WO2007052740A1

WO2007052740A1 - エクオル濃度調節剤

Info

Publication number: WO2007052740A1
Application number: PCT/JP2006/321963
Authority: WO
Inventors: Hirokazu Tsuji; Koji Nomoto; Hideyuki Akaza
Original assignee: Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2006-11-02
Publication date: 2007-05-10
Also published as: EP2702985A1; JP5521027B2; AU2006309706B2; JP2013091652A; KR20080072635A; EP1944021B1; US9080197B2; EP1944021A1; CA2628803C; AU2006309706A1; US20090253643A1; EP2702985B1; JPWO2007052740A1; CN101300000A; KR101409194B1; EP1944021A4; JP5222562B2; CA2628803A1; CN101300000B

Abstract

　体内のエクオル濃度を調節する作用を有し、かつ、長期に渡って摂取可能な安全性の高い医薬、飲食品、並びにエクオル変換能を有する微生物の選択培地、検出方法を提供することを目的とする。　各種糖類を有効成分とするエクオル濃度上昇又は低下剤；当該濃度上昇又は低下剤製造のための各種糖類の使用；各種糖類を有効量投与することを特徴とするエクオル濃度上昇又は低下方法；各種糖類を含有することを特徴とするエクオル変換能を有する微生物の選択培地；及び当該培地を用いるエクオル変換能を有する微生物の検出方法。

Description

明細書

ヱタオル濃度調節剤

技術分野

[0001] 本発明は、エタオル濃度調節剤、エタオル変換能を有する微生物の選択培地及び検出方法に関する。

背景技術

[0002] 大豆食品に多く含まれるイソフラボンは、不定愁訴等の更年期障害の改善や骨粗鬆症の予防、高脂血症や動脈硬化の予防、乳がんや前立腺がんの予防等に効果がある機能性成分として知られている。近年の研究により、イソフラボンの一つであるダィゼインは、体内の腸内細菌によってエストロゲン作用や抗酸ィ匕作用がより強力なェタオル (Equol)に代謝されることが明らかになり、エタオルは体内で上記の作用を奏する主要な有効成分の一つとして注目されて、る。

[0003] 体内でのダイゼインからエタオルへの産生は全てのヒトで一律に行われるのではなぐその産生能には個人差があり、 30〜50%のヒトがエタオル産生能を有することが報告されている（非特許文献 1)。そこで、エタオル産生能を有する腸内細菌ゃェクオル産生を促進する物質の探索が精力的に行われており、エタオル産生能を有する微生物として、バタテロイデス'ォバタス、ストレプトコッカス'インターメディアス、ストレプトコッカス ·コンステラータスが報告されている（特許文献 1)。また、ダイゼイン等と共に大豆オリゴ糖を配合した飼料を家禽に投与してエタオル含有卵を得ること (特許文献 2)、フラタトオリゴ糖 (非特許文献 2)やツイントース (R) (非特許文献 3)がエタオル産生を促進することが報告されている。なお、特許文献 1では、エタオル産生能を有する微生物の維持、増殖成分として乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラタトオリゴ糖、ガラタトオリゴ糖等のオリゴ糖が挙げられているが、これらの糖類はいずれも微生物の維持、増殖に寄与する一般的に知られている栄養成分として挙げられて!/、るもので、これらの糖類がエタオル産生に対してどのように作用するかは何ら示されて、な！/、。

[0004] 一方、体内でエストロゲン作用を示す物質は、いわゆる環境ホルモン（内分泌かく乱化学物質)と呼ばれ、ヒトに対して精子の減少、生殖能力の低下、乳がんの増加等に関与することが疑われて、る。イソフラボンやエタオルも植物性エストロゲン物質の一つとして知られ、その過剰摂取や体内での過剰生産はヒトに対して悪影響を及ぼす可能性がある。特にエストロゲン作用がイソフラボンに比べて数十倍高、エタオルが体内で過剰生産される場合は、その生産を抑制することが重要となる。しかしながら、エタオルの産生を抑制する微生物や物質としてはラクトバチルス ·ガセリ（非特許文献 4)、ィヌリン (非特許文献 5)、フラ外オリゴ糖 (非特許文献 6)が報告されているのみである。

[0005] 従って、体内のエタオル濃度を適切な状態に調節することは、上記に示した様々な疾患の治療や改善、或いはその予防といった観点や、エタオルの環境ホルモン様作用により引き起こされる悪影響を回避するといつた観点から非常に重要であり、体内のエタオル濃度を調節する作用を有し、かつ、長期に渡って摂取可能な安全性の高い物質が要望されている。

[0006] し力しながら、体内のエタオル濃度を調節する微生物や物質は上記に報告されているのみで選択肢が非常に狭ぐその効果も十分なものではな力つた。また、ェクオル変換能を有する微生物の選択培地も報告されておらず、エタオル変換能を有する微生物を簡便'迅速にスクリーニングしたり、検体中のエタオル変換能を有する微生物を検出するための選択培地の確立が切に要望されていた。

特許文献 1：国際公開 99Z7392号パンフレット

特許文献 2 :特開 2003— 310177号公報

非特許文献 l : Proc Soc Exp Biol Med、 Vol. 217、 No. 3、 p335— 339 (19 98)

非特許文献 2 :J Nutr, Vol. 132、 p2048— 2054 (2002)

非特許文献 3： 2005年度日本農芸化学会大会講演要旨集、 p97 (2005) 非特許文献 4 :食品研究成果情報、 No. 17、 pl8 - 19 (2005)

非特許文献 5 :J Agric Food Chem、 Vol. 52、 No. 10、 p2827— 2831 (2004

)

非特許文献 6 :Arch Microbiol, Vol. 183、 No. 1、 p45— 55 (2005) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 従って本発明は、体内のエタオル濃度を調節する作用を有し、かつ、長期に渡って摂取可能な安全性の高い医薬、飲食品、並びにエタオル変換能を有する微生物の選択培地、検出方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、食経験豊富で安全な物質である各種糖類がエタオル濃度を上昇又は低下させる作用を有することを見出し、また、エタオル濃度を上昇させる作用を有する糖類を含有する培地を用いれば、エタオル変換能を有する微生物を選択的に増殖させることができることを見出し、本発明を完成した。

[0009] すなわち、本発明は、アド-トール、ァラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラタチトーノレ、メレチトース、トレノヽロース、リボース、ソノレボース、キシロース、イノシトーノレ及びソルビトールカゝら選ばれる 1以上を有効成分とするエタオル濃度上昇剤；ェクオル濃度上昇剤を製造するためのこれらの糖類力選ばれる 1以上の使用；並びにこれらの糖類力選ばれる 1以上を有効量投与することを特徴とするエタオル濃度上昇方法を提供するものである。

[0010] また、本発明は、グルコース、ラタトース、ラクチュロース、メリビオース、ラフイノース、シュクロース及びガラタトオリゴ糖から選ばれる 1以上を有効成分とするエタオル濃度低下剤;エタオル濃度低下剤を製造するためのこれらの糖類カゝら選ばれる 1以上の使用；並びにこれらの糖類から選ばれる 1以上を有効量投与することを特徴とするエタオル濃度低下方法を提供するものである。

[0011] また、本発明は、アド-トール、ァラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラクチトーノレ、メレチトース、トレノヽロース、リボース、ソノレボース、キシロース、イノシトーノレ及びソルビトール力選ばれる 1以上を含有することを特徴とするエタオル変換能を有する微生物の選択培地を提供するものである。

[0012] さらに、本発明は、アド-トール、ァラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラクチト一ノレ、メレチトース、トレノヽロース、リボース、ソノレボース、キシロース、イノシトーノレ及びソルビトールカ選ばれる 1以上を含有する選択培地を用いて、検体に含まれるェタオル変換能を有する微生物を培養することを特徴とする検体中のエタオル変換能を有する微生物の検出方法を提供するものである。

発明の効果

[0013] 本発明で用いられる各種糖類は、優れたエタオル濃度の上昇作用、又は低下作用を有し、これらの糖類は食経験も豊富で安全性が高いことから、本発明のエタオル濃度上昇剤及び低下剤は、体内のエタオル濃度を適切な状態に調節するために日常的に安全に利用することができる。また、本発明の選択培地を用いることにより、エタオル変換能を有する微生物を簡便'迅速にスクリーニングしたり、検体中のエタオル変換能を有する微生物を検出することができる。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]エタオル変換に及ぼす各種糖類の影響を示すグラフである。

[図 2]選択培地によりエタオルプロデューサーの糞便を継代培養した際のダイゼイン力ものエタオル変換能の変化を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

[0015] 本発明に用いられる糖類は、アド-トール (Adonitol)、ァラビノース（Arabinose) 、エリスリトール（Erythritol)、ガラクトース（Galactose)、ラタチトール（Lactitol)、メレチトース (Melezitose)、トレハロース（Trehalose)、リボース（Ribose)、ソノレボース（Sorbose)、キシロース（Xylose)、イノシトール（Inositol)、ソルビトール（Sorbito 1)、グルコース（Glucose)、ラタトース（Lactose)、ラクチュロース (Lacturose)、メリビオース（Melibiose)、ラフイノース (Raffinose)、シュクロース（Sucrose)、ガラタトオリゴ糖（Galacto— oligosaccharide)である。これらの糖類は、 D体 L体のいずれを用いてもよいが、好ましくは、 D体である。また、無水物、 5水和物等の水和物を用いることちでさる。

[0016] トレハロースには、 2分子のグルコースの結合様式の相違により、 α , α体、 a , j8 体及び j8 , β体の異性体が存在し、本発明にお、ては、これらの、ずれも異性体も用いることができる力好ましくは a , α体である。

[0017] 本発明に用いられるイノシトールには、 9種類の立体異性体 (myo—イノシトール、 D ( + )—イノシトール、 L— (―)イノシトール、 muco—イノシトール、 scyll—イノシト一ノレ、 cis—イノシトーノレ、 epi—イノシトーノレ、 alio—イノシトーノレ、 neo—イノシトーノレ )が存在する。天然には myo—イノシトール、 D ( + )—イノシトール、 L— (一）イノシトール、 muco—イノシトール、 scyll—イノシトールが存在する力入手し易さの観点から、 myo—イノシトールを使用することが好ましい。また、当該イノシトールは 2種以上の立体異性体を併用することができる。

[0018] 本発明で用いられるガラタトオリゴ糖とは、分子内に少なくとも 1以上のガラクトース残基があるオリゴ糖の総称であり、例えば単糖が 2個〜 9個結合した糖が挙げられる。また、ガラタトオリゴ糖としては、ガラクトースが j8 1—2結合したもの、 /3 1—3結合したもの、 j8 1—4結合したもの、 j8 1—6結合したものが挙げられるが、 |8 1—4結合したもの、 j8 1—6結合したものを有するガラタトオリゴ糖が特に好ましい。本発明にお V、ては、これらのガラタトオリゴ糖の混合物を用いることもできる。

[0019] 本発明の糖類は、合成品や天然由来抽出物等の市販品を使用してもよぐまた、これらの糖類を多く含む天然由来素材として使用してもよい。具体的に、アド-トールを多く含む素材としては、植物の根やリボフラビン含有素材が挙げられ、ソルボースを多く含む素材としては植物の果実などが挙げられ、メレチトースを多く含む素材としては植物の蜜や分泌液が挙げられ、トレハロースを多く含む素材としてはキノコ類が挙げられる。

[0020] 各種糖類のエタオル濃度調節活性は、例えば、エタオル産生能を有するヒト（エタオルプロデューサー）力も糞便を採取し、採取した糞便にエタオルの基質となるダイゼイン (Daidzein)と対象とする糖類を添加し培養を行って培養液中のエタオル濃度を測定し、糖類を含まない培養液中のエタオル濃度と比較して、次式に当てはめることにより調べることができる。

エタオル濃度調節活性 (％) = (対象とする糖類を含む培養液中のエタオル濃度) Z (糖類を含まない培養液中のエタオル濃度） X 100

[0021] ここでエタオルプロデューサーより採取した糞便は遠心洗浄処理したものを用いることが好ましぐ培養はヒト腸管内の状態を再現するために、嫌気培養で行うことが望ましい。エタオル濃度は常法に従って測定することができ、すなわち、液体クロマトグラフィーあるいは LC— MSにより測定すればよい。本発明のエタオル濃度上昇作用を有する糖類はエタオル濃度調節活性が 200%以上の糖類であり、特に 400%以上である糖類がより好ましい。また、本発明のエタオル濃度低下作用を有する糖類はェタオル濃度調節活性が 50%以下の糖類であり、特に 10%以下である糖類がより好ましい。

[0022] エタオルプロデューサーより採取した糞便にダイゼインと抗生物質を添加して嫌気培養するとダイゼインからのエタオルの産生が阻害されることから、各種糖類によるェタオル濃度調節作用は、糞便中に存在する微生物を介した作用であると考えられる。すなわち、エタオル濃度上昇作用を有する糖類はエタオル変換能を有する微生物を選択的に増殖させたり、或いは微生物のエタオル変換能を亢進して、るものと推測され、エタオル濃度低下作用を有する糖類は、エタオル変換能を有する微生物の増殖を選択的に阻害したり、或いは微生物のエタオル変換能を阻害して、るものと推測される。

[0023] また、エタオル濃度上昇作用を有する糖類を含有する培地は、エタオル変換能を有する微生物の選択培地として利用することができる。この選択培地は、アド-トール、ァラビノース、エリスリトーノレ、ガラクトース、ラタチトール、メレチトース、トレハロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール及びソルビトールから選ばれる 1以上を含有する力これら糖類のほか、エタオルの基質となるダイゼインを添加することが好ましい。培地において、例えば、使用し得る状態にしたときの全体量に対して、糖類は 0. 3〜3質量％、ダイゼインは 0. 0025-0. 25質量％の範囲で使用可能である。ここで、培地とは、培養に直ちに使用し得る状態にあるもののほか、水に溶解して滅菌した後に培養に供するための、水以外の培地構成成分の混合物も含む。培地は、液体培地として、また寒天等を加えて固形培地としても使用できる。選択培地には、目的とする微生物の選択性を高める目的で抗生物質を添加してもよぐコリスチン（Colistin)やクロラムフエ-コール（Chloramphenicol)などが、使用し得る状態にしたときの全体量に対して、例えば、 1〜： LOO /z gZmlの範囲で使用可能である。また、その他の窒素源等の適当な成分を加えて使用してもよいが、エタオル変換能を有する微生物の増殖を阻害したり、微生物のエタオル変換能を阻害する成分の使用は好ましくない。加えることができる成分としては、例えば、ペプトン、トリプチケースペプトン、イーストエキス、へミン、ビタミン K1等のビタミン、 L—システィン塩酸塩、 K H PO 、 K HPO 、 NaCl、（NH ) SO 、 CaCl 、 MgSO等が挙げられる。本発明

2 4 2 4 4 2 4 2 4

の培地中に含まれる成分のうち、エタオル濃度上昇作用を有する糖類やダイゼイン以外の成分の組成は、例えば、 PY培地、 GAM培地、 BHI培地などの組成とすることがでさる。

[0024] この選択培地を用いて、ダイゼインからのエタオル産生能 (変換能）を確認しながら、糞便等の検体を継代培養していくことで、エタオル変換能を有する微生物をスクリ一-ングすることが可能となり、エタオル変換能を有する微生物を取得することができる。また、この選択培地により検体中のエタオル変換能を有する微生物の検出も可能となる。エタオル変換能を有する微生物の検出は、例えば、本発明の培地を用いて検体を培養したのち、培地中のエタオル濃度を測定し、エタオル濃度上昇が観察された場合に、検体中にはエタオル変換能を有する微生物がいると判断することにより行うことができる。ここでエタオル濃度上昇についての対照には、本発明に用いられる糖類が無添加である以外は共通の組成の培地を用いたものを用いればょ、。

[0025] 本発明の検出方法の検体に特に制限はないが、エタオル変換能を有する微生物をスクリーニングする場合は、エタオル変換能を有する微生物が存在する可能性のある検体を用いることが望ましぐ特に糞便や消化管内容物等が好適に用いられる。

[0026] 本発明のエタオル濃度上昇作用を有する糖類 (アド-トール、ァラビノース、エリスリトーノレ、ガラクトース、ラタチトール、メレチトース、トレノヽロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール、ソルビトール）は体内、血中、大腸内等の腸内等におけるエタオル濃度上昇剤として利用でき、これら糖類を有効成分とするエタオル濃度上昇剤は、不定愁訴等の更年期障害、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、乳がん、前立腺がん、月経前症候群等のイソフラボンが関与する様々な疾病の治療や改善、或いはその予防等の目的に利用できる。ここで、本発明のエタオル濃度上昇作用を有する糖類は、単独で用いてもよぐ又は 2種類以上組み合わせて用いてもよい。

[0027] また、本発明の糖類は、エタオルの基質となるダイゼインと共に使用することが好ましい。ダイゼインは合成品や天然由来抽出物等の市販品を使用してもよぐダイゼィンを多く含む天然由来素材やその加工品として使用してもよい。具体的に、ダイゼィンを多く含む素材としては大豆、えんどう豆、葛、クローバー等が挙げられ、これらの加工品としては例えば、豆腐、豆乳、油揚げ、納豆、醤油、味噌、テンペ等が挙げられる。また、一般的に、イソフラボン配糖体は体内の腸内細菌の働きによりァグリコン化されるため、ダイゼインは、その配糖体ィ匕合物であるダイジン、マロニルダィジン、ァセチルダィジン等の形態として使用することもできる。

[0028] さらに、本発明の糖類は、本発明の選択培地により得られたエタオル変換能を有する微生物と共に使用してもよい。微生物を使用する場合、微生物の形態は特に制限されず、生菌又は加熱菌体 (死菌体)のいずれでもよぐまた凍結乾燥したものであつてもよぐあるいはこれら微生物を含む培養物として利用することもできる。

[0029] 本発明のエタオル濃度低下作用を有する糖類 (グルコース、ラタトース、ラクチュロース、メリビオース、ラフイノース、シュクロース、ガラタトオリゴ糖）は体内、血中、大腸内等の腸内等におけるエタオル濃度低下剤として利用でき、これら糖類を有効成分とするエタオル濃度低下剤は、エタオルの環境ホルモン様作用により引き起こされる、精子の減少、生殖能力の低下等の悪影響を予防する目的に利用できる。ここで、本発明のエタオル濃度低下作用を有する糖類は、単独で用いてもよぐ又は 2種類以上組み合わせて用いてもょ、。

[0030] 本発明のエタオル濃度上昇剤とエタオル濃度低下剤を適宜用いることで、体内のエタオル濃度を適切な状態に調節することができる。例えば、環境ホルモンへの感受性が高いと指摘されている乳幼児や小児、或いは妊産婦においては、エタオル暴露のリスクを軽減させるため、本発明のエタオル濃度低下剤を使用することが挙げられる。逆に、不定愁訴等の更年期障害や骨粗鬆症、発がんのリスクが高まる中年期や老年期においては本発明のエタオル濃度上昇剤を使用することが挙げられる。特に、エタオル産生能を有さな、ヒト（エタオル非プロデューサー）やエタオル産生能が低ぃヒトに、エタオル濃度上昇剤を使用することは、イソフラボンが関与する様々な疾病を日常的に予防するとの観点力も非常に重要である。ここで、体内でのエタオル産生能の把握は、対象者の尿中や血中のエタオル濃度を HPLC等の常法により測定することで行うことができる。 [0031] 本発明のエタオル濃度上昇剤、エタオル濃度低下剤の有効成分である各種糖類は、食経験も豊富で安全性が高いことから、これらをエタオル濃度上昇剤、或いはェタオル濃度低下剤として使用する場合の投与量に厳格な制限はない。また、対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その投与量は 1日当たり 0. lmg〜： LOOgであり、特に 50 mg〜50gが好ましい。

[0032] 本発明のエタオル濃度上昇剤、エタオル濃度低下剤は、経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分である各種糖類を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。

[0033] このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシェチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定ィ匕剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することちでさる。

[0034] また、本発明の糖類は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなぐ飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明の糖類をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。エタオル濃度上昇作用を有する糖類を用いた場合は、体内のエタオル濃度を上昇させる目的、或いは不定愁訴等の更年期障害、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、乳がん、前立腺がん、月経前症候群等の改善、予防等に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には前記の効果を有する旨の表示を付してもょ、。エタオル濃度低下作用を有する糖類を用いた場合は、体内のエタオル濃度を低下させる目的、或いはエタオルの環境ホルモン様作用により引き起こされる、精子の減少、生殖能力の低下等の予防に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明の糖類を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよぐまた種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、力まぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。

実施例

[0035] 以下、試験例及び実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。

[0036] 試験例 1 エタオル産生に及ぼす各種糖類の影響

エタオルプロデューサーの新鮮排泄便について、ガラスビーズ（ φ 3mm)を用いて

10倍容の嫌気状態の希釈液 (KH PO 0. 00255%、 K HPO 0. 00255%、 N

2 4 2 4

aCl 0. 006%、 (NH ) SO 0. 00255%、 CaCl 0. 000255%、 MgSO 0.

4 2 4 2 4

000255%, 0. 1%レサズジン溶液 0. 1%、 8%Na CO溶液 2. 2%、 L システ

2 3

イン塩酸塩 0. 05%)に懸濁し、滅菌ガーゼを用いて固形分を除去した。 8, OOOrp m、 10分の遠心分離を行い、沈殿を同量の同希釈液にて懸濁した。この状態で 3 0°Cにて凍結保存した。

解凍した糞便希釈液につ!、て再度遠心分離し、沈殿を 100倍容の PY培地 (ぺブトン 0. 5%、卜!;プチケースべプ卜ン 0. 5%、ィース卜エキス 1%、へミン 0. 00005 %、ビタミン K1 0. 0001%、 L システィン塩酸塩 0. 05%, KH PO 0. 0006

2 4

%、 K HPO 0. 0006%、 NaCl 0. 0012%、 0. 0006%、 CaCl

2 4 （NH ) SO

4 2 4 2

0. 00006%、 MgSO 0. 00006%)に再懸濁した。その際に最終濃度 1%となる

4

ように、アド-トール、ァラビノース、セロビオース、エリスリトール、フラタトオリゴ糖、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グリコーゲン、イノシトール、ィヌリン、ラクチトーノレ、ラタトース、ラクチュロース、マノレトース、マンニトーノレ、マンノース、メレチトース、メリビオース、ラフイノース、ラムノース、リボース、ソルビトール、ソルボース、シュクロース、トレハロース、キシロース、ガラタトオリゴ糖を加えた。同時に糖を添加しない系列も作製した。それらに最終濃度 100 /z Mとなるようにダイゼインを添加し、 37°Cで、 1 6時間完全嫌気培養を行った。なお、培養はすべて独立した 4系列で行った。得られた培養液から、ダイゼインとエタオルの抽出及び HPLC分析を行った。なお、ここで用いたイノシトールは、 SIGMA社製の myo—イノシトールである。グリコーゲンは、 S IGMA社製のグリコーゲンであり、その由来は、牡蠣である。トレハロースは、 SIGM A社製の D ( + )トレハロースであり、 a , α体である。ガラタトオリゴ糖は、ヤクルト薬品工業社製の TOS— Sであり、 4'ガラクトシルラクトースと 6 'ガラクトシルラクトースとの混合物である。フラタトオリゴ糖は、和光純薬社製であり、 1—ケストース、ニストース、 1—フラタトシル -D-ニストースとの混合物である。

ダイゼイン及びエタオルの抽出は以下のように行った。培養液 500 Lに 250 L のジェチルエーテルを添カ卩し十分に攪拌した。この混合液を 2, OOOrpmにて 10分間遠心分離し、ジェチルエーテル層を得た。残った水層に対して同様のジェチルェ一テル抽出を再び行、、 2度の抽出で得られたエーテル層を併せて窒素ガス噴射下 40°Cにて濃縮乾固した。これを 250 Lの 80%メタノールにて溶解し、フィルター濾過した通過物を測定検体とした。

また、 HPLC条件は次の条件で行った。

装置： LCモジュール 1 (Waters)

カラム： YMC— Pack CN (Y. M. C製）

検出:紫外吸光光度計 (測定波長 280nm)

カラム温度： 40°C

移動相： 0. 1%蟻酸溶液 Zァセトニトリル Zメタノール (87 : 3 : 10)混液流量： 2. 5mL/ mm

サンプル注入量： 10 /z L

上記条件にて、ダイゼイン、エタオルの標準品をそれぞれ注入し、検量線を作成して、試料中のダイゼイン、エタオル濃度を測定した。得られた濃度より段落〔0020〕に記載した数式を用いてエタオル濃度調節活性を算出した。

その結果を表 1及び図 1に示した。糖無添加を 100%とした場合、フラタトオリゴ糖、グルコース、ィヌリン、ラタトース、ラクチュロース、メリビオース、ラフィノース、シュクロース、ガラタトオリゴ糖では、エタオル変換が 50%以下に抑制されていたことから、負のエタオル濃度調節活性があることがわ力つた。特に、フラタトオリゴ糖、グルコース、ィヌリン、ラタトース、ラフイノース、シュクロース、ガラタトオリゴ糖では、生成したェクオルは全く見られず培地に添カ卩した 100 Mのダイゼインが殆ど残存していた。なお、ィヌリンにはラットの血清中のエタオル濃度を低下させる作用が知られているが（非特許文献 5)、今回の試験系でもィヌリンにダイゼインカゝらのエタオル変換能を著しく低下させる作用が見出された。また、フラタトオリゴ糖にはエタオル産生を促進させるとの報告 (非特許文献 5)、及びヒト糞便培養物のエタオル産生活性を低下させるとの報告 (非特許文献 6)があるが、今回の試験系ではフラタトオリゴ糖にダイゼインカのエタオル変換能を著しく低下させる作用が見出された。

一方、アド-トール、ァラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラタチトール、メレチトース、トレノヽロース、リボース、ソノレボース、キシロース、イノシトーノレ、ソノレビトーノレでは、エタオル変換が 200%以上に促進されていたことから、正のエタオル濃度調節活性があることがわかった。特に、ラタチトール、メレチトース、トレハロース、ソルボース、キシロース、イノシトールでは、培地に添カ卩した 100 μ Μのダイゼインの 70%以上がエタオルに変換されており、エタオル濃度調節活性も 400%以上であった。

[表 1]

ダイゼイン-エタオル変換に及ぼす各種糖類の影響

試験例 2 エタオル変換能を有する微生物の培養

試験例 1に記載の方法にて保存した糞便懸濁液を 500 μ Lの ΡΥ培地（ΡΥ培地に最終 1%となるようにアド-トール又はソルボースを添加、アド-トール又はソルボースの代わりに滅菌蒸留水を添加したものを対照とした）に 1Ζ10となるように懸濁し、最終濃度 100 Mとなるようにダイゼインを添加した。それを 16時間、 37°Cにて完全嫌気培養した。培養後液 50 Lを新しい 500 Lの同培地に植え継ぎ、残りはダイゼィン及びエタオルの抽出に用いた。植え継ぎ以降の操作を順次繰り返し、継代を重ねた。その際に、適宜菌液をグラム染色し、顕微鏡観察した。ダイゼイン及びエタオルの抽出及び HPLCによる定量は、試験例 1に記載の方法で行った。得られたダイゼイン及びエタオル濃度を次式に当てはめることによりダイゼイン一エタオル変換率を求めた。なお、培養はすべて独立した 3系列で行い、平均値と標準偏差を求めた。ダイゼイン—エタオル変換率（％) = 100 X (培養液中のエタオル濃度) Z (培養液中のエタオル濃度 +ダイゼイン濃度）

その結果、図 2に示すように、アド-トール、ソルボースを糖源とした場合、それぞれ 8代目、及び 11代目までダイゼイン—エタオル変換能が維持できた。また、 11代目の培養液内には元来の糞便由来物は 10¹²分の 1しか含まれて、な、ことから、ソルボースを糖源とした PY培地のみでエタオル変換能を維持できることが推察された。また、ソルボースを糖源とした PY培地で 11代培養した際のグラム染色像を観察すると、 3〜5種類の細菌が観察された。このことから、 11代の継代培養によりエタオル変換菌が選択的に増殖していることがわ力つた。

[0039] 処方例 1 錠剤の製造

下記の処方で各種成分を混合して造粒 ·乾燥 ·整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。

(処方）（mg)

微結晶セルロース 100

トレハロース 80

ステアリン酸マグネシウム 0. 5

メチノレセノレロース 12

[0040] 処方例 2 清涼飲料の製造

下記処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。得られた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。 (処方） (g)

香料 0. 8 クェン酸 0. 2

果糖 4

ガラタトオリゴ糖 1. 5

水 93. 5

処方例 3 培地の製造

下記の組成で各種成分を混合し、水を用いて 1Lに調整した後、滅菌してエタオル変換能を有する微生物の選択培地を製造した。

(組成） (g)

ペプトン 5

トリプチケースペプトン 5

イーストエキス 10

アド二トール 10

ソノレボース 10

へミン 0. 0005

ビタミン K1 0. 001

L システィン塩酸塩 0. 5

KH PO 0. 006

2 4

K HPO 0. 006

2 4

NaCl 0. 012

(NH ) SO 0. 006

4 2 4

CaCl 0. 0006

2

MgSO 0. 0006

4

1 OmMダイゼイン溶液 10

Claims

請求の範囲

[I] アド-トール、ァラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラタチトール、メレチトース

、トレノヽロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール及びソルビトールから選ばれる 1以上を有効成分とするエタオル濃度上昇剤。

[2] エタオル変換能を有する微生物を選択的に増殖及び Z又は微生物のエタオル変換能を亢進するものである請求項 1記載のエタオル濃度上昇剤。

[3] エタオル濃度上昇剤を製造するための、アド-トール、ァラビノース、エリスリトール

、ガラクトース、ラタチトール、メレチトース、トレノヽロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール及びソルビトールカ選ばれる 1以上の使用。

[4] エタオル濃度上昇剤が、エタオル変換能を有する微生物を選択的に増殖及び Z又は微生物のエタオル変換能を亢進するものである請求項 3記載の使用。

[5] アド-トール、ァラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラタチトール、メレチトース

、トレノヽロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール及びソルビトールから選ばれる 1以上を有効量投与することを特徴とするエタオル濃度上昇方法。

[6] エタオル変換能を有する微生物を選択的に増殖及び Z又は微生物のエタオル変換能を亢進するものである請求項 5記載のエタオル濃度上昇方法。

[7] グルコース、ラタトース、ラクチュロース、メリビオース、ラフイノース、シュクロース及びガラタトオリゴ糖から選ばれる 1以上を有効成分とするエタオル濃度低下剤。

[8] エタオル変換能を有する微生物の増殖を選択的に阻害及び Z又は微生物のエタオル変換能を阻害するものである請求項 7記載のエタオル濃度低下剤。

[9] エタオル濃度低下剤を製造するための、グルコース、ラタトース、ラクチュロース、メリビオース、ラフイノース、シュクロース及びガラタトオリゴ糖から選ばれる 1以上の使用。

[10] エタオル濃度低下剤が、エタオル変換能を有する微生物の増殖を選択的に阻害及び Z又は微生物のエタオル変換能を阻害するものである請求項 9記載の使用。

[II] グルコース、ラタトース、ラクチュロース、メリビオース、ラフイノース、シュクロース及びガラタトオリゴ糖から選ばれる 1以上を有効量投与することを特徴とするエタオル濃度低下方法。

[12] エタオル変換能を有する微生物の増殖を選択的に阻害及び Z又は微生物のエタオル変換能を阻害するものである請求項 11記載のエタオル濃度低下方法。

[13] アド-トール、ァラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラタチトール、メレチトース、トレノヽロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール及びソルビトールから選ばれる 1以上を含有することを特徴とするエタオル変換能を有する微生物の選択培地。

[14] さらにダイゼインを含有することを特徴とする請求項 13記載の選択培地。

[15] 請求項 13又は 14記載の選択培地を用いて、検体に含まれるエタオル変換能を有する微生物を培養することを特徴とする検体中のエタオル変換能を有する微生物の検出方法。