TW202237815A - 一種含副乾酪乳酸桿菌s38和凝結芽孢桿菌bc198之益生菌組合物及其在改變身體組成之應用 - Google Patents

Abstract

本發明公開一種副乾酪乳酸桿菌S38、凝結芽孢桿菌BC198及其益生菌組合物和其用途，該益生菌組合物為醫藥組合物、營養補充品、保健食品或其組合。其用途包含減重、減脂、降低食慾、增加腸道中丁酸生成、增加腸道中艾克曼嗜黏蛋白菌( Akkermansia muciniphila)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)數目。

Description

一種含副乾酪乳酸桿菌S38和凝結芽孢桿菌BC198之益生菌組合物及其在改變身體組成之應用

本發明公開一種含副乾酪乳酸桿菌S38或凝結芽孢桿菌BC198之益生菌組合物和其用途，其中副乾酪乳酸桿菌S38來源為在健康青年腸道糞便中取得菌株加以培養，凝結芽孢桿菌BC198來源為在綠麥芽中取得菌株加以培養，在之後的動物實驗中發現，其有顯著的減重效果，且兩株菌有加成效果，使用低劑量即可達到顯著的效果，包含減重、減脂、增加腸道中丁酸生成、增加腸道中艾克曼嗜黏蛋白菌( Akkermansia muciniphila)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)數目，該益生菌組合物為醫藥組合物、營養補充品、保健食品或其組合。

世衛組織2016年的報告指出，世界成年人口中有39%超重，且13%為肥胖。世界多數人口所居住的國家，死於超重和肥胖的人數大於死於體重不足的人數。

預防或改善肥胖的常見選擇包含：手術、藥物治療、飲食控制、運動、膳食補充品。其中手術及藥物治療的副作用較強，飲食控制及運動考驗減重者的執行力。膳食補充品是最普遍接受的改善方式，膳食補充品種類多元，其中公認有益健康的益生菌最被青睞。

然而並非所有的益生菌都具有減重的功效， 2016曾有文獻報導， Lactobacillus kefiranofaciensM1會促進體重與體脂增加(非專利文獻1)，攝取 Lacticaseibacillus casei LcS不影響體重與體脂(非專利文獻2)。

學界普遍接受，肥胖是人類本身、環境兩者互相影響的結果。研究證實，飲食可以改變腸道菌相，腸道菌相(microbiota)是決定肥胖的重要因子，其機制包含能改變能量的吸收率，影響脂質代謝、改變食慾等(非專利文獻3)。而不同菌的能力各有不同，例如艾克曼嗜黏蛋白菌( Akkermansia muciniphila)藉由改善腸漏與發炎抑制體脂生成(非專利文獻4)，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)分泌丁酸(butyric acid)抑制食慾、改善發炎導致的肥胖等，脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae) 透過促發炎的機制促進體脂生成。

由於腸道菌是影響肥胖的重要因子，故可以透過調控腸道菌相的手段，達到改善肥胖的效果。益生菌普遍能改變腸道菌相，然而不同益生菌菌株對腸道菌相的改變卻大不相同，因此無法預測一菌株對腸道菌相、體重、脂質生成的影響。

由於不同菌株的特性與能力是可變的，因此有必要透過篩選、實證，確認單一益生菌菌株的減重效果。

不同的菌株，可能透過相異的機制調節菌相、體重，且益生菌菌株間可能存在交乎作用，因此複數菌株的功能，無法由組成成分的單一菌株之功能推導。過去曾有研究探討複數菌株組合物的效果，然而改善肥胖之效力，菌株組合物與單一菌株相比沒有差異，甚至可能效果更差(非專利文獻5、及非專利文獻6)，故抗肥胖的菌株組合物，需要實際驗證。

因此如何找出一種可以有效改善肥胖、改善身體組成的菌株或者複數菌株的組合物，即為本發明在此欲解決的一重要課題。

非專利文獻 非專利文獻1. Journal of functional foods, 2016, 23: 580-589. 非專利文獻2. Metabolism and Cardiovascular Diseases, 2017, 27.10: 910-918. 非專利文獻3. Nutrition reviews, 2015, 73.6: 376-385. 非專利文獻4. Frontiers in microbiology, 2017, 8: 1765. 非專利文獻5. Obesity, 2013, 21.12: 2571-2578.；Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases, 2017, 27.10: 910-918. 非專利文獻6. Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases, 2017, 27.10: 910-918 非專利文獻7. Adipocyte, 2016, 5.4: 351-358. 非專利文獻8. Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62: 192-197 非專利文獻9. Journal of Biological Chemistry, 1957, 226: 497-509 非專利文獻10. Molecules, 2018, 23: 1-9 非專利文獻11. Nature medicine, 2017, 23.1: 107-113

本發明的目的在於提供一種副乾酪乳酸桿菌S38(Lacticaseibacillus paracasei S38)，其寄存編號為BCRC911007及DSM33753，且具有改善身體組成的功效。

本發明的另一目的在於提供一種凝結芽孢桿菌BC198(Bacillus coagulans BC198)，其寄存編號為BCRC910916及DSM33206，且具有改善身體組成的功效。

本發明的另一目的在於提供一種益生菌組合物，其中該益生菌組合物包含如前所述之副乾酪乳酸桿菌S38和如前所述之凝結芽孢桿菌BC198，且具有改善身體組成的功效。

為達上述目的，該益生菌組合物所包含之益生菌為活菌；劑型包含載劑、賦形劑、稀釋劑；劑型係選自溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿、和膠囊所構成之群組；益生菌組合物可進一步製成流體乳品、濃縮牛奶、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆漿、發酵豆漿、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥組合物、膳食補充品。

本發明的另一目的在於提供一種益生菌組合物用於改善身體組成之用途。

為達上述目的，係經由體重降低、體脂減少、或內臟脂肪減少；功效包含食慾降低、腸道中丁酸提升、艾克曼嗜黏蛋白菌提升、或瘤胃菌科提升；其中該改善身體組成係高飲食後的體重升高、體脂升高、或內臟脂肪升高；副乾酪乳酸桿菌S38服用劑量介於2.4×10 ⁸-2.4×10 ¹⁰CFU (colony forming unit)/天，凝結芽孢桿菌BC198服用劑量2.4×10 ⁸-2.4×10 ¹⁰CFU (colony forming unit)/天。

綜合上述，與現在的技術相較，本發明篩選出的新菌係為副乾酪乳酸桿菌S38及凝結芽孢桿菌BC198，其具有下列優點： 1. 抑制脂肪細胞的脂質生成、減少內臟脂肪、體重降低、體脂減少、抑制食慾、腸道中丁酸提升、艾克曼嗜黏蛋白菌提升、及瘤胃菌科提升。 2. 合併兩株新菌，其效果更佳，具有加乘效果，有超乎預期之功效。

實施例1  副乾酪乳酸桿菌S38菌株(以下簡稱S38)之分離

收集台灣健康年輕人之腸道排泄物，置入MRS肉湯培養基中，在37℃厭氧環境下培養24小時後，將該培養物塗佈在MRS瓊脂平板上，再於37℃厭氧環境培養3天，再收集於瓊脂培養基上出現的單一菌落，並進一步純化，分離出過氧化氫酶陰性，呈桿狀之S38菌株。

實施例2  S38菌株之菌學特徵

S38菌株之菌學特徵如下所示：

形態學特徵： 細胞形狀與革蘭氏染色：當細菌置於MRS肉湯培養基中，在37℃厭氧環境下培養24小時後，於顯微鏡下觀察之外觀呈捲曲狀之桿菌如圖1。 活動力：無運動性。 孢子形成：無孢子形成。 革蘭氏染色：陽性。

培養特徵： 培養基：MRS肉湯培養基，pH = 6.25。 培養條件：37℃厭氧或好氧環境。

生理學特徵： 過氧化氫酶：陰性。 氧化酶：陰性。

實施例3 Lacticaseibacillus paracaseiS38菌株之菌種鑑定

S38菌株之16S rDNA定序分析：萃取S38菌株之DNA，進行16S rDNA (ribosomal DNA)片段放大，並將所得到之PCR產物進行瓊脂凝膠電泳確認產物符合預期大小，並進行定序，所得S38菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: 1(見序列表)所示；將S38菌株序列對照複合序列比對資料集(NCBI blastn)進行序列比對，序列比對結果與 Lactobacillus paracaseistrain HBUAS53050最為接近，相似度達99.89%。

實施例4  凝結芽孢桿菌BC198菌株(以下簡稱BC198)之分離

綠麥芽加入10倍重量的滅菌水，以均質機打碎後，再以重力沉降10分鐘，將上清液置入MRS肉湯培養基中，在50℃培養48小時後，將該培養物塗佈在MRS瓊脂平板上，再於50℃厭氧培養3天，再收集於瓊脂培養基上出現的單一菌落，並進一步純化，分離出過氧化氫酶陽性，呈桿狀之BC198菌株。

實施例5  BC198菌株之菌學特徵

BC198菌株之菌學特徵如下所示：

形態學特徵： 細胞形狀與革蘭氏染色：當細菌於瓊脂平板37℃下培養48小時後，於顯微鏡下觀察之外觀呈桿狀之桿菌，且有部分轉變為內孢子的型態如圖2。 活動力：具運動性。 孢子形成：有孢子形成。 革蘭氏染色：陽性。

培養特徵： 培養基：MRS肉湯培養基，pH = 6.25。 培養條件：45℃厭氧或好氧環境。

生理學特徵： 過氧化氫酶：陽性。

實施例6 Bacillus coagulansBC198菌株之菌種鑑定

BC198菌株之16S rDNA定序分析：萃取BC198菌株之DNA，進行16S rDNA (ribosomal DNA)片段放大，並將所得到之PCR產物進行瓊脂凝膠電泳確認產物符合預期大小，並進行定序，所得BC198菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: 2(見序列表)所示；將BC198菌株序列對照複合序列比對資料集(NCBI blastn)進行序列比對，序列比對結果與 Bacillus coagulansstrain 4086最為接近，相似度達100.00%。

實施例7  S38與BC198合併使用具有抑制3T3-L1生成脂質的功效

7.1  發酵液樣品製備

將S38、及另外2株來自於生物資源保存及研究中心（BCRC , Hsinchu, Taiwan）的 L. paracasei，分別以MRS肉湯培養基於37℃靜置培養培養24小時。將BC198、3株自市售乾燥木耳分離而得的 B. coagulans，分別以MRS肉湯培養基於45℃靜置培養培養24小時。培養結束後對培養液進行離心（10,000 RCF，10分鐘），取上清液並置於70℃水浴30分鐘，此為發酵液樣品。發酵液樣品再接種至MRS培養液後於37℃培養4天，結果無生長跡象，表示已不含活菌。

7.2  細胞實驗設計

小鼠前脂肪細胞3T3-L1細胞株(BCRC 60159)購自BCRC，並以基礎培養液（含10%胎牛血清的DMEM）於37℃5% CO2培養。

3T3-L1細胞種於60 mm培養皿(3×10 ⁵cells/dish)，培養至約70-80%滿後，以脂肪細胞分化試劑0.5 mM methylisobutylxanthine + 1 μM dexamethasone + 10 μg/mL insulin 配置於基礎培養液進行誘導分化48小時，接著棄去培養液，改以含10 μg/mL insulin、含1%(v/v)樣品之一般培養液，培養48小時後再棄去培養液，加入含1%(v/v)樣品之基礎培養液培養48小時。未添加樣品之組別為對照組。

將3T3-L1細胞進行紅油染色法，再參考以分光光度計定量脂質含量。已分化成脂肪細胞之3T3-L1細胞，參考Kraus等人的方法(非專利文獻7)進行紅油染色法，再以分光光度計定量脂質含量，將對照組脂質含量設為100%。

以上1~3步驟，共執行2次獨立試驗。

7.3  統計方法

兩次脂質定量結果，以平均值±變異數表示。各發酵液樣品以Student’s t-test與對照組比較。p＜0.05(*)視為具有顯著差異。

7.4  抑制脂質生成

圖3顯示3株 L. paracasei，僅有S38能夠抑制脂肪細胞生成脂質，且具有統計差異。

圖4顯示4株 B. coagulans皆能抑制脂質生成，然而僅有BC198具統計意義且效果最強，約為其他 B. coagulans菌株的2倍效力。

實施例8 S38與BC198合併使用具有改善肥胖的功效

8.1  動物實驗方法

實驗模式以益生菌及高脂飲食同時處理誘發動物肥胖模式進行。使用8週齡雄性Sprague-Dawley品系大鼠，飼養環境維持溫度22 ± 2°C，日夜循環各12時，飲食採自由攝食方式。正常控制組(NC)於實驗期持續給予正常飼料，含有5% (w/w)油脂可提供3.4 kcal/g，實驗組(HF)給予高脂飼料，提供22.5% (w/w)油脂及4.3 kcal/g，正常控制組及對組的飼料成分如下表1 A、及表1 B所示。

表1 A、飼料成分(g/100 g)

成分(g/100 g)		組別	正常控制組(NC)	對照組(HF)
一般飼料Chow 1	100.0	54.0
豆油		4.8
濃縮牛乳 2		28.5
豬油		12.7
1. Chow：購自PMI Nutrition International, St Louis, Mo, USA，每100g含蛋白質23.9 g，脂質5.0 g，與碳水化合物 48.7 g
2. 濃縮牛乳：每100g含蛋白質7.3 g，脂質8.2 g，與碳水化合物54.5 g

表1 B、飼料成分(%)

成分(%)		組別	正常控制組(NC)	對照組(HF)
碳水化合物(%)	48.7	41.7
脂質 (%)	5.0	22.5
蛋白質 (%)	23.9	15.0
能量 1(kcal/g)	3.4	4.3
1. 能量(kcal / g ) = ( 碳水化合物 % × 4 + 脂質 % × 9 + 蛋白質 % ×4) / 100

實驗組分為S38-L、S38-H、BC198-L、BC198-H、及S38+BC198，其中實驗組S38-L、S38-H分別管餵S38 5×10 ⁷及5×10 ⁹CFU(colony forming unit)/day，BC198-L、BC198-H分別管餵BC198 5×10 ⁷及5×10 ⁹CFU/day，S38+BC198 每日管餵BC198 5×10 ⁷與S38 5×10 ⁷，合計1×10 ⁸CFU/day。

動物試驗期間，每日測量並記錄飼料攝取量，同時，每日於給予飼料前精秤體重一次，實驗為期12週。於實驗期結束的最後3天，分別收集每隻大鼠的糞便樣品，並儲存於-20℃，待後續進行菌相分析。

8.2  實驗指標

1. 體重：每日測量。最終體重(g)-初始體重(g)=獲得之體重

2. 總熱量：每日攝取量×飼料熱量

3. 內臟脂肪重量：參考Chu等人(2014)之方法(非專利文獻8)，實驗結束後，取出腎周脂肪、腸繫膜脂肪及附睪脂肪，並分別秤重。總內臟脂肪定義為腎周脂肪、腸繫膜脂肪及附睪脂肪之總和，佔體重的百分比，其計算方式如下： 總內臟脂肪(%)=(總內臟脂肪重/最終體重)×100%

4. 肝臟脂質：根據Folch等人(1957)之方法(非專利文獻9)，肝臟總脂質含量測定，以正己烷:甲醇(2:1,v/v)為萃取溶劑，進行萃取並定量之。

5. 糞便中短鏈脂肪酸含量測定：根據Kao等人(2018)之方法(非專利文獻10)。利用氣相層析儀進行，分析樣品中所含乙酸、丙酸、丁酸之含量，分析條件： 管柱：Agilent J and W HP-INNO Wax GC Column，30m，0.25mm，0.25μm 移動相：氦氣 流速： 7 mL/分鐘 樣品注入量：1μL 程式設計： 起始溫度 80℃，1分鐘→140℃，1分鐘→220℃，2分鐘 注射器溫度： 140℃ 探測器溫度： 250℃

8.3  統計方法

本實驗結果以平均值±標準差(mean±SD)的方式表示。利用SPSS軟體進行統計分析，以One-way ANOVA進行檢定，再利用Duncan’s Multiple Range test檢定各組樣本間之組間差異。當p-value＜0.05時，代表具有顯著差異，在表中使用不同英文字母(a、b或c)標記。

8.4  S38與BC198合併使用具有降低體重、抑制食慾的功效

可由下表2可得知S38與BC198合併使用的抑制體重增加之功效，BC198、S38能夠改善高脂飲食引起的體重增加，劑量越大抑制的效果越好，然而單一菌株之組別皆未達統計差異。BC198及S38合併使用的劑量(1×10 ⁸)遠低於單方高劑量(5×10 ⁹)，但BC198及S38合併使用抑制體重增加的效果明顯優於單方菌株，顯示BC198與S38存在協同作用。 表2、各組實驗動物體重變化

組別	起始體重 (g)	最終體重 (g)	增加體重 (g)
NC	373.1	±	18.7a	563.9	±	13.1c	190.8	±	12.5c
HF	377.7	±	10.1a	664.1	±	47.9a	286.5	±	41.3a
BC198-L	394.2	±	20.7a	673.6	±	23.4a	279.4	±	24.0a
BC198-H	374.6	±	17.1a	638.2	±	35.4ab	263.6	±	39.7ab
S38-L	393.0	±	26.6a	655.2	±	39.8a	262.2	±	15.9ab
S38-H	383.7	±	14.0a	629.6	±	74.9ab	245.9	±	61.8ab
BC198+S38	373.8	±	15.7a	591.8	±	68.8bc	217.9	±	56.2bc

可由下表3可得知S38與BC198合併使用的抑制食慾之功效，各組的攝食熱量觀察結果，BC198無法抑制食慾，而S38似乎有輕微的抑制食慾效果，然而令人驚訝的是，BC198及S38合併使用的劑量(1×10 ⁸)遠低於單方高劑量(5×10 ⁹)，但抑制食慾的效果更為明顯，顯示BC198與S38存在抑制食慾的協同作用，低劑量的組合菌株即可發揮巨大的效果。 表3、各組實驗動物攝食卡路里

組別	總攝食卡路里 (kcal)
NC	7123	±	174c
HF	8760	±	920ab
BC198-L	9532	±	760a
BC198-H	8752	±	829ab
S38-L	8573	±	655b
S38-H	8313	±	1024b
BC198+S38	8018	±	468b

8.5  S38與BC198合併使用具有抑制脂肪生成的功效

可由下表4可得知S38與BC198合併使用的抑制總內臟脂肪之功效，BC198、S38能夠抑制高脂飲食引起的內臟脂肪累積，劑量越大抑制的效果越好，然而單一菌株之組別皆未達統計差異。十分意外地，BC198及S38合併使用卻能顯著地抑制總內臟脂肪累積，效果明顯優於單方菌株。

不同部位，包含腎周、腸系膜、及副睪脂肪的脂質重量如下表4，整體而言，BC198、S38不影響或抑制脂肪累積，劑量越大通常抑制脂質累積的效果越好，但我們意外地發現BC198與S38合併使用之效果明顯優於單方菌株。 表4、各組實驗動物不同部位脂質重量

組別

總內臟脂肪 (g/100g 體重)

腎周脂肪 (g/100 g體重)

腸系膜脂肪 (g/100 g體重)

副睪脂肪 (g/100 g體重)

NC

5.51

±

0.87c

2.30

±

0.15c

1.48

±

0.39c

1.73

±

0.35c

HF

11.26

±

1.30a

5.00

±

0.76a

2.86

±

0.61ab

3.40

±

0.40a

BC198-L

10.85

±

2.02a

4.69

±

0.96a

2.98

±

0.72a

3.17

±

0.49a

BC198-H

10.37

±

0.94a

4.61

±

0.44a

2.85

±

0.30ab

2.91

±

0.58ab

S38-L

10.32

±

0.88a

4.57

±

0.71a

2.82

±

0.15ab

2.93

±

0.34ab

S38-H

9.56

±

1.09a

4.37

±

0.64a

2.69

±

0.29ab

2.50

±

0.36b

BC198+S38

7.90

±

1.90b

3.15

±

0.71b

2.27

±

0.54b

2.48

±

0.68b

肝臟脂質重如下表5，BC198、S38能夠抑制高脂飲食引起的肝臟脂肪累積，劑量越大抑制效果越好，然而僅有S38-H達統計差異。但意外地發現BC198與S38合併使用能顯著抑制脂質累積，效果明顯優於單方菌株。 表5、各組實驗動物肝臟脂質重量

組別	肝臟脂質重(mg/g)
NC	157.78	±	8.62d
HF	289.00	±	60.47a
BC198-L	269.38	±	27.26ab
BC198-H	250.70	±	24.21ab
S38-L	259.83	±	35.04ab
S38-H	233.11	±	8.82b
BC198+S38	195.72	±	22.01c

BC198與S38合併使用具正面的協同作用，對內臟脂肪、肝臟脂質的分析發現，BC198、S38具有抑制脂肪生成的效果，然而意外的是BC198與S38合併使用劑量(1×10 ⁸CFU/day)遠低於單方高劑量(5×10 ⁹CFU/day)，但抑制脂肪累積的效果卻明顯優於單方菌株，顯示BC198與S38合併使用出現了無法預期的協同作用，低劑量的組合菌株即可發揮更佳的效果。

8.6  BC198與S38合併使用對短鏈脂肪酸生成的影響

如下表6所示，BC198、S38能夠促進乙酸、抑制丙酸的生成，而對丁酸無明顯地影響。BC198與S38合併使用複方對乙酸有促進的效果，不影響丙酸，但非常意外的發現BC198與S38合併使用卻可以顯著提高丁酸的生成，複方菌株產生了無法預測的效果，使低劑量的複方株即可誘導大量丁酸生成。 表6、各組實驗動物腸道乙酸、丙酸與丁酸重量

組別	乙酸 (μmol/g)	丙酸 (μmol/g)	丁酸 (μmol/g)
NC	174	±	40b	73.0	±	36.7a	25.7	±	15.7c
HF	129	±	55b	50.0	±	22.1ab	50.2	±	20.6b
BC198-L	175	±	35b	31.2	±	12.6b	44.0	±	5.3bc
BC198-H	174	±	24b	34.3	±	14.9b	45.8	±	8.2b
S38-L	258	±	44a	46.5	±	18.3ab	50.3	±	17.7b
S38-H	288	±	45a	48.5	±	15.1ab	43.8	±	21.9bc
BC198+S38	252	±	64a	68.5	±	16.1a	100.2	±	5.8a

已知丁酸對肥胖的改善機制有：(1)促進PYY、GLP-1分泌抑制食慾、(2)改善腸漏與發炎，抑制高油飲食引起的脂質生成、(3)促進腸黏膜分泌黏液，以黏液為食的艾克曼嗜黏蛋白菌豐度增加改善脂質生成。丁酸對肥胖有抑制效果，而丁酸的數據大致符合BC198及S38合併使用體重、脂肪比例、脂質含量優於BC198或S38的結果。

實施例9  BC198與S38合併使用具有改變腸道菌相的功效

9.1  試驗組別：

在減緩體重增加、抑制脂肪生成的動物試驗數據中，單一菌株中高劑量組的效果較佳，因此挑選NC、HF、BC198-H、S38-H、BC198與S38合併使用組別，分析各組六隻小鼠的糞便，觀察單一與複方益生菌對整體腸道菌相、與肥胖密切相關物種的調節效果，以及嘗試了解複方菌株是否存在交互作用。

9.2  菌相分析方法

腸道菌相分析委託圖爾思生物科技股份有限公司進行。微生物體研究常使用細菌 16S 核糖體基因作為定序標的，搭配次世代定序技術，可以鑑定生物樣本中所含有的細菌種類。細菌的 16S 核糖體基因序列具有10個保留區(conserved regions)，以及9個高度變異區(hypervariable regions)。保留區序列在不同菌種間沒有明顯差異，可用來查看生物物種的親緣關係；而高度變異區則隨著菌屬和菌種的不同，在序列組成上有多樣性，可用來查看物種間的差異。基於以上兩種特色，定序策略為萃取糞便中的細菌 DNA 後，針對核糖體基因保留區利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)進行擴增，擴增片段涵蓋一部分的高度變異區，做為次世代定序 (next generation sequence，簡稱NGS)後菌種鑑定和分析的根據。樣品定序流程如下所述: 樣品製備→DNA萃取及純化→PCR擴增→產物純化→樣品資料建立→上機定序，得到原始數據→經由成對序拼接(Raw Tags) →過濾得到Clean Tags→進行去除嵌合體得到可用於後續分析的有效數據(Effective Tags) →基於有效數據進行相似度(大於97%)OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。

9.2  對腸道菌相”門”分類階層的影響

選取實驗組別在分類學上門層(phylum level)中相對豐度排名前10名的物種，產生物種相對豐度柱狀圖，直接觀察各實驗組在門層中相對豐度較高的物種及其比例，other表示前10名門之外的其他所有門的相對豐度之總和。門層物種相對豐度柱狀圖顯示於圖5，將無肥胖表徵的NC組之腸道菌視為正常菌相，高脂飲食增加HF組厚壁菌門(Firmicutes)並減少擬桿菌門(Bacteroidetes)，S38-H、BC198-H並不明顯影響厚壁菌門及擬桿菌門，然而意外的是，BC198與S38合併使用卻可以將厚壁菌門及擬桿菌門恢復至接近正常菌相。此外，BC198與S38合併使用會造成疣微菌門(Verrucomicrobia) 的增加，然而BC198-H或S38-H皆無法增加疣微菌門，顯示BC198與S38合併使用出現了無法預期的協同作用。

厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例(Firmicutes/Bacteroidetes ratio，簡稱F/B ratio)是近年微生物體研究中，用來衡量特定疾病風險的一項因子。文獻指出，相對較高的厚壁菌門比例和肥胖具有相關性。為了瞭解F/B ratio在研究或疾斷上的意義，通常以箱型圖來表示不同條件下的實驗組別中所有樣本的F/B ratio，以Kruskal-Wallis方法計算p-value，**表示兩組間p-value＜0.01，***表示兩組間p-value＜0.001，結果顯示於圖6。高脂飲食增加HF組F/B ratio，但S38-H、BC198-H不改變高脂飲食引起的F/B ratio變化，然而意外的是，BC198與S38合併使用顯著降低 F/B ratio至正常菌相的NC組數值，顯示BC198與S38合併使用可以恢復高脂飲食引起的菌相失衡，出現了無法預期的協同作用。

9.3  主成分分析(Principal Component Analysis，簡稱PCA)

PCA是一種應用方差分解，對多維數據進行降維，同時保持數據集中雙方差貢獻最大的特徵，從而有效地找出資料中，最主要的元素和結構的方法。利用PCA分析，能找出可最大程度反映樣品間差異的座標軸，從而將多維資料的差異以線性組合的方式，反應在二維座標上，藉此觀察個體或群體間的差異。如果樣品的群落組成越相似，則PCA圖中的距離則越接近。橫座標表示第一主成分，緃座標表示第二主成分，百分比表示主成分對樣品差異的貢獻率。每個實驗組別的樣本平均值以常態信心橢圓的中心標示，圖中每個點代表一個樣品，同一個實驗組別中的樣品使用同種顏色表示。圖7，透過 PCA 的分析，可以清楚判斷出不同的菌叢分布，可評估樣品對菌相的改善程度。由 C 圖之結果顯示， HF組之菌相分布明顯不同於正常的NC組，顯示HF組腸道菌相已失衡。BC198-H、S38-H稍微改變菌相分布，但仍趨近於HF組。然而BC198與S38合併使用其菌相分布卻與 NC 組非常趨近，與HF明顯不同，顯示BC198與S38合併使用出現了無法預期的協同作用，可改善因高脂飲食造成的腸道菌相失衡。

9.4  對腸道菌相［科］、［屬］分類階層的影響

由於菌相扮演體重控制、調控脂質代謝等之機制，因此BC198與S38合併使用可能是透過改變特定菌的豐度(richness)，達到改善肥胖的效果。為了進一步研究腸道菌相的變化，根據所有實驗組別在分類學上科層(family level)及屬層(genus level)的物種注釋資訊及豐度資訊，分別選取豐度排名前35名之科層物種及屬層物種，分組的豐度為組內所有樣品的平均豐度，從物種層面進行聚類繪製熱圖(heatmap)，以便於發現那些物種在那些樣品中含較高或較低。結果如圖8所示，橫座標表示實驗組別，縱座標表示物種注釋資訊，圖8左側及上方為物種聚類樹。結果顯示，Heatmap於分類學上科層或屬層階級上的物種聚類樹，HF、BC198-H、S38-H組的菌相相度豐度相似( x軸被cluster成一群)，而NC、BC198與S38合併使用之菌相相對豐度相似(於x軸被cluster成一群)。科層與屬層的前35個OUT中，BC198-H、S38-H只能稍微改變部分OUT的豐度，然而我們驚訝的發現，BC198與S38合併使用可以大幅改變高脂飲食引起的不正常菌相，使菌相接近NC組的正常菌相，顯示BC198與S38合併使用出現了無法預期的協同作用，可改善因高脂飲食造成的主要腸道菌失衡。

科層中，紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)已證實於肥胖族群中，與增加膽固醇(膽固醇屬脂質類分子)吸收呈正相關性；脫硫弧菌科存在於肥胖族群之腸道菌相中，己證實會驅動腸道發炎反應，最終造成代謝功能障礙；消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)豐度的增加己被證實與高熱量飲食 (high-calorie diet)具有相關性。BC198-H、S38-H可以減少上述三科的豐度，達到抑制脂質生成的效果，而BC198與S38合併使用可以在僅有單方的1/50劑量下，更進一步抑制上述三個會促進肥胖的菌科的豐度。

伯克氏菌科(Burkholderiaceae)蓄積於過重或肥胖族群脂肪組織之體脂萃段(stoma vascular fraction)中，且其豐度與身體質量指數 (body mass index)呈正比；丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)富含於高脂飲食糞便菌相中，其與肥胖表徵 (phenotype) 間具正相關性，有趣的是BC198-H、S38-H會輕微促進上述兩個菌科的豐度，而意外的是BC198與S38合併使用卻可以減少上述兩個菌科的豐度，而有利於改善肥胖。

瘤胃菌科已知與非酒精性脂肪肝 (non-alcoholic fatty liver disease) 及腸道滲漏 (intestinal leaking) 呈負相關，且瘤胃菌科包含許多重要的產丁酸菌，因此瘤胃菌科對改善肥胖有正面影響。我們驚訝的發現，BC198-H、S38-H雖然會減少瘤胃菌科，但BC198與S38合併使用後卻反而提高瘤胃菌科的豐度，因此BC198與S38合併使用可以透過增加瘤胃菌科而改善肥胖。

屬層中，Romboutsia肝臟中脂質合成作用間呈正相關。BC198-H、S38-H可以減少Romboutsia的豐度，而BC198與S38合併使用更進一步抑制豐度，達到抑制肝臟脂質生成的效果。

Akkermansiaceae屬於疣微菌門，存在大鼠中的Akkermansiaceae只有艾克曼嗜黏蛋白菌一個物種，因此heatmap中的Akkermansiaceae可視為艾克曼嗜黏蛋白菌。艾克曼嗜黏蛋白菌可強力抑制脂肪生成，研究已證實，僅僅給予艾克曼嗜黏蛋白菌製造的蛋白質Amuc_1100，可強烈的抑制脂肪生成(非專利文獻11)。非常有趣的是，BC198-H、S38-H不影響艾克曼嗜黏蛋白菌的豐度，但BC198與S38合併使用卻可劇烈的增加艾克曼嗜黏蛋白菌的豐度，顯示BC198與S38合併使用出現了無法預期的協同作用，此應為BC198與S38合併使用有效抑制肥胖的主要機制之一。

值得注意的是，艾克曼嗜黏蛋白菌會產生丙酸，並促進產丁酸菌增加，而BC198與S38合併使用組糞便中的丙酸、丁酸含量有增加，與艾克曼嗜黏蛋白菌豐度增加一致。艾克曼嗜黏蛋白菌唯一可使用的碳源來自於黏膜層分泌的黏液，丁酸可促進黏液(mucin)分泌，黏液增加可促進艾克曼嗜黏蛋白菌的生長。因此BC198與S38合併使用另一個有效抑制肥胖的機制，應是增加產丁酸菌如 瘤胃菌科的豐度，增加丁酸產量。

以上腸道菌相的結果說明，BC198-H、S38-H可以改善高脂飲食誘發的部分菌相失調如紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)、脫硫弧菌科。然而在BC198與S38合併使用的協同作用下，出現無法預期的菌相改變，可將菌相改善至正常菌相，並促進有益於減脂的特定菌增加，例如艾克曼嗜黏蛋白菌、瘤胃菌科。

圖8中紅色箭頭所指為BC198與S38合併使用預期外的結果，與單方的效應相反，有無法預期的功效

本發明之益生菌組合物，在小鼠上應用的低劑量為5×10 ⁷CFU，高劑量為5×10 ⁹，人類應用之有效劑量係依據美國食藥署(Food and Drug Administration)提供之人類等同劑量(Human Equivalent Dose)以及體表面積而換算，假設人類體重為60kg，而人類和小鼠之體表面積轉換係數為12.3，因此可得在人體應用上的低劑量為2.4×10 ⁸CFU，高劑量為2.4×10 ¹⁰CFU。

本發明之益生菌組合物，其組合物包含載劑、賦形劑、稀釋劑；本組合物之劑型選自溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿、和膠囊所構成之群組；組合物可進一步製成流體乳品、濃縮牛奶、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆漿、發酵豆漿、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥組合物、膳食補充品。

上列詳細說明係針對本發明之可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

圖1 係為副乾酪乳酸桿菌S38在顯微鏡下之型態 圖2 係為凝結芽孢桿菌BC198在顯微鏡下之型態 圖3 係為副乾酪乳酸桿菌S38的抑制脂肪細胞生成脂質能力比較 圖4 係為凝結芽孢桿菌BC198的抑制脂肪細胞生成脂質能力比較 圖5 係為門層物種相對豐度柱狀圖 圖6 係為厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例(Firmicutes/Bacteroidetes ratio) 圖7 係為菌叢主成分分析(Principal Component Analysis，PCA) 圖8 係為組合物對腸道菌相［科］、［屬］分類階層的影響

國內寄存資訊(依寄存機構、日期、號碼順序註記) 1.    財團法人食品工業發展研究所，寄存日期為2019年7月11日、寄存編號為BCRC 910916 2.    財團法人食品工業發展研究所，寄存日期為2020年7月3日、寄存編號為BCRC 911007 國外寄存資訊(依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 1.    寄存於德國，德國國家菌種保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)、寄存日期為2019年7月10日、寄存編號為DSM33206 2.    寄存於德國，德國國家菌種保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)、寄存日期為2021年1月8日、寄存編號為DSM33753

Claims (10)

1. 一種副乾酪乳酸桿菌S38( Lacticaseibacillus paracaseiS38)，其寄存編號為BCRC911007及DSM33753，具有改善身體組成的功效。
2. 一種凝結芽孢桿菌BC198( Bacillus coagulansBC198)，其寄存編號為BCRC910916及DSM33206，具有改善身體組成的功效。
3. 一種益生菌組合物，其中該益生菌組合物包含如請求項1所述之副乾酪乳酸桿菌S38和如請求項2所述之凝結芽孢桿菌BC198，具有改善身體組成的功效。
4. 如請求項3所述之益生菌組合物，其中該益生菌組合物所包含之益生菌為活菌。
5. 一種如請求項3所述之益生菌組合物用於改善身體組成之用途。
6. 如請求項5所述之益生菌組合物用於改善身體組成之用途，其中該改善身體組成係為降低高脂飲食後的體重升高、降低高脂飲食後的體脂升高、或降低高脂飲食後的內臟脂肪升高。
7. 如請求項5所述之益生菌組合物用於改善身體組成之用途，其中該改善身體組成係經由高脂飲食後抑制食慾、抑制脂質生成、提升腸道中丁酸含量、調整腸道菌相。
8. 如請求項7所述之益生菌組合物用於改善身體組成之用途，其中該調整腸道菌相係為提高高脂飲食後腸道中的艾克曼嗜黏蛋白菌或瘤胃菌科之數量或比例。
9. 如請求項1所述之副乾酪乳酸桿菌S38，其中該副乾酪乳酸桿菌S38成人服用劑量介於2.4×10 ⁸-2.4×10 ¹⁰CFU (colony forming unit)/天。
10. 如請求項2所述之凝結芽孢桿菌BC198，其中該凝結芽孢桿菌BC198成人服用劑量2.4×10 ⁸-2.4×10 ¹⁰CFU (colony forming unit)/天。

Images