TWI669124B - 芽孢乳酸菌用於製備代謝重金屬及保護肝臟醫藥組成物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一芽孢乳酸菌的用途，提供了用於製備代謝重金屬及/或保護肝臟醫藥組成物之用途，其中該芽孢乳酸菌係Bacillus coagulans TCI711，寄存編號BCRC910807。藉由本發明醫藥組成物中的芽孢乳酸菌，可降低重金屬的濃度，降低氧化物質對肝臟細胞傷害，提升肝臟細胞粒線體的活性，並可降低脂肪肝的形成。
Description
本發明係關於一種與肝臟機能相關之醫藥組成物，尤其是關於一種可代謝重金屬及/或保護肝臟的醫藥組成物。
所謂的「脂肪肝」是指肝臟內所蓄積的脂肪(主要為三酸甘油脂)的重量超過全肝臟重量的百分之十以上。在未加以改善的情形下，有可能導致肝纖維化與肝硬化，或肝功能無法正常作用的危險。而與脂肪肝形成最相關原因之一就是身體中重金屬的累積，例如過多的汞，容易造成肝臟中脂肪的累積，同時也會產生脂質過氧化物，或造成粒線體的退化，同時抑制了身體中許多酵素的活性而影響代謝。因此，當人們暴露在高重金屬濃度的環境下，勢必因為呼吸、飲食或接觸等方式而受到相當大的健康危害。
芽孢乳酸菌原本之學名為Lactobacillus sporogenes，後來科學家發現乳酸菌屬的細菌並無法像凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)一樣產生孢子，因此後來正名為Bacillus coagulans，中文名稱也稱之為凝結芽孢桿菌。芽孢乳酸菌是一種可以產生乳酸的革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在不佳之生長環境下會產生內孢子而停止生長，但其被動物食入後，經與胃酸反應再進到小腸時，會從孢子狀態回復而繼續生長與繁殖，因此具有耐酸與耐熱(超過50℃就會產生孢子)的特性。芽孢乳酸菌被發現一開始時被作為動物的益生菌使用，也些用於餵養家畜，也有些個案用於改善女性陰道的菌叢，或是改善腸躁症的腹痛症狀。
目前對於益生菌的研究已愈來愈廣泛，除了腸胃道相關疾病或症狀的處置外，其他常見疾病亦有相關的發現，但目前對於肝臟功能的影響，並無具體相關的研究。然而，肝臟疾病例如前述的脂肪肝、肝臟細胞對於有毒物質的代謝與吸收，在在都影響肝臟機能的運作效率與健康，若能發現一種對於肝臟細胞活性或其他作用具有功效的益生菌，並進一步應用於相關保健食品或醫藥品上，對於人類健康將有莫大的助益。
本發明目的之一在於提供一種芽孢乳酸菌的用途，藉由芽孢乳酸菌的作用，吸收並降低重金屬的濃度，以降低因為重金屬所產生後續健康上的危害。
本發明另一目的之一在於提供一種利用芽孢乳酸菌保護肝臟細胞的用途，藉由芽孢乳酸菌的作用，減少肝臟細胞中的氧化活性物質、脂肪等有害物質，提升肝臟細胞的活力，進而促進肝臟的作用機能。
為了達成前述目的，本發明提供一種芽孢乳酸菌用於製備代謝重金屬及/或保護肝臟醫藥組成物之用途，該芽孢乳酸菌係Bacillus coagulans TCI711，寄存編號BCRC910807。
在本發明的一實施例中，該芽孢乳酸菌係一活菌。
在本發明的一實施例中，該芽孢乳酸菌之有效劑量係108~1010cfu/天，較佳為109~1010cfu/天。
在本發明的一實施例中，該芽孢乳酸菌可用以降低重金屬的濃度，該重金屬可為汞、鉛或銅，但並不僅限於此。
在本發明的一實施例中，該芽孢乳酸菌可用以降低肝臟細胞中活性氧化物質的形成。
在本發明的一實施例中，以該芽孢乳酸菌可用以提升肝臟細胞中粒線體之活性。
在本發明的一實施例中，該芽孢乳酸菌可用以降低脂肪肝之形成。
在本發明的一實施例中，該醫藥組成物的劑型可為一溶液、一明膠膠囊、一軟膠囊或一錠劑。
在本發明的另一實施例中，該醫藥組成物進一步用於製備食品、保健食品或膳食補充品。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係本發明實施例芽孢乳酸菌對於重金屬銅降解能力之測試結果圖。
圖2係本發明實施例芽孢乳酸菌對於重金屬汞降解能力之測試結果圖。
圖3係本發明實施例芽孢乳酸菌對於重金屬鉛降解能力之測試結果圖。
圖4係本發明實施例芽孢乳酸菌對於細胞活性氧化物質(ROS)影響之測試結果圖。
圖5係本發明實施例芽孢乳酸菌對於粒腺體活性影響之測試結果圖。
圖6係本發明實施例芽孢乳酸菌對於肝臟細胞油滴累積之測試結果圖。
本發明用以代謝重金屬及保護肝臟醫藥組成物所包含之菌株係芽孢乳酸菌(Bacillus coagulans TCI711)，其寄存於食品工業發展研究所，編號BCRC910807。TCI711菌之培養方式，可將保存於甘油之菌株，接種在MRS培養基(1%，v/v)中，於37℃下培養16至24小時後備用。所培養的菌株可進一步接種
到另外的培養基上進行測試，或是將菌株調配成OD600=1的菌液，使菌數約在108~1010cfu之間，之後再以1%(v/v)添加至其他測試溶液進行後續培養。
準備前述實施例1中所製備的菌液，分別培養於添加有10ppm銅、30ppm汞與0.4ppm鉛等重金屬之MRS培養基中，於37℃下培養24小時。空白組則未加入實施例1中所製備的菌液。之後，各培養試管以5000rpm轉速離心10分鐘後，取出上清液進行重金屬濃度的檢測，其結果分別如圖1、圖2與圖3所示。
由圖1可知，本發明實施例之芽孢乳酸菌可降低培養液中高達80%的含銅量，而在圖2中可發現其亦可降低22%的含汞量，在圖3中更可發現本發明實施例之芽孢乳酸菌具有降低高達94%鉛含量的功效。藉由前述圖1~圖3之結果可知，本發明實施例之芽孢乳酸菌可有效降低液體中的重金屬，若利用於人體，將可降低人體對於重金屬的吸收，減低肝臟的負擔。
準備人類HepG2肝臟細胞(ATCC HB-8065)，接種於6孔盤中，每孔中含2ml細胞培養液[Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin，Gibco)、10%胎牛血清(Gibco)]，使每孔具有1 x 105個細胞，將其置於37℃下培養24小時。
將測試樣本分為四組，其中，A組為空白組，B組為加入0.5mM過氧化氫(H2O2)的控制組，C組為MRS加入0.5mM過氧化氫(H2O2)的對照組，D組則為試驗組，除C組之成分外再加入由前述實施例1所調製的芽孢乳酸菌液0.5mg/ml。D組細胞加入芽孢乳酸菌後，先置於37℃下反應培養1小時。
之後，分別於每組每孔中加入5μg/ml的DCFH-DA(Sigma/SI-D6883-50MG)，並置於37℃下培養15分鐘。接者以0.5mM的過氧化氫於37℃下對細胞處理反應1小時，之後將培養液吸乾，再以1ml的1X PBS清洗每孔2次。之後每孔加入200μl胰蛋白酶(trypsin)，置於黑暗中反應5分鐘。於黑暗中再將含有細胞的培養液吸出轉移至15ml離心管，於300g下離心5分鐘。離
心後將上清液移除，並以1X PBS清洗離心沉澱物1次。再次於300g下離心10分鐘，將上清液移除後，以1ml的1X PBS回溶離心沉澱物。接著，以流式細胞儀(BD Accuri C6 Plus)，分別於激發波長450-490nm、發射波長510-550nm的條件下，偵測DCFH-DA的螢光訊號值。偵測出之數值以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定分析二數值間的統計顯著性，其結果如圖4所示。其中，***表示相較於空白組，p值<0.001；**表示相較於空白組，p值<0.01；###表示相較於MRS組，p值<0.001。
由圖4之結果可知，在含有本發明實施例之芽孢乳酸菌的作用下，可將過氧化氫所誘發之活性氧化物質(ROS)大幅減少約55%，顯見本發明實施例之芽孢乳酸菌具有相當優秀之抗氧化能力，而可改善毒性物質所形成的自由基傷害。
準備人類HepG2肝臟細胞(ATCC HB-8065)，接種於6孔盤中，每孔中含2ml細胞培養液[Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin，Gibco)、10%胎牛血清(Gibco)]，使每孔具有1 x 105個細胞，將其置於37℃下培養24小時。
將測試樣本分為三組，其中，A組為空白組，B組為含MRS對照組，C組則為試驗組，加入由前述實施例1所調製的芽孢乳酸菌液0.5mg/ml。將各組細胞加入測試樣本後，於培養液中預處理24小時。
之後將培養液吸乾，以1ml的1X PBS清洗每孔2次。之後每孔加入200μl胰蛋白酶(trypsin)反應5分鐘。再將含有細胞的培養液吸出轉移至15ml離心管，於300g下離心5分鐘。離心後將上清液移除，並以1ml的1X PBS清洗離心沉澱物1次。再次於300g下離心10分鐘，將上清液移除後，以1ml的1X PBS回溶離心沉澱物。接著，以1：250的JC-1染液與JC-1染色緩衝液(BD MitoScreen)進行細胞染色。染色反應15分鐘後以1X PBS清洗兩次。最後以流式細胞儀(BD Accuri C6 Plus)，分別於激發波長450-490nm、發射波長510-550nm的條件下，進行粒線體染色訊號值的分析，以測試肝臟活細胞活性的變化。偵測出之數值
以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定分析二數值間的統計顯著性，其結果如圖5所示。其中，***表示相較於空白組，p值<0.001；##表示相較於MRS，p值<0.001。
由圖5之結果可知，在含有本發明實施例之芽孢乳酸菌的作用下，可讓肝臟細胞中粒線體之活性大幅增加一倍，顯見本發明實施例之芽孢乳酸菌可大幅增加肝臟細胞的活性，因而對於肝臟細胞生長可提供更多的能量並影響相關生長機制，而改善肝臟的機能。
準備人類HepG2肝臟細胞(ATCC HB-8065)，接種於6孔盤中，每孔中含2ml細胞培養液[Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin，Gibco)、10%胎牛血清(FBS，Gibco)]，使每孔具有1 x 105個細胞，將其置於37℃下培養24小時。
將測試樣本分為四組，其中，A組為空白組，B組為脂肪肝對照組，C組為含MRS對照組，D組則為試驗組，加入由前述實施例1所調製的芽孢乳酸菌液0.5mg/ml。將各組細胞加入測試樣本後，加入含有2%FBS培養液中，進行反應24小時。
培養24小時之後將培養液移除，替換為含有1%青黴素-鏈黴素、2%FBS以及OA-BSA結合物的細胞培養液，並於各組細胞加入測試樣本反應作用24小時。之後將培養液移除，以1ml的1X PBS清洗每孔2次。之後以10%甲醛(formaldehyde)固定細胞30分鐘，以1X PBS清洗每孔2次，接著以50%異丙醇(isopropanol)漂洗15秒。之後，以溶於60%異丙醇的油紅O染色1小時，並以光學顯微鏡進行觀察。觀察之後，以100%異丙醇將染劑溶解，進行油紅比例之定量分析，其結果如圖6所示。其中，*表示相較於脂肪肝對照組，p值<0.05，**表示相較於脂肪肝對照組，p值<0.01。
由圖6之結果可知，在含有本發明實施例之芽孢乳酸菌的作用下，可減少19%肝臟細胞油滴的累積，有助於降低脂肪肝形成的機率。
藉由上述試驗可知，本發明實施例之芽孢乳酸菌，不但可吸附溶液中的重金屬，更可以降低肝臟細胞ROS的形成、減低脂肪肝形成的機率，並
有效提升肝臟細胞的活性，可用於保護肝臟造細胞免於自由基的傷害，而提升肝臟細胞的機能。
此外，於製備包含本發明實施例芽孢乳酸菌之醫藥組成物時，亦可進一步加入所屬技術領域所熟知之載劑或其他輔劑。而其劑型，可為但不限於溶液、膠囊、或錠劑。同時，本發明實施例之芽孢乳酸菌或包含其他成分的醫藥組成物，亦可添加於食品、保健食品或膳食補充品中。
【寄存國家】TW中華民國
【寄存機構】食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心
【寄存日期】2017/12/26
【寄存號碼】BCRC 910807
Claims (7)
- 一種凝結芽孢桿菌之用途，係用於製備代謝重金屬及/或在肝臟細胞中降低活性氧化物質形成、提升粒線體活性、及降低脂肪累積之醫藥組成物，其中該凝結芽孢桿菌係Bacillus coagulans TCI711，寄存編號BCRC910807。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該凝結芽孢桿菌係一活菌。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該凝結芽孢桿菌有效劑量係108~1010cfu/天。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該凝結芽孢桿菌有效劑量係109~1010cfu/天。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該重金屬係銅、汞或鉛。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物的劑型係一溶液、一明膠膠囊、一軟膠囊或一錠劑。
- 一種包含凝結芽孢桿菌的食品、保健食品或膳食補充品的護肝用途，其中該凝結芽孢桿菌係Bacillus coagulans TCI711，寄存編號BCRC910807。
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| 观晓辉，凝结芽胞杆菌活菌片对非酒精性脂肪性肝炎患者内毒素及细胞因子的影响，中國微生態學雜誌， 2009年7月，第21卷第7期，第639-640頁 * |
| 观晓辉，凝结芽胞杆菌活菌片对非酒精性脂肪性肝炎患者内毒素及细胞因子的影响，中國微生態學雜誌， 2009年7月，第21卷第7期，第639-640頁。 |
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