WO2020085023A1 - 間葉系細胞の培養方法、活性化間葉系細胞の製造方法、毛包原基の製造方法、間葉系細胞の活性化方法、及び上皮系細胞の活性化方法 - Google Patents

間葉系細胞の培養方法、活性化間葉系細胞の製造方法、毛包原基の製造方法、間葉系細胞の活性化方法、及び上皮系細胞の活性化方法 Download PDF

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WO2020085023A1
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WO
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mesenchymal cells
cells
current
hair follicle
electrode
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PCT/JP2019/038934
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福田　淳二
達斗 景山
ライ エン
ビンビン チャン
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国立大学法人横浜国立大学
地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0666—Mesenchymal stem cells from hair follicles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0627—Hair cells
    • C12N5/0628—Hair stem cells; Hair progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing mesenchymal cells, a method for producing activated mesenchymal cells, a method for producing hair follicle primordium, a method for activating mesenchymal cells, and a method for activating epithelial cells.
  • Patent Document 1 a step of seeding mesenchymal cells and epithelial cells in a micro-engraved plate composed of regularly arranged micro-recesses and performing mixed culture while supplying oxygen to form a hair follicle primordium And a method for producing an aggregate of regenerated hair follicle primordia.
  • Patent Document 2 discloses a method for culturing dermal papilla cells, which comprises culturing dermal papilla cells in the presence of basic fibroblast growth factor (bFGF), and subculturing the dermal papilla cells into spheres. Have been described.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Patent Document 3 discloses culturing dermal papilla cells maintaining hair-inducing ability, which comprises culturing dermal papilla cells in the presence of FGF-based material, BMP-2 / BMP-4-based material and WNT-based material. The method is described.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and a method for culturing mesenchymal cells that improves hair growth-related properties, a method for producing activated mesenchymal cells, a method for producing hair follicle primordia, and It is one of the objects to provide a method for activating leaflet cells and a method for activating epithelial cells.
  • a method for culturing mesenchymal cells according to an embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problem is to cultivate the mesenchymal cells adhered to the surface of an electrode while applying a current through the electrode. Including.
  • the present invention provides a method for culturing mesenchymal cells, which improves hair growth-related properties of mesenchymal cells.
  • the current may be a pulse current.
  • the current may be applied via the electrode as the first electrode and the second electrode arranged at a position facing the first electrode.
  • a method for producing activated mesenchymal cells according to an embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problem is to culture mesenchymal cells adhered to the surface of an electrode while applying a current through the electrode. Thereby obtaining activated mesenchymal cells as compared to mesenchymal cells cultured by the same method except that no current is applied.
  • the present invention provides a method for producing activated mesenchymal cells having improved hair growth-related properties.
  • the current may be a pulse current.
  • the current may be applied via the electrode as the first electrode and the second electrode arranged at a position facing the first electrode.
  • the activated mesenchymal cells have an expression level of at least one hair growth-related gene increased while that of mesenchymal cells cultured by the same method except that no current is applied. It may be leafy cells.
  • a method for producing a hair follicle primordium according to an embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problem is that hair is obtained by co-culturing mesenchymal cells produced by any of the above methods and epithelial cells. Including forming a primordium. According to the present invention, there is provided a method for producing a hair follicle primordia with effectively improved hair growth-related properties.
  • the hair follicle primordium may be formed by co-culturing the mesenchymal cells and the epithelial cells on a cell non-adhesive surface.
  • the hair follicle primordia formed by the co-culture are the same method except that mesenchymal cells produced by the same method as the mesenchymal cells are used except that no current is applied.
  • the activated epithelial cells may be included as compared with the epithelial cells contained in the hair follicle primordia formed in (4).
  • the activated epithelial cells are mesenchymal cells produced by the same method as the mesenchymal cells except that the expression level of at least one hair growth-related gene is not applied with current.
  • the number of epithelial cells contained in the hair follicle primordia formed by the same method may be higher than that of epithelial cells.
  • the hair follicle primordia formed by the co-culture are the same method except that mesenchymal cells produced by the same method as the mesenchymal cells are used except that no current is applied.
  • the activated mesenchymal cells may be included as compared with the mesenchymal cells contained in the hair follicle primordia formed in (1).
  • the activated mesenchymal cells were formed by the same method except that mesenchymal cells produced by the same method as the mesenchymal cells were used except that no current was applied.
  • the mesenchymal cells may have an increased expression level of at least one hair growth-related gene as compared with the mesenchymal cells contained in the hair follicle primordia.
  • a method for activating mesenchymal cells according to an embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problem is to culture the mesenchymal cells adhered to the surface of an electrode while applying a current through the electrode. Activates the mesenchymal cells.
  • a method for activating mesenchymal cells which effectively improves hair growth-related properties of mesenchymal cells.
  • the method for activating epithelial cells according to an embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problems is a hair follicle primordium formed by co-culture of mesenchymal cells and epithelial cells, wherein the mesenchymal cells are By using the mesenchymal cells produced by any one of the above methods as the cells, the epithelial cells contained in the hair follicle primordia are activated.
  • a method for activating epithelial cells which effectively improves hair growth-related properties of epithelial cells.
  • a method for culturing mesenchymal cells that improves hair growth-related properties a method for producing activated mesenchymal cells, a method for producing hair follicle primordia, a method for activating mesenchymal cells, and epithelium
  • a method for activating lineage cells is provided.
  • Example 2 which concerns on this embodiment, it is explanatory drawing which shows the result of having evaluated the gene expression level of the hair papilla cell when changing the timing which starts applying an electric current.
  • Example 2 which concerns on this embodiment, it is explanatory drawing which shows the result of having evaluated the gene expression level of the hair papilla cell when changing the applied electric current value.
  • Example 2 which concerns on this embodiment, it is explanatory drawing which shows the result of having evaluated the gene expression level of the hair papilla cell when changing the time which applies an electric current.
  • Example 3 it is an explanatory view showing a photograph of hair growth from a hair follicle primordium formed using hair papilla cells cultured by applying an electric current and transplanted into a mouse. is there.
  • Example 3 according to the present embodiment an explanatory view showing a photograph of hair growth from a hair follicle primordium formed using hair papilla cells cultured without applying an electric current and transplanted into a mouse. Is.
  • Example 3 which concerns on this embodiment, it is explanatory drawing which shows the result of having evaluated the number of hair growth from the hair follicle primordium transplanted to the mouse.
  • this method A method according to one embodiment of the present invention (hereinafter referred to as “this method”) will be described below.
  • the present invention is not limited to this embodiment.
  • This method includes a method for culturing mesenchymal cells, which comprises culturing mesenchymal cells adhered to the surface of an electrode while applying a current through the electrode. That is, the inventors of the present invention have conducted extensive studies on technical means for improving hair growth-related properties of mesenchymal cells, and as a result, by culturing the mesenchymal cells while applying electrical stimulation, The inventors have uniquely found that leaf cells are activated and their hair growth-related properties are effectively improved, and completed the present invention.
  • the present method activates the mesenchymal cells by culturing the mesenchymal cells adhered to the surface of the electrode while applying a current through the electrode.
  • the method of conversion is included.
  • this method is a method in which mesenchymal cells adhered to the surface of an electrode are cultured while applying a current through the electrode, and mesenchymal cells cultured by the same method except that no current is applied.
  • the method for producing activated mesenchymal cells which comprises obtaining the mesenchymal cells activated as compared with the method of 1.
  • the present method includes a method for producing a hair follicle primordium, which comprises forming a hair follicle primordia by co-culturing the mesenchymal cells produced by the above-mentioned method and an epithelial cell. .
  • the inventors of the present invention surprisingly include the activated mesenchymal cells and epithelial cells by co-culturing the cells to form hair follicle primordia, which is unexpectedly included in the hair follicle primordia. It was independently found that activated epithelial cells are activated.
  • this method uses the mesenchymal cells produced by the above-mentioned method as the mesenchymal cells in the hair follicle primordia formed by co-culture of mesenchymal cells and epithelial cells.
  • the method for activating the epithelial cells which activates the epithelial cells contained in the hair follicle primordia, is included.
  • the mesenchymal cells used in the present method are those having hair growth-related properties (for example, expression of hair growth-related genes and / or formation of hair follicle primordia by co-culture with epithelial cells). It is not particularly limited.
  • the mesenchymal cells may be cells derived from adult hair follicle tissue (for example, dermal papilla and / or hair root sheath), and skin tissue (whether fetus, juvenile, or adult skin tissue) Cells derived from stem cells (eg, induced pluripotent (iPS) stem cells, embryonic stem (ES) cells, or embryonic germ (EG) cells) in vitro. Cells may be used.
  • stem cells eg, induced pluripotent (iPS) stem cells, embryonic stem (ES) cells, or embryonic germ (EG) cells
  • the mesenchymal cells may be primary cells collected from a living body, or may be pre-cultured cells (eg, subcultured cells and / or established cells).
  • Mesenchymal cells are identified as cells expressing, for example, Versican and ALP (alkaline phosphatase).
  • Versican and ALP alkaline phosphatase
  • hair papilla cells and / or hair bulb sheath cells are preferably used as the mesenchymal cells. Hair papilla cells and hair bulb sheath cells express Versican and ALP.
  • the mesenchymal cells are preferably derived from humans, but may be derived from non-human animals (animals other than humans).
  • the non-human animal is not particularly limited, but it is preferably a non-human vertebrate (vertebrate other than human).
  • the non-human vertebrate is not particularly limited, but it is preferably a non-human mammal.
  • Non-human mammals include, but are not limited to, primates (eg, monkeys), rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits), meats (eg, dogs, cats), or ungulates. (For example, pig, cow, horse, goat, sheep).
  • the culture medium used for culturing the mesenchymal cells is not particularly limited as long as it has a composition suitable for survival of the mesenchymal cells and maintenance of hair growth-related properties.
  • a culture medium for cell culture is preferably used.
  • culture surface The surface to which the mesenchymal cells adhere (hereinafter referred to as “culture surface”) used in this method (hereinafter referred to as “culture electrode”) can be cultured by adhering the mesenchymal cells. Moreover, it is not particularly limited as long as it is a conductive surface to which an electric current can be applied.
  • the culture electrode preferably contains a metal film.
  • the metal constituting the metal film is not particularly limited as long as it imparts conductivity to the culture electrode, and for example, selected from the group consisting of gold, platinum, silver, copper, titanium, chromium and nickel. One or more of the above or alloys thereof are preferably used.
  • the culture electrode may include a conductive polymer membrane. That is, for example, the culture electrode may include a metal film and a conductive polymer film formed on the metal film.
  • the conductive polymer forming the conductive polymer film is not particularly limited, but, for example, polypyrrole-based polymer, polythiophene-based polymer, polyaniline-based polymer, polyacetylene-based polymer, and polyparaphenylene-based polymer One or more selected from the group consisting of is preferably used.
  • the culture electrode may include a cell adhesive substance film. That is, for example, the culture electrode may include a metal film and a cell adhesive substance film formed on the metal film. Further, for example, the culture electrode may include a metal film, a conductive polymer film formed on the metal film, and a cell adhesive substance film formed on the conductive polymer film.
  • the cell-adhesive substance is not particularly limited as long as it is a substance that promotes adhesion of mesenchymal cells to the electrode surface, and examples thereof include extracellular matrix components such as collagen, fibronectin, and laminin, and specific cells exhibiting cell adhesiveness. Amino acid sequences (eg, arginine, glycine, aspartic acid (so-called RGD) sequences, etc.) and specific sugar chain sequences exhibiting cell adhesiveness are preferably used.
  • the culture electrode does not include a cell adhesive substance film, for example, by adsorbing the cell adhesive substance contained in the culture solution in contact with the culture surface of the culture electrode on the culture surface, mesenchyme
  • the lineage cell can adhere to the culture surface. That is, the culture surface is not particularly limited as long as it is a conductive surface that exhibits cell adhesiveness in contact with the culture solution.
  • Adhesion of mesenchymal cells to the culture surface is performed by seeding the mesenchymal cells on the culture surface and retaining the mesenchymal cells on the culture surface. Specifically, a culture solution containing mesenchymal cells is dropped onto the culture surface, and the mesenchymal cells precipitated on the culture surface in the culture solution are treated under conditions suitable for culturing the mesenchymal cells. (For example, the mesenchymal cells are adhered to the culture surface by holding at a temperature suitable for culturing the mesenchymal cells, a gas phase composition in contact with the culture solution, a composition of the culture solution) for a predetermined time. Although the mesenchymal cells before adhering to the culture surface are spherical, the mesenchymal cells adhering to the culture surface have a flatter shape than before adhesion.
  • the culture of mesenchymal cells in this method is performed while applying an electric current through the culture electrode to which the mesenchymal cells adhere.
  • the conditions for applying the current are not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but, for example, the expression level of at least one hair growth-related gene in the mesenchymal cells after culturing is determined by applying the current.
  • conditions that increase more than that of mesenchymal cells cultured by the same method are preferably used.
  • the timing of applying the current is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but for example, it may be 6 hours or more after the mesenchymal cells are seeded on the electrode surface. It is preferable that the time is 10 hours or more, more preferably 15 hours or more, and even more preferably 20 hours or more.
  • the timing of starting the application of the electric current is preferably, for example, 170 hours before the mesenchymal cells are seeded on the electrode surface, more preferably 120 hours before, and 80 hours before. Is more preferable, and it is particularly preferable that it is before 50 hours have elapsed.
  • the timing to start applying the current may be specified by arbitrarily combining any one of the lower limit values and any one of the upper limit values.
  • the total time of applying the electric current (when the electric current is applied in a plurality of times during the culture period, the total of the plural times of applying the electric current) is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained. Is, for example, preferably 5 minutes or longer, more preferably 10 minutes or longer, even more preferably 15 minutes or longer, and particularly preferably 20 minutes or longer.
  • the total time for applying the current is, for example, preferably 120 hours or less, more preferably 80 hours or less, further preferably 50 hours or less, and particularly preferably 20 hours or less. preferable.
  • the total time for applying the current may be specified by arbitrarily combining any of the above lower limit values and any of the above upper limit values.
  • the time for applying the current in one electrical stimulation (when applying the current in multiple times during the culture period, the time for continuously applying the current in one of the multiple current applications) is It is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but is preferably 5 minutes or more, more preferably 10 minutes or more, still more preferably 15 minutes or more, 20 Especially preferably, it is not less than minutes.
  • the time for applying the current in one electrical stimulation is, for example, preferably 120 hours or less, more preferably 80 hours or less, further preferably 50 hours or less, and 20 hours or less. Is particularly preferable.
  • the time for which the current is applied in one electrical stimulation may be specified by arbitrarily combining any of the above lower limit values and any of the above upper limit values.
  • the current value applied per unit area (cm 2 ) of the culture surface (electrode surface) is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but is preferably 10 ⁇ A / cm 2 or more, for example. , more preferably 20 .mu.A / cm 2 or more, even more preferably at 30 .mu.A / cm 2 or more, and particularly preferably 40 .mu.A / cm 2 or more.
  • the current value to be applied is preferably 1000 ⁇ A / cm 2 or less, more preferably 700 ⁇ A / cm 2 or less, even more preferably at 400 .mu.A / cm 2 or less, 200 .mu.A / cm 2
  • the applied current value may be specified by arbitrarily combining any of the above lower limit values and any of the above upper limit values.
  • the current to be applied is preferably a pulse current.
  • the pulse current is not particularly limited as long as it is a pulsed current.
  • one pulse is composed of the following (1), (2) and (3), and the following (1) and (2) ) Or may consist of the following (1) and (3): (1) first applying a positive or negative current of a first value for a first time; (2) then A second value of negative or positive current is applied for a second time ;, (3) no current is applied for a subsequent third time.
  • the description of "plus current or minus current" in (1) and "minus current or plus current” in (2) means that when plus current is applied in (1), minus current is applied in (2).
  • the negative current is applied in (1), it means that the positive current is applied in (2).
  • the first value and the second value of the pulse current described above may be different, but are preferably the same.
  • the first time and the second time may be different, but are preferably the same.
  • the third time may be different or the same as the first time and / or the second time.
  • the frequency of the pulse current is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained, but is preferably 2 Hz or higher, more preferably 3 Hz or higher, and further preferably 4 Hz or higher. It is preferably 5 Hz or more, and particularly preferably. Note that 1 Hz means that the pulse current is applied once per second.
  • the frequency of the pulse current is, for example, preferably 100 Hz or less, more preferably 50 Hz or less, even more preferably 25 Hz or less, and particularly preferably 10 Hz or less.
  • the frequency of the pulse current may be specified by arbitrarily combining any of the above lower limit values and any of the above upper limit values.
  • Applying an electric current through the culture electrode is performed using, for example, the culture electrode as the first electrode and the second electrode.
  • the first electrode (culture electrode) is used as the working electrode and the second electrode is used as the counter electrode.
  • a reference electrode may be used.
  • the positional relationship between the first electrode and the second electrode is not particularly limited as long as the first electrode and the second electrode are in contact with the culture medium containing mesenchymal cells.
  • a current may be applied via a culture electrode as the first electrode and a second electrode arranged at a position facing the first electrode. That is, in this case, between the first electrode and the second electrode, the mesenchymal cells adhered to the culture surface of the first electrode, and contact the first electrode and the second electrode A culture medium containing mesenchymal cells is arranged.
  • FIG. 1 schematically shows an example of a culture device for culturing mesenchymal cells while applying an electric current.
  • the culture device 1 is used as a counter electrode which is arranged at a position facing a first electrode 10 which is a culture electrode used as a working electrode and a culture surface 11 of the first electrode 10.
  • a second electrode 20 which is provided.
  • the first electrode 10 is composed of a metal film such as a gold thin film formed on a substrate 12 composed of a glass plate or the like.
  • the second electrode 20 is made of a metal such as platinum.
  • the culture device 1 includes a plurality (four) of culture wells 30.
  • Each culture well 30 has a partition wall 31 for holding the culture solution M on the first electrode 10.
  • the mesenchymal cells C adhere to the culture surface 11 and are cultured in the culture medium M.
  • the first electrode 10 and the second electrode 20 are each connected to a power supply 40. That is, the first electrode 10 and the second electrode 20 are connected to the power source 40 by the first wiring 41 and the second wiring 42, respectively.
  • the second electrode 20 of each of the four culture wells 30 is connected to the power source 40 by the wiring 42, it is possible to apply a current to the four culture wells 30 under different conditions. .
  • a predetermined potential is applied between the first electrode 10 and the second electrode 20 in each culture well 30 by the power supply 40, so that the first electrode 10 and the second electrode 20 are interposed.
  • An electric current can be applied.
  • the mesenchymal cells adhered to the culture surface of the culture electrode may be cultured while applying an electric current using such a culture device.
  • the time for culturing the mesenchymal cells on the culture surface is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but is preferably 5 hours or more, and more preferably 20 hours or more. It is more preferably 50 hours or more, still more preferably 70 hours or more.
  • the time for culturing the mesenchymal cells on the culture surface is, for example, preferably 400 hours or less, more preferably 300 hours or less, further preferably 200 hours or less, and 100 hours. The following is particularly preferable.
  • the time for culturing the mesenchymal cells on the culture surface may be specified by arbitrarily combining any one of the above lower limits and any one of the above upper limits.
  • the mesenchymal cells are activated by culturing the mesenchymal cells attached to the culture surface of the culture electrode while applying a current through the culture electrode. That is, activated mesenchymal cells can be obtained by culturing while applying an electric current.
  • activation of mesenchymal cells means improvement of hair growth-related properties of the mesenchymal cells.
  • the improvement of hair growth-related properties of mesenchymal cells was, for example, increased by increasing the expression level of hair growth-related genes of the mesenchymal cells, and / or was formed using the mesenchymal cells. It includes improving the hair-growth properties of the hair follicle primordia (for example, increasing the number and / or the length of hairs growing from the hair follicle primordia implanted in the living body).
  • activated mesenchymal cells obtained by this method for example, the expression level of at least one hair growth-related gene, that of mesenchymal cells cultured by the same method except that no current is applied. There are more mesenchymal cells.
  • the hair growth-related gene expressed in mesenchymal cells is not particularly limited as long as it is a gene related to the contribution of the mesenchymal cells to hair growth, and includes, for example, Versican, ALP, BMP4, Nexin and Notch1. It may be one or more selected from the group.
  • the activated mesenchymal cells obtained by the present method are, for example, mesenchymal cells cultured by the same method except that the expression amount of the ALP gene measured by RT-PCR is not applied with current. Is 1.5 times or more, or 2.0 times or more.
  • the activated mesenchymal cells produced by this method can be used for various purposes. That is, the activated mesenchymal cells are provided, for example, in a state of being directly adhered to the culture surface of the culture electrode or recovered from the culture surface and used for research purposes or medical uses such as transplantation.
  • activated mesenchymal cells are preferably used for forming hair follicle primordia in vitro. That is, by co-culturing the activated mesenchymal cells produced by the present method and the epithelial cells, it is possible to form a hair follicle primordium having excellent hair growth-related properties.
  • the epithelial cells used in the formation of the hair follicle primordia in the present method have hair growth-related properties (eg, expression of hair growth-related genes and / or formation of hair follicle primordia by co-culture with mesenchymal cells).
  • the epithelial cell may be a cell derived from hair follicle tissue (for example, the outermost layer of the outer root sheath of the bulge region of the hair follicle tissue, and / or the hair matrix), and is a cell derived from skin tissue.
  • it may be a cell derived from a stem cell (eg, iPS stem cell, ES cell, or EG cell) in vitro.
  • the epithelial cells may be primary cells collected from a living body or may be pre-cultured cells (eg, subcultured cells and / or established cells). Epithelial cells are identified, for example, as cells that express cytokeratin. The epithelial cells are preferably epithelial stem cells. Epithelial stem cells are identified as cells that express, for example, cytokeratin 15 and / or CD34.
  • the epithelial cells are preferably derived from humans, but may be derived from non-human animals (animals other than humans).
  • the non-human animal is not particularly limited, but it is preferably a non-human vertebrate (vertebrate other than human).
  • the non-human vertebrate is not particularly limited, but it is preferably a non-human mammal.
  • Non-human mammals include, but are not limited to, primates (eg, monkeys), rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits), meats (eg, dogs, cats), or ungulates. (For example, pig, cow, horse, goat, sheep).
  • the co-culture of mesenchymal cells and epithelial cells is performed by mixing mesenchymal cells recovered after being cultured while applying an electric current and epithelial cells prepared separately from the mesenchymal cells. Culture.
  • the method of co-culture is not particularly limited as long as it is a method in which mesenchymal cells and epithelial cells aggregate to form hair follicle primordia, but, for example, the mesenchymal cells and the epithelial cells are It is preferred to form hair follicle primordia by co-culturing on a non-adhesive surface.
  • the cell non-adhesive surface is not particularly limited as long as it is a surface to which mesenchymal cells and epithelial cells do not substantially adhere. That is, the cell non-adhesive surface is, for example, a surface in which mesenchymal cells and epithelial cells are not adhered and is maintained in a floating state, or the mesenchymal cells and epithelial cells are loosely adhered, but treated with trypsin. It is a surface on which the mesenchymal cells and epithelial cells are easily detached by an operation of flowing a culture solution such as pipetting without performing enzyme treatment such as.
  • the culture container having a cell-non-adhesive surface for example, a commercially available multi-well plate having a cell-non-adhesive coating on the bottom surface of each well can be used.
  • the micro intaglio described in International Publication No. 2017/073625 can also be preferably used.
  • the mesenchymal cells and the epithelial cells are co-culturing the mesenchymal cells and the epithelial cells (for example, the mesenchymal cells and the epithelial cells are dispersed and mixed in a culture solution and cultured), the mesenchymal cells and the epithelial cells are
  • the hair follicle primordia are formed by spontaneous aggregation.
  • the hair follicle primordium formed is, for example, a mesenchymal cell aggregation portion formed by spontaneously aggregating mesenchymal cells with each other, and is formed by spontaneously aggregating epithelial cells with each other, and A part of the mesenchymal cell agglutination site is combined with the epithelial cell agglutination site.
  • the mesenchymal cell agglutinating part constitutes the inner core part
  • the epithelial cell agglutinating part may constitute the outer layer covering the outer periphery of the mesenchymal cell agglomerate ( So-called core-shell hair follicle primordia).
  • mesenchymal cells and epithelial cells may be dispersed and arranged (so-called random type hair follicle primordia).
  • non-adherent hair follicle primordia are produced on the non-cell-adhesive surface.
  • the hair follicle primordia in the non-adhesive state is a hair follicle primordium in a floating state that does not adhere to the cell non-adhesive surface, or loosely adheres to the cell non-adhesive surface, but is not treated with trypsin or the like. It is a hair follicle primordium that is easily detached from the cell non-adhesive surface by an operation of flowing a culture solution such as pipetting without performing enzyme treatment.
  • the hair follicle primordia formed in this method may be, for example, hair follicle primordia spheroids.
  • Hair follicle primordia spheroids are roughly spherical cell aggregates. Hair follicle primordia spheroids are formed in a non-adherent state and are easily recovered. Therefore, the hair follicle primordia spheroid is preferably used for transplantation into a living body.
  • the hair follicle primordia formed by the co-culture in this method are formed by the same method except that the mesenchymal cells produced by the same method as the activated mesenchymal cells are used except that no current is applied.
  • the activated hair follicle primordia contains activated epithelial cells as compared to the epithelial cells.
  • mesenchymal cells cultured while applying a current by this method are called activated mesenchymal cells, and were cultured in the same manner as the activated mesenchymal cells except that no current was applied.
  • the mesenchymal cells are called control mesenchymal cells
  • the hair follicle primordium formed by co-culture of the control mesenchymal cells and epithelial cells is called control hair follicle primordia
  • the activated mesenchyme The hair follicle primordia formed by the co-culture of lineage cells and epithelial cells are control hairs formed by the same method except that the control mesenchymal cells are used in place of the activated mesenchymal cells. It contains activated epithelial cells as compared to the epithelial cells contained in the envelope.
  • epithelial cells co-cultured with mesenchymal cells cultured while applying an electric current by this method were co-cultured with mesenchymal cells cultured under the same conditions except that the current was not applied. It is activated compared to epithelial cells.
  • activated mesenchymal cells it is possible to produce hair follicle primordia containing activated epithelial cells as compared with the case of using control mesenchymal cells.
  • activation of epithelial cells means improvement of hair growth-related properties of the epithelial cells.
  • the improvement of hair growth-related properties of epithelial cells is, for example, an increase in the expression level of hair growth-related genes of the epithelial cells, and / or a hair follicle progenitor formed using the epithelial cells.
  • Including improved hair growth properties of the group eg, increased number and / or length of hair that grows from the hair follicle primordium implanted in the body).
  • the activated epithelial cells contained in the hair follicle primordium formed by the present method are, for example, activated mesenchymal cells except that the expression level of at least one hair growth-related gene is not applied with current. Except that mesenchymal cells produced by the same method as described above were used, the number of epithelial cells included in the hair follicle primordium formed by the same method was higher than that of the epithelial cells.
  • the hair growth-related gene expressed in epithelial cells is not particularly limited as long as it is a gene related to the contribution of the epithelial cells to hair growth.
  • Wnt10b, LEF1 (Lymphoid Enhancer Factor-1), Shh ( Sonic hedgehog) and ⁇ -catenin may be one or more selected from the group consisting of.
  • the activated epithelial cells contained in the hair follicle primordia produced by the present method are the same method except that the expression level of the Wnt10b gene measured by RT-PCR is the same except that no current is applied. It may be 1.5 times or more, 2.0 times or more, and 2.5 times or more that of the epithelial cells co-cultured with the cultured mesenchymal cells. Or may be 3.0 times or more.
  • the hair follicle primordia formed by the co-culture in the present method are the same method except that the mesenchymal cells produced by the same method as the activated mesenchymal cells are used except that the current is not applied.
  • the activated mesenchymal cells are included as compared with the mesenchymal cells contained in the hair follicle primordia formed in (1). That is, the activated mesenchymal cells produced by this method maintain the activated state even after forming hair follicle primordia by co-culture with epithelial cells.
  • activated mesenchymal cells contained in the hair follicle primordia formed by this method are mesenchymal cells produced by the same method as activated mesenchymal cells except that no current is applied.
  • mesenchymal cells in which the expression level of at least one hair growth-related gene is increased compared to the mesenchymal cells contained in the hair follicle primordia formed by the same method except that cells were used. is there.
  • the activated mesenchymal cells contained in the hair follicle primordia produced by the present method are the same method except that the expression level of the Versican gene measured by RT-PCR is the same as that when no current is applied. It may be 1.5 times or more, and may be 2.0 times or more, that of the mesenchymal cells that have been cultivated in (1) and have formed the hair follicle primordia.
  • activated mesenchymal cells contained in the hair follicle primordia produced by this method are cultured by the same method except that the ALP gene expression level measured by RT-PCR is not applied with current. It may be 1.5 times or more, 2.0 times or more, or 2.5 times or more that of the mesenchymal cells forming the hair follicle primordia. , 3.0 times or more.
  • the production of the hair follicle primordia by the present method is the production of the hair follicle primordia containing activated epithelial cells and / or activated mesenchymal cells, that is, activated. It can be said that it is the production of hair follicle primordia.
  • the hair follicle primordia produced by this method can be directly used for research purposes, but are also preferably used for transplantation into a living body. That is, according to this method, a hair follicle primordia that produces hair by being transplanted into a living body is produced.
  • the living body is not particularly limited and may be a human or a non-human animal.
  • the non-human animal is not particularly limited, but it is preferably a non-human mammal.
  • Non-human mammals include, but are not limited to, for example, primates (eg, monkeys), rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits), meats (eg, dogs, cats), or It may be a hoof (eg, pig, cow, horse, goat, sheep).
  • the transplantation of the hair follicle primordia into the living body is preferably transplantation into the skin of the living body.
  • the transplant to the skin may be, for example, subcutaneous transplant or intradermal transplant.
  • hair follicle primordia and their transplantation into animals may be for medical or research purposes. That is, for example, for the treatment or prevention of a disease associated with hair loss, a hair follicle progenitor is produced for the purpose of transplanting into a human patient suffering from or possibly suffering from the disease, or the hair follicle progenitor is It may be transplanted to the human patient.
  • the diseases associated with hair loss are not particularly limited, and examples thereof include androgenetic alopecia (AGA), female androgenetic alopecia (Female Androgenetic Alopecia: FAGA), postpartum alopecia, diffuse alopecia, and seborrhea.
  • Alopecia degeneration, alopecia pityroides, tractive alopecia, dysmetabolic alopecia, compressive alopecia, alopecia areata, neuronal alopecia, alopecia, systemic alopecia, and symptomatic alopecia It may be one or more selected from the group.
  • a hair follicle progenitor is produced, or the hair follicle precursor is produced.
  • the group may be transplanted to a non-human animal.
  • a culture device having the same structure as the culture device 1 shown in FIG. 1 was manufactured as follows. First, the substrate was washed. That is, a cleaning solution was prepared by mixing an ammonia solution (25%) and a hydrogen peroxide solution (30%) at a volume ratio of 3: 1. Then, the slide glass used as the substrate was immersed in a cleaning liquid boiled at 300 ° C. for 5 minutes to remove impurities attached to the surface of the slide glass. Then, the operation of immersing the slide glass in ultrapure water boiled at 300 ° C. for 5 minutes was repeated twice to wash away the cleaning liquid.
  • an electrode for culturing mesenchymal cells on the surface was prepared. That is, a chromium thin film was formed on the surface of the slide glass washed as described above by using a sputtering device, and further a gold thin film was formed on the chromium thin film.
  • the slide glass on which the gold thin film is formed is immersed in a mixed solution of a 0.1 M polypyrrole solution and a 0.1 M p-toluenesulfonic acid solution, and a current of 0.25 mA / cm 2 is applied to the mixed solution for 4 minutes. Then, a polypyrrole film (conductive polymer film) was formed on the gold thin film. Then, the slide glass on which the polypyrrole film was formed was washed with ultrapure water and air-dried.
  • a culture well was prepared. That is, by adhering a 4-well chamber (Lab Tek II Chamber Slide) to a part of the surface of the slide glass on which the polypyrrole film has been formed, the frame (partition) of the 4-well chamber is partitioned and the polypyrrole film is separated.
  • Four culture wells were formed with a bottom consisting of the formed culture surface.
  • each culture well was washed with ethanol for sterilization. Then, a 0.03% collagen type I solution was added to each culture well and air-dried to form a collagen thin film on the polypyrrole film on the bottom surface of the culture well. In this way four culture surfaces were obtained, each area being about 2 cm 2 .
  • a resin base material of a size that closes the upper opening of each culture well was prepared, and one surface of the resin base material was covered with a platinum mesh.
  • this resin substrate was used as a lid for the culture wells, and the platinum mesh surface was fitted into the upper opening of each culture well so that the platinum mesh surface faces the bottom surface of each culture well. .
  • a galvanostat device was used as the power source. That is, on the surface of the slide glass on which the polypyrrole film is formed, the portion where the culture well is not formed (the portion where the frame body of the 4-well chamber is not arranged) is electrically connected to the power source through the metal wiring. The platinum mesh of each of the four resin substrates used as lids for the four culture wells was electrically connected to the power supply via metal wiring. Thus, a culture device used for culturing mesenchymal cells was manufactured.
  • Hair papilla cells were used as the mesenchymal cells. That is, commercially available human dermal papilla cells (PromoCell) were subcultured, and the human dermal papilla cells of the 4th to 6th passages (P4 to P6) were used for the experiment. As the culture medium, a commercially available culture medium for dermal papilla cells (PromoCell) was used.
  • Example 1-1 dermal papilla cells were seeded in each culture well, and the dermal papilla cells were cultured on the bottom surface (culture surface of the culture electrode) of each culture well for 3 days. During this culture period, a pulse current was applied to each culture well for 16 minutes from the time point 24 hours after seeding the hair papilla cells.
  • pulse current stimulation (1) first, a current of “+200 ⁇ A (current value per unit area of culture surface: about +100 ⁇ A / cm 2 )” was applied to each culture chamber for 0.05 seconds. Then, (2) then a current of “ ⁇ 200 ⁇ A (current value per unit area of the culture surface: about ⁇ 100 ⁇ A / cm 2 )” was applied for 0.05 seconds, and (3) thereafter, the current was not applied ( A current of 0 ⁇ A) for 0.1 second was applied as a pulse of the (1), (2) and (3).
  • Comparative Example 1-1 dermal papilla cells were cultured for 3 days by the same method except that no current was applied. Further, as Comparative Example 1-2, dermal papilla cells were cultured for 3 days by the same method except that no current was applied, using the culture apparatus manufactured by the same method except that the polypyrrole film was not formed.
  • each culture well was washed with a phosphate buffer (PBS). Then, the stained dermal papilla cells were observed with a phase contrast microscope and a fluorescence microscope.
  • PBS phosphate buffer
  • Example 1-1 As a result of observing the stained hair papilla cells with a phase-contrast microscope and a fluorescence microscope, it was found that almost all hairs in Example 1-1, Comparative Example 1-1 and Comparative Example 1-2 were irrespective of the presence or absence of electrical stimulation.
  • the papillary cells were stained with FDA, which confirmed that they were alive. That is, it was confirmed that the pulsed current stimulation used in this experiment did not affect the survival of dermal papilla cells.
  • Hair papilla cells were used as the mesenchymal cells. That is, commercially available human dermal papilla cells (PromoCell) were subcultured, and the human dermal papilla cells of P4 to P6 were used for the experiment. A culture medium for dermal papilla cells (PromoCell) was used as the culture medium.
  • Example 2-1 1.2 ⁇ 10 4 hair papilla cells were seeded in each culture well, and the hair papilla cells were cultured on the bottom surface (culture surface of the culture electrode) of each culture well for 3 days. did.
  • Example 2-1 the timing of starting to apply the pulse current (5 hours, 29 hours, 53 hours after seeding the hair papilla cells), the magnitude of the pulse current to be applied (0 ⁇ A) (0 ⁇ A / cm 2 -culture surface), 45 ⁇ A (22.5 ⁇ A / cm 2 ), 100 ⁇ A (50 ⁇ A / cm 2 ), 200 ⁇ A (100 ⁇ A / cm 2 ), and 300 ⁇ A (150 ⁇ A / cm 2 )), continue pulse current
  • the hair papilla cells were cultured while applying a pulsed current under a plurality of conditions in which the application time (16 minutes, 3 hours, 24 hours) was different.
  • Comparative Example 2-1 dermal papilla cells were cultured for 3 days by the same method except that no current was applied.
  • PCR analysis of hair growth-related genes The gene expression level of dermal papilla cells cultured for 3 days was analyzed by RT-PCR. Regarding the nucleotide sequences of the primers used in RT-PCR, for ALP (alkaline phosphatase), Forward Primer was “5′-ATTGACCACGGGCACCAT-3 ′” and Reverse Primer was “5′-CTCCACCGCCTCATGCA-3 ′”, which was used as a control. Regarding GAPDH, the Forward Primer was “5′-GCACCGTCAAGGCTgAGAAC-3 ′”, and the Reverse Primer was “5′-TGGTGAAGACGCCACGTGGA-3 ′”.
  • ALP alkaline phosphatase
  • FIG. 2A shows the results of analysis of the expression level of ALP gene in dermal papilla cells cultured while changing the timing at which the pulse current is applied. Specifically, FIG. 2A shows the timing when the pulse current was started to be applied to the papilla cells in Comparative Example 2-1 (“Control” in the figure) in which no current was applied and Example 2-1. , An example that was 5 hours after the hair papilla cells were seeded (“Day 0” in the figure), an example that was 29 hours (“Day 1” in the figure), and 53 For each of the examples (“Day 2” in the figure) at which time has elapsed, the relative gene expression level (vertical in the figure) when the gene expression level in Comparative Example 2-1 is set to “1”. Axis "Relative gene expression").
  • FIG. 2B shows the results of analysis of ALP gene expression in dermal papilla cells cultured by changing the magnitude of applied pulse current.
  • the magnitude of the pulse current applied to the dermal papilla cells in Comparative Example 2-1 (“Control” in the figure) in which no current was applied and Example 2-1 were different.
  • the pulse current was applied for 16 minutes from the time point when 29 hours had elapsed after seeding the hair papilla cells.
  • a pulse current (1) first, a positive current having a predetermined value (for example, a current of “+45 ⁇ A (about +22.5 ⁇ A / cm 2 )”) is applied for 0.05 seconds, and (2) then a predetermined current is applied.
  • a negative current of a value (for example, a current of “ ⁇ 45 ⁇ A (about ⁇ 22.5 ⁇ A / cm 2 )”) is applied for 0.05 seconds, and (3) after that, no current is applied (0 ⁇ A) for 0.1 seconds.
  • An electric current was applied to hold (1), (2), and (3) as one pulse.
  • the expression level of ALP gene in dermal papilla cells was increased as compared with the case where no current was applied.
  • the expression level of ALP gene in dermal papilla cells was significantly increased as compared with the case where no current was applied.
  • FIG. 2C shows the results of analysis of the ALP gene expression level of dermal papilla cells cultured by changing the duration of continuous pulse current application (which is also the total duration of pulse current application during the culture period).
  • the duration of continuous pulse current application which is also the total duration of pulse current application during the culture period.
  • the time when the pulse current was applied to the hair papilla cells was 16 minutes.
  • the comparative example for each of the examples (“16 min” in the figure), 3 hours (“3h” in the figure), and 24 hours (“24h” in the figure)
  • the relative gene expression level (the vertical axis "Relative gene expression” in the figure) is shown when the gene expression level in 2-1 is "1".
  • the expression level of ALP gene in the hair papilla cells was significantly increased as compared with the case where the current was not applied.
  • Hair papilla cells were used as the mesenchymal cells. That is, commercially available human dermal papilla cells (PromoCell) were subcultured, and the human dermal papilla cells of P4 to P6 were used for the experiment. A culture medium for dermal papilla cells (PromoCell) was used as the culture medium.
  • Example 3-1 1.2 ⁇ 10 4 hair papilla cells were seeded in each culture well, and the hair papilla cells were cultured on the bottom surface (culture surface of the culture electrode) of each culture well for 3 days. did. During this culture period, a pulse current of 200 ⁇ A (100 ⁇ A / cm 2 ) was applied to each culture well for 16 minutes from the point 29 hours after seeding the hair papilla cells.
  • the hair papilla cells and the epithelial cells are mixed so that the cell density of the hair papilla cells becomes 5 ⁇ 10 3 cells / well and the cell density of the epithelial cells becomes 1 ⁇ 10 4 cells / well. And seeded into each well of a 96-multiwell plate.
  • a mixed medium prepared by mixing mesenchymal cell culture medium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin) with HuMedia-KG2 at a volume ratio of 1: 1 was used.
  • this hair follicle primordium was formed by culturing hair papilla cells and epithelial cells in a mixed state for 3 days. That is, as the culture time passed, the cells spontaneously aggregated in each well to form spherical and floating hair follicle primordia.
  • this hair follicle primordia includes a hair papilla cell aggregation portion formed mainly by aggregation of hair papilla cells, and an epithelial cell aggregation portion formed mainly by aggregation of epithelial cells. A part of the hair papilla cell aggregation part and a part of the epithelial cell aggregation part were bonded.
  • Comparative Example 3-1 the same method was used except that hair papilla cells cultured by the same method were used in place of applying no current instead of the hair papilla cells cultured while applying current.
  • the hair follicle primordium was formed by co-culturing in.
  • PCR analysis of hair growth-related genes The gene expression level of the hair follicle primordium formed by the culture for 3 days was analyzed by RT-PCR.
  • the nucleotide sequences of the primers used in the RT-PCR were “5′-CCAGCAAGCACAAAATTTTCA-3 ′” for Reverse Primer, “5′-TGCACTGGATCTGTTTCTTCA-3 ′” for Reverse Primer, and LEF1 (Lymphr enhance Factor-1 ),
  • Forward Primer is “5′-CCCGATGACGGAAAGCAT-3 ′”
  • Reverse Primer is “5′-TCGAGTAGGAGGGTCCCTTGT-3 ′”
  • ALP Forward Primer is “5′-CATravermCGergic”.
  • FIG. 3 shows the results of analysis of gene expression levels in the hair follicle primordia.
  • each of the genes (Versican, LEF1, ALP, and Wnt10b) shown on the horizontal axis was formed using dermal papilla cells cultured in Comparative Example 3-1 without applying an electric current.
  • the expression level (black bar graph) of the hair follicle primordium (“Control” in the figure) thus treated was set to “1”
  • hair papilla cells cultured by applying an electric current in Example 3-1 were used.
  • the expression level of the hair follicle primordium (“200 ⁇ A” in the figure) formed using the above method (vertical axis “Relative gene expression” in the figure) (open bar graph) is shown.
  • both Versican and ALP which are characteristic of dermal papilla cells, showed that the gene expression level of the hair follicle primordia containing dermal papilla cells cultured by applying an electric current was It was significantly larger than that of cultured hair follicle primordia containing hair papilla cells.
  • the hair papilla cells cultured by applying an electric current are not only not only formed before the formation of hair follicle primordia after the culture, but also after formation of the hair follicle primordia by co-culture with epithelial cells. It was confirmed that the expression level of hair-growth-related genes was increased in the hair follicle primordia.
  • LEF1 and Wnt10b which are characteristic of epithelial cells, were also cultured without application of current, as the gene expression level of epithelial cells that formed hair follicle primordia along with hair papilla cells cultured with current application. It was larger than that of epithelial cells that formed hair follicle primordia with hair papilla cells, and in particular, the gene expression level of Wnt10b was remarkably large.
  • the epithelial cells that formed hair follicle primordia by co-culture with hair papilla cells cultured by applying an electric current showed a marked increase in the expression level of the hair growth-related gene in the hair follicle primordia. That is, an unexpected remarkable effect was confirmed.
  • FIGS. 4A and 4B respectively show hair follicle primordia formed using hair papilla cells cultured by applying an electric current and hair papilla cells cultured without applying an electric current.
  • Fig. 3 shows a photograph of hair regenerated from the hair follicle primordia taken 30 days after the transplantation of the hair follicle primordia into the mouse.
  • a hair follicle primordia formed using hair papilla cells cultured by applying an electric current (“Example 3-1” in the figure), and cultured without applying an electric current.
  • Hair follicle primordia formed by using dermal papilla cells (“Comparative Example 3-1” in the figure) 30 days after transplantation into mice, The results of counting the number of hairs (vertical axis “number of hair growth” in the figure) are shown.
  • the number of hairs formed from the hair follicle primordia formed using hair papilla cells cultured by applying an electric current was about 40.
  • the number of hairs formed from the hair follicle primordia formed by using hair papilla cells cultured without applying an electric current was about 18 It was a book.
  • the hair follicle primordia produced using hair papilla cells cultured by applying an electric current compared with the hair follicle primordia formed using hair papilla cells cultured without applying an electric current. It was confirmed that the hair growth ability when transplanted into a living body was remarkably excellent.

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Abstract

発毛関連特性を向上させる間葉系細胞の培養方法、活性化間葉系細胞の製造方法、毛包原基の製造方法、間葉系細胞の活性化方法、及び上皮系細胞の活性化方法を提供する。間葉系細胞の培養方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することを含む。活性化間葉系細胞の製造方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することにより、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞に比べて活性化された前記間葉系細胞を得ることを含む。

Description

間葉系細胞の培養方法、活性化間葉系細胞の製造方法、毛包原基の製造方法、間葉系細胞の活性化方法、及び上皮系細胞の活性化方法
　本発明は、間葉系細胞の培養方法、活性化間葉系細胞の製造方法、毛包原基の製造方法、間葉系細胞の活性化方法、及び上皮系細胞の活性化方法に関する。
　生体外で毛包原基を形成し、当該毛包原基を生体に移植して毛髪を再生させる技術の開発が進められている。
　特許文献１には、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備えることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法が記載されている。
　特許文献２には、毛乳頭細胞を塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養し、継代する、及び毛乳頭細胞をスフェア化させる、ことを特徴とする毛乳頭培養方法が記載されている。
　特許文献３には、ＦＧＦ系材料、ＢＭＰ－２／ＢＭＰ－４系材料及びＷＮＴ系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養することを特徴とする、毛誘導能を維持した毛乳頭細胞の培養方法が記載されている。
国際公開第２０１７／０７３６２５号 特開２００７－２７４９４９号公報 国際公開第２０１０／０２１２４５号
　しかしながら、毛乳頭細胞の発毛関連特性を効果的に向上させる培養方法は、未だ確立されてはいない。
　本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、発毛関連特性を向上させる間葉系細胞の培養方法、活性化間葉系細胞の製造方法、毛包原基の製造方法、間葉系細胞の活性化方法、及び上皮系細胞の活性化方法を提供することをその目的の一つとする。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る間葉系細胞の培養方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することを含む。本発明によれば、間葉系細胞の発毛関連特性を向上させる、間葉系細胞の培養方法が提供される。
　前記方法においては、前記電流は、パルス電流であることとしてもよい。前記方法においては、第一の電極としての前記電極、及び前記第一の電極に対向する位置に配置された第二の電極を介して前記電流を印加することとしてもよい。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る活性化間葉系細胞の製造方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することにより、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞に比べて活性化された前記間葉系細胞を得ることを含む。本発明によれば、発毛関連特性が向上した活性化間葉系細胞の製造方法が提供される。
　前記方法においては、前記電流は、パルス電流であることとしてもよい。前記方法においては、第一の電極としての前記電極、及び前記第一の電極に対向する位置に配置された第二の電極を介して前記電流を印加することとしてもよい。前記方法において、前記活性化された間葉系細胞は、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞のそれより増加した間葉系細胞であることとしてもよい。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る毛包原基の製造方法は、前記いずれかの方法により製造された間葉系細胞と、上皮系細胞とを共培養することにより毛包原基を形成することを含む。本発明によれば、発毛関連特性が効果的に向上した毛包原基の製造方法が提供される。
　前記方法においては、前記間葉系細胞と前記上皮系細胞とを細胞非接着性表面上で共培養することにより前記毛包原基を形成することとしてもよい。前記方法において、前記共培養により形成された前記毛包原基は、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる上皮系細胞に比べて、活性化された前記上皮系細胞を含むこととしてもよい。この場合、前記活性化された上皮系細胞は、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる上皮系細胞のそれより増加している上皮系細胞であることとしてもよい。
　前記方法において、前記共培養により形成された前記毛包原基は、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる当該間葉系細胞に比べて、活性化された前記間葉系細胞を含むこととしてもよい。この場合、前記活性化された間葉系細胞は、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる当該間葉系細胞に比べて、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が増加している間葉系細胞であることとしてもよい。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る間葉系細胞の活性化方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することにより、前記間葉系細胞を活性化する。本発明によれば、間葉系細胞の発毛関連特性を効果的に向上させる、間葉系細胞の活性化方法が提供される。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る上皮系細胞の活性化方法は、間葉系細胞と上皮系細胞との共培養により形成される毛包原基において、前記間葉系細胞として、前記いずれかの方法により製造された間葉系細胞を用いることにより、前記毛包原基に含まれる前記上皮系細胞を活性化する。本発明によれば、上皮系細胞の発毛関連特性を効果的に向上させる、上皮系細胞の活性化方法が提供される。
　本発明によれば、発毛関連特性を向上させる間葉系細胞の培養方法、活性化間葉系細胞の製造方法、毛包原基の製造方法、間葉系細胞の活性化方法、及び上皮系細胞の活性化方法が提供される。
本実施形態において用いられる培養装置の一例について、その断面を概略的に示す説明図である。 本実施形態に係る実施例２において、電流を印加し始めるタイミングを変えた場合の毛乳頭細胞の遺伝子発現量を評価した結果を示す説明図である。 本実施形態に係る実施例２において、印加する電流値を変えた場合の毛乳頭細胞の遺伝子発現量を評価した結果を示す説明図である。 本実施形態に係る実施例２において、電流を印加する時間を変えた場合の毛乳頭細胞の遺伝子発現量を評価した結果を示す説明図である。 本実施形態に係る実施例３において、毛包原基に含まれる毛乳頭細胞及び上皮系細胞の遺伝子発現量を評価した結果を示す説明図である。 本実施形態に係る実施例３において、電流を印加して培養した毛乳頭細胞を用いて形成され、マウスに移植された毛包原基からの発毛の様子を撮影した写真を示す説明図である。 本実施形態に係る実施例３において、電流を印加することなく培養した毛乳頭細胞を用いて形成され、マウスに移植された毛包原基からの発毛の様子を撮影した写真を示す説明図である。 本実施形態に係る実施例３において、マウスに移植された毛包原基からの発毛数を評価した結果を示す説明図である。
　以下に、本発明の一実施形態に係る方法（以下、「本方法」という。）について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。
　本方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、当該電極を介して電流を印加しながら培養することを含む、間葉系細胞の培養方法を包含する。すなわち、本発明の発明者らは、間葉系細胞の発毛関連特性を向上させる技術的手段について鋭意検討を重ねた結果、電気刺激を与えながら間葉系細胞を培養することにより、当該間葉系細胞が活性化され、その発毛関連特性が効果的に向上することを独自に見出し、本発明を完成するに至った。
　このため、本方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、当該電極を介して電流を印加しながら培養することにより、当該間葉系細胞を活性化する、間葉系細胞の活性化方法を包含する。
　また、本方法は、電極の表面に接着した間葉系細胞を、当該電極を介して電流を印加しながら培養することにより、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞に比べて活性化された当該間葉系細胞を得ることを含む、活性化間葉系細胞の製造方法を包含する。
　さらに、本方法は、上記本方法により製造された間葉系細胞と、上皮系細胞とを共培養することにより毛包原基を形成することを含む、毛包原基の製造方法を包含する。
　また、本発明の発明者らは、上記活性化された間葉系細胞と上皮系細胞とを共培養して毛包原基を形成することにより、意外にも、当該毛包原基に含まれる上皮系細胞が活性化されることを独自に見出した。
　このため、本方法は、間葉系細胞と上皮系細胞との共培養により形成される毛包原基において、当該間葉系細胞として、上記本方法により製造された間葉系細胞を用いることにより、当該毛包原基に含まれる当該上皮系細胞を活性化する、上皮系細胞の活性化方法を包含する。
　本方法で用いられる間葉系細胞は、発毛関連特性（例えば、発毛関連遺伝子の発現、及び／又は、上皮系細胞との共培養による毛包原基の形成）を有するものであれば特に限られない。間葉系細胞は、成体毛包組織（例えば、毛乳頭及び／又は毛球部毛根鞘）に由来する細胞であってもよく、皮膚組織（胎児、幼体、成体のいずれの皮膚組織であってもよい。）に由来する細胞であってもよく、生体外で幹細胞（例えば、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、又は胚性生殖（ＥＧ）細胞）から誘導された細胞であってもよい。間葉系細胞は、生体から採取された初代細胞であってもよく、予め培養された細胞（例えば、継代培養された細胞、及び／又は、株化された細胞）であってもよい。間葉系細胞は、例えば、Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）を発現する細胞として特定される。具体的に、間葉系細胞としては、毛乳頭細胞及び／又は毛球部毛根鞘細胞が好ましく用いられる。毛乳頭細胞及び毛球部毛根鞘細胞は、Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＡＬＰを発現する。
　間葉系細胞は、ヒト由来であることが好ましいが、非ヒト動物（ヒト以外の動物）由来であってもよい。非ヒト動物は、特に限られないが、非ヒト脊椎動物（ヒト以外の脊椎動物）であることが好ましい。非ヒト脊椎動物は、特に限られないが、非ヒト哺乳類であることが好ましい。非ヒト哺乳類は、特に限られないが、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）であってもよい。
　間葉系細胞の培養に用いる培養液は、当該間葉系細胞の生存及び発毛関連特性の維持に適した組成のものであれば特に限られず、例えば、商業的に入手可能な間葉系細胞培養用の培養液が好ましく用いられる。
　本方法で用いられる電極（以下、「培養電極」という。）の間葉系細胞が接着する表面（以下、「培養表面」という。）は、間葉系細胞を接着させて培養することができ、且つ電流を印加できる導電性表面であれば特に限られない。培養電極は、金属膜を含むことが好ましい。この場合、金属膜を構成する金属は、当該培養電極に導電性を付与するものであれば特に限られないが、例えば、金、白金、銀、銅、チタン、クロム及びニッケルからなる群より選択される１以上、又はこれらの合金が好ましく用いられる。
　培養電極は、導電性高分子膜を含んでもよい。すなわち、例えば、培養電極は、金属膜と、当該金属膜上に形成された導電性高分子膜とを含んでもよい。導電性高分子膜を構成する導電性高分子は、特に限られないが、例えば、ポリピロール系高分子、ポリチオフェン系高分子、ポリアニリン系高分子、ポリアセチレン系高分子、及びポリパラフェニレン系高分子からなる群より選択される１以上が好ましく用いられる。
　培養電極は、細胞接着性物質膜を含んでもよい。すなわち、例えば、培養電極は、金属膜と、当該金属膜上に形成された細胞接着性物質膜とを含んでもよい。また、例えば、培養電極は、金属膜と、当該金属膜上に形成された導電性高分子膜と、当該導電性高分子膜上に形成された細胞接着性物質膜とを含んでもよい。細胞接着性物質は、間葉系細胞の電極表面への接着を促進する物質であれば特に限られないが、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックス成分、細胞接着性を示す特定のアミノ酸配列（例えば、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸（いわゆるＲＧＤ）配列等）、細胞接着性を示す特定の糖鎖配列が好ましく用いられる。
　なお、培養電極が細胞接着性物質膜を含まない場合であっても、例えば、当該培養電極の培養表面に接する培養液に含まれる細胞接着性物質が当該培養表面に吸着することで、間葉系細胞は、当該培養表面に接着することができる。すなわち、培養表面は、培養液と接した状態で細胞接着性を示す導電性表面であれば特に限られない。
　間葉系細胞の培養表面への接着は、当該培養表面上に当該間葉系細胞を播種し、当該培養表面上で当該間葉系細胞を保持することにより行う。具体的に、間葉系細胞を含む培養液を培養表面上に滴下し、当該培養液中で当該培養表面上に沈降した当該間葉系細胞を、当該間葉系細胞の培養に適した条件（例えば、間葉系細胞の培養に適した温度、培養液に接する気相組成、培養液組成）で所定時間保持することにより、当該間葉系細胞を当該培養表面に接着させる。なお、培養表面に接着する前の間葉系細胞は球状であるが、当該培養表面に接着した間葉系細胞は、接着前に比べて扁平な形状を示す。
　本方法における間葉系細胞の培養は、当該間葉系細胞が接着した培養電極を介して電流を印加しながら行う。電流を印加する条件は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、培養後の間葉系細胞の少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、当該電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞のそれより増加する条件が好ましく用いられる。
　電流の印加を開始するタイミングは、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、間葉系細胞を電極表面に播種してから６時間以上経過した後であることが好ましく、１０時間以上経過した後であることがより好ましく、１５時間以上経過した後であることがより一層好ましく、２０時間以上経過した後であることが特に好ましい。
　また、電流の印加を開始するタイミングは、例えば、間葉系細胞を電極表面に播種してから１７０時間経過前であることが好ましく、１２０時間経過前であることがより好ましく、８０時間経過前であることがより一層好ましく、５０時間経過前であることが特に好ましい。電流の印加を開始するタイミングは、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。
　電流を印加する総時間（培養期間中に複数回に分けて電流を印加する場合は、当該複数回の電流印加時間の合計）は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、５分以上であることが好ましく、１０分以上であることがより好ましく、１５分以上であることがより一層好ましく、２０分以上であることが特に好ましい。
　また、電流を印加する総時間は、例えば、１２０時間以下であることが好ましく、８０時間以下であることがより好ましく、５０時間以下であることがより一層好ましく、２０時間以下であることが特に好ましい。電流を印加する総時間は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。
　１回の電気刺激において電流を印加する時間（培養期間中に複数回に分けて電流を印加する場合は、当該複数回の電流印加のうち１回において電流を継続的に印加する時間）は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、５分以上であることが好ましく、１０分以上であることがより好ましく、１５分以上であることがより一層好ましく、２０分以上であることが特に好ましい。
　また、１回の電気刺激において電流を印加する時間は、例えば、１２０時間以下であることが好ましく、８０時間以下であることがより好ましく、５０時間以下であることがより一層好ましく、２０時間以下であることが特に好ましい。１回の電気刺激において電流を印加する時間は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。
　培養表面（電極表面）の単位面積（ｃｍ２）当たりに印加する電流値は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、１０μＡ／ｃｍ２以上であることが好ましく、２０μＡ／ｃｍ２以上であることがより好ましく、３０μＡ／ｃｍ２以上であることがより一層好ましく、４０μＡ／ｃｍ２以上であることが特に好ましい。
　また、印加する電流値は、例えば、１０００μＡ／ｃｍ２以下であることが好ましく、７００μＡ／ｃｍ２以下であることがより好ましく、４００μＡ／ｃｍ２以下であることがより一層好ましく、２００μＡ／ｃｍ２以下であることが特に好ましい。印加する電流値は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。
　印加する電流は、パルス電流であることが好ましい。パルス電流は、パルス的に印加される電流であれば特に限られないが、例えば、１つのパルスが次の（１）、（２）及び（３）から構成され、下記（１）及び（２）から構成され、又は下記（１）及び（３）から構成されることとしてもよい：（１）まず第一の値のプラス電流又はマイナス電流を第一の時間印加し；、（２）次いで第二の値のマイナス電流又はプラス電流を第二の時間印加し；、（３）続く第三の時間は電流を印加しない。なお、上記（１）の「プラス電流又はマイナス電流」及び（２）の「マイナス電流又はプラス電流」との記載は、（１）でプラス電流を印加した場合は（２）でマイナス電流を印加し、（１）でマイナス電流を印加した場合は（２）でプラス電流を印加することを意味する。
　上述したパルス電流の第一の値と第二の値とは異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。また、第一の時間と第二の時間とは異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。第三の時間は、第一の時間及び／又は第二の時間と異なっていてもよいし、同一であってもよい。
　パルス電流の周波数は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、２Ｈｚ以上であることが好ましく、３Ｈｚ以上であることがより好ましく、４Ｈｚ以上であることがより一層好ましく、５Ｈｚ以上であることが特に好ましい。なお、１Ｈｚは、１秒間に１回のパルス電流を印加することを意味する。
　また、パルス電流の周波数は、例えば、１００Ｈｚ以下であることが好ましく、５０Ｈｚ以下であることがより好ましく、２５Ｈｚ以下であることがより一層好ましく、１０Ｈｚ以下であることが特に好ましい。パルス電流の周波数は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。
　培養電極を介した電流の印加は、例えば、第一の電極としての当該培養電極と、第二の電極とを用いて行う。この場合、例えば、第一の電極（培養電極）を作用極、第二の電極を対極として用いる。また、参照極を用いることとしてもよい。第一の電極と第二の電極との位置関係は、当該第一の電極及び当該第二の電極が、間葉系細胞を含む培養液と接していれば特に限られない。
　本方法においては、例えば、第一の電極としての培養電極、及び当該第一の電極に対向する位置に配置された第二の電極を介して電流を印加することとしてもよい。すなわち、この場合、第一の電極と第二の電極との間には、当該第一の電極の培養表面に接着した間葉系細胞、及び当該第一の電極及び第二の電極と接し当該間葉系細胞を含む培養液が配置される。
　図１には、電流を印加しながら間葉系細胞を培養するための培養装置の一例を概略的に示す。図１に示す例において、培養装置１は、作用極として用いられる培養電極である第一の電極１０と、当該第一の電極１０の培養表面１１と対向する位置に配置された、対極として用いられる第二の電極２０とを含む。第一の電極１０は、ガラス板等で構成される基板１２上に形成された金薄膜等の金属膜から構成される。第二の電極２０は、白金等の金属から構成される。
　培養装置１は、複数（４つ）の培養ウェル３０を含む。各培養ウェル３０は、第一の電極１０上に培養液Ｍを保持するための隔壁３１を有している。各培養ウェル３０において、間葉系細胞Ｃは、培養液Ｍ中で培養表面１１に接着して培養される。第一の電極１０及び第二の電極２０は、それぞれ電源４０に接続される。すなわち、第一の電極１０は第一の配線４１によって、また、第二の電極２０は第二の配線４２によって、それぞれ電源４０に接続される。図１に示す例では、４つの培養ウェル３０の各々の第二の電極２０が配線４２によって電源４０に接続されるため、当該４つの培養ウェル３０には異なる条件で電流を印加することもできる。
　そして、電源４０によって、各培養ウェル３０における第一の電極１０と第二の電極２０との間に所定の電位を印加することにより、当該第一の電極１０及び第二の電極２０を介して電流を印加することができる。本方法においては、このような培養装置を用いて、電流を印加しながら、当該培養電極の培養表面に接着した間葉系細胞を培養することとしてもよい。
　培養表面上で間葉系細胞を培養する時間は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、５時間以上であることが好ましく、２０時間以上であることがより好ましく、５０時間以上であることがより一層好ましく、７０時間以上であることが特に好ましい。
　また、培養表面上で間葉系細胞を培養する時間は、例えば、４００時間以下であることが好ましく、３００時間以下であることがより好ましく、２００時間以下であることがより一層好ましく、１００時間以下であることが特に好ましい。培養表面上で間葉系細胞を培養する時間は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。
　培養電極を介して電流を印加しながら、当該培養電極の培養表面に接着した間葉系細胞を培養することにより、当該間葉系細胞は活性化される。すなわち、電流を印加しながら培養することにより、活性化された間葉系細胞が得られる。
　ここで、間葉系細胞の活性化は、当該間葉系細胞の発毛関連特性の向上を意味する。
　具体的に、間葉系細胞の発毛関連特性の向上は、例えば、当該間葉系細胞の発毛関連遺伝子の発現量の増加、及び／又は、当該間葉系細胞を用いて形成された毛包原基の発毛特性の向上（例えば、生体に移植された当該毛包原基から生える毛の数及び／又は長さの増加）を含む。
　すなわち、本方法により得られる活性化された間葉系細胞は、例えば、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞のそれより増加した間葉系細胞である。
　間葉系細胞において発現する発毛関連遺伝子は、当該間葉系細胞の発毛への寄与に関連する遺伝子であれば特に限られないが、例えば、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、ＡＬＰ、ＢＭＰ４、Ｎｅｘｉｎ及びＮｏｔｃｈ１からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。
　具体的に、本方法により得られる活性化間葉系細胞は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲで測定されるＡＬＰ遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞のそれの１．５倍以上であり、又は、２．０倍以上である。
　本方法により製造された活性化間葉系細胞は、様々な用途に供することができる。すなわち、この活性化間葉系細胞は、例えば、そのまま培養電極の培養表面に接着した状態で、又は当該培養表面から回収されて、研究用途や、移植等の医療用途に供される。
　具体的に、例えば、活性化間葉系細胞は、生体外における毛包原基の形成に好ましく用いられる。すなわち、本方法により製造された活性化間葉系細胞と、上皮系細胞とを共培養することにより、発毛関連特性に優れた毛包原基を形成することができる。
　本方法で毛包原基の形成に用いられる上皮系細胞は、発毛関連特性（例えば、発毛関連遺伝子の発現、及び／又は、間葉系細胞との共培養による毛包原基の形成）を有するものであれば特に限られない。上皮系細胞は、毛包組織（例えば、毛包組織のバルジ領域の外毛根鞘最外層、及び又は、毛母基部）に由来する細胞であってもよく、皮膚組織に由来する細胞であってもよく、生体外で幹細胞（例えば、ｉＰＳ幹細胞、ＥＳ細胞、又はＥＧ細胞）から誘導された細胞であってもよい。上皮系細胞は、生体から採取された初代細胞であってもよく、予め培養された細胞（例えば、継代培養された細胞、及び／又は、株化された細胞）であってもよい。上皮系細胞は、例えば、サイトケラチンを発現する細胞として特定される。上皮系細胞は、上皮幹細胞であることが好ましい。上皮幹細胞は、例えば、サイトケラチン１５、及び／又は、ＣＤ３４を発現する細胞として特定される。
　上皮系細胞は、ヒト由来であることが好ましいが、非ヒト動物（ヒト以外の動物）由来であってもよい。非ヒト動物は、特に限られないが、非ヒト脊椎動物（ヒト以外の脊椎動物）であることが好ましい。非ヒト脊椎動物は、特に限られないが、非ヒト哺乳類であることが好ましい。非ヒト哺乳類は、特に限られないが、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）であってもよい。
　間葉系細胞と上皮系細胞との共培養は、電流を印加しながら培養された後に回収された間葉系細胞と、当該間葉系細胞とは別に用意された上皮系細胞とを混合して培養することにより行う。
　共培養の方法は、間葉系細胞及び上皮系細胞が凝集して毛包原基を形成する方法であれば特に限られないが、例えば、当該間葉系細胞と当該上皮系細胞とを細胞非接着性表面上で共培養することにより毛包原基を形成することが好ましい。
　ここで、細胞非接着性表面は、間葉系細胞及び上皮系細胞が実質的に接着しない表面であれば特に限られない。すなわち、細胞非接着性表面は、例えば、間葉系細胞及び上皮系細胞が接着せず浮遊状態で維持される表面、又は、当該間葉系細胞及び上皮系細胞が緩く接着するものの、トリプシン処理等の酵素処理を施すことなく、ピペッティング等の培養液を流動させる操作で当該間葉系細胞及び上皮系細胞が容易に脱離する表面である。細胞非接着性表面を有する培養容器としては、例えば、商業的に入手可能な、各ウェルの底面に細胞非接着コーティングが施されたマルチウェルプレートを用いることができる。また、国際公開第２０１７／０７３６２５号に記載されたマイクロ凹版も好ましく用いることができる。
　間葉系細胞と上皮系細胞とを共培養する（例えば、間葉系細胞及び上皮系細胞を培養液中に分散し混合して培養する）ことにより、当該間葉系細胞及び上皮系細胞が自発的に凝集して、毛包原基が形成される。形成された毛包原基は、例えば、間葉系細胞同士が自発的に凝集して形成された間葉系細胞凝集部と、上皮系細胞同士が自発的に凝集して形成され、且つその一部が当該間葉系細胞凝集部の一部と結合した上皮系細胞凝集部と、を含む。
　毛包原基においては、例えば、間葉系細胞凝集部が内核部を構成するとともに、上皮系細胞凝集部が、当該間葉系細胞凝集塊の外周を覆う外層を構成することとしてもよい（いわゆるコアシェル型の毛包原基）。また、毛包原基においては、例えば、間葉系細胞と上皮系細胞とがそれぞれ分散して配置されることとしてもよい（いわゆるランダム型の毛包原基）。
　細胞非接着表面上では、非接着状態の毛包原基が製造される。ここで、非接着状態の毛包原基とは、細胞非接着表面に接着せず浮遊状態にある毛包原基、又は、当該細胞非接着表面に緩く接着しているが、トリプシン処理等の酵素処理を施すことなく、ピペッティング等の培養液を流動させる操作で当該細胞非接着性表面から容易に脱離する毛包原基である。
　本方法において形成される毛包原基は、例えば、毛包原基スフェロイドであることとしてもよい。毛包原基スフェロイドは、略球状の細胞凝集塊である。毛包原基スフェロイドは、非接着状態で形成され、容易に回収される。このため、毛包原基スフェロイドは、生体への移植に好ましく用いられる。
　本方法における共培養により形成された毛包原基は、電流を印加しない以外は活性化間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる上皮系細胞に比べて、活性化された上皮系細胞を含む。
　具体的に、本方法により電流を印加しながら培養された間葉系細胞を活性化間葉系細胞と呼び、電流を印加しない以外は当該活性化間葉系細胞と同一の方法で培養された間葉系細胞を対照間葉系細胞と呼び、当該対照間葉系細胞と上皮系細胞との共培養により形成された毛包原基を対照毛包原基と呼ぶ場合、当該活性化間葉系細胞と上皮系細胞との共培養により形成された毛包原基は、当該活性化間葉系細胞に代えて当該対照間葉系細胞を用いた以外は同一の方法で形成された対照毛包原基に含まれる上皮系細胞に比べて、活性化された上皮系細胞を含む。
　すなわち、本方法により電流を印加しながら培養された間葉系細胞と共培養された上皮系細胞は、当該電流を印加しない以外は同一の条件で培養された間葉系細胞と共培養された上皮系細胞に比べて、活性化される。換言すれば、活性化間葉系細胞を用いることにより、対照間葉系細胞を用いる場合に比べて活性化された上皮系細胞を含む毛包原基を製造することができる。
　ここで、上皮系細胞の活性化は、当該上皮系細胞の発毛関連特性の向上を意味する。具体的に、上皮系細胞の発毛関連特性の向上は、例えば、当該上皮系細胞の発毛関連遺伝子の発現量の増加、及び／又は、当該上皮系細胞を用いて形成された毛包原基の発毛特性の向上（例えば、生体に移植された当該毛包原基から生える毛の数及び／又は長さの増加）を含む。
　すなわち、本方法により形成された毛包原基に含まれる活性化された上皮系細胞は、例えば、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は活性化間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる上皮系細胞のそれより増加している上皮系細胞である。
　上皮系細胞において発現する発毛関連遺伝子は、当該上皮系細胞の発毛への寄与に関連する遺伝子であれば特に限られないが、例えば、Ｗｎｔ１０ｂ、ＬＥＦ１（Lymphoid Enhancer Factor-1）、Ｓｈｈ（Sonic hedgehog）及びβ－Ｃａｔｅｎｉｎからなる群より選択される１以上であることとしてもよい。
　具体的に、本方法により製造された毛包原基に含まれる活性化上皮系細胞は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲで測定されるＷｎｔ１０ｂ遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞と共培養された上皮系細胞のそれの１．５倍以上であることとしてもよく、２．０倍以上であることとしてもよく、２．５倍以上であることとしてもよく、３．０倍以上であることとしてもよい。
　このように、電気刺激により活性化された間葉系細胞と共培養することにより上皮系細胞が活性化されるという効果は、従来技術からは予想することができない意外な効果である。
　また、本方法における共培養により形成された毛包原基は、電流を印加しない以外は活性化間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる当該間葉系細胞に比べて、活性化された間葉系細胞を含む。すなわち、本方法により製造された活性化間葉系細胞は、上皮系細胞との共培養によって毛包原基を形成した後においても、活性化された状態を維持している。
　具体的に、本方法により形成された毛包原基に含まれる活性化された間葉系細胞は、電流を印加しない以外は活性化間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる当該間葉系細胞に比べて、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が増加している間葉系細胞である。
　具体的に、本方法により製造された毛包原基に含まれる活性化間葉系細胞は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲで測定されるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は同一の方法で培養され毛包原基を形成した間葉系細胞のそれの１．５倍以上であることとしてもよく、２．０倍以上であることとしてもよい。
　また、例えば、本方法により製造された毛包原基に含まれる活性化間葉系細胞は、ＲＴ－ＰＣＲで測定されるＡＬＰ遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は同一の方法で培養され毛包原基を形成した間葉系細胞のそれの１．５倍以上であることとしてもよく、２．０倍以上であることとしてもよく、２．５倍以上であることとしてもよく、３．０倍以上であることとしてもよい。
　このように、本方法による毛包原基の製造は、活性化された上皮系細胞、及び／又は、活性化された間葉系細胞を含む毛包原基の製造、すなわち、活性化された毛包原基の製造であるともいえる。
　本方法により製造された毛包原基は、そのまま研究用途に供することもできるが、生体への移植用途にも好ましく用いられる。すなわち、本方法によれば、生体に移植されることで毛が生える毛包原基が製造される。
　本方法により製造された毛包原基を生体に移植して当該毛包原基から毛を生やす場合、当該生体は特に限られず、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物は特に限られないが、非ヒト哺乳類であることが好ましい。非ヒト哺乳類は、特に限られないが、例えば、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）であってもよい。毛包原基の生体への移植は、当該生体の皮膚への移植であることが好ましい。皮膚への移植は、例えば、皮下移植であってもよいし、皮内移植であってもよい。
　毛包原基の製造及びその動物への移植は、医学的用途であってもよいし、研究用途であってもよい。すなわち、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防のために、当該疾患を患っている又は患う可能性のあるヒト患者に移植する目的で毛包原基を製造し、又は当該毛包原基を当該ヒト患者に移植することとしてもよい。
　脱毛を伴う疾患は、特に限られないが、例えば、男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ　Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、及び症候性脱毛症からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。
　また、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防に使用され得る物質の探索、及び／又は当該疾患の機構に関与する物質の探索のために、毛包原基を製造し、又は当該毛包原基を非ヒト動物に移植することとしてもよい。
　次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
［培養装置］
　図１に示す培養装置１と同様の構造を有する培養装置を以下のようにして製造した。まず、基板を洗浄した。すなわち、アンモニア液（２５％）と過酸化水素水（３０％）とを３：１の体積比で混合して洗浄液を調製した。次いで、基板として用いるスライドガラスを、３００℃で沸騰させた洗浄液中に５分間浸漬することで、当該スライドガラスの表面に付着している不純物を除去した。その後、スライドガラスを、３００℃で沸騰させた超純水に５分間浸漬する操作を２回繰り返すことで、洗浄液を洗い流した。
　次に、その表面で間葉系細胞を培養する電極を作製した。すなわち、上述のようにして洗浄したスライドガラスの表面に、スパッタリング装置を用いてクロム薄膜を形成し、さらに、当該クロム薄膜上に金薄膜を形成した。金薄膜が形成されたスライドガラスを、０．１Ｍポリピロール溶液と０．１Ｍｐ－トルエンスルホン酸溶液との混合液に浸漬し、当該混合液に０．２５ｍＡ／ｃｍ２の電流を４分間印加することで、当該金薄膜上にポリピロール膜（導電性高分子膜）を形成した。その後、ポリピロール膜が形成されたスライドガラスを超純水で洗浄し、風乾した。
　そして、培養ウェルを作製した。すなわち、ポリピロール膜が形成されたスライドガラス表面の一部に、４ウェルチャンバー（Ｌａｂ　Ｔｅｋ　ＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅ）を接着させることで、当該４ウェルチャンバーの枠体（隔壁）で仕切られ、当該ポリピロール膜が形成された培養表面からなる底面を有する４つの培養ウェルを形成した。
　その後、各培養ウェル内をエタノールで洗浄することで滅菌した。次いで、各培養ウェル内に、０．０３％コラーゲンタイプＩ溶液を加え、風乾させることで、当該培養ウェルの底面のポリピロール膜上にコラーゲン薄膜を形成した。こうして、各々の面積が約２ｃｍ２である４つの培養表面を得た。
　また、各培養ウェルの上部開口を塞ぐサイズの樹脂基材を用意し、当該樹脂基材の一方の表面を白金メッシュで覆った。後述する間葉系細胞の培養においては、この樹脂基材を培養ウェルの蓋として用い、その白金メッシュ表面が各培養ウェルの底面と対向するように、当該各培養ウェルの上部開口に嵌め込んだ。
　また、電源としてガルバノスタット装置を用いた。すなわち、ポリピロール膜が形成されたスライドガラス表面のうち、培養ウェルが形成されていない部分（４ウェルチャンバーの枠体が配置されていない部分）を金属配線を介して電源に電気的に接続するとともに、４つの培養ウェルの蓋として用いる４つの樹脂基材の各々の白金メッシュを金属配線を介して当該電源に電気的に接続した。こうして、間葉系細胞の培養に用いる培養装置を製造した。
［間葉系細胞の調製］
　間葉系細胞としては、毛乳頭細胞を用いた。すなわち、商業的に入手可能なヒト毛乳頭細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を継代培養し、継代４代目～６代目（Ｐ４～Ｐ６）の当該ヒト毛乳頭細胞を実験に用いた。培養液としては、商業的に入手可能な毛乳頭細胞用培養培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を用いた。
［間葉系細胞の培養］
　実施例１－１として、各培養ウェルに毛乳頭細胞を播種し、当該毛乳頭細胞を当該各培養ウェルの底面（培養電極の培養表面）上で３日間培養した。この培養期間中、毛乳頭細胞を播種してから２４時間経過した時点から１６分間、各培養ウェルにパルス電流を印加した。
　具体的に、このパルス電流刺激においては、各培養チャンバーに対して、（１）まず「＋２００μＡ（培養表面の単位面積当たりの電流値：約＋１００μＡ／ｃｍ２）」の電流を０．０５秒印加し、（２）次いで「－２００μＡ（培養表面の単位面積当たりの電流値：約－１００μＡ／ｃｍ２）」の電流を０．０５秒印加し、（３）その後、電流を印加せずに（０μＡ）０．１秒保持する、という当該（１）、（２）及び（３）を１つのパルスとする電流を印加した。
　一方、比較例１－１として、電流を印加しない以外は同一の方法で毛乳頭細胞を３日間培養した。また、比較例１－２として、ポリピロール膜を形成していない以外は同一の方法で製造した培養装置を用いて、電流を印加しない以外は同一の方法で毛乳頭細胞を３日間培養した。
［間葉系細胞の生死染色］
　培養３日目に、生細胞を染色するためのフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）と、死細胞を染色するためのエチジウムブロマイド（ＥＢ）とを用いて、毛乳頭細胞の生死染色を行った。すなわち、まず培養３日目に各培養ウェルから培地を除去し、その後、当該各培養ウェルにＦＤＡを含む培養液（生細胞染色液）を加え、３０分維持することにより、生細胞の染色を行った。次いで、各培養ウェルから生細胞染色液を除去し、その後、当該各培養ウェルにＥＢを含む培地（死細胞染色液）を加え、数分維持することにより、死細胞の染色を行った。さらに、各培養ウェルから死細胞染色液を除去した後、当該各培養ウェル内をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。そして、染色された毛乳頭細胞を位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した。
［結果］
　染色された毛乳頭細胞を位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した結果、電気刺激の有無にかかわらず、実施例１－１、比較例１－１及び比較例１－２の全てにおいて、ほとんどの毛乳頭細胞がＦＤＡで染色されており、生存していることが確認された。すなわち、本実験で用いられたパルス電流刺激は、毛乳頭細胞の生存に影響しないことが確認された。
［培養装置］
　上述の実施例１で製造した培養装置を用いた。
［間葉系細胞の調製］
　間葉系細胞としては、毛乳頭細胞を用いた。すなわち、商業的に入手可能なヒト毛乳頭細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を継代培養し、Ｐ４～Ｐ６の当該ヒト毛乳頭細胞を実験に用いた。培養液としては、毛乳頭細胞用培養培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を用いた。
［間葉系細胞の培養］
　実施例２－１として、各培養ウェルに、１．２×１０４個の毛乳頭細胞を播種し、当該毛乳頭細胞を当該各培養ウェルの底面（培養電極の培養表面）上で３日間培養した。この実施例２－１においては、パルス電流を印加し始めるタイミング（毛乳頭細胞を播種してから５時間経過時点、２９時間経過時点、５３時間経過時点）、印加するパルス電流の大きさ（０μＡ（０μＡ／ｃｍ２－培養表面）、４５μＡ（２２．５μＡ／ｃｍ２）、１００μＡ（５０μＡ／ｃｍ２）、２００μＡ（１００μＡ／ｃｍ２）、及び３００μＡ（１５０μＡ／ｃｍ２））、パルス電流を継続して印加する時間（１６分、３時間、２４時間）が異なる複数の条件で、パルス電流を印加しながら毛乳頭細胞を培養した。一方、比較例２－１として、電流を印加しない以外は同一の方法で毛乳頭細胞を３日間培養した。
［発毛関連遺伝子のＰＣＲ解析］
　３日間培養した毛乳頭細胞の遺伝子発現量をＲＴ－ＰＣＲにより解析した。ＲＴ－ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列は、ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）について、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡＴＧＣＡ－３’」であり、コントロールとして用いたＧＡＰＤＨについて、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴｇＡＧＡＡＣ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’」であった。
［結果］
　図２Ａには、パルス電流を印加し始めるタイミングを変えて培養した毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量を解析した結果を示す。具体的に、図２Ａには、電流を印加しなかった比較例２－１（図中の「Control」）、実施例２－１のうち、毛乳頭細胞にパルス電流を印加し始めたタイミングが、当該毛乳頭細胞を播種してから５時間経過した時点であった例（図中の「Day 0」）、２９時間経過した時点であった例（図中の「Day 1」）、及び５３時間経過した時点であった例（図中の「Day 2」）のそれぞれについて、当該比較例２－１における遺伝子発現量を「１」とした場合の、相対的な遺伝子発現量（図の縦軸「Relative gene expression」）を示す。
　なお、図２Ａに示す各例において、パルス電流としては、（１）まず「＋２００μＡ（約＋１００μＡ／ｃｍ２）」の電流を０．０５秒印加し、（２）次いで「－２００μＡ（約－１００μＡ／ｃｍ２）」の電流を０．０５秒印加し、（３）その後、電流を印加せずに（０μＡ）０．１秒保持する、という当該（１）、（２）及び（３）を１つのパルスとする電流を１６分間印加した。
　図２Ａに示すように、毛乳頭細胞を播種してから５時間の時点からバルス電流を印加した場合（図中の「Day 0」）には、電流を印加しない場合（図中の「Control」）に比べて、当該毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量が減少した。
　これに対し、毛乳頭細胞を播種してから２９時間の時点又は５３時間の時点からパルス電流を印加した場合（図中の「Day 1」及び「Day 2」）には、電流を印加しない場合に比べて、毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量が顕著に増加した。また、特に、２９時間の時点からパルス電流を印加した場合には、５３時間の時点からパルス電流を印加した場合に比べても、毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量は大きかった。
　図２Ｂには、印加するパルス電流の大きさを変えて培養した毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現を解析した結果を示す。具体的に、図２Ｂには、電流を印加しなかった比較例２－１（図中の「Control」）、実施例２－１のうち、毛乳頭細胞に印加したパルス電流の大きさが各培養ウェルあたり４５μＡ（各培養ウェルの培養表面（電極表面）の単位面積当たり２２．５μＡ／ｃｍ２）であった例（図中の「45μA」）、１００μＡ（５０μＡ／ｃｍ２）であった例（図中の「100μA」）、２００μＡ（１００μＡ／ｃｍ２）であった例（図中の「200μA」）、及び３００μＡ（１５０μＡ／ｃｍ２）であった例（図中の「300μA」）のそれぞれについて、当該比較例２－１における遺伝子発現量を「１」とした場合の、相対的な遺伝子発現量（図の縦軸「Relative gene expression」）を示す。
　なお、図２Ｂに示す各例において、パルス電流は、毛乳頭細胞を播種してから２９時間経過した時点から１６分間印加した。また、各例においてはパルス電流として、（１）まず所定値のプラス電流（例えば、「＋４５μＡ（約＋２２．５μＡ／ｃｍ２）」の電流）を０．０５秒印加し、（２）次いで所定値のマイナス電流（例えば、「－４５μＡ（約－２２．５μＡ／ｃｍ２）」の電流）を０．０５秒印加し、（３）その後、電流を印加せずに（０μＡ）０．１秒保持する、という当該（１）、（２）及び（３）を１つのパルスとする電流を印加した。
　図２Ｂに示すように、４５μＡ（２２．５μＡ／ｃｍ２）以上のパルス電流を印加した全ての例において、電流を印加しない場合に比べて、毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量が増加した。特に、１００μＡ（５０μＡ／ｃｍ２）以上の大きさのパルス電流を印加した場合には、電流を印加しない場合に比べて、毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量が顕著に増加した。
　図２Ｃには、パルス電流を継続的に印加する時間（培養期間中にパルス電流を印加した総時間でもある。）を変えて培養した毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量を解析した結果を示す。具体的に、図２Ｃには、電流を印加しなかった比較例２－１（図中の「Control」）、実施例２－１のうち、毛乳頭細胞にパルス電流を印加した時間が１６分であった例（図中の「16min」）、３時間であった例（図中の「3h」）、及び２４時間であった例（図中の「24h」）のそれぞれについて、当該比較例２－１における遺伝子発現量を「１」とした場合の、相対的な遺伝子発現量（図の縦軸「Relative gene expression」）を示す。
　なお、図２Ｃに示す各例においては、（１）まず「＋２００μＡ（約＋１００μＡ／ｃｍ２）」の電流を０．０５秒印加し、（２）次いで「－２００μＡ（約－１００μＡ／ｃｍ２）」の電流を０．０５秒印加し、（３）その後、電流を印加せずに（０μＡ）０．１秒保持する、という当該（１）、（２）及び（３）を１つのパルスとする電流を印加した。また、パルス電流は、毛乳頭細胞を播種してから２９時間経過した時点から印加した。
　図２Ｃに示すように、パルス電流を印加した時間が１６分以上であった全ての例において、電流を印加しない場合に比べて、毛乳頭細胞のＡＬＰ遺伝子発現量が顕著に増加した。
［培養装置］
　上述の実施例１で製造した培養装置を用いた。
［間葉系細胞の調製］
　間葉系細胞としては、毛乳頭細胞を用いた。すなわち、商業的に入手可能なヒト毛乳頭細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を継代培養し、Ｐ４～Ｐ６の当該ヒト毛乳頭細胞を実験に用いた。培養液としては、毛乳頭細胞用培養培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を用いた。
［間葉系細胞の培養］
　実施例３－１として、各培養ウェルに、１．２×１０４個の毛乳頭細胞を播種し、当該毛乳頭細胞を当該各培養ウェルの底面（培養電極の培養表面）上で３日間培養した。この培養期間中、毛乳頭細胞を播種してから２９時間経過した時点から１６分間、各培養ウェルに２００μＡ（１００μＡ／ｃｍ２）のパルス電流を印加した。
［上皮系細胞の採取］
　胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法（Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communication, 3, 784, 2012）を一部改変して、ディスパーゼ処理を４℃で１時間、４０ｒｐｍ震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。
［毛包原基の製造］
　毛包原基を形成するための培養容器として、各ウェルが、細胞非接着コーティングが施された丸底（凹状に湾曲した細胞非接着性底面）を有する、商業的に入手可能な９６マルチウェルプレートを用いた。
　上述のようにして電流を印加しながら培養して得られた毛乳頭細胞と、皮膚組織から採取された上皮系細胞とを、それぞれトリプシン処理により回収し、新鮮な培養液を添加して、当該毛乳頭細胞を含む細胞懸濁液、及び当該上皮系細胞を含む細胞懸濁液をそれぞれ調製した。
　次いで、毛乳頭細胞の細胞密度が５×１０３個／ウェルとなり、且つ上皮系細胞の細胞密度が１×１０４個／ウェルとなるように、当該毛乳頭細胞と上皮系細胞とを混合して、９６マルチウェルプレートの各ウェルに播種した。培養液としては、間葉系細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）と、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２とを体積比１：１で混合して調製された混合培地を用いた。
　そして、各ウェルにおいて、毛乳頭細胞及び上皮系細胞を混合状態で３日間培養することにより、毛包原基を形成した。すなわち、培養時間が経過するにつれて、各ウェル内において細胞同士は自発的に凝集して、球状で浮遊状態の毛包原基を形成した。なお、この毛包原基は、主に毛乳頭細胞同士が凝集して形成された毛乳頭細胞凝集部分と、主に上皮系細胞同士が凝集して形成された上皮系細胞凝集部分とを含み、当該毛乳頭細胞凝集部分の一部と当該上皮系細胞凝集部分の一部とは結合していた。
　一方、比較例３－１として、電流を印加しながら培養された毛乳頭細胞に代えて、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された毛乳頭細胞を用いたこと以外は、同一の方法で共培養を行って毛包原基を形成した。
［発毛関連遺伝子のＰＣＲ解析］
　３日間の培養により形成された毛包原基の遺伝子発現量をＲＴ－ＰＣＲにより解析した。ＲＴ－ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列は、Ｖｅｒｓｉｃａｎについて、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＡＴＴＴＣＡ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡ－３’」であり、ＬＥＦ１（Lymphoid Enhancer Factor-1）について、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＣＣＣＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＧＣＡＴ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＴＣＧＡＧＴＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＴＧＴ－３’」であり、ＡＬＰについて、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧｇＣＡＣＣＡＴ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡＴＧＣＡ－３’」であり、Ｗｎｔ１０ｂについて、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＧＴＧＡ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＡＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧ－３’」であり、コントロールとして用いたＧＡＰＤＨについて、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３’」、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒは「５‘－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’」であった。
［マウスへの移植］
　上述のようにして３日間の培養で形成した毛包原基を回収して、ヌードマウスの皮内に移植した。すなわち、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を施し、その背部をイソジンで消毒した。次いで、Ｖランスマイクロメス（日本アルコン）を用いて、皮膚の表皮層から真皮層下部に至る移植創を形成した。そして、この移植創に、毛包原基を２０個ずつ注入した。なお、ヌードマウスの飼育及び移植実験は、横浜国立大学動物実験専門委員会の指針を遵守して行った。
［結果］
　図３には、毛包原基における遺伝子発現量を解析した結果を示す。具体的に、図３には、横軸に示される遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ、ＬＥＦ１、ＡＬＰ及びＷｎｔ１０ｂ）の各々について、比較例３－１において電流を印加することなく培養された毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基（図中の「Control」）の発現量（黒塗りの棒グラフ）を「１」とした場合の、実施例３－１において電流を印加して培養された毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基（図中の「200μA」）の発現量（図の縦軸「Relative gene expression」）（白抜きの棒グラフ）を示す。
　図３に示すように、毛乳頭細胞に特徴的なＶｅｒｓｉｃａｎ及びＡＬＰはいずれも、電流を印加して培養された毛乳頭細胞を含む毛包原基の遺伝子発現量が、電流を印加せずに培養された毛乳頭細胞を含む毛包原基のそれに比べて、顕著に大きかった。
　すなわち、電流を印加して培養された毛乳頭細胞は、当該培養後で毛包原基を形成する前のみならず、上皮系細胞との共培養によって毛包原基を形成した後も、当該毛包原基において、発毛関連遺伝子の発現量が増加していることが確認された。
　また、上皮系細胞に特徴的なＬＥＦ１及びＷｎｔ１０ｂも、電流を印加して培養された毛乳頭細胞と共に毛包原基を形成した上皮系細胞の遺伝子発現量が、電流を印加せずに培養された毛乳頭細胞と共に毛包原基を形成した上皮系細胞のそれに比べて大きく、特に、Ｗｎｔ１０ｂの遺伝子発現量は、顕著に大きかった。
　すなわち、電流を印加して培養された毛乳頭細胞との共培養によって毛包原基を形成した上皮系細胞は、当該毛包原基において、その発毛関連遺伝子の発現量が顕著に増加しているという、予想外の顕著な効果が確認された。
　図４Ａ、及び図４Ｂにはそれぞれ、電流を印加して培養された毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基、及び電流を印加することなく培養された毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基をマウスに移植してから３０日後の時点で撮影された、当該毛包原基から再生した毛の写真を示す。
　また、図５には、電流を印加して培養された毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基（図中の「実施例３－１」）、及び電流を印加することなく培養された毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基（図中の「比較例３－１」）をマウスに移植してから３０日後の時点において、当該毛包原基から生えていた毛の本数を数えた結果（図中の縦軸「発毛数」）を示す。
　図４Ａ及び図５に示すように、電流を印加して培養された毛乳頭細胞を用いて形成され、マウスに移植された毛包原基から生えた毛の本数は、約４０であった。これに対し、図４Ｂ及び図５に示すように、電流を印加することなく培養された毛乳頭細胞を用いて形成され、マウスに移植された毛包原基から生えた毛の本数は約１８本であった。
　すなわち、電流を印加して培養された毛乳頭細胞を用いて製造された毛包原基は、電流を印加することなく培養された毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基に比べて、生体に移植された場合の発毛能力が顕著に優れていることが確認された。

Claims (15)

  1. 　電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することを含む、間葉系細胞の培養方法。
  2. 　前記電流は、パルス電流である、
    　請求項１に記載の間葉系細胞の培養方法。
  3. 　第一の電極としての前記電極、及び前記第一の電極に対向する位置に配置された第二の電極を介して前記電流を印加する、
    　請求項１又は２に記載の間葉系細胞の培養方法。
  4. 　電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することにより、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞に比べて活性化された前記間葉系細胞を得ることを含む、活性化間葉系細胞の製造方法。
  5. 　前記電流は、パルス電流である、
    　請求項４に記載の活性化間葉系細胞の製造方法。
  6. 　第一の電極としての前記電極、及び前記第一の電極に対向する位置に配置された第二の電極を介して前記電流を印加する、
    　請求項４又は５に記載の活性化間葉系細胞の製造方法。
  7. 　前記活性化された間葉系細胞は、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は同一の方法で培養された間葉系細胞のそれより増加した間葉系細胞である、
    　請求項４乃至６のいずれかに記載の活性化間葉系細胞の製造方法。
  8. 　請求項４乃至７のいずれかに記載の方法により製造された間葉系細胞と、上皮系細胞とを共培養することにより毛包原基を形成すること
    　を含む、毛包原基の製造方法。
  9. 　前記間葉系細胞と前記上皮系細胞とを細胞非接着性表面上で共培養することにより前記毛包原基を形成する、
    　請求項８に記載の毛包原基の製造方法。
  10. 　前記共培養により形成された前記毛包原基は、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる上皮系細胞に比べて、活性化された前記上皮系細胞を含む、
    　請求項８又は９に記載の毛包原基の製造方法。
  11. 　前記活性化された上皮系細胞は、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる上皮系細胞のそれより増加している上皮系細胞である、
    　請求項１０に記載の毛包原基の製造方法。
  12. 　前記共培養により形成された前記毛包原基は、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる当該間葉系細胞に比べて、活性化された前記間葉系細胞を含む、
    　請求項８乃至１１のいずれかに記載の毛包原基の製造方法。
  13. 　前記活性化された間葉系細胞は、電流を印加しない以外は前記間葉系細胞と同一の方法で製造された間葉系細胞を用いたこと以外は同一の方法で形成された毛包原基に含まれる当該間葉系細胞に比べて、少なくとも一つの発毛関連遺伝子の発現量が増加している間葉系細胞である、
    　請求項１２に記載の毛包原基の製造方法。
  14. 　電極の表面に接着した間葉系細胞を、前記電極を介して電流を印加しながら培養することにより、前記間葉系細胞を活性化する、
    　間葉系細胞の活性化方法。
  15. 　間葉系細胞と上皮系細胞との共培養により形成される毛包原基において、
    　前記間葉系細胞として、請求項４乃至７のいずれかに記載の方法により製造された間葉系細胞を用いることにより、前記毛包原基に含まれる前記上皮系細胞を活性化する、
    　上皮系細胞の活性化方法。

     
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BLOISE, N. ET AL.: "The effect of pulsed electromagnetic field exposure on osteoinduction of human mesenchymal stem cells cultured on nano- Ti02 surfaces", PLOS ONE, vol. 13, no. 6, 14 June 2018 (2018-06-14), pages 1/19 - 19/19, XP081620213 *

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