JP2020074718A - 毛包原基、毛包原基の製造方法、及び毛包原基に含まれる細胞の活性化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
胎齢18日のC57BL/6マウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法(Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communications, 3, 784, 2012)を一部改変して、ディスパーゼ処理を4℃で1時間、30rpm震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に100U/mLのコラゲナーゼ処理を1時間20分施し、さらにトリプシン処理を10分施すことで、上皮系細胞を単離した。
間葉系細胞としては、毛乳頭細胞を用いた。すなわち、商業的に入手可能なヒト毛乳頭細胞(PromoCell社)を継代培養し、継代4代目〜6代目(P4〜P6)の当該ヒト毛乳頭細胞を用いた。培養液としては、商業的に入手可能な毛乳頭細胞用培養培地(PromoCell社)を用いた。
間葉系幹細胞としては、脂肪由来幹細胞を用いた。すなわち、商業的に入手可能なヒト脂肪由来幹細胞(Lonza社)を継代培養し、継代4代目〜6代目(P4〜P6)の当該ヒト脂肪由来幹細胞を用いた。培養液としては、商業的に入手可能なDMEM培養培地(Sigma社)を用いた。
毛包原基を形成するための培養容器として、各ウェルが、細胞非接着コーティングが施された丸底(凹状に湾曲した細胞非接着性底面)を有する、商業的に入手可能な96マルチウェルプレートを用いた。
図1A、図1B、及び図1Cには、それぞれ培養1日目、培養2日目、及び培養3日目に、1つのウェル内で形成された毛包原基の蛍光顕微鏡写真を示す。図1A〜図1Cに示す毛包原基において、毛乳頭細胞は、蛍光試薬VybrantDiOにより緑色に蛍光染色され、脂肪由来幹細胞(図中の「ADSC」)は、蛍光試薬VybrantDilにより赤色に蛍光染色された。
上述の実施例1と同様に、胎齢18日のC57BL/6マウス胎児の皮膚組織から、上皮系細胞を単離した。
上述の実施例1と同様に、間葉系細胞として、毛乳頭細胞を調製した。
上述の実施例1と同様に、間葉系幹細胞として、脂肪由来幹細胞を調製した。
培養容器としては、上述の実施例1と同様に、96マルチウェルプレートを用いた。そして、上皮系細胞、毛乳頭細胞、及び脂肪由来幹細胞の数の比率を変えて、上述の実施例1と同様に、混合培地を用いて、各ウェルで当該上皮系細胞、毛乳頭細胞、及び脂肪由来幹細胞の共培養を行った。
3日間の培養により形成された毛包原基の遺伝子発現量をRT−PCRにより解析した。RT−PCRで用いたプライマーの塩基配列は、Versicanについて、Forward Primerは「5‘−GCTGCAAAAGAGTGTGAAAA−3’」、Reverse Primerは「5‘−AGTGGTAACGAGATGCTTCC−3’」であり、BMP4について、Forward Primerは「5‘−GCCCGCAGCCTAGCAA−3’」、Reverse Primerは「5‘−CGGTAAAGATCCCGCATGTAG−3’」であり、ALPについて、Forward Primerは「5‘−ATTGACCACGGGCACCAT−3’」、Reverse Primerは「5‘−CTCCACCGCCTCAGCA−3’」であり、コントロールとして用いたGAPDHについて、Forward Primerは「5‘−ACCACAGTCCATGCCATCAC−3’」、Reverse Primerは「5‘−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−3’」であった。
図3A、図3B、及び図3Cには、上皮系細胞、毛乳頭細胞、及び脂肪由来幹細胞の数の比を変えた共培養により形成された毛包原基のVersican遺伝子、BMP4遺伝子、及びALP遺伝子の発現量をそれぞれ解析した結果を示す。具体的に、図3A、図3B、及び図3Cには、脂肪由来幹細胞を用いることなく形成された比較例2−1の毛包原基(図中の「1:1:0」)、上皮系細胞:毛乳頭細胞:脂肪由来幹細胞=2:2:1の数比で形成された実施例2−1の毛包原基(図中の「2:2:1」)、上皮系細胞:毛乳頭細胞:脂肪由来幹細胞=4:4:1の数比で形成された実施例2−2の毛包原基(図中の「4:4:1」)、及び上皮系細胞:毛乳頭細胞:脂肪由来幹細胞=8:8:1の数比で形成された実施例2−3の毛包原基(図中の「8:8:1」)のそれぞれについて、当該比較例2−1における遺伝子発現量を「1」とした場合の、相対的な遺伝子発現量(図の縦軸)を示す。
毛包原基スフェロイドを形成するための共培養に用いるマルチウェル培養容器を、上述した特許文献1と同様にして作製した。すなわち、まずCADソフト(V Carve Pro 6.5)を用いて、作製するマルチウェルのパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系樹脂基板を切削することで、当該パターンを有する凹鋳型を作製した。この鋳型にエポキシ樹脂(クリスタルリジン、日新レジン株式会社製)を流し込み、1日硬化させ、その後、離型することで、上述の設計されたパターンを有する凸鋳型を形成した。形成した凸鋳型を24ウェルプレートの底面に固定し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を流し込んで固化し、その後、離型することで、PDMS基板に規則的なパターンで形成されたマルチウェル(各ウェルの直径は1mm、深さは1mm)を有するマルチウェル培養容器(以下、「PDMSスフェロイドチップ」という。)を作製した。
上述の実施例1と同様に、胎齢18日のC57BL/6マウス胎児の皮膚組織から、上皮系細胞を単離した。
上述の実施例1と同様に、間葉系細胞として、毛乳頭細胞を調製した。
上述の実施例1と同様に、間葉系幹細胞として、脂肪由来幹細胞を調製した。
培養容器としては、上述のようにして作製したPDMSスフェロイドチップを用いた。そして、PDMSスフェロイドチップの各ウェルに、上皮系細胞及び毛乳頭細胞をそれぞれ4×103個/ウェル、及び脂肪由来幹細胞を2×103個/ウェル(全細胞数が1×104個/ウェル)となるように混合して播種し、共培養を3日間行った。培養液としては、毛乳頭細胞培養培地(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium kit、PromoCell社)と、HuMedia−KG2とを体積比1:1で混合して調製された混合培地を用いた。
図4A及び図4Bには、それぞれ培養1日目及び培養3日目においてウェル内で形成されていた毛包原基の高倍率での位相差顕微鏡写真を示し、図4Cには、培養3日目においてウェル内で形成されていた毛包原基の低倍率での位相差顕微鏡写真を示す。
上述の実施例1と同様に、胎齢18日のC57BL/6マウス胎児の皮膚組織から、上皮系細胞を単離した。
上述の実施例1と同様に、間葉系細胞として、毛乳頭細胞を調製した。
上述の実施例1と同様に、間葉系幹細胞として、脂肪由来幹細胞を調製した。
培養容器としては、上述の実施例1と同様に、96マルチウェルプレートを用いた。そして、上皮系細胞、毛乳頭細胞、及び脂肪由来幹細胞の数の比率を変えて、各ウェルで当該上皮系細胞、毛乳頭細胞、及び脂肪由来幹細胞の共培養を行った。培養液としては、毛乳頭細胞培養培地(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium kit、PromoCell社)と、HuMedia−KG2とを体積比1:1で混合して調製された混合培地を用いた。
上述のようにして形成した毛包原基を培養3日目に回収して、ヌードマウスの皮内に移植した。すなわち、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を施し、その背部をイソジンで消毒した。次いで、Vランスマイクロメス(日本アルコン)を用いて、皮膚の表皮層から真皮層下部に至る移植創を形成した。そして、この移植創に、毛包原基を20個ずつ注入した。なお、ヌードマウスの飼育及び移植実験は、横浜国立大学動物実験専門委員会の指針を遵守して行った。
図5A、図5B、及び図5Cにはそれぞれ、脂肪由来幹細胞を用いることなく形成された比較例2−1の毛包原基(図5A中の「1:1:0」)、上皮系細胞:毛乳頭細胞:脂肪由来幹細胞=2:2:1の数比で形成された実施例4−1の毛包原基(図5B中の「2:2:1」)、上皮系細胞:毛乳頭細胞:脂肪由来幹細胞=4:4:1の数比で形成された実施例4−2の毛包原基(図5C中の「4:4:1」)、をマウスに移植してから30日後の時点で撮影された、当該毛包原基から再生した毛の写真を示す。
Claims (12)
- 上皮系細胞と、間葉系細胞と、間葉系幹細胞とを含む、毛包原基。
- 前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞である、請求項1に記載の毛包原基。
- 前記間葉系細胞は、毛乳頭細胞、及び/又は、毛球部毛根鞘細胞である、請求項1又は2に記載の毛包原基。
- 毛包原基スフェロイドである、請求項1乃至3のいずれかに記載の毛包原基。
- 前記上皮系細胞の数と前記間葉系細胞の数との合計に対する、前記間葉系幹細胞の数の比率が0.01以上である、請求項1乃至4のいずれかに記載の毛包原基。
- 前記上皮系細胞の数に対する、前記間葉系幹細胞の数の比率が0.02以上である、請求項1乃至5のいずれかに記載の毛包原基。
- 前記間葉系細胞の数に対する、前記間葉系幹細胞の数の比率が0.02以上である、請求項1乃至6のいずれかに記載の毛包原基。
- 上皮系細胞と、間葉系細胞と、間葉系幹細胞とを共培養することにより毛包原基を形成することを含む、毛包原基の製造方法。
- 前記上皮系細胞と、前記間葉系細胞と、前記間葉系幹細胞とを細胞非接着性表面上で共培養する、
請求項8に記載の毛包原基の製造方法。 - 前記共培養により形成された前記毛包原基は、前記間葉系幹細胞を用いない以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる間葉系細胞に比べて、活性化された前記間葉系細胞を含む、
請求項8又は9に記載の毛包原基の製造方法。 - 前記活性化された間葉系細胞は、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、前記間葉系幹細胞を用いない以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる間葉系細胞のそれより増加している、
請求項10に記載の毛包原基の製造方法。 - 上皮系細胞と間葉系細胞との共培養により形成される毛包原基において、
間葉系幹細胞をさらに加えて前記共培養を行うことにより、前記毛包原基に含まれる前記間葉系細胞を活性化する、
間葉系細胞の活性化方法。
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