CN113785047A - 毛囊原基及其制造方法 - Google Patents

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CN113785047A CN201980096118.XA CN201980096118A CN113785047A CN 113785047 A CN113785047 A CN 113785047A CN 201980096118 A CN201980096118 A CN 201980096118A CN 113785047 A CN113785047 A CN 113785047A
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福田淳二
景山达斗
清水亮启
中岛陆满
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Kanagawa Academy of Science and Technology
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Abstract

本发明提供一种能够简便且在短期内在体外形成毛干状结构的毛囊原基。毛囊原基的制造方法包含通过下述步骤来形成毛囊原基：接种上皮细胞和间充质细胞；在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞；以及在培养液中进行所述上皮细胞和所述间充质细胞的共培养。

Description

毛囊原基及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种毛囊原基及其制造方法。
背景技术
非专利文献1中记载了通过将由小鼠的胎儿成纤维细胞制作的人工多能干细胞(iPSCs)接种于96孔板进行培养，从而在体外(in vitro)形成皮肤组织体(skinorganoids)。
专利文献1中记载了一种再生毛囊原基的集合体的制造方法，其特征在于，具备下述工序：通过在由规则配置的微小凹部构成的微凹版上接种间充质细胞和上皮细胞，一边供给氧一边进行混合培养，从而形成毛囊原基。
专利文献2中记载了一种制造具有皮肤附属器官的全层皮肤的方法，其特征在于，所述“具有皮肤附属器官的全层皮肤”至少包含下述(1)～(3)：(1)包含表皮层和真皮层的皮肤、(2)至少1种皮肤附属器官、和(3)皮下组织；所述方法包含下述步骤：(a)用能够使Wnt路径活化的生理活性物质刺激胚状体的步骤，(b)：制备包含下述(A)和(B)的结合体的步骤，(A)在步骤(a)中进行了刺激的该胚状体的全部或一部分、(B)支架材料，(c)：将在该步骤(b)中制备的该结合体移植到动物的步骤，以及(d)：在该动物中制造来源于所述结合体的全层皮肤的步骤。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2017/073625号
专利文献2：国际公开第2016/039279号
非专利文献
非专利文献1：Jiyoon Lee et al.(2018).Hair Follicle Development inMouse Pluripotent Stem Cell-Derived Skin Organoids.Cell Reports 22,242-254
发明内容
发明所要解决的课题
然而，非专利文献1中记载的方法由于使用人工多能干细胞，因此操作繁杂，并且需要比较长的培养期间。
本发明是鉴于上述课题而完成的，其目的之一在于提供一种能够简便且在短期内在体外(in vitro)形成毛干状结构的毛囊原基。
用于解决课题的手段
用于解决上述课题的本发明的一个实施方式的方法的一个方面涉及一种毛囊原基的制造方法，其包含通过下述步骤来形成毛囊原基：接种上皮细胞和间充质细胞；在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞；以及在培养液中进行所述上皮细胞和所述间充质细胞的共培养。根据本发明，提供一种制造能够简便且在短期内在体外(in vitro)形成毛干状结构的毛囊原基的方法。
在所述方法中，也可以在分散有所述(a)层粘连蛋白和巢蛋白的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞。在所述方法中，也可以在分散有所述(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞。
所述方法也可以包含在培养液中使所接种的所述上皮细胞和所述间充质细胞沉降到培养基材上的步骤，并且，在分散有所述(a)和/或(b)的培养液中，保持沉降到所述培养基材上的所述上皮细胞和所述间充质细胞。所述方法也可以包含下述步骤：在分散有所述(a)和/或(b)的培养液中的所述上皮细胞和所述间充质细胞的保持后，在所述(a)和/或(b)的浓度比所述保持时的浓度小的培养液中，进行所述上皮细胞和所述间充质细胞的共培养。在所述方法中，也可以通过进行所述共培养，形成具有毛干状结构的所述毛囊原基。
用于解决上述课题的本发明的一个实施方式的方法的另一方面涉及一种促进毛囊原基中的毛干状结构形成的方法，其通过在包含接种上皮细胞和间充质细胞、以及将所述上皮细胞和所述间充质细胞共培养而形成所述毛囊原基的细胞培养时，在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞，从而促进所述毛囊原基中的毛干状结构形成。根据本发明，提供简便且在短期内在体外(invitro)促进毛囊原基中的毛干状结构形成的方法。
用于解决上述课题的本发明的一个实施方式的方法的又一方面涉及一种促进毛囊原基中的毛干状结构形成的方法，其在包含接种上皮细胞和间充质细胞、以及将所述上皮细胞和所述间充质细胞共培养而形成毛囊原基的细胞培养时，将(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原用于促进所述毛囊原基中的毛干状结构形成。根据本发明，提供为了简便且在短期内在体外(in vitro)促进毛囊原基中的毛干状结构形成而使用(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的方法。
用于解决上述课题的本发明的一个实施方式的毛囊原基是包含上皮细胞和间充质细胞的毛囊原基，其具有毛干状结构、不包含立毛肌结构和/或皮脂腺结构且没有移植到生物体。根据本发明，提供简便且在短期内在体外(invitro)形成的具有毛干状结构的毛囊原基。
发明效果
根据本发明，提供一种能够简便且在短期内在体外(in vitro)形成毛干状结构的毛囊原基及其制造方法。
附图说明
图1A是表示在本实施方式的例1-1中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图1B是表示在本实施方式的例1-1中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图1C是表示在本实施方式的例1-1中在培养第6天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图1D是表示在本实施方式的例1-2中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图1E是表示在本实施方式的例1-2中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图1F是表示在本实施方式的例1-2中在培养第6天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图2A是表示在本实施方式的例1-1中在培养第4天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图2B是表示在本实施方式的例1-1中在培养第5天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图2C是表示在本实施方式的例1-1中在培养第6天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图3是表示在本实施方式的例1-1中在培养第12天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4A是表示在本实施方式的例2-1中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4B是表示在本实施方式的例2-1中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4C是表示在本实施方式的例2-1中在培养第7天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4D是表示在本实施方式的例2-2中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4E是表示在本实施方式的例2-2中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4F是表示在本实施方式的例2-2中在培养第7天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4G是表示在本实施方式的例2-3中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4H是表示在本实施方式的例2-3中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图4I是表示在本实施方式的例2-3中在培养第7天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5A是表示在本实施方式的例3-1中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5B是表示在本实施方式的例3-2中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5C是表示在本实施方式的例3-3中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5D是表示在本实施方式的例3-4中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5E是表示在本实施方式的例3-5中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5F是表示在本实施方式的例3-6中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5G是表示在本实施方式的例3-7中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图5H是表示在本实施方式的例3-8中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6A是表示在本实施方式的例3-1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6B是表示在本实施方式的例3-2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6C是表示在本实施方式的例3-3中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6D是表示在本实施方式的例3-4中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6E是表示在本实施方式的例3-5中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6F是表示在本实施方式的例3-6中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6G是表示在本实施方式的例3-7中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图6H是表示在本实施方式的例3-8中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图7A是表示在本实施方式的例4中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图7B是表示在本实施方式的例4中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图7C是表示在本实施方式的例4中在培养第7天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图8A是表示在本实施方式的例5-1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图8B是表示在本实施方式的例5-2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图8C是表示在本实施方式的例5-3中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图9A是表示在本实施方式的例6中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图9B是表示在本实施方式的例6中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图10A是表示在本实施方式的例7-1中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图10B是表示在本实施方式的例7-2中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图10C是表示在本实施方式的例7-3中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图10D是表示在本实施方式的例7-4中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图10E是表示在本实施方式的例7-5中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图10F是表示在本实施方式的例7-6中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图11A是表示在本实施方式的例7-1中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图11B是表示在本实施方式的例7-2中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图11C是表示在本实施方式的例7-3中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图11D是表示在本实施方式的例7-4中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图11E是表示在本实施方式的例7-5中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图11F是表示在本实施方式的例7-6中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图12A是表示在本实施方式的例7-1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图12B是表示在本实施方式的例7-2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图12C是表示在本实施方式的例7-3中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图12D是表示在本实施方式的例7-4中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图12E是表示在本实施方式的例7-5中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图12F是表示在本实施方式的例7-6中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图13A是表示在本实施方式的例8-1中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图13B是表示在本实施方式的例8-2中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图13C是表示在本实施方式的例8-3中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图13D是表示在本实施方式的例8-4中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图13E是表示在本实施方式的例8-5中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图13F是表示在本实施方式的例8-6中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图14A是表示在本实施方式的例8-1中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图14B是表示在本实施方式的例8-2中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图14C是表示在本实施方式的例8-3中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图14D是表示在本实施方式的例8-4中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图14E是表示在本实施方式的例8-5中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图14F是表示在本实施方式的例8-6中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图15A是表示在本实施方式的例8-1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图15B是表示在本实施方式的例8-2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图15C是表示在本实施方式的例8-3中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图15D是表示在本实施方式的例8-4中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图15E是表示在本实施方式的例8-5中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图15F是表示在本实施方式的例8-6中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图16A是表示在本实施方式的例9-1中在培养第2天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图16B是表示在本实施方式的例9-2中在培养第2天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图16C是表示在本实施方式的例9-3中在培养第2天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图17A是表示在本实施方式的例9-1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图17B是表示在本实施方式的例9-2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图17C是表示在本实施方式的例9-3中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图18A是表示在本实施方式的例C1-1中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图18B是表示在本实施方式的例C1-1中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图18C是表示在本实施方式的例C1-1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图18D是表示在本实施方式的例C1-2中在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图18E是表示在本实施方式的例C1-2中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图18F是表示在本实施方式的例C1-2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图19A是表示在本实施方式的例C2中在培养第2天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图19B是表示在本实施方式的例C2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图20A是表示在本实施方式的例C3-1中在培养第12天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图20B是表示在本实施方式的例C3-2中在培养第12天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图20C是表示在本实施方式的例C3-3中在培养第12天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图20D是表示在本实施方式的例C3-4中在培养第12天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图21是表示本实施方式的例10中从移植于裸鼠背部的毛囊原基再生了毛发的情形的一例的说明图。
图22A是表示在本实施方式的例11中在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图22B是表示在本实施方式的例11中在培养第14天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图23是表示在本实施方式的例11中测量在共培养中在毛囊原基形成的毛干状结构的长度的结果的一例的说明图。
图24A是表示在本实施方式的例11中拍摄在培养第14天的毛囊原基中形成的毛干状结构的截面而得到的透射型显微镜照片的一例的说明图。
图24B是放大显示图24A所示的用白线围住的四边区域的说明图。
图24C是放大显示图24B所示的用白线围住的四边区域的说明图。
图24D是放大显示图24C所示的用白线围住的四边区域的说明图。
图25A是表示在本实施方式的例12-C1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图25B是表示在本实施方式的例12-1中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图25C是表示在本实施方式的例12-2中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
图25D是表示在本实施方式的例12-3中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片的一例的说明图。
具体实施方式
以下，对本发明的一个实施方式进行说明。需要说明的是，本发明不限于本实施方式。
本实施方式的方法(以下，称为“本方法”)作为其一个方面，包含一种毛囊原基的制造方法，其包含通过下述步骤来形成毛囊原基：接种上皮细胞和间充质细胞；在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和间充质细胞；以及在培养液中进行所述上皮细胞和间充质细胞的共培养。
即，本发明的发明者们对在体外(in vitro)制造毛囊原基的技术手段反复进行了深入研究，结果意外地发现，通过在培养液中使上皮细胞和间充质细胞与分散于该培养液中的(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原接触，能够简便且在短时间内制造能够在体外形成毛干状结构的毛囊原基，从而完成了本发明。
因此，本方法作为另一个方面，包含如下方法：通过在包含接种上皮细胞和间充质细胞、以及将该上皮细胞和间充质细胞共培养而形成毛囊原基的细胞培养时，在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和间充质细胞，从而促进所述毛囊原基中的毛干状结构形成。
另外，本方法作为又一方面，包含如下方法：在包含接种上皮细胞和间充质细胞、以及将该上皮细胞和间充质细胞共培养而形成毛囊原基的细胞培养时，将(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原用于促进所述毛囊原基中的毛干状结构形成。
即，本实施方式包含(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原作为用于促进毛囊原基中的毛干状结构形成的培养液添加剂(更具体而言，分散于培养液中的成分)的用途。
本方法中使用的上皮细胞只要是通过与间充质细胞共培养而形成毛囊原基的上皮细胞即可，没有特别限定，例如优选为选自毛囊组织来源的上皮细胞、皮肤组织来源的上皮细胞、以及在培养体系中由干细胞诱导的毛囊上皮细胞中的1种以上。
毛囊组织来源的上皮细胞例如可以为选自毛囊组织的凸出区域来源的上皮细胞(例如外毛根鞘最外层细胞)、以及毛囊组织的毛母质部来源的上皮细胞中的1种以上。皮肤组织来源的上皮细胞可以是例如选自表皮角化细胞和形成阶段的皮肤上皮细胞中的1种以上。在培养体系中由干细胞诱导的毛囊上皮细胞可以是例如由iPS(induced PluripotentStem，诱导的多能干)细胞、ES(Embryonic Stem，胚胎干)细胞或EG(Embryonic Germ，胚胎生殖)细胞诱导的毛囊上皮细胞。上皮细胞可以是上皮干细胞。
上皮细胞例如表达生发相关基因。具体而言，上皮细胞例如被确定为表达细胞角蛋白的细胞。在上皮细胞为上皮干细胞的情况下，该上皮干细胞例如被确定为表达选自细胞角蛋白15和CD34中的1种以上的细胞。上皮细胞可以是从生物体采集的原代细胞，也可以是预先培养的细胞(例如，传代培养的细胞和/或形成了细胞系的细胞)。
本方法中使用的间充质细胞只要是通过与上皮细胞共培养而形成毛囊原基的间充质细胞即可，没有特别限定，例如优选为选自毛囊组织来源的间充质细胞、皮肤组织来源的间充质细胞、以及在培养体系中由干细胞诱导的间充质细胞中的1种以上。
毛囊组织来源的间充质细胞例如可以是选自毛乳头细胞和毛球部毛根鞘细胞中的1种以上。皮肤组织来源的间充质细胞例如可以是选自真皮毛根鞘细胞和形成阶段的皮肤间充质细胞中的1种以上。在培养体系中由干细胞诱导的间充质细胞可以是例如由iPS细胞、ES细胞或EG细胞诱导的毛囊间充质细胞。
间充质细胞例如表达生发相关基因。具体而言，间充质细胞例如被确定为表达选自Versican和ALP(碱性磷酸酶)中的1种以上的细胞。间充质细胞可以是从生物体采集的原代细胞，也可以是预先培养的细胞(例如，传代培养的细胞和/或形成了细胞系的细胞)。
需要说明的是，在本方法中，可以仅进行上皮细胞和间充质细胞的共培养，也可以进行进一步包含其他细胞的共培养。此时，其他细胞只要能够得到本发明的效果就没有特别限定，例如可以为选自色素细胞、色素前体细胞、色素干细胞以及多能干细胞(例如iPS细胞、ES细胞、或Muse(Multilineage-differentiating stress-enduring，多系分化持续应激)细胞)来源的色素干细胞中的1种以上。另外，接种其他细胞的时机只要在形成包含上皮细胞、间充质细胞及所述其他细胞的毛囊原基的范围内，就没有特别限定。
在本方法中，首先，接种上皮细胞和间充质细胞。关于这一点，在上述非专利文献1所记载的方法中，接种了人工多能干细胞。因此，必须进行用于使人工多能干细胞分化的繁杂的操作。与此相对，在本方法中，不需要使用多能干细胞。因此，本方法可以不包含接种多能干细胞的工序。另外，本方法也可以不包含使多能干细胞分化的工序。另外，本方法也可以不包含培养多能干细胞的工序。
上皮细胞和间充质细胞的接种通过将所述上皮细胞和间充质细胞加入培养容器来进行。具体而言，将包含上皮细胞和间充质细胞的培养液(细胞悬浮液)加入培养容器内。另外，由于培养容器包含上皮细胞和间充质细胞所沉降的培养基材(例如，所述培养容器的底部或与配置在所述培养容器内的所述培养容器分体的培养基材)，因此也可以说将所述上皮细胞和间充质细胞接种在所述培养基材上。
在上皮细胞和间充质细胞的接种中，可以同时接种所述上皮细胞和间充质细胞，或者也可以首先接种所述上皮细胞和间充质细胞中的一种细胞，接着接种另一种细胞。即，可以将上皮细胞和间充质细胞中的首先接种的一种细胞在不与另一种细胞接触的条件下接种，接着接种所述另一种细胞，使所述一种细胞与所述另一种细胞接触。在该情况下，优选首先接种间充质细胞，接着接种上皮细胞。
具体而言，例如，首先将包含间充质细胞且不包含上皮细胞的细胞悬浮液加入培养容器(例如96孔板的孔)中，接种该间充质细胞，接着在包含该间充质细胞的培养容器中加入包含上皮细胞的细胞悬浮液，接种该上皮细胞。在该情况下，包含上皮细胞的细胞悬浮液可以不包含间充质细胞。
另外，也可以将上皮细胞和间充质细胞中首先接种的一种细胞接种，接着培养所述一种细胞，然后接种另一种细胞。即，在该情况下，使上皮细胞和间充质细胞中首先接种的一种细胞在不与另一种细胞接触的条件下接种培养，接着接种所述另一种细胞，开始所述一种细胞与另一种细胞的共培养。
在将上皮细胞和间充质细胞中首先接种的一种细胞接种、接着接种另一种细胞的情况下，接种所述一种细胞起到接种所述另一种细胞为止的时间(即，例如从接种所述一种细胞起到开始所述一种细胞与另一种细胞的共培养为止的时间)只要在可得到本发明的效果的范围内就没有特别限定，例如可以为96小时以下，优选为72小时以下，更优选为48小时以下，特别优选为24小时以下。
所接种的上皮细胞和间充质细胞优选分散于培养液中。在该情况下，上皮细胞和间充质细胞在培养液中混合且分散。分散于培养液中的各个细胞未与其他细胞结合，或者即使附着于其他细胞，但通过利用吸量管吹吸等操作使所述培养液流动，可容易地从所述其他细胞分离。需要说明的是，本方法中使用的培养液只要是在可得到本发明的效果的范围内且能够维持上皮细胞和间充质细胞的生存的溶液就没有特别限定。
在将上皮细胞和间充质细胞中首先接种的一种细胞接种、接着接种另一种细胞的情况下，优选首先接种分散于培养液中的所述一种细胞，接着接种分散于培养液中的所述另一种细胞。具体而言，例如，首先将不包含上皮细胞而分散有间充质细胞的细胞悬浮液加入培养容器中，接种该间充质细胞，接着在包含该间充质细胞的培养容器中加入分散有上皮细胞的细胞悬浮液，接种该上皮细胞。
所接种的上皮细胞和间充质细胞的密度只要是在其后的共培养中能够形成毛囊原基的范围内就没有特别限定，例如优选为在培养容器内(特别是在沉降到培养基材上的状态下)，各个细胞能够与邻接的细胞接触的程度的密度。
在本方法中，通过在培养液中对所接种的上皮细胞和间充质细胞进行共培养，形成包含所述上皮细胞和间充质细胞的毛囊原基。即，通过在培养液中对上皮细胞和间充质细胞进行共培养，随着培养时间的经过，所述上皮细胞和间充质细胞凝聚，形成毛囊原基。
更具体而言，所接种的上皮细胞和间充质细胞在培养液中被混合且以分散的状态保持。之后，随着培养时间的经过，上皮细胞彼此结合的形成、间充质细胞彼此结合的形成、以及上皮细胞与间充质细胞的结合的形成进行。其结果是，上皮细胞凝聚而形成上皮细胞凝聚体，间充质细胞凝聚而形成间充质细胞凝聚体，另外，与所述上皮细胞凝聚体和间质系细胞凝聚体的形成并行地，也形成所述上皮细胞凝聚体与间充质系细胞凝聚体的结合。这样最终形成包含上皮细胞集合体和间充质细胞凝聚体的毛囊原基。
通过将上皮细胞和间充质细胞中首先接种的一种细胞(例如间充质细胞)接种，接着接种另一种细胞(例如上皮细胞)，从而能够高效地形成包含所述一种细胞凝聚而形成的第一细胞凝聚体和所述另一种细胞凝聚而形成的与所述第一细胞凝聚块连结的第二细胞凝聚体的毛囊原基。
在本方法中，为了形成毛囊原基，需要上皮细胞和间充质细胞凝聚，因此用于形成所述毛囊原基的上皮细胞和间充质细胞的共培养在具有流动性的培养液中进行。
毛囊原基是在移植到动物时形成毛发的细胞凝聚体。本方法中制造的毛囊原基可以是毛囊原基球体。毛囊原基球体为大致球状的细胞集合体。
上皮细胞和间充质细胞的数量相对于构成毛囊原基的细胞的总数的比例只要在可得到本发明的效果的范围内就没有特别限定，例如可以为50％以上，也可以为70％以上，也可以为90％以上。
在该情况下，上皮细胞和间充质细胞的数量相对于为了制造毛囊原基而接种的细胞的总数的比例例如可以为50％以上，也可以为70％以上，也可以为90％以上。
同样地，上皮细胞和间充质细胞的数量相对于为了形成毛囊原基而共培养的细胞的总数的比例例如可以为50％以上，也可以为70％以上，也可以为90％以上。
在本方法中，也可以将上皮细胞和间充质细胞在细胞非粘附性的培养基上进行共培养。在该情况下，在共培养中，上皮细胞和间充质细胞不粘附于培养基材地浮游在培养液中，或者以通过利用吸量管吹吸等操作使培养液流动、可容易地从所述培养基材脱离的程度附着于该培养基材。在细胞非粘附性的培养基材上培养的上皮细胞和间充质细胞的形状被维持为大致球形。
通过在细胞非粘附性的培养基材上进行共培养，形成非粘附状态的毛囊原基。非粘附状态的毛囊原基浮游在培养液中，或者以利用吸量管吹吸等操作使培养液流动、可容易地从所述培养基材脱离的程度附着于该培养基材。
对上皮细胞和间充质细胞进行共培养的培养容器只要该上皮细胞和间充质细胞能够形成毛囊原基就没有特别限定，例如优选使用比较小的孔。
即，作为培养容器使用的1个孔的底面的面积例如可以为1000mm2以下，优选为100mm2以下，更优选为50mm2以下，特别优选为20mm2以下。
孔的底面的面积例如可以为100μm2以上，优选为1000μm2以上，更优选为10000μm2以上，特别优选为100000μm2以上。
孔的底面的面积也可以任意组合上述的下限值之一和上述的上限值之一来确定。具体而言，孔的底面的面积例如可以为100μm2以上且1000mm2以下，优选为1000μm2以上且100mm2以下，更优选为10000μm2以上且50mm2以下，特别优选为100000μm2以上且20mm2以下。
在本方法中，也可以通过上皮细胞和间充质细胞的共培养，在各培养容器(例如各孔)内形成1个毛囊原基。即，在该情况下，接种于各培养容器的上皮细胞和间充质细胞在该培养容器内凝聚，形成1个毛囊原基。
并且，在本方法中，在上皮细胞和间充质细胞接种后，在分散有选自(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和(b)IV型胶原中的1种以上的培养液中，保持所述上皮细胞和间充质细胞。
即，例如在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白的培养液中，保持上皮细胞和间充质细胞。在该情况下，层粘连蛋白和巢蛋白优选包含层粘连蛋白与巢蛋白的复合物。
另外，例如在分散有(b)IV型胶原的培养液中，保持上皮细胞和间充质细胞。另外，例如在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和(b)IV型胶原的培养液中，保持上皮细胞和间充质细胞。
包含所分散的(a)和/或(b)的培养液通过将预先制备的包含(a)的组合物和/或预先制备的包含(b)的组合物添加到培养液中来制备。
在本方法中，通过在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持上皮细胞和间充质细胞，在该培养液中使所述上皮细胞和间充质细胞与所述(a)和/或(b)接触。
即，在具有流动性的培养液中，使上皮细胞和间充质细胞与分散在所述培养液中的(a)和/或(b)接触。具体而言，在本方法中，与上皮细胞和间充质细胞接触的(a)和/或(b)是分散在具有流动性的培养液中的(a)和/或(b)，例如不是构成包埋所述上皮细胞和间充质细胞的水凝胶的(a)和/或(b)，在所述上皮细胞和间充质细胞保持于水凝胶的表面的情况下，也不是构成所述水凝胶的(a)和/或(b)，也不是预先固定化于保持有所述上皮细胞和间充质细胞的培养基材的(a)和/或(b)。
本方法可以包含使保持于水凝胶(例如由含有(a)和/或(b)的成分构成的水凝胶、或不包含所述(a)和/或(b)的水凝胶)的表面上的上皮细胞和间充质细胞与分散于培养液中的(a)和/或(b)接触的工序。不过，本方法也可以不包含使保持于由含有(a)和/或(b)的成分构成的水凝胶的表面上的上皮细胞和间充质细胞与分散于培养液中的(a)和/或(b)接触的工序。另外，本方法也可以不包含使保持于不含有(a)和/或(b)的水凝胶的表面上的上皮细胞和间充质细胞与分散于培养液中的(a)和/或(b)接触的工序。另外，本方法也可以不包含使保持于水凝胶的表面上的上皮细胞和间充质细胞与分散于培养液中的(a)和/或(b)接触的工序。
本方法可以包含使保持于固定化有(a)和/或(b)的培养基材上的上皮细胞和间充质细胞与分散于培养液中的(a)和/或(b)接触的工序。不过，本方法也可以不包含使保持于固定化有(a)和/或(b)的培养基材上的上皮细胞和间充质细胞与分散于培养液中的(a)和/或(b)接触的工序。
另外，本方法也可以不包含在形成毛囊原基之前，在由含有(a)和/或(b)的成分构成的水凝胶中包埋上皮细胞和间充质细胞地进行培养的工序。另外，本方法也可以不包含在形成毛囊原基之前，在不含有(a)和/或(b)的水凝胶中包埋上皮细胞和间充质细胞地进行培养的工序。另外，本方法也可以不包含在形成毛囊原基之前，在水凝胶中包埋上皮细胞和间充质细胞地进行培养的工序。
需要说明的是，包含接种中使用的上皮细胞和间充质细胞的细胞悬浮液可以含有(a)和/或(b)，也可以不含有(a)和/或(b)。在接种时的细胞悬浮液不含有(a)和/或(b)的情况下，接种后，通过向培养液中添加所述(a)和/或(b)，使所述上皮细胞和间充质细胞与分散于所述培养液中的(a)和/或(b)接触。
即，在同时接种上皮细胞和间充质细胞的情况下，可以将包含所述上皮细胞和间充质细胞、及(a)和/或(b)的细胞悬浮液加入培养容器中进行接种，或者也可以首先将包含所述上皮细胞和间充质细胞而不含有(a)和/或(b)的细胞悬浮液加入培养容器中进行接种，然后在该培养容器中添加(a)和/或(b)。
另外，在首先接种上皮细胞和间充质细胞中的一种细胞(例如间充质细胞)、接着接种另一种细胞(例如上皮细胞)的情况下，在所述一种细胞和所述另一种细胞各自的接种中，可以将包含所述一种细胞或所述另一种细胞及(a)和/或(b)的细胞悬浮液加入培养容器中进行接种，或者也可以首先将含有所述一种细胞或所述另一种细胞而不含有(a)和/或(b)的细胞悬浮液加入培养容器中进行接种，然后在该培养容器中添加(a)和/或(b)。
保持上皮细胞和间充质细胞的培养液中的(a)层粘连蛋白和巢蛋白的浓度只要在可得到本发明的效果的范围内就没有特别限定，例如可以为1μg/mL以上，优选为3μg/mL以上，特别优选为5μg/mL以上。
另外，上述培养液中的(a)层粘连蛋白和巢蛋白的浓度例如可以为3000μg/mL以下，优选为2500μg/mL以下，特别优选为2000μg/mL以下。
上述培养液中的(a)层粘连蛋白和巢蛋白的浓度可以任意组合上述的下限值中的任一个和上述的上限值中的任一个来确定。即，保持上皮细胞和间充质细胞的培养液中的(a)层粘连蛋白和巢蛋白的浓度例如可以为1μg/mL以上且3000μg/mL以下，优选为3μg/mL以上且2500μg/mL以下，特别优选为5μg/mL以上且2000μg/mL以下。
保持上皮细胞和间充质细胞的培养液中的(b)IV型胶原的浓度只要在可得到本发明的效果的范围内就没有特别限定，例如可以为1μg/mL以上，优选为3μg/mL以上，特别优选为5μg/mL以上。
另外，上述培养液中的(b)IV型胶原的浓度例如可以为1000μg/mL以下，优选为700μg/mL以下，特别优选为400μg/mL以下。
上述培养液中的(b)IV型胶原的浓度可以任意组合上述的下限值中的任一个和上述的上限值中的任一个来确定。即，保持上皮细胞和间充质细胞的培养液中的(b)IV型胶原的浓度例如可以为1μg/mL以上且1000μg/mL以下，优选为3μg/mL以上且700μg/mL以下，特别优选为5μg/mL以上且400μg/mL以下。
本方法中，将(a)和/或(b)分散于培养液的目的并不是为了该培养液的凝胶化，因此培养液中的(a)和/或(b)的浓度可以比通常用于凝胶化的浓度低。即，保持上皮细胞和间充质细胞的培养液中的(a)和/或(b)的浓度可以低于使所述培养液整体凝胶化的浓度。
在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持上皮细胞和间充质细胞的温度只要在可获得本发明的效果的范围内就没有特别限定，例如优选为适于所述上皮细胞和间充质细胞的共培养的温度，具体而言，例如优选为30℃以上且45℃以下的温度，特别优选为35℃以上且40℃以下的温度。
在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持上皮细胞和间充质细胞的时间(在分散有该(a)和/或(b)的培养液中，在适于共培养的温度下保持所述上皮细胞和间充质细胞的时间)只要在可得到本发明的效果的范围内就没有特别限定，例如可以为30分钟以上，优选为40分钟以上，更优选为50分钟以上，特别优选为60分钟以上。
在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持上皮细胞和间充质细胞的时机只要在可得到本发明的效果的范围内就没有特别限定，优选在毛囊原基的形成前开始。
具体而言，在分散有(a)和/或(b)的培养液中的上皮细胞和间充质细胞的保持例如可以在从开始所述上皮细胞和间充质细胞的共培养的时间点(即，将该上皮细胞和间充质细胞开始保持于适于共培养的温度(例如，优选35℃以上且39℃以下，特别优选36℃以上且38℃以下)的时间点)起至经过了28小时之前开始，优选在经过了24小时之前开始，更优选在经过了20小时之前开始，更进一步优选在经过了15小时之前开始，特别优选在经过了10小时之前开始。
即，在同时接种上皮细胞和间充质细胞的情况下，以及在首先接种上皮细胞和间充质细胞中的一种细胞(例如间充质细胞)、接着接种另一种细胞(例如上皮细胞)的情况下的任意情况下，可以在从开始所述上皮细胞和间充质细胞的共培养的时间点起至经过了上述任一个阈值时间之前(从与该共培养开始同时或其之后的该共培养开始起至经过了上述任一个阈值时间之前)，开始在分散有(a)和/或(b)的培养液中的所述上皮细胞和间充质细胞的保持。
另外，在首先接种上皮细胞和间充质细胞中的一种细胞(例如间充质细胞)开始所述一种细胞的培养、接着接种另一种细胞(例如上皮细胞)开始共培养的情况下，可以从所述一种细胞的培养开始的时间点(即，将所述一种细胞开始保持于适于培养的温度(例如，优选35℃以上且39℃以下，特别优选36℃以上且38℃以下)的时间点)起至经过了28小时之前(从与所述一种细胞的培养开始同时或其之后的所述一种细胞的培养开始起至经过了该28小时之前)，开始在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持所述一种细胞。
该情况下，分散有(a)和/或(b)的培养液中的一种细胞(上皮细胞和间充质细胞中首先接种的细胞)的保持例如优选在从所述一种细胞的培养开始的时间点起至经过了24小时之前开始，更优选在经过了18小时之前开始，进一步优选在经过了12小时之前开始，特别优选与所述一种细胞的培养开始同时开始。
本方法还可以包含在培养液中，使所接种的上皮细胞和间充质细胞沉降到培养基材上的工序，在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持沉降到所述培养基材上的所述上皮细胞和间充质细胞。
即，在未添加(a)和/或(b)的培养液中(特别是未添加(a)的培养液中)将上皮细胞和间充质细胞接种于培养基材上的情况下，例如，首先在该培养液中，使所接种的所述上皮细胞和间充质细胞沉降到所述培养基材上，然后在所述培养液中添加所述(a)和/或(b)，在含有经分散的所述(a)和/或(b)的培养液中保持所述上皮细胞和间充质细胞。
另外，在添加有(a)和/或(b)的培养液中(特别是添加有(a)的培养液中)将所述上皮细胞和间充质细胞接种于培养基材上的情况下，例如，首先在比适于共培养的温度低的温度(例如，优选10℃以下(具体而言，例如超过0℃且10℃以下)、更优选7℃以下、特别优选5℃以下)下，使该上皮细胞和间充质细胞沉降到培养基材上，然后在适于该共培养的温度下，在含有经分散的所述(a)和/或(b)的培养液中保持所述上皮细胞和间充质细胞。
使上皮细胞和间充质细胞沉降到培养基材上的方法没有特别限定，例如，通过将包含所述培养基材的培养容器静置，和/或通过对包含所述培养基材的培养容器实施离心处理，能够在该培养容器内的培养液中使所述上皮细胞和间充质细胞沉降到培养基材上。
在本方法中，如上所述，通过在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持上皮细胞和间充质细胞后，在培养液中进行该上皮细胞和间充质细胞的共培养，形成包含所述上皮细胞和间充质细胞的毛囊原基。
在共培养中，可以使用添加有(a)和/或(b)的培养液，也可以使用未添加(a)和/或(b)的培养液。即，本方法可以包含下述工序：在分散有(a)和/或(b)的培养液中的上皮细胞和间充质细胞保持后，在所述(a)和/或(b)的浓度小于所述保持时的浓度的培养液中，进行所述上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在该情况下，在以第一浓度含有经分散的(a)和/或(b)的培养液中保持上皮细胞和间充质细胞，然后在所述(a)和/或(b)的浓度为比所述第一浓度小的第二浓度的培养液中，对该上皮细胞和间充质细胞进行共培养。
第二浓度只要比第一浓度小且在可得到本发明的效果的范围内就没有特别限定，例如可以为第一浓度的5分之1以下，也可以为10分之1以下，也可以为15分之1以下，也可以为20分之1以下，也可以为25分之1以下，或者也可以为30分之1以下。
(a)的第二浓度例如可以小于1μg/mL，也可以小于0.2μg/mL，也可以小于0.1μg/mL。(b)的第二浓度例如可以小于1μg/mL，也可以小于0.2μg/mL，也可以小于0.1μg/mL。
在本方法包含以第二浓度进行共培养的工序的情况下，可以在直至形成毛囊原基为止的共培养期间的整个期间，在所述(a)和/或(b)的浓度为第二浓度的培养液中进行共培养，也可以仅在该共培养期间中的一部分期间，在所述(a)和/或(b)的浓度为第二浓度的培养液中进行共培养。
通过降低在共培养中使用的培养液中的(a)和/或(b)的浓度，例如，能够有效地降低毛囊原基的制造成本，另外也能够通过减少繁杂操作而提高操作性。
在本方法中，通过使分散于培养液中的(a)和/或(b)与上皮细胞和间充质细胞接触，然后对所述上皮细胞和间充质细胞进行共培养，能够在体外简便且在短时间内制造能够形成毛干状结构的毛囊原基。即，通过进一步培养通过本方法制造的毛囊原基，能够在该毛囊原基中形成毛干状结构。
因此，在本方法中，也可以通过在分散有(a)和/或(b)的培养液中保持上皮细胞和间充质细胞后，进行该上皮细胞和间充质细胞的共培养，形成具有毛干状结构的毛囊原基。
即，在该情况下，在上皮细胞和间充质细胞凝聚而形成毛囊原基后，也继续进行上皮细胞和间充质细胞的共培养(该毛囊原基的培养)，直至在该毛囊原基中形成毛干状结构。其结果，能够在体外简便且在短时间内制造具有毛干状结构的毛囊原基。
具体而言，在本方法中，例如可以在从上皮细胞和间充质细胞的共培养开始的时间点起至经过了480小时之前、优选在经过了360小时之前、更优选在经过了240小时之前、特别优选在经过了170小时之前，形成具有毛干状结构的毛囊原基。
毛囊原基所具有的毛干状结构是形成于所述毛囊原基的丝状的结构体。该毛干状结构可以包含角蛋白。另外，毛干状结构也可以含有黑色素。另外，毛干状结构也可以从毛囊原基萌发。另外，毛干状结构也可以具有毛表皮结构。
本毛囊原基所具有的毛干状结构的长度没有特别限定，例如可以为30μm以上，也可以为50μm以上，也可以为100μm以上。
本实施方式的毛囊原基(以下，称为“本毛囊原基”)是包含上皮细胞和间充质细胞的毛囊原基，其是具有毛干状结构、不包含立毛肌结构和/或皮脂腺结构且没有移植到生物体的毛囊原基。本毛囊原基优选通过上述的本方法制造。
本毛囊原基虽然尚未移植到生物体，但具有毛干状结构。关于这一点，以往也可制造在移植到生物体后能够在该生物体中形成毛干状结构的毛囊原基。然而，在移植到生物体之前，难以在生物体外在毛囊原基中形成毛干状结构。
在上述非专利文献1记载的方法中，培养人工多能干细胞而形成的皮肤组织体具有立毛肌结构、皮脂腺结构等复杂的结构。与此相对，本毛囊原基具有比较简单的结构。
即，本毛囊原基不包含上述非专利文献1中记载的立毛肌结构和/或皮脂腺结构。具体而言，本毛囊原基可以不包含立毛肌结构，也可以不包含皮脂腺结构，或者也可以不包含立毛肌结构和皮脂腺结构。
毛囊原基的用途没有特别限定，该毛囊原基例如可以用于向患者移植等的医疗，或者也可以用于与毛发的形成相关的研究。移植毛囊原基的生物体可以是人，也可以是非人动物，但优选是人。毛囊原基向生物体的移植优选为向该生物体的皮肤的移植。
毛囊原基向生物体的移植可以是医学用途，也可以是研究用途。毛囊原基向生物体的移植可以是例如用于治疗或预防伴随脱发的疾病的向患有该疾病或具有患该疾病的可能性的人患者的移植。
伴随脱发的疾病没有特别限定，例如可以为选自雄激素性脱发(AndrogeneticAlopecia：AGA)、女子男性型脱发症(Female Androgenetic Alopecia：FAGA)、分娩后脱发症、肥胖脱发症、脂溢性脱发症、糠皮性脱发症、牵引性脱发症、代谢异常性脱发症、压迫性脱发症、圆形脱发症、神经性脱发症、拔毛癖(Trichotillomania)、全身性脱发症、及症状性脱发症(alopecia symptomatica)中的1种以上。
毛囊原基例如可以用于探索能够用于治疗或预防伴随脱发的疾病的物质、探索与该疾病有关的物质、关于该疾病的机理的研究。
下面，对本实施方式的具体实施例进行说明。
实施例1
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
从胎龄18天的C57BL/6小鼠胎儿采集背部的皮肤组织，对中尾等报告的方法(Koh-ei Toyoshima et al.Nature Communications,3,784,2012)进行部分改变，在4℃下、在30rpm振荡条件下进行分散酶处理1小时，将所述皮肤组织的上皮层与间质层分离。然后，通过对上皮层实施100U/mL的胶原酶处理1小时20分钟，进一步实施胰蛋白酶处理10分钟，分离出上皮细胞。另外，通过对间质层实施100U/mL胶原酶处理1小时20分钟，分离出间充质细胞。
[培养]
在例1-1中，使用含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液，进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。首先，作为培养液，制备含有1％GultaMax Supplement(GIBCO(注册商标))和0.2％Normоcin(InvivoGen)的DMEM/F12培养基(Advanced Dulbecco‘s ModifiedEagle Medium/Ham’sF-12、GIBCO(注册商标))。
接着，在该培养液中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，进一步添加浓度达到1v/v％的量的基质凝胶(Matrigel(注册商标)Basement Membrane Matrix、CORNING(注册商标))，由此制备细胞悬浮液。
所使用的基质凝胶制品含有10.6mg/mL(以Lowry法测定的蛋白的质量)的从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肿瘤中提取的可溶性基底膜基质，该基底膜基质中的组成比率为：层粘连蛋白为56％、巢蛋白为8％、和IV型胶原为31％。
由此，计算出添加有1v/v％的基质凝胶制品的上述细胞悬浮液含有59μg/mL的层粘连蛋白、8μg/mL的巢蛋白和33μg/mL的IV型胶原。
通过将100μL的上述细胞悬浮液加入96孔板(Prime surface(注册商标)、住友Bakelite)的各孔中，接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内静置20分钟。通过该静置，在冰箱内，在冷却后的培养液中，上皮细胞和间充质细胞在能够相互接触的状态下沉降到孔的底面上。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。共培养进行12天。
在共培养中，培养液的更换2天进行1次。培养液的更换如下进行：首先从各孔中除去几乎全部的培养液，接着，作为新的培养液，在各孔中添加100μL的不含基质凝胶、含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
另外，在用于比较的例1-2中，除了在接种时的细胞悬浮液中没有添加基质凝胶(即，仅使用不含基质凝胶的培养液)以外，与上述例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
[结果]
图1A、图1B和图1C表示在例1-1的一个孔内的共培养中分别在培养第1天、培养第3天及培养第6天拍摄的相位差显微镜照片。图1D、图1E和图1F表示在例1-2的一个孔内的共培养中分别在培养第1天、培养第3天及培养第6天拍摄的相位差显微镜照片。图1A～图1F中，标尺条表示100μm。
如图1D～图1F所示，在例1-2中，没有形成具有毛干状结构的毛囊原基。与此相对，如图1A～图1C所示，在例1-1中，形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，如图1C中箭头所指示的那样，在培养第6天的毛囊原基中形成了毛干状结构。
另外，图2A、图2B和图2C表示在例1-1的另一个孔内的共培养体系中分别在培养第4天、培养第5天及培养第6天拍摄的相位差显微镜照片。图2A～图2C中，标尺条表示100μm。如图2A～图2C中箭头所指示的那样，在例1-1中，在培养第4天确认了毛干状结构形成，之后，该毛干状结构随着培养时间的经过而伸长。
另外，评价了培养第10天的毛囊原基中的毛干状结构的形成效率。即，通过将在培养第10天形成有毛干状结构的毛囊原基的数目除以毛囊原基的总数并乘以100，算出毛干状结构的形成率(％)。
其结果，在例1-2中，在96个毛囊原基的全部中，没有确认到毛干状结构形成，毛干状结构的形成率为0(零)％。与此相对，在例1-1中，在96个毛囊原基中有88个毛囊原基中确认到毛干状结构形成，毛干状结构的形成率为92％。
图3表示例1-1中在培养第12天的毛囊原基中形成的毛干状结构的扫描型显微镜照片。在图3中，标尺条表示30μm。如图3所示，毛囊原基中形成的毛干状结构具有作为生物体的毛干的特征性结构即毛表皮(cuticle)结构。
实施例2
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例2-1中，与上述实施例1的例1-1同样地在含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中接种上皮细胞和间充质细胞。即，首先，作为培养液，制备含有1％GultaMaxSupplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
接着，在该培养液中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，进一步添加浓度达到1v/v％的量的基质凝胶，由此制备细胞悬浮液。
通过在96孔板的各孔中加入100μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内并静置20分钟，由此使上皮细胞和间充质细胞在各孔中沉降。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。
培养1天后，在各孔中添加100μL的含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin且不含基质凝胶的DMEM/F12培养基。其结果，各孔的培养液的量达到约200μL。
然后，将培养液2天更换1次。培养液的更换如下进行：首先从各孔中除去100μL的培养液，接着，作为新的培养液，在各孔中添加100μL的不含基质凝胶、含有1％GultaMaxSupplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
例2-2中，在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中接种上皮细胞和间充质细胞，然后，在培养第1天，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中。
即，首先，在含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，制备细胞悬浮液。
接着，将100μL的上述细胞悬浮液加入到96孔板的各孔中，由此接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至37℃的培养箱中，开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在培养1天后(具体而言，从共培养开始(将96孔板移至37℃的培养箱的时间点)起至经过了约22小时的时间点)，在各孔中添加100μL的含有1％GultaMax Supplement、0.2％Normоcin和2v/v％基质凝胶的DMEM/F12培养基。其结果，各孔的培养液的量达到约200μL，该培养液中的基质凝胶浓度达到约1v/v％。
此外，在基质凝胶添加后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内静置20分钟。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内继续进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述例2-1同样地进行。
例2-3中，在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中接种上皮细胞和间充质细胞，然后，在培养第3天，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中。
即，与上述例2-2同样地，通过将100μL的包含上皮细胞和间充质细胞的细胞悬浮液加入到96孔板的各孔中，接种该上皮细胞和间充质细胞，在37℃培养箱内开始共培养。
培养1天后，在各孔中添加100μL的含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。其结果，各孔的培养液的量达到约200μL。
在培养3天后(具体而言，从共培养开始起至经过了约69小时的时间点)，首先从各孔中除去培养液100μL，接着，添加100μL的含有1％GultaMax Supplement、0.2％Normоcin和2v/v％基质凝胶的DMEM/F12培养基。其结果，各孔的培养液中的基质凝胶浓度为约1v/v％。
此外，在基质凝胶添加后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内静置20分钟。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内继续上皮细胞和间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述例2-1同样地进行。
[结果]
图4A、图4B和图4C表示在例2-1的共培养中分别在培养第1天、培养第3天及培养第7天拍摄的相位差显微镜照片。图4D、图4E和图4F表示在例2-2的共培养中分别在培养第1天、培养第3天及培养第7天拍摄的相位差显微镜照片。图4G、图4H和图4I表示在例2-3的共培养中分别在培养第1天、培养第3天及培养第7天拍摄的相位差显微镜照片。在图4A～图4I中，标尺条表示200μm。
如图4A～图4C所示，在例2-1中形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，如图4C中箭头所指示的那样，在培养第7天的毛囊原基中形成了毛干状结构。与此相对，如图4D～图4I所示，在例2-2和例2-3中，在培养第7天的毛囊原基中没有形成毛干状结构。
实施例3
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
例3-1中，首先，在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中接种上皮细胞和间充质细胞，接着，在该接种后(从该接种起0小时后)立即将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中。
即，首先，在含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，制备细胞悬浮液。
接着，通过在96孔板的各孔中加入100μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞和间充质细胞。接着，在刚接种后的各孔中添加100μL的含有1％GultaMax Supplement、0.2％Normоcin和2v/v％基质凝胶的DMEM/F12培养基。其结果，各孔的培养液的量达到200μL，该培养液中的基质凝胶浓度达到1v/v％。
需要说明的是，在即将添加含有基质凝胶的培养液之前的刚接种后，各孔内的上皮细胞和间充质细胞的一部分在孔底面上尚未沉降而浮游在培养液中。
然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述实施例2的例2-1同样地进行。
在例3-2中，首先，在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中接种上皮细胞和间充质细胞，开始共培养，然后，在从该共培养开始起至经过了0.5小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中。
即，在含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞悬浮，制备细胞悬浮液。
通过在96孔板的各孔中加入100μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在从共培养开始起至经过了0.5小时的时间点，在各孔中添加100μL的含有1％GultaMax Supplement、0.2％Normоcin和2v/v％基质凝胶的DMEM/F12培养基。其结果，各孔的培养液的量达到约200μL，该培养液中的基质凝胶浓度达到1v/v％。
需要说明的是，在即将添加包含基质凝胶的培养液之前的从共培养开始起至经过了0.5小时的时间点，各孔内的上皮细胞和间充质细胞已经沉降到孔底面上。
然后，继续进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述实施例2的例2-1同样地进行。
在例3-3中，在从共培养开始起至经过了1小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中，除此以外，与上述例3-2同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在例3-4中，在从共培养开始起至经过了2小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中，除此以外，与上述例3-2同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在例3-5中，在从共培养开始起至经过了3小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中，除此以外，与上述例3-2同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在例3-6中，在从共培养开始起至经过了6小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中，除此以外，与上述例3-2同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在例3-7中，在从共培养开始起至经过了15小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中，除此以外，与上述例3-2同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在例3-8中，在从共培养开始起至经过了22小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中，除此以外，与上述例3-2同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
[结果]
图5A、图5B、图5C、图5D、图5E、图5F、图5G和图5H分别表示在例3-1、例3-2、例3-3、例3-4、例3-5、例3-6、例3-7和例3-8的共培养中，在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片。图6A、图6B、图6C、图6D、图6E、图6F、图6G和图6H分别表示在例3-1、例3-2、例3-3、例3-4、例3-5、例3-6、例3-7和例3-8的共培养中，在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。在图5A～图5H和图6A～图6H中，标尺条表示200μm。
如图5A～图5H和图6A～图6H所示，在从共培养开始起至经过了0小时～22小时的时间点，在将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中的全部的例子(例3-1～例3-8)中，形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，如图6A～图6H所示，在全部的例子中，在培养第8天的毛囊原基中形成了毛干状结构。
另外，毛干状结构的形成率在例3-1中为22％(9个毛囊原基中有2个)，在例3-2中为89％(9个毛囊原基中有8个)，在例3-3中为78％(9个毛囊原基中有7个)，在例3-4中为100％(9个毛囊原基中有9个)，在例3-5中为89％(9个毛囊原基中有8个)，在例3-6中为78％(9个毛囊原基中有7个)，在例3-7中为44％(9个毛囊原基中有4个)，在例3-8中为22％(9个毛囊原基中有2个)。
作为在从共培养开始起至经过了15小时或22小时的时间点添加基质凝胶的例3-7和例3-8的毛干状结构形成效率比在0.5小时～6小时的时间点添加基质凝胶的例3-2～例3-6更小的理由，认为例如在添加该基质凝胶的时间点上皮细胞和间充质细胞的凝聚已经进行了。
另外，作为在共培养刚开始后添加基质凝胶的例3-1的毛干状结构形成效率较小的理由，认为例如在添加该基质凝胶的时间点上皮细胞和间充质细胞的一部分未沉降到孔底面上、还处于浮游状态。
需要说明的是，在上述实施例2的例2-2中，与例3-6同样地，尽管在从共培养开始起至经过了约22小时的时间点，将层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原添加到培养液中，但在培养第6天的毛囊原基中没有确认到毛干状结构形成。作为其原因，认为例如是来自采集细胞的小鼠的个体差异的影响。
实施例4
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例4中，使用含有层粘连蛋白和巢蛋白的培养液，进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。首先，作为培养液，制备含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
接着，在该培养液中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，进一步添加浓度达到1v/v％的量的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物(HIGH CONCENTRATION LAMININ/ENTACTIN COMPLEX、CORNING(注册商标))，由此制备细胞悬浮液。
所使用的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品含有15.2mg/mL的从EHS小鼠肿瘤中提取的可溶性基底膜基质，含有通过SDS-PAGE得到的纯度为90％以上的层粘连蛋白/巢蛋白复合物，层粘连蛋白与巢蛋白以等摩尔比含有。
由此，计算出添加有1v/v％的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品的上述细胞悬浮液含有137～152μg/mL的层粘连蛋白/巢蛋白复合物(即分别含有68～76μg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白)。
即，在例4的细胞悬浮液中，层粘连蛋白的含量为上述实施例1的例1-1的细胞悬浮液中的相应含量的115％～129％，层粘连蛋白和巢蛋白的总含量计算为上述实施例1的例1-1的细胞悬浮液中的相应含量的204～227％。
通过在96孔板的各孔中加入100μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内并静置20分钟，由此在该冰箱内，在冷却后的培养液中，使上皮细胞和间充质细胞沉降到孔的底面上。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述实施例1的例1-1同样地进行。
[结果]
图7A、图7B和图7C表示在例4的共培养中分别在培养第1天、培养第3天及培养第7天拍摄的相位差显微镜照片。在图7A～图7C中，标尺条表示200μm。
如图7A～图7C所示，通过使用含有层粘连蛋白和巢蛋白的培养液，形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，在图7C中，如箭头所指示的那样，在培养第7天的毛囊原基中形成了毛干状结构。
实施例5
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例5-1中，使用含有层粘连蛋白的培养液，进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。即，首先，作为培养液，制备含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
接着，在该培养液中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，进一步添加浓度达到1v/v％的量的高纯度层粘连蛋白(LAMININ-ULTRAPURE，MOUSE、CORNING(注册商标))，由此制备细胞悬浮液。
所使用的高纯度层粘连蛋白制品含有0.82mg/mL的从EHS小鼠肿瘤中提取的可溶性基底膜基质，含有通过SDS-PAGE得到的纯度为95％以上的层粘连蛋白。
由此，计算出添加有1v/v％的高纯度层粘连蛋白制品的上述细胞悬浮液含有约8μg/mL的层粘连蛋白。即，在例5-1的细胞悬浮液中，计算出层粘连蛋白的含量为上述实施例1的例1-1的细胞悬浮液中的相应含量的13％～14％。
通过在96孔板的各孔中加入100μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内并静置20分钟，由此在该冰箱内，在冷却后的培养液中，使上皮细胞和间充质细胞沉降到孔的底面上。
然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述实施例1的例1-1同样地进行。
在例5-2中，与上述实施例4的例4同样地，使用含有层粘连蛋白和巢蛋白的培养液进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
在例5-3中，使用含有IV型胶原的培养液，进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。即，首先，作为培养液，制备含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
接着，在该培养液中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，进一步添加浓度达到1v/v％的量的IV型胶原(COLLAGEN IV，MOUSE、CORNING(注册商标))，由此制备细胞悬浮液。
所使用的IV型胶原制品含有1.25mg/mL的从EHS小鼠肿瘤中提取的可溶性基底膜基质，含有通过SDS-PAGE得到的纯度为90％以上的IV型胶原。
由此，计算出添加有1v/v％的IV型胶原制品的上述细胞悬浮液含有11～13μg/mL的IV型胶原。即，例5-3的细胞悬浮液中，IV型胶原的含量为上述实施例1的例1-1的细胞悬浮液中的相应含量的34％～38％。
通过在96孔板的各孔中加入100μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内并静置20分钟，由此在该冰箱内，在冷却后的培养液中，使细胞沉降到孔的底面上。
然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述实施例1的例1-1同样地进行。
[结果]
图8A、图8B和图8C分别表示在例5-1、例5-2和例5-3中在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。在图8A～图8C中，标尺条表示200μm。
如图8A所示，在使用了含有层粘连蛋白的培养液的例5-1中，在培养第8天的毛囊原基中未形成毛干状结构。与此相对，在图8B中，如箭头所指示的那样，在使用了含有层粘连蛋白和巢蛋白的培养液的例5-2中，在培养第8天的毛囊原基中形成了毛干状结构。另外，如图8C中箭头所指示的那样，在使用了含有IV型胶原的培养液的例5-3中，在培养第8天的毛囊原基中也形成了毛干状结构。
实施例6
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例6中，代替在上述实施例1的例1-1中使用的基质凝胶制品，以培养液中的浓度达到1v/v％的量使用降低了生长因子的含量的基质凝胶制品(Matrigel(注册商标)Basement Membrane Matrix(Growth Factor Reduced)、CORNING(注册商标))，除此以外，与所述实施例1的例1-1同样地进行8天的上皮细胞和间充质细胞的共培养。
所使用的基质凝胶制品(GFR)含有8～12mg/mL(以Lowry法测定的蛋白的质量)的从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肿瘤中提取的可溶性基底膜基质，该基底膜基质中的组成比率为：层粘连蛋白为61％、巢蛋白为7％、和IV型胶原为30％。
[结果]
图9A和图9B表示在例6的共培养中分别在培养第1天和培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。如图9A和图9B所示，在例6中，形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，如图9B所示，在培养第8天的毛囊原基中形成了毛干状结构。
另外，在96个毛囊原基中，在85个毛囊原基中确认到毛干状结构形成，毛干状结构的形成率为89％。即，在例6中，与上述例1-1同样地形成了具有毛干状结构的毛囊原基，毛干状结构的形成率也与所述例1-1为同等程度。
实施例7
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
例7-1中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为0.1v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有0.1v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有6μg/mL的层粘连蛋白、1μg/mL的巢蛋白和3μg/mL的IV型胶原。
例7-2中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为0.2v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有0.2v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有12μg/mL的层粘连蛋白、2μg/mL的巢蛋白和7μg/mL的IV型胶原。
例7-3中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为0.3v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有0.3v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有18μg/mL的层粘连蛋白、3μg/mL的巢蛋白和10μg/mL的IV型胶原。
例7-4中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为0.4v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有0.4v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有24μg/mL的层粘连蛋白、3μg/mL的巢蛋白和13μg/mL的IV型胶原。
例7-5中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为0.5v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有0.5v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有30μg/mL的层粘连蛋白、4μg/mL的巢蛋白和16μg/mL的IV型胶原。
例7-6中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为0.6v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有0.5v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有36μg/mL的层粘连蛋白、5μg/mL的巢蛋白和20μg/mL的IV型胶原。
[结果]
图10A、图10B、图10C、图10D、图10E和图10F分别表示在例7-1、例7-2、例7-3、例7-4、例7-5和例7-6的共培养中，在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片。图11A、图11B、图11C、图11D、图11E和图11F分别表示在例7-1、例7-2、例7-3、例7-4、例7-5和例7-6的共培养中，在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片。图12A、图12B、图12C、图12D、图12E和图12F分别表示在例7-1、例7-2、例7-3、例7-4、例7-5和例7-6的共培养中，在培养8天拍摄的相位差显微镜照片。在图10A～图10F、图11A～图11F、和图12A～图12F中，标尺条表示200μm。
如图10A～图10F、图11A～图11F、和图12A～图12F所示，在全部的例子(例7-1～例7-6)中，形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，如图12A～图12F所示，在全部的例子中，在培养8天的毛囊原基中形成了毛干状结构。
另外，培养第8天的毛干状结构的形成率在例7-1中为25％(12个毛囊原基中有3个)，在例7-2为58％(12个毛囊原基中有7个)，在例7-3为92％(12个毛囊原基中有11个)，在例7-4、例7-5和例7-6中为100％(12个毛囊原基中有12个)。
实施例8
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
例8-1中，除了将向培养液中添加的基质凝胶的浓度设为2.0v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有2.0v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有119μg/mL的层粘连蛋白、17μg/mL的巢蛋白和66μg/mL的IV型胶原。
例8-2中，除了将向培养液中添加的基质凝胶的浓度设为2.5v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有2.5v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有148μg/mL的层粘连蛋白、21μg/mL的巢蛋白和82μg/mL的IV型胶原。
在例8-3中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为3.0v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有3.0v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有178μg/mL的层粘连蛋白、25μg/mL的巢蛋白和99μg/mL的IV型胶原。
在例8-4中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为3.5v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有3.5v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有208μg/mL的层粘连蛋白、30μg/mL的巢蛋白和115μg/mL的IV型胶原。
在例8-5中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为4.0v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有4.0v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有237μg/mL的层粘连蛋白、34μg/mL的巢蛋白和131μg/mL的IV型胶原。
在例8-6中，除了将添加到培养液中的基质凝胶的浓度设为4.5v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例1的例1-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有4.5v/v％的基质凝胶的细胞悬浮液含有267μg/mL的层粘连蛋白、38μg/mL的巢蛋白和148μg/mL的IV型胶原。
[结果]
图13A、图13B、图13C、图13D、图13E和图13F分别表示在例8-1、例8-2、例8-3、例8-4、例8-5和例8-6的共培养中，在培养第1天拍摄的相位差显微镜照片。图14A、图14B、图14C、图14D、图14E和图14F分别表示在例8-1、例8-2、例8-3、例8-4、例8-5和例8-6的共培养中，在培养第3天拍摄的相位差显微镜照片。图15A、图15B、图15C、图15D、图15E和图15F分别表示在例8-1、例8-2、例8-3、例8-4、例8-5和例8-6的共培养中，在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。在图13A～图13F、图14A～图14F、和图15A～图15F中，标尺条表示200μm。
如图13A～图13F、图14A～图14F、和图15A～图15F所示，在全部的例子(例8-1～例8-6)中，形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，如图15A～图15F所示，在全部的例子中，在培养8天的毛囊原基中形成了毛干状结构。
另外，培养第8天的毛干状结构的形成率在例8-1、例8-2和例8-3中为100％(6个毛囊原基中有6个)，例8-4、例8-5和例8-6也为100％(12个毛囊原基中有12个)。
实施例9
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例9-1中，除了将添加到培养液中的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品的浓度设为0.5v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例4的例4同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有0.5v/v％的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品的细胞悬浮液含有68～76μg/mL的层粘连蛋白/巢蛋白复合物(即分别含有34～38μg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白)。
在例9-2中，除了将添加到培养液中的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品的浓度设为5.0v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例4的例4同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有5.0v/v％的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品的细胞悬浮液含有684～760μg/mL的层粘连蛋白/巢蛋白复合物(即分别含有342～380μg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白)。
在例9-3中，除了将添加到培养液中的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品的浓度设为10.0v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例4的例4同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出添加有5.0v/v％的高浓度层粘连蛋白/巢蛋白复合物制品的细胞悬浮液含有1368～1520μg/mL的层粘连蛋白/巢蛋白复合物(即分别含有684～760μg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白)。
[结果]
图16A、图16B和图16C分别表示在例9-1、例9-2和例9-3的共培养中，在培养第2天拍摄的相位差显微镜照片。图17A、图17B和图17C分别表示在例9-1、例9-2和例9-3的共培养中，在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。在图16A～图16C、和图17A～图17C中，标尺条表示200μm。
如图16A～图16C、和图17A～图17C所示，在全部的例子(例9-1～例9-3)中，形成了具有毛干状结构的毛囊原基。即，如图17A～图17C所示，在全部的例子中，在培养8天的毛囊原基中形成了毛干状结构。
参考例1
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例C1-1中，除了将添加到培养液中的高纯度层粘连蛋白制品的浓度设为5v/v％以代替1v/v％以外，与上述实施例4的例4同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出含有5v/v％的高纯度层粘连蛋白制品的细胞悬浮液含有39～41μg/mL的层粘连蛋白。
在例C1-2中，除了将添加到培养液中的高纯度层粘连蛋白制品的浓度设为10v/v％代替1v/v％以外，与上述实施例4的例4同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。其中，计算出含有10v/v％的高纯度层粘连蛋白制品的细胞悬浮液含有78～82μg/mL的层粘连蛋白。
[结果]
图18A、图18B和图18C表示在例C1-1的共培养中分别在培养第1天、培养第3天和培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。图18D、图18E和图18F表示在例C1-2的共培养中分别在培养第1天、培养第3天和培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。在图18A～图18F中，标尺条表示200μm。
如图18A～图18F所示，在例C1-1和例C1-2的任一者中均未形成具有毛干状结构的毛囊原基。
参考例2
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例C2中，在预先涂敷了IV型胶原的培养皿表面上，在不含IV型胶原的培养液中进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。首先，将上述实施例5的例5-3中使用的IV型胶原制品按照其使用说明书中的有关涂敷方法的记载，用0.05M HCl溶液稀释至100μg/mL的浓度，制备涂敷液。接着，将1mL该涂敷液添加至直径为35mm的培养皿中，在室温下保持1小时。然后，从培养皿中丢弃涂敷液，用纯化水清洗该培养皿表面。
另一方面，在含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/mL的量(总细胞密度达到1×104cells/mL的量)的上皮细胞和间充质细胞，制备细胞悬浮液。
通过将上述细胞悬浮液每个2mL地加入到如上述那样预先涂敷了IV型胶原的培养皿中，接种上皮细胞和间充质细胞，开始共培养。
[结果]
图19A和图19B表示在例C2的共培养中分别在培养第2天和培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。在图19A和图19B中，标尺条表示200μm。
如图19A和图19B所示，即使在实施了IV型胶原的涂覆处理的培养皿表面上，在不含IV型胶原的培养液中进行上皮细胞和间充质细胞的共培养，也没有形成具有毛干状结构的毛囊原基。
参考例3
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例C3-1中，在含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的凝胶上，在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
即，首先将上述实施例1的例1-1中使用的基质凝胶制品50μL滴加到96孔平底培养板的各孔的底面上，在37℃下孵育15分钟使其凝胶化。然后，在各孔的凝胶上接种悬浮在不含有基质凝胶制品的培养液中的上皮细胞和间充质细胞，在该凝胶上进行共培养。
在例C3-2中，在含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的凝胶内进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
即，首先将基质凝胶制品与上皮细胞和间充质细胞混合，将得到的细胞悬浮液50μL滴加到96孔平底培养板的各孔的底面上，在37℃下孵育15分钟使其凝胶化。然后，在各孔的包埋有经分散的上皮细胞和间充质细胞的凝胶上，注入不含有基质凝胶制品的培养液，在该凝胶内进行共培养。
在例C3-3中，将在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中对上皮细胞和间充质细胞进行共培养而形成的毛囊原基在含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的凝胶上、在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中进行培养。
即，首先，与上述实施例1的例1-2同样地，在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中，进行3天的上皮细胞和间充质细胞的共培养，形成包含该上皮细胞和间充质细胞的毛囊原基。
另一方面，与上述例C3-1同样地形成基质凝胶的凝胶。然后，在未添加基质凝胶的培养液中，将如上述那样形成的毛囊原基接种到如上那样形成的凝胶上，在该凝胶上培养该毛囊原基9天。
在例C3-4中，将在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中对上皮细胞和间充质细胞进行共培养而形成的毛囊原基在含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的凝胶内培养。
即，首先，与上述实施例1的例1-2同样地，在不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液中，进行3天的上皮细胞和间充质细胞的共培养，形成包含该上皮细胞和间充质细胞的毛囊原基。然后，与上述例C3-2同样地将毛囊原基包埋在基质凝胶的凝胶内，在该凝胶内培养该毛囊原基9天。
[结果]
图20A、图20B、图20C和图20D分别表示在例C3-1、例C3-2、例C3-3和例C3-4中，在培养第12天拍摄的相位差显微镜照片。在图20A～图20D中，标尺条表示200μm。
如图20A～图20D所示，在例C3-1～例C3-4的任一者中均未形成具有毛干状结构的毛囊原基。
实施例10
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。
[培养]
在例10中，使用含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。首先，作为培养液，制备含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
接着，在该培养液中悬浮各自的细胞密度达到5×103cells/200μL的量(总细胞密度达到1×104cells/200μL的量)的上皮细胞和间充质细胞，进一步添加浓度达到1v/v％的量的基质凝胶，由此制备细胞悬浮液。
通过在96孔板的各孔中加入200μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞和间充质细胞。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内静置20分钟。通过该静置，在冰箱内，在冷却后的培养液中，上皮细胞和间充质细胞在能够相互接触的状态下沉降到孔的底面上。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。共培养进行6天。
在共培养中，培养液的更换2天进行1次。培养液的更换如下进行：首先从各孔中除去100μL的培养液，接着，作为新的培养液，在各孔中添加100μL的不含基质凝胶、含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
[毛囊原基的移植]
在相位差显微镜下观察通过6天的共培养形成的毛囊原基，确认在各毛囊原基中是否形成了毛干状结构。然后，仅选择性地回收形成有毛干状结构的毛囊原基，在使用了小动物用异氟烷麻醉器(BioRearch center株式会社)的麻醉下，移植到5周龄的ICR裸鼠(Oriental酵母工业株式会社)的皮下。即，在裸鼠的背部使用Ophthalmic V-lance(20G、日本Alcon株式会社)形成移植孔，使用移液管，将各个具有毛干状结构的21个毛囊原基插入到该移植孔内。
[结果]
图21表示移植后第22天的裸鼠背部的照片的一例。如图21所示，在裸鼠背部的移植有毛囊原基的部位形成了毛发。具体而言，在移植的21个毛囊原基中，从18个中确认到毛发的形成。即，移植的在裸鼠背部形成了毛发的毛囊原基的数量相对于移植的毛囊原基的总数的比例(毛发再生效率)为85.7％(＝18/21×100)。需要说明的是，该毛发再生效率比移植了使用不含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液形成的不具有毛干状结构的毛囊原基的情况(结果未图示)高。这样，通过将通过上述的共培养制造的毛囊原基移植到生物体中，确认到毛发高效率地再生。
实施例11
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
与上述实施例1同样地制备上皮细胞和间充质细胞。不过，首先，在仅接种间充质细胞的那天，从第一小鼠个体采集间充质细胞，接着，在该间充质细胞培养1天后进一步接种上皮细胞的那天，从与所述第一个体不同的第二小鼠个体采集上皮细胞。
[培养]
在例11中，首先，使用含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液仅开始间充质细胞的培养，接着，添加上皮细胞，使用含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
作为培养液，制备含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。在该培养液中悬浮细胞密度达到5×104cells/mL的量的间充质细胞，进而添加浓度达到1v/v％的量的基质凝胶，由此制备该间充质细胞的细胞悬浮液。
通过在96孔板的各孔中加入100μL的间充质细胞的细胞悬浮液，接种间充质细胞(间充质细胞的细胞密度：5×103cells/孔)。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内静置20分钟，使间充质细胞沉降到孔的底面上。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始间充质细胞的培养。间充质细胞的培养进行1天。
在从间充质细胞的培养开始1天后，在培养液(含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基)中悬浮细胞密度达到5×104cells/mL的量的上皮细胞，进而添加浓度达到1v/v％的量的基质凝胶，由此制备该上皮细胞的悬浮液。
另一方面，将含有如上述那样培养了1天的间充质细胞的96孔板移至4℃的冰箱内并静置20分钟。然后，通过在包含间充质细胞的各孔中加入100μL的上皮细胞的悬浮液，接种上皮细胞(上皮细胞的细胞密度：5×103cells/孔)。
在上皮细胞接种后，将包含该上皮细胞和间充质细胞的96孔板移至4℃的冰箱内静置20分钟。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞和间充质细胞的共培养。共培养进行14天。即，从在包含间充质细胞的各孔中接种上皮细胞的那天起的14天中，进行该上皮细胞与间充质细胞的共培养。培养液的更换与上述例10同样地进行。
[结果]
图22A和图22B表示在例11的共培养中分别从共培养开始起第3天及第14天拍摄的相位差显微镜照片。在图22A和图22B中，标尺条表示200μm。
如图22A所示，在培养第3天形成的毛囊原基中大多包含间充质细胞凝聚而形成的间充质细胞凝聚体、和上皮细胞凝聚而形成的与该间充质细胞凝聚体串联连接的上皮细胞凝聚体。另外，如图22B所示，也确认到在培养第14天，由1个毛囊原基形成了1根长的毛干状结构的情形。
图23表示测定在共培养中在毛囊原基中形成的毛干状结构的长度的结果。在图23中，横轴表示共培养的天数，纵轴表示在毛囊原基中形成的毛干状结构的长度。
如图23所示，在从共培养开始起至经过了4天后开始观察到毛干状结构，之后随着培养时间的经过，该毛干状结构生长、变长。
图24A表示用透射型显微镜观察在培养第14天的毛囊原基中形成的毛干状结构的截面而得到的照片。在图24A中，标尺条表示5μm。图24B放大表示图24A所示的用白线围住的四边形的区域。在图24B中，标尺条表示2μm。图24C放大表示图24B所示的用白线围住的四边形的区域。在图24C中，标尺条表示500nm。图24D放大表示图24C所示的用白线围住的四边形的区域。在图24D中，标尺条表示200nm。
如图24A～图24D所示，确认了在毛囊原基中形成的毛干状结构具有类似黑色素、毛皮质这样的生物体的毛发的结构。
实施例12
[上皮细胞和间充质细胞的采集]
从胎龄18天的Bulb/c小鼠胎儿采集背部的皮肤组织，对中尾等报告的方法(Koh-ei Toyoshima et al.Nature Communications,3,784,2012)进行部分改变，在4℃下、在30rpm的振荡条件下进行分散酶处理1小时，将该皮肤组织的上皮层与间质层分离。然后，对上皮层实施100U/mL的胶原酶处理1小时20分钟，进而实施胰蛋白酶处理10分钟，由此分离出上皮细胞。另外，通过对间质层实施100U/mL的胶原酶处理1小时20分钟，分离出间充质细胞。
[培养]
在例12-1中，使用含有层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原的培养液，进行上皮细胞、间充质细胞和黑色素细胞的共培养。首先，作为培养液，制备含有1％GultaMax Supplement和0.2％Normоcin的DMEM/F12培养基。
接着，在该培养液中悬浮(总细胞密度：1.125×104cells/200μL)各自的细胞密度达到5×103cells/200μL的量的上皮细胞和间充质细胞、以及细胞密度达到1.25×103cells/200μL的量的黑色素细胞(正常人(黑人)表皮黑色素细胞)，进而添加浓度达到1v/v％的量的基质凝胶，由此制备细胞悬浮液。
通过在96孔板的各孔中加入200μL的上述细胞悬浮液，接种上皮细胞、间充质细胞和黑色素细胞。接种后，立即将96孔板移至4℃的冰箱内静置20分钟。通过该静置，上皮细胞、间充质细胞和黑色素细胞在能够相互接触的状态下沉降到孔的底面上。然后，将96孔板移至37℃的培养箱中，在该培养箱内开始上皮细胞、间充质细胞和黑色素细胞的共培养。共培养进行8天。培养液的更换与上述例10同样地进行。
在例12-2中，除了使用细胞密度达到2.5×103cells/200μL的量的黑色素细胞(总细胞密度：1.25×104cells/200μL)以外，与上述例12-1同样地进行上皮细胞、间充质细胞和黑色素细胞的共培养。
在例12-3中，除了使用细胞密度达到5×103cells/200μL的量的黑色素细胞(总细胞密度：1.5×104cells/200μL)以外，与上述例12-1同样地进行上皮细胞、间充质细胞和黑色素细胞的共培养。
在例12-C1中，除了不使用黑色素细胞(总细胞密度：1×104cells/200μL)以外，与上述例12-1同样地进行上皮细胞和间充质细胞的共培养。
即，3种细胞的接种数的比率(上皮细胞：间充质细胞：黑色素细胞)在例12-C1中为“1：1：0”，在例12-1中为“4：4：1”，在例12-2中为“2：2：1”，在例12-3中为“1：1：1”。
[结果]
图25A、图25B、图25C和图25D分别表示在例12-C1、例12-1、例12-2和例12-3的共培养中，在培养第8天拍摄的相位差显微镜照片。
如图25A所示，通过具有白毛的Bulb/c小鼠来源的上皮细胞和间充质细胞的共培养，形成了具有白色的毛干状结构的毛囊原基。与此相对，如图25B～图25D所示，在例12-1～例12-3的全部中，通过在具有白毛的Bulb/c小鼠来源的上皮细胞和间充质细胞中进一步加入黑色素细胞进行共培养，形成了具有黑色的毛干状结构的毛囊原基。

Claims (9)

1.一种毛囊原基的制造方法，其包含通过下述步骤来形成毛囊原基：
接种上皮细胞和间充质细胞；
在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞；以及
在培养液中进行所述上皮细胞和所述间充质细胞的共培养。
2.根据权利要求1所述的毛囊原基的制造方法，其中，
在分散有所述(a)层粘连蛋白和巢蛋白的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞。
3.根据权利要求1或2所述的毛囊原基的制造方法，其中，
在分散有所述(b)IV型胶原的培养液中，保持所述上皮细胞和所述间充质细胞。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的毛囊原基的制造方法，其中，
包含在培养液中使所接种的所述上皮细胞和所述间充质细胞沉降到培养基材上的步骤，
并且，在分散有所述(a)和/或(b)的培养液中保持沉降到所述培养基材上的所述上皮细胞和所述间充质细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的毛囊原基的制造方法，其中，包含下述步骤：
在分散有所述(a)和/或(b)的培养液中的所述上皮细胞和所述间充质细胞保持后，在所述(a)和/或(b)的浓度比所述保持时的浓度小的培养液中，进行所述上皮细胞和所述间充质细胞的共培养。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的毛囊原基的制造方法，其中，
通过进行所述共培养，形成具有毛干状结构的所述毛囊原基。
7.一种促进毛囊原基中的毛干状结构形成的方法，其在包含接种上皮细胞和间充质细胞、以及将所述上皮细胞和所述间充质细胞共培养而形成所述毛囊原基的细胞培养时，
通过在分散有(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原的培养液中保持所述上皮细胞和所述间充质细胞，从而促进所述毛囊原基中的毛干状结构形成。
8.一种促进毛囊原基中的毛干状结构形成的方法，其在包含接种上皮细胞和间充质细胞、以及将所述上皮细胞和所述间充质细胞共培养而形成所述毛囊原基的细胞培养时，
将(a)层粘连蛋白和巢蛋白、和/或(b)IV型胶原用于促进所述毛囊原基中的毛干状结构形成。
9.一种毛囊原基，其是包含上皮细胞和间充质细胞的毛囊原基，
其具有毛干状结构、不包含立毛肌结构和/或皮脂腺结构且没有移植到生物体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023056591A (ja) * 2021-10-08 2023-04-20 国立大学法人横浜国立大学 毛髪再生能を有する細胞凝集塊の製造方法及びこれに関連する方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014179559A1 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Skin substitutes and methods for hair follicle neogenesis
JP2018082638A (ja) * 2016-11-21 2018-05-31 国立大学法人横浜国立大学 毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法、毛包組織含有シート、及び毛包組織含有シートの製造方法
CN108138133A (zh) * 2015-10-30 2018-06-08 国立大学法人横滨国立大学 再生毛囊原基的集合体的制造方法、含毛囊组织薄片及含毛囊组织薄片的制造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201701685QA (en) 2014-09-08 2017-04-27 Organ Technologies Inc Method of producing full thickness skin having skin accessory organs
US20200208106A1 (en) 2017-08-22 2020-07-02 National University Corporation Yokohama National University Production Method of Multiple Regenerated Hair Follicle Primordia, Production Method of Hair Follicle Tissue-Containing Sheet, Hair Regeneration Kit and Method for Screening Hair Growth promoter or Hair Growth Inhibitor

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014179559A1 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Skin substitutes and methods for hair follicle neogenesis
CN108138133A (zh) * 2015-10-30 2018-06-08 国立大学法人横滨国立大学 再生毛囊原基的集合体的制造方法、含毛囊组织薄片及含毛囊组织薄片的制造方法
JP2018082638A (ja) * 2016-11-21 2018-05-31 国立大学法人横浜国立大学 毛細血管構造を有する再生毛包原基の集合体の製造方法、毛包組織含有シート、及び毛包組織含有シートの製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOJI SUGAWARA等: "Laminin-332 and -511 in skin", EXP DERMATOL, vol. 17, no. 6, pages 473 - 480 *
MAKOTO FUNAKI等: "Technologies to Engineer Cell Substrate Mechanics in Hydrogels", pages 7, Retrieved from the Internet <URL:https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/matrigel> *

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