WO2022064714A1 - 赤外域の円二色性測定装置 - Google Patents

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優 清水
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Definitions

  • the present invention relates to an infrared CD (so-called vibration circular dichroism) measuring device.
  • Vibrational circular dichroism measuring devices related to vibration transitions have been applied to structural analysis of pharmaceuticals and bioactive substances because they have good comparison between the spectrum obtained by measurement and the spectrum predicted by calculation from the molecular structure. ..
  • Patent Document 1 discloses a method for measuring vibration circular dichroism using a Fourier transform type CD spectrophotometer.
  • FT type Fourier conversion type
  • An example of the configuration of the FT type CD spectrophotometer is an infrared light source ⁇ an interferometer ⁇ a polarization modulator (PEM) ⁇ a cell unit (sample) ⁇ an MCT detector ⁇ a signal processing unit (lock-in amplifier, etc.) ⁇ a Fourier transform unit ( Computer etc.).
  • PEM polarization modulator
  • the interference wave of infrared light becomes an interference wave consisting of right-handed and left-handed circularly polarized waves alternately generated by PEM, irradiates the sample, and is detected by the MCT detector.
  • the interference wave detection signal (called an interferogram)
  • the difference in absorbance ( ⁇ A) between the left and right circularly polarized light appears as a periodic change in signal intensity. That is, since the interference wave detection signal contains an alternating current component (AC) and a direct current component (DC) that are synchronized with the polarization modulation of the PEM, these are extracted by a lock-in amplifier or the like, and the ratio (AC / DC) of the two is calculated. calculate.
  • the detected signal is an interference wave signal
  • the CD spectrum in the infrared region is finally obtained by Fourier transform on a computer.
  • the measurement accuracy will theoretically be better if the sample with the highest absorbance A is measured.
  • the higher the absorbance A of the sample the smaller the amount of light detected and the weaker the detection signal, so the influence of noise becomes greater and the difference in absorbance cannot be measured.
  • the absorbance A of the sample is 1.5 to 2 at the highest, usually around 1.
  • the absorbance A is defined by the following equation.
  • L the optical path length
  • c the molar concentration
  • ⁇ the molar extinction coefficient
  • I 0 the intensity of the incident light
  • I the intensity of the emitted light.
  • the molar concentration c or the optical path length L of the cell is changed to adjust the absorbance A of the sample to at most 1.5 to less than 2.
  • the absorbance often exceeds 2, and it is difficult to obtain a CD signal in the infrared region.
  • An object of the present invention is for a sample in which the absorbance of the sample is 2 or more (for example, in the range of 2 to 5) and the measurement conditions are disadvantageous because the amount of light cannot be sufficiently detected by a conventional measuring device. Further, it is an object of the present invention to provide an infrared region dichromaticity measuring device capable of measuring an infrared region CD having an appropriate SN ratio.
  • the inventors focused on a quantum cascade laser (QCL), which is an infrared laser but has a high-brightness, high-output, and wide-band variable wave frequency function, and uses this infrared laser light as the measurement light for infrared CD measurement.
  • QCL quantum cascade laser
  • the circular dichroism measuring device in the infrared region includes a laser light source capable of sweeping the wave number of the laser light within the wave number region including at least one absorption peak of the sample.
  • a detector that detects changes in the intensity of laser light that has passed through the sample and whose polarization state has been modulated, and An alternating current component (AC) and a direct current component (DC) synchronized with the modulation frequency are extracted from the detection signal of the detector, and the infrared circular dichroism value of the sample is calculated based on the ratio of the two (AC / DC). It is characterized by including a signal processing unit for calculation.
  • AC alternating current component
  • DC direct current component
  • the laser light source is a quantum cascade laser (QCL). Further, the average output when the laser light is output from the laser light source in the continuous mode of the maximum power is 1 mW or more, and the oscillation line width of the laser light is 0.05 to 4.0 cm -1 . preferable.
  • the signal processing unit calculates the value of the infrared circular dichroism for each specific wave number to be swept and acquires the infrared CD spectrum of the sample.
  • a gain switching optical element placed at any position on the optical path of the laser beam and It is preferable to provide a switching means for adjusting the amount of light entering the detector by switching the gain switching optical element according to the sweep wave number of the laser light.
  • the signal processing unit includes a gain switching electric element that electrically switches the intensity of the analog signal according to the number of sweep waves of the laser light to reduce the quantization error at the time of AD conversion.
  • the chopper is provided at any position on the optical path of the laser beam and the passage rate of the chopper is 70% or more.
  • the signal processing unit is A storage unit that holds the absorption peak wavenumber of water or water vapor, A determination unit for determining whether the sweep wave number of the laser beam matches the absorption peak wave number of the water or water vapor, and It has an avoidance unit that executes a process of avoiding the influence of the absorption peak when they match.
  • the avoidance unit is configured to calculate the infrared CD value in the absorption peak wave number of water or water vapor based on the infrared CD value of the sweep wave number before and after the absorption peak wave number of water or water vapor by the laser beam. It is preferable to have.
  • an infrared laser having a wave number selected from high brightness, high output, and a wide band is provided by providing a laser light source capable of sweeping the laser light in the infrared range in a predetermined wave number range.
  • Light can be used as the measurement light.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the CD measurement optical system which constitutes the CD measurement apparatus in the infrared region. It is a figure which shows the structure of the light source system of a Fourier transform type. It is a figure which shows the structure of a laser light source system. The figure which superposed the wave number tuning curve for each semiconductor chip of QCL. It is a figure which shows the change of the intensity of a laser beam when the wave number is swept from 1750 cm -1 to 1500 cm -1 . The figure which shows the oscillation line width of the laser beam of 1675.5cm -1 of QCL. It is a figure which shows the whole structure of the infrared region CD measuring apparatus using a laser beam. It is a spectral diagram which shows the effectiveness of N 2 purge.
  • an infrared CD spectrum diagram obtained by measuring a sample with an integration time of 20 minutes.
  • the figure which shows the test result using the rotary chopper of FIG. (A) to (D) are 100% line diagrams for showing the effect of the water vapor absorption avoidance treatment of the present embodiment.
  • (A) to (D) are diagrams of AC / DC signals for showing the effect of the water vapor absorption avoidance treatment of the present embodiment.
  • FIG. 1 shows a CD measuring optical system 10 constituting a CD measuring device in the infrared region.
  • the CD measurement optical system 10 arranges the optical element on the movable block 11, the optical filter 12, the polarizing element 13, the PEM 14, the sample chamber 15, the condenser lens 16, and the MCT detector 17 in this order along the optical axis of the measurement light.
  • the measurement light is configured to be selectable from "infrared interference wave light" and "infrared laser light”.
  • the infrared interference wave light is supplied from the Fourier transform type light source system 20 (see FIG. 2).
  • the laser light is supplied from the laser light source system 30 (see FIG. 3).
  • Two types of optical elements an elliptical mirror 11a for infrared interference waves and a plane mirror 11b for lasers
  • the movable block 11 is slid so that one of the optical elements is the optical axis of the CD measurement optical system.
  • the selected measurement light is limited to light in a desired wavenumber range by the optical filter 12, and only the linearly polarized light component is extracted by the polarizing element 13 and sent to the PEM 14.
  • the optical axis direction of the polarizing element 13 and the main axis direction of the PEM 14 intersect at 45 degrees when viewed from the optical axis direction.
  • the linearly polarized light from the splitter 13 is modulated in its polarization state by the PEM 14.
  • the phase difference ⁇ between two polarized components orthogonal to each other in linear polarization is modulated. Modulation of the phase difference ⁇ is usually performed by a sine curve, and along with this, counterclockwise and clockwise circular polarizations are alternately emitted from the PEM 14 toward the sample chamber 15.
  • the positional relationship between the PEM 14 and the sample chamber 15 is not limited to FIG. 1, and the PEM 14 can be arranged closer to the detector than the sample chamber 15.
  • the solution sample in the cell put it in the sample chamber 15.
  • the sample in the cell is alternately irradiated with the left and right circularly polarized light from the PEM, the transmitted light is condensed by the condenser lens 16, and the light intensity is detected by the MCT detector 17.
  • the measurement light When the measurement light is an infrared interference wave, it becomes a linearly polarized interference wave by the polarizing element 13 and is phase-modulated by the PEM 14, so that the sample receives the interference wave composed of the left and right circularly polarized components.
  • the measurement light when the measurement light is an infrared laser light, it becomes a linearly polarized laser light by the polarizing element 13 and is phase-modulated by the PEM 14, so that the sample receives the laser light composed of the left and right circularly polarized components. If the directivity of the infrared laser light is high, the condenser lens 16 may be omitted.
  • the detector 17 is not limited to the MCT detector, but is a detector using a quantum detection element such as a Si photodiode, an InSb detector, or an InGaAs detector, or a detector using a pyroelectric element such as TGS or DLaTGS. May be appropriately selected.
  • a quantum detection element such as a Si photodiode, an InSb detector, or an InGaAs detector
  • a detector using a pyroelectric element such as TGS or DLaTGS. May be appropriately selected.
  • FIG. 2 shows the configuration of a Fourier transform type light source system (IR light source 21 ⁇ elliptical mirror 22 ⁇ aperture 23 ⁇ Michelson interferometer 24 ⁇ parabolic mirror 25 on the emitting side ⁇ aperture 26).
  • the Michelson interferometer 24 is composed of a parabolic mirror 24a on the incident side, a beam splitter (BS), a fixed mirror 24b, and a moving mirror 24c.
  • One parallel light flux divided by the BS reflects the fixed mirror 24b and returns to the BS, and the other parallel light flux divided by the BS reflects the moving mirror 24c and returns to the BS as well.
  • the two parallel luminous fluxes are combined by the BS and emitted as interference waves toward the parabolic mirror 25.
  • the moving mirror 24c generates an interference wave (interferogram) corresponding to the variable optical path difference D.
  • the light of the infrared interference wave reflects the parabolic mirror 25 on the emitting side, advances to the elliptical mirror 11a of the movable block 11 of the CD measurement optical system 10, and is used as the measurement light.
  • FIG. 3 shows the configuration of the laser light source system 30 characteristic of this embodiment.
  • the laser light source system 30 uses a quantum cascade laser (QCL) as an infrared light source to supply infrared laser light having a specific wave number selected from high luminance, high output, and wide band.
  • QCL quantum cascade laser
  • the QCL is provided with one or a plurality of semiconductor chips having an active region of a multilayer semiconductor structure. Since the injected electrons pass through the layer of the active region like a waterfall and a large number of photons are emitted, the laser gain is high and the wavenumber range is wide. For example, when four semiconductor chips (QCL-1 to QCL-4) are used and the wavenumber range is expanded to the fingerprint region (1850 to 890 cm -1 ), the wavenumber tuning curve for each semiconductor chip is superimposed on FIG. Shown.
  • the wave number range of QCL-1 is about 1850 to 1500 cm -1
  • the wave number range of QCL-2 is about 1750 to 1400 cm -1
  • the wave number range of QCL-3 is about 1500 to 1100 cm -1
  • the wave number range of QCL-4 is about. It may be 1300 to 890 cm -1 . When converted to the wavelength range, it is 5.4 to 11.2 ⁇ m.
  • the wave number of the output laser beam changes depending on the built-in drive unit 31.
  • a resonator (cavity) as a drive unit sweeps the output wavenumber.
  • FIG. 5 shows the change in the intensity of the laser beam when the wave number is swept from 1750 cm -1 to 1500 cm -1 using only the QCL-2.
  • the spectral shapes of a standard infrared light source of a Fourier transform infrared spectrophotometer (FTIR) measured under the same conditions are arranged.
  • the average output when the laser beam is output in continuous mode with a wave number of 1600 cm -1 (maximum power) is about 300 mW.
  • the average output of the trial laser is at least 1 mW or more, a detection signal with better quality than the detection signal by the conventional measuring device can be obtained. It is preferably 10 mW or more, more preferably 100 mW or more. If a laser with an average output of about 1 mW to several hundred mW is used, the quality of the detection signal is improved in proportion to the output. If a laser having a large average output is used, restrictions such as sample burnout and saturation of the detector sensitivity occur. Therefore, a laser having an average output of at most 1 W to 10 W is preferable.
  • the output to be burnt out differs depending on the sample and the amount of detected light also changes, it is preferable to select the average output of the laser that can most exert the effect of the present invention according to the sample.
  • a gain switching means such as a dimming device
  • the dimming rate of the laser light can be adjusted, so that it is actually possible to mount a laser having a larger average output.
  • the oscillation line width of the laser beam of 1675.5 cm -1 of QCL is enlarged and shown in FIG.
  • the full width at half maximum of the laser beam in FIG. 6 is 0.13 cm -1 .
  • the oscillation line width (full width at half maximum) of the laser beam is preferably about 0.05 to 4.0 cm -1 .
  • the characteristics of the QCL laser beam are that (1) the wave number range that can be swept is wide, (2) the output is surprisingly strong, and (3) the oscillation line width (full width at half maximum) is very narrow.
  • the QCL outputs a laser beam having a specific wave number in a continuous mode (CW mode).
  • CW mode continuous mode
  • a QCL in which the pulse mode can be selected may be used, but the CW mode has a larger detection signal and better measurement accuracy.
  • the movable block 33 is equipped with optical elements (an ellipsoidal mirror 33c on the entrance side, an aperture 33d, and an ellipsoidal mirror 33e on the exit side) for forming an optical path passing through the aperture. ..
  • optical elements an ellipsoidal mirror 33c on the entrance side, an aperture 33d, and an ellipsoidal mirror 33e on the exit side
  • the infrared laser beam from the QCL becomes an intermittent laser beam according to the passing rate of the rotary chopper 32.
  • the laser light passes through an optical path on the movable block, further passes through the dimming device set 35, and proceeds to the plane mirror 11b on the movable block 11 of the CD measurement optical system 10 to be used as measurement light.
  • the circular dichroism CD of the sample is defined by the formula (2).
  • Circular dichroism CD is the difference ( ⁇ A ) between the absorbance AL of the sample for left circular polarization and the absorbance AR of the sample for right circular polarization, and is the left circular polarization transmitted through the sample as shown in equation (2). It is shown by the common logarithm of the ratio of the light intensity IL of the right circular dichroism to the light intensity IR of the right circular polarization. The light intensity I 0 is the intensity of the incident light on the sample. Since the difference in absorbance ⁇ A is a dimensionless number, it is usually converted into an ellipticity (CD [mdeg]) as shown in the following equation (3).
  • the CD value can be measured.
  • FIG. 7 shows the overall configuration of an infrared CD measuring device that uses an infrared laser beam.
  • the configuration of the signal processing means 40 preamplifier 41, lock-in amplifier 42 for DC signal, lock-in amplifier 43 for AC signal, PEM controller 44, A / D converter 45, data logger 46, computer, etc.
  • the arithmetic processing device 47 of the above is also shown.
  • the light intensity signal from the detector 17 is amplified by the preamplifier 41, and each signal of the DC component and the AC component is sent from the preamplifier 41 to the lock-in amplifiers 42 and 43, respectively.
  • the lock-in amplifier 42 for a DC signal extracts a DC signal from the signal of the DC component of the preamplifier by using a reference signal synchronized with the chopping frequency. That is, the signal value of the DC component in the light blocking period of the rotary chopper 32 and the signal value of the DC component in the passing period of the rotary chopper 32 are extracted and recorded in the data logger 46. The difference between the signal values during the shading period and the passing period is treated as a DC signal.
  • the lock-in amplifier 43 for the AC signal uses a reference signal synchronized with the drive frequency of the PEM 14 to extract an AC signal having the same frequency component as the PEM 14 from the signal of the AC component of the preamplifier 41 and records it in the data logger 46. do.
  • the DC signal and the AC signal are digitized by the A / D converter 45.
  • the arithmetic processing device 47 reads an AC signal and a DC signal from the data logger 46, obtains a ratio (AC / DC) of both signals, and calculates an infrared CD value based on the equation (4).
  • the arithmetic processing apparatus 47 calculates the infrared region CD value for each wave number selected in the QCL, so that the infrared region CD spectrum data can be obtained.
  • the arithmetic processing apparatus reads the AC signal and the DC signal from the data logger 46 and performs Fourier transform processing on the value of the ratio (AC / DC) of both signals to obtain CD spectrum data in the infrared region.
  • the formula in which "AC / DC” in the above formula (4) is replaced with "F [AC / DC]” is an approximate formula for the CD value using the Fourier transform.
  • F [] in the equation represents the Fourier transform.
  • the preamplifier 41 of the signal processing means 40 sends the signal of the DC component filtered by 400 Hz to the lock-in amplifier.
  • the wave number of the laser beam was swept in the range of 1750-1500 cm -1 , and the light intensity was detected by the MCT detector in 1 cm -1 step.
  • the step speed is 500 msec / cm -1 .
  • the results are shown in spectrum A in FIG. It can be seen that without purging, the influence of absorption by water vapor in each housing is large over the entire wave number.
  • the wave number of the laser beam is fixed at 1635 cm -1 , and the inside of the housing containing the CD measurement optical system 10 and the laser light source system 30 is purged with N 2 at a gas supply amount of 6 L / min.
  • Each housing is provided with a purging device that can be independently controlled. Most of the laser light with a wave number of 1635 cm -1 is absorbed by the water vapor inside the device, so it is suitable for evaluating the effectiveness of the N2 purge.
  • FIG. 9 shows the change in the intensity of the laser beam having a wave number of 1635 cm -1 from the start of purging to the lapse of 90 minutes. It can be seen that the replacement with nitrogen is greatly promoted by purging for a relatively short time of about 1 hour, and purging for 2 hours is sufficient.
  • the spectrum B was measured in the state of “after 90 minutes of purging”. It was found that the absorption peak due to water vapor etc. was significantly reduced, and the influence of absorption of water vapor etc. was greatly reduced in a relatively short purge time.
  • FIG. 11 shows a spectrum measured in the state of "after purging for 120 minutes” and similarly drawn with a 100% transmittance line.
  • FIG. 13 shows the change in the intensity of the laser beam having a wave number of 1635 cm -1 from the start of purging to the elapse of 120 minutes.
  • the strength which was about 28 mW at the start of purging, surged in the first 30 minutes and reached around 120 mW 60 minutes later.
  • Table 1 the preliminary measurements shown in Table 1 below were performed.
  • Table 1 shows the results of measuring the intensities of the two types of laser light, the wave number 1635 cm -1 and the wave number 1600 cm -1 , which are not easily affected by the absorption of water vapor, by placing a power meter directly under the QCL.
  • the intensity at the outlet (“connecting portion”) of the laser light source system 30 was also measured using the experimental device of FIG. All measurements were taken in the "no purge” state.
  • the values in parentheses in the table are the measured values at the time of quadruple expansion.
  • the strength value in the sample chamber is also shown.
  • the infrared CD measuring device of the present embodiment can exert the purging effect in a short time by providing the N 2 purging device in each housing.
  • the infrared CD measuring device having the configuration shown in FIG. 7, the infrared CD spectrum of a solution sample in which bi-2-naphthol was dissolved in a chloroform solvent was measured.
  • the wave number range of the QCL laser beam was set to 1650-1500 cm -1
  • the chopping frequency of the chopper was set to 500 Hz
  • the transmittance of the dimming device (for example, ND filter) was set to 2% (98% dimming).
  • the transmitted light of the sample was detected by the MCT detector with the modulation frequency of the PEM set to 50 kHz.
  • the inside of the housing containing the CD measurement optical system 10 and the laser light source system 30 was purged with N 2 for 120 minutes at a gas supply amount of 6 L / min.
  • the wave number of the laser light was swept 3 times in the range of 1650-1500 cm -1 , and the light intensity was detected by the MCT detector in 1 cm -1 step, and the average value was calculated.
  • the infrared CD spectrum is shown in FIG.
  • FIG. 15 shows the measurement results of the Fourier transform CD spectrophotometer.
  • the infrared CD spectrum measured by the infrared CD measuring device has the following notable points. First, it is clear from the comparison with the infrared CD spectrum measured by the Fourier transform type CD spectrophotometer that the wavenumber resolution is very high.
  • the influence of absorption of water vapor and the like in the wavenumber range of 1650-1500 cm -1 is significantly reduced by N 2 purging for 120 minutes. Then, it can be said that the influence of water vapor and the like is small even in the infrared CD spectrum of FIG. 14, and it can be said that even a minute CD peak that cannot be measured by the Fourier transform type CD spectrophotometer can be measured.
  • the measurement range (vertical axis) of the infrared CD spectrum with the Fourier transform CD spectrophotometer is from about -0.0001 to +0.0001.
  • the measurement range is about 1000 times wider, from about -0.08 to +0.08. That is, the detection signal from the detector becomes large due to the laser light having a very strong output as shown in FIG. 6, and the detection sensitivity of the absorbance A is raised. Along with this, it has become possible to acquire an infrared CD signal with a very large value, which could be measured only by a very weak one in the past.
  • the second reason is that a laser beam with a profile (half-value full width 0.13 cm -1 ) close to the ideal single wavenumber light as shown in Fig. 6 was used.
  • the advantages of the apparatus of this embodiment can be deepened by raising the problems in the conventional distributed CD spectrophotometer.
  • a distributed CD spectrophotometer using a diffraction grating is the mainstream.
  • the bandwidth (full width at half maximum) of the light extracted from the distributed spectroscope can be set to about 1/10 or less of the half width of the absorption peak of the sample. It is said to be good. For example, if the absorption peak having a half width of 15 nm is measured with pseudo-monochromatic light having a bandwidth of 2 nm, the error of the measured value can be suppressed to a small value.
  • Bandwidth is determined by the width of the slit built into the spectroscope. Therefore, it cannot be said that the bandwidth should be simply set small. This is because when the bandwidth is reduced, the light illuminating the sample is weakened and noise increases.
  • the apparatus of this embodiment is excellent in that the full width at half maximum of the laser light of a specific wave number swept is narrow enough to be said to be ideal monochromatic light, and the output of the laser light can be maintained in a high state. Is. As a result, a strong detection signal is obtained from the detector, and the measurement sensitivity of the infrared CD value is improved. In Fourier transform type and distributed type CD spectrophotometers, the detection signal tends to be weakened by narrowing the luminous flux of the interference wave with an aperture or narrowing the bandwidth of monochromatic light with a slit, and the SN ratio is high. The absorbance of the sample had to be adjusted to less than 1.5-2 at the highest to the extent that it did not deteriorate. The apparatus of this embodiment is very excellent in that there are no restrictions on the absorbance of such a sample.
  • FIG. 16 shows the results of infrared CD spectrum measurement of an amino acid solution sample (Fmoc-Leucine) adjusted to an absorbance of 4 using the apparatus of this embodiment with a resolution of 0.0001 ⁇ A.
  • 17 (A) and 17 (B) show the results of measuring the infrared CD spectrum of a pinene solution sample (( ⁇ )- ⁇ -pinene) with an integration time of 20 minutes using the apparatus of this embodiment.
  • Two types of element sizes (diameter 1 mm, diameter 0.2 mm) of the MCT detector were used, and in both measurements, a sensitive infrared CD spectrum was obtained in a short integration time.
  • the switching means 37 of the dimming device set 35 of FIG. 3, which is characteristic of the present embodiment, will be described.
  • the dimming device set 35 is composed of one or a plurality of dimming elements 35a and 35b, and is provided with a switching means 37 capable of independently switching the individual dimming devices 35a and 35b online / offline. ..
  • a switching means 37 capable of independently switching the individual dimming devices 35a and 35b online / offline. ..
  • two dimming elements 35a and 35b having a transmittance of 2% are used. Since the total transmittance when two sheets are online at the same time is 0.04%, the switching means 37 switches the total transmittance by the dimming device set 35 to 100%, 2%, and 0.04%. It is possible.
  • the dimming device set 35 may be arranged at any position on the optical path of the laser beam.
  • the measurement gain is optically switched by using the switching means 37 of the dimming device set 35.
  • the wave number of the laser beam is swept to perform background measurement.
  • Gain is set individually for the wave number at which the obtained output is below the reference value. For example, when the light to the detector 17 is dark, it is advisable to take both the dimming elements 35a and 35b offline. On the contrary, for the wave number whose output in the preliminary measurement is too strong, it is preferable to bring both the dimming elements 35a and 35b online.
  • the measurement conditions are stored in the storage unit 49.
  • the measurement gain is optically switched for each wavenumber sweep according to the stored set value.
  • the fluctuation of the amount of light to the detector 17 according to the sweep wave number of the laser light can be suppressed to a small extent.
  • the wave number may decrease due to the high absorbance of the sample. Even for such a wave number, the amount of dimming can be adjusted by setting measurement conditions such as taking the dimming elements 35a and 35b offline.
  • the above optical gain switching means 37 facilitates measurement of the infrared CD spectrum of a sample having high absorbance.
  • the gain is optically changed by the dimming elements 35a, 35b, etc.
  • the baseline of the spectrum is deviated.
  • ⁇ Electrical gain switching means Similar to optical gain switching, electrical gain switching can also be adopted.
  • the gain switching electric element 48 provided in the signal processing means 40 of FIG. 7 electrically amplifies the strength of the analog signal with respect to the wave number at which the output becomes low, and the A / D converter 45. The quantization error may be reduced.
  • the chopper 32 is provided for acquiring an infrared absorption signal (DC signal), and is not limited to the position shown in FIG. 7, and may be located at any position on the optical path of the laser beam.
  • DC signal infrared absorption signal
  • the signal strength of the infrared CD signal is very weak, 1/1000 or less, compared to the infrared absorption signal. Chopping causes a further decrease in the intensity of the CD signal in the infrared region, and at the same time, the SN ratio is also reduced.
  • the passing rate of the chopper 32 is set to 70% or more based on the test results using the rotary choppers having three passing rates (50%, 75%, 83%).
  • FIG. 18 shows an example of a rotary chopper with a passing rate (also called Duty) of 83% used in the chopping test.
  • the rib portion extending in five directions from the central portion functions as a light-shielding portion.
  • FIG. 19 shows changes in the intensities of the DC signal and the AC signal extracted from the detected signal.
  • the fluctuation of the signal strength in the three sweep wave numbers (1595 cm -1 , 1600 cm -1 , 1605 cm -1 ) is within the allowable range, and the appropriate DC signal (Fig. (A)) and AC signal (same).
  • Figure (B)) could be obtained.
  • the signal processing means 40 of FIG. 7 further includes a storage unit 49 having a known absorption peak wave number of water or water vapor, and a determination unit 51 for determining whether or not the sweep wave number of the laser light matches these absorption peak wave numbers. And an avoidance unit 52 for avoiding the influence of the absorption peak when they match.
  • the determination unit 51 and the avoidance unit 52 are incorporated in the arithmetic processing means 47.
  • the influence of the absorption peak of water or water vapor on the infrared CD measurement of the present embodiment is large. Especially in the "no purge" state, the individual absorption peaks are sharp and are detected very sensitively.
  • the avoidance unit 52 uses the infrared region CD value obtained by the laser light of the sweep wave number before and after the absorption peak wave number of water or water vapor, and sets the average value or the like as the infrared region CD in the absorption peak wave number of water or water vapor. Calculate as a value. As a result, it is possible to reduce water or water vapor noise caused by the sharpness of the detection sensitivity of the QCL laser beam.
  • FIG. 20 (A) shows a line acquired by sweeping the wave number in 0.5 cm -1 step.
  • the lines of FIGS. 20 (B) to 20 (D) are lines obtained by extracting only the strength information for 1.0 cm -1 step from FIG. 20 (A).
  • the line in FIG. 20B is before the avoidance process.
  • the storage unit 49 stores in advance two sets of wave numbers to be avoided as shown in Table 2 (removal 1 and removal 2). These wavenumber sets contain wavenumber information that can empirically produce particularly large water vapor peaks.
  • the water vapor peak at the wave number of removal 1 is larger than the water vapor peak at the wave number of removal 2.
  • the determination unit 51 extracts the intensity information of the wave number point corresponding to the peak wave number of the removal 1 from the line of FIG. 20 (B).
  • the avoidance unit 52 calculates the average value of the intensity information of the wave number points on both sides of the peak wave number for each extracted intensity information. Then, the extracted intensity information is replaced with the average value.
  • FIG. 20C shows a line after avoidance processing for the wave number set of removal 1.
  • the determination unit 51 further extracts the intensity information of the wave number point corresponding to the peak wave number of the removal 2.
  • the avoidance unit 52 calculates the average value of the intensity information of the wave number points on both sides of the peak wave number for each extracted intensity information, and replaces the extracted intensity information with the average value.
  • FIG. 20D shows a line for which avoidance processing has been performed for the wave number set of removal 2.
  • FIGS. 20 (A) to 20 (D) correspond to the measured DC signals in this embodiment. Therefore, changes in AC / DC signals are also shown in FIGS. 21 (A) to 21 (D) under the same conditions.
  • FIG. 21 (A) shows an AC / DC signal acquired by a wavenumber sweep of 0.5 cm -1 step.
  • FIG. 21B shows an AC / DC signal extracted from FIG. 21A for 1.0 cm -1 step.
  • FIG. 21C shows an AC / DC signal that has been evaded for the wavenumber set of removal 1.
  • FIG. 21D shows an AC / DC signal that has been evaded for the wave number set of removal 2.
  • the waveform of the AC / DC signal is generally improved by executing the avoidance process. Since the peak of 1531 cm -1 in FIG. 21 (D) is at the wavenumber point where the absorption of water vapor is not so large, it is considered to be caused by the fluctuation on the QCL side.
  • CD measurement optical system 14 Polarization modulator (PEM) 15 Sample chamber 17 MCT detector 20 Fourier transform type light source system 30 Laser light source system 32 Chopper 35 Dimmer set (optical element for gain switching) 35a, 35b Dimming element 37 Switching means 40 Signal processing means (signal processing unit) 48 Gain switching electric element 49 Storage unit 51 Judgment unit 52 Avoidance unit QCL Quantum cascade laser (laser light source)

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Abstract

本発明は、試料の吸光度が２以上であっても、適正なＳＮ比の赤外域ＣＤを測定することが可能な円二色性測定装置を提供する。円二色性測定装置は、試料の少なくとも１つの吸収ピークを含む赤外波数域内でレーザー光の波数を掃引可能なレーザー光源（ＱＣＬ）と、試料が配置される試料室（１５）と、掃引された特定波数のレーザー光が試料を透過する前後のいずれかにおいて当該レーザー光の偏光状態を変調させる偏光変調子（１４）と、試料を透過して偏光状態を変調されたレーザー光の強度変化を検出する検出器（１７）と、検出器（１７）の検出信号から変調周波数に同期する交流成分（ＡＣ）と直流成分（ＤＣ）とを抽出し、両者の比（ＡＣ／ＤＣ）に基づいて試料の赤外域円二色性の値を算出する信号処理部（４０）と、を備える。

Description

赤外域の円二色性測定装置
　本発明は赤外域ＣＤ（いわゆる振動円二色性）の測定装置に関する。
　振動遷移に関わる振動円二色性の測定装置は、測定で得られるスペクトルと分子構造から計算で予測されるスペクトルの比較性が良いことから、医薬や生理活性物質の構造解析に応用されてきた。
　特許文献１にはフーリエ変換型のＣＤ分光光度計を用いた振動円二色性の測定方法が示されている。フーリエ変換型（ＦＴ型）では、回折格子を用いず、光路差可変の干渉計を用いて赤外光の干渉波を作り出し、これを測定光として用いる。ＦＴ型ＣＤ分光光度計の構成の一例は、赤外光源→干渉計→偏光変調子（ＰＥＭ）→セル部（試料）→ＭＣＴ検出器→信号処理部（ロックインアンプ等）→フーリエ変換部（コンピュータ等）となる。
　赤外光の干渉波は、ＰＥＭによって交互に生じる右周りと左周りの円偏光からなる干渉波となって、試料を照射し、ＭＣＴ検出器で検出される。干渉波の検出信号（インターフェログラムと呼ばれる）には、左右の円偏光の吸光度の差（ΔＡ）が信号強度の周期的な変化として表れる。つまり、干渉波の検出信号は、ＰＥＭの偏光変調に同期する交流成分（ＡＣ）および直流成分（ＤＣ）を含むため、これらをロックインアンプ等で抽出し、両者の比（ＡＣ／ＤＣ）を算出する。ただし、検出信号は干渉波の信号であるから、最後にコンピュータ上でフーリエ変換して赤外域のＣＤスペクトルを得る。
特開２０１３－２０５２７５号公報
　吸光度の差ΔＡを測定するのであれば、できるだけ吸光度Ａが高い状態の試料を測定した方が、理論的には測定精度がよくなる。しかし、試料の吸光度Ａが高いほど、検出される光量が減って検出信号が弱くなってしまうので、ノイズの影響が大きくなり、吸光度の差の測定ができなくなる、という実情がある。
　特許文献１のフーリエ変換型のＣＤ分光光度計では、試料の吸光度Ａが高くても１．５～２、通常は１前後になるようにする、という制約がある。ここで、吸光度Ａは、次式で定義される。
　　　Ａ＝εｃＬ＝－ｌｏｇ１０（Ｉ／Ｉ０）　　　　　　・・・（１）
式中のＬは光路長、ｃはモル濃度、εはモル吸光係数、Ｉ０は入射光の強度、Ｉは出射光の強度を示す。例えば、溶液試料の場合、モル濃度ｃまたはセルの光路長Ｌを変更して、試料の吸光度Ａを高くても１．５～２未満に調整する。これに対し、水を溶媒とするタンパク質等の試料測定では、吸光度が２を超えることが多く、赤外域のＣＤ信号を得ることが困難な状況である。
　本発明の目的は、試料の吸光度が２以上（例えば、２～５の範囲）であって、従来の測定装置では光量を十分に検出できないことから測定条件が不利になるような試料に対しても、適正なＳＮ比の赤外域ＣＤを測定することができる赤外域の円二色性測定装置を提供することにある。
　発明者らは、赤外域レーザーでありながら、高輝度・高出力・広帯域での波数可変機能を持つ量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）に着目し、この赤外域レーザー光を測定光として、赤外域ＣＤ測定に適用する研究を進め、本発明の完成に至った。
　すなわち、本発明に係る赤外域の円二色性測定装置は、試料の少なくとも１つの吸収ピークを含む赤外波数域内でレーザー光の波数を掃引可能なレーザー光源と、
　試料が配置される試料室と、
　掃引された特定波数の前記レーザー光が試料を透過する前後のいずれかにおいて当該レーザー光の偏光状態を変調させる偏光変調子と、
　前記試料を透過して偏光状態を変調されたレーザー光の強度変化を検出する検出器と、
　前記検出器の検出信号から変調周波数と同期する交流成分（ＡＣ）と直流成分（ＤＣ）とを抽出し、両者の比（ＡＣ／ＤＣ）に基づいて試料の赤外域円二色性の値を算出する信号処理部と、を備えることを特徴とする。
　ここで、前記レーザー光源が量子カスケードレーザ（ＱＣＬ）であることが好ましい。また、前記レーザー光源からレーザー光を最大パワーの連続モードで出力した際の平均出力が、１ｍＷ以上であり、当該レーザー光の発振線幅が、０．０５～４．０ｃｍ－１であることが好ましい。
　また、前記信号処理部が、掃引される特定波数毎に前記赤外域円二色性の値を算出して、試料の赤外域ＣＤスペクトルを取得することが好ましい。
　さらに、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたゲイン切替用光学素子と、
　前記ゲイン切替用光学素子をレーザー光の掃引波数に応じて切り替えて、前記検出器に入る光量を調整する切替手段と、を備えることが好ましい。
　また、前記信号処理部は、レーザー光の掃引波数に応じてアナログ信号の強度を電気的に切り替えて、ＡＤ変換時の量子化誤差を低減させるゲイン切替用電気素子を備えることが好ましい。
　さらに、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたチョッパーを備え、当該チョッパーの通過率が７０％以上であることが好ましい。
　また、前記信号処理部は、
　水または水蒸気の吸収ピーク波数を保有する記憶部と、
　レーザー光の掃引波数が前記水または水蒸気の吸収ピーク波数に一致するかを判断する判断部と、
　一致した場合に当該吸収ピークの影響を回避する処理を実行する回避部と、を有し、
　前記回避部は、前記水または水蒸気の吸収ピーク波数の前後の掃引波数のレーザー光による赤外域ＣＤ値に基づいて、水または水蒸気の吸収ピーク波数における赤外域ＣＤ値を算出するように構成されていることが好ましい。
　以上の構成の赤外域のＣＤ測定装置によれば、赤外域のレーザー光を所定波数域で掃引可能なレーザー光源を備えることで、高輝度、高出力、広帯域から選択された波数の赤外レーザー光を測定光として用いることができる。その結果、吸光度が２以上である試料に対しても適正なＳＮ比での赤外域ＣＤが測定可能になり、測定精度が向上する。
赤外域のＣＤ測定装置を構成するＣＤ測定光学系を示す図である。 フーリエ変換型の光源系の構成を示す図である。 レーザー光源系の構成を示す図である。 ＱＣＬの半導体チップ毎の波数チューニングカーブを重ねて示した図。 １７５０ｃｍ－１から１５００ｃｍ－１まで波数掃引した場合のレーザー光の強度の変化を示す図である。 ＱＣＬの１６７５．５ｃｍ－１のレーザー光の発振線幅を示す図。 レーザー光を用いた赤外域ＣＤ測定装置の全体構成を示す図である。 Ｎ２パージの有効性を示すスペクトル図である。 パージ開始から９０分経過までのレーザー光の強度変化を示す図である。 パージなし、で測定したスペクトルを透過率１００％ラインで示した図。 パージあり、で測定したスペクトルを透過率１００％ラインで示した図。 Ｎ２パージの有効性を個別評価するための実験装置を示す図である。 図１２の実験装置を用いてパージ開始から１２０分経過までのレーザー光の強度変化を測定した結果を示す図である。 本実施形態の測定例としての赤外域ＣＤスペクトル図である。 比較のための赤外域ＣＤスペクトル図である。 測定例として高い吸光度の試料を測定した赤外域ＣＤスペクトル図。 測定例として試料を積算時間２０分で測定した赤外域ＣＤスペクトル図。 チョッピング試験に用いた通過率８３％の回転式チョッパーを示す図。 図１８の回転式チョッパーを使った試験結果を示す図。 （Ａ）～（Ｄ）は本実施形態の水蒸気の吸収回避処理による効果を示すための１００％ラインの図である。 （Ａ）～（Ｄ）は本実施形態の水蒸気の吸収回避処理による効果を示すためのＡＣ／ＤＣ信号の図である。
＜赤外域のＣＤ測定装置＞
　本発明の各実施形態について図面を用いて説明する。まず、図１に赤外域のＣＤ測定装置を構成するＣＤ測定光学系１０を示す。ＣＤ測定光学系１０は、測定光の光軸に沿って、可動ブロック１１上の光学素子、光学フィルター１２、偏光子１３、ＰＥＭ１４、試料室１５、集光レンズ１６、ＭＣＴ検出器１７の順に配置されている。測定光として、「赤外干渉波の光」および「赤外レーザー光」から選択可能に構成されている。
　赤外干渉波の光は、フーリエ変換型の光源系２０（図２参照）から供給される。レーザー光は、レーザー光源系３０（図３参照）から供給される。可動ブロック１１には２種類の光学素子（赤外干渉波用の楕円鏡１１ａ、レーザー用の平面鏡１１ｂ）が搭載され、可動ブロック１１をスライドさせて一方の光学素子をＣＤ測定光学系の光軸に配置するで、ＣＤ測定光学系１０への測定光が切り替わる。
　図１のＣＤ測定光学系において、選択された測定光は、光学フィルター１２によって所望の波数域の光のみとされ、偏光子１３によって直線偏光成分のみが取り出されてＰＥＭ１４に送られる。
　偏光子１３の光学的な光軸方向とＰＥＭ１４の主軸方向とは、光軸方向から見て４５度で交わる関係になっているとよい。偏光子１３からの直線偏光は、ＰＥＭ１４により偏光状態の変調を受ける。具体的には、直線偏光の互いに直交する２つの偏光成分間の位相差δが変調する。位相差δの変調は、通常、サインカーブで行われ、これに伴って左回りと右回りの円偏光がＰＥＭ１４から交互に試料室１５に向けて出射される。
　ＰＥＭ１４および試料室１５の位置関係は図１に限られず、ＰＥＭ１４を試料室１５よりも検出器側に配置することもできる。
　例えば、溶液試料をセル内に入れて、試料室１５に配置する。セル内の試料はＰＥＭからの左右の円偏光の照射を交互に受け、その透過光は集光レンズ１６で集光されてＭＣＴ検出器１７で光強度が検出される。
　測定光が赤外干渉波の場合、偏光子１３で直線偏光の干渉波になって、ＰＥＭ１４で位相変調されるので、試料は左右の円偏光成分からなる干渉波を受ける。一方、測定光が赤外レーザー光の場合、偏光子１３で直線偏光のレーザー光になって、ＰＥＭ１４で位相変調されるので、試料は左右の円偏光成分からなるレーザー光を受ける。なお、赤外レーザー光の指向性が高い場合は集光レンズ１６を省略してもよい。
　検出器１７としては、ＭＣＴ検出器に限られず、Ｓｉフォトダイオード、ＩｎＳｂ検出器、ＩｎＧａＡｓ検出器などの量子型検出素子を用いた検出器や、ＴＧＳ、ＤＬａＴＧＳなどの焦電素子を用いた検出器を、適宜選択してもよい。
　図２にフーリエ変換型の光源系（ＩＲ光源２１→楕円鏡２２→アパーチャー２３→マイケルソン干渉計２４→出射側の放物面鏡２５→アパーチャー２６）の構成を示す。マイケルソン干渉計２４は、入射側の放物面鏡２４ａ、ビームスプリッター（ＢＳ）、固定鏡２４ｂ、移動鏡２４ｃによって構成される。ＢＳで分割された一方の平行光束は固定鏡２４ｂを反射してＢＳに戻り、分割された他方の平行光束は移動鏡２４ｃを反射して同様にＢＳに戻る。２つの平行光束はＢＳで合成され干渉波として放物面鏡２５に向けて出射する。このようにして、移動鏡２４ｃによって可変な光路差Ｄに応じた干渉波（インターフェログラム）が生じる。赤外干渉波の光は、出射側の放物面鏡２５を反射して、ＣＤ測定光学系１０の可動ブロック１１の楕円鏡１１ａに進み、測定光として利用される。
　図３に本実施形態において特徴的なレーザー光源系３０の構成を示す。レーザー光源系３０は、量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）を赤外光源とすることで、高輝度・高出力・広帯域から選択された特定波数の赤外レーザー光を供給する。
　ＱＣＬには、多層半導体構造の活性領域を有する半導体チップが１ないし複数個設けられている。注入された電子が活性領域のレイヤを滝のように通過して多数のフォトンが放出されるので、レーザー利得が高く、波数域が広い。例えば、４個の半導体チップ（ＱＣＬ－１～ＱＣＬ－４）を使って、波数域を指紋領域（１８５０～８９０ｃｍ－１）まで広げた場合について、図４に半導体チップ毎の波数チューニングカーブを重ねて示す。ＱＣＬ－１の波数域を約１８５０～１５００ｃｍ－１、ＱＣＬ－２の波数域を約１７５０～１４００ｃｍ－１、ＱＣＬ－３の波数域を約１５００～１１００ｃｍ－１、ＱＣＬ－４の波数域を約１３００～８９０ｃｍ－１としてもよい。波長域に換算すると、５．４～１１．２μｍになる。
　ＱＣＬでは内蔵された駆動部３１によって出力レーザー光の波数が変化する。例えば、駆動部としての共振器（キャビティ）が出力波数を掃引する。
　ＱＣＬ－２のみを使って、波数を１７５０ｃｍ－１から１５００ｃｍ－１まで掃引した場合のレーザー光の強度の変化を図５に示す。比較のため、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴＩＲ）の標準的な赤外光源のスペクトル形状を同条件で測定したものを並べた。波数１６００ｃｍ－１（最大パワー）でレーザー光を連続モード出力した際の平均出力が約３００ｍＷになっている。
　試用するレーザーの平均出力としては、少なくとも１ｍＷ以上であれば、従来の測定装置による検出信号よりも質の良い検出信号が得られる。好ましくは１０ｍＷ以上、より好ましくは１００ｍＷ以上である。１ｍＷ～数百ｍＷ程度の平均出力のレーザーを用いれば、概ね出力に比例して検出信号の質が改善される。平均出力が大きいレーザーを用いると、試料の焼損や検出器感度の飽和といった制約が生じるので、大きくとも１Ｗ～１０Ｗ程度の平均出力のレーザーがよい。試料によって、焼損する出力は異なり、また、検出光量も変わるため、試料に応じて最も本発明の効果を発揮できるレーザーの平均出力を選定するとよい。なお、測定装置にゲイン切替手段（減光器など）を設ける場合は、レーザー光の減光率を調整できるので、実際にはさらに大きな平均出力のレーザーを搭載することも可能である。
　図５の例で、両者のスペクトル形状を同じ波数（例えば１６００ｃｍ－１）で比較すると、ＦＴＩＲ標準光源の出力値が４．４を示すのに対し、ＱＣＬの出力は、２４２３倍の１０６６４．７を示し、出力強度の差が非常に大きいことが分かる。
　次に、ＱＣＬの１６７５．５ｃｍ－１のレーザー光の発振線幅を図６に拡大して示す。レーザー光の発振線幅（半値全幅）が狭い程、レーザー光の波数分解能が高い。図６のレーザー光の半値全幅は０．１３ｃｍ－１である。レーザー光の発振線幅（半値全幅）としては、約０．０５～４．０ｃｍ－１であることが好ましい。
　ＱＣＬのレーザー光の特徴は、（１）掃引可能な波数域が広く、（２）出力が驚くほど強く、（３）発振線幅（半値全幅）が非常に狭いことである。なお、ＱＣＬは、特定波数のレーザー光を連続モード（ＣＷモード）で出力する。パルスモードを選択できるＱＣＬでもよいが、ＣＷモードの方が検出信号が大きく、測定精度がよい。
　図３に戻って、ＱＣＬからの赤外レーザー光の進路には、回転式チョッパー３２、可動ブロック３３上の２つの平面鏡３３ａ，３３ｂ、減光器入側の固定平面鏡３４、減光器セット３５、減光器出側の固定平面鏡３６が順に配置されている。可動ブロック３３には、２つの平面鏡の他に、アパーチャーを通過する光路を形成するための光学素子（入側の楕円面鏡３３ｃ、アパーチャー３３ｄ、出側の楕円面鏡３３ｅ）が搭載されている。可動ブロック３３がスライドすることで、アパーチャーを通過しない光路と、アパーチャーを通過する光路とが切り替わる。後者の光路ではレーザー光の光束断面が、アパーチャー前後の楕円面鏡３３ｃ，３３ｅによって拡張され、アパーチャー３３ｄの開口部の大きさになる。
　ＱＣＬからの赤外域レーザー光は、回転式チョッパー３２の通過率に応じた断続的なレーザー光になる。そのレーザー光は、可動ブロック上の光路を通り、さらに減光器セット３５を通過し、ＣＤ測定光学系１０の可動ブロック１１上の平面鏡１１ｂに進んで測定光として利用される。
　試料の円二色性ＣＤは、式（２）で定義される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　円二色性ＣＤは、左円偏光に対する試料の吸光度ＡＬと右円偏光に対する試料の吸光度ＡＲとの差（ΔＡ）であり、式（２）のように、試料を透過した左円偏光の光強度ＩＬと右円偏光の光強度ＩＲとの比の常用対数で示される。光強度Ｉ０は、試料への入射光の強度である。吸光度の差ΔＡは無次元数であるため、通常は次式（３）のように楕円率（ＣＤ［mdeg］）に変換される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、ＰＥＭを用いた偏光変調法に基づいて、式（２）の左円偏光強度ＩＬと右円偏光強度ＩＲを測定する場合、これらの平均値（（ＩＬ＋ＩＲ）／２）が偏光変調法での光強度の波形中の「ＤＣ信号」に対応し、また、これらの差の半分（（ＩＬ－ＩＲ）／２）が偏光変調法での光強度の波形中の「ＡＣ信号の最大振幅」に対応している。１次のベッセル関数J1(2πδ０)のモデルを適用すると、偏光変調法での光強度Ｉの波形は、ＤＣ信号の項とＡＣ信号の項の和として示される。従って、式（３）は次の近似式のように表現できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　つまり、光強度の検出波形データから、ＡＣ信号とＤＣ信号を抽出できれば、ＣＤ値の測定が可能になる。
　図７に、赤外域レーザー光を用いる赤外域ＣＤ測定装置の全体構成を示す。同図には、信号処理手段４０の構成（プリアンプ４１、ＤＣ信号用のロックインアンプ４２、ＡＣ信号用のロックインアンプ４３、ＰＥＭコントローラー４４、Ａ／Ｄ変換器４５、データロガー４６、コンピュータ等の演算処理装置４７）を併せて示す。検出器１７からの光強度信号はプリアンプ４１で増幅され、プリアンプ４１から直流成分と交流成分の各信号がそれぞれのロックインアンプ４２，４３に送られる。
　ＤＣ信号用のロックインアンプ４２は、チョッピング周波数に同期する基準信号を使って、プリアンプの直流成分の信号からＤＣ信号を抽出する。つまり、回転式チョッパー３２の遮光期間における直流成分の信号値と、回転式チョッパー３２の通過期間における直流成分の信号値とを抽出し、データロガー４６に記録する。遮光期間および通過期間の信号値の差分をＤＣ信号として扱う。
　ＡＣ信号用のロックインアンプ４３は、ＰＥＭ１４の駆動周波数と同期する基準信号を使って、ＰＥＭ１４と同じ周波数成分であるＡＣ信号を、プリアンプ４１の交流成分の信号から抽出してデータロガー４６に記録する。
　データロガー４６に記録する際、ＤＣ信号およびＡＣ信号はＡ／Ｄ変換器４５で数値化される。演算処理装置４７は、データロガー４６からＡＣ信号とＤＣ信号を読み出して、両信号の比（ＡＣ／ＤＣ）を得て、式（４）に基づいて赤外域ＣＤ値を算出する。
　測定光が赤外レーザー光であるから、ＱＣＬにおいて選択された波数毎に、演算処理装置４７が赤外域ＣＤ値を算出することで、赤外域のＣＤスペクトルデータが得られる。
　なお、測定光として図２の赤外干渉波の光を選択した場合は、光強度信号はインターフェログラムであるから、光強度信号に基づく算出結果はＣＤ値そのものではない。そのため、演算処理装置は、データロガー４６からＡＣ信号とＤＣ信号を読み出して、両信号の比（ＡＣ／ＤＣ）の値をフーリエ変換処理することで、赤外域のＣＤスペクトルデータを得る。上述の式（４）における「ＡＣ／ＤＣ」を「Ｆ［ＡＣ／ＤＣ］」に置き換えた数式が、フーリエ変換を利用したＣＤ値の近似式になる。式中のＦ［　］はフーリエ変換を表す。
＜Ｎ２パージの有効性の評価＞
　図７に基づく実験装置を使って、窒素ガス置換（Ｎ２パージ）にかかる時間と、その有効性について評価した。実験装置では、ＱＣＬの出力波数域を１７５０－１５００ｃｍ－１とし、チョッパーのチョッピング周波数を５００Ｈｚとし、減光器（例えばＮＤフィルター）の透過率を２％とした。試料室にはサンプルを置かず、ＰＥＭは駆動させないで、レーザー光をＭＣＴ検出器で検出した。
　信号処理手段４０のプリアンプ４１は、４００ＨｚフィルタリングしたＤＣ成分の信号をロックインアンプに送る。
　まず、「パージなし」の状態で、レーザー光の波数を１７５０－１５００ｃｍ－１の範囲で掃引し、１ｃｍ－１ステップで光強度をＭＣＴ検出器で検出した。ステップ速度は５００ｍｓｅｃ／ｃｍ－１である。結果を図８のスペクトルＡに示す。パージなしでは、各筐体内の水蒸気等による吸収の影響が波数全域に渡って大きいことが分かる。
　次に、レーザー光の波数を１６３５ｃｍ－１に固定して、ＣＤ測定光学系１０およびレーザー光源系３０をそれぞれ収納している筐体内を毎分６Ｌのガス供給量でＮ２パージする。各筐体には、独立制御可能なパージ装置が設けられている。波数１６３５ｃｍ－１のレーザー光は、装置内部の水蒸気にほとんどが吸収されるため、Ｎ２パージの有効性の評価に適する。図９は、パージ開始から９０分経過までの波数１６３５ｃｍ－１のレーザー光の強度変化を示す。約１時間という比較的短時間のパージによって、窒素への置換が大きく進み、２時間のパージをすれば十分であることが分かる。
　図８のスペクトルＡと同様に、「９０分間のパージ後」の状態でスペクトルＢを測定した。水蒸気などによる吸収ピークが大幅に減少し、比較的短いパージ時間で水蒸気などの吸収の影響が大きく低減されることが分かった。
　次に、「パージなし」の状態で、図８のスペクトルＡと同様にスペクトルを測定し、レーザー光の透過率Ｔ（＝Ｉ／Ｉ０×１００）が１００％である透過率１００％ラインを描いたものを図１０に示す。パージなしの状態でのスペクトル測定を３回繰り返し、３つの結果を重ねて表示した。これに対して、「１２０分間のパージ後」の状態でスペクトルを測定し、同様に透過率１００％ラインを描いたものを図１１に示す。
　図１０には水蒸気等の吸収の影響が波数域の全体にわたってノイズのように生じていることが分かる。同じ波数のレーザー光であっても、透過率１００％ラインを押し上げる場合と押し下げる場合の両方がある。これに対して図１１のパージ後の透過率１００％ラインでは、水蒸気等の吸収の影響が波数域の全体にわたって大幅に減少していることが分かる。
＜Ｎ２パージの有効性の個別評価＞
　次に、レーザー光源系３０へのＮ２パージの有効性の評価を個別に行った。図１２に示す実験装置を用いた。レーザー光の波数を１６３５ｃｍ－１に固定して、レーザー光源系３０の筐体内をＮ２パージする。筐体内部の光路上に、４倍エキスパンド用の一対の反射鏡を設置して、ビーム径を４倍に拡張させる。レーザー光の強度を、レーザー光源系３０の出口に置かれたパワーメーター（サーモパイル型検出器）で検出する。
　図１３は、パージ開始から１２０分経過までの波数１６３５ｃｍ－１のレーザー光の強度変化を示す。パージ開始時に約２８ｍＷであった強度は、最初の３０分位で急上昇し、６０分後には１２０ｍＷ前後まで達している。このパージ効果を詳細に評価するため、次の表１の予備測定を行った。
　表１に、ＱＣＬの直下にパワーメーターを置いて、前記の波数１６３５ｃｍ－１と、水蒸気の吸収の影響を受けにくい波数１６００ｃｍ－１の２種類のレーザー光の強度をそれぞれ測定した結果を示す。また、図１２の実験装置を用いて、レーザー光源系３０の出口（「連結部」）での強度も測定した。いずれも「パージなし」の状態で測定した。
　表中のカッコ内の数値は、４倍エキスパンド時の測定値である。参考に、試料室での強度値も示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　光源直下では水蒸気の影響を受けないと仮定して、ＱＣＬを出た直後のレーザー光強度の比率Ｐｒａｔｉｏ（＝Ｐ１６３５／Ｐ１６００＝１９０／２９５）を計算すると０．６４４になる。１６００ｃｍ－１のレーザー光は水蒸気の影響をほとんど受けないため、連結部での１６００ｃｍ－１の光強度（１９２．６ｍＷ）に基づいて連結部での１６３５ｃｍ－１の光強度を求めると、Ｐ１６３５（＝１９２．６＊０．６４４）は、１２３．７ｍＷになる。この値は、１６３５ｃｍ－１のレーザー光が水蒸気の影響を受けない場合の数値に相当する。図１３によれば、パージ後６０分の連結部での光強度が１２０ｍＷ前後（上記の１２３．７ｍＷの計算値に近い値）にまで回復していることから、１時間程度のＮ２パージで置換が十分に行われたと評価できる。
　これらの評価結果から、本実施形態の赤外域ＣＤ測定装置が、それぞれの筐体にＮ２パージ装置を設けることでのパージ効果が短時間で発揮し得ることが分かる。
＜赤外域ＣＤ測定結果１＞
　図７の構成の赤外域ＣＤ測定装置を使って、クロロホルム溶媒にビ－２－ナフトール（Ｂｉ-２-ｎａｐｈｔｏｌ）を溶かした溶液試料の赤外域ＣＤスペクトルを測定した。この装置では、ＱＣＬのレーザー光の波数域を１６５０－１５００ｃｍ－１とし、チョッパーのチョッピング周波数を５００Ｈｚとし、減光器（例えばＮＤフィルター）の透過率を２％（９８％減光）とした。ＰＥＭの変調周波数を５０ｋＨｚとして、試料の透過光をＭＣＴ検出器で検出した。
　測定前に、ＣＤ測定光学系１０およびレーザー光源系３０をそれぞれ収納している筐体内を、毎分６Ｌのガス供給量で１２０分間Ｎ２パージした状態にした。赤外域ＣＤ測定では、レーザー光の波数を１６５０－１５００ｃｍ－１の範囲で３回掃引し、１ｃｍ－１ステップで光強度をＭＣＴ検出器で検出し、平均値を算出した。その赤外域ＣＤスペクトルを図１４に示す。比較のため、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計での測定結果を図１５に示す。
　本実施形態に係る赤外域ＣＤ測定装置で測定した赤外域ＣＤスペクトルには、以下の注目すべき点がある。まず、波数分解能が非常に高いことが、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計で測定した赤外域ＣＤスペクトルとの比較から歴然としている。
　本書では、試料が本来有している２つのＣＤピークが隣り合っていて、一方のピーク波数νに対し、他方のピーク波数をν＋Δνで表す場合に、測定装置が区別できる２つのＣＤピーク間のΔνの最小値を波数分解能（ｃｍ－１）として示す。
　図１１に示した通り、１２０分間のＮ２パージで１６５０－１５００ｃｍ－１の波数域での水蒸気等の吸収の影響は大幅に減少している。そうすると、図１４の赤外域ＣＤスペクトルにおいても、水蒸気などの影響は小さくなっていると言え、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計が測定できなかった微小なＣＤピークまで測定できていると言える。
　波数分解能が高い理由の１つに、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計での赤外域ＣＤスペクトルの測定範囲（縦軸）が約－０．０００１から＋０．０００１までであるのに対して、本実施形態の装置では、約－０．０８から＋０．０８までと１０００倍程度広い測定範囲になっていることが挙がる。つまり、図６のような非常に強い出力のレーザー光によって、検出器からの検出信号が大きくなり、吸光度Ａの検出感度が挙がった。それに伴って、従来は非常に弱いものしか測定できなかった赤外域ＣＤ信号が、非常に大きな値で取得できるようになった。
　２つ目の理由として、図６のような理想的な単波数光に近いプロファイル（半値全幅０．１３ｃｍ－１）のレーザー光を使ったことが挙がる。
　本実施形態の装置の長所は、従来型の分散型ＣＤ分光光度計における課題を挙げることで理解が深まる。例えば、ＵＶ－可視光域のＣＤ分光光度計では、回折格子を使った分散型のＣＤ分光光度計が主流である。
　分散型ＣＤ分光光度計において、波長分解能を高めるには、分散型分光器から取り出された光のバンド幅（半値全幅）を、試料の吸収ピークの半値幅の概ね１／１０以下に設定できるとよい、とされている。例えば、半値幅１５ｎｍの吸収ピークをバンド幅２ｎｍの擬似単色光で測定すれば、測定値の誤差を小さく抑えられる。
　バンド幅は、分光器に組み込まれたスリットの幅で決まる。そのため、単純にバンド幅を小さく設定すれば良いとは言えない。バンド幅を小さくすると、試料を照射する光が弱くなってノイズが増加するからである。
　本実施形態の装置が優れているのは、掃引された特定波数のレーザー光の半値全幅が理想的な単色光と言えるレベルの狭さであり、かつ、レーザー光の出力を高い状態に維持できることである。それによって、検出器から強い検出信号が得られ、赤外ＣＤ値の測定感度が向上することである。フーリエ変換型や分散型のＣＤ分光光度計では、干渉波の光束をアパーチャーで絞ったり、単色光のバンド幅をスリットで狭くしたりすることで、検出信号が弱くなる傾向があり、ＳＮ比が悪化しない程度に、試料の吸光度を高くても１．５～２未満に調整しなければならなかった。本実施形態の装置では、そのような試料の吸光度についての制約がなくなる点で非常に優れている。
＜赤外域ＣＤ測定結果２＞
　本実施形態の装置を使って、吸光度４に調整したアミノ酸の溶液試料（Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕｃｉｎｅ）を０．０００１ΔＡの分解能で赤外域ＣＤスペクトル測定した結果を図１６に示す。
＜赤外域ＣＤ測定結果３＞
　図１７（Ａ），（Ｂ）に、本実施形態の装置を使って、ピネンの溶液試料（（－）－α－ｐｉｎｅｎｅ）を積算時間２０分で赤外域ＣＤスペクトル測定した結果を示す。ＭＣＴ検出器の素子サイズを２種類（直径１ｍｍ、直径０．２ｍｍ）用いたが、どちらの測定も、短い積算時間で感度のよい赤外域ＣＤスペクトルが得られた。
　以下、本実施形態の赤外域ＣＤ測定装置にオプションとして装備可能な構成について説明する。
＜光学的ゲイン切替手段＞
　本実施形態において特徴的な図３の減光器セット３５の切替手段３７について説明する。減光器セット３５は、１ないし複数の減光素子３５ａ，３５ｂから構成され、かつ、個々の減光器３５ａ，３５ｂをオンライン／オフラインに独立して切り替え可能な切替手段３７が設けられている。例えば、透過率２％の２枚の減光素子３５ａ，３５ｂを用いる。２枚同時にオンラインにした場合の合計透過率が０．０４％になるため、切替手段３７は、減光器セット３５による合計透過率を１００％、２％、０．０４％の３通りに切り替え可能である。なお、減光器セット３５は、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されていればよい。
　本実施形態では、減光器セット３５の切替手段３７を使って、測定ゲインを光学的に切り替える。まず、事前測定として、減光素子３５ａを１枚だけオンライン状態にして、レーザー光の波数掃引を行ってバックグラウンド測定を実行する。得られた出力が基準値以下になる波数に対し、個別にゲインを設定する。例えば、検出器１７への光が暗い場合は、減光素子３５ａ，３５ｂを２枚ともオフライン状態にするとよい。逆に、事前測定での出力が強過ぎる波数に対しては、減光素子３５ａ，３５ｂを２枚ともオンライン状態にするとよい。測定条件は記憶部４９に保存される。試料のスペクトル測定を実行する際、記憶した設定値に従って、波数掃引ごとに測定ゲインを光学的に切り替える。この結果、レーザー光の掃引波数に応じた検出器１７への光量変動が小さく抑えられる。
　また、予め試料なしの状態で減光量が最適化された光学系に試料を入れると、試料の吸光度が大きいなどの理由で、出力が低下する波数が生じる場合がある。このような波数に対しても、減光素子３５ａ，３５ｂをオフラインにする等の測定条件を設定して、減光量を調整することができる。
　以上の光学的ゲインの切替手段３７によって、高い吸光度の試料の赤外域ＣＤスペクトル測定が容易になる。なお、減光素子３５ａ，３５ｂなどで光学的にゲインを変更すると、スペクトルのベースラインにずれが生じるが、ゲインの変更前後の掃引波数域を一部オーバーラップさせたスペクトル測定を実行する手段を設けることで、その測定結果を使えば演算処理手段４７によるベースラインの接続が容易になる。
＜電気的ゲイン切替手段＞
　光学的なゲイン切り替えと同様に、電気的なゲインの切り替えを採用することもできる。例えば、図７の信号処理手段４０に設けられたゲイン切替用電気素子４８が、低出力になる波数に対して、アナログ信号の強度を電気的に増幅させて、Ａ／Ｄ変換器４５での量子化誤差を低減させるようにしてもよい。
＜チョッパーの通過率＞
　次に、チョッパー３２の通過率の設定について説明する。チョッパー３２は、赤外吸収信号（ＤＣ信号）を取得するために設けられており、図７の位置に限られず、レーザー光の光路上のいずれかの位置にあればよい。
　赤外域ＣＤ信号の信号強度は、赤外吸収信号と比べて１０００分の１以下と非常に弱い。チョッピングは、赤外域ＣＤ信号の更なる強度低下を招き、そのＳＮ比も同時に低下させてしまう。本実施形態では、３通りの通過率（５０％、７５％、８３％）の回転式チョッパーを使った試験結果に基づいて、チョッパー３２の通過率を７０％以上に設定することにした。
　図１８にチョッピング試験に用いた通過率（Ｄｕｔｙとも呼ぶ）が８３％の回転式チョッパーの一例を示す。中心部から５方向に伸びたリブ部が遮光部として機能する。
　通過率８３％の回転式チョッパーを使ってチョッピングして、ＰＥＭ１４で偏光変調したレーザー光を検出器１７で検出した。その検出信号から抽出したＤＣ信号とＡＣ信号の強度変化を図１９に示す。３通りの掃引波数（１５９５ｃｍ－１，１６００ｃｍ－１，１６０５ｃｍ－１）での信号強度の変動は、いずれも許容範囲内であり、適正なＤＣ信号（同図（Ａ））とＡＣ信号（同図（Ｂ））を取得することができた。
＜水または水蒸気の吸収ピークの影響回避＞
　本実施形態において特徴的な水等の吸収ピークの影響回避手段について説明する。図７の信号処理手段４０は、さらに、水または水蒸気の既知の吸収ピーク波数を保有する記憶部４９と、レーザー光の掃引波数がこれらの吸収ピーク波数に一致するかどうかを判断する判断部５１と、一致した場合に吸収ピークの影響を回避させる回避部５２とを有する。判断部５１および回避部５２は、演算処理手段４７に組み込まれている。
　図８に示したように、本実施形態の赤外域ＣＤ測定への水または水蒸気の吸収ピークの影響は大きい。特に「パージなし」の状態では、個々の吸収ピークが鋭く、非常に感度良く検出されてしまう。
　そこで、回避部５２は、水または水蒸気の吸収ピーク波数の前後の掃引波数のレーザー光によって得られた赤外域ＣＤ値を使って、その平均値などを水または水蒸気の吸収ピーク波数における赤外域ＣＤ値として算出する。その結果、ＱＣＬのレーザー光による検出感度の鋭さに起因する水または水蒸気ノイズの軽減を図ることができる。
　水または水蒸気の吸収ピークの影響回避の具体的な手法を説明する。
　まず、本実施形態の装置を用いて、シングルビーム（ＳＢ）を例えば１０本測定し、２本ずつの５組とする。各組の２本を除算して、１００％ラインを５本得る。
　０．５ｃｍ－１ステップで波数掃引して取得したラインを図２０（Ａ）に示す。図２０（Ｂ）～（Ｄ）のラインは、図２０（Ａ）から１．０ｃｍ－１ステップ分の強度情報だけ抜き出して得たラインである。図２０（Ｂ）のラインは回避処理前のものである。
　記憶部４９には、表２に示す回避処理対象の波数セットが２セット（除去１、除去２）分、予め記憶されている。これらの波数セットは、経験的に特に大きい水蒸気ピークを生じ得る波数情報を含んでいる。除去１の波数における水蒸気ピークの方が、除去２の波数における水蒸気ピークよりも大きい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　判断部５１は、図２０（Ｂ）のラインから、除去１のピーク波数に該当する波数ポイントの強度情報を抽出する。回避部５２は、抽出された強度情報ごとに、そのピーク波数の両隣りの波数ポイントの強度情報の平均値を計算する。そして、抽出された強度情報をその平均値に置き換える。図２０（Ｃ）に除去１の波数セットについて回避処理後のラインを示す。
　判断部５１は、さらに、除去２のピーク波数に該当する波数ポイントの強度情報を抽出する。回避部５２は、抽出された強度情報ごとに、そのピーク波数の両隣りの波数ポイントの強度情報の平均値を計算し、抽出された強度情報をその平均値に置き換える。図２０（Ｄ）に除去２の波数セットについても回避処理済みのラインを示す。
　このような回避処理を実行すれば、Ｎ２パージなしの状態でも赤外域ＣＤスペクトルの測定結果に与える水蒸気の影響を大幅に低減させることができる。
　図２０（Ａ）～（Ｄ）のラインは、本実施形態でのＤＣ信号を測定したものに該当する。そこで、ＡＣ／ＤＣ信号の変化についても、同様の条件で図２１（Ａ）～（Ｄ）に示す。図２１（Ａ）は０．５ｃｍ－１ステップの波数掃引で取得したＡＣ／ＤＣ信号を示す。図２１（Ｂ）は、図２１（Ａ）から１．０ｃｍ－１ステップ分のＡＣ／ＤＣ信号を抜き出したものを示す。図２１（Ｃ）は除去１の波数セットについて回避処理済みのＡＣ／ＤＣ信号を示す。図２１（Ｄ）は、さらに除去２の波数セットについても回避処理したＡＣ／ＤＣ信号を示す。
　このようにＡＣ／ＤＣ信号の波形は、回避処理の実行によって、おおむね改善されている。なお、図２１（Ｄ）の１５３１ｃｍ－１のピークは、水蒸気の吸収が余り大きく出ない波数ポイントにあるので、ＱＣＬ側のゆらぎに起因するものと考えられる。
１０　ＣＤ測定光学系
１４　偏光変調子（ＰＥＭ）
１５　試料室
１７　ＭＣＴ検出器
２０　フーリエ変換型の光源系
３０　レーザー光源系
３２　チョッパー
３５　減光器セット（ゲイン切替用光学素子）
３５ａ，３５ｂ　減光素子
３７　切替手段
４０　信号処理手段（信号処理部）
４８　ゲイン切替用電気素子
４９　記憶部
５１　判断部
５２　回避部
ＱＣＬ　量子カスケードレーザー（レーザー光源）

Claims (8)

  1. 　試料の少なくとも１つの吸収ピークを含む赤外波数域内でレーザー光の波数を掃引可能なレーザー光源と、
    　試料が配置される試料室と、
    　掃引された特定波数の前記レーザー光が試料を透過する前後のいずれかにおいて当該レーザー光の偏光状態を変調させる偏光変調子と、
    　前記試料を透過して偏光状態を変調されたレーザー光の強度変化を検出する検出器と、
    　前記検出器の検出信号から変調周波数と同期する交流成分（ＡＣ）と直流成分（ＤＣ）とを抽出し、両者の比（ＡＣ／ＤＣ）に基づいて試料の赤外域円二色性の値を算出する信号処理部と、を備える、
    ことを特徴とする赤外域の円二色性測定装置。
  2. 　前記レーザー光源が、量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）であることを特徴とする請求項１記載の赤外領域の円二色性測定装置。
  3. 　前記レーザー光源からレーザー光を最大パワーの連続モードで出力した際の平均出力が、１ｍＷ以上であり、
    　当該レーザー光の発振線幅が、０．０５～４．０ｃｍ－１である、
    ことを特徴とする請求項１または２記載の赤外領域の円二色性測定装置。
  4. 　前記信号処理部が、掃引される特定波数毎に前記赤外域円二色性の値を算出して、試料の赤外域ＣＤスペクトルを取得する、
    ことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の赤外域の円二色性測定装置。
  5. 　さらに、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたゲイン切替用光学素子と、
    　前記ゲイン切替用光学素子をレーザー光の掃引波数に応じて切り替えて、前記検出器に入る光量を調整する切替手段と、を備える、
    ことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の赤外域の円二色性測定装置。
  6. 　前記信号処理部は、レーザー光の掃引波数に応じてアナログ信号の強度を電気的に切り替えて、ＡＤ変換時の量子化誤差を低減させるゲイン切替用電気素子を備える、
    ことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の赤外域の円二色性測定装置。
  7. 　さらに、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたチョッパーを備え、当該チョッパーの通過率が７０％以上である、
    ことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の赤外域の円二色性測定装置。
  8. 　前記信号処理部は、
    　水または水蒸気の吸収ピーク波数を保有する記憶部と、
    　レーザー光の掃引波数が前記水または水蒸気の吸収ピーク波数に一致するかを判断する判断部と、
    　一致した場合に当該吸収ピークの影響を回避する処理を実行する回避部と、を有し、
    　前記回避部は、前記水または水蒸気の吸収ピーク波数の前後の掃引波数のレーザー光による赤外域ＣＤ値に基づいて、水または水蒸気の吸収ピーク波数における赤外域ＣＤ値を算出する、
    ことを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の赤外域の円二色性測定装置。
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