WO2007126141A1

WO2007126141A1 - エレクトロスプレーによるイオン化方法および装置

Info

Publication number: WO2007126141A1
Application number: PCT/JP2007/059438
Authority: WO
Inventors: Kenzo Hiraoka; Atsushi Takamizawa
Original assignee: University Of Yamanashi
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-26
Publication date: 2007-11-08
Also published as: US20090140137A1; US7902499B2; EP2017610B1; EP2017610A1; JP4862167B2; JPWO2007126141A1; EP2017610A4

Abstract

前処理なしの生体試料を測定対象とすることができ,しかも大気圧下でイオンの脱離イオン化が可能で,nmオーダの分解能をもつイメージングを可能とする。大気圧下,前処理なしの生体組織などを測定対象試料とする。XYZ軸駆動ピエゾ素子のSTM探針(プローブ)を用い,Z方向駆動の振動数:数Hzないし数kHz,振幅:数10μmないし数mmで上下振動させ,nmオーダ深さで生体試料と接触させて探針先に試料分子を捕捉する。探針にパルス状高電圧を印加し,探針エレクトロスプレーを実現する。探針先端に捕捉した試料分子をプラズモン支援エレクトロスプレー,または赤外レーザ加熱支援によって脱離イオン化し,直交型飛行時間質量分析計,イオントラップ質量分析計などの質量分析計を用いて質量分析する。探針をXY方向に掃引して振動を繰返し,生体試料のnm領域分子イメージング像を測定する。また,他の態様では,液体クロマトグラフの出口に接続されたキャピラリーの先端に生成される液滴にプローブを接触させて液体試料を捕捉し,エレクトロスプレーを発生させる。

Description

エレクトロスプレーによるイオン化方法おょぴ装置

技術分野

この発明は，一般的にエレクトロスプレーによるイオン化方法および明

装置に関し，一例としてはイメージングが可能なエレクトロスプレーによるイオン化方法おょぴ装置，他の例としては微細化が可能なェレクトロスプレーによるイオン化方法おょぴ装書置に関する。

背景技術

生体試料や，工業製品などを対象としたィメ一ジング質量分析法は，大別して 2つある。第 1はマトリックス支援レーザ脱離イオン化法（MA LDI ) , 第 2は，二次イオン質量分析法（SIMS) である。これらの方法は，たとえば次のような文献に記載されてレヽる。 "Imaging mass spect rometry： a new tool to investigate the spatial organi zat ion of p eptides and proteins in mammalian tissue sections" Current Opini on in Chemical Biology 2002, 6, 676-681 , "Direct molecular imag ing of Lymnaea stagnal i s nervous tissue at subcellular spatial r esolution by mass spectrometry" Anal. Chem. 2005, 77， 735 - 741.

MALDI による試料調製法の一例を挙げれば，生体試料を— 18°C程度に冷却し，ステンレスブレードなどによって 15μ m の生体試料切片を作成する。これを電導性のフィルムに載せ，試料を乾燥させる。さらに試料表面にマトリックスを薄く塗布して MALDI 試料とし，これを真空チャンバーに揷入し， MALDI を行う。また，ポリエチレンフィルム上に生体試料を載せ，フィルムの裏側からレーザ光を照射して高分子フィルムを瞬間的に加熱して，接触界面の細胞をフィルムに転写する方法（laser ca pture mi crodi ssect i on ) などもある。試料ィ才ンの脱離イオンィ匕には，主に 337nraの窒素レーザが使用される。

これらの方法では，レーザ光のビーム径を数 10 /z m 以下に絞るのが困難で，またアブレーシヨンが広域にわたるので，空間分解能は 50 μ ra が限界である。また， MALDI の最大の特色であるマトリックスを使用することで，イオンの検出感度が飛躍的に増大するが，他方では，試料に塗布するマトリックスの結晶サイズが 100 /1 ra以上になることから，空間分解能が制約される。 .

S IMS法では，点光源に近い金属イオン源（Ga+, Au+など）などが実用化され， / m 以下の空間分解能が達成されている。しかしながら，ィォンのエネルギーが大きく（10〜20keV ) ，入射イオンが試料に数 100ォングストロームの深さにわたって侵入し，試料が損傷を受ける。このため，生体試料など分解し易い試料からのイオンの収率が時間とともに急速に低下する。脱離する試料は表面近傍の分子に限られるので，生体関連試料に対するィオンの検出感度が低い。

この欠点を解消することを目的に，クラスター SIMSが開発されてきた。たとえば，金クラスターイオン（Au_n ⁺ ) や C₆₀ ⁺イオンを入射イオンとして用いると，二次イオンの脱離効率が急増することが明らかとなった。しかしながら，一次イオンビーム電流が小さいこと，イオンビーム径が数 μ m 以上になることなどから， μ m 以下の空間分解能を得ることが困難である。これらの SIMS法は，いずれも生体高分子等の高質量分子には適用が難しい。

以上述べたような MALDI や S IMSによるイメージング技術が，近年，ラィフサイエンスの分野で普及しつつある。しかしながら，これらの方法はその原理的な制約によって μ m 以下の分解能を得ることは困難である。また，高真空でのみ作動する質量分析装置の真空系に試料を導入せざるを得ないので，前処理が極めて煩雑となる。したがって，従来の MALDI または SIMS法にいかなる改良を加えたとしても，これらを基本技術とする限り， / ra 以下の分解能を実現することは不可能に近い。

生体試料などを大気圧下でそのままの状態に保ちつつ，かつ非破壌でイメージング像を実時間ナノスケール（ 1 μ m 以下）計測する質量分析法はこれまでに開発されていない。

他方，従来エレクトロスプレーまたはナノレーザスプレーでは，試料液体がキヤビラリ一先端で円錐状の形状をなし（ティラー（Taylor) コーンと呼ばれる），円錐状の先端から微細な帯電液滴が生成する。この液滴は，液体の粘性のために，マイクロメートルないしはサブマイクロメートル以下のサイズにすることは原理的に不可能である。これは，ティラーコーンの先端が電場の力で引きちぎられて液滴が発生する際，液体の粘性によってティラーコーンの先端径が自動的にサブマイクロメ一トルのサイズになってしまうからである。このように，エレクトロスプレーで生成できる液滴サイズは，自然発生的に決まってしまい，更なる極小化は困難である。

また，従来のエレクトロスプレーでは，ナノ化に伴い（ナノエレクトロスプレー），キヤピラリーの径を細くする必要があり，目詰まり等，多くの制約がある。スプレーも発生させにくいし，取り扱いが煩雑である。さらに従来のエレクトロスプレーでは，塩濃度が高くなると，スプレーが困難になり，またイオンの気相への脱離効率が激減する。したがつて，生理食塩水など， 150raM程度の NaCl水溶液などには適用ができな

発明の開示この発明は，前処理なしの生体組織などを対象試料とすることができ，しかも大気圧下で試料ィオンの脱離，イオン化が可能なィオン化方法および装置を提供するものである。

この発明はまた，目詰まり等を起こすことなく極微細な試料を取扱うことができ，しかも効率よくエレクトロスプレーを発生させることが可能な方法おょぴ装置を提供するものである。

この発明はさらに，液体状生体試料，塩濃度が高い試料に対してもェレクトロスプレー現象を起こすことができる方法および装置を提供するものである。

さらにこの発明は，ナノメートル（rnn) オーダの分解能のイメージングも可能となるイオン化方法および装置を提供するものである。

この発明はさらに，上記のイオン化方法，装置を用いた質量分析方法および装置も提供する。

この発明によるエレクトロスプレーによるイオン化方法は，金属製プローブの先端が試料に接近した原点位置で，そのプローブの先端が試料に接触する程度の振幅をもつて上記プローブをその長手方向に振動させ，上記プローブにエレクトロスプレーを生じさせる電圧を印加し，上記プロープの先端に試料を捕捉し，その試料をイオン化するものである。上記プローブは原点位置（上至点）と試料にプローブ先端が接触する位置 (下至点または試料捕捉位置）との間で振動する。大気圧下で生成された試料イオンはイオンサンプリング用のキヤビラリ一またはオリフィスなどを通して，または直接に質量分析装置に導かれる。振動とは，周期的な運動のみならず，プローブが原点位置と試料捕捉位置との間を 1回のみ往復する運動（動き）も含むものとする。

この発明によるイオン化装置は，試料を保持するための試料保持手段と，電圧が印加される金属製のプローブと，このプロ一プをその長手方向に振動させる振動装置とを備えているものである。振動装置は，プロ一プを長手方向に一往復のみさせる装置を含む。

この発明によると，金属製プローブや試料を真空室内に配置する必要はなく，大気圧下（大気，他の不活性ガス中または飽和的蒸気圧チャンバー内など）でイオン化を行うことができる。試料に前処理を加えることなくそのまま使用することができる。試料には生体試料を用いることが可能である。

この発明によるプローブ（採針）エレクトロスプレーは，プローブを振動させて試料をプローブ先端に捕捉してエレクトロスプレーさせており，プローブ（探針）を用いるので目詰まりが起こらない。先端の鋭いプローブを用いると，効率よくエレクトロスプレーを発生させることができる（電場の効果が極限的に高められる）。プローブを振動させているので，プローブに捕捉される試料の量を多くすることができ，これは振動周波数を高めれば高めるほど多くなる。さらに，原子レベルの先端径をもつプローブ（探針）を用いれば，針先端の径を極限にまでナノ化できる。この結果，塩濃度が高い試料に対しても，エレクトロスプレー現象を起こすことができる。プローブに印加する電圧は，プローブと他の部材，たとえば質量分析装置の一部またはそれに関連する部材（ィォンのサンプリング孔を持つオリフィス，スキマーなど，サンプリング ' チューブ，キヤビラリ一など），試料保持手段（試料）またはそれに関連する部材（場合によってはプローブと試料保持手段との間には電位差が殆ど生じないようにすることが好ましいこともあるが，印加電圧の種々の態様については後述する）との間に電位差を生じさせるように印加する。

さらに望ましい実施態様においては，プローブの先端付近にレーザ光 (紫外，赤外または可視光）を照射するレーザ装置を設け，上記原点位置におけるプローブの先端付近または先端からわずかに離れた位置（下方に離れた位置）にレーザ光を照射する。

可視レーザ光（たとえば 532nraの YAG 2倍波）の場合には，レーザ光によって照射された金属（プローブ）表面に表面プラズモンが誘起される。この表面プラズモンはプローブ表面を先端に向って伝播し，プロ一ブ先端付近の電場強度を増強する。したがって，エレクトロスプレーによる試料分子の脱離ィオン化が増強される。赤外レーザ光を使った場合は，プローブ先端付近に捕捉された試料及び金属表面の加熱により，試料の乾燥の促進およぴ液滴からのイオン脱離効率が増強される。また，この加熱効果で，非共有結合性複合体などを各々のサブュニットに選択的に解離させることができる。赤外レーザ光照射では，生体反応で重要な役割を果たす非共有結合性複合体の解離の観測ができる。

この発明の他の実施態様では上記原点位置における上記プローブの先端付近に溶媒を吹き付ける。これは，試料が乾燥して，または生体試料のように成分濃度が高く，エレクトロスプレーが発生しにくい場合に有効である。

エレクトロスプレーを生じさせる電圧（比較的高電圧）は常時プロ一プに印加しておいても良いが， ''好ましくは，プローブが原点位置またはその付近にある期間において，エレクトロスプレーを生じさせる電圧をプローブに印加する。プローブの先端が試料に接触しているとき，またはその付近にある期間においては，プロ一ブの電位は試料と同電位とするカまたは試料から選択的にイオンを捕捉するために，それに適した比較的低い電圧を印加することが好ましい。

イオン化装置は，一実施態様では，上記プローブに印加するパルス状電圧であって，振幅，パルス幅おょぴ波形のうちの少なくともいずれか一つが可変なパルス状電圧を発生する電源装置を備える。プローブに印加する電圧の値，その期間等を調整可能とすることが好ましい。

さらに他の好ましい実施態様では，上記プローブ先端が原点位置付近にある期間において，エレクトロスプレーを生じさせる電圧を上記プローブに印加し，レーザ光照射と上記電圧印加とを同期させる。すなわち，上記プローブが上記原点位置またはその付近にあるときには上記プローブに上記電圧を印加しかつレーザ光を照 †する。

プローブに試料がより多く捕捉されるようにするために試料の状態に応じてプローブの温度調整をするとよい。たとえばプローブのホルダ一にペルチヱ素子（温度調整素子）を取付けることによりプローブの温度制御が可能となる。

さらに，捕捉する試料量を増大させるために，上記プローブを回転させる，上記プローブの先端に凹凸を形成し，その表面積を増大させる等の態様を採用することもできる。

生体試料のような液体を含む固体状の試料の場合には，試料を試料台に載置して供給すればよい。試料を容器に入れてもよい。

生体試料のような液体を含む固体状の試料の場合には，特に，ィメージングが可能と ¾る。すなわち，プローブの先端のサイズを nmオーダとし，かつプローブを試料表面に沿って変位させるときの最小変位量単位を nmォ一ダで制御すれば，試料表面において nmォーダの分解能でプロ一ブにより試料分子を捕捉することができる。したがって，試料表面の分子の分布を nmオーダで測定すること（イメージング）が可能となる。上記のイオン化方法を実現するためのこの発明によるイオン化装置は: 試料を保持するための試料台と，金属製のプローブと，このプローブをその長手方向に振動させる振動装置と，試料台またはプローブの少なくともいずれかを，相対的に接近離間および平行移動させる 3次元変位駆動装置とを備えているものである。好ましい実施態様では，まず試料表面についての像を得（髙さ分布など），この像において試料分子を捕捉する場所（探索領域）を決定する。この実施態様を実現する方法は，プローブ先端と試料表面との距離を一定に保ってプローブを試料表面にほぼ沿う方向（表面をなぞるように ) に移動させ，プローブの位置に応じた試料表面像を得，この像上において探索領域を特定し，この探索領域内でプローブを原点位置にもたらし，プローブをその長手方向に振動（ 1回の往復運動を含む）させるものである。探索領域を順次移動するとよい。

試料の表面のみならず深さ方向のさまざまな位置において試料を捕捉すれば， 3次元イメージングが可能となる。特に細胞などのように試料表面が硬い膜で覆われている場合などにおいては試料を穿孔し，この孔内に上記プローブを侵入させて試料を捕捉するとよい。試料の穿孔には，先端にねじ溝を切ったプローブなどを用いるとよい。

液体の試料にこの発明を適用する場合には，液体試料をキヤビラリ一の先端から供給するとよい。好ましい実施態様では，上記キヤビラリ一が電圧が印加されるエレクトロスプレーのキヤビラリ一である。液体試料を容器に入れて供給してもよい。

好ましい態様では，プローブと上記キヤピラリーとは同電位（またはエレクトロスプレーや放電等が生じない程度の同電位に近い電位差）とする。望ましくはプローブおよび上記キヤビラリ一と質量分析装置の一部（もしくはこれに関連する部材），または他の部材との間に，エレクト口スプレーを生じさせる電位差が生じるように，電圧を印加する。上記の方法によると，液体クロマトグラフ装置にそのまま適用可能である。すなわち，液体クロマトグラフィーから上記キヤビラリ一に液体試料を供給する。

以上のようにして，高塩濃度試料，血液等にもこの発明を適用することができる。

プローブ（探針）としては，高温での使用が可能な白金やタンダステンを使用すれば，レーザ光（可視，赤外レーザ光）で劣化することがない。

上述したイオン化方法およびイオン化装置における振動するプロ一ブによる試料の捕捉を利用し，他のエレクトロスプレー法（装置）（側方エレクトロスプレー）を適用したイオン化方法および装置もこの発明は提供している。

このイオン化方法は，プローブの先端が試料に接近した原点位置（上至点）で，そのプローブの先端が試料に接触する程度の振幅をもって上記プローブをその長手方向に振動させて（すなわち，上至点と試料捕捉位置（下至点）との間で振動させて）上記プローブの先端に試料を捕捉し，上記原点位置付近において上記プローブの先端に捕捉された試料をエレクトロスプレーに晒すことにより上記試料をィオン化するものである。振動とは上至点と試料捕捉位置との間を一回往復することを含む。このイオン化装置は，試料を保持するための試料保持手段と，プローブをその長手方向に振動させる振動装置と，プローブの先端付近の位置にエレクトロスプレーの場を形成するエレクトロスプレー装置とを備えているものである。振動装置はプローブを一往復させるものでもよレ、。プローブ先端に捕捉された試料を，適当な溶媒を用いたエレクトロスプレーによって供給される帯電液滴によって湿潤化し，希釈することにより，試料の脱離，イオン化が促進される。必要に応じて気送アシスト · ガスを用いてイオン化された試料を分析装置に導く。

プローブは絶縁体でもよい。金属製プローブを用い，この金属製プロープにエレクトロスプレーを生じさせる電圧を印加するようにしてもよいし，さらに上記原点位置における上記プローブの先端付近にレーザ光を照射するようにすることもできる。

この発明はさらに，上述したすべてのイオン化方法またはイオン化装置によりイオン化された試料を質量分析する分析方法および装置も提供する。図面の簡単な説明

第 1図は，第 1実施例のイオン化装置の構成を示すプロック図である。第 2図は，イオン化の様子を示す。

第 3図は，プラズモン支援エレクトロスプレーの測定例を示す。

第 4図は，第 2実施例のイオン化方法を実施する様子を示す。

第 5図は 150m Mの食塩水に 1 (Γ⁵Μのダラミシジンを溶かした試料についての分析例を示す。

第 6図は電圧印加，レーザ光照射および溶媒の吹き付けのタイミングを示すチヤ一トである。

第 7図は第 3実施例のイオン化装置の構成を示すものである。発明を実施するための最良の形態

第 1図は第 1実施例によるイメージングが可能なイオン化装置の概略構成を示すものである。

このイオン化装置は大気圧下で動作可能である。このイオン化装置によって試料から脱離，イオン化された試料イオンは，たとえば質量分析装置に導かれる。質量分析装置の例としては直交型飛行時間質量分析計を拳げることができるが，この発明は（リニア）イオントラップ装置等の質量分析装置にも適用可能である。

試料台 15はィオン化装置内の適所に固定されている。この試料台 15上には生体試料がそのまま（MALDI のように前処理することなく）載置される。便宜的に試料台 15の上面を X Y平面とし，これに垂直な方向を Ζ 方向とする。

試料台の上方には Χ Υステージ 13が配置されている。 Χ Υステージ 13 は Ζステージ 12を Χ Υ方向に移動可能に保持する。 Χ Υステージ 13の X 方向および Υ方向への変位の駆動源はたとえばピエゾ素子または機械駆動装置など機械的な変位を与え得るものであり， nmオーダの分解能で X， Y方向への変位を制御できることが望ましい。

Zステージ（高さ調整用ァクチユエータ） 12は Z方向振動装置 11を Z 方向に移動可能に保持するもので，これもピエゾ素子，モータ駆動または磁気駆動装置など機械的に再現性のよい運動機能を備えたものにより駆動され， Z方向へは nmオーダで変位量を制御できることが好ましい。振動装置 11には金属製のプローブ（探針） 10が取付けられている。このプローブ 10の先端は nmオーダのサイズになるように微細に加工されている。プローブ 10は試料台 15に垂直に（Z方向に）向っており（プロ一ブ 10の長手方向が試料台 15の上面に垂直）， Z方向に振動駆動される。振動装置 11による振動の周波数，振幅，振動回数（ 1回も含む）も制御可能である。振動装置 11と Zステージ 12とを兼用して 1つの Z方向振動駆動装置により実現してもよい。

プローブ 10 (好ましくは，後述するイオンサンプリング用キヤビラリ一 14との間）には電圧可変電源装置 16によりエレクトロスプレーのための正または負の電圧（試料台 15，試料台 15の試料またはイオンサンプリングキヤピラリー 14を基準として，たとえば土数百 Vないし士数千 V。詳細は後述する。）が印加される。正イオンを得る場合には正電圧を，負ィ.オンを得る場合には，負電圧を印加する。

プローブ 10を X Yステージ 13と Zステージ 12により X Y方向および Z 方向に変位させる構成とする代わりに，試料台 15を X Y方向および Z方向に変位させる構成としてもよい。

イオン化装置にはさらにレーザ装置 20 (たとえば YAG レーザ）が設けられ，そのレーザ出射方向がプローブ 10の方向に向けられている。レーザ装置 20は， X Yステージ 22おょぴ Zステージ 21によって X Y方向およぴ Z方向に位置調整自在に支持されている。 X Yステージに代えて回転ステージを用いることもできる。

プローブ 10が設けられている場所の付近には，イオンサンプリング用のキヤビラリ一 14の先端が臨むように配置されている。キヤピラリー 14 はここで生成された試料イオンを質量分析装置に導くためのものである。第 2図を参照して，このイオン化装置を用いたイオン化方法についてその一例を説明する。

試料台 15上に置かれた試料 Sの表面と平行（X Y方向）に X Yステージ 13によってプロ一ブ 10を振動（変位）させながら Zステージ 12を駆動してプローブ 10の先端を試料に近づける。試料表面への接近によつてプローブ 10が剪断力を受け，振動数に変化が生じる。この変化を Zステージ 12 (高さ調整用ァクチユエータ）にフィードバックすることによって，試料 Sの表面とプローブ 10の先端間距離を一定に保ち， X Yステージ 13 によりプローブ 10を X Y方向に変位させて試料 Sの表面のイメージング像（Z方向の位置の像）を nraオーダの分解能で得る。次に，得られたィメージング像に基づいて探索すべき領域を特定する。

特定した探索領域内の所定位置において，試料表面から上方数 10 ra から数 mmの高さ位置にプローブ 10の先端を位置決めする（この位置を原点位置または後述する上死点，上至点もしくは上限位置という）。プロープ 10を，振動装置 11により，原点位置から下方に向けて（試料 Sの方向に向けて） Z方向に振動させる。振動振幅は数 10 mから数 mm程度とし，プローブ 10が最も下がった位置（試料捕捉位置，下死点，下至点または下限位置）で，プローブ 10の先端が nraオーダの深さで試料 Sの表面に接触するように調節する。プローブを上至点と下至点との間を一往復させるだけでもよい。すなわち，プローブの一往復運動も振動の概念に含まれるものとする。下至点位置においてプローブ 10の先端が試料 Sに接触することにより，試料 S中の生体分子が nraサイズのプローブ 10の先端に捕捉される。プローブ 10が引き上げられ，上至点付近に達したときに後述するようにプローブ 10に数 10 Vないしは数千 Vのパルス状電圧を印加する。プローブ 10の先端にエレクトロスプレーが発生し，試料分子が気相に脱離イオン化される。このようにして生成された試料イオンはキヤピラリー 14により吸引されて質量分析装置に送られる。必要に応じて， X Y方向の位置を変えながら，上記の動作を行う。 X Y方向の位置を固定して，プローブ 10が試料 S内に侵入する深さ（Z方向位置）を変えてもよい。探針先端は，試料の保持（採取，捕捉）効率を高めるために，表面を粗く加工してもよい（後述するように，たとえばプローブ 10 の先端にねじ溝のような溝を切っておく）。

原点位置にあるプローブ 10に，レーザ装置 20によつて横方向からたとえば波長 532nra の YAG レーザ光（ 2倍波）を照射する。プローブ 10が最上部に引き上げられた位置（原点位置）で，レーザビーム光がプローブ 10の先端付近より数以内に照射されるように位置を調節する。レーザ光によって照射された金属（プローブ 10) 表面には，表面プラズモンが誘起される。この表面プラズモンはプローブ 10表面を先端に向かって伝播し，先端付近の電場強度が数桁にも増強される。また，赤外レーザ光で照射した場合，試料で濡れたプローブ表面が急速加熱され，この加熱効果で，捕捉された試料の脱離が促進される。また，赤外レーザ加熱により，非共有結合性複合体などの生体試料のサブュニットへの選択的解離も観測できる。赤外レーザ光をプローブ先端に直接照射せず，プロープ先端から外れた近傍（たとえば少し下方）に照射する。これにより，プローブ先端からスプレーされた帯電液滴を加熱することができる。この加熱で帯電液滴中のイオンの気相への気化を促進させ，イオン · シグナルを増強することができる。

このようにプローブ 10の先端に 532 nra レーザ光を照射することによりプラズモンが励起され，試料イオンの脱離効率がさらに増強される。この実施例のイオン化方法は，エレクトロスプレーとプラズモン励起を組み合わせた複合技術によつて脱離 · イオン化を最大限に増強させるものである。大気圧下で気相に脱離したイオンは，イオンサンプリング用キャビラリ一 14にて飛行時間質量分析計に輸送され，分離 ' 検出される。 X Y方向に探針を掃引することで， nmオーダの分解能によるイメージング像を計測できる。赤外レーザ照射では，プラズモンは励起されにくいが，レーザ照射による表面加熱効果，または帯電液滴の加熱によるィォンの気化の促進によりイオンの脱離効率の増大，また非共有結合性複合体の選択的解離などを起こすことができる。

プラズモン支援エレクトロスプレーの測定例として，第 3図に，内径 30 μ m , 外径 70 μ m のナノエレクトロスプレー（第 1図，第 2図に示す構成とは異なる）によるオリゴ糖の測定結果を示す。エレクトロスプレ一においても比較的測定が難しいマンノトリオース（manno t r i o s e ) のイオン強度が 532nm の YAG レーザ光照射で大きく増強されていることが分る。この結果は， SUS キヤビラリ一先端部の光増強電場によるプラズモン励起で，エレクトロスプレーにおける脱離イオン化効率が大幅に促進されたことを検証するものである。このような増強効果は，チトクロム cなどのタンパク質においても同様に観測されている。このプラズモン支援エレクトロスプレー法では，探針先端表面に分子レベルで試料が捕捉されるので，プラズモン支援による脱離効率の増強効果がさらに顕著になると予想される。

上記の通り，上記イオン化法は，エレクトロスプレーを基本とするので，生体高分子が多価イオンとして容易に検出できる。また，このィォン化法は，鋭いプローブ 10を用いる点で，エレクトロスプレーの極限とみなせる電界脱離イオン化に外揷できるという究極のエレクトロスプレ一技術である。このため，生体試料中の塩（生理食塩水条件下など）の存在下でも高いィオン化効率が期待できる。

第 4図は第 2実施例を示すものであり , この実施例は液体試料に好適な構成を持つ。

質量分析装置 40内は高真空に保持されている。質量分析装置 40のィォンを導入する部分にはスキマー 41が設けられ，スキマー 41に微細孔（ィオン導入口） 41 aがあけられている。

このような質量分析装置 40のスキマー 41の前面（質量分析装置 40の外側の大気圧の空間）に，エレクトロスプレーのキヤピラリー 30が配置されている。このキヤピラリー 30は液体クロマトグラフ装置 31の出口に接続され，液体クロマトグラフ装置 31から出力される液体がキヤビラリ一 30に供給される。

金属製プローブ 10は，キヤピラリー 30の先端に生成される微細な液滴の位置（試料捕捉位置，下死点，下至点または下限位置）と，これよりもわずかに（図では上方に）離れた位置（この位置を原点位置，または上死点，上至点もしくは上限位置とする）との間を振動駆動される。金属製プローブ 10は第 1実施例と同じように Z方向振動装置に保持され，かつその長手方向にたとえば数 Hzないし数 KHzで振動駆動される（この実施例では X Yステージ 13および Zステージ 12に相当するものは不要である）。一往復のみの振動であってもよい。また，金属製プローブ 10 ( プローブ 10と質量分析装置 40のスキマー 41との間）には数百 Vないし数千 V程度のエレクトロスプレーの発生のための正または負の電圧が印加される。キヤピラリー 30 (キヤピラリー 30と質量分析装置 40のスキマー 41との間）にエレクト口スプレー電圧（土数百 V程度）を印加しても（この場合にはキヤピラリー 30は金属製），印加しなくてもよい。プロ一ブ 10とキヤピラリー 30との間にエレクトロスプレーが発生するのを抑制するためには，両者間の電位差を小さくするのが良い（好ましくは同電位）。エレクトロスプレーの発生は，プローブ 10の先端とイオンサンプリング ' スキマー（オリフィス） 41との間で起こる。

原点位置のプローブ 10の先端には，レーザ装置から紫外，可視または赤外のレーザ光ビームが照射される。液体クロマトグラフで分離した成分をキヤピラリー 30に送液する。キヤピラリー 30の先端から流出した液体に，キヤピラリー 30の軸に対して横方向から先端の鋭いプローブ（探針） 10を接触させ，液体試料を捕捉する。プローブ 10を上下振動させ，かつエレクトロスプレーを発生させ，生体試料などをエレクトロスプレ一し，質量分析する。プローブ 10に紫外，可視，赤外レーザ光等を照射して，試料の脱離を促進させる。発生したイオンは，大気圧側から質量分析装置 40の真空部内に粘性流として引き込まれる。

細いプローブを使用しているので，従来のキヤピラリーを用いたエレクトロスプレーのように目詰まりがおこらない。プローブの先端が鋭いので，効率よくエレクトロスプレーが発生する（電場の効果が極限的に高められる）。プローブを数ないし数 Ι ΟΚΗζ で振動させて，探針に捕捉される試料量を高める。これが，イオンシグナル増強につながる。

原子レベルの先端径をもつプローブを用いれば，プローブ先端の径を極限にまでナノ化できる。この結果，塩濃度が高い試料に対しても，ェレクトロスプレー現象を起こすことができる。

液体ク口マトグラフ装置の出口から出る液体試料が測定対象であり，高速液体クロマトグラフィ一との結合が容易である。

キヤビラリ一 30をクロストグラフィー装置 31に接続せず，単なる試料供給用の細管としてもよい。このような試料供給用細管に試料を供給し , その先端に形成される液滴についてプローブ（探針）エレクトロスプレーを行って分析した結果の一例を第 5図に示す。 150 m Mの食塩水に 10"⁵Mのグラミシジン Sを溶かしたものを試料とする。通常のエレクトロスプレーでは 150 m Mの食塩水液滴のスプレーは困難である力第 5 図に示す通り塩化ナトリウム（NaCl ) 150m Mの共存下において強くぺプチドのイオンが観測されている。液体試料は容器に入れて供給することもできる。

プローブの材質は，ステンレス鋼，白金，金，タングステン，白金 - イリジウム合金，シリコンなどを使用できるが，高温での使用が可能な白金やタングステンを使用すれば，レーザ光（可視，赤外光）で劣化することがない。また，たとえば 532nmの可視レーザ光を使用する場合は表面に金をコーティングするなどして， 532nraレーザ光の吸収を增強させる。

Z方向振動駆動装'置に，ピエゾ素子に代えて磁気駆動，モータ駆動などを利用して往復運動を生じさせる駆動装置など簡便な装置が使用できるので，安価で普及の可能性が大きい。

上記の第 1，第 2実施例において，プローブへの電圧印加のやり方は種々ある。プローブ 10へ連続的に電圧を印加しておいてもよいが，プロープ 10の先端が生体試料 S と接触し，試料を捕捉する過程では，プロープ 10に高電圧を印加せず，表面から十分に離れた位置でプローブ 10に高電圧を印加して，エレクトロスプレーを発生させることが望ましい。すなわち，プローブ 10と試料 Sを同電位，または両者の電位差を数 Vないし数 10 Vとして，プローブ 10の先端に生体試料を捕捉する（電場による分極効果）（正イオンを捕捉する場合は，生体試料に対して，プロ一ブ 10を負電位に，負イオン捕捉の場合にはその逆にして，正，負イオンを選択的に捕捉する）。先端に試料を捕捉したプローブ 10は生体試料 S から離れて，上至点に達する。この位置またはその付近で，プローブ 10 にはパルス的に高電圧（数 100 Vから数 1000 V ) を印加する。エレクトロスプレー発生が終了した時点で，プローブ 10の電圧を元の値に戻す。プローブ 10の先端に捕捉された試料を効率よくプローブ 10から脱離（ェレクトロスプレー）させ，さらに発生した帯電液滴を急速加熱乾燥し，液滴から効率よく気相イオンを発生させるために，プローブ 10の先端に赤外レーザ光（波長 10. 6 z m) と 532nra可視レーザ光を照射する（赤外レ一ザまたは可視レーザのいずれかでもよい。）。このレーザ光照射もプローブ 10への高電圧印加と同期させるとよい。プローブ先端近傍に赤外レーザ光を照射すれば，帯電液滴の急速加熱により，イオンの気化が促進できる。

第 6図は上述のプローブの位置とプローブへの電圧印加とレーザ光照射との関係を表わしたタイミング · チャートである。プローブ 10が試料 Sから最も離れた位置が上至点，プローブ 10が試料 Sに接触して最も深く入り込んだ位置が下至点として示されている。プロ一ブ 10は上至点と下至点との間を往復振動（ 1往復でもよい）する。

電源装置 16によって，プローブ 10の振動に同期してパルス状（図示のように矩形波でも，矩形波をやや滑らかにした正弦波状でも，矩形波の上縁を斜め（上り勾配又は下り勾配）にした形状でも，鋸歯状波でもよい）の電圧を発生し，プローブ 10にこの電圧を印加する。プローブ 10 が上至点に達する直前または達した付近でプローブ 10に印加される電圧は上述の高電圧（数百 Vないし数千 V ) (これを電圧 V _Bとする）となる。プローブ 10が上死点付近にある間はプローブ 10に高電圧が印加されている。プローブ 10が下至点に至る直前付近からプローブ 10に印加する電圧（これを電圧 V _Aとする）は，試料 S と同電位（ 0 V ) または試料 Sに対して数 Vないし数十 Vとする。

プローブ 10に高電圧が印加されている期間 T _B (パルス幅）において，レーザ光が照射される。レーザ光の照射時間帯はこの期間 T _Bと必ずしも厳密に一致しなくてもよい。レーザ光照射の断続は，たとえば印加電圧の変化またはプローブ 10の振動に同期してレーザ光を反射するミラーを駆動することにより行なうことができる。

試料 Sの種類や性質，レーザ光照射の有無または波長，その他の条件により，印加電圧の値 V _A , V _Bおよび電圧 V _Aを印加している期間 T

A , 電圧 V _Bを印加している期間 T _B，ならびに波形（これらのうちの少なくとも一つ）は，イオン検出感度が最適となるように，電源装置 16において適宜調整できるようにしておくことが好ましい。

プローブ 10に捕捉された試料 Sが上方（上至点の方向）に移動する間に，試料から溶媒が気化して試料が乾燥しエレクトロスプレーが発生しにくくなる場合がある。また，生体試料のように成分濃度が高く，ェレクトロスプレーが発生しにくい試料が対象となる場合がある。このような場合に対処するために，生体試料にメタノール，エタノール，ァセトニトリル，プロパノール，イソプロノくノールなどのエレクトロスプレ一を発生しやすくする溶媒（すべての極性，無極性溶媒）を噴霧して試料表面を湿潤化させて，試料表面近傍を溶媒希釈し，エレクトロスプレ一の発生を促すようにするとよい。好ましくは，第 6図に示すように，レーザ光照射や電圧印加，プローブの振動と同期して，試料を捕捉したプローブが上至点付近に至ったときに溶媒を吹き付けるようにする。

プローブの先端に溶媒を吹き付ける方法としては，（ i )プローブの上至点付近にわずかな量の溶媒を連続的に噴霧しておく方法，（ii )機械的に，プローブが上至点に至った瞬間に溶媒をスプレーさせる方法（溶媒スプレーヤーを横振動させるなど），（ffi )プローブが上至点に到達した瞬間に，液滴ドットをパルス的にプローブ先端めがけて発射し，先端を溶媒で湿潤させる，などの方法を採用することができる。

上述した 2つの実施例の変形例を，捕捉する試料量を増大させることや 3次元イメージングのために数多く挙げることができる。

捕捉する試料量を増大させるために上述したように，プローブの先端にねじ溝のような溝を切ったりすることにより（凹凸を形成することにより）プローブ先端の表面積を増大させるとよい。また，プローブを試料の内部で回転させるとよい（これは後述する 3次元イメージングゃレーザ光の均一照明においても有効である）。

さらにプローブの温度制御を行うとよい。たとえば，水を多く含む生体試料の場合，プローブを摂氏 0度付近あるいはそれ以下に冷却すると，プローブに捕捉される試料の量が大幅に増大する。これにより，検出感度の増大を図れる。逆にプローブの温度を室温以上に上げることによって，揮発性の低い（粘性の高い液体，さらには固体）試料を融解して捕捉することもできる。このようにプローブの温度を調整することに 'よって種々の試料に適する温度での捕捉が可能になり，この発明によるイオン化方法および装置の応用範囲を広げることができるようになる。プローブの温度制御のためには，プロープまたはそのホルダーにベルチェ素子のような温度調整素子を設けるとよい。

3次元イメージングのためには試料の深さ方向の分子の分析も必要となる。試料（たとえば細胞膜）に穴をあけて，この穴を通してプロ一プを侵入させることにより試料の表面よりも下部，深部の試料を測定対象として捕捉することができる。穴の深さ，捕捉する試料の深さはプローブの振動振幅を調整することにより制御できる。試料の穿孔には，ねじ溝を先端に切ったプローブを用いるとよい。このようにして，試料の切開部分を最小限に抑えることができる。

細胞などが対象試料の場合，生体試料が，硬い膜で覆われていることが多い。このような場合，プローブによる表面のみの浅い穿孔では生体試料内部の分子の分析が行いにくい。生体組織の内部（深部）に存在する分子のイメージングが必要な場合もある。このような場合に，上述の穿孔による試料捕捉方法は好適である。

プローブを回転させる方法は，プローブの表面をレーザ光により均一に照射するためにも重要である。

第 7図は第 3 の実施例を示すものである。上述した第 1，第 2実施例に示すものと同一物には同一符号を付し，重複説明を避ける。

第 3実施例における特徴的事項は，プローブの原点位置（上至点）の側方斜め下方の位置に側方エレクトロスプレー装置 50を配置し，上至点の位置にあるプローブ 10の先端に捕捉された微量試料にェレクトロスプレー装置（好ましくはナノエレクトロスプレー） 50から（斜め下方から）帯電液滴を吹きつけ，これによつて試料を溶解しかつスプレーによつて吹き飛ばしてイオンサンプリング用キヤピラリー 14を通して分析装置に導くものである。エレクトロスプレーの溶媒としては水，エタノール，メタノール, その他の電解質のものであればいかなるものでもよレ、。エレクトロスプレー装置（ナノエレクトロスプレー装置） 50は，溶媒が供給される極細の金属製キヤピラリー 51と，その外側に間隔をあけて設けられた外筒 52とを含み，キヤビラリ一 51には高電圧が印加される。プローブ 10が上至点に至ったときにパルス状の高電圧（第 6図に示すプロープへの印加電圧と同じようなパルス形状の電圧）を印加するようにしてもよいし，常時一定電圧を印加しておいてもよい。キヤビラリ一 51と外筒 52との間の空間にネブライザ一 · ガス（またはアシスト · ガス（N ₂ガスなど））が必要に応じて供給され，その先端からプローブ 10に向けて嘖出される。

エレクトロスプレー装置 50は X Yステ一ジ 54おょぴ Z ステ一ジ 53によって X Y方向および Z方向に位置調整自在に支持されている。 X Yステージに代えて回転ステージを用いることもできる。エレクトロスプレ一装置 50におけるキヤビラリ一 51の傾き角も調整自在になるように支持するとよレ、。プローブ 10としては，金属（金，白金，白金 . イリジウム合金，タングステン，ステンレス鋼など）または絶縁体（誘電体）であるガラスや石英などの先端径がナノスケールの針状細線を用いるとよい第 1，第 2実施例と異なり，プローブ 10には必ずしも電圧を印加する必要はないので，プローブ 10に絶縁体を用いることができる。

第 3実施例におけるイオン化装置の動作は次の通りである。第 1，第 2実施例と同じように，プローブ 10を縦振動（Z軸）させて，プロ一プ 10の先端に試料を捕捉する。試料を捕捉したプローブ 10が上至点またはその付近に達した位置において，プローブ 10の側方にエレクトロスプレー装置 50により発生させているナノエレクトロスプレーの一部（プルームの外周近傍）にプローブ 10の先端を晒す。これにより，プローブ 10 の先端に捕捉された試料を脱離，イオン化させる。ナノエレクトロスプレーの働きは，プローブ 10の先端の試料を，ナノエレクトロスプレーによって供給される帯電液滴によって湿潤化し，希釈する点にある。これにより，エレクトロスプレーしにくい高成分濃度の試料が容易にェレクトロスプレーされるようになる。また，ナノエレクトロスプレーの気送アシスト（支援）によって，プローブ 10の先端に捕捉された試料の脱離: イオン化を促進させることができる。脱離，イオン化された試料はキヤビラリ一 14により分析装置に導かれる。

プローブ 10として，金属を用いる場合には，プローブ 10の電位を試料と常に同電位とするとよい。プローブ先端の試料が側方エレクトロスプレーで十分脱離されない場合には，プローブ 10の先端が側方のェレクトロスプレー · プルームの一部に晒された位置において，プローブ 10に第 1 , 第 2実施例と同じようにパルス的に高電圧を印加し，プローブ 10 の先端にエレクトロスプレーを強制的に癸生させ，イオン強度を増大させる。

側方エレクトロスプレーは，ネプライザ一 · ガスを用いる場合（気送エレクトロスプレー）と，用いない場合の 2通りの選択が可能である。ネブライザ一 · ガスを用いない場合，プローブ先端に捕捉された試料の脱離が効率よく行われない可能性があるので，金属プローブに代えて，絶縁体製プローブを用いて，クーロン斥力でイオンの脱離を促す。ネブライザ一 · ガスを用いる場合には，気流によって，プローブ先端の試料が吹き飛ばされて，脱離が支援されるので，より効率よく，イオンの脱離，イオン化が行われやすい。

金属プローブにパルス的に高電圧を印加して，プローブ先端の試料をエレクトロスプレーし，イオンのより効率的発生を促すことができる。さらに，プローブ 10が上至点に達した位置において，第 1 , 第 2実施例の場合と同じようにパルス . レーザ光を照射し，液体の加熱（赤外レーザ照射），またはプラズモン励起脱離（金属プローブの場合のみ。このときはたとえば 532nmの可視レーザ光照射が好ましい）を促す。

第 3実施例においても，上述した第 1 , 第 2実施例の変形例，たとえばプローブの温度調整，プローブの回転，プローブ先端に凹凸を形成してその表面積を増大させること， 3次元イメージングのために試料を穿孔してこの孔にプローブを侵入させること等の適用が可能であるのはいうまでもない。

Claims

請求の範囲

1 . 金属製プローブの先端が試料に接近した原点位置で，そのプローブの先端が試料に接触する程度の振幅をもって上記プローブをその長手方向に振動させ，

上記プローブにェレクト口スプレーを生じさせる電圧を印加し，上記プローブの先端に試料を捕捉し，その試料をイオン化する，エレクトロスプレーによるイオン化方法。

2 . 上記原点位置における上記プローブの先端付近にレーザ光を照射する，請求の範囲第 1項に記載のイオン化方法。

3 . 上記原点位置における上記プローブの先端付近に溶媒を吹き付ける，請求の範囲第 1項または第 2項に記載のイオン化方法。

4 . 上記プローブ先端が原点位置付近にある期間において，エレクト口スプレーを生じさせる電圧を上記プローブに印加する，請求の範囲第 1 項から第 3項のいずれか一項に記載のイオン化方法。

5 . 上記プローブ先端が原点位置付近にある期間において，エレクト口スプレーを生じさせる電圧を上記プローブに印加し，レーザ光照射と上記電圧印加とを同期させる，請求の範囲第 2項に記載のイオン化方法。

6 . 上記電圧の値と印加する期間が調整可能である，請求の範囲第 4項または第 5項に記載のイオン化方法。

7 . 上記プローブの温度を調整する，請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか一項に記載のイオン化方法。

8 . 上記プローブを回転させる，請求の範囲第 1項から第 7項のいずれか一項に記載のイオン化方法。

9 . 上記プローブの先端に凹凸を形成し，その表面積を増大させる，請求の範囲第 1項から第 8項のいずれか一項に記載めイオン化方法。

10. 試料を穿孔し，この孔内に上記プローブを侵入させて試料を捕捉する，請求の範囲第 1項から第 9項のいずれか一項に記載のイオン化方法。

11. 試料を試料台上に載置して供給する，請求の範囲第 1項ないし第 10 項のいずれか一項に記載のィオン化方法。

12. 上記プローブの先端と試料表面との距離を一定に保って上記プロ一ブを試料表面にほぼ沿う方向に移動させ，上記プローブの位置に応じた試料表面像を得，この像上において探索領域を特定し，この探索領域内で上記プローブを原点位置にもたらし，上記プローブをその長手方向に振動させる，請求の範囲第 1項ないし第 11項のいずれか一項に記載のィメ一ジングが可能なイオン化方法。

13. 液体試料をキヤビラリ一の先端から供給する，請求の範囲第 1項ないし第 10項のいずれか一項に記載のイオン化方法。

14. 上記キヤビラリ一が電圧が印加されるェレクトロスプレーのキヤピラリーである，請求の範囲第 13項に記載のイオン化方法。

15. 液体クロマトグラフィーから上記キヤビラリ一に液体試料を供給する，請求の範囲第 13項または第 14項に記載のィオン化方法。

16. プローブの先端が試料に接近した原点位置で，そのプローブの先端が試料に接触する程度の振幅をもって上記プローブをその長手方向に振動させて上記プローブの先端に試料を捕捉し，

上記原点位置付近において上記プローブの先端に捕捉された試料をェレクトロスプレーに晒すことにより上記試料をィオン化する，

エレクトロスプレ^"によるイオン化方法。

17. 金属製プローブを用い，この金属製プローブにエレクトロスプレーを生じさせる電圧を印加する，請求の範囲第 16項に記載のイオン化方法。

18. 上記原点位置における上記プローブの先端付近にレーザ光照射する，請求の範囲第 16項または第 17項に記載のイオン化方法。

19. 請求の範囲第 1項ないし第 18項のいずれか一項に記載の上記ィオン化方法により得られたイオンの質量分析を行う，分析方法。

20. 試料を保持するための試料保持手段と，

電圧が印加される金属製のプローブと，

このプローブをその長手方向に振動させる振動装置と，

を備えたエレクトロスプレーによるイオン化装置。

21. プロ一ブの先端付近にレーザ光を照射するレーザ装置をさらに備えている，請求の範囲第 20項に記載の装置。

22. 上記プローブに印加するパルス状電圧であって，振幅，パルス幅おょぴパルス波形の少なくとも一つが可変なパルス状電圧を発生する電源装置を備えている，請求の範囲第 20項または第 21項に記載の装置。

23. 上記試料保持手段が試料を载置する試料台である，請求の範囲第 20 項または第 21項に記載のイオン化装置。

24. 試料台またはプローブの少なくともいずれかを，相対的に接近離間および平行移動させる 3次元変位駆動装置，

をさらに備えたィメ一ジングが可能な請求の範囲第 23項に記載のェレクトロスプレーによるイオン化装置。

25. 上記試料保持手段が液体試料を保持して供給するキャピラリーである，請求の範囲第 20項または第 21項に記載のィオン化装置。

26. 試料を保持するための試料保持手段と，

プローブをその長手方向に振動させる振動装置と，

プローブの先端付近の位置にエレクトロスプレーの場を形成するエレクトロスプレー装置と，

を備えたイオン化装置。

27. 請求の範囲第 20項ないし第 26項のいずれか一項に記載のィオン化装置を備えた質量分析装置。