JPH1151855A - 円二色性蛍光励起スペクトル測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、検出感度の向上を図るこ
とができると共に、試料の利用効率の改善を図ることが
できる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置を提供する
ことにある。 【解決手段】 光源１２と、励起光波長選択手段１４
と、円偏光変調器１６と、サンプルセル１８と、蛍光波
長選択手段１９と、蛍光測定手段２０と、該蛍光強度を
検出した電気信号ｓ２のうち、該変調周波数ｓ１に同期
して交流成分ｓ４を取り出して円二色性蛍光励起スペク
トルとする信号処理手段２８と、を備え、該サンプルセ
ル１８と蛍光測定手段２０の間に集光系を介さず、か
つ、該サンプルセル１８と蛍光測定手段２０を近接させ
たことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装
置１０。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は円二色性蛍光励起ス
ペクトル測定装置、特にその蛍光の集光効率と試料の利
用効率の改善に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】多くの化学物質において、その絶対構
造、立体構造に関する知見は、極めて基本的かつ重要不
可欠な情報となっている。特に薬物、毒物、生体物質な
どの生理活性物質においては、その生理活性が直接にそ
のキラリティ、すなわち絶対構造、立体構造に依存する
ことから、重要な研究課題とされている。しかしなが
ら、キラリティのみ異なる光学異性体は、化学的性質は
実質的に同一であり、各種物理的特性も極めて近似して
いるため、これら薬物、毒物、生体物質などの生理活性
物質のキラリティを解析する手段としては、Ｘ線結晶構
造解析、円二色性スペクトルくらいに限られてくる。特
に円二色性スペクトルは、取り扱いが比較的平易である
ことから、この研究には重要不可欠な手段として広く用
いられている。

【０００３】ところが、例えば生理活性物質などのよう
に試料によっては、この円二色性スペクトル測定のため
に十分な量を確保することが容易ではない場合も多く、
この円二色性スペクトル測定検出感度の向上、あるいは
より感度の高い代替の測定手段の実現が強く望まれてい
た。その代替となり得る手段として、蛍光検出円二色性
測定装置が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところが、従来の蛍光
検出円二色性スペクトル測定装置は、もっぱら蛍光検出
による選択性の向上にのみ着目されていて、その潜在的
な感度向上の可能性については全く考慮されておらず、
大きな改善の余地が残されていた。すなわち、蛍光を検
出する場合の検出感度は、試料から放射される蛍光の集
光効率に依存するため、可能な限りその集光効率を高め
る設計がなされることが望ましいが、従来の蛍光検出円
二色性スペクトル測定装置ではそれがなされておらず、
大きな改善の余地が残されていた。

【０００５】本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされ
たものであり、その目的は検出感度の向上を図ることが
できると共に、試料の利用効率の改善を図ることができ
る円二色性蛍光励起スペクトル測定装置を提供すること
にある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装
置は、光源と、該光源から出た光束のうち、所定波長の
励起光束のみを通過させる励起光波長選択手段と、該励
起光波長選択手段からの光束を所定の変調周波数で交互
に左右の円偏光とする円偏光変調器と、試料が入れら
れ、該円偏光変調器を通過した左右の円偏光が交互に照
射されるサンプルセルと、該サンプルセル内の試料から
放射された蛍光のうち、所定波長の蛍光のみを通過させ
る蛍光波長選択手段と、該蛍光波長選択手段からの蛍光
を蛍光強度信号とする蛍光測定手段と、該蛍光強度を検
出した電気信号のうち、該変調周波数に同期して交流成
分を取り出して円二色性蛍光励起スペクトルとする信号
処理手段と、を備え、サンプルセルと蛍光測定手段の間
に集光系を介さず、かつ、該サンプルセルと蛍光測定手
段を近接させたことを特徴とする。

【０００７】なお、前記装置において、前記蛍光波長選
択手段はカットオフフィルタであり、該カットオフフィ
ルタにより励起光の散乱光の波長域の光を選択的に吸収
して除去することが好適である。また、前記装置におい
て、前記サンプルセルを透過した光の通過コース上に設
けられ、該透過光を除去する光トラップを備えることが
好適である。

【０００８】また、前記装置において、前記サンプルセ
ルを間に挟み蛍光測定手段の反対側に、その鏡面をサン
プルセルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料か
ら放射された蛍光のうち、蛍光測定手段の反対方向に放
射された蛍光を入反射して蛍光測定手段へ導く凹面鏡を
備えることが好適である。または、実質的に前記サンプ
ルセルの外周面のほぼ全周に亘り、その鏡面をサンプル
セルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料から放
射された蛍光を入反射して蛍光測定手段へ導く内面反射
型の反射鏡を備えることも好適である。また、前記装置
において、前記サンプルセル内の試料の高さは、前記励
起光束のビーム径とほぼ同一の高さであり、

【０００９】また底部が高さ調節自在で、該高さ調節が
自在の底部上に前記サンプルセルが設けられたセルホル
ダと、前記セルホルダ底部の高さを調節可能な高低調節
手段と、を備え、前記サンプルセル内の試料の高さと励
起光波長選択手段からの励起光束のビーム径とがほぼ一
致するように、前記高低調節手段によりサンプルセルの
高さを調節することが好適である。さらに、前記装置に
おいて、前記サンプルセルは円筒形よりなることが好適
である。

【００１０】

【発明の実施形態】以下、図面に基づき本発明の好適な
実施形態を説明する。図１には本発明の一実施形態にか
かる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置が示されてい
る。

【００１１】同図に示す円二色性蛍光励起スペクトル測
定装置１０は、光源１２と、励起光波長選択手段である
分光器１４と、ピエゾエラスティックモジュレータ（Ｐ
ＥＭ）よりなる円偏光変調器１６と、サンプルセル１８
と、蛍光波長選択手段であるカットオフフィルタ１９
と、蛍光測定手段であり、光増倍管（ＰＭＴ）よりなる
検出器２０と、プリアンプ２２と、直流アンプ２４と、
交流アンプ２６と、ロック・インアンプ２８と、直流ア
ンプ３０と、Ａ／Ｄ変換器３２と、Ｉ／Ｏ装置３４と、
分光器ドライバ３６と、ＰＥＭドライバ３８と、ＰＭＴ
印加電圧制御回路４０と、制御手段であるＣＰＵ４２
と、記憶手段４４を備える。

【００１２】そして、光源１２の発光方向前方には分光
器１４が設置され、この分光器１４により波長走査され
順次所定波長の単色光となり、さらに所定の振動方向の
直線偏光となった光束は、分光器１４の前方に設置され
た円偏光変調器１６を通過する。この円偏光変調器１６
では、左右円偏光が所定の変調周波数信号ｓ１（本実施
形態においては図２（ａ）に示すように５０ｋＨｚ）で
交互につくられて、サンプルセル１８内の試料に照射さ
れる。

【００１３】ここで、サンプルセル１８内の試料に励起
光束Ｌ１である左右円偏光の不等吸収が起こると、円偏
光変調器１６の変調周波数信号ｓ１に対応して蛍光Ｌ２
にも強弱の波が生じ検出器２０に到達するが、試料から
放射された蛍光Ｌ２は、カットオフフィルタ１９により
励起光束Ｌ１の散乱光が取り除かれ、目的の蛍光波長域
の光のみが検出器２０に入射する。以上のようにして本
実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置
１０を構成することにより、試料から放射された蛍光を
測定することができる。

【００１４】なお、本実施形態では円偏光変調器１６を
用いているため、検出器２０の出力信号には、直流成分
信号ｓ３にわずかの交流成分信号ｓ４が含まれており
（図２（ｂ）参照）、この交流成分信号ｓ４には、左右
の円偏光で励起したときの蛍光強度の差（励起スペクト
ルの差）が反映している（同図（ｃ）参照）。このた
め、本実施形態においては、例えばこの励起スペクトル
の差を求めることにより、円二色性蛍光励起スペクトル
（図３参照）を得ることができる。

【００１５】また、分光器１４、円偏光変調器１６の動
作は、それぞれ分光器ドライバ３６、ＰＥＭドライバ３
８により管理されている。このような円二色性蛍光励起
スペクトル測定装置１０においては、もともと微弱な蛍
光のさらに差を解析しなければならないため、通常の蛍
光測定装置と比較しても一層の蛍光検出効率の向上が要
求される。以下、本実施形態の特徴的事項について詳細
に説明するが、まず本実施形態における蛍光の集光効率
の改善方法について説明する。

【００１６】サンプルセルと検出器の配置 従来においては、サンプルセル１８の設置場所に空間を
確保してその扱いを容易にするため、図４（ａ）に示す
ように、検出器２０をサンプルセル１８より離し、この
サンプルセル１８と検出器２０との間の光路中に、集光
系である集光レンズ４６，４８を設置していた。

【００１７】しかしながら、従来のように検出器２０を
サンプルセル１８より離すと、集光レンズ４６，４８の
開口角は限られていて十分大でなく、その分、集光効率
も限られていた。また、集光系は最低２枚のレンズ４
６，４８を設けていたため、この集光レンズ４６，４８
の表面での反射によっても、試料から放射された蛍光Ｌ
２の約２０％程度をロスしていた。

【００１８】そこで、本実施形態においては、同図
（ｂ）に示すように、前記集光系である集光レンズ４
６，４８を介さず、カットオフフィルタ１９を介して検
出器２０をサンプルセル１８に近接させている。この結
果、試料から放射された蛍光Ｌ２の大部分を検出器２０
に入射させることができる。これにより、蛍光Ｌ２の集
光効率を最大とすることができるので、検出感度の向上
を図ることができる。

【００１９】カットオフフィルタ 従来より、一般的な蛍光分光光度計などの円二色性蛍光
励起スペクトル測定装置では、検出する蛍光Ｌ２の波長
を選択するために回折格子を用いた分光器を組み込むの
が普通である。しかしながら、このような分光器を組み
込むことにより、検出する蛍光Ｌ２の波長を可変するこ
とができる、蛍光の波長純度をコントロールすることが
できる、などの利点があるものの、光学素子の効率のた
めに光のロスが避けられず、その分、機構が複雑となり
コストがかかるなどのマイナス面もあった。

【００２０】そこで、本実施形態においては、励起光Ｌ
１の散乱光さえ取り除くことができれば、それより長い
波長の光の全部を用いても何等問題なく、むしろ光の量
が増えて感度を向上させるためには好都合であることか
ら、検出器２０側の分光器として前記図４（ｂ）に示す
ようにカットオフフィルタ１９を用いることが好適であ
る。このカットオフフィルタ１９は、入射した光のう
ち、励起光Ｌ１の散乱光の波長成分のみを吸収して、そ
れより長波長の蛍光のみを検出器２０に入射させるの
で、検出器２０に入射される蛍光Ｌ２の量を増やすこと
ができ、検出感度の向上を図ることができる。

【００２１】また、このカットオフフィルタ１９の厚さ
は数ｍｍ程度と薄いため、その後段に設置される検出器
２０をサンプルセル１８にできる限り近接させて、その
開口比を大きく確保することにも役立つ。これにより、
集光効率の向上を図ることができるので、検出感度の向
上を図ることもできる。

【００２２】光トラップ 試料を透過した光束は迷光となり、測定の妨害となるお
それがあった。また、本実施形態のように励起光として
円偏光を用いた場合には、試料を透過した円偏光に反射
が生じると偏光状態が変わり、最悪、逆方向の円偏光と
なって再度サンプルセル１８に戻るおそれがあった。そ
して、このような逆方向の円偏光がサンプルセル１８に
入射すると、試料の励起に関わり、左右の円偏光励起に
よる蛍光強度の差を小さくし、折角の信号を小さくして
しまう。

【００２３】そこで、本実施形態においては、これらの
影響を取り除くため、前記図４（ｂ）に示すように、サ
ンプルセル１８からの透過光Ｌ３を除去することが可能
な光トラップ５０を設けている。これにより、前述のよ
うなノイズを大幅に低減することができると共に、最大
信号の確保を行うことができる。

【００２４】凹面鏡 前記図４（ｂ）に示すように、試料からの蛍光Ｌ２は、
励起光Ｌ１の照射方向に関わらず、全包囲に放射される
が、検出に用いられるのは、そのうちの１方向である検
出器２０方向でしかなく、その他は無駄となる。そこ
で、本実施形態においては、サンプルセル１８を間に挟
み検出器２０の反対側に凹面鏡５２を設置して、その焦
点をサンプルセル１８のほぼ中央部に位置させる。これ
により、検出器２０の反対側に放射された蛍光Ｌ２も、
この凹面鏡５２で入反射されてサンプルセル１８に戻
り、そのまま検出器２０に入射することができる。

【００２５】この結果、検出器２０に入射する蛍光Ｌ２
の量を増やすことができるので、検出感度の向上を図る
ことができる。

【００２６】内面反射型の筒形反射鏡 本実施形態においては、前記図４（ｂ）に示す凹面鏡５
２に代わり、図５に示すように、サンプルセル１８とし
て円筒形セルを用い、該円筒形セルの周囲を一部除いた
内面反射型の筒形反射鏡で囲み込み、光の利用効率を上
げることも好適である。

【００２７】すなわち、サンプルセル１８として円筒形
セルを用いたときの光利用効率をさらに上げるために
は、図５に示すように、円筒形セルの周りに内面反射型
の筒形反射鏡を設置することが好適であり、その１つ
は、同図（ａ）に示すように内面反射型の円筒形鏡５４
の一部（例えば検出器２０の口径とほぼ同様）を切り欠
いたものを用いて、試料から実質的に全方位へ放射され
た蛍光を、この円筒形鏡５４にて入反射させて、前記図
１に示す検出器２０に入射させることができる。

【００２８】もう１つは、同図（ｂ）に示すような、内
面反射型の楕円筒形鏡４８を用いることができる。そし
て、この楕円筒形鏡５６の切り抜き部分（例えば検出器
２０の口径とほぼ同様）から遠い方の焦点が、サンプル
セル１８である円筒形セルの中心に一致するように設け
る。これにより、サンプルセル１８である円筒形セルか
ら放射された蛍光を、もう１つの焦点に集光した後、効
率的に前記図１に示す検出器２０に導くことができる。

【００２９】この結果、試料から放射された蛍光のう
ち、検出器２０方向だけでなく、実質的に全方向に放射
された蛍光を検出器２０に入射させることができる。こ
れにより、検出器２０に入射する蛍光の量を増やすこと
ができるので、検出感度の向上を図ることができる。な
お、前記円筒形鏡５４、楕円筒形鏡５６などの内面反射
型の筒形反射鏡としては、金属製の筒体の内面を研磨し
たものを用いることができる。

【００３０】また、サンプルセルとして無蛍光ガラス製
の円筒形セルを用い、その外周面に、前記筒形反射鏡と
してアルミなど反射率の高い金属を蒸着、メッキするこ
とでも前記円筒形鏡５４、楕円筒形鏡５６と同様の効果
を得ることもできる。しかも、このようにサンプルセル
１８の外周面に鏡面を設けることにより、サンプルセル
をキズや劣化などから有効に保護することもできる。

【００３１】導光パイプ 本実施形態においては、試料から放射された蛍光Ｌ２
を、できる限り効率的に検出器２０に集光させるために
は、前記図４に示すように、サンプルセル１８、カット
オフフィルタ１９および検出器２０を直接近接させるこ
とも好適であるが、このほか、図６に示すように、サン
プルセル１８とカットオフフィルタ１９との間の光路中
に、その内面が鏡面研磨された導光パイプ５８を設ける
ことも好適である。

【００３２】この結果、サンプルセル１８から図中右方
向に放射された蛍光Ｌ２の一部は、該導光パイプ５８の
内面にて反射せずに直接カットオフフィルタ１９を介し
て検出器２０に入射するものもあるが、また導光パイプ
５８の内面に入射した蛍光Ｌ２も、その内面にて１回な
いし複数回入反射して、カットオフフィルタ１９を介し
て検出器２０に入射することができる。これにより、前
記図４に示すサンプルセル１８、カットオフフィルタ１
９および検出器２０を直接近接させる構成と同様に、試
料から放射された蛍光Ｌ２の集光効率の向上を図ること
ができるので、検出感度の向上を図ることができる。

【００３３】サンプルセルの形状の違いによる蛍光の集
光効率の改善 試料と空気の屈折率の違いにより、サンプルセル１８と
して角形セルを用いた場合、サンプルセル１８から外部
に蛍光が出るとき、図７（ａ）に示すように、蛍光Ｌ２
が開くように屈折する。このため、検出器２０に入射さ
れる蛍光Ｌ２は、その検出器２０の口径とサンプルセル
１８からの距離とで幾何学的に決まる開口立体角と比較
して少なくなる。そこで、本実施形態のように、同図
（ｂ）に示すようにサンプルセル１８として円筒形セル
を用いることにより、その回転軸方向の事情は変わらな
いが、径方向では屈折がないため、その分だけ、高い光
の利用効率を確保することができるので、検出感度の向
上を図ることができる。

【００３４】以上のようにしてサンプルセル１８、カッ
トオフフィルタ１９、検出器２０、光トラップ５０、凹
面鏡５２、内面反射型の筒形反射鏡５４，５６、導光パ
イプ５８などを適宜構成して蛍光の集光効率の向上を図
ることにより、蛍光のように微弱な光を検出する場合で
も検出感度の向上を図ることができる。つぎに、本実施
形態における試料の利用効率の改善について説明する。

【００３５】サンプルセルの形状の違いによる試料の利
用効率の改善 図８（ａ）に示すように、サンプルセル１８の励起光束
Ｌ１の通らない部分（図中黒い部分）は、測定に関与し
ない部分であり、限られた試料の量から、より濃い試料
溶液を調整するためには無駄な部分となる。そこで、本
実施形態においては、サンプルセル１８として円筒形セ
ルを用い、同図（ｂ）に示すように、励起光束Ｌ１とほ
ぼ同じ形状の円形に形成された端部であるセル窓板より
励起光束Ｌ１を入射させることにより、同図（ａ）に示
すようにサンプルセル１８として角形セルを用い、側方
のセル窓板より励起光束Ｌ１を入射させた場合に比較
し、その無駄な部分（図中黒い部分）を低減することが
できるので、試料の利用効率の改善を図ることができ
る。また、それ以外にもサンプルセル１８として円筒形
セルを用いると、つぎのような利点が得られる。

【００３６】すなわち、円筒形セルの方が角形のものに
比較し、前記励起光束Ｌ１の入射するセル窓板の歪みを
少なく作成することができる。この歪みは、本実施形態
において励起円偏光の偏光状態を乱し、ベースラインの
曲がりの原因となるものであるため、サンプルセル１８
としてこの歪みの少ない円筒形セルを用いることによ
り、得られるスペクトルの質的な向上を図ることもでき
る。

【００３７】サンプルセルの高低調節手段 生体成分のような試料では、その絶対量を確保すること
が困難であることが多く、測定には限られた微少量しか
用いられないことが一般的である。一方、測定で得られ
る信号強度は濃度に依存する。したがって、感度を確保
するためには、利用できる試料をできるだけ少量の溶媒
に溶解してできる限り濃い試料溶液６０とし、測定に供
するのが好ましい。より具体的には、測定において励起
光に照射されない試料部分を最小にするようにし、それ
に必要なギリギリの量の試料溶液６０を調整するのが好
ましい。

【００３８】そこで、本実施形態においては、図９に示
すように、その底部６２ａが高さ調節自在で、該底部６
２ａにサンプルセル１８が設けられたセルホルダ６２
と、セルホルダ底部６２ａを図中上下させてサンプルセ
ル１８の高さを調節可能な高低調節手段６４を備えるこ
とが好適である。そして、高低調節手段６４を駆動させ
て、励起光束Ｌ１をカバーすることができるギリギリの
高さまでサンプルセル１８を持ち上げることにより、サ
ンプルセル１８として円筒形セルを用いた場合は勿論、
たとえこれに角形のものを用いた場合でも、試料溶液６
０を該励起光束Ｌ１をカバーすることができる最低限の
量で済ませることができる。

【００３９】以上のようにしてサンプルセル１８、セル
ホルダ６２、高低調節手段６４などを構成することによ
り、励起光束Ｌ１をカバーすることができる必要最低限
の試料量で蛍光測定を行うことができるので、試料の利
用効率の改善を図ることができる。

【００４０】なお、本発明の円二色性蛍光励起スペクト
ル測定装置としては、上記実施形態のものに限られるも
のでなく、種々の態様の変更が可能であり、例えば前記
図１に示すＩ／Ｏ装置３４に、可搬型コンピュータのイ
ンターフェースをケーブル接続し、同図に示すＣＰＵ４
２の制御機能、記憶手段４４の記憶機能などの各機能
を、可搬型コンピュータ内蔵のＣＰＵ、リムーバブルデ
ィスク、ハードディスクなどの記憶手段で代用すること
も可能である。これにより、測定終了後にはその可搬型
コンピュータのみを外部へ持ち出して上記データ処理を
行うことができるので、作業性の向上などを図ることも
できる。つぎに、本実施形態において可能な種々の信号
処理方法について説明する。

【００４１】円二色性蛍光励起スペクトル 図１０に一般的な（吸収）円二色性スペクトルの１例を
示す。これは２Ｒ，３Ｒ−ビスナフトイルブタンジオー
ルの１．７８ｐｐｍのアセトニトリル溶液について測定
されたものである。この試料については極めて明瞭な円
二色性スペクトルが得られているが、この試料を１００
倍希釈した１７．８ｐｐｂの溶液については、図１１に
示すように、最早ノイズの大きさと同じ程度の信号レベ
ルとなって、このスペクトルの測定の主たる目的である
構造解析に用いることはできない。

【００４２】本実施形態の１つである円二色性蛍光励起
スペクトル測定装置は、このような希薄な試料につい
て、なお解析に利用できる高感度な円二色性蛍光励起ス
ペクトルに利用できる。図１２に示すのは、先の１７．
８ｐｐｂの試料について得られた円二色性蛍光励起スペ
クトルで、Ｓ／Ｎ比で比べて（吸収）円二色性スペクト
ルの２０倍の感度が得られている。因みに本実施形態に
よらない図４に示したような従来の円二色性蛍光励起ス
ペクトル測定で測定した円二色性蛍光励起スペクトルに
比べて、Ｓ／Ｎ比で６倍の感度が得られている。

【００４３】ところで、この図１２に示した円二色性蛍
光励起スペクトルでは、その縦軸が規格化されておら
ず、試料間の直接比較ができない。これを補うために、
本実施形態では以下に述べる方法によって円二色性蛍光
励起スペクトルの大きさの規格化を行うことが可能であ
る。すなわち、前述のように直流アンプ２４で分離され
た直流成分信号ｓ３も、そのままＡ／Ｄ変換器３２、Ｉ
／Ｏ装置３４を介してＣＰＵ４２に入力されるが、ＣＰ
Ｕ４２に入力された直流成分信号ｓ３は、そのまま全蛍
光励起スペクトル（同図（ｂ）参照）として記憶手段４
４に入力され記憶される。

【００４４】全蛍光励起スペクトルを取得後、ＣＰＵ４
２は記憶手段４４に適宜アクセスして全蛍光励起スペク
トルを読み出す。また、ＣＰＵ４２は読み出された全蛍
光励起スペクトルを所定の波長区間（本実施形態におい
ては２２０ｎｍ〜２６０ｎｍ）で積分して０でない積分
値Ｉを得る。積分値Ｉを取得後、ＣＰＵ４２は、記憶手
段４４に適宜アクセスして円二色性蛍光励起スペクトル
を読み出す。また、ＣＰＵ４２は読み出された円二色性
蛍光励起スペクトルを前記積分値Ｉで割り算することに
より、この円二色性蛍光励起スペクトルの大きさを規格
化する。

【００４５】全蛍光励起スペクトルを所定の波長区間で
積分して得られた積分値Ｉは、０でない１つの値である
から、ノイズとは無縁である。この積分値Ｉで円二色性
蛍光励起スペクトルを割り算することにより、ノイズを
増やさずに、その大きさを規格化することができる。こ
れにより、種々の試料間で円二色性蛍光励起スペクトル
を適正に比較することもできる。

【００４６】円二色性蛍光励起スペクトルの利点 円二色性蛍光励起スペクトルの縦軸を規格化する方法と
して、従来、左右の円偏光励起による蛍光強度の差を、
蛍光強度の和で割った量を蛍光検出円二色性スペクトル
として測定していた。本実施形態でも、この蛍光検出円
二色性スペクトルを、先の円二色性蛍光励起スペクトル
を全蛍光励起スペクトルで割ることにより、得ることが
できる。この間の関係は下記数１で表される。

【００４７】

【数１】 ただし、ΔＡは吸収円二色性スペクトル、Ｓは蛍光検出
円二色性スペクトル、ΔＦは円二色性蛍光励起スペクト
ル、Ａは左右の円偏光に対する試料物質の吸収係数の平
均値である。また、通常の円二色性分散計において（吸
収）円二色性スペクトルΔＡは、試料を透過した左右円
偏光の強度差ΔＩと、その平均値Ｉより下記数２で表さ
れる。

【００４８】

【数２】 いずれのスペクトルでも（吸収）円二色性スペクトルと
比較して１桁ないし２桁高い感度を得ることができる。
これは、例えば通常の紫外可視分光光度計と分光蛍光光
度計で期待される感度の違い、あるいは、ＨＰＬＣにお
いて紫外可視検出器と蛍光検出器で期待される感度の違
い（至適な試料についてはいずれも蛍光のほうが１桁な
いし３桁高い感度が得られる）に匹敵するものであり、
微少量しか用意することができないような試料の測定
に、莫大な恩恵をもたらすものである。

【００４９】さらに、これら２者を比較すると、円二色
性蛍光励起スペクトルはΔＦ、蛍光検出円二色性スペク
トルはＳを測定することになる。この蛍光検出円二色性
スペクトルは、前記数１のように後で係数を演算してΔ
Ａに直すことができ、その解釈方法も確立しているとい
う利点がある。一方、Ｓは全蛍光強度（直流成分信号ｓ
３）で割り算している分だけノイズが大きくなり、さら
に蛍光のない波長領域では分母が０（もちろん分子も
０）となるので、０／０を演算する結果、ノイズがより
拡大してスペクトルの質が著しく低下するという宿命を
もっている。

【００５０】これに対し、円二色性蛍光励起スペクトル
は、ΔＦは割り算しない分だけノイズが極めて少なく、
蛍光のない波長領域でもノイズが拡大することなく、ス
ペクトルの質が確保され、試料の量に対する感度の点で
は、顕著な利点を有する。また、蛍光性夾雑物や、キラ
リティに関与しない蛍光性官能基の影響を受けないの
で、その分、選択性の点でも有利である。また、蛍光で
検出することで選択性も向上し、化合物の特定の部位に
特異的な解析が可能となる。さらに、生のままでは蛍光
をもっていない物質についても、蛍光の官能基を化学的
に導入することにより、高感度に測定解析する道が開け
たこととなり、その効果は極めて大きい。

【００５１】図１３には本発明にかかる円二色性蛍光励
起スペクトルを用いた場合と、従来の蛍光検出励起スペ
クトルを用いた場合との検出感度の比較結果が示されて
いる。同図に示すように、本実施形態にかかる円二色性
蛍光励起スペクトルを示す同図（ａ）は、従来例の蛍光
検出励起スペクトルを示す同図（ｂ）と比較して、蛍光
のない波長域ではノイズが１桁以上低減され、蛍光のあ
る波長域ではノイズが約５０％低減されていることが理
解される。

【００５２】このように本実施形態にかかる円二色性蛍
光励起スペクトル装置を用い、蛍光検出円二色性スペク
トルを得ることも可能であるが、前述した理由からノイ
ズの少ない円二色性蛍光励起スペクトルを得ることによ
り、該スペクトルを用い、試料の適正な分析を行うこと
もできる。このほか、本実施形態においては、下記透過
光モニタ手段を用いることにより、別の信号処理を行う
ことも可能である。

【００５３】透過光モニタ手段 本実施形態においては、図１４（ａ）に示すように、サ
ンプルセル１８を透過した光Ｌ３の通過コース上に、該
透過光Ｌ３を光電変換して透過光強度信号ｓ５とする透
過光側検出器６６を備えることも可能である。透過光側
検出器６６は、例えば光増殖管（ＰＭＴ）よりなり、該
透過光側検出器６６から出力された透過光強度信号ｓ５
は、まず増幅器６８で増幅される。さらに、同図（ｂ）
に示されるように、サンプルセル１８と透過光側検出器
６６との間の光路中に、透過光側検出器６６から出力さ
れる透過光強度信号ｓ５と、蛍光側検出器２０から出力
信号される蛍光強度信号ｓ２とがほぼ同一の強度信号と
なるように、サンプルセル１８からの透過光Ｌ３を減光
して透過光側検出器６６に入射させる減光フィルタ７０
を設けることが可能である。

【００５４】そして、前述のようにして減光フィルタ７
０を設けることにより、透過光強度信号ｓ５と蛍光強度
信号ｓ２とがほぼ同一の強度信号となるように調節した
うえで、透過光側検出器６６から出力される透過光強度
信号ｓ５が常に一定となるように、検出器印加電圧アン
プ７２で透過光側検出器６６の印加電圧を調節し、か
つ、この印加電圧と同じ電圧を蛍光側検出器２０にも印
加して上記測定を行うことにより、例えば光源１２を交
換した場合などのように、前述のようにして得られた円
二色性蛍光励起スペクトルに、光源エネルギの波長依存
性や分光器の波長特性が重畳してしまうのを防ぐことが
できる。

【００５５】このほか、同図（ｂ）において、透過光側
検出器６６と蛍光側検出器２０の印加電圧を、検出器印
加電圧アンプ７２によりそれぞれ一定に固定したうえで
（それぞれの電圧は当然異なる）、透過光側検出器６６
から出力される透過光強度信号ｓ５と、蛍光側検出器２
０から出力される蛍光強度信号ｓ２を同時に得るが、こ
れらの信号は、例えば前記図１に示すＣＰＵ４２に入力
され、ＣＰＵ４２は入力された信号より、前述のように
して円二色性蛍光励起スペクトルと、透過光強度スペク
トルを得る。得られたこれらのスペクトルは記憶手段４
４に別々に入力され記憶される。

【００５６】そして、ＣＰＵ４２は記憶手段４４に適宜
アクセスして各スペクトルを読み出し、読み出された円
二色性蛍光励起スペクトルを透過光強度スペクトルで割
り算することによっても、やはり光源エネルギの波長依
存性や分光器の波長特性が重畳しない円二色性蛍光励起
スペクトルを得ることができる。このように透過光強度
には試料の光吸収は影響を及ぼすが、本実施形態による
測定で一般に測定対象となる試料の濃度は極めて薄く、
そのような試料の光吸収は極わずかであり、実質的に透
過光側検出器６６から出力される透過光強度信号は、光
源エネルギの波長依存性や分光器の波長特性のみを反映
していると見なすことができる。

【００５７】したがって、前述のようにして透過光側検
出器６６から出力される透過光強度信号が一定となるよ
うに、検出ゲインを設定することにより、これらの影響
を確実にスペクトルから除くことができる。このほか、
本実施形態においては、同図に示す装置において、蛍光
検出円二色性スペクトルを求め、この蛍光検出円二色性
スペクトルより、さらに円二色性スペクトルを得ること
も可能である。すなわち、蛍光側検出器２０の印加電圧
を一定にしておいて直流成分信号ｓ３と交流成分信号ｓ
４を別々に得、ＣＰＵ４２が前記交流成分信号ｓ４を直
流成分信号ｓ３で割り算することにより、蛍光検出円二
色性スペクトルを得ることが可能である。

【００５８】同様にして透過光側検出器６６から出力さ
れる透過光強度信号ｓ５（透過光強度信号ｓ５の直流成
分信号ｓ５_DC，交流成分信号ｓ５_AC）も前記蛍光強度信
号ｓ２と同時に得、これと試料のない溶媒だけのときの
透過光強度のスペクトルとの比の逆数の対数をとり吸光
度スペクトルとし、前記蛍光円二色性スペクトルを該吸
光度スペクトルで割り算することにより、円二色性スペ
クトルを得ることも可能である。さらに、本実施形態に
おいては、下記異常光モニタ手段を用いることにより、
別の信号処理を行うことも可能である。

【００５９】異常光モニタ手段 本実施形態においては、図１５に示すように、励起側の
分光器１４の中から異常光を取り出し、その強度を異常
光側検出器７４でモニタし、モニタされた異常光強度デ
ータで、前記交流成分信号ｓ４を割り算することによ
り、光源エネルギの波長依存性を補正し、かつ、その時
間変動を補正することが可能である。すなわち、本実施
形態のように検出感度の向上を図るため、直流成分信号
ｓ３による割り算を除いた結果、例えば光源１２を交換
した場合など、蛍光強度信号ｓ２には、光源エネルギの
波長分布、光源エネルギの時間ドリフトという好ましか
らぬ要素が含まれるおそれがある。そこで、実施形態に
おいては、これらの影響を避けるため、励起側の分光器
１４で直線偏光をつくり出すときに不要となる異常光
（常光と同じ強度がある）を異常光側検出器７４でモニ
ターする。

【００６０】異常光側検出器７４から出力された異常光
強度信号は、まず増幅器７６で増幅され、さらに例えば
前記図１に示すＡ／Ｄ変換器３２、Ｉ／Ｏ装置３４を介
して、ＣＰＵ３２に入力される。そして、ＣＰＵ４２
は、波長走査速度を考慮したうえで、入力されたデータ
に十分な時定数τを掛けて平滑化し、この平滑化された
データで、前記交流成分信号ｓ４を割り算することによ
り、光源エネルギの波長分布、光源エネルギの時間ドリ
フトを補正することができる。

【００６１】また、前述のようにデータのレベルで割り
算する代わりに、異常光側検出器７４から出力される異
常光の検出レベルが一定となるように異常光側検出器７
４のゲインをコントロールし、さらにそのコントロール
レベルを蛍光側検出器２０の印加電圧にもフィードバッ
クさせることにより（ダイノードフィードバック）、同
様の効果を得ることもできる。

【００６２】

【発明の効果】以上説明したように本発明にかかる円二
色性蛍光励起スペクトル測定装置によれば、サンプルセ
ルと蛍光測定手段の間に集光系を介さず、かつ、該サン
プルセルと蛍光測定手段を近接させたので、試料から放
射された蛍光の大部分を蛍光測定手段に入射させること
ができる。これにより蛍光の集光効率の向上を図ること
ができるので、検出感度の向上を図ることもできる。な
お、前記装置において蛍光波長選択手段として励起光の
散乱光の波長域の光を選択的に吸収して除去することが
可能なカットオフフィルタを用いることにより、回折格
子を用いた分光器の場合に比較し光のロスが少なくなる
ので、検出感度の向上を図ることができる。また、前記
装置においてサンプルセルを透過した光の通過コース上
に設けられ、該透過光を除去する光トラップを備えるこ
とにより、励起光の散乱光が蛍光測定手段に入射してし
まうのを防ぐことができるので、該励起光の散乱光によ
る測定妨害を大幅に低減することができる。さらに、透
過光が反射して逆の円偏光となって再び試料の励起に関
わり、正当な円二色性蛍光励起スペクトルの取得を妨害
することを防ぐことができる。また、前記装置において
サンプルセルを間に挟み蛍光測定手段の反対側に、その
鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サンプルセル
内の試料から放射された蛍光のうち、蛍光測定手段の反
対方向に放射された蛍光を入反射して蛍光測定手段へ導
く凹面鏡を備えることにより、あるいは、該凹面鏡に代
わり、実質的に前記サンプルセル外周面のほぼ全周に亘
り、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サン
プルセル内の試料から放射された蛍光を入反射して、サ
ンプルセルと蛍光測定手段の間の光路中へ導く内面反射
型の反射鏡を備えることにより、蛍光測定手段方向とは
異なる方向へ放射された蛍光でも集光して蛍光測定手段
へ入射させることができるので、検出感度の向上を図る
ことができる。また、前記装置において、サンプルセル
内の試料の高さと励起光波長選択手段からの励起光束の
ビーム径とがほぼ一致するように、高低調節手段により
サンプルセルの高さを調節することにより、サンプルセ
ル内に入れる試料量を励起光束のビーム径とほぼ同一の
高さの必要最低限の量で蛍光測定を行うことができるの
で、試料の利用効率の改善を図ることができる。さら
に、前記装置においてサンプルセルは円筒形よりなるも
のを用い、例えば励起光束のビームの形状ととほぼ同様
の円形である円筒形セルの端部より励起光束を入射させ
ることにより、角形よりなるものを用いた場合に比較
し、励起光束の照射されない試料部分を大幅に低減する
ことができるので、必要最低限の試料量で蛍光測定を行
い、試料を利用効率の向上を図ることができると共に、
角形のものに比較し励起光束が入射されるセル窓板の歪
みが少ないので、得られるスペクトルの質的な向上を図
ることもできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態にかかる円二色性蛍光励起
スペクトル測定装置の概略構成の説明図である。

【図２】図２（ａ）は円偏光変調器の周波数信号の１
例、図２（ｂ）は検出器の出力信号の１例、図２（ｃ）
は左右の円偏光で励起したときの励起スペクトルの１例
である。

【図３】円二色性蛍光励起スペクトルの１例である。

【図４】図４（ａ）は従来のサンプルセルと検出器の配
置状態の説明図、図４（ｂ）は図１に示す装置において
好適なサンプルセルと検出器の配置状態の説明図であ
る。

【図５】図１に示す装置において好適な内面反射型の筒
形鏡の説明図である。

【図６】図１に示す装置において好適な導光パイプの説
明図である。

【図７】サンプルセルの形状の違いによる集光効率の違
いの説明図である。

【図８】サンプルセルの形状の違いによる試料の利用効
率の違いの説明図である。

【図９】図１に示す装置において好適なサンプルセルの
高低調節手段の説明図である。

【図１０】一般的な円二色性スペクトルの１例である。

【図１１】一般的な希薄試料の円二色性スペクトルの１
例である。

【図１２】前記図１２に示す希薄試料と同様の希薄試料
の円二色性蛍光励起スペクトルの１例である。

【図１３】前記図１２に示す円二色性蛍光励起スペクト
ルを用いた場合と、蛍光検出円二色性スペクトルを用い
た場合の検出感度の比較説明図である。

【図１４】図１に示す装置に透過光モニタ手段を用いた
データ処理方法の説明図である。

【図１５】図１に示す装置に異常光モニタ手段を用いた
データ処理方法の説明図である。

【符号の説明】

１０ 円二色性蛍光励起スペクトル測定装置 １２ 光源 １４ 分光器（励起光波長選択手段） １６ 円偏光変調器 １８ サンプルセル １９ カットオフフィルタ（蛍光波長選択手段） ２０ 検出器（蛍光測定手段） ｓ１ 変調周波数信号 ｓ２ 蛍光強度信号 ｓ３ 直流成分信号 ｓ４ 交流成分信号

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光源と、 前記光源から出た光束のうち、所定波長の励起光束のみ
   を通過させる励起光波長選択手段と、 前記励起光波長選択手段からの光束を所定の変調周波数
   で交互に左右の円偏光とする円偏光変調器と、 試料が入れられ、前記円偏光変調器を通過した左右の円
   偏光が交互に照射されるサンプルセルと、 前記サンプルセル内の試料から放射された蛍光のうち、
   所定波長の蛍光のみを通過させる蛍光波長選択手段と、 前記蛍光波長選択手段からの蛍光を蛍光強度信号とする
   蛍光測定手段と、該蛍光強度を検出した電気信号のう
   ち、該変調周波数に同期して交流成分を取り出して円二
   色性蛍光励起スペクトルとする信号処理手段と、 を備え、前記サンプルセルと蛍光測定手段の間に集光系
   を介さず、かつ、該サンプルセルと蛍光測定手段を近接
   させたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測
   定装置。
2. 【請求項２】 請求項１記載の装置において、前記蛍光
   波長選択手段はカットオフフィルタであり、該カットオ
   フフィルタにより励起光の散乱光の波長域の光を選択的
   に吸収して除去することを特徴とする円二色性蛍光励起
   スペクトル測定装置。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載の装置において、
   前記サンプルセルを透過した光の通過コース上に設けら
   れ、該透過光を除去する光トラップを備えたことを特徴
   とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３の何れかに記載の装置
   において、前記サンプルセルを間に挟み蛍光測定手段の
   反対側に、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、
   該サンプルセル内の試料から放射された蛍光のうち、蛍
   光測定手段の反対方向に放射された蛍光を入反射して蛍
   光測定手段へ導く凹面鏡を備えたことを特徴とする円二
   色性蛍光励起スペクトル測定装置。
5. 【請求項５】 請求項１ないし３の何れかに記載の装置
   において、実質的に前記サンプルセル外周面のほぼ全周
   に亘り、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該
   サンプルセル内の試料から放射された蛍光を入反射し
   て、蛍光測定手段へ導く内面反射型の反射鏡を備えたこ
   とを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
6. 【請求項６】 請求項１ないし５の何れかに記載の装置
   において、前記サンプルセル内の試料の高さは、前記励
   起光束のビーム径とほぼ同一の高さであり、 また底部が高さ調節自在で、該高さ調節が自在の底部上
   に前記サンプルセルが設けられたセルホルダと、 前記セルホルダ底部の高さを調節可能な高低調節手段
   と、 を備え、前記サンプルセル内の試料の高さと励起光波長
   選択手段からの励起光束のビーム径とがほぼ一致するよ
   うに、前記高低調節手段によりサンプルセルの高さを調
   節することを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測
   定装置。
7. 【請求項７】 請求項１ないし６の何れかに記載の装置
   において、前記サンプルセルは円筒形よりなることを特
   徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。