りで、ケラチノサイトについては P 3以内の細胞を準備した。

各細胞が 3 X 1 0³個になるように、トリプシン処理後に各々の培地により希釈した。

B i o (C a l b i o c h e m社）を D M S〇 (ジメチルスルホオキサイド）にて 1 0 mM溶解して、 0. 1〜 5 ^ Mとなるように添加した。

1 0 c m角の四角い培養皿（フタ）天井側に各培養液 2 5〜 3 5 1 を分注して混合し、適当な大きさのドーム上の水滴を作成した注意深くフタを閉じ、培養液が落下しないようにして、 3 7 °C、 5 % C 0₂雰囲気にて培養した。

3 日後、上記にて使用したのと同じ培地にて、培地交換を行った。 7 日目にてサンプルを回収し、下記のとおりの R T— P C R解析

( 2 ) に供した（図 8の「0 day」）。さらに残りの同様の細胞については培地を B i o無しの条件にある培地へ交換し、分化誘導させ、 3 日目に回収したサンプルを同様に下記のとおりの R T— P C R解析（ 2 ) に供した（図 8の「3 daysj ) 。

R T - P C R解析（ 2 )

サンプルから T R I Z O L ( I n v i t r o g e n ) を用い、 R NAを抽出した。各 RNA 2 0 0 n g相当を R e v T r a A C E ( T OYO B O) 5 0 1 の反応系にて c D NAへ逆転写した。得られたサンプル 1 a 1 を下記のプライマーを用い、 5 0 [1 1 の系で P C R反応にかけた。使用した酵素は KOD— DA S H (T〇Y〇 B 〇）、 [ 9 4 °C、 2 m i n、（ 9 4。C、 3 0 s e c ; 6 3 °C、 1 0 s e c ； 7 2。C、 3 0 s e c )を 3 2サイクル、 7 2 °C、 2 m i n] の反応プロトコールを用いた。

Sense Primer (順鎖） caggaactacgtggagatcatg (配歹番号 1 3 )

Antト Sense Primer (逆鎖） ccatcccaccaaaactcgatgtc (配歹 ϋ番号 1 4 )

反応液 1 0 1 を 2 %ァガロースゲル ( C〇 S M〇 B I O ) /T AEバッファー内にて 1 0 0 Vで電気泳動をした。臭化工チヂゥムにて可視化した後、目的のバンドを検出した。

その結果を図 8に示す。図中、矢印で示しているのが Wn t 3 A のバンドである。 W n t 3 Aは発現自体が稀であり、主に上皮系細胞により発現され、器官形成や上皮系細胞一間葉系細胞の相互作用に関与する遺伝子であることが知られている。図に示すとおり、 B I Oの存在下で培養することにより Wn t シグナルを活性化せしめた細胞においては W n t 3 Aの発現は全く認められなかったのに対し、その後 B I Oを取り除くことで細胞の分化を誘導せしめた細胞では W n t 3 Aの発現が認められた。よって、本実験系では、 B I Oの存在下で培養後、 B I 〇を除いて培養することで、ケラチノサィトの分化、さらには自律的な器官形成が誘導されることが明らかとなった。

W n t 1 0 B R T— P C R

毛乳頭細胞は P 3 (継代数 1 を P Iと表記）にて B i o負荷なしで、外毛根鞘細胞については P 3以内の細胞を準備した。各細胞が 3 X 1 0³個になるように、トリプシン処理後に各々の培地により希釈した。

B i o (C a l b i o c h e m社）は、 DM S O (ジメチルスルホオキサイド）にて 1 0 mM溶解して、 0 . 1 〜 5 Mとなるように添加した。

1 0 c m角の四角い培養皿（フタ）天井側に各培養液 2 5〜 3 5 H 1 を分注して混合し、適当な大きさのドーム上の水滴を作成した注意深くフタを閉じ、培養液が落下しないようにして、 3 7 °C、 5 % C 0₂雰囲気にて培養した。

3 日後、上記にて使用したのと同じ培地にて、培地交換を行った。 7 日後にサンプルを回収し、下記のとおりの R T— P C R解析（ 3 ) に供した（図 9の「 7 日」）。さらに残りの同様の細胞については培地を B i o無しの培地へ交換して分化誘導させ、 1 0 日後と 1 4 日後に回収したサンプルを同様に下記のとおりの R T— P C R 解析（ 3 ) に供した（図 9の「 1 0 日」および「 1 4 日」）。

R T - P C R解析（ 3 )

サンプルから T R I Z O L ( I n v i t r o g e n ) を用い、 R NAを抽出した。各 R NA 2 0 0 n g相当を R e v T r a A C E ( T O YO B O) 5 0 l の反応系にて c D NAへ逆転写した。得られたサンプル 4 n 1 を下記のプライマーを用い、 2 0 n 1 の系で定量 P C R (LightCycler systen Roche) にかけた。 LightCycler FastSiart MA Master SYB Green I (R o c h e ) の反応プロトコール [ 9 5。C、 1 0 s e c ; 6 3。C、 l O s e c ； 7 2 °C, 1 5 s e c を 4 0サイクル] を用いた。

Sense Primer (順鎖） gaagt tctctcgggat t tct tggatcc (配歹 (1番号 1 5 )

Ant i-Sense Primer (逆鎖） cggt tgtgggtatcaatgaagatgg (酉己歹 U番号 1 6 )

その結果を図 9に示す。データはすべて、細胞塊において B I 〇を負荷させていない場合の 3 日後の発現量に対する相対的な発現量として表した。 Wn t 1 O Bは毛包の形態形成期と発毛期において、主に上皮系細胞により発現され、上皮系細胞一間葉系細胞の相互作用に関与する遺伝子であることが知られている。図に示すとおり

、 B I Oの存在下で培養することにより W n tシグナルを活性化せしめた細胞においては、 B I 0の存在下で培養する限りは Wn t 1 0 Bの発現は、 B I 〇の非存在下で培養したコントロールと同程度しか認められなかったのに対し、その後 B I 〇を取り除くことで細胞の分化を誘導せしめた細胞では、 Wn t 1 0 Bの発現が、経時的に高まった。よって、本実験系では、 B I Oの存在下で培養後、 B I Oを除いて培養することで、毛包上皮系細胞（外毛根鞘細胞）の分化、さらには自律的な器官形成が誘導されることが明らかとなつた。

細胞塊の発毛薬剤 e y e 1 o s p o r i n e Aへの反応性

免疫抑制剤である c y c 1 o s p o r i n e Aは、副作用として多毛症（Lutz et al, Skin Pharmacol 7, 101, 1994)が知られている薬剤であり、発毛作用（Paus et al, Lab Invest 60, 365, 1989) や毛成長促進作用（Taylor et al, J Invest Dermatol 100, 237, 1

993)を示すことが明らかになつている。

毛乳頭細胞は P 3 (継代数 1を P 1と表記）にて B i o負荷なしで、外毛根鞘細胞については P 3以内の細胞を準備した。

各細胞が 3 X 1 0³個になるように、トリプシン処理後に各々の培地により希釈した。 1 0 c m角の四角い培養皿（フタ）天井側に各培養液 2 5〜 3 5 H 1 を分注して混合し、適当な大きさのドーム上の水滴を作成した注意深くフタを閉じ、培養液が落下しないようにして、 3 7 °C、 5 % C〇₂雰囲気にて培養した。

3 日後、 e y e 1 o s p o r i n e Aを含む上記にて使用したのと同じ培地にて、培地交換を行った。 e y e 1 o s p o r i n e A (Novartis社）は、エタノールにて 1 0 mM溶解して、 0. 1〜 1 0 Mとなるように添加した。

e y e 1 o s p o r i n e A添加の 3 日後にてサンプルを回収し、下記のとおりの R T— P C R解析（ 4 ) に供した。

R T - P C R解析（ 4 )

サンプルから R N e a s yキット（Q I A G E N) を用い、 R N Aを抽出した。各 R NA 2 0 0 0 n g相当を S u p e r S c r i ρ t II ( I n v i t r o g e n) 2 0 / l の反応系にて c D NAへ逆転写した。得られたサンプル 1 1 を下記のプライマーを用い、 2 0 1 の系で定量 P C R (LightCycler system, Roche) にかけた。 LightCycler FastStart DNA Master SYB Green I (R o c h e ) の反応プロトコ一ル [ 9 5 °C、 1 0 s e c ; 5 8 °C、 1 0 s e c ; 7 2 °C、 1 5 s e c を 4 0サイクル] を用いた。

B M P 4

Sense Primer (順鎖） gggcacctcatcacacgact (配列番号 1 7 ) Antト Sense Primer (逆鎖） ggcccaat tcccactccct t (配列番号 1 8 )

c— m y c

Sense Primer (順鎖） t tctctccgtcctcggattctctg (配列番号 1 9 ) Ant i-Sense Primer (逆鎖） c gcagaaggtgatccagac tc tgac (酉己歹 U 番号 2 0 )

1 G F B P 3

Sense Primer (順鎖） acagccagcgc t acaaagt t (配列番号 2 1 ) Ant i-Sense Primer (逆鎖） gcagtgcacgtcctcct t (配列番号 2

2 )

その結果を図 1 0に示す。デ一夕はすべて、 e y e 1 o s p o r i n e Aを添加していない場合に対する相対的な発現量として示した。 B M P 4は毛包の形態形成期と発毛期において、主に毛乳頭細胞により発現され、上皮系細胞一間葉系細胞の相互作用に対して抑制的に作用する遺伝子であることが知られている（Hens et al, Dev elopment 134, 1221, 2007)。図に示すとおり、 B M P 4の発現量は 6 0 %程度にまで、有意に発現が低下した。また、 c 一 my cは発毛期のバルジ領域や成長期の毛母細胞に強く発現して、毛包上皮細胞の増殖に対して正に働く遺伝子であることが知られている（Bull

JJ et al, Invest Dermatol 116, 617, 2001) 。図に示すとおり、 c 一 my cの発現は 1. 5倍近くまで亢進した。さらに、 I G F B P 3は毛成長を抑制する因子として知られ（Weger et al, J Inv est Dermatol 125, 847, 2005) 、休止期において発現が高まることが明らかになつている（Schlake et al. , Gene Expr. Patterns 4, 141, 2004) 。図に示すとおり、 I G F B P 3の発現は 6 0 %程度にまで、有意に発現が低下した。よって、本実験系において発毛や毛成長に関わる遺伝子が e y e 1 o s p o r i n e Aによって変動することが分かり、本実験系を発毛や毛成長に影響する薬剤の評価に利用することが可能であることが明らかとなつた。

Claims

請求の範囲

1 . 体性に由来する複数の体性細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊の製造方法であって、

前記複数種の体性細胞を含む培養液を用意し、

前記 W n t シグナル活性化剤を含有する培養液を所定期間にわたり非平面接触性培養に委ね、

前記非平面接触性培養した培養物の培地を W n t シグナル活性化剤非含有培地と交換し、更に所定期間培養する、

2 . 前記複数種の体性細胞が、上皮系体細胞と間葉系体細胞との組み合わせからなり、当該間葉系体細胞が未分化状態を保っている、請求項 1記載の方法。

3 . 前記上皮系体細胞がケラチノサイトであり、前記間葉系体細胞が毛乳頭細胞である、請求項 2記載の方法。

4 . 前記細胞塊から、毛包誘導機能を有する毛包が形成される、請求項 3記載の方法。

5 . 前記 W n t シグナル活性化剤が 6—プロモインジルビン一 3 ， —ォキシム（B I 〇）である、請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の方法。

6 . 前記非平面接触性培養方法がハンギングド口ップ方法である、請求項 1〜 5のいずれか 1項記載の方法。

7 . 体性に由来する複数の体性細胞種からなる原始的な器官様をなし得る細胞塊であって、前記複数種の体性細胞を含む培養液を用意し、

8. 前記複数種の体性細胞が、上皮系体細胞と間葉系体細胞との組み合わせからなり、当該間葉系体細胞が未分化状態を保っている、請求項 7記載の細胞塊。

9. 前記上皮系体細胞がケラチノサイトであり、前記間葉系体細胞が毛乳頭細胞である、請求項 8記載の細胞塊。

1 0. 前記細胞塊から、毛包誘導機能を有する毛包が形成される、請求項 9記載の細胞塊。

1 1. 前記 W n t シグナル活性化剤が 6 —ブロモインジルビン一 3 ，ーォキシム（B I O) である、請求項 7〜 1 0のいずれか 1項記載の細胞塊。

1 2. 前記非平面接触性培養方法がハンギングドロップ方法である、請求項 7〜 1 1のいずれか 1項記載の細胞塊。

1 3. 請求項 9〜 1 2のいずれか 1項記載の細胞塊に候補薬剤を適用し、育毛効果を有する薬剤をスクリーニングする方法。

1 4. 前記細胞塊の c 一 my c、 B M P 4及び I G F B P 3から成る群から選ばれる 1又は複数の遺伝子の発現量を指標とする、請求項 1 3記載の方法。