WO2007088947A1 - 円二色性蛍光顕微鏡 - Google Patents

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WO2007088947A1
WO2007088947A1 PCT/JP2007/051734 JP2007051734W WO2007088947A1 WO 2007088947 A1 WO2007088947 A1 WO 2007088947A1 JP 2007051734 W JP2007051734 W JP 2007051734W WO 2007088947 A1 WO2007088947 A1 WO 2007088947A1
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fluorescence
circularly polarized
sample
optical lens
polarized light
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PCT/JP2007/051734
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Tsuyoshi Kawai
Kensuke Kawamura
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National University Corporation NARA Institute of Science and Technology
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/19—Dichroism
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6445—Measuring fluorescence polarisation

Definitions

  • the present invention relates to a circular dichroism fluorescence microscope for observing circular dichroism, and in particular, a circle for observing a circularly polarized excitation dichroism spectrum or a circularly polarized fluorescence dichroism spectrum.
  • the present invention relates to a dichroic fluorescence microscope.
  • physiologically active substances such as drugs, poisons, and functional biological components present in the living body have so-called chirality. It is well known that the physiological activity of these physiologically active substances strongly depends on the chirality, that is, the higher order structure (three-dimensional structure and configuration) of the substance. For this reason, in the study of physiologically active substances, it is extremely important to understand the chirality of the substance. In particular, in recent years, attention has been focused on the chirality and higher order structure of biomolecules such as proteins and nucleic acids.
  • CD circular dichroism spectrum analysis
  • FDCD circular excitation dichroism spectrum analysis
  • CPL circular polarization dichroism spectrum analysis
  • Patent Document 1 discloses a technique related to FDCD. Specifically, a fluorescent functional group is introduced into a material having chirality, excited with left and right circularly polarized light, and measured for each fluorescence intensity, and left circularly polarized light excitation and right circularly polarized light excitation are measured. A chirality analysis method for analyzing the chirality of the substance from fluorescence intensity difference information is described.
  • Patent Document 2 discloses a circle that measures the intensity of fluorescence obtained by alternately irradiating a sample with left and right circularly polarized light that is subjected to wavelength scanning at a predetermined modulation frequency to obtain an electrical signal.
  • detection can be performed by obtaining a circular dichroism fluorescence excitation spectrum by using only the AC signal component synchronized with the frequency of switching to the left and right circular polarization among the electrical signals. It describes that sensitivity can be improved.
  • Patent Document 3 describes a method and apparatus for measuring CPL or FDCD of a sample using a laser scanning microscope.
  • Fig. 4 shows a schematic diagram of a device that measures CPL
  • Fig. 9 shows a schematic diagram of a device that measures FDCD.
  • biomolecules such as proteins
  • proteins and nucleic acids are expected to interact with other proteins and cell membranes to change their three-dimensional structure.
  • such a phenomenon cannot be analyzed with a uniform experimental system in a test tube.
  • the present inventor considered that it is very important to directly analyze the higher-order structure of biomolecules in a living body (for example, in a cell). .
  • Patent Documents 1 and 2 described above require a large amount of samples for analysis rather than so-called microscope analysis techniques.
  • microscope analysis techniques only a very small amount of biomolecule can be prepared, and there is a problem that it takes time and cost to obtain a large amount of sample.
  • Patent Document 3 there is a high possibility that measurement at a practical level cannot be performed.
  • the circularly polarized component force and the sample cannot be analyzed.
  • Patent Document 3 when performing circularly polarized fluorescence dichroism spectrum analysis (CPL), a transflective mirror is used as a means for transmitting excitation light and reflecting fluorescence light. . Since the semi-transparent mirror is semi-transmissive as well as not wavelength selective, a loss of light intensity occurs due to the incident excitation light, and an intensity loss occurs even when reflected fluorescent light is reflected. It will be done. Due to such loss, there is a problem that the measurement accuracy is greatly inferior. If the semi-transparent mirror is not arranged at an angle of exactly 45 degrees with respect to the optical path, distortion will occur and the measurement accuracy and stability will be greatly degraded.
  • CPL circularly polarized fluorescence dichroism spectrum analysis
  • Patent Document 3 as shown in FIG. 4, the iris is in the immediate vicinity of the detection unit.
  • the fluorescence light emitted from the sample is multiple-reflected in the polarization modulator, and an error occurs in the detection of the polarization component.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and an object of the present invention is that a large amount of sample is not required for analysis and, for example, a sample such as a biomolecule such as a protein in a living body.
  • a sample such as a biomolecule such as a protein in a living body.
  • the purpose of this study is to provide a circular dichroism fluorescence microscope that can directly and highly accurately analyze the higher-order structure of this.
  • the present inventor has found that, in addition to the laser scanning fluorescence microscope detection'excitation optical system and data processing system, the circularly polarized excitation dichroism spectrum is further increased.
  • Analyzing (FDCD) and circular fluorescing dichroism spectrum analysis (CPL) with an optical system to detect biomolecules such as proteins in vivo using a very small amount of sample As a result, it was found that the higher order structure could be directly analyzed by using such a sample, and a new fact was found and the present invention was completed.
  • the present invention is based on powerful new knowledge. It has been completed and includes the following inventions.
  • a light source, circularly polarized light modulation means that converts left and right circularly polarized light beams emitted from the light source, and right and left circularly polarized light that passes through the circularly polarized light modulation means are condensed and applied to the sample.
  • Signal processing means for calculating a difference in intensity between the fluorescence emitted from the sample force when irradiated and the fluorescence emitted from the sample force when irradiated with the left circularly polarized light, and further, the second optical Confocal with a small aperture between the lens and the wavelength selection means Circular dichroism fluorescence microscope equipped with means.
  • a polarization control means for controlling the light beam emitted by the circular polarization modulation means to alternately turn left and right circularly polarized light at a predetermined modulation frequency, and the signal processing means force Among the fluorescence intensity signals generated by the fluorescence measurement means, the AC component is extracted in synchronization with the modulation frequency, and the fluorescence emitted from the sample when irradiated with the right circularly polarized light and when irradiated with the left circularly polarized light.
  • the circular dichroism fluorescence microscope according to (1) further comprising: a detection control unit that controls to calculate a difference in intensity between the sample force and the emitted fluorescence.
  • a light source a first optical lens for condensing and irradiating the luminous flux emitted from the light source force, a second optical lens for condensing the fluorescence emitted from the sample column,
  • the wavelength selective mirror that reflects the excitation light from the light source but transmits the fluorescence from the sample, and the left and right circularly polarized components of the fluorescence that has passed through the second optical lens are converted into modulated linearly polarized components.
  • the circularly polarized light modulating means to be changed and the linearly polarized light component of either the vertical or horizontal direction among the above linearly polarized light components
  • a polarization blocking means for blocking the transmission of light; a wavelength selection means for passing only light of a predetermined wavelength among the circularly polarized light components transmitted through the polarization blocking means; and a fluorescence intensity detected by detecting fluorescence transmitted through the wavelength selection means.
  • Signal processing that calculates the difference in intensity between the right and left circular polarization components of the fluorescence emitted from the sample based on the fluorescence measurement means used as a signal and the fluorescence intensity signal generated by the fluorescence measurement means
  • a circular dichroism fluorescence microscope further comprising a confocal means having a minute aperture between the wavelength selective mirror and the fluorescence measuring means.
  • a polarization control means for controlling the circularly polarized light that has passed through the second optical lens so that the circularly polarized light modulating means alternately turns left and right circularly polarized light at a predetermined modulation frequency, and the signal.
  • the signal processing means extracts an AC component from the fluorescence intensity signal generated by the fluorescence measurement means in synchronization with the modulation frequency, and a right circular polarization component and a left circular polarization component of the fluorescence emitted from the sample, Detection control means for controlling to calculate the difference in intensity of
  • the circular dichroic fluorescent microscope may be realized by a computer.
  • the circular dichroic fluorescent microscope is realized by a computer by operating the computer as each of the means.
  • the circular dichroism fluorescent microscope control program to be executed and a computer-readable recording medium on which the control program is recorded also fall within the scope of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a configuration of an apparatus for two-dimensional analysis of a circularly polarized excitation dichroism spectrum, which is a circular dichroism fluorescence microscope according to a reference embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a configuration of an apparatus for three-dimensionally analyzing a circularly polarized excitation dichroic vector, which is a circular dichroism fluorescence microscope according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing a configuration of an apparatus for two-dimensional analysis of a circularly polarized dichroism spectrum, which is a circular dichroism fluorescence microscope according to a reference embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing a configuration of a device that is a circular dichroism fluorescence microscope according to an embodiment of the present invention and that three-dimensionally analyzes a circularly polarized fluorescence dichroism vector.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing another configuration of the circular dichroism fluorescence microscope according to the embodiment of the present invention, which is a device for three-dimensionally analyzing a circularly polarized fluorescence dichroism vector.
  • Circular polarization modulator (circular polarization modulation means)
  • Wavelength selector (wavelength selection means)
  • Signal processing section (Signal processing means)
  • Circular polarization modulator (circular polarization modulation means)
  • Polarization blocking unit (polarization blocking means)
  • Detection control unit (Detection control means)
  • Signal processor Signal processing means
  • biomolecules such as proteins and nucleic acids have chirality and exhibit circular dichroism and different properties in the degree of absorption with respect to right circularly polarized light and left circularly polarized light.
  • Circular dichroism varies greatly depending on the chirality of the molecule. It also depends on the measurement direction for the molecule.
  • the chirality of molecules is expected to depend greatly on the environment in which the molecules are placed, it is expected to change sensitively to interactions with nucleic acids such as solid surfaces, cell membranes, proteins, and DNA. .
  • nucleic acids such as solid surfaces, cell membranes, proteins, and DNA.
  • the present invention is a technique relating to a microscope that can analyze two-dimensional or three-dimensional mapping of various substances as described above by analyzing information on chirality through circular dichroism.
  • the circular dichroism targeted in the present invention can be roughly divided into two types. Specifically, circular polarization excitation dichroism and circular polarization fluorescence dichroism.
  • the former can be analyzed by measuring and mapping the difference in fluorescence emission intensity when the excitation light is + and one circularly polarized light.
  • the latter can be analyzed by detecting and mapping the difference between + and-circularly polarized light components in fluorescence emission under linearly polarized light excitation.
  • a circularly polarized component is detected in fluorescence emitted when excited by linearly polarized light.
  • a phase difference of ⁇ ⁇ 4 is given to the fluorescent light, each circularly polarized component is converted to a linearly polarized component in the X and ⁇ directions.
  • the polarization component changes according to the phase difference.
  • the phase difference is periodically modulated, and the synchronization signal is detected by a lock-in amplifier. This can be done.
  • Fluorescent dyes are introduced into cells and incorporated into cells, proteins, and nucleic acids, and the state in which the chiral molecules change as a result of interactions between fluorescent molecules and biomolecules in living cells. Measurement / analysis while identifying the situation has been impossible with conventional technology.
  • the circular dichroism fluorescence microscope according to the present invention the above analysis is possible.
  • the phenomenon in which fluorescent molecules are taken into specific locations in the cells in response to specific organelles or specific stimuli based on the chirality of the molecules. can be detected. Therefore, the present invention is not limited to academic fields such as medicine and physiology. It can be said that it is a very excellent invention that can make a great impact in various industries such as diagnosis, medical equipment, analytical equipment, pharmaceutical business and food business.
  • FIG. 1 schematically shows the structure of a circular dichroic fluorescence microscope 100 according to this embodiment.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 100 is a fluorescence microscope apparatus for analyzing a circularly polarized dichroism spectrum (FDDC) in two dimensions in a sample.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 100 includes a sample stage 101, an optical lens 102, a light source 103, a wavelength selection mirror 104, a circular polarization modulator 105, an optical lens 106, a wavelength selection unit 107, a fluorescence measurement unit 108, A polarization control unit 109, a detection control unit 110, a stage control unit 111, and a signal processing unit 114 are provided.
  • FDDC circularly polarized dichroism spectrum
  • the sample stage 101 is a drive stage configured to be capable of two-dimensional movement in the XY direction by an XY control signal from the stage control unit 111.
  • a cell holder is also provided to hold the cell containing the sample.
  • the optical lens 102 functions as a so-called objective lens. That is, the optical lens 102 functions as a first optical lens for condensing and irradiating the sample with the light that has passed through the circular polarization modulator and reflected by the wavelength selection mirror 104.
  • the optical lens 102 also functions as a second optical lens for collecting the fluorescence emitted from the sample cartridge. That is, in this embodiment, the optical lens 102 functions as a first optical lens and a second optical lens.
  • the powerful optical lens a conventionally known objective lens can be used, and the specific configuration is not particularly limited.
  • a 40 ⁇ objective lens for a fluorescence microscope is used. Can do.
  • the optical lens 102 is described as an example of a configuration in which the optical lens 102 functions as the first optical lens and the second optical lens.
  • the first optical lens is not limited to this configuration.
  • a second optical lens installed separately! / Even if it is a configuration! /
  • the light source 103 can also be a light source (linearly polarized light) that can be irradiated to the sample.
  • a conventionally known light source can be used, and its intensity, wavelength, etc. can be appropriately set.
  • a laser light source (405 nm, 5 mW) can be used.
  • the wavelength selection mirror 104 reflects excitation light from the light source 103 while transmitting fluorescence from the sample.
  • a dichroic mirror can be used as long as it is configured to emit the light source 103 and reflect the excitation light transmitted through the circular polarization modulator 105 while transmitting the fluorescence emitted from the sample.
  • DCM490 can be used.
  • the circularly polarized light modulation unit 105 functions as a circularly polarized light modulation unit that converts the light beam emitted from the light source 103 into left and right circularly polarized light. More specifically, the circular polarization modulator 105 converts the light beam (linearly polarized light) emitted from the light source 103 into left and right circularly polarized light alternately at a predetermined modulation frequency based on the control signal of the polarization controller 109. It is. As long as the circular polarization modulator 105 has such a function, a specific configuration is not particularly limited, and a conventionally known circular polarization modulator can be used. For example, a PEM modulator such as HIDNS PM-IZFS50 can be used.
  • the optical lens 106 is for condensing the light transmitted through the wavelength selection mirror 104 onto the wavelength selection unit 107.
  • the optical lens 106 functions as a third optical lens provided between the wavelength selection mirror 104 and the wavelength selection unit 107. By providing the third optical lens, the sensitivity of the microscope can be increased.
  • the wavelength selection unit 107 functions as a wavelength selection unit that passes only the fluorescence having a predetermined wavelength out of the fluorescence that is collected by the optical lens 102 and transmitted through the wavelength selection mirror 104.
  • the specific configuration of the wavelength selection unit 107 is not particularly limited, and a conventionally known bandpass filter or monochromator, some! /, A combination thereof, or the like can be preferably used.
  • the fluorescence measurement unit 108 functions as a fluorescence measurement unit that detects fluorescence transmitted through the wavelength selection unit 107 and generates a fluorescence intensity signal. If it has such a function, a conventionally known photodetector can be suitably used. For example, a light detection module H7732-10 manufactured by Hamamatsu Photonicus can be used.
  • the polarization controller 109 is a light beam (linearly polarized light) emitted from the light source 103 by the circular polarization modulator 105. It functions as a polarization control means that controls the left and right circularly polarized light alternately at a predetermined modulation frequency.
  • a conventionally known control member can be suitably used as long as it has a powerful function. For example, a PEM modulator controller or the like can be used.
  • the detection control unit 110 extracts an AC component from the fluorescence intensity signal (electric signal) generated by the signal measurement unit 114 in the fluorescence measurement unit 108 in synchronization with the modulation frequency, and converts the right circularly polarized light. It functions as a detection control means for controlling to calculate the difference in intensity between the fluorescence emitted from the sample force when irradiated and the fluorescence emitted from the sample force when irradiated with left circularly polarized light.
  • the detection control unit 110 receives a light amount signal from the fluorescence measurement unit 108 and outputs a reference signal to the polarization control unit 109.
  • it functions as a so-called lock-in amplifier.
  • a control unit a conventionally known control member can be suitably used.
  • a known lock-in amplifier can be used.
  • the stage control unit 111 controls the movement of the sample stage 101 in the XY direction based on the XY control signal from the signal processing unit 114.
  • a conventionally known control member can be suitably used, and its specific configuration and the like are not particularly limited.
  • the signal processing unit 114 Based on the fluorescence intensity signal (electrical signal) generated by the fluorescence measurement unit 108, the signal processing unit 114 irradiates fluorescence emitted from the sample when irradiated with right circularly polarized light and left circularly polarized light. At this time, it functions as a signal processing means for calculating the difference in intensity from the fluorescence emitted from the sample. In other words, it can be said that the circularly polarized excitation dichroism spectrum for the sample is calculated.
  • the circularly polarized excitation dichroism spectrum refers to the fluorescence intensity when the sample is excited by alternately irradiating the monochromatic left and right circularly polarized light and excited by the left circularly polarized light. And the difference in fluorescence intensity when excited with the right circularly polarized light is recorded against the wavelength.
  • the signal processing unit 114 controls the predetermined wavelength of the wavelength selection unit 107 by an external signal and functions as a circularly polarized fluorescence detection wavelength control unit that controls the modulated light wavelength of the circularly polarized light modulation unit 105. Even so! / ⁇ .
  • the signal processing unit 114 is also a member that controls various control means such as the polarization control unit 109, the detection control unit 110, and the stage control unit 111.
  • the signal processing unit 114 includes an interface 112 and an analysis PC 113 connected to various control means.
  • the analysis PC 113 is configured to control various control means including the polarization control unit 109, the detection control unit 110, and the stage control unit 111 via the interface 112. Specifically, the analysis PC 113 gives a wavelength control signal to the polarization controller 109 and an XY control signal to the stage controller 111 via the interface 112.
  • the powerful interface 112 for example, a GP-IB interface or the like can be used.
  • the analysis PC 113 may further be configured to function as image processing means for forming an image on the sample V based on the difference information of the calculated fluorescence intensity.
  • This is a means of imaging and mapping chirality information about a sample.
  • conventionally known means, mechanisms, and software can be used, and there is no particular limitation.
  • software that performs imaging and mapping using data such as a laser scanning fluorescence microscope can be suitably used.
  • the signal processing unit 114 is not particularly limited in its specific configuration and the like as long as it has at least the above-described functions. Except for the points described in particular, a known arithmetic device (nodware) And software can be suitably used.
  • the signal includes an AC component and a DC component.
  • the AC component is proportional to the chirality and the number of molecules
  • the DC component is proportional to the number of molecules (concentration). From this, it is possible to pray for more precise data by mapping the g value (chirality anisotropy parameter) shown in the following equation.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 100 is used to measure the circularly polarized excitation dichroism spectrum of the sample. The operation when analyzing is described.
  • the circularly polarized light modulation unit 105 is irradiated with linearly polarized laser light from the light source 103.
  • the linearly polarized laser light is converted into left and right circularly polarized excitation light by the circular polarization modulator 105.
  • this circularly polarized excitation light enters the optical lens 102 via the wavelength selection mirror 104, and is condensed and applied to the sample on the sample stage 101.
  • This sample is fixed to the sample stage 101, and the position of the sample is controlled by the signal processing unit 114 (specifically, the analysis PC 113) via the stage control unit 111.
  • the circular polarization modulator 105 is a frequency defined by a reference signal from the detection controller 110.
  • the wavelength is the wavelength of the excitation light (circularly polarized laser light), which is given from the analysis PC 113 of the signal processing unit 114 through the interface 112 as the wavelength control signal through the polarization control unit 109.
  • the circularly polarized light modulation unit 105 modulates the light beam (linearly polarized light) emitted from the light source 103 alternately to left and right circularly polarized light at a predetermined modulation frequency.
  • fluorescence is emitted from the sample by the focused irradiation of the circularly polarized excitation light onto the sample. Fluorescence emitted from the sample is collected by the optical lens 102 and transmitted as parallel light through the wavelength selection mirror 104, passes through the optical lens 106 and the wavelength selection unit 107, and is converted into a fluorescence intensity signal (electrical signal) by the fluorescence measurement unit 108. Converted. Then, it is output to the detection control unit 110 as a light amount signal.
  • the left circularly polarized light (for convenience, the circular polarization of "" for the sake of convenience) is greater than the right circularly polarized light (for convenience, the circular polarization of "+”).
  • a strong fluorescence signal is detected when the circular polarization modulator 105 gives a phase difference of + ⁇ +4, and a weak fluorescence signal is given when a phase difference of ⁇ 4 is given.
  • a signal will be detected. Therefore, in the detection control unit 110, the electric signal (light quantity signal) from the fluorescence measurement unit 108 is modulated at the frequency ⁇ .
  • the modulated signal component is transferred to the analysis PC 113 via the interface 112.
  • the analysis PC 113 calculates the difference in intensity between the fluorescence emitted from the sample when irradiated with the right circularly polarized light and the fluorescence emitted from the sample force when irradiated with the left circularly polarized light. Nitsu The circularly polarized excitation dichroism spectrum is analyzed. The analysis PC 113 images and maps the circularly polarized excitation dichroism spectrum corresponding to the position information of the sample stage 101.
  • the sample to be analyzed by the circular dichroic fluorescence microscope 100 is not particularly limited as long as the user desires to analyze the chirality, higher order structure, three-dimensional structure, etc. Various samples Can be targeted. In particular, it is preferred to use it for analysis of higher-order structure and chirality information of proteins, nucleic acids and V, and other biomolecules in vivo.
  • the sample to be analyzed is preferably prepared so that a fluorescent substance is introduced, absorbs excitation light, and emits fluorescence.
  • a fluorescent functional group can be exemplified.
  • the fluorescent functional group is not particularly limited, but groups including naphthalene ring, anthracene ring, pyrene ring, perylene ring, coronene ring, porphyrin ring, etc.
  • the present invention is not limited to these examples, and it should be noted that the sample can be converted into a fluorescent substance using various substances and methods in accordance with the object of the present invention.
  • the circular dichroism fluorescent microscope 100 described above, first, even if the absolute amount of the sample is small, it is possible to analyze the circularly polarized excitation dichroism spectrum. This has the advantage that many samples are not required.
  • the circular dichroism fluorescence microscope for example, for biomolecules such as proteins and nucleic acids existing inside the cell, the chirality information, higher order structure, three-dimensional structure, etc. inside the cell are directly (for example, utilizing the cell alive). Can be analyzed).
  • a light scattering sample such as blood or body fluid (including saliva). Since it is difficult to measure a sample in which light is scattered by a simple vector analysis apparatus, the operational effect of the present invention is a very advantageous effect.
  • body fluids such as blood and saliva are light-scattering (turbid), so pre-processing is required when analyzing with a spectrometer.
  • pre-processing is required when analyzing with a spectrometer.
  • even a light scattering sample is directly used. It has a unique effect that it can be analyzed and pre-processing is necessary.
  • Embodiment 1 one embodiment of a circular dichroism fluorescence microscope for two-dimensional analysis of a circularly polarized excitation dichroism spectrum has been described. However, in this embodiment, confocalization is performed and a circle is formed in three dimensions. An embodiment of a circular dichroism fluorescence microscope capable of analyzing a polarization excitation dichroism spectrum will be described. For convenience of explanation, members having the same functions as those described in the first embodiment will be given the same reference numerals and explanation thereof will be omitted. In the present embodiment, differences from the first embodiment will be described.
  • FIG. 2 schematically shows the structure of the circular dichroic fluorescence microscope 100 ′ according to the present embodiment.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 100 is a fluorescence microscope for three-dimensional analysis of a circularly polarized excitation dichroism spectrum of a sample, and it is noted that the mechanism of a confocal microscope is used. This is the most different feature from Form 1.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 100 includes a sample stage 101 ′, an optical lens 102, a light source 103, a wavelength selection mirror 104, a circular polarization modulation unit 105, an optical lens 106, a wavelength selection unit 107, and a fluorescence measurement unit 108.
  • the sample stage 101 ' is a three-dimensional drive stage that can move in the Z-axis direction in addition to the function of the sample stage of Reference Embodiment 1.
  • the stage controller 111 ′ is also configured to output an XYZ control signal to control the movement of the sample stage 101 ′.
  • the optical lens 102 may be configured to be movable in the Z-axis direction (the direction in which the sample stage 101 ′ and the optical lens 102 approach or leave).
  • a conventionally known technique system or the like can be suitably used for the control system and other configurations.
  • the signal processing unit 114 ' includes an interface 112 and an analysis PC 113' for three-dimensional analysis.
  • the analysis PC113 ' performs three-dimensional circularly polarized excitation dichroism spectrum analysis from confocal microscope data.
  • conventionally known software for analyzing 3D data can be suitably used, It is not particularly limited.
  • the principle of the method for analyzing the circularly polarized excitation dichroism spectrum is the same as in Reference Form 1.
  • the analysis PC 113 ' may be configured to allow imaging' mapping processing.
  • the signal processing unit 114 controls the predetermined wavelength of the wavelength selection unit 107 by an external signal and circularly polarized fluorescence that controls the modulation light wavelength of the circular polarization modulation unit 105. It may be configured to function as a detection wavelength control unit.
  • the confocal portion 115 is provided between the wavelength selection mirror 104 and the wavelength selection portion 107 (more specifically, the optical lens 106), and is a pinhole plate including an optical lens 116 and a minute aperture. 117 and an optical lens 118 are provided.
  • the optical lens 116 is a lens for condensing light at a minute opening of the pinhole plate 117.
  • the optical lens 118 is a lens for condensing the light transmitted through the minute opening and guiding it to the optical lens 106.
  • the confocal portion 115 may be configured only by a pinhole plate having a minute opening, but more preferably a confocal portion configured by a pinhole plate and an optical system as in the present embodiment. A unit (confocal point scanner) is preferred.
  • the confocal unit 115 may be a conventionally known confocal unit, and its specific configuration can be appropriately set according to the object of the present invention.
  • the reference form 1 is the same except that it passes through the confocal portion 115 before reaching the fluorescent optical lens 106 that has passed through the wavelength selection mirror 104. The detailed description will be omitted. With the above configuration, only the light focused on the microscopic aperture of the fluorescence emitted from the sample is transmitted, and the other light is blocked. Can be obtained. Then, the signal processing unit 114 ′ performs a three-dimensional analysis of the circularly polarized excitation dichroism spectrum based on the confocal image data.
  • the diameter of the minute opening of the pinhole plate 117 is preferably 10 to: LOO ⁇ m, more preferably 30 to 50 m. If it is in the above-mentioned range, the fluorescence from the sample can be reliably adjusted, and a more accurate confocal image can be obtained.
  • biomolecules such as proteins and nucleic acids existing inside the cell Chirality information, higher order structures, 3D structures, etc. can be analyzed in 3D. It is of course possible to map 'imaging'. Since a specific example of signal processing in the image mapping mechanism is the same as that in the first embodiment described above, description thereof is omitted here.
  • each embodiment of a circular dichroism fluorescence microscope for analyzing a circularly polarized excitation dichroism spectrum in two or three dimensions has been described.
  • an embodiment of a circular dichroism fluorescent microscope capable of two-dimensional circular polarization dichroism spectrum analysis (CPL) will be described.
  • CPL circular polarization dichroism spectrum analysis
  • FIG. 3 schematically shows the structure of the circular dichroic fluorescence microscope 200 according to the present embodiment.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 200 is a fluorescence microscope for analyzing a two-dimensional circular polarization dichroism vector analysis (CPL) of a sample.
  • CPL circular polarization dichroism vector analysis
  • the circular dichroism fluorescence microscope 200 includes a sample stage 101, an optical lens 102, a light source 103, a wavelength selection mirror 104, a circular polarization modulator 205, a polarization blocking unit 206, an optical lens 106, a wavelength.
  • a selection unit 107, a fluorescence measurement unit 108, a polarization control unit 209, a detection control unit 210, a stage control unit 111, and a signal processing unit 214 are provided.
  • the circular polarization modulator 205 functions as a circular polarization modulator that changes the left and right circularly polarized components of the fluorescence transmitted through the optical lens 102 to a modulated linearly polarized component. More specifically, the circular polarization modulation unit 205 is controlled by the polarization control unit 209 so that the fluorescence (circular polarization component) transmitted through the optical lens 102 is processed at a predetermined modulation frequency and changed to a linear polarization component. It is what is done. As long as the circular polarization modulator 205 has a powerful function, a specific configuration is not particularly limited, and a conventionally known circular polarization modulator can be used. For example, a PEM modulator such as HIDNS's PM-IZFS50 can be used.
  • the polarization blocking unit 206 is a vertical polarization component out of the linearly polarized light component modulated by the circular polarization modulation unit 205. It functions as a polarization blocking means for blocking the transmission of any one of the linearly polarized light components.
  • a known polarizer can be used as the powerful polarization blocking unit 206.
  • the polarization control unit 209 processes the fluorescence (circular polarization component) transmitted by the circular polarization modulation unit 205 through the optical lens 102 at a predetermined modulation frequency and controls the fluorescence to change to a linear polarization component. It functions as a means.
  • a conventionally known control member can be suitably used as long as it has a powerful function.
  • a PEM modulator controller can be used.
  • the detection control unit 210 extracts an AC component in synchronization with the modulation frequency from the fluorescence intensity signal (electrical signal) generated by the signal processing unit 214 in the fluorescence measurement unit 108, and is emitted from the sample. It functions as a detection control means for controlling to calculate the difference in intensity between the right circularly polarized light component and the left circularly polarized light component.
  • the detection control unit 210 receives a light amount signal from the fluorescence measurement unit 108 and outputs a reference signal to the polarization control unit 209. In other words, it functions as a so-called lock-in amplifier.
  • a conventionally known control member can be preferably used.
  • a known lock-in amplifier can be used.
  • the signal processing unit 214 calculates the difference in intensity between the right circular polarization component and the left circular polarization component of the fluorescence emitted from the sample. It functions as a signal processing means to calculate. In other words, it can be said that the circularly polarized fluorescence dichroism spectrum for the sample is calculated.
  • the circularly polarized fluorescence dichroism spectrum refers to the fluorescence generated when a sample is excited by irradiation with linearly polarized light, the degree of polarization is measured, and the intensity of the right polarization component of the fluorescence and the left polarization component are measured. The difference in the intensity of the minute is recorded with respect to the wavelength.
  • the signal processing unit 214 is also a member that controls various control means such as the polarization control unit 209, the detection control unit 210, and the stage control unit 111.
  • the signal processing unit 214 includes an interface 112 and an analysis PC 213 connected to various control means.
  • the analysis PC 213 is configured to control various control means including the polarization control unit 209, the detection control unit 210, and the stage control unit 111 via the interface 112! . Specifically, the analysis PC 213 gives a wavelength control signal to the polarization controller 209 and an XY control signal to the stage controller 111 via the interface 112. As the powerful interface 112, for example, a GP-IB interface or the like can be used.
  • the signal processing unit 214 controls the predetermined wavelength of the wavelength selection unit 107 by an external signal, and controls the modulation light wavelength of the circular polarization modulation unit 205 in conjunction with the set wavelength of the wavelength selection unit 107. It may be configured to function as polarized fluorescence detection wavelength control means.
  • the analysis PC 213 further applies the above sample based on the difference information of the fluorescence intensity calculated by the signal processing unit! It may be configured to function as an image processing means for forming all the images. This is a means of imaging and mapping chirality information about a sample.
  • an imaging 'mapping mechanism conventionally known means, mechanisms, and software can be used, and are not particularly limited.
  • software that performs imaging and mapping using data such as a laser scanning fluorescent microscope can be suitably used.
  • the signal processing unit 214 is not particularly limited in its specific configuration and the like as long as it has at least the functions described above. Software) and software can be used suitably.
  • linearly polarized laser light is emitted from the light source 103 and irradiated to the optical lens meter 102 via the wavelength selection mirror 104.
  • the linearly polarized laser light is collected by the optical lens 102 and irradiated onto the sample on the sample stage 101.
  • This sample is fixed to the sample stage 101, and the position of the sample is controlled by the signal processing unit 214 (specifically, the analysis PC 213) via the stage control unit 111.
  • Fluorescence is emitted from the sample by the focused irradiation of the linearly polarized laser light (excitation light) onto the sample.
  • the fluorescence emitted from the sample cover is collected by the optical lens 102 and converted into parallel light.
  • the light passes through the wavelength selection mirror 104 and enters the circular polarization modulator 205.
  • the circularly polarized light modulation unit 205 is configured to give the fluorescent light a phase difference having a frequency ⁇ defined by the reference signal from the detection control unit 210 and an amplitude of ⁇ 4 (the polarization control unit 209 Through).
  • the wavelength is a measurement wavelength, and is given or removed as a wavelength control signal from the analysis PC 213 of the signal processing unit 214 via the interface 112 according to the maximum of fluorescence emission, via the polarization control unit 209.
  • the circularly polarized light modulation unit 205 gives a phase difference of + ⁇ ⁇ ⁇ 4 to the fluorescent light and linearly polarizes the right circularly polarized light (in this case, the right circularly polarized component is referred to as “+” component for convenience)
  • the left circularly polarized light component (for convenience, "" component) is cut by the polarization blocking unit 206.
  • the right circularly polarized light component passes through the polarization blocking unit 206, passes through the optical lens 106 and the wavelength selection unit 107, and is converted into a fluorescence intensity signal (electric signal) by the fluorescence measurement unit 108. Then, it is output to the detection control unit 210 as a light amount signal.
  • the circular polarization modulator 205 gives a phase difference of- ⁇ ⁇ 4 to the fluorescent light and linearly polarizes the left circular polarization (in this case, the left circular polarization component is referred to as a "+" component for convenience). ),
  • the right circularly polarized component (referred to as “component” for convenience) among the circularly polarized components of the fluorescent light transmitted through the circularly polarized light modulating unit 205 is cut by the polarization blocking unit 206, while the left circularly polarized component is blocked by the polarization.
  • the light passes through the unit 206, passes through the optical lens 106 and the wavelength selection unit 107, and is converted into a fluorescence intensity signal (electric signal) by the fluorescence measurement unit 108. Then, it is output to the detection control unit 210 as a light amount signal.
  • This modulation signal component is detected by the detection control unit 210 as a light amount signal, and the data is transferred to the analysis PC 213 via the interface 112 of the signal processing unit 214. Then, the analyzing PC 213 analyzes the circularly polarized fluorescence dichroism spectrum. In addition, the sample stay The circularly polarized fluorescence dichroism spectrum corresponding to the position information of the di 101 may be imaged and mapped.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 200 described above, first, it is possible to analyze the circularly polarized fluorescence dichroism spectrum even if the absolute amount of the sample is small. This has the advantage that many samples are not required.
  • the chirality information, higher order structure, and three-dimensional structure in the cell can be analyzed with respect to biomolecules such as proteins and nucleic acids existing in the cell.
  • biomolecules such as proteins and nucleic acids existing in the cell.
  • light scattering samples such as blood and body fluid (including saliva).
  • Embodiment 2 an embodiment of a circular dichroism fluorescence microscope for two-dimensional analysis of a circularly polarized fluorescence dichroism spectrum has been described.
  • confocalization enables three-dimensional analysis.
  • An embodiment of a circular dichroic fluorescence microscope capable of analyzing a circularly polarized fluorescence dichroism spectrum will be described.
  • members having the same functions as those described in the first and second embodiments and the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
  • differences from the above-described Reference Embodiments 1 and 2 and Embodiment 1 will be described.
  • FIG. 4 schematically shows the structure of the circular dichroic fluorescence microscope 200 ′ according to the present embodiment.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 200 ′ is a fluorescence microscope for confocalizing and analyzing the circularly polarized fluorescence dichroism spectrum analysis (CPL) in three dimensions of the sample.
  • CPL circularly polarized fluorescence dichroism spectrum analysis
  • the circular dichroism fluorescence microscope 200 ′ includes a sample stage 101 ′, an optical lens 102, a light source 103, a wavelength selection mirror 104, a circularly polarized light modulation unit 205, a polarization blocking unit 206, an optical lens 106, A wavelength selection unit 107, a fluorescence measurement unit 108, a polarization control unit 209, a detection control unit 210, a stage control unit 111 ′, a signal processing unit 214 ′, and a confocal unit 115 are provided.
  • PC213 'for analysis performs three-dimensional circular polarization fluorescence dichroism spectrum analysis from confocal microscope data.
  • As a method and mechanism for processing the three-dimensional data conventionally known software for analyzing the three-dimensional data can be suitably used, and there is no particular limitation. Analysis method for analyzing circularly polarized dichroism spectra The principle is the same as in Reference form 2.
  • the signal processing unit 214 controls the predetermined wavelength of the wavelength selection unit 107 by an external signal and circularly polarized fluorescence that controls the modulation light wavelength of the circular polarization modulation unit 205. It may be configured to function as a detection wavelength control unit.
  • the fluorescent power transmitted through the circular polarization modulator 205 is transmitted in a reference form except that it passes through the confocal part 115 before reaching the polarization blocking unit 206.
  • the detailed description is omitted because it is almost the same as the state 2.
  • the confocal unit 115 is installed between the circularly polarized light modulating unit 205 and the polarization blocking unit 206.
  • the confocal unit 115 is connected to the polarization blocking unit 206 and the optical unit. You may comprise so that it may arrange
  • the arrangement position of the confocal portion 115 is not limited to these configurations, and various design changes can be made as long as the object of the present invention can be achieved.
  • FIG. 5 schematically shows the structure of the circular dichroic fluorescence microscope 300 according to the present embodiment.
  • the circular dichroism fluorescence microscope 300 is a fluorescence microscope for confocal analysis and analyzing circularly polarized fluorescence dichroism spectrum analysis (CPL) in three dimensions of a sample.
  • CPL circularly polarized fluorescence dichroism spectrum analysis
  • the circular dichroism fluorescence microscope 300 includes a sample stage 101 ′, an optical lens 102, a light source 103, a wavelength selection mirror 104, a circular polarization modulator 205, a polarization blocking unit 206, an optical lens 106, A wavelength selection unit 107, a fluorescence measurement unit 108, a polarization control unit 209, a detection control unit 210, a stage control unit 111 ′, a signal processing unit 214 ′, and a confocal unit 115 ′ are provided.
  • the circular dichroic fluorescence microscope 300 differs from the circular dichroic fluorescence microscope 200 'only in that the confocal portion 115' is provided in front of the circular polarization modulator 205, as shown in FIG. . Since the configuration other than this point is the same as the circular dichroic fluorescence microscope 200 ′ in the second embodiment, the description thereof is omitted.
  • the operation of the circular dichroic fluorescence microscope 300 will be described. Basically, the operation is the same as that of the circular dichroism microscope 200 ′, except that the fluorescence emitted from the sample force passes through the confocal part 115 ′ and reaches the circularly polarized light modulation part 205. .
  • the fluorescence emitted from the sample force does not reach the circular polarization modulator 205 as it is, and is once transmitted through the confocal part 115 ′.
  • the fluorescence emitted from the sample is adjusted because only the light focused on the minute opening is transmitted and the other light is blocked. Then, the arranged fluorescence reaches the circular polarization modulator 205.
  • the inventor of the present application has provided a confocal portion 115 ′ having a minute opening for adjusting the fluorescent light emitted from the sample before the circularly polarized light modulating portion 205 as described above. It has been found that the sensitivity of the obtained data is greatly improved. That is, the present inventors have found that the confocal portion 115 ′ is used to convert the fluorescent light into a parallel light beam (adjusted fluorescence) and to enter the circularly polarized light modulation portion 205. Such knowledge is also disclosed in Patent Document 3 described above. It has been suggested that this is a technical idea unique to this application.
  • Patent Document 3 discloses an invention similar to the present invention, which should help to understand the features of the present invention.
  • the apparatus disclosed in Patent Document 3 uses a semi-transmissive mirror as means for transmitting excitation light and reflecting fluorescent light. Since the semi-transmission mirror is not only wavelength selective but also semi-transmission, the intensity of light intensity is generated for incident excitation light. In addition, intensity loss also occurs for the reflected fluorescent light. Due to such a loss, the measurement accuracy is greatly inferior. If the transflective mirror is not placed at an angle of exactly 45 degrees with respect to the optical path, distortion will occur and measurement accuracy and stability will be greatly degraded.
  • a wavelength selection mirror is used instead of the semi-transmission mirror.
  • the wavelength selection mirror bends light having a short wavelength (excitation light in this application) and makes long light (same fluorescent light) go straight.
  • the present invention and the above-mentioned Patent Document 3 are technically different in that they use a wavelength selection mirror or a semi-transmission mirror. Due to such a difference in configuration, the optical paths of excitation light (bent in the present application, but straight in the above-mentioned Patent Document 3) and fluorescent light (directly in this application, and bent in the above-mentioned Patent Document 3) are different.
  • the intensity loss in Patent Document 3 is 50% excitation light and 50% fluorescence light, which is very large, whereas in the present invention, the intensity loss is 5% excitation light.
  • the fluorescent light is only 10%. Therefore, in the present application, measurement stability can be ensured by the above configuration.
  • the iris is in the immediate vicinity of the detection unit.
  • the fluorescent light emitted from the sample is multiple-reflected in the polarization modulator, and an error occurs in the detection of the circularly polarized component.
  • the confocal portion 115 ′ exists between the wavelength selection mirror 104 and the circular polarization modulator 20 5 (modulator). For this reason, the non-parallel beam component is removed, and highly sensitive measurement is possible.
  • the fluorescence emitted by the sample force is once adjusted, and then reaches the circular polarization modulator 205, so that the confocal data detected by the fluorescence detector 108 has much higher sensitivity. improves.
  • the circular dichroic fluorescence microscope 300 is improved by about one digit in both sensitivity and reproducibility compared with the circular dichroic fluorescence microscope 200 ′.
  • a sample with a small circular polarization component force S which is difficult to analyze with the circular dichroism fluorescence microscope 200 ′ of the second embodiment, is high. Analysis can be performed with high accuracy and reproducibility.
  • the confocal part is formed between (the 0 wavelength selection mirror 104 and the fluorescence detection part 108, more preferably, the GO wavelength selection mirror 104 and the circularly polarized light modulation means 2. It can be said that it is preferable to provide it between 05.
  • the present invention may include the following circular dichroism fluorescent microscope.
  • a light source, circularly polarized light modulation means that converts the light beam emitted from the light source into left and right circularly polarized light, and left and right circularly polarized light that passes through the circularly polarized light modulation means are condensed and applied to the sample.
  • a circular dichroism fluorescence microscope comprising: signal processing means for calculating a difference in intensity between fluorescence emitted from a sample force when irradiated and fluorescence emitted from a sample force when irradiated with left circularly polarized light.
  • the polarization control means for controlling the circularly polarized light modulating means to alternately change the light beam emitted from the light source into left and right circularly polarized light at a predetermined modulation frequency, and the signal processing means.
  • the AC component is extracted in synchronization with the modulation frequency, and the fluorescence emitted from the sample when irradiated with the right circularly polarized light and when irradiated with the left circularly polarized light
  • the circular dichroism fluorescence microscope according to (a) comprising: a detection control means for controlling to calculate a difference in intensity from the fluorescence of the sample force emitted.
  • a light source for condensing and irradiating a light beam emitted from the light source, a second optical lens for condensing fluorescence emitted from the sample, and the first Circularly polarized light modulation means for converting the fluorescence transmitted through the optical lens 2 into left and right circularly polarized light, and a polarization blocking means for blocking transmission of either the left or right circularly polarized component of the left and right circularly polarized components, Of the circularly polarized light components that have passed through the polarization blocking means, a wavelength selection means that allows only light of a predetermined wavelength to pass through, a fluorescence measurement means that detects fluorescence that has passed through the wavelength selection means and generates a fluorescence intensity signal, and the fluorescence measurement And a signal processing means for calculating a difference in intensity between the right circularly polarized component and the left circularly polarized component of the fluorescence emitted from the sample based on
  • polarization control means for controlling the circularly polarized light that has passed through the second optical lens so that the circularly polarized light modulating means alternately turns left and right circularly polarized light at a predetermined modulation frequency, and the signal.
  • the signal processing means extracts an AC component from the fluorescence intensity signal generated by the fluorescence measurement means in synchronization with the modulation frequency, and a right circular polarization component and a left circular polarization component of the fluorescence emitted from the sample,
  • the circular dichroism fluorescent microscope according to (f) comprising: a detection control unit that controls to calculate a difference in intensity between
  • a confocal means is provided between the circularly polarized light modulating means and the polarization blocking means, or between the polarization blocking means and the wavelength selecting means, (f) to (i) The circular dichroism fluorescent microscope described in any one of the above.
  • the image processing means (a) to (j) further includes image processing means for forming an image on the basis of the difference information of the fluorescence intensity calculated by the signal processing means.
  • image processing means for forming an image on the basis of the difference information of the fluorescence intensity calculated by the signal processing means.
  • each block of the circular dichroic fluorescence microscope in particular, the signal processing unit, the polarization control unit, the detection control unit, and the stage control unit (hereinafter simply referred to as a signal processing unit) is implemented by hardware logic. It can be configured, or realized by software using a CPU as follows.
  • the circular dichroism fluorescence microscope has a central processing unit (CPU) that executes instructions of a control program that realizes each function, a read only memory (ROM) that stores the above program, and the above program.
  • RAM random access memory
  • a memory device such as a memory for storing the above program and various data, and the like.
  • the object of the present invention is to record the program code (execution format program, intermediate code program, source program) of the control program of the circular dichroism fluorescence microscope, which is software that realizes the functions described above, so that it can be read by a computer. This can also be achieved by supplying the recorded recording medium to the circular dichroic fluorescent microscope and reading and executing the program code recorded on the recording medium by the computer (or CPU or MPU).
  • the recording medium includes, for example, a tape system such as a magnetic tape and a cassette tape, a magnetic disk such as a floppy disk Z hard disk, and an optical disk such as CD-ROMZMOZ MD / DVD / CD-R.
  • Disk systems IC cards (including memory cards) Z optical cards and other card systems, or mask ROMZEPROMZEEPROMZ flash ROM and other semiconductor memory systems can be used.
  • the circular dichroic fluorescence microscope may be configured to be connectable to a communication network, and the above-mentioned program code may be supplied via the communication network.
  • this communication network There is no particular limitation, and the Internet, intranet, extranet, LAN, ISD N, VAN, CATV communication network, virtual private network, telephone line network, mobile communication network, satellite communication network, etc. can be used. It is.
  • the transmission medium constituting the communication network is not particularly limited, for example, IEEE1394, USB, power line carrier, cable TV line, telephone line, ADSL line, etc. Bluetooth (registered trademark), 802.11 radio, HDR, mobile phone network, satellite line, terrestrial digital network, etc. can also be used.
  • the present invention can also be realized in the form of a computer data signal embedded in a carrier wave, in which the program code is embodied by electronic transmission.
  • the circular dichroism fluorescence microscope of the present invention it is possible to analyze a circularly polarized dichroism spectrum (FDCD) or a circularly polarized dichroism spectrum (CPL) from a small amount of sample! Play the fruit. Therefore, information on the chirality of the sample can be analyzed with high accuracy without requiring a large amount of sample. For this reason, according to this circular dichroism fluorescence microscope, for example, biological information such as proteins and nucleic acids existing inside cells can be directly analyzed for chirality information, higher order structures, three-dimensional structures, etc. inside the cells.
  • FDCD circularly polarized dichroism spectrum
  • CPL circularly polarized dichroism spectrum
  • the circular dichroism fluorescence microscope according to the present invention can analyze the chirality and higher-order structure information of biomolecules, etc., so that it can be diagnosed only in an academic field such as medicine and physiology. It can be used in various industries such as pharmaceutical business and food business.

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Abstract

　共焦点部（１１５）を有し、光源（１０３）からの光束を円偏光変調部（１０５）により左右の円偏光とし、その左右の円偏光を、試料に対して集光照射し、試料から放射される蛍光を光学レンズ（１０２）により集光し、波長選択部（１０７）により所定波長の蛍光のみを透過させ、透過した蛍光を検出し、その蛍光強度信号に基づき、右円偏光を照射した際に試料から放射される蛍光と、左円偏光を照射した際に試料から放射される蛍光との強度の差分を算出する円二色性蛍光顕微鏡（１００）によれば、少量の試料から、生体内においてタンパク質等の生体分子等の試料についての高次構造を直接解析できる。

Description

明 細 書
円二色性蛍光顕微鏡
技術分野
[0001] 本発明は、円二色性を観察するための円二色性蛍光顕微鏡に関するものであり、 特に、円偏光励起二色性スペクトルまたは円偏光蛍光二色性スペクトルを観察する ための円二色性蛍光顕微鏡に関するものである。
背景技術
[0002] 薬物や毒物、あるいは生体内に存在する機能性生体成分などの生理活性物質の 多くはいわゆるキラリティを有する。そして、これら生理活性物質の生理活性は、キラ リティ、すなわち物質の高次構造 (立体構造や立体配置など）に強く依存することが 広く知られている。このため、生理活性物質の研究においては、その物質のキラリテ ィの把握がきわめて重要なことである。なかでも、近年、タンパク質や核酸等の生体 分子のキラリティや高次構造にっ 、て特に注目が集まって 、る。
[0003] これら生体分子は、生体内においてダイナミックに構造が変化していると考えられて いる。例えば、エイズを引き起こす HIVは、宿主のタンパク質を挟んで切断するプロ テアーゼによりエイズ感染を引き起こすことが知られている力 このプロテア一ゼはタ ンパク質を切断する際に大きな立体構造の変化を起すと考えられている。また、狂牛 病（BSE)の発症は、プリオンタンパク質の高次構造が大きく変化することにより引き 起こされるといわれている。
[0004] このようにタンパク質等の生体分子の高次構造を解析することは疾患の治療や診 断に有効であるなどの理由から、生体分子の高次構造を解析する技術が開発されて いる。代表的な技術として、円二色性スペクトル解析 (CD)、円偏光励起二色性スぺ タトル解析 (FDCD)、円偏光蛍光二色性スペクトル解析 (CPL)等が知られて ヽる。
[0005] 例えば、特許文献 1には、 FDCDに関する技術が開示されている。具体的には、キ ラリティを有する物質に蛍光性官能基を導入し、それを左右の円偏光で励起してそ れぞれの蛍光強度を測定し、左円偏光励起と右円偏光励起の蛍光強度差情報より 該物質のキラリティを解析するキラリティ解析方法が記載されている。 [0006] また、特許文献 2には、波長走査が行われる単色化された左右の円偏光を所定の 変調周波数で交互に試料に照射して得られる蛍光の強度を測定し電気信号とする 円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、前記電気信号のうち、左右の円偏 光に切り換える周波数に同期した交流信号成分のみを単独に用いて、円二色性蛍 光励起スペクトルを得ることにより、検出感度の向上を図ることができることが記載され ている。
[0007] また、特許文献 3には、レーザ走査型顕微鏡を用いて試料の CPLあるいは FDCD を測定する方法及び装置について記載されている。例えば、図 4〖こは CPLを測定す る装置、また図 9には FDCDを測定する装置の模式図が記載されている。
〔特許文献 1〕
特開平 11― 2606号公報 (公開日：平成 11 (1999)年 1月 6日）
〔特許文献 2〕
特開平 11— 23466号公報 (公開日：平成 11年（1999) 1月 29日）
〔特許文献 3〕
US 2003/0058442 A1 (公開曰： 2003年 5月 27曰）
ところで、タンパク質等の生体分子のキラリティは、その分子のおかれる環境に大き く依存すると考えられる。例えば、タンパク質や核酸等は、他のタンパク質や細胞膜 等と相互作用し、その立体構造を変化させていると予想される。しかし、このような現 象の解析は、試験管内の均一な実験系では解析できない。このため、生体分子の高 次構造解析を行う場合、生体内（例えば、細胞内等）において生体分子の高次構造 を直接解析することが非常に重要なことであると本発明者は考えた。
[0008] しかしながら、上述した CD, FDCD, CPLのような技術は、いずれも均一溶液中に 存在する物質のキラリティ解析を目的としたものである。このため、生体内のような様 々な物質が存在し、不均一な環境に存在する物質のキラリティ解析には不向きであ る。
[0009] また、上述した特許文献 1, 2に開示の技術は、いわゆる顕微鏡解析の技術ではな ぐ分析するための試料も大量に必要となる。しかし、生体分子は一般に極微量しか 調製できず、試料の大量取得には時間とコストがかかってしまうという問題もある。 [0010] また、上記特許文献 3に記載の技術では、実用レベルでの測定を行うことができな い可能性が高い。特に、上記特許文献 3に開示の技術では、円偏光成分力 、さい試 料は、解析できない。
[0011] また、上記特許文献 3では、円偏光蛍光二色性スぺ外ル解析 (CPL)を行う場合、 励起光を透過し、蛍光光を反射させる手段として、半透過ミラーを用いている。半透 過ミラーは波長選択性がないだけでなぐ半透過であるために、入射する励起光に っ 、て光強度のロスが発生し、さらに反射させる蛍光光にっ ヽても強度ロスが発生す ることとなる。このようなロスにより、測定精度が大幅に劣るという問題がある。カロえて、 半透過ミラーが光路に対して厳密に 45度の角度で配置されていないと、ひずみが発 生し、測定精度、安定性が大幅に劣るという問題もある。
[0012] また、上記特許文献 3では、図 4に示されるように、アイリスが検出部の直近にある 構成となっている。このような構成では、試料から出る蛍光光が偏光変調部内で多重 反射し、偏光成分の検出に誤差が生じるという問題もある。
[0013] それゆえ、解析に大量の試料が必要でなぐかつ生体内においてタンパク質等の 生体分子の高次構造を直接かつ高精度で解析できる技術の開発が求められていた 。このような技術の研究開発は従来まったく行われておらず、新規領域の開拓に資 する上記技術の開発が強く望まれている。
[0014] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、解析に大量の 試料が必要でなぐかつ、例えば、生体内においてタンパク質等の生体分子等の試 料についての高次構造を直接かつ高精度で解析できるような円二色性蛍光顕微鏡 を提供することにある。
発明の開示
[0015] 本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、レーザ走査蛍光顕微 鏡の検出'励起光学系およびデータ処理系に加えて、さらに円偏光励起二色性スぺ タトル解析 (FDCD)、円偏光蛍光二色性スペクトル解析 (CPL)を検出する光学系を 備える装置を開発することにより、極少量の試料を用いて、かつ、生体内においてタ ンパク質等の生体分子等の試料にっ 、ての高次構造を直接解析できると 、う新事実 を見出し、本願発明を完成させるに至った。本発明は、力かる新規知見に基づいて 完成されたものであり、以下の発明を包含する。
[0016] (1)光源と、上記光源から出射する光束を左右の円偏光とする円偏光変調手段と、 上記円偏光変調手段を透過する左右の円偏光を、試料に対して集光照射するため の第 1の光学レンズと、上記試料から放射される蛍光を集光するための第 2の光学レ ンズと、上記第 2の光学レンズにて集光される蛍光のうち、所定波長の蛍光のみを通 過させる波長選択手段と、上記波長選択手段を透過する蛍光を検出し蛍光強度信 号とする蛍光測定手段と、上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号に基づき、 右円偏光を照射した際に試料力 放射される蛍光と、左円偏光を照射した際に試料 力も放射される蛍光との強度の差分を算出する信号処理手段と、を備え、さらに、上 記第 2の光学レンズと上記波長選択手段との間に、微小開口部を有する共焦点手段 を備える円二色性蛍光顕微鏡。
[0017] (2)さらに、上記円偏光変調手段が上記光源力 出射した光束を所定の変調周波 数で交互に左右の円偏光とするように制御する偏光制御手段と、上記信号処理手段 力 上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号のうち、上記変調周波数に同期 して交流成分を取り出して、右円偏光を照射した際に試料から放射される蛍光と、左 円偏光を照射した際に試料力 放射される蛍光との強度の差分を算出するように制 御する検出制御手段と、を備える（1)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0018] (3)さらに、上記第 2の光学レンズと上記波長選択手段との間に、第 3の光学レンズ を備える（1)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0019] (4)上記第 1の光学レンズと上記第 2の光学レンズとは、同一の光学レンズである（1 )に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0020] (5)上記微小開口部の直径は、 10 m以上 100 m以下である（1)に記載の円二 色性蛍光顕微鏡。
[0021] (6)光源と、上記光源力 出射する光束を集光照射するための第 1の光学レンズと 、試料カゝら放射される蛍光を集光するための第 2の光学レンズと、上記光源からの励 起光は反射する一方、試料からの蛍光は透過する波長選択ミラーと、上記第 2の光 学レンズを透過した蛍光の左右の円偏光成分を、変調された直線偏光成分に変更 する円偏光変調手段と、上記直線偏光成分のうち、縦横いずれかの直線偏光成分 の透過を遮断する偏光遮断手段と、上記偏光遮断手段を透過した円偏光成分のう ち、所定波長の光のみを通過させる波長選択手段と、上記波長選択手段を透過した 蛍光を検出し蛍光強度信号とする蛍光測定手段と、上記蛍光測定手段にて生成し た蛍光強度信号に基づき、試料から放射される蛍光の右円偏光成分と左円偏光成 分との強度の差分を算出する信号処理手段と、を備え、さらに、上記波長選択ミラー と上記蛍光測定手段との間に、微小開口部を有する共焦点手段を備える円二色性 蛍光顕微鏡。
[0022] (7)上記共焦点手段は、上記波長選択ミラーと上記円偏光変調手段との間に設け られて 、る (6)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0023] (8)上記共焦点手段は、円偏光変調手段へ到達する蛍光を整える機能を有するも のである（6)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0024] (9)さらに、上記円偏光変調手段が上記第 2の光学レンズを透過した蛍光を、所定 の変調周波数で交互に左右の円偏光とするように制御する偏光制御手段と、上記信 号処理手段が、上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号のうち、上記変調周 波数に同期して交流成分を取り出して、試料から放射される蛍光の右円偏光成分と 左円偏光成分との強度の差分を算出するように制御する検出制御手段と、を備える（
6)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0025] (10)さらに、上記偏光遮断手段と上記波長選択手段との間に、第 3の光学レンズ を備える（6)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0026] (11)上記第 1の光学レンズと上記第 2の光学レンズとは、同一の光学レンズである（
6)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0027] (12)上記微小開口部の直径は、 10 m以上 100 m以下である（6)に記載の円 二色性蛍光顕微鏡。
[0028] (13)さらに、上記信号処理手段によって算出された蛍光強度の差情報に基づき、 上記試料についての画像を形成する画像処理手段を備える（1)に記載の円二色性 蛍光顕微鏡。
[0029] (14)さらに、上記信号処理手段によって算出された蛍光強度の差情報に基づき、 上記試料についての画像を形成する画像処理手段を備える（6)に記載の円二色性 蛍光顕微鏡。
[0030] (15)上記波長選択手段の所定波長を外部信号により制御するとともに、円偏光変 調手段の変調光波長を制御する円偏光蛍光検出波長制御手段を備える（1)または ( 6)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0031] なお、上記円二色性蛍光顕微鏡は、コンピュータによって実現してもよぐこの場合 には、コンピュータを上記各手段として動作させることにより上記円二色性蛍光顕微 鏡をコンピュータにて実現させる円二色性蛍光顕微鏡の制御プログラム、およびそれ を記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体も、本発明の範疇に入る。
[0032] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白にな るであろう。
図面の簡単な説明
[0033] [図 1]本発明の参考の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡であって、円偏光励起二色 性スペクトルを 2次元解析する装置の構成を模式的に示す図である。
[図 2]本発明の実施形態に係る円二色性蛍光顕微鏡であって、円偏光励起二色性ス ベクトルを 3次元解析する装置の構成を模式的に示す図である。
[図 3]本発明の参考の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡であって、円偏光蛍光二色 性スペクトルを 2次元解析する装置の構成を模式的に示す図である。
[図 4]本発明の実施形態に係る円二色性蛍光顕微鏡であって、円偏光蛍光二色性ス ベクトルを 3次元解析する装置の構成を模式的に示す図である。
[図 5]本発明の実施形態に係る円二色性蛍光顕微鏡であって、円偏光蛍光二色性ス ベクトルを 3次元解析する装置の他の構成を模式的に示す図である。
符号の説明
[0034] 100 円二色性蛍光顕微鏡
100' 円二色性蛍光顕微鏡
102 光学レンズ（第 1の光学レンズ，第 2の光学レンズ）
103 光源
104 波長選択ミラー 105 円偏光変調部（円偏光変調手段)
106 光学レンズ (第 3の光学レンズ）
107 波長選択部 (波長選択手段）
108 蛍光測定部 (蛍光測定手段）
109 偏光制御部 (偏光制御手段）
109， 偏光制御部 (偏光制御手段）
110 検出制御部 (検出制御手段）
114 信号処理部 (信号処理手段）
114， 信号処理部 (信号処理手段）
115 共焦点部 (共焦点手段）
115， 共焦点部 (共焦点手段）
200 円二色性蛍光顕微鏡
200， 円二色性蛍光顕微鏡
205 円偏光変調部（円偏光変調手段)
206 偏光遮断部 (偏光遮断手段）
210 検出制御部 (検出制御手段）
214 信号処理部 (信号処理手段）
214， 信号処理部 (信号処理手段）
300 円二色性蛍光顕微鏡
発明を実施するための最良の形態
[0035] まず、本発明の概要について説明する。
[0036] 上述したように、タンパク質や核酸等の生体分子は、キラリティを有し、右円偏光と 左円偏光に対する吸収の度合 、が異なる円二色性と 、う性質を示す。円二色性は 分子のキラリティに依存して大きく変化する。また、分子に対する計測方向にも依存 する。さらに、分子のキラリティは、分子のおかれる環境に大きく依存することが予想 されるため、固体表面や細胞膜あるいはタンパク質や DNA等の核酸との相互作用 に対して敏感に変化することが期待される。しかし、これまで、生体内部における分子 のキラリティ解析についての検討は全く行われておらず、新規領域の開拓を考えた 場合、例えば、生体内において生体分子のキラリティを直接解析できる装置の開発 が潜在的に求められて ヽたと!/、える。
[0037] 本発明は上述したような種々の物質について、円二色性を通じてキラリティに関す る情報を解析し、 2次元または 3次元でのマッピングを可能とする顕微鏡に関する技 術である。本発明において対象とする円二色性は、大きく 2種類に大別できる。具体 的には、円偏光励起二色性と円偏光蛍光二色性である。前者は励起光が +、一の それぞれの円偏光であった場合における蛍光発光の強度の差を計測、マッピングす ることにより解析できる。また、後者は直線偏光励起下での蛍光発光における +およ び—の円偏光成分の差を検出しマッピングすることにより解析できる。
[0038] 円偏光励起二色性を解析する場合について、より具体的に述べると、例えば、（1) 励起光を円偏光として +あるいは一の円偏光を照射したときの吸収係数に差があれ ば蛍光強度の差を与える。（2)励起光を円偏光とするためには Xおよび Y方向の偏 光成分に士 λ Ζ4の位相差を与える。 (3)円偏光励起二色性の計測のためには、こ の位相差を士 λ Ζ4を振幅とする正弦波により変調させ、蛍光強度の同期成分をロッ クインアンプにより検出する。という流れで行うことができる。
[0039] また、円偏光蛍光二色性を解析する場合は、例えば、（1)直線偏光により励起させ たときの蛍光発光のうち、円偏光成分を検出する。（2)蛍光光に士 λ Ζ4の位相差を 与えたときに、士それぞれの円偏光成分は Xおよび Υ方向の直線偏光成分に変換さ れるので、その強度を、偏光子を通して計測すると、円偏光成分は位相差に応じて 変化する。（3)計測には位相差を周期的に変調させ、その同期信号をロックインアン プにより検出する。という流れで行うことができる。
[0040] 蛍光色素を細胞内に導入して、細胞、タンパク質、核酸に取り込ませ、生きた細胞 中で蛍光分子と生体分子とが相互作用し、キラリティが変化する様子を、分子の局在 部位を特定しながら計測 ·解析することは、これまでの技術では不可能であった。しか し、本発明に係る円二色性蛍光顕微鏡によれば、上記解析が可能となる。特に、本 発明に係る円二色性蛍光顕微鏡を用いて、特定の細胞器官や特定の刺激に応答し て蛍光分子が細胞内の特定の場所に取り込まれる現象を、分子のキラリティをもとに 検出することができる。それゆえ、本発明は、医学 ·生理学等の学術分野だけでなぐ 診断'医療機器、分析機器、製薬事業や食品事業等の様々な産業においても大きな インパクトを与えることができる、非常に優れた発明であるといえる。
[0041] 以下、上述した技術思想を具現化した本発明に関連する参考の形態及び本発明 の実施の形態について、図面に基づき、例を挙げて詳細に説明する。
[0042] 〔参考の形態 1〕
図 1は、本参考の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡 100の構造を模式的に示すもの である。
[0043] 円二色性蛍光顕微鏡 100は、試料にっ ヽての円偏光励起二色性スペクトル (FDC D)を 2次元で解析するための蛍光顕微鏡装置である。具体的には、円二色性蛍光 顕微鏡 100は、試料ステージ 101,光学レンズ 102,光源 103,波長選択ミラー 104 ,円偏光変調部 105,光学レンズ 106,波長選択部 107,蛍光測定部 108,偏光制 御部 109,検出制御部 110,ステージ制御部 111,信号処理部 114を備えている。
[0044] 試料ステージ 101は、ステージ制御部 111からの XY制御信号により、 XY方向に 2 次元移動が可能に構成されている駆動ステージである。また、試料が入ったセルを 保持するセルホルダーが設けられて 、てもよ 、。
[0045] 光学レンズ 102は、いわゆる対物レンズとして機能するものである。すなわち、光学 レンズ 102は、円偏光変調部を透過し波長選択ミラー 104により反射した光を、試料 に対して集光照射するための第 1の光学レンズとして機能するものである。また、光学 レンズ 102は、試料カゝら放射される蛍光を集光するための第 2の光学レンズとしても 機能する。つまり、本参考の形態では、光学レンズ 102は、第 1の光学レンズおよび 第 2の光学レンズとして機能するものであると 、える。
[0046] 力かる光学レンズとしては、従来公知の対物レンズを用いることができ、具体的な構 成は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光顕微鏡用の 40倍対物レンズ等を 用いることができる。なお、本参考の形態では、光学レンズ 102が、第 1の光学レンズ および第 2の光学レンズとして機能する構成を例に挙げて説明するが、この構成に限 られるものではなぐ第 1の光学レンズおよび第 2の光学レンズがそれぞれ別々に設 けられて！/、る構成であってもよ!/、。
[0047] 光源 103についても、試料に光束 (直線偏光）を照射することができるものであれば よぐ従来公知の光源を用いることができ、その強度や波長等については適宜設定 可能である。例えば、レーザ光源 (405nm, 5mW)を用いることができる。
[0048] 波長選択ミラー 104は、光源 103からの励起光は反射する一方、試料からの蛍光 は透過するものである。つまり、光源 103を出射し、円偏光変調部 105を透過した励 起光を反射する一方、試料から放射される蛍光を透過する構成であればよぐ例え ば、ダイクロイツクミラーを用いることができる。より具体的には、例えば、 DCM490等 を用いることができる。
[0049] 円偏光変調部 105は、光源 103から出射する光束を左右の円偏光とする円偏光変 調手段として機能するものである。より具体的には、円偏光変調部 105は、偏光制御 部 109の制御信号に基づいて、光源 103から出射する光束 (直線偏光）を所定の変 調周波数で交互に左右の円偏光とするものである。円偏光変調部 105は、かかる機 能を有するものであれば、具体的な構成は特に限定されるものではなぐ従来公知の 円偏光変調手段を用いることができる。例えば、 HIDNS社製の PM-IZFS50等の PEMモジユレータを用いることができる。
[0050] 光学レンズ 106は、波長選択ミラー 104を透過した光を、波長選択部 107へ集光す るためのものである。光学レンズ 106は、波長選択ミラー 104と波長選択部 107との 間に備えられる第 3の光学レンズとして機能するものである。第 3の光学レンズを設け ることにより、顕微鏡の高感度化を図ることができる。
[0051] 波長選択部 107は、光学レンズ 102にて集光され、波長選択ミラー 104を透過した 蛍光のうち、所定波長の蛍光のみを通過させる波長選択手段として機能するもので ある。この波長選択部 107の具体的な構成についても特に限定されるものではなぐ 従来公知のバンドパスフィルターまたはモノクロメーター、ある!/、はその組み合わせ 等を好適に用いることができる。
[0052] 蛍光測定部 108は、波長選択部 107を透過した蛍光を検出し蛍光強度信号とする 蛍光測定手段として機能するものである。かかる機能を有するものであれば、従来公 知の光検出器を好適に用いることができる。例えば、浜松ホトニタス社製の光検出モ ジュール H7732— 10等を用いることができる。
[0053] 偏光制御部 109は、円偏光変調部 105が光源 103から出射する光束 (直線偏光） を所定の変調周波数で交互に左右の円偏光とするように制御する偏光制御手段とし て機能するものである。力かる機能を有するものであれば、従来公知の制御部材を 好適に用いることができる。例えば、 PEMモジュレーターコントローラ等を用いること ができる。
[0054] 検出制御部 110は、信号処理部 114が蛍光測定部 108にて生成した蛍光強度信 号 (電気信号)のうち、上記変調周波数に同期して交流成分を取り出して、右円偏光 を照射した際に試料力 放射される蛍光と、左円偏光を照射した際に試料力 放射 される蛍光との強度の差分を算出するように制御する検出制御手段として機能するも のである。
[0055] また、検出制御部 110は、蛍光測定部 108からは光量信号を受け、偏光制御部 10 9に対して参照信号を出力する。いわゆるロックインアンプとして機能するものである とも換言できる。かかる制御部としては、従来公知の制御部材を好適に用いることが でき、例えば、公知のロックインアンプを用いることができる。
[0056] ステージ制御部 111は、信号処理部 114からの XY制御信号に基づき、試料ステー ジ 101の XY方向の移動を制御するものである。かかる制御部としては、従来公知の 制御部材を好適に用いることができ、その具体的な構成等は特に限定されるもので はない。
[0057] 信号処理部 114は、蛍光測定部 108にて生成した蛍光強度信号 (電気信号）に基 づき、右円偏光を照射した際に試料から放射される蛍光と、左円偏光を照射した際 に試料から放射される蛍光との強度の差分を算出する信号処理手段として機能する ものである。換言すれば、試料についての円偏光励起二色性スペクトルを算出するも のといえる。
[0058] ここで、円偏光励起二色性スペクトルとは、試料に単色化した左と右の円偏光を交 互に照射して励起したときの蛍光強度を測定し、左の円偏光で励起したときと、右の 円偏光で励起したときの蛍光強度の差を波長に対して記録するものである。
[0059] また、信号処理部 114は、波長選択部 107の所定波長を外部信号により制御する とともに、円偏光変調部 105の変調光波長を制御する円偏光蛍光検出波長制御手 段として機能する構成であってもよ!/ヽ。 [0060] 本参考の形態では、信号処理部 114は、偏光制御部 109,検出制御部 110及びス テージ制御部 111といった各種制御手段を制御する部材でもある。具体的には、信 号処理部 114は、各種制御手段と連結されたインターフェース 112及び解析用 PC 1 13とを備えている。
[0061] 解析用 PC113は、インターフェース 112を介して、偏光制御部 109,検出制御部 1 10及びステージ制御部 111と ヽつた各種制御手段を制御するように構成されて!ヽる 。具体的には、解析用 PC113は、インターフェース 112を介して、偏光制御部 109に 対して波長制御信号を、ステージ制御部 111に対しては XY制御信号を付与する。 力かるインターフェース 112としては、例えば、 GP— IBインターフェース等を用いるこ とがでさる。
[0062] 解析用 PC113は、さらに、算出された蛍光強度の差情報に基づき、上記試料につ V、ての画像を形成する画像処理手段として機能するように構成されて 、てもよ 、。こ れは、試料についてのキラリティ情報をイメージングし、マッピングする手段である。か 力るイメージング 'マッピングの機構については、従来公知の手段や機構、ソフトゥェ ァを用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、レーザ走査型蛍光顕 微鏡等のデータを用いてイメージング 'マッピングするソフトウェア等を好適に用いる ことができる。このように、信号処理部 114は、少なくとも上述した機能を備えていれ ばよぐその具体的な構成等は特に限定されず、特に記述した点以外については、 公知の演算装置 (ノヽ一ドウエア）やソフトウェアを好適に用いることができる。
[0063] イメージマッピングの機構にっ 、て、信号処理の具体例を説明する。なお、以下の 説明は、蛍光光の強度の差分を取った後の処理である。また、検出制御部（ロックィ ンアンプ)から信号制御部へ交流成分だけでなく直流成分も送ることができる。
[0064] より具体的には、信号には交流成分と直流成分とが含まれる。交流成分はキラリテ ィと分子数に比例し、直流成分は分子数 (濃度）に比例する。このことから、下記数式 に示す g値 (キラリティ異方性パラメータ）をマッピングすることでより精密なデータの解 祈が可能となる。
[0065] g=I — I / (1/2 (1 I ) ) = 2交流成分 Z直流成分
十 一 十 一
次に、円二色性蛍光顕微鏡 100が、試料についての円偏光励起二色性スペクトル を解析する際の動作について説明する。
[0066] まず、光源 103から直線偏光のレーザ光を円偏光変調部 105に照射する。直線偏 光のレーザ光は、円偏光変調部 105により、左右の円偏光の励起光となる。次いで、 この円偏光の励起光は、波長選択ミラー 104を介して光学レンズ 102に入射し、試料 ステージ 101上の試料に集光照射される。本試料は試料ステージ 101に固定されて おり、試料の位置はステージ制御部 111を介して信号処理部 114 (具体的には、解 析用 PC113)により制御される。
[0067] 円偏光変調部 105は、検出制御部 110からの参照信号によって定義される振動数
ωで、なおかつ振幅が士 λ Ζ4の位相差を励起光に与えるように構成されている（偏 光制御部 109を介して)。ここでえは励起光（円偏光のレーザ光）の波長であり、信号 処理部 114の解析用 PC113からインターフェース 112を介して波長制御信号として 偏光制御部 109を介して与えられる。これにより、円偏光変調部 105が光源 103から 出射した光束 (直線偏光)を所定の変調周波数で交互に左右の円偏光へと変調する ことになる。
[0068] 次いで、上記円偏光の励起光の試料への集光照射により、試料から蛍光が放射さ れる。試料から発せられる蛍光は、光学レンズ 102により集光され平行光として波長 選択ミラー 104を透過し、光学レンズ 106、波長選択部 107を経て、蛍光測定部 108 にて蛍光強度信号 (電気信号）に変換される。そして、光量信号として検出制御部 11 0へ出力される。
[0069] このとき、例えば、試料の励起光に対する吸光度が右の円偏光 (便宜上、 "+ "の円 偏光とする）に対して大きぐ左の円偏光 (便宜上、 " "の円偏光とする）に対して小 さい場合には、円偏光変調部 105が + λ Ζ4の位相差を与える場合に強い蛍光信 号が検出されることになり、また λ Ζ4の位相差を与える場合に弱い蛍光信号が検 出されることになる。このため、検出制御部 110において、蛍光測定部 108からの電 気信号 (光量信号)は振動数 ωで変調される。この変調された信号成分はインターフ エース 112を介して解析用 PC113にデータを転送される。
[0070] そして、解析用 PC113は、右円偏光を照射した際に試料から放射される蛍光と、左 円偏光を照射した際に試料力 放射される蛍光との強度の差分を算出し、試料につ いての円偏光励起二色性スペクトルを解析する。また、解析用 PC113は、試料ステ ージ 101の位置情報に応じた円偏光励起二色性スペクトルをイメージィ匕しマッピング する。
[0071] また、円二色性蛍光顕微鏡 100の解析対象となる試料は、ユーザがキラリティや高 次構造、立体構造等の解析を所望する試料であれば特に限定されるものではなぐ 様々な試料を対象とすることができる。なかでも、生体内におけるタンパク質や核酸と V、つた生体分子の高次構造やキラリティ情報の解析に用いることが好ま 、。
[0072] なお、解析対象となる試料は、蛍光性物質が導入されており、励起光を吸収し、蛍 光を発するように調製されていることが好ましい。例えば、力かる蛍光性物質としては 、蛍光性官能基を挙げることができる。例えば、化学的手段を用いて蛍光性官能基 を導入して試料を蛍光物質化する手法を例示することができる。蛍光性官能基として は、特に限定されるものではないが、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環、ペリレ ン環、コロネン環、ポルフィリン環等を含む基は蛍光強度が強ぐかつそれ自身の対 称性が高ぐ電子状態や吸収 ·蛍光の遷移モーメントの方向などが十分に研究され ていて、後の解析に好都合である。なお、これらに限定されず、本発明の目的に応じ て、様々な物質 ·手法を用いて試料を蛍光物質ィ匕することができることを念のため付 言しておく。
[0073] 上述した円二色性蛍光顕微鏡 100によれば、まず、試料の絶対量が少なくても円 偏光励起二色性スペクトルを解析可能である。これにより、多くの試料を必要としない というメリットがある。また、円二色性蛍光顕微鏡によれば、例えば、細胞内部に存在 するタンパク質や核酸といった生体分子について、当該細胞内部におけるキラリティ 情報や高次構造、立体構造等を直接 (例えば、細胞を生かしたまま)解析することが できる。
[0074] さらに、血液や体液（唾液含)等の光散乱性の試料でも解析可能である。単なるス ベクトル解析装置では光が散乱する試料の測定は困難であるため、この本発明の作 用効果は非常に有利な効果である。通常、血液や唾液などの体液は光散乱性であ る（濁っている）ため、スぺクトロメータで解析する場合は前処理が必要となる。しかし 、本参考の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡では、光散乱性の試料であっても直接 解析可能であり、前処理は必要な 、と 、う特有の効果がある。
[0075] 〔実施の形態 1〕
上記参考の形態 1では、円偏光励起二色性スペクトルを 2次元解析するための円 二色性蛍光顕微鏡の一実施形態について説明したが、本実施形態では、共焦点化 し、 3次元で円偏光励起二色性スペクトルの解析が可能な円二色性蛍光顕微鏡の一 実施形態について説明する。なお、説明の便宜上、上記参考の形態 1にて説明した 部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。 本実施の形態では、上記参考の形態 1との相違点について説明するものとする。
[0076] 図 2は、本実施の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡 100'の構造を模式的に示すも のである。
[0077] 円二色性蛍光顕微鏡 100'は、試料についての円偏光励起二色性スペクトルを 3 次元解析するための蛍光顕微鏡であり、共焦点顕微鏡の機構を利用している点が参 考の形態 1と最も異なる特徴点である。具体的には、円二色性蛍光顕微鏡 100は、 試料ステージ 101 ' ,光学レンズ 102,光源 103,波長選択ミラー 104,円偏光変調 部 105,光学レンズ 106,波長選択部 107,蛍光測定部 108,偏光制御部 109,検 出制御部 110,ステージ制御部 111 ' ,信号処理部 114' ,共焦点部 115を備えてい る。
[0078] 試料ステージ 101 'は、参考の形態 1の試料ステージの機能に加えて、 Z軸方向へ の移動が可能な 3次元駆動ステージである。また、それにあわせて、ステージ制御部 111 'も XYZ制御信号を出力し、試料ステージ 101 'の移動を制御するように構成さ れている。なお、試料ステージ 101 'の替わりに、光学レンズ 102が Z軸方向（試料ス テージ 101 'と光学レンズ 102とが近づいたり、離れたりする方向）に移動可能に構成 されて 、てもよ 、。その場合の制御系その他の構成にっ 、ては従来公知の手法'シ ステム等を好適に用いることができる。
[0079] 信号処理部 114'は、インターフェース 112と 3次元解析用の解析用 PC113'を備 えている。解析用 PC113'は、共焦点顕微鏡データから 3次元の円偏光励起二色性 スペクトル解析を行うものである。 3次元データを処理する手法や機構につ 、ては、 従来公知の 3次元データを解析するためのソフトウェア等を好適に用いることができ、 特に限定されるものではない。なお、円偏光励起二色性スペクトルの解析手法の原 理については、参考の形態 1と同様である。また、解析用 PC113'は、イメージング' マッピング処理が可能に構成されて 、てもよ 、。
[0080] また、信号処理部 114'は、信号処理部 114と同様、波長選択部 107の所定波長を 外部信号により制御するとともに、円偏光変調部 105の変調光波長を制御する円偏 光蛍光検出波長制御手段として機能する構成であってもよい。
[0081] 共焦点部 115は、波長選択ミラー 104と波長選択部 107 (より詳細には、光学レン ズ 106)との間に設けられており、光学レンズ 116,微小開口部を備えるピンホール 板 117,光学レンズ 118を備えている。光学レンズ 116はピンホール板 117の微小開 口部に光を集光させるためのレンズである。光学レンズ 118は微小開口部を透過し た光を集光し、光学レンズ 106へ導くためのレンズである。かかる共焦点部 115は、 微小開口部を備えるピンホール板のみカゝら構成されていてもよいが、より好ましくは 本実施の形態のようにピンホール板と光学系とから構成される共焦点ユニット（共焦 点スキャナ）であることが好ましい。なお、上記共焦点部 115は従来公知の共焦点ュ ニットを用いることができ、その具体的な構成は、本発明の目的に応じて適宜設定可 能である。
[0082] 円二色性蛍光顕微鏡 100'の動作についても、波長選択ミラー 104を透過した蛍 光力 光学レンズ 106に到達する前に、共焦点部 115を透過する点以外は、参考の 形態 1とほぼ同様であるため、詳細な説明は省略する。上記の構成により、試料から 放射された蛍光のうち、微小開口部に焦点を結ぶ光のみが透過し、それ以外の光は 遮断されるため、蛍光検出部 108では試料力もの蛍光について共焦点像を得ること ができる。そして、信号処理部 114'は、この共焦点像データに基づき、円偏光励起 二色性スペクトルの 3次元解析を行う。
[0083] 特に、上記ピンホール板 117の微小開口部の直径は、 10〜： LOO μ mであることが 好ましぐ 30〜50 mであることがより好ましい。上記の範囲であれば、試料からの 蛍光を確実に整えることができ、より高精度の共焦点像を取得することができる。
[0084] 上記の構成によれば、上述した参考の形態 1で述べた効果に加えて、例えば、細 胞内部に存在するタンパク質や核酸といった生体分子について、細胞内部における キラリティ情報や高次構造、立体構造等を 3次元解析することができる。また、ィメー ジング 'マッピングすることも勿論可能である。イメージマッピングの機構における信号 処理の具体例は、上述の参考の形態 1と同様であるため、ここではその説明を省略 する。
[0085] 〔参考の形態 2〕
上記参考の形態 1,実施の形態 1では、それぞれ円偏光励起二色性スペクトルを 2 次元または 3次元で解析するための円二色性蛍光顕微鏡の一実施形態につ!、て説 明したが、本実施形態では、 2次元で円偏光蛍光二色性スペクトル解析 (CPL)の解 祈が可能な円二色性蛍光顕微鏡の一実施形態について説明する。なお、説明の便 宜上、上記参考の形態 1,実施の形態 1にて説明した部材と同じ機能を有する部材 については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。本実施の形態では、上記参 考の形態 1,実施の形態 1との相違点について説明するものとする。
[0086] 図 3は、本参考の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡 200の構造を模式的に示すもの である。円二色性蛍光顕微鏡 200は、試料についての 2次元で円偏光蛍光二色性ス ベクトル解析 (CPL)を解析するための蛍光顕微鏡である。
[0087] 具体的には、円二色性蛍光顕微鏡 200は、試料ステージ 101,光学レンズ 102, 光源 103,波長選択ミラー 104,円偏光変調部 205,偏光遮断部 206,光学レンズ 1 06,波長選択部 107,蛍光測定部 108,偏光制御部 209,検出制御部 210,ステー ジ制御部 111,信号処理部 214を備えている。
[0088] 円偏光変調部 205は、光学レンズ 102を透過した蛍光の左右の円偏光成分を、変 調された直線偏光成分に変更する円偏光変調手段として機能するものである。より 詳細には、円偏光変調部 205は、偏光制御部 209により、光学レンズ 102を透過し た蛍光（円偏光成分)を、所定の変調周波数で処理し、直線偏光成分に変更するよう に制御されるものである。円偏光変調部 205は、力かる機能を有するものであれば、 具体的な構成は特に限定されるものではなぐ従来公知の円偏光変調手段を用いる ことができる。例えば、 HIDNS社製の PM— IZFS50等の PEMモジユレータを用い ることがでさる。
[0089] 偏光遮断部 206は、円偏光変調部 205により変調された直線偏光成分のうち、縦 横いずれかの直線偏光成分の透過を遮断する偏光遮断手段として機能するもので ある。力かる偏光遮断部 206としては、例えば、公知の偏光子を用いることができる。
[0090] 偏光制御部 209は、円偏光変調部 205が光学レンズ 102を透過した蛍光（円偏光 成分)を、所定の変調周波数で処理し、直線偏光成分に変更するように制御する偏 光制御手段として機能するものである。力かる機能を有するものであれば、従来公知 の制御部材を好適に用いることができる。例えば、 PEMモジュレーターコントローラ 等を用いることができる。
[0091] 検出制御部 210は、信号処理部 214が蛍光測定部 108にて生成した蛍光強度信 号 (電気信号)のうち、上記変調周波数に同期して交流成分を取り出して、試料から 放射される蛍光の右円偏光成分と左円偏光成分との強度の差分を算出するように制 御する検出制御手段として機能するものである。また、検出制御部 210は、蛍光測定 部 108からは光量信号を受け、偏光制御部 209に対して参照信号を出力する。いわ ゆるロックインアンプとして機能するものであるとも換言できる。かかる制御部としては 、従来公知の制御部材を好適に用いることができ、例えば、公知のロックインアンプを 用!/、ることができる。
[0092] 信号処理部 214は、蛍光測定部 108にて生成した蛍光強度信号 (電気信号）に基 づき、試料から放射される蛍光の右円偏光成分と左円偏光成分との強度の差分を算 出する信号処理手段として機能するものである。換言すれば、試料についての円偏 光蛍光二色性スペクトルを算出するものといえる。
[0093] ここで、円偏光蛍光二色性スペクトルとは、試料に直線偏光を照射して励起したとき に発生する蛍光について、偏光度を測定し、蛍光の右偏光成分の強度と左偏光成 分の強度の差を波長に対して記録するものである。
[0094] 本参考の形態では、信号処理部 214は、偏光制御部 209,検出制御部 210及びス テージ制御部 111といった各種制御手段を制御する部材でもある。具体的には、信 号処理部 214は、各種制御手段と連結されたインターフェース 112及び解析用 PC2 13とを備えている。
[0095] 解析用 PC213は、インターフェース 112を介して、偏光制御部 209,検出制御部 2 10及びステージ制御部 111と ヽつた各種制御手段を制御するように構成されて!ヽる 。具体的には、解析用 PC213は、インターフェース 112を介して、偏光制御部 209に 対して波長制御信号を、ステージ制御部 111に対しては XY制御信号を付与する。 力かるインターフェース 112としては、例えば、 GP— IBインターフェース等を用いるこ とがでさる。
[0096] また、信号処理部 214は、波長選択部 107の所定波長を外部信号により制御する とともに、波長選択部 107の設定波長に連動して円偏光変調部 205の変調光波長を 制御する円偏光蛍光検出波長制御手段として機能する構成であってもよい。
[0097] 解析用 PC213は、さらに、本信号処理部によって算出された蛍光強度の差情報に 基づき、上記試料につ！ヽての画像を形成する画像処理手段として機能するように構 成されていてもよい。これは、試料についてのキラリティ情報をイメージングし、マツピ ングする手段である。力かるイメージング 'マッピング機構については、従来公知の手 段や機構、ソフトウェアを用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、レ 一ザ走査型蛍光顕微鏡等のデータを用いてイメージング 'マッピングするソフトウェア 等を好適に用いることができる。このように、信号処理部 214は、少なくとも上述した 機能を備えていればよぐその具体的な構成等は特に限定されず、特に記述した点 以外につ 、ては、公知の演算装置 (ノヽ一ドウエア）やソフトウェアを好適に用いること ができる。
[0098] なお、イメージマッピングの機構における信号処理の具体例は、上述の参考の形態
1と同様であるため、ここではその説明を省略する。
[0099] 次に、円二色性蛍光顕微鏡 200が、試料についての円偏光蛍光二色性スペクトル を解析する際の動作について説明する。
[0100] まず、光源 103から直線偏光のレーザ光を出射し、波長選択ミラー 104を介して光 学レンズ計 102に対して照射する。直線偏光のレーザ光は、光学レンズ 102により集 光され、試料ステージ 101上の試料に照射される。本試料は試料ステージ 101に固 定されており、試料の位置はステージ制御部 111を介して信号処理部 214 (具体的 には、解析用 PC213)により制御される。
[0101] 上記直線偏光のレーザ光 (励起光)の試料への集光照射により、試料から蛍光が 放射される。試料カゝら発せられる蛍光は、光学レンズ 102により集光され平行光とし て波長選択ミラー 104を透過し、円偏光変調部 205に入射する。円偏光変調部 205 は、検出制御部 210からの参照信号によって定義される振動数 ωで、かつ振幅が士 λ Ζ4の位相差を蛍光光に与えるように構成されて 、る（偏光制御部 209を介して)。 ここでえは計測波長であり、蛍光発光の極大にあわせて、信号処理部 214の解析用 PC213からインターフェース 112を介して波長制御信号として偏光制御部 209を介 して与免られる。
[0102] 円偏光変調部 205が + λ Ζ4の位相差を蛍光光に与え、右円偏光を直線偏光化 する場合には (この場合の右円偏光成分を便宜上、 "+ "成分とする)、円偏光変調 部 205を透過した蛍光光の円偏光成分のうち左円偏光成分 (便宜上、 " "成分とす る）は偏光遮断部 206によってカットされる。一方、右円偏光成分は偏光遮断部 206 を透過し、光学レンズ 106、波長選択部 107を経て、蛍光測定部 108にて蛍光強度 信号 (電気信号）に変換される。そして、光量信号として検出制御部 210へ出力され る。
[0103] また、円偏光変調部 205がー λ Ζ4の位相差を蛍光光に与え、左円偏光を直線偏 光化する場合には (この場合の左円偏光成分を便宜上、 "+ "成分とする)、円偏光 変調部 205を透過した蛍光光の円偏光成分のうち右円偏光成分 (便宜上" "成分 とする）は偏光遮断部 206によってカットされ、一方、左円偏光成分は偏光遮断部 20 6を透過し、光学レンズ 106、波長選択部 107を経て、蛍光測定部 108にて蛍光強 度信号 (電気信号）に変換される。そして、光量信号として検出制御部 210へ出力さ れる。
[0104] このとき、右円偏光成分と左円偏光成分とが同等の場合には、円偏光変調部 205 の位相変調に依存せずに一定の電気信号が得られるが、もしも右円偏光成分が多 い場合には、円偏光変調部 205が + λ Ζ4を与える場合に強い電気信号をあたえ、 円偏光変調部 205がー λ Ζ4を与える場合に弱い電気信号を与えることから、蛍光 測定部 108からの信号出力は振動数 ωで変調されることになる。
[0105] この変調信号成分を光量信号として検出制御部 210にて検出し、信号処理部 214 のインターフェース 112を介して解析用 PC213にデータを転送する。そして、解析用 PC213は、円偏光蛍光二色性スペクトルを解析する。なお、あわせて、試料ステー ジ 101の位置情報に応じた円偏光蛍光二色性スペクトルをイメージィ匕しマッピングし てもよい。
[0106] 上述した円二色性蛍光顕微鏡 200によれば、まず、試料の絶対量が少なくても円 偏光蛍光二色性スペクトルを解析可能である。これにより、多くの試料を必要としない というメリットがある。また、本円二色性蛍光顕微鏡によれば、例えば、細胞内部に存 在するタンパク質や核酸といった生体分子について、細胞内部におけるキラリティ情 報や高次構造、立体構造等を解析することができる。さらに、血液や体液 (唾液含） 等の光散乱性の試料でも解析可能である。
[0107] 〔実施の形態 2〕
上記参考の形態 2では、円偏光蛍光二色性スペクトルを 2次元解析するための円 二色性蛍光顕微鏡の一実施形態について説明したが、本実施形態では、共焦点化 することにより 3次元で円偏光蛍光二色性スペクトルの解析が可能な円二色性蛍光 顕微鏡の一実施形態について説明する。なお、説明の便宜上、上記参考の形態 1, 2及び実施の形態 1にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符 号を付記し、その説明を省略する。本実施の形態では、上記参考の形態 1, 2及び実 施の形態 1との相違点について説明するものとする。
[0108] 図 4は、本実施の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡 200'の構造を模式的に示すも のである。円二色性蛍光顕微鏡 200'は、共焦点化し、試料についての 3次元で円 偏光蛍光二色性スペクトル解析 (CPL)を解析するための蛍光顕微鏡である。
[0109] 具体的には、円二色性蛍光顕微鏡 200'は、試料ステージ 101 ' ,光学レンズ 102 ,光源 103,波長選択ミラー 104,円偏光変調部 205,偏光遮断部 206,光学レンズ 106,波長選択部 107,蛍光測定部 108,偏光制御部 209,検出制御部 210,ステ ージ制御部 111 ' ,信号処理部 214' ,共焦点部 115を備えている。
[0110] 信号処理部 214'は、インターフェース 112と 3次元解析用の解析用 PC213'を備 えている。解析用 PC213'は、共焦点顕微鏡データから 3次元の円偏光蛍光二色性 スペクトル解析を行うものである。 3次元データを処理する手法や機構につ 、ては、 従来公知の 3次元データを解析するためのソフトウェア等を好適に用いることができ、 特に限定されるものではない。なお、円偏光蛍光二色性スペクトル解析の解析手法 の原理については、参考の形態 2と同様である。また、解析用 PC213'は、イメージ ング 'マッピング処理が可能に構成されていてもよい。イメージマッピングの機構にお ける信号処理の具体例は、上述の参考の形態 1と同様であるため、ここではその説明 を省略する。
[0111] また、信号処理部 214'は、信号処理部 214と同様、波長選択部 107の所定波長を 外部信号により制御するとともに、円偏光変調部 205の変調光波長を制御する円偏 光蛍光検出波長制御手段として機能する構成であってもよい。
[0112] 円二色性蛍光顕微鏡 200'の動作については、円偏光変調部 205を透過した蛍光 力 偏光遮断部 206に到達する前に、共焦点部 115を透過する点以外は、参考の形 態 2とほぼ同様であるため、詳細な説明は省略する。上記の構成により、試料から放 射された蛍光のうち、微小開口部に焦点を結ぶ光のみが透過し、それ以外の光は遮 断されるため、蛍光検出部 108では試料力もの蛍光について共焦点像を得ることが できる。そして、信号処理部 214'は、この共焦点像データに基づき、円偏光蛍光二 色性スペクトルを 3次元解析することになる。
[0113] 上記の構成によれば、上述した参考の形態 2で述べた効果に加えて、例えば、細 胞内部に存在するタンパク質や核酸といった生体分子について、生体内部における キラリティ情報や高次構造、立体構造等を 3次元解析することができる。また、ィメー ジング ·マッピングすることも勿論可能である。
[0114] なお、本実施の形態では、共焦点部 115を円偏光変調部 205と偏光遮断部 206と の間に設置しているが、例えば、共焦点部 115を、偏光遮断部 206と光学レンズ 106 との間に配置されるように構成してもよい。共焦点部 115の配置位置は、これらの構 成に限られるものではなぐ本発明の目的を達成できる範囲で種々の設計変更が可 能である。
[0115] 〔実施の形態 3〕
上記実施の形態 2では、円偏光蛍光二色性スペクトルを 3次元解析するための円 二色性蛍光顕微鏡の一実施形態について説明した。さらに、本実施形態では、上記 実施の形態 2で示す円二色性蛍光顕微鏡をより高感度に改良した、円偏光蛍光二 色性スペクトルの解析が可能な円二色性蛍光顕微鏡について説明する。なお、説明 の便宜上、上記参考の形態 1, 2及び実施の形態 1, 2にて説明した部材と同じ機能 を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。本実施の形態 では、上記参考の形態 1, 2及び実施の形態 1, 2との相違点について説明するものと する。
[0116] 図 5は、本実施の形態に係る円二色性蛍光顕微鏡 300の構造を模式的に示すもの である。円二色性蛍光顕微鏡 300は、共焦点化し、試料についての 3次元で円偏光 蛍光二色性スペクトル解析 (CPL)を解析するための蛍光顕微鏡である。
[0117] 具体的には、円二色性蛍光顕微鏡 300は、試料ステージ 101 ' ,光学レンズ 102, 光源 103,波長選択ミラー 104,円偏光変調部 205,偏光遮断部 206,光学レンズ 1 06,波長選択部 107,蛍光測定部 108,偏光制御部 209,検出制御部 210,ステー ジ制御部 111 ' ,信号処理部 214' ,共焦点部 115'を備えている。
[0118] 円二色性蛍光顕微鏡 300では、図 5に示すように、共焦点部 115'が円偏光変調 部 205の前方に設けられている点のみが円二色性蛍光顕微鏡 200'と異なる。この 点以外の構成は、上記実施の形態 2における円二色性蛍光顕微鏡 200'と同じであ るため、説明を省略する。
[0119] 次に、円二色性蛍光顕微鏡 300の動作について説明する。基本的には円二色性 蛍光顕微鏡 200'の動作と同じであるが、試料力も放射された蛍光が、共焦点部 115 'を通過した後、円偏光変調部 205に到達する点のみが異なる。上記の構成によれ ば、試料力も放射された蛍光がそのまま円偏光変調部 205に到達せず、一旦共焦点 部 115'を透過することになる。この場合、共焦点部 115'の働きにより、試料から放 射された蛍光は、微小開口部に焦点を結ぶ光のみが透過し、それ以外の光は遮断 されるため、整えられることになる。そして、この整えられた蛍光が円偏光変調部 205 へと至る。
[0120] 本願発明者は、独自の研究により、上記のように円偏光変調部 205の前に、試料か ら放出される蛍光光を整えるための、微小開口部を有する共焦点部 115'を設けるこ とにより、得られるデータの感度が格段に向上することを見出した。つまり、共焦点部 115'を用いて、蛍光光を平行光束 (整えられた蛍光）にして円偏光変調部 205に入 射するように構成することを見出した。かかる知見は、上述した特許文献 3には開示も 示唆もされて 、な 、、本願独自の技術思想と 、える。
[0121] 以下に、本願発明の特徴点の理解の一助とすべぐ本願発明と類似の発明を開示 しする上記特許文献 3と対比説明を行う。
[0122] 具体的には、上述したように、上記特許文献 3に開示の装置では、励起光を透過し 、蛍光光を反射させる手段として、半透過ミラーを用いている。半透過ミラーは波長選 択性がないだけでなぐ半透過であるために、入射する励起光について光強度の口 スが発生してしまう。さらに、反射させる蛍光光についても強度ロスが発生することと なる。このようなロスにより、測定精度が大幅に劣る。力!]えて、半透過ミラーが光路に 対して厳密に 45度の角度で配置されていないと、ひずみが発生し、測定精度、安定 性が大幅に劣る。
[0123] これに対して、本願発明では、半透過ミラーに替えて、波長選択ミラーを用いている 。波長選択ミラーは波長の短い光 (本願では励起光)を曲げ、長い光（同蛍光光)を 直進させるものである。
[0124] つまり、本願発明と上記特許文献 3とでは、波長選択ミラーを用いるか、それとも半 透過ミラーを用いるかという点で、技術的に大きく異なる。このような構成の相異により 、励起光 (本願では折り曲げられるが、上記特許文献 3では直進）と蛍光光 (本願で は直行し、上記特許文献 3では折り曲げ)の光路が異なる。
[0125] この構成の相異により、上記特許文献 3の強度ロスは励起光 50%、蛍光光 50%と なり、非常に大きくなるのに対して、本願発明では、強度ロスは励起光 5%、蛍光光 1 0%に過ぎない。したがって、本願は、上記の構成により測定の安定性が確保できる
[0126] さらに、上記特許文献 3の装置では、アイリスが検出部の直近にある。この構成では 、試料から出る蛍光光が偏光変調部内で多重反射し、円偏光成分の検出に誤差が 生じてしまう。これに対して、本願発明では、波長選択ミラー 104と円偏光変調部 20 5 (モジユレータ）との間に共焦点部 115 'が存在する。このため、非平行光束成分が 除去され、高感度の計測が可能となる。
[0127] このように、試料力 放射された蛍光が一旦整えられ、その後、円偏光変調部 205 へ到達することにより、蛍光検出部 108にて検出する共焦点データは格段に感度が 向上する。例えば、円二色性蛍光顕微鏡 300は、円二色性蛍光顕微鏡 200 'に比べ て、その感度、再現性ともに、約 1桁向上する。
[0128] それゆえ、円二色性蛍光顕微鏡 300によれば、例えば、実施の形態 2の円二色性 蛍光顕微鏡 200'では解析困難であった、円偏光成分力 S小さい試料についても、高 精度かつ再現性よく解析することができる。
[0129] したがって、本円二色性蛍光顕微鏡では、共焦点部を、 (0波長選択ミラー 104と上 記蛍光検出部 108との間、より好ましくは GO波長選択ミラー 104と円偏光変調手段 2 05との間に設けることが好ましいといえる。
[0130] また、本発明は、以下の円二色性蛍光顕微鏡を含んでいてもよい。
[0131] (a)光源と、上記光源から出射する光束を左右の円偏光とする円偏光変調手段と、 上記円偏光変調手段を透過する左右の円偏光を、試料に対して集光照射するため の第 1の光学レンズと、上記試料から放射される蛍光を集光するための第 2の光学レ ンズと、上記第 2の光学レンズにて集光される蛍光のうち、所定波長の蛍光のみを通 過させる波長選択手段と、上記波長選択手段を透過する蛍光を検出し蛍光強度信 号とする蛍光測定手段と、上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号に基づき、 右円偏光を照射した際に試料力 放射される蛍光と、左円偏光を照射した際に試料 力 放射される蛍光との強度の差分を算出する信号処理手段と、を備える円二色性 蛍光顕微鏡。
[0132] (b)さらに、上記円偏光変調手段が上記光源から出射した光束を所定の変調周波 数で交互に左右の円偏光とするように制御する偏光制御手段と、上記信号処理手段 力 上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号のうち、上記変調周波数に同期 して交流成分を取り出して、右円偏光を照射した際に試料から放射される蛍光と、左 円偏光を照射した際に試料力 放射される蛍光との強度の差分を算出するように制 御する検出制御手段と、を備える（a)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0133] (c)さらに、上記第 2の光学レンズと上記波長選択手段との間に、第 3の光学レンズ を備える（a)又は (b)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0134] (d)上記第 1の光学レンズと上記第 2の光学レンズとは、同一の光学レンズである（a )〜（c)の 、ずれかに記載の円二色性蛍光顕微鏡。 [0135] (e)さらに、上記第 2の光学レンズと上記波長選択手段との間に、共焦点手段を備 える（a)〜（d)の 、ずれかに記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0136] (f)光源と、上記光源から出射する光束を集光照射するための第 1の光学レンズと、 試料から放射される蛍光を集光するための第 2の光学レンズと、上記第 2の光学レン ズを透過した蛍光を、左右の円偏光とする円偏光変調手段と、上記左右の円偏光成 分のうち、左右いずれかの円偏光成分の透過を遮断する偏光遮断手段と、上記偏光 遮断手段を透過した円偏光成分のうち、所定波長の光のみを通過させる波長選択 手段と、上記波長選択手段を透過した蛍光を検出し蛍光強度信号とする蛍光測定 手段と、上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号に基づき、試料から放射され る蛍光の右円偏光成分と左円偏光成分との強度の差分を算出する信号処理手段と 、を備える円二色性蛍光顕微鏡。
[0137] (g)さらに、上記円偏光変調手段が上記第 2の光学レンズを透過した蛍光を、所定 の変調周波数で交互に左右の円偏光とするように制御する偏光制御手段と、上記信 号処理手段が、上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号のうち、上記変調周 波数に同期して交流成分を取り出して、試料から放射される蛍光の右円偏光成分と 左円偏光成分との強度の差分を算出するように制御する検出制御手段と、を備える（ f)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0138] (h)さらに、上記偏光遮断手段と上記波長選択手段との間に、第 3の光学レンズを 備える (f)又は (g)に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0139] (i)上記第 1の光学レンズと上記第 2の光学レンズとは、同一の光学レンズである（f) 〜 (g)の 、ずれかに記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0140] (j)さらに、上記円偏光変調手段と偏光遮断手段との間、又は、上記偏光遮断手段 と波長選択手段との間に、共焦点手段を備える (f )〜 (i)の 、ずれかに記載の円二色 性蛍光顕微鏡。
[0141] (k)さらに、上記信号処理手段によって算出された蛍光強度の差情報に基づき、上 記試料にっ 、ての画像を形成する画像処理手段を備える（a)〜 (j)の 、ずれかに記 載の円二色性蛍光顕微鏡。
[0142] 上記各参考の形態及び実施の形態で述べた構成は、本発明に係る円二色性蛍光 顕微鏡のあくまで一例に過ぎず、本発明は上述した構成に限られず、本発明の目的 を達することができる範囲で様々な態様'構成が可能であることはいうまでもない。な お、本参考の形態及び実施の形態で説明していない技術的事項については、適宜 、他の参考の形態及び実施の形態の記載や本願出願当時の技術水準にある技術を 好適に利用することができる。さらに、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であ り、異なる参考の形態及び実施の形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組 み合わせて得られる参考の形態及び実施の形態についても本発明の技術的範囲に 含まれることを念のため付言しておく。
[0143] 最後に、円二色性蛍光顕微鏡の各ブロック、特に信号処理部，偏光制御部，検出 制御部，およびステージ制御部（以下、単に信号処理部等と称する。）は、ハードウ ァロジックによって構成してもよいし、次のように CPUを用いてソフトウェアによって実 現してちょい。
[0144] すなわち、円二色性蛍光顕微鏡は、各機能を実現する制御プログラムの命令を実 行する CPU (central processing unit)、上記プログラムを格納した ROM (read only m emory)、上記フ—ログラムを展開する RAM (random access memory)、上記フ—ログラム および各種データを格納するメモリ等の記憶装置 (記録媒体)などを備えて 、る。そし て、本発明の目的は、上述した機能を実現するソフトウェアである円二色性蛍光顕微 鏡の制御プログラムのプログラムコード（実行形式プログラム、中間コードプログラム、 ソースプログラム）をコンピュータで読み取り可能に記録した記録媒体を、上記円二 色性蛍光顕微鏡に供給し、そのコンピュータ (または CPUや MPU)が記録媒体に記 録されているプログラムコードを読み出し実行することによつても、達成可能である。
[0145] 上記記録媒体としては、例えば、磁気テープやカセットテープ等のテープ系、フロッ ピー（登録商標）ディスク Zハードディスク等の磁気ディスクや CD— ROMZMOZ MD/DVD/CD—R等の光ディスクを含むディスク系、 ICカード (メモリカードを含 む） Z光カード等のカード系、あるいはマスク ROMZEPROMZEEPROMZフラッ シュ ROM等の半導体メモリ系などを用いることができる。
[0146] また、円二色性蛍光顕微鏡を通信ネットワークと接続可能に構成し、上記プロダラ ムコードを、通信ネットワークを介して供給してもよい。この通信ネットワークとしては、 特に限定されず、例えば、インターネット、イントラネット、エキストラネット、 LAN, ISD N、 VAN, CATV通信網、仮想専用網（virtual private network)、電話回線網、移 動体通信網、衛星通信網等が利用可能である。また、通信ネットワークを構成する伝 送媒体としては、特に限定されず、例えば、 IEEE1394, USB、電力線搬送、ケー ブル TV回線、電話線、 ADSL回線等の有線でも、 IrDAやリモコンのような赤外線、 Bluetooth (登録商標）、 802. 11無線、 HDR、携帯電話網、衛星回線、地上波デ ジタル網等の無線でも利用可能である。なお、本発明は、上記プログラムコードが電 子的な伝送で具現化された、搬送波に埋め込まれたコンピュータデータ信号の形態 でも実現され得る。
産業上の利用の可能性
[0147] 本発明に係る円二色性蛍光顕微鏡によれば、少量の試料から円偏光励起二色性 スペクトル (FDCD)又は円偏光蛍光二色性スペクトル (CPL)を解析できると!、う効 果を奏する。このため、試料のキラリティについての情報を、大量の試料を必要とせ ず、なおかつ高精度で解析することができる。このため、本円二色性蛍光顕微鏡によ れば、例えば、細胞内部に存在するタンパク質や核酸といった生体分子について、 細胞内部におけるキラリティ情報や高次構造、立体構造等を直接解析することができ る。
[0148] 本発明に係る円二色性蛍光顕微鏡は、生体分子等のキラリティや高次構造情報を 解析することができるため、医学 ·生理学等の学術分野だけでなぐ診断'医療機器、 分析機器、製薬事業や食品事業等の様々な産業において利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] 光源と、
上記光源から出射する光束を左右の円偏光とする円偏光変調手段と、 上記円偏光変調手段を透過する左右の円偏光を、試料に対して集光照射するた めの第 1の光学レンズと、
上記試料から放射される蛍光を集光するための第 2の光学レンズと、
上記第 2の光学レンズにて集光される蛍光のうち、所定波長の蛍光のみを通過させ る波長選択手段と、
上記波長選択手段を透過する蛍光を検出し蛍光強度信号とする蛍光測定手段と、 上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号に基づき、右円偏光を照射した際 に試料カゝら放射される蛍光と、左円偏光を照射した際に試料カゝら放射される蛍光との 強度の差分を算出する信号処理手段と、を備え、
さらに、上記第 2の光学レンズと上記波長選択手段との間に、微小開口部を有する 共焦点手段を備えることを特徴とする円二色性蛍光顕微鏡。
[2] さらに、上記円偏光変調手段が上記光源から出射した光束を所定の変調周波数で 交互に左右の円偏光とするように制御する偏光制御手段と、
上記信号処理手段が、上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号のうち、上記 変調周波数に同期して交流成分を取り出して、右円偏光を照射した際に試料力 放 射される蛍光と、左円偏光を照射した際に試料力 放射される蛍光との強度の差分 を算出するように制御する検出制御手段と、を備えることを特徴とする請求項 1に記 載の円二色性蛍光顕微鏡。
[3] さらに、上記第 2の光学レンズと上記波長選択手段との間に、第 3の光学レンズを備 えることを特徴とする請求項 1に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[4] 上記第 1の光学レンズと上記第 2の光学レンズとは、同一の光学レンズであることを 特徴とする請求項 1に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[5] 上記微小開口部の直径は、 10 m以上 100 m以下であることを特徴とする請求 項 1に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[6] 光源と、 上記光源から出射する光束を集光照射するための第 1の光学レンズと、
試料から放射される蛍光を集光するための第 2の光学レンズと、
上記光源からの励起光は反射する一方、試料からの蛍光は透過する波長選択ミラ 一と、
上記第 2の光学レンズを透過した蛍光の左右の円偏光成分を、変調された直線偏 光成分に変更する円偏光変調手段と、
上記直線偏光成分のうち、縦横いずれかの直線偏光成分の透過を遮断する偏光 遮断手段と、
上記偏光遮断手段を透過した円偏光成分のうち、所定波長の光のみを通過させる 波長選択手段と、
上記波長選択手段を透過した蛍光を検出し蛍光強度信号とする蛍光測定手段と、 上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号に基づき、試料から放射される蛍光 の右円偏光成分と左円偏光成分との強度の差分を算出する信号処理手段と、を備 え、
さらに、上記波長選択ミラーと上記蛍光測定手段との間に、微小開口部を有する共 焦点手段を備えることを特徴とする円二色性蛍光顕微鏡。
[7] 上記共焦点手段は、上記波長選択ミラーと上記円偏光変調手段との間に設けられ て ヽることを特徴とする請求項 6に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[8] 上記共焦点手段は、円偏光変調手段へ到達する蛍光を整える機能を有するもので あることを特徴とする請求項 6に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[9] さらに、上記円偏光変調手段が上記第 2の光学レンズを透過した蛍光を、所定の変 調周波数で交互に左右の円偏光とするように制御する偏光制御手段と、
上記信号処理手段が、上記蛍光測定手段にて生成した蛍光強度信号のうち、上記 変調周波数に同期して交流成分を取り出して、試料から放射される蛍光の右円偏光 成分と左円偏光成分との強度の差分を算出するように制御する検出制御手段と、を 備えることを特徴とする請求項 6に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[10] さらに、上記偏光遮断手段と上記波長選択手段との間に、第 3の光学レンズを備え ることを特徴とする請求項 6に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[11] 上記第 1の光学レンズと上記第 2の光学レンズとは、同一の光学レンズであることを 特徴とする請求項 6に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[12] 上記微小開口部の直径は、 10 m以上 100 m以下であることを特徴とする請求 項 6に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[13] さらに、上記信号処理手段によって算出された蛍光強度の差情報に基づき、上記 試料につ ヽての画像を形成する画像処理手段を備えることを特徴とする請求項 1に 記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[14] さらに、上記信号処理手段によって算出された蛍光強度の差情報に基づき、上記 試料についての画像を形成する画像処理手段を備えることを特徴とする請求項 6〖こ 記載の円二色性蛍光顕微鏡。
[15] 上記波長選択手段の所定波長を外部信号により制御するとともに、円偏光変調手 段の変調光波長を制御する円偏光蛍光検出波長制御手段を備えることを特徴とする 請求項 1または 6に記載の円二色性蛍光顕微鏡。
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