JP7842407B2 - 変異グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

変異グルコースデヒドロゲナーゼ

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Description

本発明は、変異グルコースデヒドロゲナーゼに関する。より具体的には、本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ比活性が向上したポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、酵素剤、及び当該ポリペプチドの用途に関する。
糖尿病患者は年々増加しており、糖尿病患者、特にインスリン依存性の患者は、血糖値のコントロールのため、血糖値を日常的に監視する必要がある。近年、酵素を用いて簡便にかつ正確に測定できる電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定器（グルコースセンサ）が広く用いられている。
グルコースセンサに用いられる酵素として、グルコースを基質とするグルコースオキシダーゼ（以下、「ＧＯ」とも記載する。）又はグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」とも記載する。）が利用されている。
ＧＯはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点がある一方で、それを用いた測定においては測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。この問題を解決すべく、ＦＡＤ依存性のＧＤＨ（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ）が開発された。しかしながら、ＦＡＤ－ＧＤＨはキシロースへ反応することが知られているため、糖尿病判定検査時に、経口グルコース負荷試験だけでなく、経口キシロース負荷試験、経静脈キシロース負荷試験が実施されることに鑑みると、ＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合には、上記負荷試験時に血糖値へ影響することが問題となっている。
そこで、ＧＯ及びＧＤＨの両欠点を補う酵素として、特許文献１に、ＧＯをＧＤＨへ変異させたＦＡＤ－ＧＤＨを取得したことが報告されている。
国際公開第２０１１／０６８０５０号
ＧＯを変異させたＦＡＤ－ＧＤＨは、ＧＯ及びＧＤＨの両欠点が補われ、基質特異性に優れた酵素ではあるが、その比活性には改善の余地がある。
そこで本発明は、比活性が向上したグルコースデヒドロゲナーゼを提供することを目的とする。
本発明者は、ＧＯを変異させたＦＡＤ－ＧＤＨ（配列番号１）のＸ線結晶構造解析を行った結果、第５３８位ヒスチジンが立体障害を受けている可能性に着眼し、当該部位における立体障害の解消を目的として、近傍の第５７８位メチオニンへの変異導入を検討した。その結果、所定の変異を導入することで、比活性を向上できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて完成されたものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチド：
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が７０％以上であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド。
項２． 項１に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項３． 項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
項４． 項３に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項５． 項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１に記載のポリペプチドの製造方法。
項６． 項１に記載のポリペプチドを含む酵素剤。
項７． 項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース測定用試薬。
項８． 項１に記載のポリペプチドを用いて試料中のグルコースを測定する工程を含む、グルコース測定法。
項９． 項７に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
項１０． 不溶性支持体と、前記不溶性支持体に固定された項１に記載のポリペプチドとを含む、グルコースセンサ。
項１１． 項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース低減剤。
項１２． 項１に記載のポリペプチドを用いて、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物からなる群より選択される組成物中のグルコースを低減する工程を含む、グルコースが低減された組成物の製造方法。
本発明によれば、比活性が向上したグルコースデヒドロゲナーゼが提供される。
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＧＤＨの第５７８位変異体の酵素活性を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
本明細書における「Ａ１２０Ｇ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば、「Ａ１２０Ｇ」とは、特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から１２０番目のアミノ酸Ａが、アミノ酸Ｇに置換されていることを意味する。
本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
本明細書において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本明細書においては、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。
１．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、下記（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドである。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が９０％以上であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド。
前記（１）～（３）に示すポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドよりも向上したグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。
配列番号１のポリペプチドは、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）のＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体である（以下において、Ｄ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐを、上記の第５７８位におけるアミノ酸置換変異とは別に、「二重変異」とも記載する）。
前記（１）～（３）のポリペプチドには、人為的に置換して得られるポリペプチドのみならず、そのようなアミノ酸配列を元々有するポリペプチドも含まれる。
以下、前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１の第５７８位のアミノ酸残基以外を「任意相違部位」と表記することもある。本明細書において、用語「任意相違部位」とは、ポリペプチドの特性に大きく影響しない限り、相違が許容される部位である。また、本明細書において、前記（１）のポリペプチドと比較して、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチドを、前記（１）のポリペプチドの相違体という。前記（２）及び（３）のポリペプチドは、前記（１）のポリペプチドの相違体である。また、前記ポリペプチドの相違体は、前記（１）のポリペプチドと比較して、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、当該ポリペプチドの特性が実質的に同一であることがより好ましい。なお、ポリペプチドの特性が実質的に同一とは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性が同等であることをいい、具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ活性が、前記（１）のポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の０．８～１．２倍程度、好ましくは０．９～１．１倍程度、より好ましくは０．９５～１．０５倍程度を示すことを意味する。
前記（２）のポリペプチドにおけるアミノ酸の相違は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の相違（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の相違（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（２）のポリペプチドにおいて、任意相違部位におけるアミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば１～６０個又は１～５０個、好ましくは１～２０個、１～１０個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
また、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換がされた部位を除いた配列同一性は、７０％以上、８０％以上、８５％以上又は９０％以上であればよいが、好ましくは９２％以上又は９４％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、一層好ましくは９９％以上、より一層好ましくは９９．５％以上、特に好ましくは９９．８％以上が挙げられる。
ここで、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換がされた部位を除いた配列同一性とは、配列番号１に示す各アミノ酸配列から前記任意相違部位のみを抜き出して、当該任意相違部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
前記（２）及び（３）のポリペプチドの任意相違部位にアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様の一例として、保存的置換が挙げられる。即ち、（２）及び（３）のポリペプチドにおいて任意相違部位に対して導入されるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
また、前記（２）及び（３）ポリペプチドの任意相違部位にアミノ酸置換が導入される場合の、アミノ酸置換の態様の他の例として、以下の他の所定の置換が挙げられる。即ち、配列番号１に示すアミノ酸配列における、第１１５位（Ｌ）、第１３１位（Ｇ）、第１３２位（Ｔ）、第１９３位（Ｖ）、第３５３位（Ｔ）、第４３６位（Ｆ）、第４４４位（Ｓ）、第４７２位（Ｙ）、第５１１位（Ｉ）、第５３５位（Ｐ）、第５３７位（Ｙ）、及び第５８３位（Ｍ）からなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸の置換、並びに、第５８２位（Ｐ）の、Ｓ、Ｒ、又はＬへの置換（以下において、これらを「他の所定の置換」と記載する。）は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の発現、若しくは当該活性の発現及びキシロースへの反応性の抑制に寄与していると考えられるため、前記（２）及び（３）ポリペプチドの任意相違部位には、当該他の置換が導入されていてもよい。当該他の所定の置換の好ましい例としては、第４４６位（Ｈ）と、第５８２位（Ｐ）の、Ｓ、Ｒ、又はＬへの置換；及び、第４４４位（Ｓ）の、Ｒ、Ｑ、又はＥへの置換が挙げられる。
前記（２）及び（３）のポリペプチドが上記他の所定の置換を含まない場合は、配列番号１に示すアミノ酸配列における第４４６位（Ｈ）及び第５８２位（Ｐ）が、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の発現及びキシロースへの反応性の抑制に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
前記（２）及び（３）のポリペプチドが上記他の所定の置換を含む場合は、当該他の所定の置換が、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の発現、若しくは当該活性の発現及びキシロースへの反応性の抑制に寄与していると考えられるため、配列番号１に示すアミノ酸配列における第４４６位（Ｈ）及び第５８２位（Ｐ）のいずれか又は両方に置換又は欠失が導入されていてもよい。上記当該他の所定の置換を有し且つ第４４６位（Ｈ）及び第５８２位（Ｐ）のいずれか又は両方に置換又は欠失が導入されている場合の前記（２）及び（３）のポリペプチドの具体例としては、以下の［ａ］及び［ｂ］のポリペプチドが挙げられる。
［ａ］配列番号１において、第４４６位（Ｈ）は置換されず；第５８２位（Ｐ）が、Ｓ、Ｒ、又はＬへ置換され；且つ、第５７８位（Ｍ）が、Ｖ又はＰへ置換されている特徴を含むポリペプチド
［ｂ］配列番号１において、第４４４位（Ｓ）が、Ｒ、Ｑ、又はＥへ置換され；第４４６位（Ｈ）が他のアミノ酸（例えばＤ）へ置換され；第５８２位（Ｐ）は置換されず；且つ、第５７８位（Ｍ）がＶ又はＦへ置換されている特徴を含むポリペプチド
前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、「配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド」のグルコースデヒドロゲナーゼ活性の程度としては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性よりも高ければ特に限定されないが、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の１．１０倍以上、好ましくは１．１５倍以上、より好ましくは１．２０倍以上が挙げられる。前記（２）及び（３）のポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の程度の上限としては特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の１．４０倍以下、１．３５倍以下、又は１．３０倍以下が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。本発明のポリペプチドの「グルコースデヒドロゲナーゼ活性」は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
上記反応１においては、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する上記反応２により、ＰＭＳ（還元型）の酸化に伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合いを波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を求めることができる。
具体的には、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２．０５ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌのグルコース溶液０．６０ｍＬ、１５ｍｍｏｌ／ＬのＰＭＳ溶液０．１０ｍＬ、及び２ｍｍｏｌ／ＬのＤＣＩＰ溶液０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈した酵素溶液を０．１ｍＬ添加し、反応を開始する。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、Ｄ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
なお、式中のＶｔは反応試薬溶液と酵素溶液との総液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件における還元型ＤＣＩＰの１μｍｏｌ当たりの吸光係数（ｃｍ2／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
２．ＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、当業者であれば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に従って適宜設計可能である。本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡに前記のアミノ酸変異に対応する変異を導入することにより得てもよいし、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）つまり配列番号１のアミノ酸配列に前記の二重変異が導入されていない形態のポリペプチドをコードしているＤＮＡに、前記の二重変異と前記のアミノ酸変異とに対応する変異を導入することにより得てもよいし、遺伝子の全合成法に基づく人工合成により得てもよい。
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡについては、例えば、配列番号２に示される塩基配列として知られており、例えば、当該塩基配列が組み込まれたプラスミド等の核酸構築物からＰＣＲを用いた常法により当該塩基配列部分を取得することができる。また、Ａ．ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）をコードしているＤＮＡも公知であり、Ａ．ｎｉｇｅｒのゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用等が挙げられる。
塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドン利用頻度をアスペルギルス属微生物に最適化させたＤＮＡがより好ましい。
コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されない。
本発明のＤＮＡの例として、配列番号３又は４に示す塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。配列番号３又は４に示される塩基配列からなるＤＮＡは、それぞれ、前記（１）のポリペプチドの第５７８位がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されたポリペプチドをコードしている。
本発明のＤＮＡの他の例として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチドをコードし、配列番号３又は４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
本発明のＤＮＡの更なる例として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号３又は４に示す塩基配列からなるＤＮＡに７０％以上、８０％以上、８５％以上又は９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。当該相同性としては、好ましくは９２％以上又は９４％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、又は９７％以上、一層好ましくは９８％以上又は９９％以上、より好ましくは９９．５％以上、特に好ましくは９９．８％以上が挙げられる。
ここで、ＤＮＡの「相同性」は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターに設定して使用すればよい。
３．発現カセット又は組換えベクター
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター（以下、「本発明の発現カセット」又は「本発明の組換えベクター」とも表記する）は、本発明のＤＮＡにプロモーター及びターミネーターを連結することにより、又は、発現ベクターに本発明の発現カセット若しくは本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
本発明の発現カセット又は組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
本発明の組換えベクターについて、発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ株式会社）ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよい。
４．形質転換体
本発明の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって、形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能で、発現カセット又は組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で本発明のＤＮＡを含む遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等のアスペルギルス属、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する微生物；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等であってもよい。これらの中でもアスペルギルス属微生物が特に好ましい。
本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。宿主に発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が微生物の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
ＰＣＲ法よって本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体からゲノムＤＮＡ又は発現カセット又は組換えベクターを分離・精製すればよい。
発現カセット又は組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ、及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現カセット又は発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
５．ポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養する工程を含む製造方法によって得ることができる。
形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。
窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。
炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５～３７℃程度である。培養は、本発明のポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２～４８時間程度である。
本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチドは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。
６．酵素剤
本発明のポリペプチドは、酵素剤の形態で提供されることができる。したがって、本発明は、上記本発明のポリペプチドを有効成分として含む酵素剤も提供する。
本発明の酵素剤における本発明のポリペプチドの含有量としては特に限定されず、有効成分のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が発揮される範囲で適宜設定することができる。
本発明の酵素剤は、上記本発明のポリペプチド以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、上記本発明のポリペプチド以外の他の酵素、添加剤、上記製造方法で生じた培養残渣等が挙げられる。
他の酵素としては、上記本発明のポリペプチドの用途に応じて適宜決定することができるが、例えば、アミラーゼ（α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ（上記有効成分以外）、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素、プルラナーゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
添加剤としては、上記本発明のポリペプチドの用途及び酵素剤の製剤形態に応じて適宜決定することができるが、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
培養残渣としては、培地由来の成分、夾雑タンパク質、菌体成分等が挙げられる。
本発明の酵素剤の製剤形態としては特に限定されず、例えば、液状、固形状（粉末、顆粒等）等が挙げられる。これらの製剤形態の酵素剤は、一般的に公知の方法で調製することができる。
本発明の酵素剤の具体的な例としては、後述のグルコース測定用試薬及びグルコース低減剤が挙げられる。
７．用途
本発明のポリペプチドは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を利用する用途に適用することができる。このような用途としては、対象試料中のグルコースの測定を目的とした用途、対象組成物中のグルコースの低減を目的とした用途が挙げられる。
本発明のポリペプチドを、対象試料中のグルコースの測定を目的とした用途に適用する場合、より具体的には、本発明のポリペプチドは、グルコース測定用試薬の有効成分として、又はグルコースセンサの認識素子として、用いることができる。また、本発明のポリペプチドを、対象組成物中のグルコースの低減を目的とした用途に適用する場合、本発明のポリペプチドは、グルコース低減剤の有効成分として用いることができる。
つまり、本発明は、上記本発明のポリペプチドを含むグルコース測定用試薬、グルコースセンサ、及びグルコース低減剤も提供する。このうち、グルコース測定用試薬及びグルコース低減剤について、有効成分以外に含まれ得る他の成分及び製剤形態については、上記本発明の酵素剤で述べた内容と同じであり、その具体的な使用方法については後述「８．グルコース測定法」に詳述する。また、グルコースセンサ及びその具体的な使用方法については後述「１０．グルコースセンサ」に詳述する。
８．グルコース測定法
上述の通り、本発明のポリペプチドは、グルコース測定用試薬として用いることができる。従って、本発明は、上記本発明のポリペプチドを用いて試料中のグルコースを測定する工程を含む、グルコース測定法も提供する。
試料の例としては、血糖値を測定すべき試料（具体的には血液試料）、食料品中のグルコース量を測定すべき試料（具体的には、調味料、飲料等）、発酵食料品（具体的には、食酢、酒等）の製造過程において発酵度を測定すべき試料等が挙げられる。
本発明のグルコース測定法においては、上記本発明のポリペプチドによる酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定することができる。具体的には、グルコースを含む試料と、本発明のポリペプチドとを接触させて酵素反応を行い、酵素反応をモニターするシグナル変化に基づいて、反応したグルコース量を測定することができる。
より具体的には、本発明のポリペプチドを、電子受容体（２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）等）、並びに必要に応じて用いられる反応促進剤（例えば、Ｎ－（２－アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウム、イミダゾール等）、ｐＨ緩衝剤、及び／又は発色試薬とともに、グルコースを含む試料と接触させ、一定時間反応させることができる。この間、電子受容体の還元変化又は電子受容体から電子を受け取ることによる色素の重合生成に基づくシグナル変化（例えば、吸光度変化）等をモニタリングすることができる。試料中のグルコースがすべて酸化された時点までのシグナル変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
上記の酵素反応における条件は、本発明のポリペプチドの至適温度及び至適ｐＨ等に基づいて適宜決定される。
９．グルコース測定用キット
本発明は、上記のグルコース測定法を行うために用いられるグルコース測定用キットも提供する。本発明のグルコース測定用キットは、上記「７．用途」で述べたグルコース測定用試薬を含む。
本発明のグルコース測定用キットは、グルコース測定用試薬以外の他のアイテムとして、アッセイに必要な緩衝剤、電子受容体、反応促進剤、及び／又は発色試薬等の試薬、並びにキャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液等を含むことができる。これら他のアイテムの具体例及び使用方法については、上記「８．グルコース測定法」で述べた通りである。本発明のグルコース測定用キットは、これらの他のアイテムを、１種を単独で含んでいてもよいし、複数種を組み合わせて含んでいてもよい。
１０．グルコースセンサ
上述の通り、本発明のポリペプチドは、グルコースセンサの認識素子として用いることができる。従って、本発明は、不溶性支持体と、前記不溶性支持体に固定された上記本発明のポリペプチドとを含むグルコースセンサも提供する。
ポリペプチドの固定態様としては特に限定されず、付着、吸着、吸収、封入、膨潤等による物理的固定、特異的非共有的結合による化学的又は生化学的固定、及び共有結合による化学的固定が挙げられる。
また、ポリペプチドは、ポリペプチドが単独の形態で不溶性支持体に固定されていてもよいし、ポリペプチドが他の成分とともに組成物の形態で不溶性支持体に固定されていてもよい。ポリペプチドが組成物の形態で不溶性支持体に固定されている場合の具体的な態様としては、当該組成物が不溶性支持体に物理的固定している態様が挙げられる。
不溶性支持体は、少なくともその表面が、上記本発明のポリペプチドとグルコースとの反応系中に溶解せず且つ上記のポリペプチドを固定できる固体物質又は固形材料で構成されている。不溶性支持体の少なくとも表面を構成する材料の具体例としては、膨潤性材料（例えばゼラチン等の高分子マトリックス等）、多孔性基材（例えばセルロース等の多孔質体、ろ紙等の不織シート）、樹脂、ガラス、レドックスポリマー（つまり、レドックスメディエータを結合させたポリマー）、金属、カーボン等が挙げられる。
不溶性担体の形状としては特に限定されず、例えば、基板状、薄片状、スティック状、ビーズ状等が挙げられる。
上記の不溶性担体の好ましい例としては、その表面が上記の材料で構成された電極（例えば、金電極、白金電極、カーボン電極等）が挙げられる。また、このような電極には、好ましくはポリペプチドが物理的固定されており、より好ましくは、ポリペプチドが他の成分（例えば、フェロセン、フェリシアン化物等のメディエータ、フェナジンメトサルフェート等）をともに含む組成物の態様で物理的固定されている。
本発明のグルコースセンサの具体的な態様としては、バイオセンサとして採用されている任意の形態であってよく、例えば、センサチップ、マイクロタイタープレート、テストストリップ、電気化学的フローセル等が挙げられる。
このような具体的態様におけるグルコースのセンシングは、上記「８．グルコース測定法」で述べた方法に準拠した方法、特に以下の方法で行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として上記本発明のポリペプチドを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料（好ましくは血液試料、より好ましくは自己血液）を接触させて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
１１．グルコースが低減された組成物の製造方法
上述の通り、本発明のポリペプチドは、グルコース低減剤として用いることができる。従って、本発明は、上記本発明のポリペプチドを用いて、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物からなる群より選択される組成物中のグルコースを低減する工程を含む、グルコースが低減された組成物の製造方法も提供する。
本発明の製造方法においては、上記本発明のポリペプチドによる酸化還元反応を利用して上記組成物中のグルコースをグルコノ？δ？ラクトンに変換することで、グルコース量を低減することができる。具体的には、グルコースを含む上記組成物と、本発明のポリペプチドとを接触させて酵素反応を行えばよい。酵素反応における条件は、本発明のポリペプチドの至適温度及び至適ｐＨ等に基づいて適宜決定される。
本発明の製造方法によって得られる、グルコースが低減された、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物は、メイラード反応による着色を抑制することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
試験例１
配列番号１のアミノ酸配列からなるグルコースデヒドロゲナーゼ（アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼのＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体；以下において、「ＧＤＨ１」とも記載する。）のＸ線結晶構造解析を行った結果、第５８２位アミノ酸への変異導入に伴い、第５３８位のヒスチジンが立体障害を受けている可能性に着眼した。この立体障害の解消を目的として、第５３８位のヒスチジン近傍の第５７８位メチオニンへの変異導入を検討した。
配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２に示される塩基配列をもとに、以下の変異用プライマーを設計した。
Ｍ５７８Ａ変異用プライマー1：ACGCAAGCCTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号５）
Ｍ５７８Ａ変異用プライマー2：GGACGAGGCTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号６）
Ｍ５７８Ｎ変異用プライマー1：ACGCAAAACTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号７）
Ｍ５７８Ｎ変異用プライマー2：GGACGAGTTTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号８）
Ｍ５７８Ｖ変異用プライマー1：ACGCAAGTGTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号９）
Ｍ５７８Ｖ変異用プライマー2：GGACGACACTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１０）
Ｍ５７８Ｌ変異用プライマー1：TACGCAACTGTCGTCCCATCCTATG（配列番号１１）
Ｍ５７８Ｌ変異用プライマー2：GACGACAGTTGCGTAGGGGGAATAG（配列番号１２）
Ｍ５７８Ｋ変異用プライマー1：ACGCAAAAGTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１３）
Ｍ５７８Ｋ変異用プライマー2：GGACGACTTTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１４）
Ｍ５７８Ｄ変異用プライマー1：ACGCAAGATTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１５）
Ｍ５７８Ｄ変異用プライマー2：GGACGAATCTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１６）
Ｍ５７８Ｆ変異用プライマー1：ACGCAATTCTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１７）
Ｍ５７８Ｆ変異用プライマー2：GGACGAGAATTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１８）
Ｍ５７８Ｗ変異用プライマー1：ACGCAATGGTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１９）
Ｍ５７８Ｗ変異用プライマー2：GGACGACCATTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号２０）
Ｍ５７８Ｙ変異用プライマー1：ACGCAATACTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号２１）
Ｍ５７８Ｙ変異用プライマー2：GGACGAGTATTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号２２）
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡに挿入されたプラスミドを鋳型として、設計した上記のプライマーとＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片を得た。
ＰＣＲ後の増幅産物を制限酵素Ｄｐｎ Ｉで処理し、未変異のプラスミドを消化後、ライゲーションを行い、変異導入されたプラスミドを取得した。変異導入後のプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、プラスミド抽出を行い、変異導入されたプラスミドを作製した。得られた変異導入されたプラスミドをサッカロマイセス・セレビシエに形質転換した。得られた形質転換株について液体培養を行い、これにより得られた酵素溶液について以下の手法でＧＤＨ活性を調べた。
ＧＤＨ活性評価方法
５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２．０５ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌのグルコース溶液０．６０ｍＬ、１５ｍｍｏｌ／ＬのＰＭＳ溶液０．１０ｍＬ、及び２ｍｍｏｌ／ＬのＤＣＩＰ溶液０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈した酵素溶液を０．１ｍＬ添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出した。この際、ＧＤＨ活性は、Ｄ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
なお、式中のＶｔは反応試薬溶液と酵素溶液との総液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件における還元型ＤＣＩＰの１μｍｏｌ当たりの吸光係数（ｃｍ2／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
変異導入前の酵素ＧＤＨ１のＧＤＨ活性を１００％とし、各変異酵素のＧＤＨ活性の相対量（％）を算出した。結果を図１に示す。図１に示す通り、Ｍ５７８Ｖ及びＭ５７８Ｆで活性の向上が認められた。なお、各酵素の発現量はＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価し、同等レベルの発現量であることを確認した。従って、Ｍ５７８Ｖ及びＭ５７８Ｆで比活性が向上したことが認められた。
試験例２
Ｍ５７８Ｖの変異が導入されたＧＤＨ１プラスミドから、ＧＤＨ遺伝子部分をＰＣＲにて増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をタカアミラーゼ改変ＣＳ３プロモーターとアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのターミネーター遺伝子の間につなぎ、発現カセットを構築した。
構築された発現カセットと、アスペルギルス・オリゼ由来オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ遺伝子）とを、ｐＵＣ１９に挿入し、発現プラスミドを構築した。構築された発現プラスミドを用いて、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のｐｙｒＧ遺伝子欠損株を形質転換し、ウリジン要求性を利用して形質転換株を取得した。得られた形質転換株を液体培養で培養し、Ｍ５７８Ｖを含む粗酵素液を取得した。得られた粗酵素液を塩析、疎水結合クロマト、イオン交換クロマトを用いて精製し、凍結乾燥を行い、Ｍ５７８Ｖの精製酵素粉末を得た。
得られたＭ５７８Ｖの精製酵素粉末及びＧＤＨ１の精製酵素粉末の単位重量あたりのＧＤＨ活性値（Ｕ／ｍｇ）を試験例１と同様に測定し、Ｍ５７８ＶのＧＤＨ活性の相対量（相対活性）を算出し、ＧＤＨ１の活性値を１００％とした場合のＭ５７８Ｖの相対活性を導出した。結果を表１に示す。
表１に示すとおり、Ｍ５７８Ｖは、ＧＤＨ１と比較して約２割の比活性向上を示した。
また、グルコースに対するカイネティックパラメータ（Ｋｍ［ｍｍｏｌ／Ｌ］及びＶｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）を求め、ＧＤＨ１のＫｍ及びＶｍａｘをそれぞれ１００％とした場合のＭ５７８Ｖの相対Ｋｍ及び相対Ｖｍａｘ相対活性を導出した。結果を表２に示す。
表２に示す通り、Ｍ５７８ＶはＧＤＨ１と比較してグルコースに対するＫｍはほとんど変わらないが、Ｖｍａｘは約２割の向上を示した。つまり、Ｍ５７８ＶはＧＤＨ１と比較してグルコース基質に対する酵素親和力はほとんど変わらないが、酵素反応の効率が向上していることが認められた。
配列番号１は、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼのＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体である。
配列番号２は、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼのＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体をコードするＤＮＡである。
配列番号３は、配列番号１に示す二重変異体のＭ５７８Ｖ変異体をコードするＤＮＡである。
配列番号４は、配列番号１に示す二重変異体のＭ５７８Ｆ変異体をコードするＤＮＡである。
配列番号５～２２は、変異導入用プライマーである。

Claims (12)

  1. 以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチド：
    （１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１～６０個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド、及び
    （３）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が９０％以上であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
  3. 請求項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
  4. 請求項３に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  5. 請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
  6. 請求項１に記載のポリペプチドを含む酵素剤。
  7. 請求項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース測定用試薬。
  8. 請求項１に記載のポリペプチドを用いて試料中のグルコースを測定する工程を含む、グルコース測定法。
  9. 請求項７に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
  10. 不溶性支持体と、前記不溶性支持体に固定された請求項１に記載のポリペプチドとを含む、グルコースセンサ。
  11. 請求項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース低減剤。
  12. 請求項１に記載のポリペプチドを用いて、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物からなる群より選択される組成物中のグルコースを低減する工程を含む、グルコースが低減された組成物の製造方法。


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