WO2007112729A1 - Antioxidative wirkstofffraktionen für kosmetische formulierungen - Google Patents

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WO2007112729A1
WO2007112729A1 PCT/DE2007/000578 DE2007000578W WO2007112729A1 WO 2007112729 A1 WO2007112729 A1 WO 2007112729A1 DE 2007000578 W DE2007000578 W DE 2007000578W WO 2007112729 A1 WO2007112729 A1 WO 2007112729A1
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ethyl acetate
aqueous phase
variant
methanol
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PCT/DE2007/000578
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Kathrin Kabrodt
Ingo Schellenberg
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Hochschule Anhalt (Fh)
Esa Patentverwertungsagentur Sachsen-Anhalt Gmbh
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/52—Stabilizers
    • A61K2800/522—Antioxidants; Radical scavengers

Definitions

  • Antioxidant agent fractions for cosmetic formulations are provided.
  • the invention relates to the use of antioxidant drug fractions for cosmetic formulations for topical application as creams, lotions, ointments, facial waters or jelly with the application fields care cosmetics, sunscreen, diaper rash and atopic dermatitis from Rheum species species.
  • ROS reactive oxygen species
  • Extrinsic skin aging is influenced by exogenous influences, in particular UV radiation. As an essential mechanism leading to extrinsic skin aging, the formation of ROS is considered. These reactive substances lead to the oxidation of various cell components. This is known as oxidative stress. For their natural balance (homeostasis), the skin forms enzymatic and non-enzymatic radical scavengers between the intracellularly generated radicals and their neutralization. These molecules take over the unpaired electrons of radical compounds and in this way become radicals themselves.
  • the aim of the invention is the elimination of the disadvantages of the known antioxidant drug fractions for topical application.
  • the object of the invention is to provide active ingredient fractions for cosmetic formulations with excellent water and lipid solubility, which have at least a 2 times higher antioxidant capacity than the known formulations in order to improve the protection of the skin accordingly.
  • antioxidant drug fractions for cosmetic formulations for topical application as creams, lotions, ointments, facial waters or jelly with the fields of care cosmetics, sun protection, diaper rash and atopic dermatitis from Rheum species species which are characterized in that the drug fractions by extraction obtained the dried and ground root samples with methanol, the complete removal of methanol freed the aqueous phase formed from lipophilic impurities, extracted the purified aqueous phase with ethyl acetate and the combined ethyl acetate phase in a limited number of drug fractions by column chromatography (sc) separated and summarized the drug fractions with the same content spectrum become.
  • inventive isolated isolated rhubarb fractions are well above the antioxidant capacity of selected commercial polyphenol extracts.
  • Figure 1 shows the extraction scheme for the processing of dried, ground rhubarb roots.
  • FIG. 2 shows the chromatographic separation of the sc fraction 4 obtained from Rheum palmatum MAXIM. (Variant 11) The upper track shows each of the
  • FIG. 3 shows the chromatographic separation of the fraction 4 obtained
  • FIG. 4 shows the comparison of the water-soluble antioxidative capacities of the ethyl acetate phases of variant 11 and variant 19.
  • FIG. 5 shows the comparison of the lipid-soluble antioxidant capacity of the ethyl acetate phase fractions of variant 11 and variant 19.
  • Figure 6 shows the comparison of the antioxidant capacity of selected commercial polyphenol extracts with that of selected rhubarb fractions.
  • the water-soluble anti-oxidative capacity is given in mmol / kg
  • vitamin C Ascorbic acid equivalent
  • methanol is used as the primary extractant instead of acetone / water, and these methanolic extracts are used further.
  • a preparative column chromatographic fractionation of the total ethyl acetate extract is carried out.
  • a proof of efficacy of sc fractionated polyphenolic fractions is then carried out by determining the water- and lipid-soluble antioxidant capacity.
  • the collected extracts were then concentrated on a rotary evaporator under vacuum at 35 0 C, and after addition of 500 ml of water, the methanol was completely removed.
  • the aqueous extract was stored overnight under nitrogen in the refrigerator at 5 0 C. The precipitates could be centrifuged off the next day.
  • the aqueous solution was then shaken out three times with 500 ml of petroleum ether each time.
  • the thus purified aqueous phase was then extracted by shaking four times with 750 ml of ethyl acetate each time, after which there should be an increase in the number of low-oligomerized compounds in the combined ethyl acetate phases and compounds with a higher degree of oligomerization in the remaining aqueous phase and the water phase were then concentrated onsverdampfer under vacuum at 35 0 C on rotationally added in a little water and then freeze-dried.
  • the lyophilized tanned extracts were stored at -21 ° C. under N 2 atmosphere until further use.
  • only the ethyl acetate phase of a preparative column chromatographic fractionation is used.
  • the separation of Sephadex LH-20 is carried out for preparative isolation of the polyphenolic ingredients.
  • the eluents are Ethano! or alcohol / water mixtures established.
  • Acetone / water mixtures (7: 3, v / v) are suitable for the separation of polymeric substances.
  • the ethyl acetate phase was dissolved in methanol, applied to the column (length 100 cm, diameter 5 cm) and eluted successively with ethanol, methanol and acetone / water (7: 3, v / v).
  • an MPLC system with sample feed pump was used. After TLC examination of the test tube fractions obtained, the fractions of the ethyl acetate phase with the same content spectrum were combined for the individual genotypes.
  • Rheum palmatum 20 g of EtOAc phase dissolved in 50 ml of methanol (variant n) 9.51 ethanol
  • Figures 2 and 3 show the chromatograms of the two most effective fractions from the sc separation of the ethyl acetate / phase of Rheum palmatum MAXIM, and Rheum rhaponticum L.
  • the upper lane shows the absorbance at 280 nm, the lower one at 242 nm. Both wavelengths were used for quantification since epigallocatechin and the two procyanidins showed distinctly higher absorption intensities at 242 nm.
  • FIG. 4 shows the ascertained water-soluble antioxidant capacities of the chromatographically separated fractions of the ethyl acetate phase of Rheum palmatum (left gray column) and of Rheum rhaponticum (right black column). in mmol / kg ascorbic acid equivalent, compared to the ⁇ esamx Install shown.
  • fractionation surprisingly causes an increase in the antioxidant capacity.
  • certain individual fractions 4, 7 and 9 have about 2-3 times the antioxidant potential compared to the ⁇ esamx Month. These individual fractions are thus separated chromatographically for their use.
  • 2,788 kilograms of vitamin C have the same antioxidant capacity as 1 kilogram of the sample of fraction 4 of the ethyl acetate phase separation, or in other words:
  • Fraction 4 of the separation ethyl acetate phase of Rheum palmatum is about 2.7 times as effective as vitamin C.
  • FIG. 5 shows the determined lipid-soluble antioxidant capacities of the chromatographically separated fractions of the ethyl acetate phase of Rheum palmatum (left column) and of Rheum rhaponticum (right column), expressed in mmol / kg Trolox equivalent, in comparison with the total extract. Also in this test, some of the chromatographically separated fractions have 2-3 times higher antioxidant capacity than the whole extract. Calculated detection of the determined lipid-soluble antioxidant capacity of fraction 4 of Rheum rhaponticum by comparison with that of Trolox (vitamin E analog).
  • Fraction 4 of the separation of the ethyl acetate phase of Rheum rhaponticum is about 5.5 times as effective as Trolox.
  • FIG. 6 shows the results for the determination of the water-soluble antioxidant capacity.
  • the antioxidant capacity of the isolated rhubarb fractions (right in the picture) is significantly higher than that of the comparator products.
  • the left column shows the water-soluble antioxidant capacity of fraction 4 of the separation of the ethyl acetate phase from Rheum palmatum
  • the right column shows the water-soluble antioxidant capacity of fraction 4 of the separation of the ethyl acetate phase from Rheum rhaponticum.
  • Variant 01 Rh. Officinale BAILL .; Dolomites (Münster)
  • Variant 02 Rh. Officinale BAILL .; Vacrutot (Hungary)
  • Variant 03 Rh. Officinale BAILL .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 04 Rh. Officinale BAILL .; Medicina Rhubarb, Wisley (England)
  • Variant 05 Rh. Officinale BAILL .; Dolomites (Münster) Variation 09: Rh. Palmatum L.; Orlando (USSR)
  • Variant 10 Rh. Rhabarbarum L .; The Sutton
  • Variant 11 Rh. Palmatum l.f. florc rubra MAXIM. Moscow (USSR)
  • Variant 12 Rh. Rhabarbarum L .; Holstein blood
  • Variant 13 Rh. Rhabarbarum L .; Utrecht (Holland)
  • Variant 14 Rh. Rhabarbarum L.; Uppsala (Sweden)
  • Variant 16 Rh. Rhaponticum L .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 17 Rh. Rhaponticum L .; Dnepropetrovsk (USSR)
  • Variant 18 Rh. Rhaponticum L .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 19 Rh. Rhaponticum L .; Uppsala (Sweden)
  • Variant 20 Rh. Rhaponticum L .; Petrograd (USSR)
  • Variant 21 Rh. Rhaponticum L .; Taplozek (Finland)
  • Variant 22 Rh. Rhabarbarum L .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 23 Rh. Rhabarbarum L .; China 1956
  • Variant 24 Rh. Rhabarbarum L .; KVDR 1987
  • Variant 26 Rh. Alexandra VEITCH .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 27 Rh. Wittrockii LUNDSTR .; Petrograd (USSR)
  • Variant 29 Rh. Emod. WOOL .; Petrograd (USSR) Variant 30: Rh. Leucorum; Wroclaw (Poland)
  • Variant 31 Rh. Leucorrhizum PALL; Bucharest (Romania)
  • Variant 32 Rh. Maximowiczii LOSINSK .; Petrograd (USSR)
  • Variant 33 Rh. Tataricum l.f. lasi (Romania)
  • Variant 34 Rh. Undulatum L .; Pruhonice (CSSR) Variant 35: Rh. Altaicum LOSINSK. ; Petrograd (USSR)
  • Variant 38 Rh. Old land type (Germany) Variation 39: Rh. Old land variety (Poland) Variation 40: Bastard Rh. Rhab. x Rh. raponticum Variation 41: Rh. alexandra VEITGH .; Petrograd (USSR) Variant 42: Rh. Officinale BAILL .; Country type, Slovak Ore Mountains
  • antioxidant drug fractions for cosmetic formulations for topical application is explained in more detail in the following examples.
  • Exemplary care cream (O / W cream):

Abstract

Die Erfindung betrifft antioxidative Wirkstofffraktionen für kosmetische Formulierun gen zur topischen Applikation als Cremes, Lotionen, Salben, Gesichtswässer oder Gele mit den Anwendungsfeldern Pflegekosmetik, Sonnenschutz, Windeldermatit und Neurodermitis aus Rheum species-Arten, wobei die Wirkstofffraktionen durch Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol erhalten unter vollständiger Methanolentfernung die gebildete wässrige Phase von lipophile Begleitstoffen befreit, die gereinigte wässrige Phase mit Ethylacetat ausgeschüttel und die vereinigte Ethylacetatphase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktion säulenchromatografisch aufgetrennt und die Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhaltsspektrum zusammengefasst werden.

Description

Antioxidative Wirkstofffraktionen für kosmetische Formulierungen
Die Erfindung betrifft den Einsatz antioxidativer Wirkstofffraktionen für kosmetische Formulierungen zur topischen Applikation als Cremes, Lotionen, Salben, Gesichts- wässer oder Gelee mit den Anwendungsfeldern Pflegekosmetik, Sonnenschutz, Windeldermatitis und Neurodermitis aus Rheum species-Arten.
Durch Schadstoffe in der Umwelt, falsche Ernährung, Rauchen, UV-Strahlen etc. entstehen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und andere Radikalspezies im Über- maß, die durch endogen oder exogen wirkende Faktoren den menschlichen Organismus belasten. Begriffe wie Hyperradikalie und oxidativer Stress sind neuzeitliche Bezeichnungen für die Imbalance zwischen den anfallenden freien Radikalen und den zur Neutralisierung vorhandenen Abwehrmechanismen. Eine besondere Bedeutung kommt dabei dem Schutz der Haut zu, die als äußeres Organ mit einer großen Oberfläche diesen negativ wirkenden Faktoren direkt ausgesetzt ist. Im Zusammenhang mit der Hautalterung hat insbesondere in den letzten Jahren eine intensive Suche nach Wirkstoffen eingesetzt, welche die schädlichen Wirkungen von ROS beseitigen und somit das Gewebe vor oxidativer Schädigung schützen sollen. Substanzen, die diese Eigenschaften besitzen, sind als Antioxidantien bekannt. Die extrinsische Hautalterung wird durch exogene Einflüsse, insbesondere die UV- Strahlung, beeinflusst. Als wesentlicher Mechanismus, der zur extrinsischen Hautalterung führt, wird die Bildung von ROS angesehen. Diese reaktiven Substanzen führen zur Oxidation verschiedener Zellbestandteile. Dies ist als oxidativer Stress bekannt. Für ihr natürliches Gleichgewicht (Homöostase) bildet die Haut zwischen den intrazellulär generierten Radikalen und deren Neutralisierung enzymatische und nicht-enzymatische Radikalfänger. Diese Moleküle übernehmen die ungepaarten Elektronen radikalischer Verbindungen und werden auf diese Weise selbst zu Radikalen. Im Gegensatz zu den ursprünglich sehr reaktiven Molekülen sind die gebildeten Radikale wesentlich stabiler, was zwangsläufig zur Unterbrechung der Oxidati- onsketten führt (Hansen, Jörg; 1998; Etablierung und Optimierung von in vivo und in vitro Nachweismethoden zur Bestimmung endogener Wirkprofile von hautrelevanten Antioxidanssystemen; Hamburg: Universität Hamburg, Dissertation). Die Imbalance dieser Homöostase wird durch ein Nachlassen der Spannkraft und ein frühzeitiges Altern der Haut deutlich. Bekannt ist, dass die Homöostase der Haut durch externe Anwendung antioxidativer Wirkstoffe unterstützt werden kann. Forschungsergebnisse zeigen, dass bestimmte Extrakte aus nativen Ressourcen antioxidativ wirksam sind und sich verträglich in Trägermaterial von Körperpflegemitteln einmengen lassen. Neben anderen haben sich Extrakte vom grünen Tee, Salbei, Rheum species etc. als besonders geeignet erwiesen. Die Schriften DE 19824727 A1 , DE 19962369 A1 und DE 101 33203 A1 zeigen Verwendungen von u.a. Catechinen oder Gallensäu- reestern aus den Blättern des grünen Tees zur Prophylaxe, Behandlung und Pflege trockener Hautzustände. Ebenso wird in der US 4673530 eine Antioxidantien- Mischung mit einem verfahren zur Gewinnung aus grünem Tee vorgestellt. Weiter zeigt die DE 19903716 A1 eine Antioxidantien-Kombination aus einem Toco- pherol und/oder Tocopherolester und einem Auszug einer Teepflanze für eine topische Applikation. Ferner weist die WO 01 /85 189 A1 auf eine Zubereitung zur topi- sehen Behandlung aus Rhabarber- und Salbeiextrakten hin.
Diese aufgeführten Lösungen offenbaren jedoch begrenzte antioxidative Kapazitäten, die in der Art der Gewinnung und Formulierung der Substanzen begründet sind. Sie können aus diesem Grund nur bedingt den Anforderungen gerecht werden.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Eliminierung der Nachteile der bekannten antioxidativen Wirkstofffraktionen zur topischen Applikation. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Wirkstofffraktionen für kosmetische Formulierungen mit ausgezeichneter Wasser- und Lipidlöslichkeit bereitzustellen, die mindestens eine 2fach höhere antioxidative Kapazität gegenüber den bekannten Formulierungen aufweisen, um den Schutz der Haut entsprechend zu verbessern.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch antioxidative Wirkstofffraktionen für kosmetische Formulierungen zur topischen Applikation als Cremes, Lotionen, Salben, Gesichtswässer oder Gelee mit den Anwendungsfeldern Pflegekosmetik, Sonnenschutz, Windeldermatitis und Neurodermitis aus Rheum species-Arten gelöst, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Wirkstofffraktionen durch Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol erhalten, unter vollständiger Methanolentfernung die gebildete wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen befreit, die gereinigte wässrige Phase mit Ethylacetat ausgeschüttelt und die vereinigte Ethylacetatphase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen säulenchromatografisch (sc) aufgetrennt und die Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhaltsspektrum zusammengefasst werden.
Als außerordentlich überraschend hat sich herausgestellt, dass die aus dem Ethyla- cetat-Gesamtextrakt von Rheum species durch chromatografische Auftrennung gewonnenen Rhabarberfraktionen das ca. 2 - 3fache antioxidative Potenzial gegenüber der antioxidativen Kapazität des Gesamtextraktes (Ethylacetat-Gesam- textrakt) besitzen.
Darüber hinaus zeigen die erfinderischen herausgelösten isolierten Rhabarberfrak- tionen, dass sie deutlich über der antioxidativen Kapazität von ausgewählten handelsüblichen Polyphenolextrakten liegen.
Die Figuren 1 bis 6 erläutern die Erfindung näher.
Figur 1 zeigt das Extraktionsschema für die Aufarbeitung getrockneter, gemahlener Rhabarberwurzeln .
Figur 2 zeigt die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Fraktion 4 aus Rheum palmatum MAXIM. (Variante 11) Die obere Spur zeigt jeweils die
Absorption bei 280 nm, die untere bei 242 nm.
Figur 3 zeigt die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Fraktion 4 aus
Rheum rhaponticum L. (Variante 19) Die obere Spur zeigt jeweils die Absorption bei 280 nm , die untere bei 242 nm .
Figur 4 zeigt den Vergleich der wasserlöslichen antioxidativen Kapazitäten der Ethy- lacetatphasen der Variante 11 und der Variante 19.
Figur 5 zeigt den Vergleich der lipidlöslichen antioxidativen Kapazität der Ethylace- tat-Phase-Fraktionen der Variante 11 und der Variante 19.
Figur 6 zeigt den Vergleich der antioxidativen Kapazität ausgewählter handelsüblicher Polyphenolextrakte mit der von ausgewählten Rhabarberfraktionen. Angegeben wird die wasserlösliche anti-oxidative Kapazität in mmol/kg
Ascorbinsäureäquivalent (Vitamin C).
Das Extraktionsschema für die Aufarbeitung getrockneter, gemahlener Rhabarberwurzeln ist in der Figur 1 dargestellt. Zur Gewinnung der Wirkstoffe wird eine bekannte Extraktionsvorschrift, wie sie z.B. in Abb. 8 der DE 101 32936 A1 dargestellt wird, modifiziert.
Für die Erzeugung der wässrigen Ausgangsphase wird statt Aceton/Wasser, Methanol als Primär-Extraktionsmittel eingesetzt, und diese methanolischen Extrakte werden weiterverwendet. Nach der mehrstufigen extraktiven Aufarbeitung wird eine präparative säulenchromatographische Fraktionierung des Ethylacetat-Gesamtex- traktes durchgeführt. In einem nächsten Schritt erfolgt dann ein Wirksamkeitsnachweis von sc fraktionierten polyphenolischen Fraktionen durch die Bestimmung der wasser- und lipidlöslichen antioxidaktiven Kapazität. Für eine Extraktion des Rhabarberwurzei-Materials wurden 1 kg einer getrockneten und gemahlenen Wurzelprobe einer fünfmaligen Wirbelextraktion mit insgesamt etwa 8000 ml Methanol für je 15 min am Ultra-Turrax unterworfen. Die gesammelten Extrakte wurden dann am Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 350C eingeengt, und nach Zugabe von 500 ml Wasser wurde das Methanol vollständig abgezogen. Zur Ausfällung störender lipophiler Substanzen wurde der wässrige Extrakt über Nacht unter Stickstoffbegasung im Kühlschrank bei 50C aufbewahrt. Die Fällungen konnten am nächsten Tag abzentrifugiert werden. Zur Abtrennung weiterer lipophiler Begleitstoffe wurde die wässrige Lösung anschließend noch drei Mal mit je 500 ml Petrolether ausgeschüttelt. Die so gereinigte wässrige Phase wurde daraufhin vier Mal mit je 750 ml Ethylacetat ausgeschüttelt, wonach sich in den vereinigten Ethyla- cetat-Phasen vermehrt niedrig oligomerisierte Verbindungen befinden sollten und in der verbleibenden wässrigen Phase Verbindungen mit höherem Oligomerisierungs- grad. Sowohl die Ethylacetat- als auch die Wasser-Phase wurden dann am Rotati- onsverdampfer unter Vakuum bei 35 0C eingeengt, in wenig Wasser aufgenommen und anschließend gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten gerbstoffangereicherten Extrakte wurden bis zur weiteren Verwendung unter Stickstoffatmosphäre bei - 21 0C aufbewahrt. Es wird für die erfindungsgemäße Anwendung nur die Ethylacetat-Phase einer präparativen säulenchromatographischen Fraktionierung eingesetzt. Bei der säulen- chromatographischen Auftrennung des Ethylacetat-Gesamtextraktes wird zur präparativen Isolierung der polyphenolischen Inhaltsstoffe die Trennung an Sepha- dex LH-20 durchgeführt. Als Elutionsmittel haben sich Ethano! oder Alkohol/Wasser-Gemische etabliert. Zur Trennung polymerer Substanzen sind Aceton/Wasser-Gemische (7 : 3; v/v) geeignet.
Die Ethylacetat-Phase wurde in Methanol gelöst, auf die Säule (Länge 100 cm, Durchmesser 5 cm) aufgegeben und nacheinander mit Ethanol, Methanol und Aceton/Wasser (7 : 3; v/v) eluiert. Hierfür wurde eine MPLC-Anlage mit Probenaufgabepumpe genutzt. Nach DC-Überprüfung der erhaltenen Reagenzglasfraktionen wurden für die einzelnen Genotypen die Fraktionen der Ethylacetat-Phase mit gleichem Inhaltsstoffspektrum zusammengefasst.
Aufgrund der unterschiedlichen Lösungseigenschaften der Genotypen musste mit unterschiedlichen Mengen an Lösungsmitteln eluiert werden. Rheum palmatum: 20 g der EtOAc-Phase in 50 ml Methanol gelöst (Variante n) 9,51 Ethanol
5,51 Methanol
2,01 Aceton : Wasser (7 : 3; v/v)
Nach der sc Trennung der Ethylacetat-Phase resultierten bei Variante 11 elf Fraktionen.
Figure imgf000006_0001
Rheum rhaponticum: 20 g der EtOAc-Phase in 75 ml Methanol (Variante 19) 9,5) Ethanol
6,21 Methanol
2,21 Aceton : Wasser (7 : 3; v/v)
Nach der sc Trennung der Ethylacetat- Phase resultierten bei Variante 19 zwölf Fraktionen.
Figure imgf000007_0001
Rheum spec. Landsorte Polen: 20g EtOAc-Phase in 100ml Methanol gelöst
(Variante 25) 11 ,521 Ethanol
6,481 Methanol
2,16I Aceton :Wasser (7 : 3;v/v) Nach der sc Trennung der Ethylacetat-Phase resultierten bei Variante 25 vierzehn
Fraktionen.
Figure imgf000008_0001
Für die Charakterisierung der durch säulenchromatografische Vortrennung gewonnenen und hinsichtlich ihrer antioxidativen Kapazität als besonders wirksam einzuschätzenden Fraktionen gelten folgende Bedingungen;
Chromatographie
Stationäre Phase: Synergi Polar RP, 80Ä, 4 μm, 250 X 2,0 mm
Mobile Phase: A 0,1 %ige Ameisensäure
B Methanol
Flow: 0,3 ml/min
Temperatur: 400C Gradientenbedingungen: Time (min) %B
0 0
10 10
40 50
41 0
55 0
Dθtektion: DAD
Über Kalibration mit entsprechenden Standardsubstanzen konnten folgende Substanzen in den sc vorgetrennten Fraktionen - soweit enthalten - quantifiziert werden:
Epigallocatechin
Catechin
Procyanidin B1 Epicatechin
Procyanidin B2
Epigallocatechingallat
Epicatechingallat.
Die Figuren 2 und 3 zeigen die Chromatogramme der beiden wirksamsten Fraktionen aus der sc Trennung der Ethylacetat/Phase von Rheum palmatum MAXIM, und Rheum rhaponticum L.
Die obere Spur zeigt jeweils die Absorption bei 280 nm, die untere bei 242 nm. Es wurden beide Wellenlängen zur Quantifizierung verwendet, da Epigallocatechin sowie die beiden Procyanidine deutlich höhere Absorptionsintensitäten bei 242 nm aufwiesen.
Bei Rheum palmatum MAXIM, konnten quantitativ bestimmt werden: Catechin Procyanidin B1 Procyanidin B2 Epicatechingallat. Bei Rheum rhaponticum L. konnten quantitativ bestimmt werden: Catechin Procyanidin B1 Epicatechin Procyanidin B2 Epicatechingallat.
Diese Daten wurden durch gleichzeitige Aufnahme desTotalionenstroms über Massenspektrometrie abgesichert. Die Identifizierung der Substanzen erfolgte außerdem über den Vergleich der Massenspektren der Standardsubstanzen mit den Massenspektren der bei den Standardretentionszeiten detektierten Peaks. Im Vergleich mit allen anderen Fraktionen wiesen die Fraktionen 4 jeweils isoliert aus Rheum palmatum MAXIM, bzw. Rheum rhaponticum L. sowohl in der Summe die höchsten Gehalte an quantifizierbaren Substanzen auf, als auch insbesondere die höchsten Gehalte an Epicatechingallat. Diese Verbindung scheint ursächlich verantwortlich für die hohen Werte bei der Bestimmung der antioxidativen Kapazität zu sein, denn bei der Untersuchung einer weiteren Rheum species mit 10fach geringerer antioxidativer Kapazität wurden nur 25 % der bei Rheum rhaponticum L. 19 gefundenen Menge an Epicatechingallat bestimmt. Bei den weiteren im Chromatogramm sichtbaren Substanzen handelt es sich um typische in Rheum-Arten vorkommende Verbindungen.
Nach Dünnschicht-Überprüfung der erhaltenen Reagenzglasfraktionen wurden für die einzelnen Rhabarberarten die Fraktionen der Ethylacetat- Phase mit gleichem Inhaltsstoffspektrum zusammengefasst. In einem nächsten Schritt wurde ein Wirksamkeitsnachweis von säulenchromato- grafisch (sc) fraktionierten Rhabarberfraktionen durch die Bestimmung der wasser- und lipidlöslichen antioxidaktiven Kapazität erbracht. Dies erfolgte mit Analysenmethoden, die auf der Messung der Photochemolumineszenz beruhen. Die Bestimmung sowohl der wasser- als auch der lipidlöslichen antioxidaktiven Kapazität gibt einen Hinweis darauf, in welchem Milieu der kosmetischen Formulierung (hydrophil oder lipophil) das antioxidative Potenzial der polyphenolischen Verbindungen besser zur Wirkung kommt.
Bei wiederholten Versuchen ergaben sich reproduzierbare positive Effekte der signifikanten Steigerung der wasser- und der lipidlöslichen antioxidativen Kapazitäten einer Mehrheit der Rhabarberfraktionen gegenüber dem Ethylacetat-Gesamtextrakt. In Figur 4 sind die ermittelten wasserlöslichen antioxidativen Kapazitäten der chro- matografisch aufgetrennten Fraktionen der Ethylacetat- Phase von Rheum palmatum (linke graue Säule) und von Rheum rhaponticum (rechte schwarze Säule), ange- geben in mmol/kg Ascorbinsäureäquivalent, im Vergleich zum Θesamtextrakt dargestellt.
Die Fraktionierung bewirkt überraschend deutlich eine Steigerung der antioxidativen Kapazität. Wie ersichtlich, weisen bestimmte Einzelfraktionen 4, 7 und 9 das ca. 2 - 3fache antioxidative Potenzial verglichen mit dem Θesamtextrakt auf. Diese Einzelfraktionen werden so chromatografisch für ihre Verwendung abgetrennt.
Rechnerischer Nachweis der Wirksamkeit der ermittelten wasserlöslichen antioxidativen Kapazität der Fraktion 4 von Rheum palmatum durch einen Vergleich mit der von Vitamin C (Ascorbinsäure).
Ermittelte antioxidative Kapazität: 15833,3 mmol/kg
Molekulargewicht von Vitamin C = Ascorbinsäure: 176,1 g/mol = 0,1761 kg/mol
→ Zu berechnen ist die Menge Vitamin C = Ascorbinsäure, die 15833,3 mmol entspricht:
°'1761 kg - X ■ x = 2,788 kg 1*103 mmol 15833,3 mmol '
Damit ergibt sich folgende Aussage:
2,788 Kilogramm Vitamin C besitzen die gleiche antioxidative Kapazität wie 1 Kilo- gramm der Probe von Fraktion 4 der Trennung Ethylacetat-Phase oder anders ausgedrückt:
Fraktion 4 der Trennung Ethylacetat-Phase von Rheum palmatum ist ca. 2,7-mal so wirksam wie Vitamin C.
In Figur 5 sind die ermittelten lipidlöslichen antioxidativen Kapazitäten der chromatografisch aufgetrennten Fraktionen der Ethylacetat-Phase von Rheum palmatum (linke Säule) und von Rheum rhaponticum (rechte Säule), angegeben in mmol/kg Troloxäquivalent, im Vergleich zum Gesamtextrakt dargestellt. Auch bei diesem Test weisen einige der chromatografisch aufgetrennten Fraktionen eine 2 - 3fach höhere antioxidative Kapazität als der Gesamtextrakt auf. Rechnerischer Nachweis der ermittelten lipidlöslichen antioxidativen Kapazitäten der Fraktion 4 von Rheum rhaponticum durch einen Vergleich mit der von Trolox (Vitamin E- Analoges).
Ermittelte antioxidative Kapazität: 21.895 mmol/kg
Molekulargewicht von Trolox: 250,3 g/mol = 0,2503 kg/mol
■→ Zu berechnen ist die Menge Trolox, die 21.895 mmol entspricht:
0,2503 kg x x = 5,480 kg
1*103 mmol 21895 mmol
Damit ergibt sich folgende Aussage:
5,480 Kilogramm Trolox besitzen die gleiche antioxidative Kapazität wie ein Kilogramm der Probe von Fraktion 4 der Trennung der Ethylacetat- Phase von Rheum rhaponticum
oder anders ausgedrückt:
Fraktion 4 der Trennung der Ethylacetat-Phase von Rheum rhaponticum ist ca.5,5- mal so wirksam wie Trolox.
Die deutliche Steigerung der antioxidativen Kapazität nach der chromatografischen Fraktionierung wird außerdem sichtbar beim direkten Vergleich mit handelsüblichen polyphenolischen Extrakten. In der Figur 6 sind hier die Ergebnisse für die Bestimmung der wasserlöslichen antioxidativen Kapazität dargestellt. Die antioxidative Kapazität der isolierten Rhabarberfraktionen (rechts in der Abbil- düng) liegt deutlich über der der Vergleichspräparate.
Die linke Säule zeigt die wasserlösliche antioxidative Kapazität der Fraktion 4 der Auftrennung der Ethylacetatphase aus Rheum palmatum, die rechte Säule zeigt die wasserlösliche antioxidative Kapazität der Fraktion 4 der Auftrennung der Ethylacetatphase aus Rheum rhaponticum. Vorteile: Aufgrund dieser gesteigerten wasser- und der lipidlöslichen antioxidativen Kapazitäten lassen sich diese Rhabarberfraktionen als verbesserte antioxidativ wirkende Substanzen in kosmetische Pflegemittel der Haut einarbeiten. Rheum species ist eine Pflanze, die weltweit vorzufinden ist und sich in verschiede- nen Arten seiner Umwelt angepasst hat.
Nachfolgend angeführt ist eine Liste mit allen Rhabarberarten für die erfinderische
Lösung.
Variante 01 : Rh. officinale BAILL.; Dolomiten (Münster)
Variante 02: Rh. officinale BAILL.; Vacrutot (Ungarn)
Variante 03: Rh. officinale BAILL.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 04: Rh. officinale BAILL.; Medicinai Rhubarb, Wisley (England)
Variante 05: Rh. officinale BAILL.; Dolomiten (Münster) Variante 09: Rh. palmatum L. ; Petersburg (UdSSR)
Variante 10: Rh. rhabarbarum L.; The Sutton
Variante 11 : Rh. palmatum l.f. florc rubra MAXIM. Petersburg (UdSSR)
Variante 12: Rh. rhabarbarum L.; Holsteiner Blut
Variante 13: Rh. rhabarbarum L.; Utrecht (Holland) Variante 14: Rh. rhabarbarum L. ; Uppsala (Schweden)
Variante 15: Rh. rhabarbarum L.; KVDR 1986
Variante 16: Rh. rhaponticum L.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 17: Rh. rhaponticum L.; Dnepropetrovsk (UdSSR)
Variante 18: Rh. rhaponticum L.; Kirovsk (UdSSR) Variante 19: Rh. rhaponticum L.; Uppsala (Schweden)
Variante 20: Rh. rhaponticum L.; Petrograd (UdSSR)
Variante 21 : Rh. rhaponticum L.; Taplozek (Finnland)
Variante 22: Rh. rhabarbarum L.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 23: Rh. rhabarbarum L.; China 1956 Variante 24: Rh. rhabarbarum L.; KVDR 1987
Variante 25: Rh. spec. Landsorte Polen 1976
Variante 26: Rh. alexandra VEITCH.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 27: Rh. wittrockii LUNDSTR.; Petrograd (UdSSR)
Variante 29: Rh. emod. WOLL.; Petrograd (UdSSR) Variante 30: Rh. leucorum; Wroclaw (Polen)
Variante 31 : Rh. leucorrhizum PALL; Bukarest (Rumänien)
Variante 32: Rh. maximowiczii LOSINSK.; Petrograd (UdSSR)
Variante 33: Rh. tataricum l.f. lasi (Rumänien)
Variante 34: Rh. undulatum L.; Pruhonice (CSSR) Variante 35: Rh. altaicum LOSINSK. ; Petrograd (UdSSR)
Variante 36: Rh. altaicum LOSINSK.; Moskau (UdSSR)
Variante 37: Rh. alte Landsorte (Deutschland)
Variante 38: Rh. alte Landsorte (Deutschland) Variante 39: Rh. alte Landsorte (Polen) Variante 40: Bastard Rh. rhab. x Rh. raponticum Variante 41 : Rh. alexandra VEITGH.; Petrograd (UdSSR) Variante 42: Rh. officinale BAILL.; Landsorte, Slovakisches Erzgebirge
Der Einsatz der antioxidativen Wirkstofffraktionen für kosmetische Formulierungen zur topischen Applikation wird an folgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Ausführungsbeispiel für Pflegecreme (O/W-Creme):
Rezeptur:
INCI Name %
Glycerin 3 ,00
Sodium Behenoyl Lactylate 2 ,00
Cetearyl Alcohol 4 ,00
Glyceryl Stearate 2 ,60 Isopropyl Palmitate 6 ,00
Buxus Ghinensis 5 ,00
Rheum ssp. Fraktion 1 ,00 bis 5 ,00
Wasser, demineralisiert ad 100 ,00
Ausführungsbeispiel für Aufbaucreme:
Rezeptur:
INCI Name °/c i
Helianthus aπnuus Öl 17 ,30
Theobroma cacao 7 ,50
Theobromagrandif. 2 ,90 Glyceryl stearate 7 ,50
Triticum vulgäre 8 ,70
Persea gratissima 4,35
Copaiferaoffic. 1 ,45
Rheum ssp. Fraktion 1 ,00 bis 3 ,00 Wasser, demiπeralisiert ad 100 ,00
Die Einarbeitung der Rheum ssp. Wirkfraktionen in kosmetische Trägersysteme sowohl in deren lipophile Phase als auch in deren hydrophile Phase ist ebenfalls möglich.

Claims

Patentansprüche
1. Antioxidative Wirkstofffraktionen für kosmetische Formulierungen zur topischen Applikation als Cremes, Lotionen, Salben, Gesichtswässer oder Gele mit den Anwendungsfeldern Pflegekosmetik, Sonnenschutz, Windeldermatitis und
Neurodermitis aus Rheum-species- Arten, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte: a) Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol, b) Befreiung der gebildeten wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen unter vollständiger Methanolentfernung nach Zugabe von Wasser, c) Ausschütteln der gereinigten wässrigen Phase mit Ethylacetat,
■ d) säulenchromatografische Auftrennung der vereinigten Ethylacetatphase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen, e) Zusammenfassung der Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhaltsstoffspektrum, f) Abtrennung einzelner Wirkstofffraktionen zur Verwendung nach Durchführung eines Wirksamkeitsnachweises der Wirkstofffraktionen durch die Bestimmung sowohl der wasser- als auch der lipidlöslichen antioxidativen Kapazität.
2. Antioxidative Wirkstofffraktionen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Befreiung der gebildeten wässrigen Phase von lipophilen Begleitstoffen durch Ausfällung der lipophilen Begleitstoffe bei 50C unter Stickstoffbegasung erfolgt.
3. Antioxidative Wirkstofffraktionen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die wässrige Phase mit Petrolether ausgeschüttelt wird.
4. Antioxidative Wirkstofffraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Ausschütteln der gereinigten wässrigen Phase mit Ethylacetat die vereinigten Ethylacetatphasen unter Vakuum eingeengt, in wenig Wasser aufgenommen und anschließend gefriergetrocknet werden.
5. Antioxidative Wirkstofffraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) zur säulenchromatografischen Auftrennung als Elutionsmittel Ethanol, Methanol und ein Gemisch aus Aceton und Wasser eingesetzt werden.
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