JP3745881B2 - 円二色性蛍光励起スペクトル測定装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は円二色性蛍光励起スペクトル測定装置、特にその信号処理機構の改良に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多くの化学物質において、その絶対構造、立体構造に関する知見は、極めて基本的かつ重要不可欠な情報となっている。特に薬物、毒物、生体物質などの生理活性物質においては、その生理活性が直接にそのキラリティ、すなわち絶対構造、立体構造に依存することから、重要な研究課題とされている。
【０００３】
しかしながら、キラリティのみ異なる光学異性体は、化学的性質は実質的に同一であり、各種物理的特性も極めて近似しているため、これら薬物、毒物、生体物質などの生理活性物質のキラリティを解析する手段としては、Ｘ線結晶構造解析、円二色性スペクトルくらいに限られてくる。特に円二色性スペクトルは、取り扱いが比較的平易であることから、この研究には重要不可欠な手段として広く用いられている。
従来よりこのような手段として後述する吸収円二色性測定装置、蛍光検出円二色性測定装置が知られている。
【０００４】
図１には前記吸収円二色性測定装置の概略構成が示されている。
同図に示す吸収円二色性測定装置１０は、光源１２と、分光器１４と、ピエゾエラスティックモジュレータ（ＰＥＭ）よりなる円偏光変調器１６と、サンプルセル１８と、光電子増倍管（ＰＭＴ）よりなる検知器２０と、プリアンプ２２と、直流アンプ２４と、ＰＭＴ印加電圧制御回路２６と、交流アンプ２８と、ロック・インアンプ３０と、アンプ３２と、Ａ／Ｄコンバータ３４と、ＰＥＭドライバ３６を備える。
【０００５】
そして、光源１２から出た光束は、分光器１４で波長走査が行われ単色化され、さらに直線偏光となり、この分光器１４の後方に設置された円偏光変調器１６を通過する。この円偏光変調器１６により所定の変調周波数信号ｓ１０（図２（ａ）参照）で変調され交互につくられた左右の円偏光Ｌ１０は、サンプルセル１８内の試料に照射される。
ここで、サンプルセル１８内の試料に左右円偏光Ｌ１０の不等吸収が起こると、円偏光変調器１６による変調周波数信号ｓ１０に対応して透過光束Ｌ１２にも強弱の波が生じ、検知器２０に到達する。
【０００６】
そして、検知器２０により出力された電気信号ｓ１２のうち、直流信号成分ｓ１４はＰＭＴ印加電圧制御回路２６に入力され、このＰＭＴ印加電圧制御回路２６により検知器２０に入力される直流信号成分ｓ１４が一定となるようにＰＭＴ印加電圧ｖ１０が制御される。そのうえで検出器２０により出力された電気信号ｓ１２より変調周波数信号ｓ１０に同期した交流信号成分ｓ１６をロック・インアンプ３０で取り出している。
【０００７】
こうして取り出された交流信号成分ｓ１６は、左の円偏光の透過光強度と右の円偏光の透過光強度との差を左右の円偏光の透過光強度の平均値で割った比に相当する。吸収円二色性、すなわち左の円偏光に対する吸光度と右の円偏光に対する吸光度との差は、まさにこの比として得られる量であり、例えば図２（ａ），（ｂ）に示されるような吸収円二色性スペクトルを得ることができる。
なお、円偏光変調器１６の動作は、ＰＥＭドライバ３６により管理されている。
【０００８】
図３には前記蛍光検出円二色性測定装置の概略構成が示されている。
なお、前記図１と対応する部分には符号１００を加えて示し説明を省略する。
同図に示す蛍光検出円二色性測定装置１１０は、前記図１に示す吸収円二色性測定装置１０をそのまま利用したものであり、前記図１に示す吸収円二色性測定装置１０では検知器１２０を透過光束Ｌ１１２の通過コース上に設置しているのに対し、蛍光検出円二色性測定装置１１０ではこれを円偏光束Ｌ１１０とほぼ直交する方向に設置している。
【０００９】
そして、この蛍光検出円二色性測定装置１１０ではサンプルセル１１８内の試料に左右円偏光Ｌ１１０の不等吸収が起こると、円偏光変調器１１６による変調周波数信号ｓ１１０に対応して試料から放射される蛍光Ｌ１１４にも強弱の波が生じ検知器１２０に到達するが、サンプルセル１１８と検知器１２０との間の光路中に、回折格子などを用いた分光器１３８を設け、該分光器１３８により励起光束の散乱光は除去するが、蛍光Ｌ１１４は通過させ検知器１２０に入射させる。
【００１０】
また、この蛍光検出円二色性測定装置１１０では、検知器１２０により出力された電気信号ｓ１１２のうち、直流信号成分ｓ１１４はＰＭＴ印加電圧制御回路１２６に入力され、このＰＭＴ印加電圧制御回路１２６により直流信号成分ｓ１１４が一定となるようにＰＭＴ印加電圧ｖ１０が制御される。そのうえで検出器１２０により出力された電気信号ｓ１１２より変調周波数信号ｓ１１０に同期した交流信号成分ｓ１１６をロック・インアンプ１３０で取り出している。
こうして取り出された交流信号成分ｓ１１６は、左の円偏光の蛍光強度と右の円偏光の蛍光強度との差を左右の円偏光の蛍光強度の平均値で割った比に相当する。蛍光検出円二色性は、まさにこの比として得られる量であり、例えば図４に示されるような蛍光検出円二色性スペクトルを得ることができる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
一般に、生理活性物質は稀少で、特別に幸運な場合を除いて、研究のために十分な量を確保することは、それほど容易なことでない。
通常、試料の採取のために多大な努力を払った上で、その解析、測定には尚微量な試料しか供することができないことが多く、その測定手段において、少しでも高い感度が永遠のテーマとして希求されている。
【００１２】
一方、測定手段の側からみると、円二色性スペクトルは左右の円偏光に対する試料物質の吸収の差を観測するものであり、吸収そのもの（紫外可視吸収スペクトル）の測定と比較し、原理的に２桁ないし数桁低い感度しか持ち得ない。
そのことからも、従来より、円二色性スペクトル測定において、少しでも高い感度が得られる技術の開発が強く望まれていたものの、これを解決することのできる適切な技術が存在しなかった。
【００１３】
すなわち、前記図３に示す蛍光検出円二色性測定装置１１０では、前記図１に示す吸収円二色性測定装置１０の大部分をそのまま利用したものであり、特に信号処理のための構成は、吸収円二色性測定装置１０のものをそのまま踏襲したものに他ならない。
そのために蛍光検出円二色性測定装置１１０では、蛍光検出という測定感度、測定の選択性の点で利点を有する測定原理を採用しているにも拘わらず、その利点を最大限に生かせる構成、特に信号処理のための構成となっていなかった。
すなわち、一般的に、蛍光検出円二色性測定装置においては蛍光検出円二色性スペクトルを得るため、交流信号成分を直流信号成分で割っている点にある。
【００１４】
例えば、前記図３に示す蛍光検出円二色性測定装置１１０では、交流信号成分ｓ１１６を直接直流信号成分ｓ１１４で割っていないものの、直流信号成分ｓ１１４が一定の大きさで得られるよう検知器１２０に与える印加電圧がコントロールされているので、交流信号成分ｓ１１６を直流信号成分ｓ１１４で割ったことと等価な結果が得られてしまう。
直流信号成分ｓ１１４もノイズを含まないことはあり得ない。このためにノイズを含んでいる直流信号成分ｓ１１４で交流信号成分ｓ１１６を割ると、交流信号成分ｓ１１６にノイズを増やす結果をもたらす。
【００１５】
すなわち、前記図３に示す蛍光検出円二色性測定装置１１０では、直流信号成分ｓ１１４のノイズがＰＭＴ印加電圧ｖ１１０にゆらぎを与え、それが検知器１２０での信号増幅率のゆらぎとなり、得られる電気信号ｓ１１２のゆらぎとなってそこに含まれる交流信号成分ｓ１１６にノイズの増加をもたらす。
さらに不利なことは、蛍光強度が小さい波長領域では、直流信号成分ｓ１１４、すなわち割る分母が小さくなり、割られた結果のノイズを著しく誇張する。極端な場合で蛍光がない波長領域では直流信号成分ｓ１１４が０となり、交流信号成分ｓ１１６／直流信号成分ｓ１１４は０／０の演算を行うこととなってしまうため、その値は不定、すなわち極端に大きなノイズを与える結果となってしまう。
【００１６】
本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は検出感度の向上を図ることができる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
そして、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、波長走査が行われる単色化された左右の円偏光を所定の変調周波数で交互に試料に照射して得られる蛍光の強度を測定し電気信号とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、前記電気信号のうち、左右の円偏光に切り換える周波数に同期した交流信号成分のみを単独に用いて、円二色性蛍光励起スペクトルを得ることにより、検出感度の向上を図ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、前記目的を達成するために本発明にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置は、波長走査が行われる単色化された左右の円偏光を所定の変調周波数で交互に試料に照射して得られる蛍光の強度を測定し電気信号とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、交流成分分離手段と、円二色性蛍光励起スペクトル取得手段と、を備えたことを特徴とする。
前記交流成分分離手段は、前記電気信号より前記変調周波数に同期した交流信号成分を分離する。
【００１９】
前記円二色性蛍光励起スペクトル取得手段は、前記交流成分分離手段により得られた変調周波数に同期した交流信号成分より、左右の円偏光で励起したときの蛍光強度差を求め、これを波長に対し記録して円二色性蛍光励起スペクトルとする。
なお、前記装置において、前記電気信号より直流信号成分を分離する直流成分分離手段と、
前記直流成分分離手段により得られた直流信号成分より、左右の円偏光で励起したときの平均の蛍光強度を求め、これを波長に対し記録して全蛍光励起スペクトルとする全蛍光励起スペクトル取得手段と、
を備えることが好適である。
【００２０】
また、前記装置において、前記電気信号は、前記直流成分分離手段により得られた直流信号成分に依存しない一定の印加電圧が印加された光電子増倍管により得られることが好適である。
また、前記装置において、前記全蛍光励起スペクトル取得手段により得られた全蛍光励起スペクトルを所定の波長区間で積分して０でない積分値を得る積分値取得手段と、
前記円二色性蛍光励起スペクトル取得手段により得られた円二色性蛍光励起スペクトルを、前記積分値取得手段により得られた０でない積分値で割算して、前記円二色性蛍光励起スペクトルの大きさを規格化する割算手段と、
を備えることが好適である。
【００２１】
さらに、前記装置において、前記交流成分分離手段により分離された交流信号成分を増幅する機構で最終的に得られる交流信号成分が、前記直流成分分離手段により分離された直流信号成分に対しほぼ３２９８０倍となるように増幅率を調節することが可能な増幅率調節手段を備えることが好適である。
【００２２】
ところで、試料が光のエネルギを吸収して励起したあと、そのエネルギの一部を熱などの形で失って最低励起状態に移り、そこから残りのエネルギーを再び光として放出するのが蛍光である。そして、試料に照射する光の波長を走査しながら蛍光強度を記録して得られるのが励起スペクトルである。一定波長の光を照射しながら検出する光の波長を走査して得られるのが蛍光スペクトルである。
放出される蛍光の強度は、吸収された光エネルギの大きさ、そこから最低励起状態に転換する効率、最低励起状態から蛍光を発して基底状態に戻る確率の積に比例する。そのうちの最低励起状態に転換する効率と、最低励起状態から蛍光を発して基底状態に戻る確率が同一である状況では、蛍光の強さは吸収の強さに比例することとなる。この状況は、どれかある特定の励起状態への遷移に伴う振動構造などを含めた１つの吸収帯の中では保証されるので、個々の帯（バンド）の形は吸収スペクトルのそれと相似形となる。
【００２３】
ここで、励起するのに円偏光を用いて、左右の円偏光を交互に試料に照射することを考える。前述のように１つのバンドの中で考える限り、蛍光強度は光吸収の強度に比例する。もし、試料が左右の円偏光を吸収するとき、吸収度合いに差があると、それはそのまま蛍光強度に反映されて検知されることとなる。この左右の円偏光に対する吸光度合いの差は（吸収）円二色性（ＣＤ）といわれるもので、ＣＤがプラスの吸収帯バンドでは、左円偏光で励起しているときの蛍光強度のほうが、右円偏光で励起しているときの蛍光強度と比較し強くなる。
結論として個々の吸収帯に関する限り、左の円偏光で励起したときの蛍光強度と右の円偏光で励起したときの蛍光強度の差には、吸収で観測する円二色性と同じ情報が含まれて観測されることとなる。
【００２４】
【発明の実施形態】
以下、図面に基づき本発明の好適な実施形態を説明する。
図５には本発明の一実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置が示されている。
なお、前記図３と対応する部分には符号１００を加えて示し説明を省略する。
同図に示す円二色性蛍光励起スペクトル測定装置２１０は、光源２１２と、分光器２１４と、ピエゾエラスティックモジュレータ（ＰＥＭ）よりなる円偏光変調器２１６と、サンプルセル２１８と、光電子増倍管（ＰＭＴ）よりなる検知器２２０と、カットオフフィルタ２３８と、プリアンプ２２２と、直流アンプ２２４と、ＰＭＴ印加電圧制御回路２２６と、交流アンプゲイン調整回路２２７と、交流アンプ２２８と、ロック・インアンプ２３０と、アンプ２３２と、Ａ／Ｄコンバータ２３４と、Ｉ／Ｏインターフェース２４０と、ＣＰＵ２４２と、円二色性蛍光励起スペクトル記憶装置２４４ａと、全蛍光スペクトル記憶装置２４４ｂと、主記憶装置２４４ｃを備える。
【００２５】
そして、光源２１２から出た光束は、分光器２１４で波長走査が行われ単色化され、さらに直線偏光となり、この分光器２１４の後方に設置された円偏光変調器２１６を通過する。この円偏光変調器２１６により所定の変調周波数信号ｓ２１０で変調され交互につくられた左右の円偏光Ｌ２１０は、サンプルセル２１８内の試料に照射される。
【００２６】
ここで、サンプルセル２１８内の試料に左右円偏光Ｌ２１０の不等吸収が起こると、円偏光変調器２１６の変調周波数信号ｓ２１０に対応して蛍光Ｌ２１４にも強弱の波が生じ、検知器２２０に到達するが、試料から放射された蛍光Ｌ２１４は、カットオフフィルタ２３８により励起光束の散乱光が取り除かれ、目的の蛍光波長域の光Ｌ２１４のみが検出器２２０に入射する。
そして、入射した蛍光Ｌ２１４は、検知器２２０により図６（ａ）に示されるような電気信号ｓ２１２に光電変換される。
【００２７】
なお、分光器２１４、円偏光変調器２１６の動作は、それぞれ分光器ドライバ２４６、ＰＥＭドライバ２３６により管理されている。
また、カットオフフィルタ２３８は、測定しようとする試料の示す蛍光バンドより少し短い波長の除去機能を有し、励起光の散乱光は除去するが、蛍光は透過させ検知器２２０に入射させることができるようなものを、試料毎に最適なものを選んで用いることが好適である。
【００２８】
以上のようにして本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置２１０を構成することにより、例えば図６（ａ）に示されるような電気信号ｓ２１２を得ることができる。
【００２９】
本発明において特徴的なことは、例えば図６（ａ）に示されるような電気信号ｓ２１２より、図６（ｂ）に示されるような変調周波数信号ｓ２１０に同期した、図６（ｃ）に示されるような交流信号成分ｓ２１６（交流信号成分の振幅）のみを抽出して、例えば図７に示されるような円二色性蛍光励起スペクトルを得るようにしたことである。
【００３０】
すなわち、本実施形態においては、検出感度の向上を図るためにノイズの点で不利な円二色性蛍光励起スペクトルの直流信号成分（図６（ｄ）参照）による割り算をなくし、本来の交流信号成分のみを用いて、図７に示されるような円二色性蛍光励起スペクトルを得るようにした。
これにより、前記図７に示されるような円二色性蛍光励起スペクトルは、全く同一の試料について測定し得られた前記図２（ｂ）に示されるような（吸収）円二色性スペクトル、及び図４に示されるような蛍光検出円二色性と比較し、同一濃度の同一試料について、基本的に同一の条件で測定したものはノイズが大幅に低減されていることが明らかである。
【００３１】
また、図７に示されるような円二色性蛍光励起スペクトルが、図４に示されるような蛍光検出円二色性スペクトルと比べて、蛍光のある波長領域で約５０％のノイズが低減され、蛍光のない領域ではノイズが１桁以上低減されていることが明白に示されており、本実施形態による円二色性蛍光励起スペクトル測定装置がノイズの低減において著しい効果を上げていることが容易に理解できる。
さらに、試料に測定しようとするする目的物質の他に、蛍光を有する夾雑物が含まれた場合を考える。その夾雑物が光学活性であるときには、その信号は円二色性蛍光励起スペクトルと蛍光検出円二色性スペクトルの両方に表れ、有利、不利については同等である。
【００３２】
しかしながら、夾雑物が光学活性でないときには、その蛍光は直流信号成分ｓ１１４にのみ表れ、円二色性蛍光励起スペクトルではその影響を受けず、光学活性な目的成分の信号のみを選択的に得ることができる。
このために本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトルが実際に利用されるときに含まれる可能性のある夾雑物が光学活性でないことが圧倒的に多いことを考えると、純粋に交流信号成分ｓ１１６のみを取り出すこととした本実施形態の効果を容易に理解することができる。
【００３３】
ところで、本実施形態のように円二色性蛍光励起スペクトルを得た場合の問題点は、その大きさ（縦軸）が規格化されていなくて、試料間で円二色性蛍光励起スペクトルを比較するためには試料の濃度、セル長、スペクトルバンド幅、ＰＭＴ印加電圧ｖ２１０等がスペクトルの縦軸に影響を与えるので、測定パラメータを厳密に一致させて測定を行うことが要求される。
【００３４】
そこで、本実施形態においては、検出感度を犠牲にしないでこの大きさ（縦軸）を規格化するために直流信号成分ｓ２１４も全蛍光励起スペクトル（図８（ｂ）参照）として取得する。
すなわち、前記図５に示す直流アンプ２２４により分離された直流信号成分ｓ２１４も、そのままＡ／Ｄコンバータ２３４、Ｉ／Ｏインターフェース２４０を介してＣＰＵ２４２に入力される。このＣＰＵ２４２に入力された直流信号成分ｓ２１４は、そのまま全蛍光励起スペクトル（図８（ｂ）参照）として直流成分記憶手段２４４ｂに記憶される。
【００３５】
取得後、ＣＰＵ２４２は、この全蛍光励起スペクトル（図８（ｂ）参照）を適当な波長区間で積分して０でない積分値を得る。
すなわち、図８（ｂ）に示されるような全蛍光励起スペクトルを、適当な波長区間（本実施形態においては２２０ｎｍ〜２５５ｎｍ）で積分して０でない積分値を得る。
そして、ＣＰＵ２４２は、得られた積分値で同図（ａ）に示されるような円二色性蛍光励起スペクトルを割算してその大きさ（縦軸）を規格化する。このようにしてＣＰＵ２４２により大きさの規格化された円二色性蛍光励起スペクトルは、主記憶手段２４４ｃに記憶され、この主記憶手段２４４ｃに記憶された円二色性蛍光励起スペクトルが試料の分析に用いられる。
【００３６】
直流成分記憶手段２４４ｂに記憶された全蛍光励起スペクトル（例えば図８（ｂ）参照）を積分して得られた積分値は、０でない１つの値であるからノイズとは無縁である。
したがって、このノイズとは無縁の積分値で、交流成分記憶手段２４４ａに記憶された、例えば図８（ａ）に示されるような円二色性蛍光励起スペクトルを割算しても、得られる円二色性蛍光励起スペクトルのノイズを増やさずに、その大きさを良好に規格化することができる。これにより、種々の試料間で円二色性蛍光励起スペクトルの比較を適正に行うこともできる。
【００３７】
但し、この全蛍光励起スペクトルの区間積分値による円二色性蛍光励起ススペクトルの縦軸の規格化も、１台の装置の中では確実にその有用性が保証されるが、装置間を考えた場合ではまだ十分でない。
それは円二色性蛍光励起スペクトル測定装置２１０において、直流信号成分ｓ１１４の増幅を行う直流アンプ２２４と交流信号成分ｓ１１６の増幅を行う交流アンプ２２８，ロック・インアンプ２３０，アンプ２３２の増幅率が独立に設定される機構となっていることに起因する。規格化の有用性を装置間でも保証するためには、これらのアンプの増幅率の比を適切な基準に基づいて校正することが必要となる。
【００３８】
このために本実施形態においては交流アンプゲイン調節回路２２７が、この校正機能を付与する。
すなわち、円二色性蛍光励起スペクトルは、本発明によって初めて測定されるようになったものであり、この目的のために適切な基準となる円二色性蛍光励起スペクトル標準物質は定められておらず、別の基準によらなければならない。
この別の基準には（吸収）円二色性スペクトルの標準物質（例えばｄ−１０−カンファースルフォン酸アンモニウム、Ｄ−パントラクトン、ｄ−トリスエチレンジアミンコバルト錯体などが利用できる）が値付けされていて適切である。
校正にあたっては、検知器２２０を移動させて透過光の通過コース上に設置し、（吸収）円二色性スペクトルの標準物質を測定し、交流信号成分を直流信号成分で割った結果が値付けされている（吸収）円二色性値に一致するように、交流アンプゲイン調整回路２２７を調整する。このときの増幅率は、理論上交流信号成分ｓ１１６が直流信号成分ｓ１１４に対しほぼ３２９８０倍となる。
【００３９】
なお、本実施形態においては、この交流アンプゲイン調整回路と２２７は、交流アンプ２２８のゲインを調整するように構成されているが、勿論、ロック・インアンプ２３２、アンプ２３２のゲインを調整しても構わない。
【００４０】
円二色性蛍光励起スペクトルと蛍光検出円二色性スペクトル、（吸収）円二色性スペクトルの関係
前述のように本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトルは、左右の円偏光で励起したときの励起スペクトルにおける差である。これに対し、従来の蛍光検出円二色性スペクトルは、蛍光強度で検出した（吸収）円二色性スペクトルとして扱われてきた。これと（吸収）二色性スペクトルとの関係は下記数１に表される。
【数１】

【００４１】
ただし、ΔＡは（吸収）円二色性スペクトル、Ｓは蛍光検出円二色性スペクトル、ΔＦは円二色性蛍光励起スペクトル、Ａは左右の円偏光に対する試料物質の吸収係数の平均値である。また、（吸収）円二色性スペクトルΔＡは、通常の円二色性分散計において試料物質を透過する左右の円偏光の強度の差ΔＩと平均値Ｉから、下記数２で表される。
【数２】

【００４２】
つぎに応用、実用の観点からこれら２者についてさらに議論する。
本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトルを示す図７は、全く同一の試料について測定して得られた従来の吸収円二色性スペクトルを示す図２（ｂ）、及び従来の蛍光検出円二色性スペクトル図４（ｂ）の何れのスペクトルと比較しても、高い感度が得られている。
【００４３】
これは、例えば通常の紫外可視分光光度計と分光蛍光光度計とで期待される検出感度の違い、あるいは、ＨＰＬＣにおいて紫外可視検出器と蛍光検出器で期待される感度の違い（至適な試料についてはいずれの場合も蛍光のほうが１桁ないし３桁高い感度が得られる）に匹敵するものであり、微少量しか用意することができないような試料の測定に、莫大な恩恵をもたらすものである。
【００４４】
さらに、これら２者を比較すると、円二色性蛍光励起スペクトルはΔＦ、蛍光検出円二色性スペクトルはＳを測定することとなる。Ｓは全蛍光強度（直流信号成分）で割算している分だけノイズが大きくなる。さらに蛍光のない波長領域では分母が０（もちろん分子も０）となり、０／０を演算する結果、ノイズがより拡大して、スペクトルの質が著しく低下するという宿命をもっている。
これに対し、本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトルは、ΔＦは割り算しない分だけノイズが少なく、蛍光のない波長領域でもノイズが拡大することはなく、スペクトルの質が確保され、試料の量に対する感度の点では、顕著な利点を有する。
【００４５】
以上のように、本発明の実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置２１０によれば、前述のような円二色性蛍光励起スペクトルを得ることとしたので、至適な試料については従来の（吸収）円二色性スペクトル測定に比較し、１桁ないし２桁高い感度が得られる。これは画期的なことである。
【００４６】
例えば、生物体内に存在する生理活性物質の構造を研究する例を考える。そのためには現状では多数、多量の生物を集め、そこから目的の物質を取り出す必要があったとする。
ところが、本実施形態のように感度が２０倍向上すると、必要となる生物の数量が１／２０で済むこととなって、試料の確保に要求される努力は飛躍的に軽減されることとなる。また、測定のための試料量の確保が不可能な生理活性物質の例の数多く存在しているが、感度が非常に向上したことにより、そのような物質の分析が実現する可能性も高くなるため、研究の幅が著しく広がるものと期待される。
【００４７】
また、蛍光で検出することで選択性も向上し、化合物の特定の部位に特異的な解析が可能となる。さらに、生のままでは蛍光をもっていない物質についても、蛍光の官能基を化学的に導入することにより、高感度に測定解析する道が開けたことになり、その効果は極めて大きいと思われる。
【００４８】
なお、本発明の円二色性蛍光励起スペクトル測定装置としては、前記各構成に限定されるものではなく、発明の要旨の範囲内で種々の変形が可能である。
例えば、このような円二色性蛍光励起スペクトル測定装置２１０においては、もともと微弱な蛍光をさらに解析しなければならないため、通常の蛍光測定装置と比較しても一層の蛍光集光効率の向上が要求される。
【００４９】
以下、このような蛍光の集光効率の改善方法について説明する。
サンプルセルと検知器の配置状態
本実施形態においては、サンプルセル２１８と検知器２２０の間の光路中には集光系を介さず、かつ、サンプルセル２１８と検知器２２０を近接させることが好適である。
すなわち、従来より、円二色性（ＣＤ）と蛍光検出円二色性（ＦＤＣＤ）の装置上の互換性を確保するため、またサンプルセル２１８の設置場所に空間を確保してその扱いを容易にするため、図９（ａ）に示されるように検知器２２０はサンプルセル２１８より離して設置し、その間に集光系であるレンズ２５０，２５２を設置することが一般的であった。
しかしながら、前記従来の構成では、レンズの開口角は限られていて十分大でなく、その分、集光効率も限られていた。また、集光系は最低２枚のレンズ２５０，２５２を用いているため、レンズ表面における反射により２０％程度の光をロスしていた。
【００５０】
そこで、本実施形態においては、同図（ｂ）に示されるように、前記従来の集光系であるレンズ２５０，２５２を介さず、検知器２２０とサンプルセル２１８を直近に設置させている。
この結果、サンプルセル２１８内の試料から放射された蛍光Ｌ２１４の大部分を検出器２２０に入射させることができる。これにより、蛍光Ｌ２１４の集光効率を最大とすることができるので、検出感度の向上を図ることができる。
【００５１】
カットオフフィルタ
また、本実施形態において検知器側の分光器としては、カットオフフィルタ２３８を用いることが好適である。
すなわち、従来の蛍光分光光度計では、検出する蛍光の波長を選択するために回折格子を用いた分光器を組み込むのが普通であった。これにより、蛍光の波長を可変にできる、蛍光の波長純度をコントロールできる、などの利点を有するものの、光学素子の効率のため光のロスが避けられず、その分、機構が複雑でコストがかかるなどのマイナス面もあった。
【００５２】
そこで、本実施形態においては、励起光の散乱さえ取り除くことができれば、それより長い波長の光の全部を用いても何等問題もなく、むしろ光の量が増えて感度の向上のために好都合であることから、検知器側の分光器としてカットオフフィルタ２３８を用いた。
このカットオフフィルタ２３８は、試料の蛍光バンドの波長に応じて最適の吸収帯を有するものを選んで用いるが、前記図５に示す円二色性蛍光励起スペクトル測定装置２１０では、例えば３２０ｎｍ以下の波長を除去している。
また、このカットオフフィルタ２３８の厚さは数ｍｍと薄く、その後段に設置する検知器２２０をサンプルセル２１８に出来る限り近接させて、その開口比を大きく確保することにも役立つ。これにより、集光効率の向上を図ることができるので、検出感度の向上を図ることもできる。
【００５３】
光トラップ
また、本実施形態においては、サンプルセル２１８を透過した透過光束Ｌ２１２を除くために、前記図９（ｂ）に示されるような光トラップ２５４を設けることが好適である。
すなわち、サンプルセル２１８に入れられた試料を透過した透過光束Ｌ２１２は、試料室内で反射され迷光となって、測定の妨害となる。また、円偏光は境界面で反射するとき偏光状態が変わり、最悪の場合、逆の円偏光となって試料の励起に関わり折角の信号を小さくしてしまう結果をもたらす。
【００５４】
そこで、本実施形態においては、これらの悪影響を取り除くために、前記図９（ｂ）に示されるような、透過光Ｌ２１２を除去することが可能な光トラップ２５４を設けることが好適である。これにより、ノイズの低減と最大信号の確保を行うことができる。
【００５５】
凹面鏡
また、本実施形態においては、前記図９（ｂ）に示されるように、サンプルセル２１８を間に挟んで検知器２２０の反対側に凹面鏡２５６などの反射鏡を設置することが好適である。
すなわち、試料からの蛍光Ｌ２１４は、励起光Ｌ２１０の照射方向に関わらず、全包囲に放射される。そして、検出に用いられるのは、そのうちの１方向である検知器２２０方向でしかなく、その他は無駄となる。
【００５６】
そこで、本実施形態においては、サンプルセル２１８を間に挟んで検知器２２０の反対側に凹面鏡２５６を設置し、その焦点をサンプルセル１８のほぼ中央部に位置させる。これにより、検知器２２０の反対側に放射された蛍光Ｌ２１４も、ここで反射されてサンプルセル２１８に戻り、そのまま検知器２２０に入射することができる。
この結果、検出器２２０に入射する蛍光Ｌ２１４の量を増やすことができるので、検出感度の向上を図ることができる。
【００５７】
内面反射型の筒形反射鏡
さらに、本実施形態においては、図１０に示されるようにサンプルセル２１８として円筒形セルを用い、該円筒形セルの周囲を一部除いた内面反射型の円筒形鏡２５８あるいは楕円筒形鏡２６０などの反射筒形鏡により囲み、光の利用効率を上げることも好適である。
すなわち、サンプルセル２１８として円筒形セルを用いたときの光利用効率をさらに上げるためには、図１０に示されるようにサンプルセル２１８である円筒形セルの周りに内面反射型の筒形反射鏡を設置することが好適である。
【００５８】
その１つは、同図（ａ）に示されるような内面反射型の円筒形鏡２５８の一部（例えば検知器２２０の口径とほぼ同様）を切り欠いたものである。
もう１つは、同図（ｂ）に示されるような内面反射型の楕円筒形鏡２６０を用いることもできる。そして、この楕円筒形夾２６０の切り抜き部分（例えば検知器２２０の口径とほぼ同様）から遠い方の焦点が、サンプルセル２１８である円筒形セルの中心に一致するように設置する。これにより、サンプルセル２１８である円筒形セルから放射された蛍光を、もう１つの焦点に集光した後、効率的に検知器２２０に導くことができる。
【００５９】
この結果、試料から放射された蛍光のうち、検知器２２０方向のみでなく、実質的に全方位に放射された蛍光を検知器２２０に入射させることができる。これにより、検知器２２０に入射する蛍光の量を増やすことができるので、検出感度の向上を図ることができる。
【００６０】
サンプルセルの形状
本実施形態においては、サンプルセル２１８として例えば４面透過形の角形セルを用いることも可能であるが、円筒形セルを用いることがより好適である。
１つには、放射される蛍光Ｌ２１４の集光効率の改善である。すなわち、試料と空気の屈折率の違いにより、サンプルセル２１８として角形セルを用いた場合、該角形セルから外に蛍光が出るとき、例えば図１１（ａ）に示されるように蛍光Ｌ２１４が開くように屈折する。
このため、本実施形態において検知器２２０に導かれる蛍光Ｌ２１４は、その検知器２２０の口径と、サンプルセル２１８からの距離で幾何学的に決まる開口立体角に比較し少なくなる。
【００６１】
これに対し、同図（ｂ）に示されるようにサンプルセル２１８として円筒形セルを用いた場合、円筒の回転軸方向は事情は変わらないが、径方向では屈折がないため、その分だけ、高い光の利用効率を確保することができるので、検出感度の向上を図ることができる。
以上のようにしてサンプルセル２１８、検知器２２０、カットオフフィルタ２３８、光トラップ２５４、凹面鏡２５６、内面反射型の筒形反射鏡２５８，２６０などを適宜用いて蛍光の集光効率の向上を図ることにより、蛍光のように微弱な光を検出する場合でも検出感度の向上を図ることができる。
【００６２】
つぎに、試料の利用効率の改善について説明する。
すなわち、図１２（ａ）に示すように、サンプルセル２１８の励起光束Ｌ２１０の通らない部分（図中黒い部分）は、測定に関与しない部分であり、限られた試料の量から、より濃い試料溶液を調整するためには無駄な部分となる。
【００６３】
そこで、本実施形態においては、サンプルセル２１８として円筒形セルを用い、同図（ｂ）に示すように、励起光束Ｌ２１０とほぼ同じ形状の円形に形成された端部であるセル窓板より励起光束Ｌ２１０を入射させることにより、同図（ａ）に示すようにサンプルセル２１８として角形セルを用い、側方のセル窓板より励起光束Ｌ２１０を入射させた場合に比較し、その無駄な部分（図中黒い部分）を低減することができるので、試料の利用効率の改善を図ることができる。
【００６４】
また、それ以外にもサンプルセル２１８として円筒形セルを用いると、つぎのような利点が得られる。
すなわち、円筒形セルの方が角形のものに比較し、前記励起光束Ｌ２１０の入射するセル窓板の歪みを少なく作成することができる。この歪みは、本実施形態において励起円偏光の偏光状態を乱し、ベースラインの曲がりの原因となるものであるため、サンプルセル２１８としてこの歪みの少ない円筒形セルを用いることにより、得られるスペクトルの質的な向上を図ることもできる。
【００６５】
サンプルセルの高低調節機構
また、本実施形態においては、サンプルセル２１８の高さを調節することが可能な機構を設けることが好適である。
すなわち、生体成分のような試料では、その絶対量を確保することが困難であることが多く、測定には限られた微少量しか用いられないことが一般的である。一方、測定で得られる信号強度は、濃度に依存する。
したがって、感度を確保するためには、利用できる試料を出来るだけ少量の溶媒に溶解して出来る限り濃い溶液とし、測定に供するのが最善である。より具体的には、測定において励起光に照射されない部分を最小にするようにし、それに必要なギリギリの量の試料溶液を調整するのが最善である。
【００６６】
このために本実施形態においては、図１３に示されるように、その底部２６２ａが高さ調節自在で、該高さ調節が自在の底部２６２ａ上にサンプルセル２１８が設けられたセルホルダ２６２と、セルホルダ底部２６２ａの高さを調節することが可能な高低調節手段２６４を備えることも好適である。
そして、高低調節手段２６４を駆動させて励起光束Ｌ２１０をカバーすることのできるギリギリの高さまでサンプルセル２１８を持ち上げることにより、サンプルセル２１８として円筒形セルを用いた場合は勿論、たとえ角形のものを用いた場合でも、試料溶液２６６を該励起光束Ｌ２１０をカバーすることのできる最低限の試料量で蛍光測定を適正に行うことができるので、試料の利用効率の向上を図ることができる。
【００６７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置によれば、検出器により出力された電気信号より、直流信号成分で割ることなく交流信号成分のみを用いて、円二色性蛍光励起スペクトルを得るので、検出感度の向上を図ることができる。これにより、従来に比較し少ない試料量であっても、従来と同等もしくはそれ以上の検出感度でその試料の絶対構造情報、立体構造情報を得ることもできる。
なお、前記装置において、前記検出器により出力された電気信号より直流信号成分を分離し、該直流信号成分より左右の円偏光で励起したときの蛍光強度の平均値を求め、これを波長に対し記録することにより全蛍光励起スペクトルを得ることができる。
また、前記装置において、前記検出器として、前記直流信号成分に依存しない一定の印加電圧が印加された光電子増倍管を採用することにより、ノイズを大幅に低減することができるので、検出感度の向上を図ることができる。
また、前記装置において、前記全蛍光励起スペクトルを所定の波長区間で積分して０でない積分値を得ることにより、ノイズとは無縁の積分値を得ることができる。そして、このノイズとは無縁の積分値で、前記円二色性蛍光励起スペクトルを割算することにより、ノイズを増やすことなく前記円二色性蛍光励起スペクトルの大きさを規格化することができる。これにより、種々の試料間で円二色性蛍光励起スペクトルを適正に比較することもできる。
さらに、前記装置において、最終的に得られる交流信号成分が、前記直流信号成分に対しほぼ３２９８０倍となるように増幅率を調節することが可能な増幅率調節手段を備えることにより、前記直流信号成分及び交流信号成分の増幅率の比を適切な基準に基づき校正することができるので、前記円二色性蛍光励起スペクトルの大きさの規格化の有用性を複数の装置間でも保証することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の（吸収）円二色性スペクトル測定装置の概略構成の説明図である。
【図２】図２（ａ）は前記図１に示す装置で得られた（吸収）円二色性スペクトルの１例、図２（ｂ）は１／１００の濃度の試料について得られた（吸収）円二色性スペクトルの１例である。
【図３】従来の蛍光検出円二色性スペクトル測定装置の概略構成の説明図である。
【図４】図４は前記図３に示す装置で得られた蛍光検出円二色性スペクトルの１例である。
【図５】本発明の実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置の概略構成の説明図である。
【図６】図６（ａ）は図５に示す装置の検出器により出力された電気信号の説明図、図６（ｂ）は変調周波数信号の説明図、図６（ｃ）は円二色性蛍光励起スペクトルの交流信号成分の説明図、図（ｄ）は全蛍光励起スペクトルの直流信号成分の説明図である。
【図７】図５に示す装置で得られた円二色性蛍光励起スペクトルの交流信号成分の１例である。
【図８】図５に示す装置の割算工程の説明図である。
【図９】図５に示す装置で好適に用いられるサンプルセルと検知器の配置状態の説明図である。
【図１０】図５に示す装置で好適に用いられる内面反射型の筒形反射鏡の説明図である。
【図１１】図５に示す装置でのサンプルセルの形状の違いによる蛍光の集光効率の違いの説明図である。
【図１２】図５に示す装置でのサンプルセルの形状の違いによる試料の利用効率の違いの説明図である。
【図１３】図５に示す装置で好適に用いられるサンプルセルの高低調節手段の説明図である。
【符号の説明】
２１０ … 円二色性蛍光励起スペクトル測定装置
２１２ … 光源
２１４ … 励起側分光器
２１６ … 円偏光変調器
２１８ … サンプルセル
２２０ … 検知器（光電子増倍管）
２２４ … 直流アンプ（直流成分分離手段）
２２７ … 交流アンプゲイン調整回路（増幅率調節手段）
２３０ … ロック・インアンプ（交流成分分離手段）
２３８ … カットオフフィルタ（蛍光側分光器）
２４２ … ＣＰＵ（積分値取得手段、割算手段）
２４４ａ … 交流成分記憶手段
２４４ｂ … 直流成分記憶手段
２６６ … 試料溶液（試料）
ｓ２１０ … 変調周波数信号
ｓ２１２ … 検知器により出力された電気信号
ｓ２１４ … 直流信号成分
ｓ２１６ … 交流信号成分

Claims (5)

1. 波長走査が行われる単色化された左右の円偏光を所定の変調周波数で交互に試料に照射して得られる蛍光の強度を測定し電気信号とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、
   前記電気信号より前記変調周波数に同期した交流信号成分を分離する交流成分分離手段と、
   前記交流成分分離手段により得られた変調周波数に同期した交流信号成分より、左右の円偏光で励起したときの蛍光強度差を求め、これを波長に対し記録して円二色性蛍光励起スペクトルとする円二色性蛍光励起スペクトル取得手段と、
   を備えたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
2. 請求項１記載の円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、前記電気信号より直流信号成分を分離する直流成分分離手段と、
   前記直流成分分離手段により得られた直流信号成分より、左右の円偏光で励起したときの平均の蛍光強度を求め、これを波長に対し記録して全蛍光励起スペクトルとする全蛍光励起スペクトル取得手段と、
   を備えたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
3. 請求項１または２記載の円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、前記電気信号は、前記分離手段により得られた直流信号成分に依存しない一定の印加電圧が印加された光電子増倍管により得られることを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
4. 請求項１ないし３の何れかに記載の円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、
   前記全蛍光励起スペクトル取得手段により得られた全蛍光励起スペクトルを所定の波長区間で積分して０でない積分値を得る積分値取得手段と、
   前記円二色性蛍光励起スペクトル取得手段により得られた円二色性蛍光励起スペクトルを、前記積分値取得手段により得られた０でない積分値で割算して、前記円二色性蛍光励起スペクトルの大きさを規格化する割算手段と、
   を備えたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
5. 請求項１ないし４の何れかに記載の円二色性蛍光励起スペクトル測定装置において、前記交流成分分離手段により分離された交流信号成分を増幅する機構で最終的に得られる交流信号成分が、前記直流成分分離手段により分離された直流信号成分に対しほぼ３２９８０倍となるように増幅率を調節することが可能な増幅率調節手段を備えたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。

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