WO2007148451A1 - ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法 - Google Patents

ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007148451A1
WO2007148451A1 PCT/JP2007/052732 JP2007052732W WO2007148451A1 WO 2007148451 A1 WO2007148451 A1 WO 2007148451A1 JP 2007052732 W JP2007052732 W JP 2007052732W WO 2007148451 A1 WO2007148451 A1 WO 2007148451A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polyamine
oxidase
polyamine oxidase
diacetyl
measuring
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/052732
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mikio Bakke
Kazuhiko Shimoji
Naoki Kajiyama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kikkoman Corp
Original Assignee
Kikkoman Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kikkoman Corp filed Critical Kikkoman Corp
Priority to JP2008522315A priority Critical patent/JP5166259B2/ja
Publication of WO2007148451A1 publication Critical patent/WO2007148451A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing polyamine oxidase, a method for improving substrate specificity, a method for measuring diacetyl polyamine using polyamine oxidase, and the like, which are used for clinical diagnosis and production of useful substances.
  • the present invention relates to a method for producing monoacetyl polyamine by reacting polyamine oxidase, a method for purifying polyamine oxidase, a stabilized polyamine oxidase preparation, a reagent for measuring diacetyl polyamine, and the like.
  • Polyamine is a general term for compounds having two or more amino groups in the same molecule.
  • four types of polyamines such as putrescine, cadaverine, spermidine, and spermine, and their monoacetyl and diacetyl groups.
  • urinary polyamine content has been measured for cancer diagnosis (e.g., non-patented (Ref. 1). Since most of the urine polyamines exist in monoacetyl form, it was conventionally measured as the total polyamine content that does not distinguish between free polyamines that hydrolyze acetyl groups and are acetylated with acetyl ethers. (For example, see Patent Document 1).
  • N 1 , N 12 diacetyl spermine (II) (hereinafter simply referred to as diacetyl spermine) and N 1 , N 8 — diacetyl spermidine (II 2) 2
  • II diacetyl spermine
  • N 1 , N 8 diacetyl spermidine
  • HPLC-enzyme method for example, see Non-Patent Document 2
  • HPLC-enzyme method see Non-Patent Document 2
  • various polyamines in the sample are separated by HPLC, and then the free polyamine produced by the action of acetylhydrolase in the HPLC detector is oxidized with polyamine oxidase, and the resulting hydrogen peroxide is electrochemically detected. It is the method of detecting using a container.
  • this method has a problem that a large number of samples cannot be processed in a short time.
  • Patent Documents 2, 3, and 4 Non-Patent Documents 3 and 4
  • the operation was complicated, and the measured value was inversely proportional to the sample amount of the sample.
  • Such polyamine oxidase is thought to be useful for the measurement of diacetyl spermine.
  • the stability of the enzyme and its specificity for diacetyl spermine should be further improved. Was considered necessary.
  • N 1 -acetyl spermidine is about 30%, 50%, 90% (pH 7.5), respectively. This shows the reactivity under phosphate buffer conditions), and there has been a problem of measuring polyamines other than diacetyl spermine.
  • polyamine oxidase is a diacetyl spermine (Chemical Formula 1) N 1 -acetyls permidine (4) that is useful as a raw material for pharmaceuticals and agricultural chemicals. It has been reported that it can be used in manufacturing methods (PCT / JP200 67310648). Although this method is simple and requires fewer steps compared to the conventionally known organic synthesis methods (for example, see Non-Patent Documents 6 and 7), the enzyme is unstable. It had the disadvantage that a large amount of enzyme was required. In addition, since the substrate specificity is insufficient, a part of the produced N 1 acetyl spermidine is converted to putrescine, resulting in a decrease in yield.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 1 85080
  • Patent Document 2 WO 2004Z081569 Nonfret
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-38594
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-199655
  • Non-patent document 1 “Cancer ResearchJ, (USA), 1971, 31 ⁇ , p. 1555-1558
  • Non-patent document 2 “ Journal of BiochemistryJ, (Japan), 1995, 117 ⁇ , p. 107-112
  • Non-Patent Document 3 "Clinical Cancer Research”, (USA), 2005, 11 ⁇ , p. 2986-2990
  • Non-Patent Document 4 “Journal of BiochemistryJ, (Japan), 2006, 139 ⁇ , p. 315-322
  • Non-Patent Document 5 “Clinica Chimica ActaJ, (Landland), 2004, 340 ⁇ , ⁇ 219—22 7
  • Non-Patent Literature 6 journal of Chemical society, Perkm Transactions I ”(UK), 1988, p. 1905- 1911
  • Non-Patent Document 7 “Acta Chemica ScandinavicaJ, (Denmark), 1989, 43 ⁇ , p. 990-994
  • the subject of the present invention is a method for stabilizing polyamine oxidase, a method for improving substrate specificity, And a method for producing diacetyl polyamine by using polyamine oxidase and a method for producing monoacetyl polyamine using the same, a method for purifying polyamine oxidase, It is intended to provide a decontaminated polyamine oxidase preparation and a reagent for measuring diacetylpolyamine.
  • the present inventors have (1) the stability of polyamine oxidase is improved by the coexistence of an alcoholic compound and Z or a chelating reagent. (2) The substrate specificity of polyamine oxidase is improved by the coexistence of surfactants, and (3) the substrate of polyamine oxidase by allowing polyamine oxidase to act at a pH below 7.5. The inventors have found that the specificity is improved and have completed the present invention based on these findings.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for stabilizing polyamine oxidase comprising coexisting an alcohol compound and Z or a chelating reagent with polyamine oxidase.
  • a method for improving the substrate specificity of polyamine oxidase characterized by allowing polyamine oxidase to act in the presence of a surfactant.
  • a method for improving the substrate specificity of polyamine oxidase characterized by allowing polyamine oxidase to act at a pH of less than 7.5.
  • a method for measuring diacetyl polyamine which comprises measuring a diacetyl polyamine by allowing a reagent containing polyamine oxidase to act on a sample.
  • a stabilized polyamine oxidase preparation comprising an alcoholic compound and Z or a chelating reagent and a polyamine oxidase.
  • the reagent for measuring diacetyl polyamine according to (13) above which contains an alcoholic compound and Z or a chelating reagent, and polyamine oxidase.
  • an alcoholic compound and Z or a chelating reagent are allowed to coexist.
  • the polyamine oxidase can be stabilized.
  • the substrate specificity of polyamine oxidase can be improved by coexisting a surfactant and making the condition less than Z or PH 7.5.
  • monoacetyl polyamine can be produced by using polyamine oxidase to diacetyl polyamine, or polyamine oxidase can be used.
  • Diacetyl polyamine can be measured by V.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of enzyme stability due to the coexistence of an alcohol compound and a chelating reagent.
  • FIG. 2 is a graph showing the thermal stability of a polyamine oxidase preparation.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the concentration and absorbance when a diacetyl spermine sample was measured using a reagent containing diacetyl spermine oxidase.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the concentration and the absorbance when a sample containing diacetyl spermine oxidase and diacetylspermine added to urine was measured.
  • polyamine oxidase used in the present invention is an enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing diacetyl polyamine in the presence of oxygen to produce monoacetyl polyamine, aldehyde, and hydrogen peroxide.
  • any of polyamine oxidase produced by microorganisms, plants, animals, etc. is not particularly limited. Examples thereof include polyamine oxidase originating from yeast and the like, and preferably, enzymes derived from the genera Debaryomyces, Candida and Pichia are used.
  • diacetyl spermine oxidase is particularly preferable. Used frequently.
  • the di ⁇ cetyl spermine O Kishida over Ze described herein, N 1 - Asechirusu Perumin, N 1 - ⁇ cetyl spermidine, N 8 - active high for di ⁇ cetyl spermine than activity against ⁇ cetyl spermidine refers to polyamine O Kishida over Ze, For example, Debaryomyces' Nonsenyi, Denoriomyces' malama, Denoriomyces' Marams, Candida glabrata, Pichia minuta diacetyl spermine oxidase and the like.
  • diacetyl spermine oxidase having each of the physical properties described in the following (la) to (lg) or a combination thereof as appropriate (the physicochemical properties of the following enzymes are: (Including inevitable errors in measurement):
  • C—N bond is cleaved to form N 1 -acetyl spermidine, 3-acetamidopropanal and hydrogen peroxide.
  • N 1 -acetyl spermine, N 1 -acetyl spermidine, N 8 -acetyl spermidine is the substrate.
  • the enzyme of the present invention having a physical property having an activity of 90 or less, preferably 60 or less, more preferably 50 or less, and most preferably 40 or less. There are no restrictions on the pH conditions or the type and concentration of the buffer in this evaluation!
  • 200 mM acetate buffer pH 4.5 to 6.0
  • 200 mM potassium phosphate buffer ⁇ 6.0 to 8.0
  • 200 mM PIPES-NaOH pH 6.5 to 7.5
  • the enzyme of the present invention having physical properties of pH 6.5 to 8.5, preferably pH 7.0 to 8.0 as the optimum pH.
  • Stable pH 6.0-8.0
  • 200 mM acetate buffer pH 4.5 to 6.0
  • 200 mM potassium phosphate buffer ⁇ 6.0 to 8.0
  • 200 mM PIPES-NaOH pH 6.5 to 7.5
  • 200 mM Tris-hydrochloric acid buffer pH 7.5 to 9.5
  • the stable pH range include the enzyme of the present invention having physicochemical properties of pH 6.0 to 8.0, preferably pH 6.5 to 7.5.
  • the activity of the present enzyme is measured at various temperatures to determine the optimum temperature range of action.
  • the enzyme of the present invention having a physical property of 37 to 55 ° C. as the temperature range of action. (If) Thermal stability: 37 ° C or less
  • the enzyme according to the present invention having physicochemical properties of 37 ° C or lower can be cited as a range where the enzyme can stably exist.
  • the molecular weight of the enzyme of the present invention is not particularly limited, but examples of the molecular weight include the enzyme of the present invention having a molecular weight of about 92,000 (gel filtration method).
  • Diacetyl spermine oxidase having each of the physical properties described in (2a) to (2g) below or a combination thereof as appropriate (the physical properties of the following enzymes are Including inevitable errors):
  • N 1 -acetyl spermine, N 1 -acetyl spermidine, N 8 -acetyl spermidine is the substrate.
  • the enzyme of the present invention having a physical property having an activity of 90 or less, preferably 60 or less, and more preferably 50 or less when used as. There are no restrictions on the pH conditions or the type and concentration of the buffer in this evaluation.
  • 200 mM acetate buffer pH 4.5 to 6.0
  • 200 mM potassium phosphate buffer ⁇ 6.0 to 8.0
  • 200 mM PIPES-NaOH pH 6.5 to 7.5
  • the enzyme of the present invention having physical properties of pH 7.0 to 8.5, preferably pH 7.5 to 8.0 as the optimum pH.
  • Stable pH 5.5 to 9.5
  • 200 mM acetate buffer pH 4.5 to 6.0
  • 200 mM potassium phosphate buffer ⁇ 6.0 to 8.0
  • 200 mM PIPES-NaOH pH 6.5 to 7.5
  • 200 mM Tris-hydrochloric acid buffer pH 7.5 to 9.5
  • the stable pH range include the enzyme of the present invention having physicochemical properties of pH 5.5 to 9.5, preferably pH 6.5 to 9.0.
  • the activity of the present enzyme is measured at various temperatures to determine the optimum temperature range of action.
  • the enzyme of the present invention having a physical property of 45 to 55 ° C as the temperature range of action can be mentioned.
  • the enzyme according to the present invention having physicochemical properties of 37 ° C or lower can be mentioned as a range where the enzyme can stably exist.
  • the molecular weight of the enzyme of the present invention is not particularly limited, and examples of the molecular weight include the enzyme of the present invention having a molecular weight of about 90,000 (gel filtration method).
  • the first enzyme mentioned above is Debaryomyces malama HUT 7199, Debaryomyces maramus NBRC 0668 and Denoriomyces Hansenii Tsukuba 42 (FERM BP-10603)
  • the second enzyme mentioned above is Each one is produced by Brata Noda 162 and can be easily prepared from these cells by those skilled in the art.
  • the enzyme-encoding gene can be cloned and assembled in other hosts such as Escherichia coli and yeast. It can also be prepared by expression.
  • Debariomyces Hansenii Tsukuba 42 (FERM BP-10603) and Canida glabrata Noda 162 (FERM BP-10602) are strains obtained by the present inventors from soils in Ibaraki Prefecture and Chiba Prefecture, respectively. As of May 10, 2006, it was deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Budapest Treaty on the International Approval of Deposit of Microorganisms in Patent Procedures, each with deposit number FERM BP— 10603 And FERM BP-10602.
  • polyamine oxidase those using FAD or copper as a coenzyme are known, and although not particularly limited, polyamine oxidase using FAD as a coenzyme is desirable.
  • polyamine oxidases those produced by gene recombinants can be used.
  • the alcohol compound coexisted in order to improve the stability of polyamine oxidase is an organic compound having a hydroxyl group (OH), and those skilled in the art can use any compound having such a functional group.
  • Any compound known in the art can be used in the present invention.
  • an organic compound in which one or more hydrogen atoms of an aliphatic hydrocarbon are substituted with a hydroxyl group is preferably used because it is easily available. More specific Examples include aliphatic alcohols such as methanol, ethanol, 1 propanol, 2-propanol, ethylene glycol and glycerol, and sugars such as trehalose, xylitol, sucrose and glucose.
  • the above alcohol compounds can be used either individually or in combination.
  • the concentration of the alcohol compound in the solution coexisting with the polyamine oxidase may be within a range in which the stabilizing effect of the polyamine oxidase is exhibited and there is no inconvenience in handling the reagent containing the enzyme.
  • each compound can be added at a concentration at which an appropriate stability effect is recognized.
  • it is used at a concentration of 0.5 to 20%, more preferably 1 to 10% (hereinafter referred to as “volume%” unless otherwise specified).
  • the chelating reagent that coexists in order to improve the stability of polyamine oxidase is a compound that coordinates to a metal ion to give a chelating compound, and has such an action. Any compound known to those skilled in the art can be used in the present invention.
  • ethylenediamine-acetic acid (Ethylenediamine—N, N, ⁇ ,, ⁇ , —tetraacetic acid, (hereinafter referred to as “EDTA”)), 1, 2-Diaminopropane-N, N, N, N, Tetraacetic acid (hereinafter referred to as “Me—EDTA”), N— (2-Hydroxymethyl) ethy lenediamine-N, N, N, N, unitetraacetic acid (hereinafter referred to as “EDTA—OH”), trans— 1, 2-Diaminocyclohexane- N, N, N ', N'— tetraacetic acid (hereinafter referred to as “CyDTA”), 1, 3— Diamino— 2— hydroxypropane— N, N, N, N, -tetraacetic acid (Hereinafter referred to as “DTPA—OH”), O, ⁇ '— Bis (2—aminoethylenediamine—N
  • the chelating reagents may be used alone or in combination.
  • Ma Examples of the polyamine oxidase stabilized by the chelating reagent include, for example, polyamine oxidase originating from yeast and the like, and more specifically, Devariomyces' Hansenii, Denoriomyces. Malama, Denoriomyces. Marams, Candida diacetyl spermine oxidase derived from glabrata, and Candida 'bodily derived from Candida as described in FEBS Letters, (UK), 476 ,, p. 150—154 1 — acetyl spermidine oxidase and the like.
  • the concentration of the chelating reagent coexisting with polyamine oxidase in the solution the stability of the polyamine oxidase is exerted and the concentration of the chelating reagent is not particularly inconvenient in handling the reagent containing the enzyme.
  • concentration of the chelating reagent is not particularly inconvenient in handling the reagent containing the enzyme.
  • it is preferably used at a concentration of 0.01 to 50 mM, more preferably 1 to LOmM.
  • the polyamine oxidase can be stabilized by using the alcohol compound and the chelating reagent in combination.
  • the alcoholic compound and the chelating reagent can be used alone or in combination.
  • the alcohol compound and Z or a solid powder to which a chelating reagent, polyamine oxidase, and other reagents are added, or a solution thereof, can be allowed to coexist by appropriately mixing them.
  • the concentration of polyamine oxidase used in the stability method of the present invention is not particularly limited.
  • This enzyme solution contains coenzymes such as FAD, NAD, NADP, NADH, NADPH, peroxidase, 4-aminoantipyrine, phenol, N-ethyl N-sulfopyl pill-m-toluidine (TOOS), 10- (carboxymethyl) (Aminocarbols) — 3, 7 Hydrogen peroxide detection reagents such as bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt (DA—67), redox coloring such as 1 Methoxy PMS and WST—8 (formazan reagent) One or more of reagents, enzymes such as catalase, and various polyamines such as diacetyl spermine may be contained.
  • coenzymes such as FAD, NAD, NADP, NADH, NADPH, peroxidase, 4-aminoantipyrine, phenol, N-ethyl N-sulfopyl pill-m-toluidine (TOOS), 10-
  • the stability of an enzyme is greatly affected by the pH during storage, it is preferable to simultaneously use various buffers in the stable pH range.
  • the stability of the enzyme of the present invention The type of buffer used, its concentration, and pH are not particularly limited, but for example, it is set to a concentration having a buffer capacity between pH 6 and 10 and maintaining a necessary and sufficient buffer capacity. It is desirable that Examples of such buffers include general-purpose Tris buffers and phosphate buffers, organic acid buffers such as acetic acid, citrate, and oxalic acid, MES, BES, HEPES, and TES. Good buffer such as bicine and tricine, amino acid buffer such as glycine-NaOH, borate buffer, Bis-Tris propane buffer, imidazole buffer and the like can also be used.
  • the concentration of the buffer solution for storing the enzyme is not particularly limited, but preferably 5
  • the alcohol compound of the present invention and Z or a chelating reagent are added to the buffer, they may be added directly or, for example, an aqueous solution thereof adjusted to pH 6 to 10, preferably pH 6 to 8, may be added. Good. If the pH is outside the target range by adding an alcoholic compound and Z or a chelating reagent, for example, acetic acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia water, etc. It is preferable to adjust the pH so that it falls within the target range.
  • reagents if necessary, for example, various inorganic salts such as sodium chloride sodium, potassium salt sodium, sodium azide, polysaccharides such as dextran, urine serum albumin (BSA), glycerol Further, chemotherapeutic agents such as amino acids, surfactants, antibiotics and sulfa drugs may coexist. These reagents may be preliminarily added to the buffer solution.
  • the stability was evaluated by storing polyamine oxidase under various conditions in accordance with the storage conditions, transport conditions, and measurement conditions of the enzyme actually used, and measuring changes over time.
  • an acceleration test is generally used to perform evaluation in a short time. For example, a method of keeping polyamine oxidase at a constant high temperature and measuring its change over time can be mentioned.
  • polyamine oxidase particularly diacetyl spermine oxidase
  • This stable method is used to produce a stabilized polyamine oxidase formulation containing an alcoholic compound and a Z or chelating reagent and a polyamine oxidase. It can be done.
  • a PH6 ⁇ : LO buffer solution containing 1 to 10% of an alcohol compound and Z or a chelating reagent at a concentration of 1 to 50 mM is prepared, and polyamine oxidase is added to this buffer solution. Is added to make LOOOUZml.
  • a coenzyme such as FAD may be added to be 0.01-: LOmM.
  • peroxidase may be added at 10 to: LOOOUZml, TOOS at 0.05 to 5 mM, and 4-aminoantipyrine at 0.1 to 20 mM. This mixture can be stirred to produce a polyamine oxidase preparation.
  • this liquid preparation may be freeze-dried or spray-dried.
  • the polyamine oxidase preparation thus obtained is significantly stabilized as compared with the preparation produced by the conventional method, and is stabilized in a simple manner and at a low cost by the method of the present invention. Polyamine oxidase preparations can be produced.
  • a purified polyamine oxidase can be produced using this stability method.
  • a method for purifying an enzyme a method commonly used for enzyme purification can be used. For example, ammonium sulfate salting out method, organic solvent precipitation method, ion exchange chromatography method, gel filtration chromatography method, hydrophobic chromatography method, adsorption It is preferable to carry out an appropriate combination of chromatographic methods, electrophoresis methods and the like.
  • the polyamine oxidase is isolated and purified in a stable state by adding and coexisting an alcohol compound and Z or a chelating reagent. Can do. This makes it possible to produce the enzyme with a high recovery rate.
  • diacetyl spermine oxidase described in PCTZJP2006Z310648 is used for cell disruption with dynomill, ammonium sulfate precipitation, dialysis, anion exchange column chromatography, hydrophobic column chromatography, gel filtration and the like. Purify in combination, but with one or more of these steps, alcohol compound and Z or chelating reagent are added and coexisted in one step or multiple steps to stabilize diacetyl spermine oxidase. In this state, it can be isolated and purified.
  • N 1 -acetyl spermidine can be efficiently produced using this stable method.
  • Addition and coexistence of a compound and Z or a chelating reagent stabilizes diacetyl spermine oxidase, which makes it possible to carry out the reaction with a smaller amount of enzyme, which is industrially advantageous.
  • the above reaction is usually carried out in a buffer solution, but if necessary, a hydrogen peroxide-eliminating enzyme such as catalase or a preservative such as sodium azide may be added.
  • the buffer solution is not particularly limited as long as it is a normal buffer solution having a pH of 5 to 10, but examples thereof include general-purpose Tris buffer solution and phosphate buffer solution, and include acetic acid, citrate, and oxalic acid.
  • Organic acid buffer such as MES, BES, HEPES, TES, Good buffer such as bicine and tricine, Amino acid buffer such as glycine-NaOH, Boric acid buffer, Bis-Tris propane buffer, Imidazole buffer Etc.
  • the reaction time may be any time, but it is preferable to stop the reaction in 1 hour to 3 days, preferably 3 hours to 2 days.
  • “improving the substrate specificity of polyamine oxidase” means the ratio of the reactivity of polyamine oxidase to “diacetyl spermine” to “reactivity to other polyamines”, that is, “diacetyl”. Improve reactivity to spermine Z and reactivity to other polyamines!
  • “other polyamines” refer to, for example, N 1 -acetyl spermine, N 1 -acetyl spermidine, N 8 -acetyl spermidine, spermine, spermidine and the like.
  • Substrate specificity was evaluated by measuring the enzyme activity by changing the type of substrate added to the reaction solution used to measure the enzyme activity, and comparing the reactivity to diacetylspermine with the reactivity to other polyamines.
  • the "other polyamine” if example embodiment, N 1 - ⁇ cetyl spermine, N 1 - ⁇ cetyl spermidine, N 8 - Asechirusuperumi Jin, spermine, and a method of measuring the like spermidine and the like.
  • it is possible to compare the reactivity to diacetyl polyamine and the reactivity to one other polyamine eg N 1 -acetyl spermidine).
  • a surfactant is composed of a hydrophilic group and a lipophilic group (hydrophobic group), and is a substance that exhibits an activity of dissolving in water and lowering the surface tension of water. It can also be used in combination.
  • surfactants are Ryoon surfactants (anionic surfactants), cationic surfactants (cationic surfactants)
  • Nonionic surfactants non-ionic surfactants
  • amphoteric surfactants include quaternary amphoteric surfactants
  • A-on surfactant is an ion that is ionized in water to become an organic anion.
  • anionic surfactant is an ion that is ionized in water to become an organic anion.
  • the lipophilic group in the molecule of the surfactant is R, RCOONa, R SO Na, RSO Na, etc.
  • a cationic surfactant (cationic surfactant) is ionized in water to become an organic cation.
  • the lipophilic group in the surfactant molecule is R and the halogen is X, , R -NH X, [ ⁇ 4 ⁇ ] ⁇ (quaternary ammonia salt), (C ⁇ — N) RX (alkyl pyrimido
  • Nonionic surfactants are those whose hydrophilic groups are nonionic, and those often used as hydrophilic groups include, for example, oxyethylene groups (one CH CH
  • sorbitan sucrose ester
  • glycerin derivative monoglyceride etc.
  • the lipophilic group in the surfactant molecule is R, RO (CH 2 CH 2 O) H, RCOO (
  • Amphoteric surfactants are those having both an anion group and a cationic group in the molecule.
  • nonionic surfactants and amphoteric surfactants are particularly preferably used for improving the substrate specificity of polyamineoxidase. More specifically, as nonionic surfactants, for example, Triton X-100 [Polyoxyethy lene (10J Octylphenyl Ether), Triton X-405 [p-tertiary Octylphenoxy-Polyethoxy Ethanols], Tween 20 [Polyoxyethylene ( 20) Sorbitan Monolaurate], Tween 40 [Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monopalmitate], T ween 80 [Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monooleate], Tween 85 [Polyo xyethylene (20) Sorbitan Trioleate], Brij 35 [Polyoxyethylene (23) Lauryl Ether], Brij 58 [Polyoxyethylene (20) Cetyl Ether], Brij 78 [Polyoxyethylene (20) Stearyl Ether], Emanoregen 9
  • the above surfactants can be used alone or in combination.
  • the polyamine oxidase and the surfactant can be mixed together in the same reagent and used together.
  • the surfactant since the surfactant only needs to be present when the reaction with polyamine oxidase proceeds, for example, reagent A containing polyamine oxidase and reagent B containing the surfactant are separately provided. It is also possible to prepare them and mix them as appropriate so that the polyamine oxidase reaction can proceed in the presence of the surfactant.
  • the concentration of the surfactant when coexisting with polyamine oxidase is not particularly limited, and each compound can be added at a concentration at which an appropriate substrate specificity improving effect is recognized. It is preferably used at a concentration of 0.001 to 20%, more preferably 0.0 to 1 to 5%.
  • the type, concentration, and pH of the buffer used for improving the substrate specificity by the surfactant of the present invention are not particularly limited.
  • the buffer is relaxed between pH 5 and L0. It is desirable that the concentration is set so as to have an impulsive capacity and to maintain a necessary and sufficient buffer capacity.
  • buffers include general-purpose Tris buffers and phosphate buffers, organic acid buffers such as acetic acid, citrate, and oxalic acid, MES, BES, HEPES, Good buffers such as TES, bicine, and tricine, amino acid buffers such as glycine-NaOH, borate buffer, Bis-Tris propane buffer, and imidazole buffer can also be used.
  • the concentration of the buffer is, for example, preferably 5 to 500 mM, more preferably 20 to: LOOmM.
  • a method of performing an enzyme reaction at a pH of less than 7.5 can also be mentioned. More preferable pH conditions include, for example, 6.0 or more and less than 7.5.
  • the above-mentioned surfactant that can improve the substrate specificity of polyamine oxidase can also be present.
  • the polyamine oxidase can be used in such a form that it is preferentially contained in a reagent having a pH of less than 7.5, more preferably pH 6.0 or more and less than 7.5.
  • the pH should be less than 7.5, more preferably pH 6.0 or more and less than 7.5. containing Okishidaze) was prepared separately respectively, a mixture of them, pH 7. less than 5, more preferably P H6. 0 or 7. as a condition of less than 5 is advanced polyamine O Kishida over peptidase reaction It ’s easy to do.
  • the concentration of polyamine oxidase used for improving the substrate specificity by carrying out the enzymatic reaction in the presence of the above-mentioned surfactant of the present invention and less than Z or PH 7.5 is not particularly limited.
  • This enzyme solution includes coenzymes such as FAD, NAD, NADP, NADH and NADPH, peroxidases, hydrogen peroxide detection reagents such as 4-aminoantipyrine, phenol, TOOS and DA-67, 1-Methoxy PMS and WST— 8 Oxidation-reduction coloring reagents such as (formazan reagent), enzymes such as catalase, and various polyamines such as diacetyl spermine! /, Or more than one! /, May! / .
  • coenzymes such as FAD, NAD, NADP, NADH and NADPH
  • peroxidases such as 4-aminoantipyrine, phenol, TOOS and DA-67
  • Oxidation-reduction coloring reagents such as (formazan reagent)
  • enzymes such as catalase
  • various polyamines such as diacetyl spermine! /, Or more than one!
  • chelating reagents and other reagents which are stabilizers as described above can be used together.
  • various inorganic salts such as sodium salt, potassium salt, sodium salt, polysaccharides such as dextran, ushi serum albumin (BSA), glycerol, amino acids, antibiotics, sulfa drugs, etc. These chemotherapeutic agents may coexist.
  • N 1 -acetyl spermidine can be efficiently produced by using the method for improving substrate specificity by carrying out an enzymatic reaction in the presence of the above-described surfactant and under Z or PH 7.5. it can.
  • N 1 -Acetylspermidine can be obtained by acting diacetylspermine oxidase on diacetylenoperm, but at this time the substrate has substrate specificity in the reaction system.
  • the product N 1 -acetyl spermidine is less susceptible to further conversion to putrescine and the recovery is improved, which is industrially advantageous.
  • the present invention includes a method for measuring diacetylpolyamine by allowing a reagent containing polyamine oxidase to act on a sample.
  • the sample to be measured is not particularly limited, and examples thereof include urine, serum, food and extracts thereof.
  • the concentration of diacetylpolyamine contained in the measurement sample is not particularly limited, and examples thereof include ImM or lower, and the sample can be diluted as appropriate.
  • the amount of polyamine oxidase to be used is not particularly limited, and for example, it may be added so that the final concentration is 0.05-1000 U / mU, preferably 0.2-100 U / ml.
  • the pH to be applied is not particularly limited.
  • the pH is 5 to 10, preferably 6 to 9, particularly preferably 6.0 to less than 7.5.
  • the pH adjustment method is not particularly limited.
  • a general-purpose Tris buffer or phosphate buffer can be used, an organic acid buffer such as acetic acid, citrate, or oxalic acid, MES, or the like.
  • Good buffers such as BES, HEPES, TES, bicine, and tricine, amino acid buffers such as glycine-NaOH, borate buffer, Bis-Tris propane buffer, and imidazole buffer can be used.
  • an alcohol compound which is a stabilizer of polyamine oxidase, a chelating reagent, and a surfactant, which is a substrate specificity improver, may be present as appropriate.
  • the action time is, for example, 30 seconds to 120 minutes, preferably 1 to 30 minutes.
  • the working temperature is, for example, 20 to 45 ° C., and a temperature used for a normal enzyme reaction can be appropriately selected.
  • the polyamine oxidase solution added to the sample includes Tris, phosphate, acetic acid, citrate, oxalic acid, MES, BES, HEPES, TES, bicine, tricine, glycine, boric acid, Bis—Tris propane, Even if a buffer such as imidazole, a coenzyme such as FAD, an alcohol compound chelating reagent that is a stabilizer of polyamine oxidase, or a surfactant that is a substrate specificity improver of polyamine oxidase is added. Good.
  • various inorganic salts such as sodium chloride, potassium salt and sodium salt, polysaccharides such as dextran, BSA, glycerol, amino acids and the like may coexist.
  • This liquid preparation may be freeze-dried or spray-dried.
  • the product of the polyamine oxidase reaction may be measured by any method.
  • the generated hydrogen peroxide should be measured by an enzymatic measurement method using peroxidase and an appropriate coloring reagent, a luminescent reagent, or an electrical method using an enzyme electrode. Can do.
  • the aldehyde produced can be measured by combining aldehyde oxidase or aldehyde dehydrogenase with an appropriate color reagent.
  • detection reagents for reaction products using enzymes include tris, phosphoric acid, acetic acid, citrate, oxalic acid, MES, BE S, HEPES, TES, bicine, tricine, glycine, boric acid, Bis—Tris propane Buffers such as imidazole, coenzymes such as FAD, NAD, NADP, NADH, NADPH, hydrogen peroxide detection reagents such as peroxidase, 4-aminoantipyrine, phenol, TOOS, DA-67, 1-Methoxy PMS
  • redox coloring reagents such as WST-8 (formazan reagent) and enzymes such as catalase can be contained.
  • an alcohol compound that is a stabilizer of polyamine oxidase, a chelating reagent, and a surfactant that is a substrate property improving agent may be appropriately added.
  • various inorganic salts such as sodium chloride, sodium chloride potassium and azido sodium, polysaccharides such as dextran, BSA, glycerol, amino acids and the like may coexist. Freeze or spray dry this liquid formulation.
  • the polyamine oxidase reaction and its product can be detected simultaneously. It is preferable to add polyamine oxidase to the above-mentioned detection reagent for the reaction product in a range of 0.05-: L000 U / mU, preferably 0.2-: LOO U / ml. This liquid preparation may be freeze-dried or spray-dried.
  • the amount of the specimen used for the measurement of diacetyl polyamine, the addition amount of each reagent, and the ratio thereof are not particularly limited.
  • the present invention provides a reagent for measuring diacetyl polyamine used in the above measurement method.
  • the measurement reagent for diacetylpolyamine may be prepared as a liquid product, or a frozen product or a freeze-dried product of the liquid product.
  • Enzyme is diluted in A (50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing ImM EDTA and 0.2% (w / v) urine serum albumin (BSA, Sigma)) or Diluent B [Diluted appropriately with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing ImM EDTA and 5% (v / v) ethanol].
  • 0.05 ml of enzyme sample was added to the reaction solution and mixed. A total volume of 1.15 ml was reacted at 37 ° C for 3 minutes, and the change in absorbance at 555 nm of the reaction solution for 3 minutes from the start of the reaction was measured using a spectrophotometer.
  • the enzyme 1U of diacetyl spermine oxidase was defined as the amount of enzyme that produces 1 mol of hydrogen peroxide per minute when diacetyl spermine is used as a substrate under the above measurement conditions.
  • the millimolar molecular extinction coefficient under these conditions was 1.57 cm 2 Z mol.
  • This measurement method is just an example, and there is no limitation on the type, concentration, or pH of the reagent for activity measurement.
  • a phosphate buffer or the like can be used in place of the Tris-HC1 buffer.
  • the stability test of polyamine oxidase was performed by diluting enzyme samples with 50 mM phosphate buffer (PH 7.0) supplemented with various reagents, and comparing the residual activity after accelerated tests by storage at 30 ° C. went.
  • the residual activity of the enzyme solution after the acceleration test was expressed as a relative amount (%) when the amount of change in absorbance at the time of preparing the enzyme solution was taken as 100%.
  • a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) containing ImM or 5 mM chelating reagents was prepared.
  • a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 10% (vZv) ethanol as an alcohol compound and 5 mM EDTA as Z or a chelating reagent was prepared.
  • a diacetylsperminoxidase solution 0.1 lU / ml derived from Debaryomyces' Nonsenii Tsukuba42 (FERM BP-10603) described in PCTZJP2006Z310648 was prepared.
  • the above enzyme solution 0.1 lU / ml was prepared with a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) containing no reagent.
  • the enzyme protein was removed by dialyzing against water using Centrivrep 10 (Amicon).
  • Cetylspermidine dihydrochloride was obtained (yield 76%). [0087] The above 82 mg of N 1 -acetyl spermidine dihydrochloride was recrystallized from ethanol to obtain 52 mg of N 1 -acetyl spermidine dihydrochloride (yield 47%). Melting points and 1 H, 13 C—NMR measurements agreed with literature known values (“Acta Chemica Scandinavica J, (Denmark), 19 89, 43 ⁇ , p. 990—994). In the production method of N 1 -acetyl spermidine described in JP2006 / 310648, 2 U / ml diacetyl spermine oxidase was used. N 1 -acetyl spermidine dihydrochloride was obtained.
  • Triton X-100 (Non-ionic, Wako Pure Chemical Industries) 13. 2
  • Triton X-405 (Nonionic, manufactured by Nacalai Tesque) 11. 1
  • Tween 80 (nonionic, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 11.8
  • Debariomyces origin Debaryomyces. Hansenii T s u k u b a 42 ERM BP— 10603) Diacetyl spermine oxidase derived from Candida: Candida glabrata No d a l 62 (FERM
  • a 0.2M phosphate buffer solution having a pH of 6.5 to 7.5 was prepared.
  • the polyamine oxidase activity measurement method described above was performed using the Debariomyces 'Nonseneni Tsukuba42 (FERM BP-10603) -derived diacetyl spermine oxidase solution and Candida' Grabrata Nodal62 ( FER M BP-10602) -derived diacetyl spermine oxidase was measured and compared for enzyme activity against various polyamines. The results are shown in Table 4. Thus, the effect of improving the substrate specificity was recognized by making the pH less than 7.5.
  • a 0.2M phosphate buffer solution D0l ⁇ oo C (oi (pH 6.5 to 7.5) containing 0.3% TritonX-100 was prepared, and the denomination described in PCTZJP2006Z310648 was performed using the polyamine oxidase activity measurement method described above. Enzyme activity against various polyamines was measured and compared using diacetyl spermine oxidase solution derived from Riomyces'Nonsenii Tsukuba42 (FERM BP-10603), and the results are shown in Table 5. Further improvement of substrate specificity was observed by adding calorie and adjusting the pH to less than 7.5, and did not react with putretin under any of the conditions.
  • N 1 A c S pm: N 1 — Acetylspentolemin, N 1 — Ac S pd: N 1 — Acetylspermidine, N 8 — A C S pd: N 8 — Acetyls penolemidine, S pm: Spenoremin , S pd: Spenoremidin
  • TritonX 100 0.04%
  • Diacetyl sperminoxidase (derived from Debaryomyces) 24UZmL Peroxidase (derived from horseradish rust) 15UZmL
  • Diacetyl sperminoxidase (derived from Debaryomyces) 24UZmL Peroxidase (derived from horseradish rust) 15UZmL
  • a stable polyamine oxidase preparation containing an alcohol compound and Z or a chelating reagent and a polyamine oxidase is produced by a simple method and at a low cost using the stable method of the present invention. Can do.
  • a polyamine oxidase preparation with improved substrate specificity containing a surfactant and polyamine oxidase can be produced by a simple method and at low cost.
  • a reagent for measuring diacetylpolyamine can be produced by a simple method and at a low cost.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
ポリアミンォキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法
技術分野
[0001] 本発明は、臨床診断や有用物質生産等に用いられるポリアミンォキシダーゼの安 定化方法、基質特異性の改良方法、ポリアミンォキシダーゼを用いるジァセチルポリ ァミンの測定方法、及び、それらを利用してポリアミンォキシダーゼを作用させてモノ ァセチルポリアミンを製造する方法及びポリアミンォキシダーゼを精製する方法、並 びに、安定ィ匕されたポリアミンォキシダーゼ製剤及びジァセチルポリアミン測定用試 薬等に関する。 背景技術
[0002] ポリアミンとは、同一分子内に 2個以上のアミノ基を有する化合物の総称であり、ヒト の体内には、プトレツシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミンの 4種類のポリアミン とそれらのモノァセチル体及びジァセチル体が存在する。癌患者において、尿中ポリ ァミンの排泄量が増加することが 1971年に Russelによって報告されて以来、癌の診 断を目的として尿中のポリアミン含量の測定が行われてきた (例えば、非特許文献 1 参照)。尿中ポリアミンの大部分はモノアセチル体で存在するため、従来はァセチル 基を加水分解し、ァセチルポリアミンとァセチルイ匕されて ヽな 、遊離型のポリアミンを 区別しない総ポリアミン含量として測定されていた (例えば、特許文献 1参照)。
[0003] し力しながら、尿中総ポリアミンにぉ 、ては悪性腫瘍患者の中に偽陰性例が相当数 認められることが明らかになつている。また、悪性腫瘍以外にも、炎症性疾患、心筋 梗塞、肝硬変、創傷治癒過程など、種々の病態に関連して有意に上昇することが明 らかになり、腫瘍マーカーとしては実用的でないと考えられるようになった。
[0004] 近年、 N1, N12—ジァセチルスペルミン（ィ匕 1) (以下、単にジァセチルスペルミンと 記載する）と N1, N8—ジァセチルスペルミジン（ィ匕 2)の 2種類のジァセチルポリアミン が尿中に排泄されていることが見出された (例えば、非特許文献 2参照)。健常者の 尿中においては、これらの成分は総ポリアミンのそれぞれ 0. 6%、 1. 4%を占めるに すぎないが、癌患者における増加の割合が総ポリアミンと比較して際立って高ぐ既 存の腫瘍マーカーよりも真陽性率が高いことから、新たな腫瘍マーカーとして注目を 集めている（例えば、非特許文献 3、 4参照)。
[0005] [化 1]
Figure imgf000004_0001
[0006] [化 2]
Figure imgf000004_0002
[0007] ジァセチルポリアミンを特異的に測定する方法としては、例えば、 HPLC—酵素法（ 例えば、非特許文献 2参照）が挙げられる。まず検体中の各種ポリアミンを HPLCに て分離した後、 HPLC検出器中にてァセチル加水分解酵素を作用させて生じるフリ 一ポリアミンをポリアミンォキシダーゼで酸ィ匕し、生じる過酸化水素を電気化学検出 器を用いて検出する方法である。し力しながら、本方法では多数の検体を短時間で 処理できない等の問題が生じていた。最近、ジァセチルスペルミンに対する特異性 が高い抗体が取得され、本抗体を用いる間接競合 ELISA法による測定法も開発さ れたが (例えば、特許文献 2、 3、 4、非特許文献 3、 4参照）、その操作は煩雑であり、 測定値は試料の検体量に反比例するものであった。
[0008] このような背景から、ジァセチルポリアミンに特異的に作用するポリアミンォキシダー ゼゃデヒドロゲナーゼを用いて、より簡便で直接的にジァセチルポリアミンを測定でき る方法が開発されれば非常に有用であると期待されるが (例えば、非特許文献 5参照 )、これまでにこのような試みはなかった。その理由として、これまでに知られているほ とんどのポリアミンォキシダーゼは、モノァセチルポリアミン（例えば、 N1—ァセチルス ペルミン、 N1—ァセチルスペルミジン、 N8—ァセチルスペルミジン、ァセチルプトレツ シン等）ゃァミノ基がァセチルイ匕されていないフリーのポリアミン (例えば、スペルミン、 スペルミジン、プトレツシン、カタべリン等）に高い反応性を示すものであり、ジァセチ ルポリアミンの測定には不向きであったためと考えられる。
[0009] し力しながら、最近になって、本発明者等によって、ジァセチルスペルミン (ィ匕 1)に 対して高い反応性を有し、（化 3)に示す反応を触媒するポリアミンォキシダーゼがデ ノ リオミセス、キャンディダ、ピキア等から単離された（PCTZJP2006Z310648参 照)。
[0010] [化 3]
Figure imgf000005_0001
^ AcHN^^N^^^N H2 + O^^^NHAc + H202
[0011] このようなポリアミンォキシダーゼはジァセチルスペルミンの測定に有用であると考 えられるが、実用化に向けては、酵素の安定性とジァセチルスペルミンに対する特異 性をさらに改善することが必要であると考えられた。
[0012] まず、酵素の安定性について説明する。一般的に、酵素は液体に溶解した状態で は不安定であると 、う欠点を有して 、る。ポリアミンォキシダーゼにつ 、ても例外では なぐこの解決策として、種々の安定ィ匕方法が試みられてきたが有効な方法はなかつ た。
[0013] 次に、酵素の基質特異性について説明する。本発明者等によって発見された上記 の酵素は、ジァセチルスペルミンに対する反応性を 100%とすると、例えば、 N1—ァ セチルスペルミジンにはそれぞれ約 30%、 50%、 90% (pH7. 5 リン酸緩衝液条件 下）の反応性を示すものであり、ジァセチルスペルミン以外のポリアミンも測定してしま うという問題が生じていた。
[0014] また、ポリアミンォキシダーゼは、ジァセチルポリアミンの測定という用途以外にも、 ジァセチルスペルミン（化 1)力 医薬品や農薬の原料として有用な N1—ァセチルス ペルミジン (ィ匕 4)を製造する方法に利用できることが報告されて ヽる (PCT/JP200 67310648)。本法は、従来より知られていた有機合成法 (例えば、非特許文献 6、 7参照）と比較すると工程数が少なぐ簡便であるものの、酵素が不安定であるために 多量の酵素が必要となるという欠点を有していた。また、基質特異性が不十分である ために、生成する N1 ァセチルスペルミジンの一部がプトレツシンに変換されてしま い、収率が低下してしまうという欠点も有していた。
[化 4]
Figure imgf000006_0001
[0016] 特許文献 1 :特開平 1 85080号公報
特許文献 2： WO 2004Z081569ノ ンフレット
特許文献 3：特開 2006 - 38594号公報
特許文献 4：特開 2006— 199655号公報
非特許文献 1：「Cancer ResearchJ , (米国）， 1971年， 31卷， p. 1555- 1558 非特許文献 2 :「Journal of BiochemistryJ , (日本）, 1995年， 117卷， p. 107 - 112
非特許文献 3 :「Clinical Cancer Research] , (米国）, 2005年， 11卷, p. 2986 - 2990
非特許文献 4:「Journal of BiochemistryJ , (日本）， 2006年， 139卷， p. 315 - 322
非特許文献 5 :「Clinica Chimica ActaJ , (蘭国）， 2004年， 340卷， ρ219— 22 7
非特干文献 6： journal of Chemical society, Perkm Transactions I」 , ( 英国）， 1988年， p. 1905- 1911
非特許文献 7 :「Acta Chemica ScandinavicaJ , (デンマーク）， 1989年， 43卷， p. 990- 994
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0017] 本発明の課題は、ポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕方法、基質特異性の改良方法、 及びポリアミンォキシダーゼを用いるジァセチルポリアミンの測定方法、及び、それら を利用してポリアミンォキシダーゼを作用させてモノァセチルポリアミンを製造する方 法及びポリアミンォキシダーゼを精製する方法、並びに、安定ィ匕されたポリアミンォキ シダーゼ製剤及びジァセチルポリアミン測定用試薬を提供することである。
課題を解決するための手段
[0018] 本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、（1)アルコールィ匕 合物及び Z又はキレート試薬を共存させることにより、ポリアミンォキシダーゼの安定 性が向上すること、（2)界面活性剤を共存させることにより、ポリアミンォキシダーゼの 基質特異性が改良されること、（3)ポリアミンォキシダーゼを pH7. 5未満で作用させ ることにより、ポリアミンォキシダーゼの基質特異性が改良されることなどを見出し、こ れらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
[0019] すなわち、本発明は、以下に関する。
(1)アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬と、ポリアミンォキシダーゼを共存さ せることを特徴とする、ポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕方法。
(2)ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、上記（1)に 記載のポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕方法。
(3)界面活性剤存在下にてポリアミンォキシダーゼを作用させることを特徴とする、ポ リアミンォキシダーゼの基質特異性の改良方法。
(4)ポリアミンォキシダーゼを pH7. 5未満で作用させることを特徴とする、ポリアミン ォキシダーゼの基質特異性の改良方法。
(5)ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、上記（3)〜 (4)の 、ずれかに記載のポリアミンォキシダーゼの基質特異性の改良方法。
(6)ポリアミンォキシダーゼを含有する試薬を試料に作用させて、ジァセチルポリアミ ンを測定することを特徴とする、ジァセチルポリアミンの測定方法。
(7)アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬により安定ィ匕されたポリアミンォキシ ダーゼを用いることを特徴とする、上記（6)に記載の測定方法。
(8)界面活性剤により基質特異性が改良されたポリアミンォキシダーゼを用いること を特徴とする、上記（6)〜（7)の 、ずれかに記載の測定方法。 (9)ポリアミンォキシダーゼを pH7. 5未満で作用させることを特徴とする、上記（6)〜 (8)の 、ずれかに記載の測定方法。
(10)ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、上記（6) 〜（9)の 、ずれかに記載のジァセチルポリアミンの測定方法。
(11)アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬と、ポリアミンォキシダーゼを含有す ることを特徴とする、安定化されたポリアミンォキシダーゼ製剤。
(12)ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、上記 16に 記載の安定ィ匕されたポリアミンォキシダーゼ製剤。
(13)ポリアミンォキシダーゼを含有することを特徴とする、ジァセチルポリアミンの測 定試薬。
(14)アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬と、ポリアミンォキシダーゼを含有す ることを特徴とする上記（13)に記載のジァセチルポリアミンの測定試薬。
(15)界面活性剤とポリアミンォキシダーゼを含有することを特徴とする上記（13)又 は（14)のいずれかに記載のジァセチルポリアミン測定試薬。
(16)ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、上記（13) 〜（15)のいずれかに記載のジァセチルポリアミン測定試薬。
(17)上記（1)又は（2)記載のポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕方法、及び Z又は上 記（3)〜（5)の 、ずれか一項に記載のポリアミンォキシダーゼの基質特異性の改良 方法を利用することを特徴とする、ジァセチルポリアミンにポリアミンォキシダーゼを作 用させてモノァセチルポリアミンを製造する方法。
(18)ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、上記（17) 記載のモノァセチルポリアミンの製造方法。
(19)上記（1)又は（2)記載のポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕方法を利用することを 特徴とする、ポリアミンォキシダーゼの精製方法。
(20)ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、上記（19) 記載のポリアミンォキシダーゼの精製方法。
発明の効果
本発明の方法によれば、アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬を共存させる ことにより、ポリアミンォキシダーゼを安定ィ匕することができる。また、界面活性剤を共 存させる及び Z又は PH7. 5未満の条件下とすることにより、ポリアミンォキシダーゼ の基質特異性を改良することができる。さらに、このような安定ィ匕方法及び Z又は基 質特異性の改良方法を用いて、ジァセチルポリアミンへポリアミンォキシダーゼを作 用させてモノァセチルポリアミンを製造したり、ポリアミンォキシダーゼを用 V、ることに よりジァセチルポリアミンを測定することができる。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1]アルコールィ匕合物とキレート試薬を共存させることによる酵素の安定ィ匕効果を 示すグラフである。
[図 2]ポリアミンォキシダーゼ製剤の熱安定性を示すグラフである。
[図 3]ジァセチルスペルミンォキシダーゼを含有する試薬を用い、ジァセチルスペルミ ン試料を測定したときの濃度と吸光度の関係を示すグラフである。
[図 4]ジァセチルスペルミンォキシダーゼを含有する試薬を用い、尿にジァセチルス ペルミンを添加した試料を測定したときの濃度と吸光度の関係を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
[0022] 以下、本発明を詳細に説明する。本発明に用いられる「ポリアミンォキシダーゼ」は 、ジァセチルポリアミンを酸素存在下で酸化して、モノァセチルポリアミン、アルデヒド 及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であり、如何なる起源のものでも用 いることができる。例えば、微生物、植物、あるいは動物などの生産するポリアミンォ キシダーゼ等、いずれであってもよぐ特に制限されない。例えば、酵母等を起源と するポリアミンォキシダーゼ等が挙げられ、好ましくはデバリオミセス属、キャンディダ 属、ピキア属由来の酵素等が用いられる。
[0023] さらに具体的には、デバリオミセス'ハンセニイ（Debaryomyces hansenii)、デバリオ セス'マフマ (Debaryomyces maramaノ、ァノ リオ セス'マフムス (Debaryomyces mar amus)、キャンディダ'グラブラタ（Candida glabrata)及び「FEBS Letters] , (英国） , 2000年， 476卷， p. 150— 154に記載のキャンディダ 'ボイディ-ィ（Candida boid inii)由来のポリアミンォキシダーゼ等が好ましく用いられる。
[0024] ポリアミンォキシダーゼの中でも、特にジァセチルスペルミンォキシダーゼは好まし く用いられる。ここで述べるジァセチルスペルミンォキシダーゼとは、 N1—ァセチルス ペルミン、 N1—ァセチルスペルミジン、 N8—ァセチルスペルミジンに対する活性より もジァセチルスペルミンに対する活性が高 、ポリアミンォキシダーゼを指し、例えば、 デバリオミセス'ノヽンセニイ、デノ リオミセス'マラマ、デノ リオミセス'マラムス、キャン デイダ ·グラブラタ、ピキア ·ミヌタ由来のジァセチルスペルミンォキシダーゼ等が挙げ られる。
[0025] このようなジァセチルスペルミンォキシダーゼの好適例として、 PCTZJP2006Z3
10648に記載されている以下の酵素を挙げることができる。
[0026] すなわち、以下の（la)〜（lg)に記載の理ィ匕学的性質をそれぞれ若しくはそれらを 適宜併せて有するジァセチルスペルミンォキシダーゼ（なお、下記の酵素の理化学 的性質は、測定上不可避的な誤差を含んでいる）：
[0027] (la)作用：化 3に示したとおり、酸素存在下にてジァセチルスペルミンの 2級ァミンの
C— N結合を開裂して、 N1—ァセチルスペルミジン、 3—ァセトアミドプロパナール及 び過酸化水素を生成する。
(lb)基質特異性：ジァセチルスペルミン > N1—ァセチルスペルミン， N1 -ァセチル スペルミジン， N8—ァセチルスペルミジン
例えば、 pH7. 5の条件下において、ジァセチルスペルミンを基質として用いたとき の活性を 100としたとき、 N1—ァセチルスペルミン、 N1—ァセチルスペルミジン、 N8 —ァセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が 90以下、好ましくは 60以下 、さらに好ましくは 50以下、もっとも好ましくは 40以下である理ィ匕学的性質を有する 本発明酵素などが挙げられる。本評価における pHの条件や緩衝液の種類と濃度に つ!ヽてはなんら制限されな!ヽ。
(lc)至適 pH : 6. 5〜8. 5
例えば、緩衝液として 200mM酢酸緩衝液 (pH4. 5〜6. 0)、 200mMリン酸カリ ゥム緩衝液（ρΗ6. 0〜8. 0)、 200mM PIPES -NaOH (pH6. 5〜7. 5)、 200m Mトリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5〜9. 5)を用い、それぞれの pHにおいて、温度 37 °Cにて酵素反応を行い、至適 pHを求める。例えば、至適 pHとして pH6. 5〜8. 5、 好ましくは pH7. 0〜8. 0の理ィ匕学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。 (Id)安定 pH : 6. 0〜8. 0
例えば、緩衝液として 200mM酢酸緩衝液 (pH4. 5〜6. 0)、 200mMリン酸カリ ゥム緩衝液（ρΗ6. 0〜8. 0)、 200mM PIPES -NaOH (pH6. 5〜7. 5)、 200m Mトリス—塩酸緩衝液（pH7. 5〜9. 5)を用い、それぞれの pHにおいて、 30°Cで 3 0分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定 pHの範囲とし て、 pH6. 0〜8. 0、好ましくは pH6. 5〜7. 5の理化学的性質を有する本発明酵素 などが挙げられる。
(le)至適温度： 37〜55°C
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種 々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適 温の範囲として 37〜55°Cの理ィ匕学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。 (If)熱安定性： 37°C以下
例えば、 200mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)を用い、それぞれの温度におい て 30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは 90% 以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例 えば、酵素が安定に存在できる範囲として、 37°C以下の理化学的性質を有する本発 明酵素などが挙げられる。
(lg)分子量:約 92, 000 (ゲルろ過法）
分子量はゲルろ過法、 Native PAGE法、 SDS— PAGE法等を用いて測定する ことができる。本発明酵素の分子量については特に限定されないが、例えば、分子 量の一例として、分子量約 92, 000 (ゲルろ過法)の本発明酵素などが挙げられる。 以下の（2a)〜（2g)に記載の理ィ匕学的性質をそれぞれ若しくはそれらを適宜併せ て有するジァセチルスペルミンォキシダーゼ (なお、下記の酵素の理ィ匕学的性質は、 測定上不可避的な誤差を含んでいる）：
(2a)作用：化 3に示したとおり、酸素存在下にてジァセチルスペルミンの 2級ァミンの C— N結合を開裂して、 N1—ァセチルスペルミジン、 3—ァセトアミドプロパナール及 び過酸化水素を生成する。
(2b)基質特異性：ジァセチルスペルミン > N1—ァセチルスペルミン， N1 -ァセチル スペルミジン， N8—ァセチルスペルミジン
例えば、 pH7. 5の条件下において、ジァセチルスペルミンを基質として用いたとき の活性を 100としたとき、 N1—ァセチルスペルミン、 N1—ァセチルスペルミジン、 N8 —ァセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が 90以下、好ましくは 60以下 、さらに好ましくは 50以下である理ィ匕学的性質を有する本発明酵素などが挙げられ る。本評価における pHの条件や緩衝液の種類と濃度にっ ヽてはなんら制限されな い。
(2c)至適 pH : 7. 0〜8. 5
例えば、緩衝液として 200mM酢酸緩衝液 (pH4. 5〜6. 0)、 200mMリン酸カリ ゥム緩衝液（ρΗ6. 0〜8. 0)、 200mM PIPES -NaOH (pH6. 5〜7. 5)、 200m Mトリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5〜9. 5)を用い、それぞれの pHにおいて、温度 37 °Cにて酵素反応を行い、至適 pHを求める。例えば、至適 pHとして pH7. 0〜8. 5、 好ましくは pH7. 5〜8. 0の理ィ匕学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。 (2d)安定 pH : 5. 5〜9. 5
例えば、緩衝液として 200mM酢酸緩衝液 (pH4. 5〜6. 0)、 200mMリン酸カリ ゥム緩衝液（ρΗ6. 0〜8. 0)、 200mM PIPES -NaOH (pH6. 5〜7. 5)、 200m Mトリス—塩酸緩衝液（pH7. 5〜9. 5)を用い、それぞれの pHにおいて、 30°Cで 3 0分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定 pHの範囲とし て、 pH5. 5〜9. 5、好ましくは pH6. 5〜9. 0の理化学的性質を有する本発明酵素 などが挙げられる。
(2e)至適温度： 45〜55°C
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種 々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適 温の範囲として 45〜55°Cの理ィ匕学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。 (2f)熱安定性： 37°C以下
例えば、 200mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)を用い、それぞれの温度におい て 30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは 90% 以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例 えば、酵素が安定に存在できる範囲として、 37°C以下の理化学的性質を有する本発 明酵素などが挙げられる。
(2g)分子量:約 90, 000 (ゲルろ過法）
分子量は、ゲルろ過法、 Native PAGE法、 SDS— PAGE法等を用いて測定する ことができる。本発明酵素の分子量については、特に限定されないが、例えば、分子 量の一例として、分子量約 90, 000 (ゲルろ過法)の本発明酵素などが挙げられる。
[0029] なお、上記の一番目に挙げた酵素はデバリオミセス マラマ HUT 7199、デバリ ォミセス マラムス NBRC 0668及びデノリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 ( FERM BP— 10603)、並びに、上記の二番目に挙げた酵素はキャンディダ グラ ブラタ Noda 162がそれぞれ生産するもので、当業者であれば、これらの菌体から 容易に調製することができるし、酵素をコードする遺伝子をクローユングして、大腸菌 や酵母等の他の宿主で組換え発現させて調製することもできる。
[0030] デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP— 10603)及びキャンデ イダ グラブラタ Noda 162 (FERM BP— 10602)は、本発明者らが茨城県内 及び千葉県内の土壌よりそれぞれ分離して得た菌株であり、 2006年 5月 10日付け で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の 微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき寄託され、それぞれ、 受託番号 FERM BP— 10603、及び、 FERM BP— 10602が付与されている。
[0031] ポリアミンォキシダーゼには、 FAD又は銅を補酵素とするものが知られており、特に 限定はされな ヽが、 FADを補酵素として利用するポリアミンォキシダーゼが望ま ヽ 。これらのポリアミンォキシダーゼは、遺伝子組換え体によって製造されたものも用い ることがでさる。
[0032] [ポリアミンォキシダーゼの安定性の向上]
本発明にお 、て、ポリアミンォキシダーゼの安定性を向上させるために共存させる アルコール化合物とは、ヒドロキシル基 (OH)を有する有機化合物であり、そのような 官能基を有する化合物であれば当業者に公知の如何なる化合物でも本発明に用い ることができる。特に脂肪族炭化水素の 1個又は複数個の水素原子をヒドロキシル基 で置換した有機化合物は、入手が容易であることから好ましく用いられる。より具体的 には、例えば、メタノール、エタノール、 1 プロパノール、 2—プロパノール、エチレン グリコール及びグリセロール等の脂肪族アルコール、並びにトレハロース、キシリトー ル、スクロース及びグルコース等の糖類が挙げられる。本発明においては、上記アル コールィ匕合物は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。
[0033] ポリアミンォキシダーゼと共存させる前記アルコール化合物の溶液中の濃度につい ては、ポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕効果が発揮され、かつ酵素を含む試薬を取り 扱う上で不都合のない範囲内であれば特に限定されず、各化合物について適切な 安定ィ匕効果が認められる濃度で添加することができる。好ましくは 0. 5〜20%、より 好ましくは 1〜10% (以下、特に断りがない限り、「体積％」を意味する）の濃度で用い られる。
[0034] 本発明において、ポリアミンォキシダーゼの安定性を向上させるために共存させる キレート試薬とは、金属イオンに配位しキレートイ匕合物を与えるような化合物であり、 そのような作用を有する化合物であれば当業者に公知の如何なる化合物でも本発明 に用いることができる。
[0035] 例えば、エチレンジァミン 4酢酸（Ethylenediamine— N, N, Ν， , Ν，— tetraacet ic acid, (以下「EDTA」と称する））、 1, 2 - Diaminopropane - N, N, N，， N，一 t etraacetic acid (以下「Me— EDTA」と称する）、 N— ( 2 - Hydroxymethyl) ethy lenediamine-N, N, N，， N，一 tetraacetic acid (以下「EDTA— OH」と称する） 、 trans— 1, 2― Diaminocyclohexane― N, N, N' , N'— tetraacetic acid (以 下「CyDTA」と称する）、 1 , 3— Diamino— 2— hydroxypropane— N, N, N，， N， -tetraacetic acid (以下「DTPA— OH」と称する）、 O, Ο '— Bis (2— aminoethy 1) ethyleneglycol-N, N, N，， N，—tetraacetic acid (以下「EGTA」と称する）、 Triethylenetetramine— N, N, N' , , , — hexaacetic acid (以下 「TTHA」と称する）などのポリアミンカルボン酸系のキレート試薬や、クェン酸、リンゴ 酸、イソクェン酸などのォキシカルボン酸系のキレート試薬等が挙げられる。上記キレ ート試薬に配位する塩の有無、種類や数については何ら限定されるものではないが 、例えば、ナトリウム塩ィ匕合物が好ましく用いられる。
[0036] 上記キレート試薬は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。ま た、上記キレート試薬によって安定ィ匕させるポリアミンォキシダーゼとして、例えば、 酵母等を起源とするポリアミンォキシダーゼが挙げられ、さらに具体的には、デバリオ ミセス'ハンセニイ、デノ リオミセス.マラマ、デノ リオミセス.マラムス、キャンディダ.グ ラブラタ由来のジァセチルスペルミンォキシダーゼ、及び「FEBS Letters] , (英国 ) , 2000年， 476卷， p. 150— 154に記載のキャンディダ 'ボイディ-ィ由来の Ν1— ァセチルスペルミジンォキシダーゼ等が挙げられる。
[0037] ポリアミンォキシダーゼと共存させる前記キレート試薬の溶液中の濃度については 、ポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕効果が発揮され、かつ酵素を含む試薬を取り扱う 上で不都合のない範囲内であれば特に限定されないが、好ましくは 0. 01〜50mM 、より好ましくは 1〜： LOmMの濃度で用いられる。
[0038] さらに、前記アルコール化合物と前記キレート試薬を併用することにより、ポリアミン ォキシダーゼを安定ィ匕させることができる。前記アルコールィ匕合物と前記キレート試 薬は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。
[0039] このとき、必要により、その他の試薬が共存していてもよい。通常、アルコール化合 物及び Z又はキレート試薬、ポリアミンォキシダーゼ及び他の試薬等が添加された固 体粉末若しくはそれらの溶液をそれぞれ適宜混合することにより共存させることがで きる。
[0040] 本発明の安定ィ匕方法に用いられるポリアミンォキシダーゼの濃度は、特に制限され ないが、例えば、溶液の場合、 0. 05〜： LOOO U/mU好ましくは 0. 2〜： LOO U/ml である。この酵素溶液には、 FAD、 NAD、 NADP、 NADH、 NADPH等の補酵素 、ペルォキシダーゼ、 4—ァミノアンチピリン、フエノール、 N ェチル N—スルホプ 口ピル— m—トルイジン (TOOS)、 10— (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）— 3, 7 ビス (ジメチルァミノ)フエノチアジンナトリウム塩 (DA— 67)等の過酸化水素検出 試薬、 1 Methoxy PMSや WST— 8 (ホルマザン試薬）等の酸化還元系発色試 薬、カタラーゼ等の酵素、ジァセチルスペルミン等の各種ポリアミン類のいずれか 1つ 以上を含有させることもできる。
[0041] 一般に酵素は、保存時の pHによりその安定性が大きく影響を受けるため、安定な p H域の種々の緩衝液を同時に用いることが好ましい。本発明の酵素の安定ィ匕におい て用いられる緩衝液の種類及びその濃度、 pHは特に限定されるものではないが、例 えば、 pH6〜10の間で緩衝能を有し、かつ必要十分な緩衝能を保つ濃度に設定さ れていることが望ましい。この様な緩衝液として、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン 酸緩衝液を挙げることもできるし、酢酸、クェン酸、シユウ酸等の有機酸系緩衝液、 M ES、 BES、 HEPES、 TES、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン— NaOH などのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、 Bis-Tris propane緩衝液、イミダゾール 緩衝液などを使用することもできる。
[0042] 酵素を保存する際の緩衝液の濃度については特に限定されないが、好ましくは 5
〜500mM、さらに好ましくは 20〜100mMである。本発明のアルコール化合物及び Z又はキレート試薬を緩衝液に添加する場合は、直接添加するか、又は、例えば、 p H6〜10、好ましくは pH6〜8に調整したそれらの水溶液を添カ卩すればよい。アルコ 一ルイ匕合物及び Z又はキレート試薬を添加することにより、 PHが目的とする範囲か ら外れるときは、例えば、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、アンモニア 水等の添カ卩により pHが目的の範囲内におさまるように調整するのが好適である。
[0043] さらに、その他の試薬として、必要により、例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、ァ ジ化ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、ゥシ血清アルブミン (BSA )、グリセロール、アミノ酸、界面活性剤、抗生物質、サルファ剤等の化学療法剤等を 共存させてもよい。これらの試薬は、あら力じめ緩衝液に添カロしておいてもよい。
[0044] 安定性の評価は、実際に用いる酵素の保存条件、輸送条件及び測定条件などに 即した種々の条件下に、ポリアミンォキシダーゼを保存、放置して、経時的にその変 化を測定することにより行なわれるが、一般に、短時間で評価を行うために、通常、加 速試験が用いられる。例えば、一定の高温下にポリアミンォキシダーゼを保温して、 経時的にその変化を測定する方法などが挙げられる。
[0045] [安定ィ匕されたポリアミンォキシダーゼ製剤]
この様にして、アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬を共存させることにより、 ポリアミンォキシダーゼ、特にジァセチルスペルミンォキシダーゼを安定ィ匕することが できる。この安定ィ匕方法を用いて、アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬と、ポ リアミンォキシダーゼを含有する安定ィ匕されたポリアミンォキシダーゼ製剤を製造す ることがでさる。
[0046] 例えば、アルコール化合物を 1〜10%、及び Z又はキレート試薬を l〜50mMの 濃度で含有する、 PH6〜： LOの緩衝液を調製し、この緩衝液にポリアミンォキシダー ゼを濃度が 0. 05〜： LOOOUZmlとなるように添加する。次に、 FADなどの補酵素を 0. 01〜： LOmMとなるように添カ卩してもよい。さらに、必要により、例えば、ペルォキシ ダーゼを 10〜： LOOOUZml、TOOSを 0. 05〜5mM、 4ーァミノアンチピリンを 0. 1 〜20mMとなるように加えてもよい。この混合液を撹拌し、ポリアミンォキシダーゼ製 剤を製造することができる。
[0047] さらに、必要により、この液状の製剤を凍結乾燥や噴霧乾燥してもよい。このように して得られたポリアミンォキシダーゼ製剤は、従来の方法により製造された製剤に比 ベて著しく安定化されており、本発明の方法により、簡単な方法でかつ安価に、安定 化されたポリアミンォキシダーゼ製剤を製造することができる。
[0048] [ポリアミンォキシダーゼの精製方法]
また、この安定ィ匕方法を用いて、精製したポリアミンォキシダーゼを製造することが できる。酵素の精製法としては、通常の酵素精製に用いられる方法が使用でき、例え ば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグ ラフ法、疎水クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わ せて行うのが好ましい。例えば、これらの精製工程のいずれか 1工程若しくは複数の 工程において、アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬を添加、共存させることに よってポリアミンォキシダーゼを安定ィ匕した状態で単離精製することができる。これに より酵素を高い回収率で製造することが可能となる。
[0049] さらに具体的には、 PCTZJP2006Z310648に記載のジァセチルスペルミンォキ シダーゼは、ダイノーミルによる菌体破砕、硫安沈殿、透析、陰イオン交換カラムクロ マトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過等を組み合わせて精製す るが、これらの工程の ヽずれか 1工程若しくは複数の工程にぉ ヽてアルコール化合 物及び Z又はキレート試薬を添加、共存させることによりジァセチルスペルミンォキシ ダーゼを安定ィ匕した状態で単離精製することができる。
[0050] さらに、この安定ィ匕方法を用いて、 N1—ァセチルスペルミジンを効率よく製造するこ とができる。例えば、 PCTZJP2006Z310648〖こ記載のよう〖こ、ジァセチルスペルミ ンに対してジァセチルスペルミンォキシダーゼを作用させることにより、 N1 -ァセチル スペルミジンを得ることができる力 このとき反応系にアルコールィ匕合物及び Z又は キレート試薬を添加、共存させることによってジァセチルスペルミンォキシダーゼが安 定化されるため、より少量の酵素で反応を行うことが可能となり、産業上有利である。
[0051] 上記の反応は、通常緩衝液中で行うが、必要に応じ、カタラーゼ等の過酸化水素 消去酵素やアジィ匕ナトリウム等の防腐剤を添加してもよい。緩衝液としては、 pH5〜l 0の通常の緩衝液であれば特に限定さないが、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン 酸緩衝液を挙げることもできるし、酢酸、クェン酸、シユウ酸等の有機酸系緩衝液、 M ES、 BES、 HEPES、 TES、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン— NaOH などのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、 Bis-Tris propane緩衝液、イミダゾール 緩衝液等を挙げることができる。反応時間はいかなる時間でもよいが、 1時間から 3日 間、好ましくは 3時間から 2日間程度で反応を停止させるのが好ましい。
[0052] [ポリアミンォキシダーゼの基質特異性の改良]
本発明において、「ポリアミンォキシダーゼの基質特異性の改良」とは、ポリアミンォ キシダーゼの「ジァセチルスペルミンに対する反応性」の「その他のポリアミンに対す る反応性」に対する比、すなわち、「ジァセチルスペルミンに対する反応性 Zその他 のポリアミンに対する反応性」を向上させることを!、う。ここで 、う「その他のポリアミン」 とは、例えば、 N1—ァセチルスペルミン、 N1—ァセチルスペルミジン、 N8—ァセチル スペルミジン、スペルミン、スペルミジンなどを指す。
[0053] 基質特異性の評価は、酵素活性の測定に用いる反応液に添加する基質の種類を 変えて酵素活性を測定し、ジァセチルスペルミンに対する反応性とその他のポリアミ ンに対する反応性を比較することにより行う。ここでいう「その他のポリアミン」とは、例 えば、 N1—ァセチルスペルミン、 N1—ァセチルスペルミジン、 N8—ァセチルスペルミ ジン、スペルミン、スペルミジンなど測定する方法などが挙げられる。簡易的な評価を 行うために、ジァセチルポリアミンに対する反応性と 1種類のその他のポリアミン (例え ば、 N1—ァセチルスペルミジン）に対する反応性を比較して評価することもできる。
[0054] 本発明にお 、て、ポリアミンォキシダーゼの基質特異性を改良するために使用する 界面活性剤とは、親水基と親油基 (疎水基)とで構成されており、水に溶けて水の表 面張力を低下させる活性を示す物質であり、そのような化合物であれば如何なるィ匕 合物でも用いることができる。一般的に、親水基の種類によって界面活性剤は、了二 オン界面活性剤 (陰イオン界面活性剤)、カチオン界面活性剤（陽イオン界面活性剤
)、非イオン性界面活性剤 (ノ-オン界面活性剤)、両性界面活性剤の 4種に分類さ れている。
[0055] ァ-オン界面活性剤（陰イオン界面活性剤）とは、水中で電離して有機陰イオンと なるものであり、例えば、界面活性剤の分子中の親油基を Rとすると、 RCOONa、 R SO Na、 RSO Naなどがある。
3 4
[0056] カチオン界面活性剤（陽イオン界面活性剤）とは、水中で電離して有機陽イオンと なるものであり、例えば界面活性剤の分子中の親油基を R、ハロゲンを Xとすると、 R -NH X、 [Κ 4Ν]Χ(第 4級アンモ-ゥム塩）、 (C Η— N)RX (アルキルピリ
3 5 5
ジニゥム塩)などがある。
[0057] 非イオン性界面活性剤 (ノ-オン界面活性剤）とは、親水基が非イオン性のもので あり、親水基としてよく用いられるものとして、例えば、ォキシエチレン基（一 CH CH
2 2 o— )、ソルビタン、ショ糖のエステル、グリセリン誘導体のモノグリセリドなどがあり、例 えば、界面活性剤の分子中の親油基を Rとすると、 RO (CH CH O) H、 RCOO (
2 2 η
CH CH O) Hなどがある。
2 2 η
[0058] 両性界面活性剤とは、分子内にァニオン基とカチオン基の両方をあわせもつている ものである。
[0059] 各種界面活性剤の中でも、特に非イオン性界面活性剤と両性界面活性剤はポリア ミンォキシダーゼの基質特異性を向上させるためにより好ましく用いられる。さらに具 体的には、非イオン性界面活性剤として、例えば、 Triton X— 100 [Polyoxyethy lene (10J Octylphenyl Ether]、 Triton X— 405 [p— tertiary Octylphenox y— Polyethoxy Ethanols]、 Tween 20 [Polyoxyethylene (20) Sorbitan Mo nolaurate]、 Tween 40 [Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monopalmitate]、 T ween 80 [Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monooleate]、 Tween 85 [Polyo xyethylene (20) Sorbitan Trioleate]、 Brij 35 [Polyoxyethylene (23) Lauryl Ether]、 Brij 58 [Polyoxyethylene (20) Cetyl Ether]、 Brij 78 [Polyoxyeth ylene (20) Stearyl Ether]、エマノレゲン 913 (Nonyl Phenol Ethoxylate) などが挙げられ、両性界面活性剤として、例えば、 3 ' - [ (3 - Cholamidopropyl) di methyl— ammonioj— 2— hydroxypropane— sulfonic acid (CHAPSO)など が挙げられる。
[0060] 上記界面活性剤は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。
[0061] ポリアミンォキシダーゼと前記界面活性剤を同一の試薬内にあら力じめ混合し、共 存する形で用いることができる。若しくは、ポリアミンォキシダーゼによる反応が進行 するときに前記界面活性剤が存在していればよいので、例えば、ポリアミンォキシダ ーゼを含有する試薬 Aと前記界面活性剤を含有する試薬 Bをそれぞれ別途調製し、 これらを適宜混合して、前記界面活性剤存在下でポリアミンォキシダーゼ反応を進 行させることもできる。ポリアミンォキシダーゼと共存するときの前記界面活性剤の濃 度については特に限定されず、各化合物について適切な基質特異性改良効果が認 められる濃度で添加することができる。好ましくは 0. 001〜20%、より好ましくは 0. 0 1〜5%の濃度で用いられる。
[0062] 本発明の界面活性剤による基質特異性の改善にぉ ヽて用いられる緩衝液の種類 及びその濃度、 pHは特に限定されるものではないが、例えば、 pH5〜： L0の間で緩 衝能を有し、かつ必要十分な緩衝能を保つ濃度に設定されていることが望ましい。こ の様な緩衝液として、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン酸緩衝液を挙げることもで きるし、酢酸、クェン酸、シユウ酸等の有機酸系緩衝液、 MES、 BES、 HEPES、 TE S、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン一 NaOHなどのアミノ酸系緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 Bis-Tris propane緩衝液、イミダゾール緩衝液などを使用すること もできる。緩衝液の濃度については、例えば、好ましくは 5〜500mM、さらに好ましく は 20〜： LOOmMである。
[0063] また、ポリアミンォキシダーゼの基質特異性を改良するため、 pH7. 5未満にて酵素 反応を行う方法も挙げられる。より好ましい pH条件として、例えば、 6. 0以上 7. 5未 満が挙げられる。本発明においては、同様にポリアミンォキシダーゼの基質特異性を 改良する効果が得られる上記界面活性剤を共存させることもできる。 [0064] ポリアミンォキシダーゼは、 pH7. 5未満、より好ましくは pH6. 0以上 7. 5未満の試 薬内にあら力じめ含有される形で用いることができる。又は、ポリアミンォキシダーゼ による反応が進行するときに PH7. 5未満、より好ましくは pH6. 0以上 7. 5未満にな つていればよいので、例えば、 2種以上の試薬 (いずれカゝがポリアミンォキシダーゼを 含有する）をそれぞれ別途調製し、これらを適宜混合して、 pH7. 5未満、より好ましく は PH6. 0以上 7. 5未満の条件となるようにしてポリアミンォキシダーゼ反応を進行さ せることちでさる。
[0065] 本発明の上記の界面活性剤存在下及び Z又は PH7. 5未満にて酵素反応を行うこ とによる基質特異性の改良に用いられるポリアミンォキシダーゼの濃度は、特に制限 されないが、例えば、溶液の場合、 0. 05〜： LOOO U/mU好ましくは 0. 2〜： LOO U Zmlである。この酵素溶液には、 FAD、 NAD、 NADP、 NADH、 NADPH等の補 酵素、ペルォキシダーゼ、 4—ァミノアンチピリン、フエノール、 TOOS、 DA— 67等の 過酸化水素検出試薬、 1 -Methoxy PMSや WST— 8 (ホルマザン試薬）等の酸 化還元系発色試薬、カタラーゼ等の酵素、ジァセチルスペルミン等の各種ポリアミン 類の!/、ずれか 1つ以上が存在して!/、てもよ!/、。
[0066] さらに、その他の試薬として、既に記載したような安定化剤であるアルコールィ匕合物 及び Z又はキレート試薬やその他の試薬を共存させて用いることもできる。また、必 要により、例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、アジィ匕ナトリウム等の各種無機塩、 デキストラン等の多糖類、ゥシ血清アルブミン (BSA)、グリセロール、アミノ酸、抗生 物質、サルファ剤等の化学療法剤等を共存させてもよい。
[0067] さらに、上記の界面活性剤存在下及び Z又は PH7. 5未満にて酵素反応を行うこと による基質特異性の改良方法を用いて、 N1—ァセチルスペルミジンを効率よく製造 することができる。例えば、 PCTZJP2006Z310648〖こ記載のよう〖こ、ジァセチノレス ペルミンに対してジァセチルスペルミンォキシダーゼを作用させることにより、 N1—ァ セチルスペルミジンを得ることができるが、このとき反応系に基質特異性が向上して いるため、生成物である N1—ァセチルスペルミジンがさらなるプトレツシンへの変換を 受けにくくなり、回収率が向上するため、産業上有利である。
[0068] [ジァセチルポリアミンの測定方法] さらに本発明は、ポリアミンォキシダーゼを含有する試薬を試料に作用させて、ジァ セチルポリアミンを測定する方法も含む。測定検体は特に限定されないが、例えば、 尿、血清、食品やその抽出物等が挙げられる。測定検体中に含まれるジァセチルポ リアミンの濃度についても特に限定されないが、例えば、 ImM以下が挙げられるし、 検体は適宜希釈することができる。用いるポリアミンォキシダーゼの量は、特に制限さ れないが、例えば、終濃度が 0. 05-1000 U/mU好ましくは 0. 2-100 U/ml となるように添加すればよい。作用させる pHは特に限定されるものではないが、例え ば、 pH5〜10、好ましくは pH6〜9、特に好ましくは pH6. 0以上 7. 5未満である。 p Hの調整法は、特に限定されず、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン酸緩衝液を挙 げることもできるし、酢酸、クェン酸、シユウ酸等の有機酸系緩衝液、 MES、 BES、 H EPES、 TES、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン一 NaOHなどのアミノ酸 系緩衝液、ホウ酸緩衝液、 Bis-Tris propane緩衝液、イミダゾール緩衝液などを 使用することができる。この際、ポリアミンォキシダーゼの安定化剤であるアルコール 化合物ゃキレート試薬、基質特異性改良剤である界面活性剤が適宜存在して!/ヽても よい。作用時間は、例えば、 30秒〜 120分間、好ましくは 1〜30分間である。作用温 度は、例えば、 20〜45°Cであり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択する ことができる。
[0069] 試料に添加するポリアミンォキシダーゼ溶液には、トリス、リン酸、酢酸、クェン酸、 シユウ酸、 MES、 BES、 HEPES、 TES、ビシン、トリシン、グリシン、ホウ酸、 Bis— Tr is propane,イミダゾール等の緩衝剤、 FAD等の補酵素、ポリアミンォキシダーゼ の安定化剤であるアルコールィ匕合物ゃキレート試薬、ポリアミンォキシダーゼの基質 特異性改良剤である界面活性剤が添加されていてもよい。また、必要により、塩ィ匕ナ トリウム、塩ィ匕カリウム、アジィ匕ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、 B SA、グリセロール、アミノ酸等を共存させてもよい。この液状の製剤を凍結乾燥や噴 霧乾燥してもよ ヽ。
[0070] ポリアミンォキシダーゼの反応による生成物は、いかなる方法により測定してもよい 。例えば、生成する過酸化水素は、ペルォキシダーゼ及び適当な発色試薬、発光試 薬を用いる酵素的測定法、若しくは酵素電極を用いる電気的方法等で測定すること ができる。また、生成するアルデヒドをアルデヒドォキシダーゼやアルデヒドデヒドロゲ ナーゼと適当な発色試薬を組み合わせて測定することもできる。例えば、酵素を用い る反応生成物の検出試薬には、トリス、リン酸、酢酸、クェン酸、シユウ酸、 MES、 BE S、 HEPES、 TES、ビシン、トリシン、グリシン、ホウ酸、 Bis— Tris propane,イミダ ゾール等の緩衝剤、 FAD、 NAD、 NADP、 NADH、 NADPH等の補酵素、ペルォ キシダーゼ、 4ーァミノアンチピリン、フエノール、 TOOS、 DA— 67等の過酸化水素 検出試薬、 1 -Methoxy PMSや WST— 8 (ホルマザン試薬）等の酸化還元系発 色試薬、カタラーゼ等の酵素のいずれか 1つ以上を含有させることができる。これに、 ポリアミンォキシダーゼの安定化剤であるアルコールィ匕合物ゃキレート試薬、基質特 異性改良剤である界面活性剤を適宜添加してもよい。また、必要により、塩化ナトリウ ム、塩ィ匕カリウム、アジィ匕ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、 BSA 、グリセロール、アミノ酸等を共存させてもよい。この液状の製剤を凍結乾燥や噴霧乾 燥してちょい。
[0071] ポリアミンォキシダーゼ反応の生成物の測定を行う際、ポリアミンォキシダーゼ反応 とその生成物の検出を同時に行うことも可能である。前述の反応生成物の検出試薬 に、ポリアミンォキシダーゼを 0. 05〜： L000 U/mU好ましくは 0. 2〜： LOO U/mlと なるように添加することが好ま 、。この液状の製剤を凍結乾燥や噴霧乾燥してもよ い。
[0072] ジァセチルポリアミンの測定に用いる検体の量、上記の各試薬の添加量、比率に つ!ヽては特に限定されな 、。
[0073] [ジァセチルポリアミンの測定試薬]
さらに本発明では、上記測定方法に使用されるジァセチルポリアミンの測定試薬を 提供する。ジァセチルポリアミンの測定試薬は上述の各試薬を異なる容器に含むも のとして調製すればよぐ例えば、液状品、又は液状品の凍結物若しくは凍結乾燥品 として提供できる。あるいは、アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬、及び Z又 は界面活性剤とポリアミンォキシダーゼを含有する測定試薬を調製することも可能で ある。
[0074] [モノァセチルポリアミンを製造する方法] さらに、これまで記載したポリアミンォキシダーゼの安定ィ匕方法、及び Z又はポリア ミンォキシダーゼの基質特異性の改良方法を用いて、ジァセチルポリアミンへポリアミ ンォキシダーゼを作用させてモノァセチルポリアミンを製造することが可能である。
[0075] 以下、実験例及び実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。本発明の技 術的範囲は、これらの例により何ら限定されない。
実施例 1
[0076] (ポリアミンォキシダーゼの活性測定法）
0. 2M Tris— HC1緩衝液（pH7. 5) 0. 9ml、 7. OmM ポリアミン（例えば、ジァ セチルスペルミン）溶液 0. lml、 15mM TOOS溶液 0. 04ml, 150UZmlペル ォキシダーゼ（キッコーマン社製）溶液 0. 04ml, 1. 76% (w/v) 4—ァミノアンチ ピリン溶液 0. 02mlの混合液を 37°Cで 5分間インキュベートした。酵素は希釈液 A[ ImMの EDTA及び 0. 2% (w/v)のゥシ血清アルブミン（BSA、シグマ社製）を含 有する 50mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0) ]若しくは希釈液 B[ ImMの EDTA及 び 5% (v/v)のエタノールを含有する 50mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0) ]にて 適宜希釈した。酵素サンプル 0. 05mlを反応液に添加、混合した。全容 1. 15mlを 37°Cで 3分間反応させ、反応開始から 3分間の、反応溶液の 555nmにおける吸光 度の変化を、分光光度計を用いて測定した。ジァセチルスペルミンォキシダーゼの 酵素 1Uは、上記測定条件下において、ジァセチルスペルミンを基質とするときに 1分 間あたり 1 molの過酸ィ匕水素を生成する酵素量とした。なお、本条件におけるミリモ ル分子吸光係数を 1. 57cm2Z molとした。なお、本測定方法は一例を示したもの であり、活性測定の試薬の種類や濃度、 pHについては何ら制限するものではない。 例えば、 Tris— HC1緩衝液の代わりにリン酸緩衝液等を用いることもできる。
[0077] (ポリアミンォキシダーゼの安定性試験）
ポリアミンォキシダーゼの安定性試験は、各種試薬を添加した 50mMリン酸力リウ ム緩衝液 (PH7. 0)で酵素サンプルを希釈し、 30°C保存による加速試験後の残存活 性を比較して行った。加速試験を行った後の該酵素溶液の残存活性は、該酵素溶 液調製時における吸光度変化量を 100%としたときの相対量（％)として表した。
[0078] (各種アルコール化合物の安定化効果の確認） 5%若しくは 10%の各種アルコールィ匕合物を含有する 50mMのリン酸緩衝液 (pH 7. 0)をそれぞれ調製した。これらの各種試薬を含有する緩衝液を用いて、 PCT/J P2006/310648に記載のデノ リオミセス'ノヽンセニイ Tsukuba42 (FERM BP 10603)由来ジァセチルスペルミンォキシダーゼ溶液 0. lUZmlをそれぞれ調製 した。なお、比較例として、アルコールィ匕合物を含有しない 50mMのリン酸緩衝液 (p H7. 0)で、上記酵素溶液 0. lUZmlを調製した。各酵素溶液について 30°C、 6時 間の加速試験を行い、その結果を表 1に示した。このように各種アルコール化合物に ついて安定ィ匕効果が認められた。特開平 5— 211869〖こ記載のよう〖こ、エタノール等 の有機溶媒の添カ卩は酵素を失活させやすいと考えるのが一般的であるが、今回、ェ タノール、メタノール、 1 プロパノール、 2—プロパノールのような有機溶媒も本酵素 の安定化剤として利用可能であることが示された。
[表 1]
添加試薬 残存活性 (％)
メタノール 5% (ν/ν) 75
メタノール 10% (ν/ν) 74
エタノール 5% (ν/ν) 78
エタノール 10% (ν/ν) 92
エチレングリコール 5% (ν/ν) 69
エチレングリコール 10% (ν/ν) 83
1 -プロパノール 5% (ν/ν) 83
1 -プロパノール 10% (ν/ν) 69
2 -プロパノール 5% (ν/ν) 74
2-プロパノール 10% (ν/ν) 88
トレハロース 5% (w/v) 66
トレハロース 10% (w/v) 71
キシリトール 5% (w/v) 58
キシリ I ^一ル 10% (w/v) 62
無添加 51 実施例 2
[0080] (各種キレート試薬の安定化効果の確認）
ImM若しくは 5mMの各種キレート試薬を含有する 50mMのリン酸緩衝液（pH7. 0)をそれぞれ調製した。これらの各種試薬を含有する緩衝液を用いて、 PCT/JP2 006/310648に記載のデノ リオミセス'ノヽンセニイ Tsukuba42 (FERM BP— 1 0603)由来ジァセチルスペルミンォキシダーゼ溶液、キャンディダ'グラブラタ Nod a 162 (FERM BP— 10602)由来ジァセチルスペルミンォキシダーゼ溶液、及び「 FEBS LettersJ , (英国）， 2000年， 476卷， p. 150— 154に記載のキャンディダ' ボイディニイ NBRC 10574由来ポリアミンォキシダーゼ溶液を 0. lUZmlとして それぞれ調製した。
[0081] なお、比較例として、キレート試薬を含有しな!、50mMのリン酸緩衝液 (pH7. 0)で 、上記各種酵素溶液 0. lUZmlを調製した。各酵素溶液について 30°C、 12時間の 加速試験を行い、その結果を表 2に示した。このように各種キレート試薬について、 3 種すベての酵素に対する安定ィヒ効果が認められた。なお、 EDTAの添加濃度が lm M及び 5mM添加のときは、安定ィ匕効果はほぼ同等であった。
[0082] [表 2]
残存活性 (％)
濃度
添加試薬 (m ) デバリオミセス キャンディダ キャンディダ
ハンセニイ由来 グラブラタ由来 ボイディニイ由来
EDTA 1 52 86 76
EDTA 5 53 88 77
Me- EDTA 5 57 90 79
EDTA-OH 5 52 89 79
CyDTA 5 59 89 77
DTPA-OH 5 60 89 80
EGTA 5 53 88 78
TTHA 5 59 91 80 無添加 32 76 58
実施例 3
[0083] (アルコール化合物とキレート試薬の共存効果）
アルコール化合物である 10% (vZv)エタノール、及び Z又はキレート試薬である 5 mM EDTAを含有する、 50mMのリン酸緩衝液 (pH7. 0)をそれぞれ調製した。こ れらの各種試薬を含有する緩衝液を用いて、 PCTZJP2006Z310648に記載の デバリオミセス'ノヽンセニイ Tsukuba42 (FERM BP— 10603)由来ジァセチルス ペルミンォキシダーゼ溶液 0. lU/mlをそれぞれ調製した。なお、比較例として、試 薬を含有しない 50mMのリン酸緩衝液 (pH7. 0)で、上記酵素溶液 0. lU/mlを調 製した。各酵素溶液について 30°C、 6時間の加速試験を行い、加速試験後の酵素 活性を測定した。加速試験前の酵素活性と比較して、加速試験後の安定性を評価し 、その結果を図 1に示した。アルコール化合物であるエタノール、及びキレート試薬で ある EDTAを共存させることによりジァセチルスペルミンォキシダーゼがさらに安定に 保持された。
実施例 4
[0084] (安定ィ匕されたポリアミンォキシダーゼ製剤の製造） 10% (v/v) エタノール及び ImM EDTAを含有する 0. 2M リン酸緩衝液（pH 7. 0) 9ml、 15mM TOOS溶液 0. 4ml、 150U/ml ペルォキシダーゼ（キッコ 一マン社製）溶液 0. 4ml、 1. 76% (w/v) 4—ァミノアンチピリン溶液 0. 2ml、 0. 5U/ml ジァセチルスペルミンォキシダーゼ [デノ リオミセス'ノヽンセニイ Tsuk uba42 (FERM BP— 10603)由来、 PCTZJP2006Z310648記載のとおり] 0. 5mlを混合し、よく撹拌して、ポリアミンォキシダーゼ製剤 (溶液)を製造した。対照製 剤として、安定化剤を除いたポリアミンォキシダーゼ製剤を調製した。本発明製剤と 対照製剤について、 30°C、 24時間の虐待試験を行い、その結果を図 2に示した。対 照製剤は、酵素活性がほとんど失われているのに対して、本発明製剤は、酵素活性 が安定に保持されていた。
実施例 5
[0085] (安定化されたジァセチルスペルミンォキシダーゼを用いるモノァセチルポリアミン の製造）
10% (vZv)エタノール、 ImM EDTA, 0. 5U/ml カタラーゼ（Sigma社製）及 び 7mM ジァセチルスペルミン · 2塩酸塩（150mg)を含有する 60mlの 20mM リン 酸緩衝液（PH7. 5)に、ジァセチルスペルミンォキシダーゼ [デノ リオミセス'ノヽンセ ニイ Tsukuba42 (FERM BP— 10603)由来、 PCTZJP2006Z310648に記 載のとおり]を lUZmlとなるように添カ卩した。 30°Cで 2日間インキュベートし、 TLCで N1 -ァセチルスペルミジンの生成を確認した（クロ口ホルム：メタノール：アンモニア水 ：水 = 2 :4 : 1 : 1、ニンヒドリン発色）。
[0086] セントリブレップ 10 (アミコン社製)を用いて水で透析し、酵素タンパクを除去した。
透析外液を陽イオン交換榭脂 [DOWEX 50W—X4 (H+) ]カラム（lcm X 10cm) に通し、反応生成物を吸着させた。水で洗浄後、 1M アンモニアで溶出させた。溶 出液を減圧濃縮した後、クロ口ホルム:メタノール = 1 : 1の溶媒に溶解させて、シリカ ゲルカラムカラム（2cm X 15cm)に吸着させた。展開溶媒としてクロ口ホルム:メタノー ル（1： 1〜0： 1)を用いて溶出させ、 N1—ァセチルスペルミジン溶出画分に塩酸を添 加した後減圧濃縮し、 82mgの N1—ァセチルスペルミジン 2塩酸塩を得た (収率 76 %)。 [0087] 上記の 82mgの N1—ァセチルスペルミジン 2塩酸塩をエタノールで再結晶し、 52m gの N1—ァセチルスペルミジン 2塩酸塩を得た（収率 47%)。融点と1 H,13C— NMR の測定値は文献既知の値（「Acta Chemica ScandinavicaJ , (デンマーク）， 19 89年， 43卷， p. 990— 994)と一致した。力くして、 PCT/JP2006/310648に記 載の N1—ァセチルスペルミジンの製造方法では 2U/mlのジァセチルスペルミンォ キシダーゼを用いていたが、今回、安定化剤を用いることにより、半分の酵素量で同 量の N1—ァセチルスペルミジン 2塩酸塩を得ることができた。
実施例 6
[0088] (各種界面活性剤の基質特異性改良効果の確認）
0. 3%の各種界面活性剤を含有する 0. 2M リン酸緩衝液 (pH7. 5)をそれぞれ 調製した。これらの各種界面活性剤を含有する緩衝液を用いて、前記のポリアミンォ キシダーゼの活性測定法にて、 PCTZJP2006Z310648に記載のデバリオミセス' ハンセ-ィ Tsukuba42 (FERM BP— 10603)由来ジァセチルスペルミンォキシ ダーゼ溶液及びキャンディダ.グラブラタ Nodal62 (FERM BP— 10602)由来ジ ァセチルスペルミンォキシダーゼについて、ジァセチルスペルミン及び N1—ァセチ ルスペルミジンに対する酵素活性を測定、比較した。その結果を表 3に示した。このよ うに各種界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤と両性界面活性剤を添加すること により、基質特異性の改善効果が認められた。
[0089] [表 3]
N1—AcSpdに対する反応性（ ）※
(DASpmに対する反応性を 100%とする) 界面活性剤
^リオミセス由来 キャンディダ由来 無添加 29.7 49.5
Triton X-100 (非イオン性、和光純薬工業社製） 13. 2
Triton X-405 (非イオン性、ナカライテスク社製） 11. 1
Tween 20 (非イオン性、和光純薬工業社製） 7.4
Tween 40 (非イオン性、和光純薬工業社製） 11.0
Tween 80 (非イオン性、和光純薬工業社製） 11.8
Tween 85 (非イオン性、和光純薬工業社製） 11.9
Brij 35 (非イオン性、和光純薬工業社製） 38.6
Brij 58 (非イオン性、シグマ社製） 4.4
Brij 78 (非イオン性、シグマ社製） Ί.3
ェマルゲン 913 (非イオン性、花王社製） 12.9
CHAPS0 (両性、同仁化学社製） 17.0
※！^1— A c S p d ： N1—ァセチルスペルミジン
DAS pm：ジァセチルスペルミン
デバリオミセス由来：デバリオミセス . ハンセニイ T s u k u b a 42 ERM BP— 10603) 由来ジァセチルスペルミンォキシダ一ゼ キャンディダ由来：キャンディダ ·グラブラタ No d a l 62 (FERM
P- 10602) 由来ジァセチルスペルミンォキシダーゼ
実施例 7
[0090] (pH条件の基質特異性改良効果の確認）
pH6.5〜7.5の 0.2M リン酸緩衝液をそれぞれ調製した。これらの緩衝液を用 いて、前記のポリアミンォキシダーゼの活性測定法にて、 PCTZJP2006Z310648 に記載のデバリオミセス'ノヽンセニイ Tsukuba42(FERM BP— 10603)由来ジァ セチルスペルミンォキシダーゼ溶液及びキャンディダ 'グラブラタ Nodal62 (FER M BP— 10602)由来ジァセチルスペルミンォキシダーゼについて、各種ポリアミン に対する酵素活性を測定、比較した。その結果を表 4に示した。このように pHを 7.5 未満にすることにより、基質特異性の改善効果が認められた。
[0091] [表 4] N1—AcSpdに対する反応性（ ）※
酵素の由来 PH
(DASpmに対する反応性を 100とする）
7.5
デバリオミセス ハンセニイ
7.0
Tsukuba 42
6.5
7.5
キャン丁イダ ワラブラタ
7.0
Noda 162
6.5
※！^1— Ac S p d ： N1—ァセチルスペルミジン
DAS pm : ジァセチルスペルミン
実施例 8
[0092] (界面活性剤の添加と pH条件を組み合わせた基質特異 M 」」 性改良効果の確認）
0.3%の TritonX— 100を含有する 0.2M リン酸緩衝液D0l ω o o C (oi (pH6.5〜7.5)を調製 し、前記のポリアミンォキシダーゼの活性測定法にて、 PCTZJP2006Z310648に 記載のデノ リオミセス'ノヽンセニイ Tsukuba42(FERM BP— 10603)由来ジァセ チルスペルミンォキシダーゼ溶液にっ 、て、各種ポリアミンに対する酵素活性を測定 、比較した。その結果を表 5に示した。このように TritonX— 100を添カロし、かつ pHを 7.5未満とすることにより、さらなる基質特異性の改善効果が認められた。なお、いず れの条件においてもプトレツシンには反応しなかった。
[0093] [表 5]
各種ポリアミンに対する反応性※
(DASpmに対する反応性を 100とする) μ
Triton X— 100
DASpd N1 - N1— N8-
Spm Spd AcSpm AcSpd AcSpd
7.5 無添加 51.0 3.5 0 0
7.0 無添加 19.5 19.9 1.4 0 0
7.0 添加 18.6 7.8 7.8 1.0 0 0
6. 5 無添加 25.8 9.4 11.9 0.6 0 0
6. 5 添カロ 15.2 6. 1 7.0 0.5 0 0
00
※ AS pm：ジァセチルスペルミン、 DAS p d :ジァセチルスペルミジン、
ω
N1— A c S p m： N1—ァセチルスぺノレミン、 N1— Ac S p d ： N1—ァセチ ルスペルミジン、 N8— A c S p d ： N8—ァセチルスぺノレミジン、 S pm :ス ぺノレミン、 S p d :スぺノレミジン
なお、 いずれの条件においてもプトレツシンには反応しなかった。 実施例 9
[0094] (ポリアミンォキシダーゼを含有する試薬を用いる、ジァセチルポリアミンの測定方 法。）
第 1試薬
MES緩衝液（pH7.0) 50mM
DA— 67 0.05mM
TritonX— 100 0.04%
アジ化ナトリウム 0.09%
2纏
MES緩衝液（pH7.0) 50mM
ジァセチルスペルミンォキシダーゼ（デバリオミセス由来） 24UZmL ペルォキシダーゼ（西洋ヮサビ由来） 15UZmL
[0095] 生理食塩水で希釈調製したジァセチルスペルミン試料（125nM 500nM)各 10 μ Lに第 1試薬 80 Lを混和し、 37°Cで 5分間加温した。続いて第 2試薬 30 Lを添 加し、 5分間反応させた後の 658nmにおける吸光度を測定し、その結果を図 3に示 した。力べして、ジァセチルスペルミンォキシダーゼを用いた試薬でジァセチルスペル ミンを簡便かつ短時間に測定することができることがわ力 た。
実施例 10
(ポリアミンォキシダーゼを含有する試薬を用いる、尿検体中のジァセチルポリアミン の測定方法。 ) 1纏
TES緩衝液（pH7. 7) 50mM
TOOS ImM
TritonX— 100 1. 5%
KC1 70mM
カタラーゼ 300UZmL
ァスコルビン酸ォキシダーゼ 3UZmL
TES緩衝液（pH7. 7) 50mM
TritonX- 100 1. 5%
KC1 70mM
4ーァミノアンチピリン 4mM
ジァセチルスペルミンォキシダーゼ（デバリオミセス由来） 24UZmL ペルォキシダーゼ（西洋ヮサビ由来） 15UZmL
アジ化ナトリウム 0. 09% 尿検体にジァセチルスペルミン（32nM〜500nM)を添加して調整した試料各 10 μ Lに、第 1試薬 80 Lを混和し、 37°Cで 5分間加温した。続いて第 2試薬 30 Lを 5分間反応させた後の 550nmにおける吸光度を測定し、その結果を図 4に示した。 力べして、ジァセチルスペルミンォキシダーゼを用いた試薬で尿試料中のジァセチ ルスペルミンを測定することができることがわかった。
産業上の利用可能性 本発明の安定ィ匕方法を用いて、アルコールィ匕合物及び Z又はキレート試薬とポリ アミンォキシダーゼを含有する安定ィ匕されたポリアミンォキシダーゼ製剤を、簡単な 方法でかつ安価に製造することができる。また、本発明の基質特異性の改良方法を 用いて、界面活性剤とポリアミンォキシダーゼを含有する基質特異性が改良されたポ リアミンォキシダーゼ製剤を、簡単な方法でかつ安価に製造することができる。さらに 、ジァセチルポリアミン測定用試薬を簡単な方法でかつ安価に製造することができる
Figure imgf000035_0001
g理官庁記入欄 -4 この用紙は国際出願とともに受理した
(はい/いいえ）
-4-1 権限のある職員 国際事務局記入 ft
0-5 この用紙が国際事務局に受理された日
0-5-1 権限のある職員
差替え用紙（規則 26)

Claims

34 雜囲
[I] アルコール化合物及び/又はギレ ト '薬と、ポリアミンォキシダ ゼを共存させる ことを特徴とする、ポリアミンォキシダ一 め安定ィ匕方法。
[2] ポリアミンォキシダーゼがジァセチル ペルミンォキシダーゼである、請求項 1に記 載のポリアミンォキシダーゼの安定匕;^ 。
[3] 界面活性剤存在下にてポリアミン才キ. ダーゼを作用させることを特徴とする、ポリ アミンォキシダーゼの基質特異性 Φ改:良方法。
〔4] ポリアミンォキシダ一せを pH7. 5未満 作用させることを特徴とする、ポリアミンォ キシダ一ゼの基質特異性の改良方法。
[5] ポリアミンォキシダーゼがジァセ ルスペルミンォキシダーゼである、請求項 3〜4 のいずれかに記載のポリアミンォキシ ゼの.基質特異性の改良方法。
[6] ポリアミンォキシダーゼを含有 る 試料に作用させて、ジァセチルポリアミン を測定することを特徴とする、ジァセチ リアミンの測定方法。
[7] アルコール化合物及ぴ 又は^".ト により安定化されたポリアミン才キシダ 一ゼを用 V、ることを特徴とする、鏞 錄 12載の測定方法。
[8] 界面活性剤により碁質時異性 ^^ た^リアミンォキシダーゼを用いることを 特徴とする、睛求項 6〜7のい ¾ 〖£ 測定方法。 .
[9] ポリアミンォキシダーゼ pH7、 5未満？ きせることを特徴とする、請求項 6〜8 のいずれかに記載の測定方法。
[10] ポリアミンォキシダ ゼがジァセチル ペルミンォキシダーゼである、請求項 6〜9 のいずれかに記載のジァセチルポリアミ の測定方法。
[II] アルコール化合物 ¾ぴ 又は ト戴^ ΐ、ポリアミンォキシダーゼを含有するこ とを特徴とする、安定ィ匕されたポリ ミ^キ ダーゼ製剤。
[12] ポリアミンォキシダーゼがジアセ^レスペルミンォキシダーゼである、請求項 11に 記載の安定化されたポリアミンオキシ^^ゼ製剤。
[13] ポリアミンォキシダーゼを含有す と ¾き徼とする、ジァセチルポリアミンの測定試 薬。
[14] アルコール化合物及び/又はキレ ト試藥と、ポリアミンォキシダーゼを含有するこ
差替え用紙 （規則 26) 3'5
とを特徴とする請求項 3に記載.のジァ ½チルポリアミンの測定試薬。
[15] 界面活性剤とポリアミンォキシダ を含有することを特徴とする請求項 13又は 14 のレ、ずれかに記載のジァセチルポリアミ 測定試薬。
[16] ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、請求項 13〜 1
5のいずれかに記載のジァセチルポ:リ ミ , ' 則定試薬。
C17] 請求項 1又は 2言己載のポリアミシォキ タ^ゼの安定化方法、及び/又は請求項 3
〜5のいずれか一項に記載のポリ ミ ;^キシダ一ゼの基質特異性の改良方法を用
V、ることを特徴とする、ジァセチ ポリアミンへポリアミンォキシダーゼを作用させてモ ノアセチルポリアミンを製造する方法。
[18] ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、請求項 17記 載のモノァセチルポリアミンの製瑋 ¾法。
[19] 請求項 1又は 2記載のポリアミンォキジダーゼの安定化方法を利用することを特徴と する、ポリアミンォキシダーゼの精製方法。
[20] ポリアミンォキシダーゼがジァセチルスペルミンォキシダーゼである、請求項 19記 載のポリアミンォキシダーゼの精製方法。
差替え用紙（規則 26)
PCT/JP2007/052732 2006-06-22 2007-02-15 ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法 Ceased WO2007148451A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008522315A JP5166259B2 (ja) 2006-06-22 2007-02-15 ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006172080 2006-06-22
JP2006-172080 2006-06-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007148451A1 true WO2007148451A1 (ja) 2007-12-27

Family

ID=38833195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/052732 Ceased WO2007148451A1 (ja) 2006-06-22 2007-02-15 ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5166259B2 (ja)
WO (1) WO2007148451A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009240289A (ja) * 2008-04-01 2009-10-22 Toyobo Co Ltd チラミンオキシダーゼの安定化方法およびその組成物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07194378A (ja) * 1993-12-28 1995-08-01 Fuji Seito Kk トレハロースによる酵素の安定化法
JP2003116539A (ja) * 2001-10-12 2003-04-22 Kikkoman Corp アスコルビン酸オキシダーゼの安定化法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6078581A (ja) * 1983-10-04 1985-05-04 Seiwa Kasei Kk 液状カタラ−ゼの安定法
FI943458A7 (fi) * 1992-01-22 1994-09-21 Novo Nordisk As Aktivoitu tekijä XIII
US5356800A (en) * 1992-11-30 1994-10-18 Buckman Laboratories International, Inc. Stabilized liquid enzymatic compositions
DE19937218A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Affinitätschromatographie
JP2002017348A (ja) * 2000-07-11 2002-01-22 Kikkoman Corp Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの安定化方法
JP4308545B2 (ja) * 2003-02-17 2009-08-05 天野エンザイム株式会社 耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤及びその製造方法
EP1610127B1 (en) * 2003-03-11 2012-04-25 CRC Inc. N1,n12-diacetylspermine as tumor marker

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07194378A (ja) * 1993-12-28 1995-08-01 Fuji Seito Kk トレハロースによる酵素の安定化法
JP2003116539A (ja) * 2001-10-12 2003-04-22 Kikkoman Corp アスコルビン酸オキシダーゼの安定化法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHUKLA O.P. ET AL.: "Polyamine oxidase from Acanthamoeba culbertsoni specific for N8-acetylspermidine", MOL. BIOCHEM. PARASITOL., vol. 51, no. 1, 1992, pages 91 - 98, XP003002448 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009240289A (ja) * 2008-04-01 2009-10-22 Toyobo Co Ltd チラミンオキシダーゼの安定化方法およびその組成物

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007148451A1 (ja) 2009-11-12
JP5166259B2 (ja) 2013-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102292439B (zh) 黄素结合型葡萄糖脱氢酶
EP2647705B1 (en) Flavin-bound glucose dehyrogenase, production method for flavin-bound glucose dehyrogenase, and yeast transformant used in same
JP5176045B2 (ja) 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法
US9493814B2 (en) Flavin-binding glucose dehydrogenase having improved substrate specificity
US20080003628A1 (en) Method for enhancing stability of a composition comprising soluble glucose dehydrogenase (gdh)
JP6128560B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2014045912A1 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
JP2010035448A (ja) 基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
WO2013147206A1 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びこれをコードするポリヌクレオチド
JP5593689B2 (ja) 乳酸オキシダーゼ組成物
Van der Linden et al. Occurrence of inducible and NAD (P)-independent primary alcohol dehydrogenases in an alkane-oxidizing Pseudomonas
JP2010054503A (ja) グルコース脱水素酵素を用いたグルコースの電気化学測定法
JP6460513B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
WO2007148451A1 (ja) ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法
JP2008035748A (ja) アスペルギルス属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ
CN1962860A (zh) 提高含有水溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶（gdh）的组合物热稳定性的方法
Groen et al. Characterization of hexose oxidase from the red seaweed Chondrus crispus
JP4381369B2 (ja) 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
US10077432B2 (en) Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
JP4381463B2 (ja) 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
JP7842407B2 (ja) 変異グルコースデヒドロゲナーゼ
EP3372678A1 (en) Novel glucose dehydrogenase
US12234487B2 (en) Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
JP4847775B2 (ja) 安定なポリオール脱水素酵素組成物
JP4770911B2 (ja) 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07714262

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008522315

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07714262

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1