JP7427180B2 - 毛包原基及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、毛包原基及びその製造方法に関する。
非特許文献１には、マウスの胎児線維芽細胞から作製された人工多能性幹細胞（iPSCs）を９６ウェルプレートに播種して培養することにより、in vitroで皮膚組織体（skin organoids）を形成することが記載されている。
特許文献１には、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備えることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法が記載されている。
特許文献２には、皮膚付属器官を有する全層皮膚を製造する方法であって、当該「皮膚付属器官を有する全層皮膚」は、少なくとも下記（１）～（３）；（１）表皮層と真皮層を含む皮膚、（２）少なくとも１種類の皮膚付属器官、及び（３）皮下組織を含み、当該方法は、下記ステップ；（ａ）胚様体を、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質で刺激するステップ、（ｂ）：下記（Ａ）および（Ｂ）を含む結合体を調製するステップ；（Ａ）ステップ（ａ）で刺激を行った当該胚様体の全部または一部（Ｂ）足場材料、（ｃ）：当該ステップ（ｂ）で調製した当該結合体を動物に移植するステップ、および、（ｄ）：当該動物中において、前記結合体由来の全層皮膚を製造するステップ、を含むことを特徴とする、方法が記載されている。
Jiyoon Lee et al. (2018). Hair Follicle Development in Mouse Pluripotent Stem Cell-Derived Skin Organoids. Cell Reports 22, 242-254
しかしながら、非特許文献１に記載の方法は、人工多能性幹細胞を用いるため、操作が煩雑であり、また、比較的長い培養期間が必要であった。
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、簡便に且つ短期間で、in vitroにおいて毛幹様構造を形成できる毛包原基を提供することをその目的の一つとする。
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法の一側面は、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること；、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持すること；及び、培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞の共培養を行うことにより、毛包原基を形成すること、を含む、毛包原基の製造方法である。本発明によれば、簡便に且つ短期間で、in vitroにおいて毛幹様構造を形成できる毛包原基を製造する方法が提供される。
前記方法においては、前記（ａ）ラミニン及びエンタクチンが分散された培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持することとしてもよい。前記方法においては、前記（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持することとしてもよい。
前記方法は、培養液中で、播種された前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を、培養基材上に沈降させることを含み、前記培養基材上に沈降した前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を、前記（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で保持することとしてもよい。前記方法は、前記（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中における前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞の保持後、前記（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度が前記保持時の濃度より小さい培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞の共培養を行うことを含むこととしてもよい。前記方法においては、前記共培養を行うことにより、毛幹様構造を有する前記毛包原基を形成することとしてもよい。
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法の他の側面は、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること、及び前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を共培養して毛包原基を形成することを含む細胞培養において、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持することにより、前記毛包原基における毛幹様構造の形成を促進する方法である。本発明によれば、簡便に且つ短期間で、in vitroにおいて毛包原基における毛幹様構造の形成を促進する方法が提供される。
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法のさらに他の側面は、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること、及び前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を共培養して毛包原基を形成することを含む細胞培養において、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンを、前記毛包原基における毛幹様構造の形成を促進するために使用する方法である。本発明によれば、簡便に且つ短期間で、in vitroにおいて毛包原基における毛幹様構造の形成を促進するために、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンを使用する方法が提供される。
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る毛包原基は、上皮系細胞及び間葉系細胞を含む毛包原基であって、毛幹様構造を有し、立毛筋構造及び／又は皮脂腺構造を含まず、生体に移植されていない、毛包原基である。本発明によれば、簡便に且つ短期間に、in vitroで形成された、毛幹様構造を有する毛包原基が提供される。
本発明によれば、簡便に且つ短期間で、in vitroにおいて毛幹様構造を形成できる毛包原基及びその製造方法が提供される。
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。
本実施形態に係る方法（以下、「本方法」という。）は、その一側面として、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること；、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を保持すること；及び、培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行うことにより、毛包原基を形成すること、を含む、毛包原基の製造方法を包含する。
すなわち、本発明の発明者らは、in vitroで毛包原基を製造する技術的手段について鋭意検討を重ねた結果、意外にも、培養液中で、上皮系細胞及び間葉系細胞を、当該培養液に分散された（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンと接触させることにより、in vitroにおいて毛幹様構造を形成することができる毛包原基を、簡便に且つ短期間で製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
このため、本方法は、他の側面として、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること、及び当該上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養して毛包原基を形成することを含む細胞培養において、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を保持することにより、当該毛包原基における毛幹様構造の形成を促進する方法を包含する。
また、本方法は、さらに他の側面として、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること、及び当該上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養して毛包原基を形成することを含む細胞培養において、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンを、当該毛包原基における毛幹様構造の形成を促進するために使用する方法を包含する。
すなわち、本実施形態は、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）ＩＶ型コラーゲンの、毛包原基における毛幹様構造の形成を促進するための培養液添加剤（より具体的には、培養液中に分散された成分）としての使用を包含する。
本方法において用いられる上皮系細胞は、間葉系細胞と共培養することにより毛包原基を形成する上皮系細胞であれば特に限られないが、例えば、毛包組織に由来する上皮系細胞、皮膚組織に由来する上皮系細胞、及び、培養系で幹細胞から誘導された毛包上皮系細胞からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
毛包組織に由来する上皮系細胞は、例えば、毛包組織のバルジ領域に由来する上皮系細胞（例えば、外毛根鞘最外層細胞）、及び、毛包組織の毛母基部に由来する上皮系細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。皮膚組織に由来する上皮系細胞は、例えば、表皮角化細胞及び発生期の皮膚上皮系細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。培養系で幹細胞から誘導された毛包上皮系細胞は、例えば、ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ）細胞、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ）細胞、又はＥＧ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ）細胞から誘導された毛包上皮系細胞であることとしてもよい。上皮系細胞は、上皮幹細胞であってもよい。
上皮系細胞は、例えば、発毛関連遺伝子を発現する。具体的に、上皮系細胞は、例えば、サイトケラチンを発現する細胞として特定される。上皮系細胞が上皮幹細胞である場合、当該上皮幹細胞は、例えば、サイトケラチン１５及びＣＤ３４からなる群より選択される１以上を発現する細胞として特定される。上皮系細胞は、生体から採取された初代細胞であってもよいし、予め培養された細胞（例えば、継代培養された細胞、及び／又は、株化された細胞）であってもよい。
本方法において用いられる間葉系細胞は、上皮系細胞と共培養することにより毛包原基を形成する間葉系細胞であれば特に限られないが、例えば、毛包組織に由来する間葉系細胞、皮膚組織に由来する間葉系細胞、及び、培養系で幹細胞から誘導された間葉系細胞からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
毛包組織に由来する間葉系細胞は、例えば、毛乳頭細胞及び毛球部毛根鞘細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。皮膚組織に由来する間葉系細胞は、例えば、真皮毛根鞘細胞及び発生期の皮膚間葉系細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。培養系で幹細胞から誘導された間葉系細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又はＥＧ細胞から誘導された毛包間葉系細胞であることとしてもよい。
間葉系細胞は、例えば、発毛関連遺伝子を発現する。具体的に、間葉系細胞は、例えば、Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）からなる群より選択される１以上を発現する細胞として特定される。間葉系細胞は、生体から採取された初代細胞であってもよく、予め培養された細胞（例えば、継代培養された細胞、及び／又は、株化された細胞）であってもよい。
なお、本方法においては、上皮系細胞及び間葉系細胞のみの共培養を行うこととしてもよいが、さらに他の細胞を含む共培養を行うこととしてもよい。この場合、他の細胞は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、色素細胞、色素前駆細胞、色素幹細胞、及び多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又はＭｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ－ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞）由来色素幹細胞からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。また、他の細胞を播種するタイミングは、上皮系細胞、間葉系細胞及び当該他の細胞を含む毛包原基が形成される範囲内であれば特に限られない。
本方法においては、まず、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種する。この点、上記非特許文献１に記載の方法においては、人工多能性幹細胞を播種している。このため、人工多能性幹細胞を分化させるための煩雑な操作が必須であった。これに対し、本方法では、多能性幹細胞を用いる必要がない。このため、本方法は、多能性幹細胞を播種することを含まないこととしてもよい。また、本方法は、多能性幹細胞を分化させることを含まないこととしてもよい。また、本方法は、多能性幹細胞を培養することを含まないこととしてもよい。
上皮系細胞及び間葉系細胞の播種は、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を培養容器に入れることにより行う。具体的には、上皮系細胞及び間葉系細胞を含む培養液（細胞懸濁液）を培養容器内に入れる。また、培養容器は、上皮系細胞及び間葉系細胞が沈降する培養基材（例えば、当該培養容器の底部、又は当該培養容器内に配置された当該培養容器と別体の培養基材）を含むため、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を当該培養基材上に播種するともいえる。
上皮系細胞及び間葉系細胞の播種においては、当該上皮系細胞と間葉系細胞とを同時に播種してもよいし、又は、当該上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞を播種し、次いで他方の細胞を播種してもよい。すなわち、上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞を、他方の細胞と接触させることなく播種し、次いで、当該他方の細胞を播種して、当該一方の細胞と当該他方の細胞とを接触させることとしてもよい。この場合、まず間葉系細胞を播種し、次いで、上皮系細胞を播種することが好ましい。
具体的に、例えば、まず間葉系細胞を含み上皮系細胞を含まない細胞懸濁液を培養容器（例えば、９６ウェルプレートのウェル）に入れて当該間葉系細胞を播種し、次いで、当該間葉系細胞を含む培養容器に、上皮系細胞を含む細胞懸濁液を入れて当該上皮系細胞を播種する。この場合、上皮系細胞を含む細胞懸濁液は間葉系細胞を含まないこととしてもよい。
また、上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞を播種し、次いで当該一方の細胞を培養し、その後、他方の細胞を播種することとしてもよい。すなわち、この場合、上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞を他方の細胞と接触させることなく播種して培養し、次いで当該他方の細胞を播種して、当該一方の細胞と他方の細胞との共培養を開始する。
上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞を播種し、次いで他方の細胞を播種する場合、当該一方の細胞を播種してから、当該他方の細胞を播種するまでの時間（すなわち、例えば、当該一方の細胞を播種してから、当該一方の細胞及び他方の細胞の共培養を開始するまでの時間）は、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られないが、例えば、９６時間以下であってもよく、７２時間以下であることが好ましく、４８時間以下であることがより好ましく、２４時間以下であることが特に好ましい。
播種される上皮系細胞及び間葉系細胞は、培養液中に分散されていることが好ましい。この場合、上皮系細胞及び間葉系細胞は、培養液中で混合され、且つ分散される。培養液中に分散された個々の細胞は、他の細胞と結合しておらず、又は、他の細胞に付着しているがピペッティング等の操作により当該培養液を流動させることで当該他の細胞から容易に分離される。なお、本方法で用いられる培養液は、本発明の効果が得られる範囲内で、上皮系細胞及び間葉系細胞の生存を維持できる溶液であれば特に限られない。
上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞を播種し、次いで他方の細胞を播種する場合、まず培養液に分散された当該一方の細胞を播種し、次いで培養液に分散された当該他方の細胞を播種することが好ましい。具体的に、例えば、まず上皮系細胞を含まず間葉系細胞が分散された細胞懸濁液を培養容器に入れて当該間葉系細胞を播種し、次いで、当該間葉系細胞を含む培養容器に、上皮系細胞が分散された細胞懸濁液を入れて当該上皮系細胞を播種する。
播種される上皮系細胞及び間葉系細胞の密度は、その後の共培養において毛包原基を形成できる範囲内であれば特に限られず、例えば、培養容器内で（特に、培養基材上に沈降した状態で）、個々の細胞が隣接する細胞と接触可能となる程度の密度であることが好ましい。
本方法においては、播種された上皮系細胞及び間葉系細胞を、培養液中で共培養することにより、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を含む毛包原基を形成する。すなわち、培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養することにより、培養時間の経過に伴い、当該上皮系細胞及び間葉系細胞が凝集して、毛包原基を形成する。
より具体的に、播種された上皮系細胞及び間葉系細胞は、培養液中、混合され且つ分散された状態で保持される。その後、培養時間の経過に伴って、上皮系細胞同士の結合の形成、間葉系細胞同士の結合の形成、及び、上皮系細胞と間葉系細胞との結合の形成が進む。その結果、上皮系細胞は凝集して上皮系細胞凝集体を形成し、間葉系細胞は凝集して間葉系細胞凝集体を形成し、また、当該上皮系細胞凝集体及び間葉系細胞凝集体の形成と並行して、当該上皮系細胞凝集体と間葉系細胞凝集体との結合も形成される。こうして最終的に、上皮系細胞集合体と間葉系細胞凝集体とを含む毛包原基が形成される。
上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞（例えば、間葉系細胞）を播種し、次いで他方の細胞（例えば、上皮系細胞）を播種することにより、当該一方の細胞が凝集して形成された第一の細胞凝集体と、当該他方の細胞が凝集して形成され、当該第一の細胞凝集塊と連結された第二の細胞凝集体とを含む毛包原基を効率的に形成することができる。
本方法において毛包原基を形成するためには、上皮系細胞及び間葉系細胞が凝集する必要があるため、当該毛包原基を形成するための上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養は、流動性のある培養液中で行う。
毛包原基は、動物に移植された場合に毛髪を形成する細胞凝集体である。本方法において製造される毛包原基は、毛包原基スフェロイドであることとしてもよい。毛包原基スフェロイドは、略球状の細胞集合体である。
毛包原基を構成する細胞の総数に対する、上皮系細胞及び間葉系細胞の数の割合は、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られないが、例えば、５０％以上であることとしてもよく、７０％以上であることとしてもよく、９０％以上であることとしてもよい。
この場合、毛包原基を製造するために播種される細胞の総数に対する、上皮系細胞及び間葉系細胞の数の割合も、例えば、５０％以上であることとしてもよく、７０％以上であることとしてもよく、９０％以上であることとしてもよい。
同様に、毛包原基を形成するために共培養される細胞の総数に対する、上皮系細胞及び間葉系細胞の数の割合も、例えば、５０％以上であることとしてもよく、７０％以上であることとしてもよく、９０％以上であることとしてもよい。
本方法においては、上皮系細胞及び間葉系細胞を、細胞非接着性の培養基材上で共培養することとしてもよい。この場合、共培養中、上皮系細胞及び間葉系細胞は、培養基材上に接着することなく培養液中に浮遊し、又は、ピペッティング等の操作により培養液を流動させることで当該培養基材から容易に脱離する程度に当該培養基材に付着する。細胞非接着性の培養基材上で培養される上皮系細胞及び間葉系細胞の形状は、ほぼ球形に維持される。
細胞非接着性の培養基材上で共培養することにより、非接着状態の毛包原基が形成される。非接着状態の毛包原基は、培養液中に浮遊し、又は、ピペッティング等の操作により培養液を流動させることで当該培養基材から容易に脱離する程度に当該培養基材に付着する。
上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養する培養容器は、当該上皮系細胞及び間葉系細胞が毛包原基を形成できるものであれば特に限られないが、例えば、比較的小さなウェルが好ましく用いられる。
すなわち、培養容器として用いられる１つのウェルの底面の面積は、例えば、１０００ｍｍ２以下であってもよく、１００ｍｍ２以下であることが好ましく、５０ｍｍ２以下であることがより好ましく、２０ｍｍ２以下であることが特に好ましい。
ウェルの底面の面積は、例えば、１００μｍ２以上であってもよく、１０００μｍ２以上であることが好ましく、１００００μｍ２以上であることがより好ましく、１０００００μｍ２以上であることが特に好ましい。
ウェルの底面の面積は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。具体的に、ウェルの底面の面積は、例えば、１００μｍ２以上、１０００ｍｍ２以下であってもよく、１０００μｍ２以上、１００ｍｍ２以下であることが好ましく、１００００μｍ２以上、５０ｍｍ２以下であることがより好ましく、１０００００μｍ２以上、２０ｍｍ２以下であることが特に好ましい。
本方法においては、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養により、各培養容器（例えば、各ウェル）内に、１つの毛包原基を形成することとしてもよい。すなわち、この場合、各培養容器に播種された上皮系細胞及び間葉系細胞は、当該培養容器内で凝集し、１つの毛包原基を形成する。
そして、本方法においては、上皮系細胞及び間葉系細胞の播種後、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び、（ｂ）ＩＶ型コラーゲンからなる群より選択される１以上が分散された培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する。
すなわち、例えば、（ａ）ラミニン及びエンタクチンが分散された培養液中で、上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する。この場合、ラミニン及びエンタクチンは、ラミニンとエンタクチンとの複合体を含んでいることが好ましい。
また、例えば、（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する。また、例えば、（ａ）ラミニン及びエンタクチン、及び（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する。
分散された（ａ）及び／又は（ｂ）を含む培養液は、予め調製された（ａ）を含む組成物、及び／又は、予め調製された（ｂ）を含む組成物を培養液に添加することにより調製される。
本方法においては、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を保持することにより、当該培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を、当該（ａ）及び／又は（ｂ）と接触させる。
すなわち、流動性を有する培養液中で、上皮系細胞及び間葉系細胞を、当該培養液中に分散された（ａ）及び／又は（ｂ）と接触させる。具体的に、本方法において上皮系細胞及び間葉系細胞と接触させる（ａ）及び／又は（ｂ）は、流動性を有する培養液中に分散されている（ａ）及び／又は（ｂ）であり、例えば、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を包埋しているハイドロゲルを構成している（ａ）及び／又は（ｂ）ではないし、当該上皮系細胞及び間葉系細胞がハイドロゲルの表面に保持されている場合において当該ハイドロゲルを構成している（ａ）及び／又は（ｂ）ではないし、当該上皮系細胞及び間葉系細胞が保持されている培養基材に予め固定化されている（ａ）及び／又は（ｂ）ではない。
本方法は、ハイドロゲル（例えば、（ａ）及び／又は（ｂ）を含む成分で構成されるハイドロゲル、又は、当該（ａ）及び／又は（ｂ）を含まないハイドロゲル）の表面上に保持されている上皮系細胞及び間葉系細胞と、培養液中に分散されている（ａ）及び／又は（ｂ）とを接触させることを含んでもよい。ただし、本方法は、（ａ）及び／又は（ｂ）を含む成分で構成されるハイドロゲルの表面上に保持されている上皮系細胞及び間葉系細胞と、培養液中に分散されている（ａ）及び／又は（ｂ）とを接触させることを含まないこととしてもよい。また、本方法は、（ａ）及び／又は（ｂ）を含まないハイドロゲルの表面上に保持されている上皮系細胞及び間葉系細胞と、培養液中に分散されている（ａ）及び／又は（ｂ）とを接触させることを含まないこととしてもよい。また、本方法は、ハイドロゲルの表面上に保持されている上皮系細胞及び間葉系細胞と、培養液中に分散されている（ａ）及び／又は（ｂ）とを接触させることを含まないこととしてもよい。
本方法は、（ａ）及び／又は（ｂ）が固定化された培養基材上に保持されている上皮系細胞及び間葉系細胞と、培養液中に分散されている（ａ）及び／又は（ｂ）とを接触させることを含んでもよい。ただし、本方法は、（ａ）及び／又は（ｂ）が固定化された培養基材上に保持されている上皮系細胞及び間葉系細胞と、培養液中に分散されている（ａ）及び／又は（ｂ）とを接触させることを含まないこととしてもよい。
また、本方法は、毛包原基が形成される前に、（ａ）及び／又は（ｂ）を含む成分で構成されるハイドロゲル中に上皮系細胞及び間葉系細胞を包埋して培養することを含まないこととしてもよい。また、本方法は、毛包原基が形成される前に、（ａ）及び／又は（ｂ）を含まないハイドロゲル中に上皮系細胞及び間葉系細胞を包埋して培養することを含まないこととしてもよい。また、本方法は、毛包原基が形成される前に、ハイドロゲル中に上皮系細胞及び間葉系細胞を包埋して培養することを含まないこととしてもよい。
なお、播種に用いられる上皮系細胞及び間葉系細胞を含む細胞懸濁液は、（ａ）及び／又は（ｂ）を含んでもよいし、（ａ）及び／又は（ｂ）を含まなくてもよい。播種時の細胞懸濁液が（ａ）及び／又は（ｂ）を含まない場合、播種後、培養液に当該（ａ）及び／又は（ｂ）を添加することにより、当該上皮系細胞及び間葉系細胞と、当該培養液に分散された（ａ）及び／又は（ｂ）とを接触させる。
すなわち、上皮系細胞と間葉系細胞とを同時に播種する場合、当該上皮系細胞及び間葉系細胞と、（ａ）及び／又は（ｂ）とを含む細胞懸濁液を培養容器に入れて播種を行うこととしてもよいし、又は、まず当該上皮系細胞及び間葉系細胞を含み、（ａ）及び／又は（ｂ）を含まない細胞懸濁液を培養容器に入れて播種を行い、その後、当該培養容器に（ａ）及び／又は（ｂ）を添加することとしてもよい。
また、上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞（例えば、間葉系細胞）を播種し、次いで他方の細胞（例えば、上皮系細胞）を播種する場合、当該一方の細胞及び当該他方の細胞のそれぞれの播種において、当該一方の細胞又は当該他方の細胞と、（ａ）及び／又は（ｂ）とを含む細胞懸濁液を培養容器に入れて播種を行うこととしてもよいし、又は、まず当該一方の細胞又は当該他方の細胞を含み、（ａ）及び／又は（ｂ）を含まない細胞懸濁液を培養容器に入れて播種を行い、その後、当該培養容器に（ａ）及び／又は（ｂ）を添加することとしてもよい。
上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する培養液中の（ａ）ラミニン及びエンタクチンの濃度は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、１μｇ／ｍＬ以上であってもよく、３μｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、５μｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。
また、上記培養液中の（ａ）ラミニン及びエンタクチンの濃度は、例えば、３０００μｇ／ｍＬ以下であってもよく、２５００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、２０００μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。
上記培養液中の（ａ）ラミニン及びエンタクチンの濃度は、上述した下限値のいずれかと、上述した上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。すなわち、上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する培養液中の（ａ）ラミニン及びエンタクチンの濃度は、例えば、１μｇ／ｍＬ以上、３０００μｇ／ｍＬ以下であってもよく、３μｇ／ｍＬ以上、２５００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５μｇ／ｍＬ以上、２０００μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。
上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する培養液中の（ｂ）ＩＶ型コラーゲンの濃度は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、１μｇ／ｍＬ以上であってもよく、３μｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、５μｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。
また、上記培養液中の（ｂ）ＩＶ型コラーゲンの濃度は、例えば、１０００μｇ／ｍＬ以下であってもよく、７００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、４００μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。
上記培養液中の（ｂ）ＩＶ型コラーゲンの濃度は、上述した下限値のいずれかと、上述した上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。すなわち、上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する培養液中の（ｂ）ＩＶ型コラーゲンの濃度は、例えば、１μｇ／ｍＬ以上、１０００μｇ／ｍＬ以下であってもよく、３μｇ／ｍＬ以上、７００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５μｇ／ｍＬ以上、４００μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。
本方法において、（ａ）及び／又は（ｂ）を培養液に分散する目的は、当該培養液のゲル化ではないため、培養液中の（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度は、一般にゲル化のために用いられる濃度に比べて低くてもよい。すなわち、上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する培養液中の（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度は、当該培養液の全体をゲル化させる濃度より低いこととしてもよい。
（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する温度は、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られないが、例えば、当該上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養に適した温度であることが好ましく、具体的には、例えば、３０℃以上、４５℃以下の温度であることが好ましく、３５℃以上、４０℃以下の温度であることが特に好ましい。
（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する時間（当該（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中、共培養に適した温度で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する時間）は、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られないが、例えば、３０分以上であることとしてもよく、４０分以上であることが好ましく、５０分以上であることがより好ましく、６０分以上であることが特に好ましい。
（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を保持するタイミングは、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られないが、毛包原基の形成前に開始することが好ましい。
具体的に、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中での上皮系細胞及び間葉系細胞の保持は、例えば、当該上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養が開始された時点（すなわち、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養に適した温度（例えば、好ましくは３５℃以上、３９℃以下、特に好ましくは３６℃以上、３８℃以下）で保持し始めた時点）から、２８時間が経過する前に開始することとしてもよく、２４時間が経過する前に開始することが好ましく、２０時間が経過する前に開始することがより好ましく、１５時間が経過する前に開始することがより一層好ましく、１０時間が経過する前に開始することが特に好ましい。
すなわち、上皮系細胞と間葉系細胞とを同時に播種する場合、及び、上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞（例えば、間葉系細胞）を播種し、次いで他方の細胞（例えば、上皮系細胞）を播種する場合、のいずれの場合においても、当該上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養が開始された時点から上記いずれかの閾値時間が経過する前（当該共培養が開始されると同時又はそれより後であって、当該共培養が開始されてから上記いずれかの閾値時間が経過する前）に、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中での当該上皮系細胞及び間葉系細胞の保持を開始することとしてもよい。
また、上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、まず一方の細胞（例えば、間葉系細胞）を播種して当該一方の細胞の培養を開始し、次いで、他方の細胞（例えば、上皮系細胞）を播種して共培養を開始する場合、当該一方の細胞の培養が開始された時点（すなわち、当該一方の細胞を培養に適した温度（例えば、好ましくは３５℃以上、３９℃以下、特に好ましくは３６℃以上、３８℃以下）で保持し始めた時点）から、２８時間が経過する前（当該一方の細胞の培養開始と同時又はそれより後であって、当該一方の細胞の培養開始から当該２８時間が経過する前）に、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で当該一方の細胞を保持することを開始することとしてもよい。
この場合、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中における一方の細胞（上皮系細胞及び間葉系細胞のうち、先に播種された細胞）の保持は、例えば、当該一方の細胞の培養が開始された時点から２４時間が経過する前に開始することが好ましく、１８時間が経過する前に開始することがより好ましく、１２時間が経過する前に開始することがより一層好ましく、当該一方の細胞の培養開始と同時に開始することが特に好ましい。
本方法は、培養液中で、播種された上皮系細胞及び間葉系細胞を、培養基材上に沈降させることをさらに含み、当該培養基材上に沈降した当該上皮系細胞及び間葉系細胞を、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で保持することとしてもよい。
すなわち、（ａ）及び／又は（ｂ）が添加されていない培養液中（特に、（ａ）が添加されていない培養液中）で上皮系細胞及び間葉系細胞を培養基材上に播種する場合、例えば、まず当該培養液中で、播種された当該上皮系細胞及び間葉系細胞を当該培養基材上に沈降させ、その後、当該培養液に当該（ａ）及び／又は（ｂ）を添加して、分散された当該（ａ）及び／又は（ｂ）を含む培養液中、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する。
また、（ａ）及び／又は（ｂ）が添加された培養液中（特に、（ａ）が添加された培養液中）で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を培養基材上に播種する場合、例えば、まず、共培養に適した温度より低い温度（例えば、好ましくは１０℃以下（具体的には、例えば、０℃超、１０℃以下）、より好ましくは７℃以下、特に好ましくは５℃以下）で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を培養基材上に沈降させ、その後、当該共培養に適した温度で、分散された当該（ａ）及び／又は（ｂ）を含む培養液中、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を保持する。
上皮系細胞及び間葉系細胞を培養基材上に沈降させる方法は、特に限られず、例えば、当該培養基材を含む培養容器を静置することにより、及び／又は、当該培養基材を含む培養容器に遠心処理を施すことにより、当該培養容器内の培養液中で当該上皮系細胞及び間葉系細胞を培養基材上に沈降させることができる。
本方法においては、上述のようにして（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を保持した後、培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行うことにより、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を含む毛包原基を形成する。
共培養においては、（ａ）及び／又は（ｂ）が添加された培養液を用いてもよいし、（ａ）及び／又は（ｂ）が添加されていない培養液を用いてもよい。すなわち、本方法は、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中における上皮系細胞及び間葉系細胞の保持後、当該（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度が当該保持時の濃度より小さい培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行うことを含んでもよい。
この場合、分散された（ａ）及び／又は（ｂ）を第一の濃度で含む培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を保持し、その後、当該（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度が当該第一の濃度より小さい第二の濃度である培養液中で、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養する。
第二の濃度は、第一の濃度より小さく、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られないが、例えば、第一の濃度の５分の１以下であってもよいし、１０分の１以下であってもよいし、１５分の１以下であってもよいし、２０分の１以下であってもよいし、２５分の１以下であってもよいし、又は３０分の１以下であってもよい。
（ａ）の第二の濃度は、例えば、１μｇ／ｍＬ未満であってもよく、０．２μｇ／ｍＬ未満であってもよく、０．１μｇ／ｍＬ未満であってもよい。（ｂ）の第二の濃度は、例えば、１μｇ／ｍＬ未満であってもよく、０．２μｇ／ｍＬ未満であってもよく、０．１μｇ／ｍＬ未満であってもよい。
本方法が、第二の濃度で共培養を行うことを含む場合、毛包原基が形成されるまでの共培養期間を通じて、当該（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度が第二の濃度である培養液中で共培養を行うこととしてもよいし、当該共培養期間のうち一部の期間でのみ、当該（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度が第二の濃度である培養液中で共培養を行うこととしてもよい。
共培養に用いる培養液中の（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度を低減することにより、例えば、毛包原基の製造コストを効果的に低減することができ、また、煩雑な操作の低減によって操作性を向上させることもできる。
本方法においては、培養液中に分散された（ａ）及び／又は（ｂ）と上皮系細胞及び間葉系細胞を接触させ、その後、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養することにより、in vitroにおいて毛幹様構造を形成することができる毛包原基を、簡便に且つ短期間で製造することができる。すなわち、本方法で製造された毛包原基をさらに培養することにより、当該毛包原基において、毛幹様構造を形成することができる。
そこで、本方法においては、（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を保持した後、当該上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行うことにより、毛幹様構造を有する毛包原基を形成することとしてもよい。
すなわち、この場合、上皮系細胞及び間葉系細胞が凝集して毛包原基が形成された後も、当該毛包原基に毛幹様構造が形成されるまで、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養（当該毛包原基の培養）を継続する。その結果、in vitroで、簡便且つ短期間に、毛幹様構造を有する毛包原基を製造することができる。
具体的に、本方法においては、例えば、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養が開始された時点から、４８０時間が経過する前、好ましくは３６０時間が経過する前、より好ましくは２４０時間が経過する前、特に好ましくは１７０時間が経過する前に、毛幹様構造を有する毛包原基を形成することとしてもよい。
毛包原基が有する毛幹様構造は、当該毛包原基に形成される糸状の構造体である。この毛幹様構造は、ケラチンを含むこととしてもよい。また、毛幹様構造は、メラニンを含むこととしてもよい。また、毛幹様構造は、毛包原基から萌出していることとしてもよい。また、毛幹様構造は、キューティクル構造を有することとしてもよい。
本毛包原基が有する毛幹様構造の長さは、特に限られないが、例えば、３０μｍ以上であることとしてもよく、５０μｍ以上であることとしてもよく、１００μｍ以上であることとしてもよい。
本実施形態に係る毛包原基（以下、「本毛包原基」という。）は、上皮系細胞及び間葉系細胞を含む毛包原基であって、毛幹様構造を有し、立毛筋構造及び／又は皮脂腺構造を含まず、生体に移植されていない、毛包原基である。本毛包原基は、上述した本方法により好ましく製造される。
本毛包原基は、未だ生体に移植されていないにも関わらず、毛幹様構造を有している。この点、従来も、生体に移植された後、当該生体において毛幹様構造を形成できる毛包原基は製造することは可能であった。しかしながら、生体に移植する前に、生体外で、毛包原基に毛幹様構造を形成することは難しかった。
上記非特許文献１に記載の方法では、人工多能性幹細胞を培養して形成される皮膚組織体は、立毛筋構造や皮脂腺構造といった複雑な構造を有している。これに対し、本毛包原基は、比較的シンプルな構造を有する。
すなわち、本毛包原基は、上記非特許文献１に記載されているような立毛筋構造及び／又は皮脂腺構造を含まない。具体的に、本毛包原基は、立毛筋構造を含まないこととしてもよく、皮脂腺構造を含まないこととしてもよく、又は立毛筋構造及び皮脂腺構造を含まないこととしてもよい。
毛包原基の用途は、特に限られないが、当該毛包原基は、例えば、患者への移植等の医療に用いることができ、又は、毛髪の形成に関する研究のために用いることもできる。毛包原基が移植される生体は、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよいが、ヒトであることが好ましい。毛包原基の生体への移植は、当該生体の皮膚への移植であることが好ましい。
毛包原基の生体への移植は、医学的用途であってもよいし、研究用途であってもよい。毛包原基の生体への移植は、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防のための、当該疾患を患っている又は患う可能性のあるヒト患者への移植であることとしてもよい。
脱毛を伴う疾患は、特に限られないが、例えば、男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、及び症候性脱毛症からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。
毛包原基は、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防に使用され得る物質の探索、当該疾患に関与する物質の探索、当該疾患のメカニズムに関する研究のために用いられることとしてもよい。
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法（Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communications, 3, 784, 2012）を一部改変して、ディスパーゼ処理を４℃で１時間、３０ｒｐｍ震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。また、間葉層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施すことで間葉系細胞を単離した。
胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法（Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communications, 3, 784, 2012）を一部改変して、ディスパーゼ処理を４℃で１時間、３０ｒｐｍ震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。また、間葉層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施すことで間葉系細胞を単離した。
［培養］
例１－１においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ（登録商標））及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、ＧＩＢＣＯ（登録商標））を調製した。
例１－１においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ（登録商標））及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、ＧＩＢＣＯ（登録商標））を調製した。
次いで、この培養液に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量のマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標） Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））を添加することにより、細胞懸濁液を調製した。
用いられたマトリゲル製品は、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ）マウス腫瘍から抽出された可溶性基底膜マトリクスを１０．６ｍｇ／ｍＬ（Ｌｏｗｒｙ法で測定されるタンパク質量）含み、当該基底膜マトリクスにおける組成比率は、ラミニンが５６％、エンタクチンが８％、及びＩＶ型コラーゲンが３１％であった。
よって、１ｖ／ｖ％のマトリゲル製品が添加された上記細胞懸濁液は、５９μｇ／ｍＬのラミニン、８μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び３３μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレート（Ｐｒｉｍｅ ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）、住友ベークライト）の各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置した。この静置により、冷蔵庫内で、冷却された培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞がウェルの底面上に、互いに接触可能な状態で沈降した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。共培養は、１２日間行った。
共培養において、培養液の交換は、２日に１回行った。培養液の交換は、まず各ウェルから、ほぼ全ての培養液を除去し、次いで、新たな培養液として、マトリゲルを含まず、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を各ウェルに１００μＬ添加することにより行った。
また、比較のための例１－２においては、播種時の細胞懸濁液にマトリゲルを添加しなかったこと（すなわち、マトリゲルを含まない培養液のみを用いたこと）以外は上記例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
［結果］
図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃには、例１－１の一つのウェル内の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養６日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１Ｄ、図１Ｅ、及び図１Ｆには、例１－２の一つのウェル内の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養６日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１Ａ～図１Ｆにおいて、スケールバーは１００μｍを示す。
図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃには、例１－１の一つのウェル内の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養６日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１Ｄ、図１Ｅ、及び図１Ｆには、例１－２の一つのウェル内の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養６日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１Ａ～図１Ｆにおいて、スケールバーは１００μｍを示す。
図１Ｄ～図１Ｆに示すように、例１－２においては、毛幹様構造を有する毛包原基は形成されなかった。これに対し、図１Ａ～図１Ｃに示すように、例１－１においては、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図１Ｃにおいて矢頭が指し示すように、培養６日目の毛包原基には毛幹様構造が形成されていた。
また、図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃには、例１－１の他の一つのウェル内の共培養系において、それぞれ培養４日目、培養５日目、及び培養６日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図２Ａ～図２Ｃにおいて、スケールバーは１００μｍを示す。図２Ａ～図２Ｃにおいて矢頭が指し示すように、例１－１では、培養４日目に毛幹様構造の形成が確認され、その後、当該毛幹様構造は培養時間の経過に伴って伸長した。
また、培養１０日目の毛包原基における毛幹様構造の形成効率を評価した。すなわち、培養１０日目において毛幹様構造が形成されている毛包原基の数を、毛包原基の総数で除して、１００を乗じることにより、毛幹様構造の形成率（％）を算出した。
その結果、例１－２では、９６個の毛包原基の全てにおいて、毛幹様構造の形成は確認されず、毛幹様構造の形成率は、０（ゼロ）％であった。これに対し、例１－１では、９６個の毛包原基のうち、８８個の毛包原基において毛幹様構造の形成が確認され、毛幹様構造の形成率は、９２％であった。
図３には、例１－１において、培養１２日目の毛包原基に形成されていた毛幹様構造の走査型顕微鏡写真を示す。図３において、スケールバーは３０μｍを示す。図３に示すように、毛包原基に形成された毛幹様構造は、生体の毛幹の特徴的な構造であるキューティクル構造を有していた。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例２－１においては、上記実施例１の例１－１と同様、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。すなわち、まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
例２－１においては、上記実施例１の例１－１と同様、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。すなわち、まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
次いで、この培養液に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量のマトリゲルを添加することにより、細胞懸濁液を調製した。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置することにより、各ウェルで上皮系細胞及び間葉系細胞を沈降させた。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。
培養１日後、各ウェルに、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含み、マトリゲルを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ添加した。この結果、各ウェルの培養液の量は約２００μＬとなった。
その後、培養液は２日に１回交換した。培養液の交換は、まず各ウェルから、１００μＬの培養液を除去し、次いで、新たな培養液として、マトリゲルを含まず、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を各ウェルに１００μＬ添加することにより行った。
例２－２においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を播種し、その後、培養１日目に、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加した。
すなわち、まず、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
次いで、上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。
培養１日後（具体的には、共培養の開始（９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移した時点）から約２２時間が経過した時点）に、各ウェルに、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎ、及び２ｖ／ｖ％マトリゲルを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ添加した。この結果、各ウェルの培養液の量は約２００μＬとなり、当該培養液中のマトリゲル濃度は約１ｖ／ｖ％となった。
さらに、マトリゲルの添加後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を継続した。培養液の交換は、上記例２－１と同様に行った。
例２－３においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を播種し、その後、培養３日目に、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加した。
すなわち、上記例２－２と同様に、上皮系細胞及び間葉系細胞を含む細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を播種し、３７℃インキュベータ内で共培養を開始した。
培養１日後に、各ウェルに、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ添加した。この結果、各ウェルの培養液の量は約２００μＬとなった。
培養３日後（具体的には、共培養の開始から約６９時間が経過した時点）に、まず各ウェルから培養液１００μＬを除去し、次いで、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎ、及び２ｖ／ｖ％マトリゲルを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ添加した。この結果、各ウェルの培養液中のマトリゲル濃度は約１ｖ／ｖ％となった。
さらに、マトリゲルの添加後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を継続した。培養液の交換は、上記例２－１と同様に行った。
［結果］
図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃには、例２－１の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図４Ｄ、図４Ｅ、及び図４Ｆには、例２－２の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図４Ｇ、図４Ｈ、及び図４Ｉには、例２－３の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図４Ａ～図４Ｉにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃには、例２－１の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図４Ｄ、図４Ｅ、及び図４Ｆには、例２－２の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図４Ｇ、図４Ｈ、及び図４Ｉには、例２－３の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図４Ａ～図４Ｉにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図４Ａ～図４Ｃに示すように、例２－１においては、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図４Ｃにおいて矢頭が指し示すように、培養７日目の毛包原基には毛幹様構造が形成されていた。これに対し、図４Ｄ～図４Ｉに示すように、例２－２及び例２－３においては、培養７日目の毛包原基に毛幹様構造は形成されていなかった。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例３－１においては、まず、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を播種し、次いで、当該播種直後（当該播種から０時間後）に、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加した。
例３－１においては、まず、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を播種し、次いで、当該播種直後（当該播種から０時間後）に、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加した。
すなわち、まず、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
次いで、上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。次いで、播種直後の各ウェルに、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎ、及び２ｖ／ｖ％マトリゲルを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ添加した。この結果、各ウェルの培養液の量は２００μＬとなり、当該培養液中のマトリゲル濃度は１ｖ／ｖ％となった。
なお、マトリゲルを含む培養液を添加する直前の、播種直後において、各ウェル内の上皮系細胞及び間葉系細胞の一部は、ウェル底面上に未だ沈降しておらず、培養液中に浮遊していた。
その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。培養液の交換は、上記実施例２の例２－１と同様に行った。
例３－２においては、まず、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を播種して共培養を開始し、その後、当該共培養の開始から０．５時間が経過した時点で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加した。
すなわち、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。
共培養の開始から０．５時間が経過した時点で、各ウェルに、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎ、及び２ｖ／ｖ％マトリゲルを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ添加した。この結果、各ウェルの培養液の量は約２００μＬとなり、当該培養液中のマトリゲル濃度は１ｖ／ｖ％となった。
なお、マトリゲルを含む培養液を添加する直前の、共培養の開始から０．５時間が経過した時点において、各ウェル内の上皮系細胞及び間葉系細胞は、ウェル底面上に既に沈降していた。
その後、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を継続した。培養液の交換は、上記実施例２の例２－１と同様に行った。
例３－３においては、共培養の開始から１時間が経過した時点で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加したこと以外は上記例３－２と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例３－４においては、共培養の開始から２時間が経過した時点で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加したこと以外は上記例３－２と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例３－５においては、共培養の開始から３時間が経過した時点で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加したこと以外は上記例３－２と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例３－６においては、共培養の開始から６時間が経過した時点で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加したこと以外は上記例３－２と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例３－７においては、共培養の開始から１５時間が経過した時点で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加したこと以外は上記例３－２と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例３－８においては、共培養の開始から２２時間が経過した時点で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加したこと以外は上記例３－２と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
［結果］
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、及び図５Ｈには、それぞれ例３－１、例３－２、例３－３、例３－４、例３－５、例３－６、例３－７、及び例３－８の共培養において、培養３日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、及び図６Ｈには、それぞれ例３－１、例３－２、例３－３、例３－４、例３－５、例３－６、例３－７、及び例３－８の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図５Ａ～図５Ｈ、及び図６Ａ～図６Ｈにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、及び図５Ｈには、それぞれ例３－１、例３－２、例３－３、例３－４、例３－５、例３－６、例３－７、及び例３－８の共培養において、培養３日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、及び図６Ｈには、それぞれ例３－１、例３－２、例３－３、例３－４、例３－５、例３－６、例３－７、及び例３－８の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図５Ａ～図５Ｈ、及び図６Ａ～図６Ｈにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図５Ａ～図５Ｈ、及び図６Ａ～図６Ｈに示すように、共培養の開始から０時間～２２時間が経過した時点でラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加した全ての例（例３－１～例３－８）において、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図６Ａ～図６Ｈに示すように、全ての例において、培養８日目の毛包原基に毛幹様構造が形成されていた。
また、毛幹様構造の形成率は、例３－１で２２％（９個の毛包原基のうち２個）、例３－２で８９％（９個の毛包原基のうち８個）、例３－３で７８％（９個の毛包原基のうち７個）、例３－４で１００％（９個の毛包原基のうち９個）、例３－５で８９％（９個の毛包原基のうち８個）、例３－６で７８％（９個の毛包原基のうち７個）、例３－７で４４％（９個の毛包原基のうち４個）、及び例３－８で２２％（９個の毛包原基のうち２個）であった。
共培養の開始から１５時間又は２２時間が経過した時点でマトリゲルを添加した例３－７及び例３－８の毛幹様構造形成効率が、０．５時間～６時間が経過した時点でマトリゲルを添加した例３－２～例３－６のそれより小さい理由としては、例えば、当該マトリゲルを添加する時点で既に上皮系細胞及び間葉系細胞の凝集が進行していたことが考えられる。
また、共培養の開始直後にマトリゲルを添加した例３－１の毛幹様構造形成効率が小さい理由としては、例えば、当該マトリゲルを添加する時点で上皮系細胞及び間葉系細胞の一部がウェル底面上に沈降しておらず、未だ浮遊状態にあったことが考えられる。
なお、上記実施例２の例２－２では、例３－６と同様、共培養の開始から約２２時間が経過した時点でラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを培養液に添加したにもかかわらず、培養６日目における毛包原基に毛幹様構造の形成は確認されなかった。この原因としては、例えば、細胞を採取したマウスの個体差に由来する影響が考えられる。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例４においては、ラミニン及びエンタクチンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
例４においては、ラミニン及びエンタクチンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
次いで、この培養液に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量の高濃度ラミニン／エンタクチン複合体（ＨＩＧＨ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ ＬＡＭＩＮＩＮ／ＥＮＴＡＣＴＩＮ ＣＯＭＰＬＥＸ、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））を添加することにより、細胞懸濁液を調製した。
用いられた高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品は、ＥＨＳマウス腫瘍から抽出された可溶性基底膜マトリクスを１５．２ｍｇ／ｍＬ含み、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度９０％以上でラミニン／エンタクチン複合体を含み、ラミニンとエンタクチンとは等モル比で含まれていた。
よって、１ｖ／ｖ％の高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品が添加された上記細胞懸濁液は、１３７～１５２μｇ／ｍＬのラミニン／エンタクチン複合体（すなわち、それぞれ６８～７６μｇ／ｍＬのラミニン及びエンタクチンを）を含有していたと算出される。
すなわち、例４の細胞懸濁液において、ラミニンの含有量は、上記実施例１の例１－１の細胞懸濁液におけるそれの１１５％～１２９％であり、ラミニン及びエンタクチンの総含有量は、上記実施例１の例１－１の細胞懸濁液におけるそれの２０４％～２２７％であったと算出される。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置することにより、当該冷蔵庫内で、冷却された培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞をウェルの底面上に沈降させた。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。培養液の交換は、上記実施例１の例１－１と同様に行った。
［結果］
図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃには、例４の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図７Ａ～図７Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃには、例４の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養７日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図７Ａ～図７Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図７Ａ～図７Ｃに示すように、ラミニン及びエンタクチンを含む培養液を用いることにより、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図７Ｃにおいて矢頭が指し示すように、培養７日目の毛包原基には毛幹様構造が形成されていた。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例５－１においては、ラミニンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。すなわち、まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
例５－１においては、ラミニンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。すなわち、まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
次いで、この培養液に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量の高純度ラミニン（ＬＡＭＩＮＩＮ－ＵＬＴＲＡＰＵＲＥ，ＭＯＵＳＥ、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））を添加することにより、細胞懸濁液を調製した。
用いられた高純度ラミニン製品は、ＥＨＳマウス腫瘍から抽出された可溶性基底膜マトリクスを０．８２ｍｇ／ｍＬ含み、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度９５％以上でラミニンを含んでいた。
よって、１ｖ／ｖ％の高純度ラミニン製品が添加された上記細胞懸濁液は、約８μｇ／ｍＬのラミニンを含有していたと算出される。すなわち、例５－１の細胞懸濁液において、ラミニンの含有量は、上記実施例１の例１－１の細胞懸濁液におけるそれの１３％～１４％であったと算出される。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置することにより、当該冷蔵庫内で、冷却された培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞をウェルの底面上に沈降させた。
その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。培養液の交換は、上記実施例１の例１－１と同様に行った。
例５－２においては、上記実施例４の例４と同様にして、ラミニン及びエンタクチンを含む培養液を用いて上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例５－３においては、ＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。すなわち、まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
次いで、この培養液に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量のＩＶ型コラーゲン（ＣＯＬＬＡＧＥＮ ＩＶ，ＭＯＵＳＥ、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））を添加することにより、細胞懸濁液を調製した。
用いられたＩＶ型コラーゲン製品は、ＥＨＳマウス腫瘍から抽出された可溶性基底膜マトリクスを１．２５ｍｇ／ｍＬ含み、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度９０％以上でＩＶ型コラーゲンを含んでいた。
よって、１ｖ／ｖ％のＩＶ型コラーゲン製品が添加された上記細胞懸濁液は、１１～１３μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。すなわち、例５－３の細胞懸濁液において、ＩＶ型コラーゲンの含有量は、上記実施例１の例１－１の細胞懸濁液におけるそれの３４％～３８％であった。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置することにより、当該冷蔵庫内で、冷却された培養液中、細胞をウェルの底面上に沈降させた。
その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。培養液の交換は、上記実施例１の例１－１と同様に行った。
［結果］
図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃには、それぞれ例５－１、例５－２、及び例５－３において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図８Ａ～図８Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃには、それぞれ例５－１、例５－２、及び例５－３において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図８Ａ～図８Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図８Ａに示すように、ラミニンを含む培養液を用いた例５－１では、培養８日目の毛包原基において毛幹様構造は形成されていなかった。これに対し、図８Ｂにおいて矢頭が指し示すように、ラミニン及びエンタクチンを含む培養液を用いた例５－２では、培養８日目の毛包原基において毛幹様構造が形成されていた。また、図８Ｃにおいて矢頭が指し示すように、ＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いた例５－３においても、培養８日目の毛包原基において毛幹様構造が形成されていた。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例６においては、上記実施例１の例１－１において用いられたマトリゲル製品に代えて、増殖因子の含有量が低減されたマトリゲル製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標） Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ）、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））を、培養液中の濃度が１ｖ／ｖ％となる量で用いたこと以外は、当該実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を８日間行った。
例６においては、上記実施例１の例１－１において用いられたマトリゲル製品に代えて、増殖因子の含有量が低減されたマトリゲル製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標） Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ）、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））を、培養液中の濃度が１ｖ／ｖ％となる量で用いたこと以外は、当該実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を８日間行った。
用いられたマトリゲル製品（ＧＦＲ）は、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ）マウス腫瘍から抽出された可溶性基底膜マトリクスを８～１２ｍｇ／ｍＬ（Ｌｏｗｒｙ法で測定されるタンパク質量）含み、当該基底膜マトリクスにおける組成比率は、ラミニンが６１％、エンタクチンが７％、及びＩＶ型コラーゲンが３０％であった。
［結果］
図９Ａ及び図９Ｂには、例６の共培養において、それぞれ培養１日目及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図９Ａ及び図９Ｂに示すように、例６においては、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図９Ｂに示すように、培養８日目の毛包原基には毛幹様構造が形成されていた。
図９Ａ及び図９Ｂには、例６の共培養において、それぞれ培養１日目及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図９Ａ及び図９Ｂに示すように、例６においては、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図９Ｂに示すように、培養８日目の毛包原基には毛幹様構造が形成されていた。
また、９６個の毛包原基のうち、８５個の毛包原基において毛幹様構造の形成が確認され、毛幹様構造の形成率は、８９％であった。すなわち、例６においては、上述の例１－１と同様に毛幹様構造を有する毛包原基が形成され、毛幹様構造の形成率も当該例１－１と同程度であった。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例７－１においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．１ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．１ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、６μｇ／ｍＬのラミニン、１μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び３μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例７－１においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．１ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．１ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、６μｇ／ｍＬのラミニン、１μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び３μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例７－２においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．２ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．２ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、１２μｇ／ｍＬのラミニン、２μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び７μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例７－３においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．３ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．３ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、１８μｇ／ｍＬのラミニン、３μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び１０μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例７－４においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．４ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．４ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、２４μｇ／ｍＬのラミニン、３μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び１３μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例７－５においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．５ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、３０μｇ／ｍＬのラミニン、４μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び１６μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例７－６においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．６ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．５ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、３６μｇ／ｍＬのラミニン、５μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び２０μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
［結果］
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、及び図１０Ｆには、それぞれ例７－１、例７－２、例７－３、例７－４、例７－５、及び例７－６の共培養において、培養１日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、及び図１１Ｆには、それぞれ例７－１、例７－２、例７－３、例７－４、例７－５、及び例７－６の共培養において、培養３日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆには、それぞれ例７－１、例７－２、例７－３、例７－４、例７－５、及び例７－６の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１０Ａ～図１０Ｆ、図１１Ａ～図１１Ｆ、及び図１２Ａ～図１２Ｆにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、及び図１０Ｆには、それぞれ例７－１、例７－２、例７－３、例７－４、例７－５、及び例７－６の共培養において、培養１日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、及び図１１Ｆには、それぞれ例７－１、例７－２、例７－３、例７－４、例７－５、及び例７－６の共培養において、培養３日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆには、それぞれ例７－１、例７－２、例７－３、例７－４、例７－５、及び例７－６の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１０Ａ～図１０Ｆ、図１１Ａ～図１１Ｆ、及び図１２Ａ～図１２Ｆにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１０Ａ～図１０Ｆ、図１１Ａ～図１１Ｆ、及び図１２Ａ～図１２Ｆに示すように、全ての例（例７－１～例７－６）において、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図１２Ａ～図１２Ｆに示すように、全ての例において、培養８日の毛包原基に毛幹様構造が形成されていた。
また、培養８日目における毛幹様構造の形成率は、例７－１で２５％（１２個の毛包原基のうち３個）、例７－２で５８％（１２個の毛包原基のうち７個）、例７－３で９２％（１２個の毛包原基のうち１１個）、例７－４、例７－５、及び例７－６で１００％（１２個の毛包原基のうち１２個）であった。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例８－１においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて２．０ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、２．０ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、１１９μｇ／ｍＬのラミニン、１７μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び６６μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例８－１においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて２．０ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、２．０ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、１１９μｇ／ｍＬのラミニン、１７μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び６６μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例８－２においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて２．５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、２．５ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、１４８μｇ／ｍＬのラミニン、２１μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び８２μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例８－３においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて３．０ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、３．０ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、１７８μｇ／ｍＬのラミニン、２５μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び９９μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例８－４においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて３．５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、３．５ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、２０８μｇ／ｍＬのラミニン、３０μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び１１５μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例８－５においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて４．０ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、４．０ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、２３７μｇ／ｍＬのラミニン、３４μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び１３１μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していたと算出される。
例８－６においては、培養液に添加したマトリゲルの濃度を１ｖ／ｖ％に代えて４．５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例１の例１－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、４．５ｖ／ｖ％のマトリゲルが添加された細胞懸濁液は、２６７μｇ／ｍＬのラミニン、３８μｇ／ｍＬのエンタクチン、及び１４８μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲンを含有していた。
［結果］
図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅ、及び図１３Ｆには、それぞれ例８－１、例８－２、例８－３、例８－４、例８－５、及び例８－６の共培養において、培養１日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅ、及び図１４Ｆには、それぞれ例８－１、例８－２、例８－３、例８－４、例８－５、及び例８－６の共培養において、培養３日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅ、及び図１５Ｆには、それぞれ例８－１、例８－２、例８－３、例８－４、例８－５、及び例８－６の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１３Ａ～図１３Ｆ、図１４Ａ～図１４Ｆ、及び図１５Ａ～図１５Ｆにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅ、及び図１３Ｆには、それぞれ例８－１、例８－２、例８－３、例８－４、例８－５、及び例８－６の共培養において、培養１日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅ、及び図１４Ｆには、それぞれ例８－１、例８－２、例８－３、例８－４、例８－５、及び例８－６の共培養において、培養３日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅ、及び図１５Ｆには、それぞれ例８－１、例８－２、例８－３、例８－４、例８－５、及び例８－６の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１３Ａ～図１３Ｆ、図１４Ａ～図１４Ｆ、及び図１５Ａ～図１５Ｆにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１３Ａ～図１３Ｆ、図１４Ａ～図１４Ｆ、及び図１５Ａ～図１５Ｆに示すように、全ての例（例８－１～例８－６）において、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図１５Ａ～図１５Ｆに示すように、全ての例において、培養８日の毛包原基に毛幹様構造が形成されていた。
また、培養８日目における毛幹様構造の形成率は、例８－１、例８－２及び例８－３で１００％（６個の毛包原基のうち６個）、例８－４、例８－５、及び例８－６でも１００％（１２個の毛包原基のうち１２個）であった。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例９－１においては、培養液に添加した高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品の濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例４の例４と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．５ｖ／ｖ％の高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品が添加された細胞懸濁液は、６８～７６μｇ／ｍＬのラミニン／エンタクチン複合体（すなわち、それぞれ３４～３８μｇ／ｍＬのラミニン及びエンタクチンを）を含有していたと算出される。
例９－１においては、培養液に添加した高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品の濃度を１ｖ／ｖ％に代えて０．５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例４の例４と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、０．５ｖ／ｖ％の高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品が添加された細胞懸濁液は、６８～７６μｇ／ｍＬのラミニン／エンタクチン複合体（すなわち、それぞれ３４～３８μｇ／ｍＬのラミニン及びエンタクチンを）を含有していたと算出される。
例９－２においては、培養液に添加した高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品の濃度を１ｖ／ｖ％に代えて５．０ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例４の例４と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、５．０ｖ／ｖ％の高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品が添加された細胞懸濁液は、６８４～７６０μｇ／ｍＬのラミニン／エンタクチン複合体（すなわち、それぞれ３４２～３８０μｇ／ｍＬのラミニン及びエンタクチンを）を含有していたと算出される。
例９－３においては、培養液に添加した高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品の濃度を１ｖ／ｖ％に代えて１０．０ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例４の例４と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、５．０ｖ／ｖ％の高濃度ラミニン／エンタクチン複合体製品が添加された細胞懸濁液は、１３６８～１５２０μｇ／ｍＬのラミニン／エンタクチン複合体（すなわち、それぞれ６８４～７６０μｇ／ｍＬのラミニン及びエンタクチンを）を含有していたと算出される。
［結果］
図１６Ａ、図１６Ｂ、及び図１６Ｃには、それぞれ例９－１、例９－２、及び例９－３の共培養において、培養２日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃには、それぞれ例９－１、例９－２、及び例９－３の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１６Ａ～図１６Ｃ、及び図１７Ａ～図１７Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１６Ａ、図１６Ｂ、及び図１６Ｃには、それぞれ例９－１、例９－２、及び例９－３の共培養において、培養２日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃには、それぞれ例９－１、例９－２、及び例９－３の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１６Ａ～図１６Ｃ、及び図１７Ａ～図１７Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１６Ａ～図１６Ｃ、及び図１７Ａ～図１７Ｃに示すように、全ての例（例９－１～例９－３）において、毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。すなわち、図１７Ａ～図１７Ｃに示すように、全ての例において、培養８日の毛包原基に毛幹様構造が形成されていた。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例Ｃ１－１においては、培養液に添加した高純度ラミニン製品の濃度を１ｖ／ｖ％に代えて５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例４の例４と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、５ｖ／ｖ％の高純度ラミニン製品を含有する細胞懸濁液は、３９～４１μｇ／ｍＬのラミニンを含有していたと算出される。
例Ｃ１－１においては、培養液に添加した高純度ラミニン製品の濃度を１ｖ／ｖ％に代えて５ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例４の例４と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、５ｖ／ｖ％の高純度ラミニン製品を含有する細胞懸濁液は、３９～４１μｇ／ｍＬのラミニンを含有していたと算出される。
例Ｃ１－２においては、培養液に添加した高純度ラミニン製品の濃度を１ｖ／ｖ％に代えて１０ｖ／ｖ％としたこと以外は上記実施例４の例４と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。なお、１０ｖ／ｖ％の高純度ラミニン製品を含有する細胞懸濁液は、７８～８２μｇ／ｍＬのラミニンを含有していたと算出される。
［結果］
図１８Ａ、図１８Ｂ、及び図１８Ｃには、例Ｃ１－１の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆには、例Ｃ１－２の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１８Ａ～図１８Ｆにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１８Ａ、図１８Ｂ、及び図１８Ｃには、例Ｃ１－１の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆには、例Ｃ１－２の共培養において、それぞれ培養１日目、培養３日目、及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１８Ａ～図１８Ｆにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１８Ａ～図１８Ｆに示すように、例Ｃ１－１及び例Ｃ１－２のいずれにおいても、毛幹様構造を有する毛包原基は形成されなかった。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例Ｃ２においては、予めＩＶ型コラーゲンをコーティングした培養ディッシュ表面上で、ＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず上記実施例５の例５－３で用いたＩＶ型コラーゲン製品を、その取扱説明書におけるコーティング方法に関する記載に従い、０．０５Ｍ ＨＣｌ溶液で１００μｇ／ｍＬの濃度に希釈してコーティング液を調製した。次いで、このコーティング液１ｍＬを、３５ｍｍ径の培養ディッシュに添加し、室温で１時間保持した。その後、培養ディッシュからコーティング液を捨て、当該培養ディッシュ表面を精製水で洗浄した。
例Ｃ２においては、予めＩＶ型コラーゲンをコーティングした培養ディッシュ表面上で、ＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず上記実施例５の例５－３で用いたＩＶ型コラーゲン製品を、その取扱説明書におけるコーティング方法に関する記載に従い、０．０５Ｍ ＨＣｌ溶液で１００μｇ／ｍＬの濃度に希釈してコーティング液を調製した。次いで、このコーティング液１ｍＬを、３５ｍｍ径の培養ディッシュに添加し、室温で１時間保持した。その後、培養ディッシュからコーティング液を捨て、当該培養ディッシュ表面を精製水で洗浄した。
一方、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
上記細胞懸濁液を、上述のようにして予めＩＶ型コラーゲンをコーティングした培養ディッシュに２ｍＬずつ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種し、共培養を開始した。
［結果］
図１９Ａ、及び図１９Ｂには、例Ｃ２の共培養において、それぞれ培養２日目、及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１９Ａ及び図１９Ｂにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１９Ａ、及び図１９Ｂには、例Ｃ２の共培養において、それぞれ培養２日目、及び培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図１９Ａ及び図１９Ｂにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図１９Ａ及び図１９Ｂに示すように、ＩＶ型コラーゲンのコーティング処理を施した培養ディッシュ表面上で、ＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行っても、毛幹様構造を有する毛包原基は形成されなかった。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例Ｃ３－１においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含むゲル上で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例Ｃ３－１においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含むゲル上で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
すなわち、まず上記実施例１の例１－１で用いたマトリゲル製品を９６ウェル平底培養プレートの各ウェルの底面に５０μＬ滴下し、３７℃にて１５分間インキュベートすることでゲル化させた。その後、各ウェルのゲル上に、マトリゲル製品を含まない培養液に懸濁した上皮系細胞及び間葉系細胞を播種し、当該ゲル上で共培養を行った。
例Ｃ３－２においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含むゲル内で、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
すなわち、まずマトリゲル製品と、上皮系細胞及び間葉系細胞とを混合し、得られた細胞懸濁液を、９６ウェル平底培養プレートの各ウェルの底面に５０μＬ滴下し、３７℃にて１５分間インキュベートすることでゲル化させた。その後、各ウェルの、分散された上皮系細胞及び間葉系細胞が包埋されたゲル上に、マトリゲル製品を含まない培養液を注ぎ、当該ゲル内で共培養を行った。
例Ｃ３－３においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養して形成された毛包原基を、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含むゲル上で、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中、培養した。
すなわち、まず、上記実施例１の例１－２と同様にして、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を３日間行い、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を含む毛包原基を形成した。
一方、上記例Ｃ３－１と同様にして、マトリゲルのゲルを形成した。そして、上述のようにして形成した毛包原基を、マトリゲルが添加されていない培養液中、上述のようにして形成したゲル上に播種し、当該ゲル上で当該毛包原基を９日間培養した。
例Ｃ３－４においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養して形成された毛包原基を、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含むゲル内で培養した。
すなわち、まず、上記実施例１の例１－２と同様にして、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液中で、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を３日間行い、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を含む毛包原基を形成した。そして、上記例Ｃ３－２と同様にして、毛包原基をマトリゲルのゲル内に包埋し、当該ゲル内で当該毛包原基を９日間培養した。
［結果］
図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、及び図２０Ｄには、それぞれ例Ｃ３－１、例Ｃ３－２、例Ｃ３－３、及び例Ｃ３－４において、培養１２日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図２０Ａ～図２０Ｄにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、及び図２０Ｄには、それぞれ例Ｃ３－１、例Ｃ３－２、例Ｃ３－３、及び例Ｃ３－４において、培養１２日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図２０Ａ～図２０Ｄにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
図２０Ａ～図２０Ｄに示すように、例Ｃ３－１～例Ｃ３－４のいずれにおいても、毛幹様構造を有する毛包原基は形成されなかった。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。
［培養］
例１０においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
例１０においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
次いで、この培養液に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなる量（総細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなる量）の上皮系細胞及び間葉系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量のマトリゲルを添加することにより、細胞懸濁液を調製した。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μＬ入れることで、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置した。この静置により、冷蔵庫内で、冷却された培養液中、上皮系細胞及び間葉系細胞がウェルの底面上に、互いに接触可能な状態で沈降した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。共培養は、６日間行った。
共培養において、培養液の交換は、２日に１回行った。培養液の交換は、まず各ウェルから、１００μＬの培養液を除去し、次いで、新たな培養液として、マトリゲルを含まず、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を各ウェルに１００μＬ添加することにより行った。
［毛包原基の移植］
６日間の共培養により形成された毛包原基を位相差顕微鏡下で観察し、各毛包原基に毛幹様構造が形成されているかどうかを確認した。そして、毛幹様構造が形成されている毛包原基のみを選択的に回収し、小動物用イソフルラン麻酔器（バイオリサーチセンター株式会社）を用いた麻酔下、５週齢のＩＣＲヌードマウス（オリエンタル酵母工業株式会社）の皮下に移植した。すなわち、ヌードマウスの背部にオフサルミックＶランス（２０Ｇ、日本アルコン株式会社）を用いて移植穴を形成し、ピペットを用いて、各々が毛幹様構造を有する２１個の毛包原基を当該移植穴に挿入した。
６日間の共培養により形成された毛包原基を位相差顕微鏡下で観察し、各毛包原基に毛幹様構造が形成されているかどうかを確認した。そして、毛幹様構造が形成されている毛包原基のみを選択的に回収し、小動物用イソフルラン麻酔器（バイオリサーチセンター株式会社）を用いた麻酔下、５週齢のＩＣＲヌードマウス（オリエンタル酵母工業株式会社）の皮下に移植した。すなわち、ヌードマウスの背部にオフサルミックＶランス（２０Ｇ、日本アルコン株式会社）を用いて移植穴を形成し、ピペットを用いて、各々が毛幹様構造を有する２１個の毛包原基を当該移植穴に挿入した。
［結果］
図２１には、移植後２２日目におけるヌードマウスの背部の写真の一例を示す。図２１に示すように、ヌードマウスの背部の毛包原基が移植された部位に毛髪が形成された。具体的に、移植した２１個の毛包原基のうち、１８個から毛髪の形成が確認された。すなわち、移植した毛包原基の総数に対する、移植したヌードマウス背部で毛髪を形成した毛包原基の数の割合（毛髪再生効率）は８５．７％（＝１８／２１×１００）であった。なお、この毛髪再生効率は、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液を用いて形成された、毛幹様構造を有しない毛包原基を移植した場合（結果は図示せず）に比べて高かった。このように、上述の共培養により製造された毛包原基を生体に移植することにより毛髪が高効率に再生することが確認された。
図２１には、移植後２２日目におけるヌードマウスの背部の写真の一例を示す。図２１に示すように、ヌードマウスの背部の毛包原基が移植された部位に毛髪が形成された。具体的に、移植した２１個の毛包原基のうち、１８個から毛髪の形成が確認された。すなわち、移植した毛包原基の総数に対する、移植したヌードマウス背部で毛髪を形成した毛包原基の数の割合（毛髪再生効率）は８５．７％（＝１８／２１×１００）であった。なお、この毛髪再生効率は、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含まない培養液を用いて形成された、毛幹様構造を有しない毛包原基を移植した場合（結果は図示せず）に比べて高かった。このように、上述の共培養により製造された毛包原基を生体に移植することにより毛髪が高効率に再生することが確認された。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。ただし、まず間葉系細胞のみを播種する日に第一のマウス個体から間葉系細胞を採取し、次いで、当該間葉系細胞の１日培養後、上皮系細胞をさらに播種する日に、当該第一の個体とは異なる第二のマウス固体から上皮系細胞を採取した。
上記実施例１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞を調製した。ただし、まず間葉系細胞のみを播種する日に第一のマウス個体から間葉系細胞を採取し、次いで、当該間葉系細胞の１日培養後、上皮系細胞をさらに播種する日に、当該第一の個体とは異なる第二のマウス固体から上皮系細胞を採取した。
［培養］
例１１においては、まずラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて間葉系細胞のみの培養を開始し、次いで、上皮系細胞を添加し、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
例１１においては、まずラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて間葉系細胞のみの培養を開始し、次いで、上皮系細胞を添加し、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。この培養液に、細胞密度が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量の間葉系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量のマトリゲルを添加することにより、当該間葉系細胞の細胞懸濁液を調製した。
間葉系細胞の細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ入れることで、間葉系細胞を播種した（間葉系細胞の細胞密度：５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置し、間葉系細胞をウェルの底面上に沈降させた。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で間葉系細胞を開始した。間葉系細胞の培養は、１日間行った。
間葉系細胞の培養開始から１日後、培養液（１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、細胞密度が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量の上皮系細胞を懸濁し、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量のマトリゲルを添加することにより、当該上皮系細胞の懸濁液を調製した。
一方、上述のようにして１日間培養した間葉系細胞を含む９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置した。その後、間葉系細胞を含む各ウェルに、上皮系細胞の懸濁液を１００μＬ入れることで、上皮系細胞を播種した（上皮系細胞の細胞密度：５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）。
上皮系細胞の播種後、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を含む９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。共培養は、１４日間行った。すなわち、間葉系細胞を含む各ウェルに上皮系細胞を播種した日から１４日間、当該上皮系細胞と間葉系細胞との共培養を行った。培養液の交換は、上記例１０と同様に行った。
［結果］
図２２Ａ及び図２２Ｂには、例１１の共培養において、それぞれ共培養の開始から３日目及び１４日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図２２Ａ及び図２２Ｂにおいてスケールバーは２００μｍを示す。
図２２Ａ及び図２２Ｂには、例１１の共培養において、それぞれ共培養の開始から３日目及び１４日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。図２２Ａ及び図２２Ｂにおいてスケールバーは２００μｍを示す。
図２２Ａに示すように、培養３日目に形成されていた毛包原基のうち多くは、間葉系細胞が凝集して形成された間葉系細胞凝集体と、上皮系細胞が凝集して形成され、当該間葉系細胞凝集体と直列的に連結された上皮系細胞凝集体とを含んでいた。また、図２２Ｂに示すように、培養１４日目には、１つの毛包原基から１本の長い毛幹様構造が形成されている様子も確認された。
図２３には、共培養中に毛包原基において形成された毛幹様構造の長さを測定した結果を示す。図２３において、横軸は共培養の日数を示し、縦軸は毛包原基において形成されていた毛幹様構造の長さを示す。
図２３に示すように、共培養の開始から４日が経過した後に毛幹様構造が観察され始め、その後、培養時間が経過するにつれて、当該毛幹様構造は成長し、長くなっていった。
図２４Ａには、培養１４日目の毛包原基において形成された毛幹様構造の断面を透過型顕微鏡で観察して得られた写真を示す。図２４Ａにおいてスケールバーは５μｍを示す。図２４Ｂには、図２４Ａに示す白い線で囲まれた四角の領域を拡大して示す。図２４Ｂにおいてスケールバーは２μｍを示す。図２４Ｃには、図２４Ｂに示す白い線で囲まれた四角の領域を拡大して示す。図２４Ｃにおいてスケールバーは５００ｎｍを示す。図２４Ｄには、図２４Ｃに示す白い線で囲まれた四角の領域を拡大して示す。図２４Ｄにおいてスケールバーは２００ｎｍを示す。
図２４Ａ～図２４Ｄに示すように、毛包原基において形成された毛幹様構造は、メラニンやコルテックスといった、生体の毛髪に類似した構造を有していることが確認された。
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
胎齢１８日のＢｕｌｂ／ｃマウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法（Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communications, 3, 784, 2012）を一部改変して、ディスパーゼ処理を４℃で１時間、３０ｒｐｍ震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。また、間葉層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施すことで間葉系細胞を単離した。
胎齢１８日のＢｕｌｂ／ｃマウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法（Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communications, 3, 784, 2012）を一部改変して、ディスパーゼ処理を４℃で１時間、３０ｒｐｍ震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。また、間葉層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施すことで間葉系細胞を単離した。
［培養］
例１２－１においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて、上皮系細胞、間葉系細胞及びメラノサイトの共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
例１２－１においては、ラミニン、エンタクチン及びＩＶ型コラーゲンを含む培養液を用いて、上皮系細胞、間葉系細胞及びメラノサイトの共培養を行った。まず培養液として、１％ＧｕｌｔａＭａｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２％Ｎｏｒｍоｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
次いで、この培養液に、それぞれの細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなる量の上皮系細胞及び間葉系細胞と、細胞密度が１．２５×１０３ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなる量のメラノサイト（正常ヒト（黒人）表皮メラノサイト）とを懸濁し（総細胞密度：１．１２５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬ）、さらに、濃度が１ｖ／ｖ％となる量のマトリゲルを添加することにより、細胞懸濁液を調製した。
上記細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μＬ入れることで、上皮系細胞、間葉系細胞及びメラノサイトを播種した。播種後、直ちに９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して２０分間静置した。この静置により、上皮系細胞、間葉系細胞及びメラノサイトがウェルの底面上に、互いに接触可能な状態で沈降した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに移し、当該インキュベータ内で上皮系細胞、間葉系細胞及びメラノサイトの共培養を開始した。共培養は、８日間行った。培養液の交換は、上記例１０と同様に行った。
例１２－２においては、細胞密度が２．５×１０３ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなる量のメラノサイト（総細胞密度：１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬ）を用いた以外は上述の例１２－１と同様にして、上皮系細胞、間葉系細胞及びメラノサイトの共培養を行った。
例１２－３においては、細胞密度が５×１０３ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなる量のメラノサイト（総細胞密度：１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬ）を用いた以外は上述の例１２－１と同様にして、上皮系細胞、間葉系細胞及びメラノサイトの共培養を行った。
例１２－Ｃ１においては、メラノサイトを用いなかった（総細胞密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬ）以外は上述の例１２－１と同様にして、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を行った。
すなわち、３種の細胞の播種数の比率（上皮系細胞：間葉系細胞：メラノサイト）は、例１２－Ｃ１において「１：１：０」、例１２－１において「４：４：１」、例１２－２において「２：２：１」、及び例１２－３において「１：１：１」であった。
［結果］
図２５Ａ、図２５Ｂ、図２５Ｃ、及び図２５Ｄには、それぞれ例１２－Ｃ１、例１２－１、例１２－２、及び例１２－３の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。
図２５Ａ、図２５Ｂ、図２５Ｃ、及び図２５Ｄには、それぞれ例１２－Ｃ１、例１２－１、例１２－２、及び例１２－３の共培養において、培養８日目に撮影された位相差顕微鏡写真を示す。
図２５Ａに示すように、白い毛を有するＢｕｌｂ／ｃマウス由来の上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養により、白色の毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。これに対し、図２５Ｂ～図２５Ｄに示すように、例１２－１～例１２－３の全てにおいて、白い毛を有するＢｕｌｂ／ｃマウス由来の上皮系細胞及び間葉系細胞に、さらにメラノサイトを加えた共培養により、黒色の毛幹様構造を有する毛包原基が形成された。
Claims (8)
- 上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること；、
（ａ）総濃度１μｇ／ｍＬ以上のラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）濃度１μｇ／ｍＬ以上のＩＶ型コラーゲンが分散された流動性を有する培養液中、３０℃以上、４５℃以下の温度で３０分以上、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持すること；及び、
培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞の共培養を行うことにより、毛包原基を形成すること、
を含む、毛包原基の製造方法。 - 前記（ａ）ラミニン及びエンタクチンが分散された培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持する、請求項１に記載の毛包原基の製造方法。
- 前記（ｂ）ＩＶ型コラーゲンが分散された培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持する、請求項１又は２に記載の毛包原基の製造方法。
- 培養液中で、播種された前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を、培養基材上に沈降させることを含み、
前記培養基材上に沈降した前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を、前記（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中で保持する、請求項１乃至３のいずれかに記載の毛包原基の製造方法。 - 前記（ａ）及び／又は（ｂ）が分散された培養液中における前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞の保持後、前記（ａ）及び／又は（ｂ）の濃度が前記保持時の濃度より小さい培養液中で、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞の共培養を行うことを含む、請求項１乃至４のいずれかに記載の毛包原基の製造方法。
- 前記共培養を行うことにより、毛幹様構造を有する前記毛包原基を形成する、請求項１乃至５のいずれかに記載の毛包原基の製造方法。
- 上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること、及び前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を共培養して毛包原基を形成することを含む細胞培養において、
（ａ）総濃度１μｇ／ｍＬ以上のラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）濃度１μｇ／ｍＬ以上のＩＶ型コラーゲンが分散された流動性を有する培養液中、３０℃以上、４５℃以下の温度で３０分以上、前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を保持することにより、前記毛包原基における毛幹様構造の形成を促進する方法。 - 上皮系細胞及び間葉系細胞を播種すること、及び前記上皮系細胞及び前記間葉系細胞を共培養して毛包原基を形成することを含む細胞培養において、
流動性を有する培養液中に分散された（ａ）総濃度１μｇ／ｍＬ以上のラミニン及びエンタクチン、及び／又は（ｂ）濃度１μｇ／ｍＬ以上のＩＶ型コラーゲンを、前記毛包原基における毛幹様構造の形成を促進するために使用する方法。
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