WO2007052613A1 - 非液相型化学発光酵素免疫測定法および測定キット - Google Patents

非液相型化学発光酵素免疫測定法および測定キット Download PDF

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WO2007052613A1
WO2007052613A1 PCT/JP2006/321675 JP2006321675W WO2007052613A1 WO 2007052613 A1 WO2007052613 A1 WO 2007052613A1 JP 2006321675 W JP2006321675 W JP 2006321675W WO 2007052613 A1 WO2007052613 A1 WO 2007052613A1
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WO
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enzyme
chemiluminescent
substance
liquid phase
measurement
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/321675
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takehide Matsuda
Koichi Shimizu
Takeshi Kawaguchi
Yasuyo Maeda
Original Assignee
National University Corporation Hokkaido University
Seiken Co., Ltd
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Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N21/8483—Investigating reagent band

Definitions

  • the present invention relates to a chemiluminescent enzyme immunoassay and measurement kit, and more particularly to a non-liquid phase chemiluminescent immunoassay for measuring biological components such as proteins and a measurement kit using the same.
  • Immunoassay is a measurement method that utilizes the property that an antibody specifically binds to a substance to be measured (antigen).
  • enzyme immunoassay EIA
  • the enzyme immunoassay has a high sensitivity of several ngZmL and is widely used in clinical tests as a test method for cancer-related proteins and viruses.
  • chemiluminescent enzyme imm unoassay CLEIA
  • the immunochromatography method is an immune complex between a substance to be measured and a labeled antibody (labeled with a visible substance such as gold-copied particles or color latex). Is captured in a concentrated manner at the part where the antibody is arranged in a line on the test piece, and the substance to be measured is measured by visually or optically reading the captured immune complex (appears as a colored line).
  • a labeled antibody labeled with a visible substance such as gold-copied particles or color latex.
  • Patent Document 1 JP-A-3-53897
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-249079
  • Patent Document 3 Japanese Patent No. 3481894
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay is very sensitive and is used for measurement of trace amounts of proteins.
  • the conventional chemiluminescent enzyme immunoassay has a problem that the measuring apparatus becomes large and expensive when applied to an automatic measuring apparatus.
  • the conventional chemiluminescent enzyme immunoassay is a liquid-phase assay, so if it is applied to an automatic measuring device, it involves complicated procedures such as sample and reagent dispensing mechanisms and a cleaning mechanism for BZF separation. A mechanism is required. As a result, the measuring apparatus to which the conventional chemiluminescent enzyme immunoassay is applied becomes large and expensive.
  • the present inventor has characterized the characteristics of the liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay (for example, being hardly affected by external light and being highly sensitive), and the non-liquid phase immunochromatography method.
  • the development of an immunoassay that combines these features was studied.
  • Chemiluminescence is a phenomenon in which light is emitted as energy when returning to a molecular force stable state excited by the catalytic action of an enzyme.
  • an enzyme, a chemiluminescent substrate, and a chemiluminescence enhancer are generally added in a solution. Mix in to light the whole solution and measure the amount of light emitted.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassays described in Patent Document 1 and Patent Document 2 are immunoassays using this liquid-phase chemiluminescent reaction system.
  • the present inventor develops a non-liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay method by using an antibody that acts on a chemiluminescent substrate instead of a visible gold colloid as an antibody labeling substance in the immunochromatography method. It was investigated.
  • a solution of a chemiluminescent substrate or a solution of a chemiluminescence enhancer can be applied to the test piece.
  • the generated luminescent product diffuses without being fixed around the immune complex, indicating that it is not a stable measurement object.
  • the present inventor does not apply a solution of the chemiluminescent substrate directly on the test piece, but superimposes a support film containing the chemiluminescent substrate on the test piece, so that the luminescent product is stably formed on the support film.
  • the present invention has been completed.
  • the inventor superimposes a support film containing a chemiluminescence enhancer on a test piece, and further superimposes a support film containing a chemiluminescence substrate on the support film containing the chemiluminescence enhancer.
  • a luminescence product can be stably left on the support film as in the case without the chemiluminescence enhancer, and the present invention has been completed. It was.
  • the first of the present invention relates to the chemiluminescent enzyme immunoassay shown below.
  • a non-liquid phase chemiluminescent enzyme comprising: a step of superposing a support membrane; and a step of detecting the amount of luminescence generated by the reaction between the enzyme-labeled antibody and the chemiluminescent substrate and measuring the amount of the analyte. Immunoassay.
  • the second of the present invention relates to the measurement kit shown below.
  • Specimen injection part for injecting a specimen containing a substance to be measured, a labeled antibody holding part containing an enzyme-labeled antibody labeled with an enzyme that acts on a chemiluminescent substrate, an immunity containing the substance to be measured and the enzyme-labeled antibody
  • Non-liquid having a measurement part for capturing a complex, a test piece having a support on which the specimen injection part, the labeled antibody holding part and the measurement part are arranged, and a support film containing the chemiluminescent substrate
  • test piece further includes a second measurement unit that captures the antibody or the immune complex on the support.
  • a measurement substance is measured with high sensitivity without taking complicated procedures such as reagent dispensing, washing, and stirring. be able to. Further, according to the present invention, since the complicated procedure is not required, a small and low-cost measuring device can be manufactured.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a measurement kit according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the principle of a non-liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay method according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a configuration of a measurement kit according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 4 shows the principle of a non-liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay method according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a measuring apparatus that performs multi-item simultaneous measurement by the non-liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of Example 2.
  • non-liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention an antibody labeled with an enzyme that catalyzes a chemiluminescent substrate is used, and the enzyme-labeled antibody and the chemiluminescent substrate are reacted on a support membrane. It is characterized by that. Thereby, a reaction product can be kept on a support membrane.
  • a reaction system in which a reagent solution is reacted in a container to generate chemiluminescence is called a “liquid phase reaction system”, and conventional chemiluminescent enzyme immunization using a liquid phase reaction system is used.
  • the measuring method is called “liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay”.
  • the present inventor has described a reaction system for generating chemiluminescence on a support membrane that is a “non-liquid phase type” by superimposing a support membrane containing a chemiluminescent substrate on an enzyme-labeled antibody on a V ⁇ support in a solution layer.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention using a non-liquid phase reaction system was defined as a “non-liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay”.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention (i.e., non-liquid phase chemiluminescent enzyme immunoassay method) generates chemiluminescence stably without using a container such as a test tube or a microplate. Can be held. [0016]
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention measures a substance to be measured such as protein or chemical substance using a non-liquid phase reaction system.
  • “measuring” includes detecting the presence or absence of a substance to be measured rather than just measuring the concentration (amount) of the substance to be measured.
  • the reaction product can be kept on the support film without diffusing on the support, so that the substance to be measured can be measured stably.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention does not require a washing step unlike the liquid-phase chemiluminescent enzyme immunoassay method, so that a procedure for exchanging a solution such as a buffer solution is unnecessary. It can be performed by a simple procedure.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a measurement kit according to Embodiment 1 of the present invention.
  • a measurement kit 100 includes a test piece 200, a chemiluminescent substrate support film 300, and an chemiluminescence enhancer support film 400.
  • the test piece 200 includes a support 210, a specimen injection unit 220, a labeled antibody holding unit 230, a first measurement unit 240, a second measurement unit 250, and an absorption unit 260.
  • the specimen injection unit 220, the labeled antibody holding unit 230, the first measurement unit 240, the second measurement unit 250, and the absorption unit 260 are formed on the support 210, and are preferably arranged in this order. .
  • the support 210 includes a membrane 210-1 for developing a test sample by capillary action, and examples of the membrane 210-1 include a nitrocellulose membrane or a nylon membrane.
  • the support 210 preferably further includes a support plate 210-2 to which the film 210-1 is attached in order to ensure strength.
  • Examples of the support plate 210-2 include a plate glass or a synthetic resin plate.
  • the support 210 need not have a solution layer. Therefore, it is necessary to form a tank on the support.
  • the sample injection unit 220 is a portion to which a test sample is applied, and is composed of, for example, a rayon nonwoven fabric, filter paper, cotton cloth (absorbent cotton), or the like. It is preferable that the sample injection unit 220 is in contact with the labeled antibody holding unit 230! /.
  • the labeled antibody holding unit 230 includes the enzyme labeled antibody 232, the first measuring unit 240, and the second A member that includes an antibody 234 labeled with a substance that binds to the second measurement unit 250 (hereinafter referred to as “measurement unit binding substance-labeled antibody”) in a movable state, such as a glass fiber non-woven fabric.
  • the enzyme-labeled antibody 232 and the measurement-particulate binding substance-labeled antibody 234 contained in the labeled-antibody holding unit 230 are preferably dried in order to facilitate storage of the test piece.
  • the enzyme-labeled antibody 232 is an antibody that is labeled with an enzyme that catalyzes a chemiluminescence reaction and binds to a substance to be measured.
  • the enzyme-labeled antibody 232 may be a primary antibody that directly binds to the substance to be measured !, or may be a secondary antibody or a tertiary antibody that binds to the substance to be measured via another antibody.
  • the enzyme labeled with the enzyme-labeled antibody 232 may be appropriately selected according to the chemiluminescent substrate contained in the chemiluminescent substrate support film 300.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Luciferase Luciferase
  • HRP horse radish peroxidase
  • the measurement unit binding substance labeled antibody 234 is an antibody that binds to a substance to be measured and is labeled with a substance that binds to the first measurement unit 240 and the second measurement unit 250.
  • a substance that binds to the first measurement unit 240 and the second measurement unit 250 For example, when avidin or streptavidin, which is a piotin-specific binding protein, is immobilized on the first measurement unit 240 and the second measurement unit 250, the measurement unit binding substance labeled antibody 234 is labeled with piotin.
  • the analyte, the enzyme-labeled antibody 232, and the measurement unit-bound substance-labeled antibody 234 contained in the test sample that has moved from the sample injection unit 220 bind to form an immune complex. Is done.
  • the first measurement unit 240 is a band-like or dot-like part that captures the immune complex formed by the labeled antibody holding unit 230. It is preferable that a substance 242 capable of binding to the measurement part binding substance labeled antibody 234 is fixed to the first measurement part 240. For example, when the measurement part binding substance labeled antibody is an antibody labeled with piotin, it is preferable that avidin or streptavidin is immobilized on the first measurement part 240. The first measurement unit 240 binds to the measurement unit binding substance labeled antibody 234 bound to the substance to be measured and captures the immune complex.
  • the second measurement unit 250 is a band-like or dot-like part that captures a strong immune complex that has not been captured by the first measurement unit 240. Similarly to the first measurement unit 240, the second measurement unit 250 has a substance 252 that can bind to the measurement unit binding substance labeled antibody fixed thereto, and is attached to the measurement unit binding substance labeled antibody 234 bound to the measurement target substance. Bind and capture immune complexes.
  • the absorption unit 260 is a portion that absorbs a liquid (usually water) contained in a test sample, and is configured by, for example, filter paper.
  • the chemiluminescent substrate support film 300 is a dry or wet support film containing a chemiluminescent substrate.
  • the chemiluminescent substrate support membrane 300 is preferably transparent or translucent from the viewpoint of measuring luminescence by the reaction between the enzyme labeling antibody 232 and the chemiluminescent substrate.
  • agarose gel or polyacrylamide gel Cellulose acetate membrane.
  • these gels are preferably fixed to a transparent polyester film or polyethylene film for gel support.
  • the chemiluminescent substrate contained in the chemiluminescent substrate support film 300 may be appropriately selected according to the enzyme that labels the enzyme-labeled antibody 232.
  • the enzyme labeling the enzyme-labeled antibody 232 is ALP
  • a dioxetane compound such as CDP-Star or CSPD (Roche Diagnostics) may be selected as the chemiluminescent substrate.
  • the enzyme labeled with the enzyme-labeled antibody 232 is luciferase, luciferin (Dojin University, etc.) or the like may be selected as the chemiluminescent substrate.
  • luminol such as Pierce
  • the chemiluminescent substrate in the chemiluminescent substrate support film 300, for example, in the case of an agarose gel or polyacrylamide gel, the chemiluminescent substrate is added to the composition for producing the gel, and the composition is fixed. It may be polymerized or polymerized. In the case of cellulose acetate membranes, excess chemical emissions after impregnating the cellulose acetate membrane with a chemiluminescent substrate. What is necessary is just to remove a light substrate.
  • the chemiluminescence enhancer support film 400 is a dry or wet support film containing a chemiluminescence enhancer.
  • the chemiluminescence enhancer support membrane 400 is, for example, agarose gel, polyacrylamide gel, cellulose acetate membrane, filter paper, or the like.
  • the chemiluminescence enhancer contained in the chemiluminescence enhancer support film 400 may be appropriately selected according to the chemiluminescence reaction system.
  • the enzyme that labels enzyme-labeled antibody 232 is ALP, 4 such as myristyltrimethylammonium bromide, cetyltrimethylammonium bromide, polybutenylbenzyldimethylammonium chloride, and polybutylbenzyltributylammonium chloride.
  • a water-soluble polymer containing a quaternary ammonium group or -Troblock (Tropics) may be selected as the fluorescence enhancer.
  • enzyme that labels the enzyme-labeled antibody 232 is luciferase, ATP or the like may be selected as an enzyme luminescence enhancer. If the enzyme labeled with enzyme-labeled antibody 232 is HRP, phenol or the like can be selected as a chemical luminescence enhancer!
  • the chemiluminescence enhancer in the chemiluminescence enhancer support film 400, for example, in the case of an agarose gel or polyacrylamide gel, the chemiluminescence enhancer is added to the composition for producing the gel,
  • the composition may be solidified or polymerized.
  • the excess chemiluminescence enhancer should be removed.
  • chemiluminescence enhancer may not be required.
  • the chemiluminescence enhancer support film 400 is unnecessary.
  • the support film containing the chemiluminescent substrate (chemiluminescent substrate support film 300) and the support film containing the chemiluminescence enhancer (chemiluminescence enhancer support film 400) have been described as separate. May contain a chemiluminescent substrate and a chemiluminescent enhancer.
  • the support membrane containing the chemiluminescent substrate and the chemiluminescence enhancer is, for example, agarose gel, polyacrylamide gel, cellulose acetate membrane, filter paper, or the like.
  • the principle of measuring the substance to be measured with the measurement kit of Embodiment 1 will be described with reference to the schematic diagram of FIG. In FIG. 2, the solvent of the test sample is not shown for convenience of explanation.
  • the test sample passes through the surface of the labeled antibody holding unit 230 and the membrane 210-1 due to capillary action, and the absorption unit. Move to 260.
  • the labeled antibody holding unit 230 the measurement substance 500, the enzyme-labeled antibody 232, and the measurement part binding substance-labeled antibody 234 contained in the test sample are combined to form an immune complex 510.
  • the formed immune complex 510 moves on the surface of the membrane 210-1 toward the absorption part 260.
  • the measurement part binding substance labeled antibody 234 contained in the immune complex 510 binds to the first measurement part 240, most of the immune complex 510 is captured by the first measurement part 240 (FIG. 2B). The remaining immune complex 510 further moves toward the absorption unit 260 on the surface of the membrane 210-1 and is captured by the second measurement unit 250 (FIG. 2B).
  • the enzyme-labeled antibody 232 is obtained.
  • the enzyme to be labeled acts on the substrate contained in the chemiluminescent substrate support film 300, and the first measurement unit 240 and the second measurement unit 250 generate the fluorescence (FIG. 2C).
  • an optical means such as a cooled CCD camera or a photomultiplier tube, the measurement substance 500 contained in the test sample can be measured.
  • the state of the reaction system (for example, the presence or absence of the prozone phenomenon) can be examined by comparing the light emission amount of the first measurement unit 240 with the light emission amount of the second measurement unit 250. Further, the concentration (amount) of the substance to be measured 500 in the test sample can be measured by applying the luminescence amount of the first measurement unit 240 to the calibration curve prepared in advance.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method and measurement kit according to the present embodiment, a state in which the chemiluminescent substrate and the chemiluminescence enhancer are included in the support film, not in the solution. Then, the immune complex containing the enzyme-labeled antibody is supplied onto the first measurement unit and the second measurement unit that have captured the immune complex.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay and measurement kit according to the present embodiment can realize a highly sensitive chemiluminescent enzyme immunoassay using a simple non-liquid phase reaction system.
  • the measurement unit binding substance labeled antibody is added to the measurement target substance in the labeled antibody holding unit.
  • An example is shown in which the immune complex is captured by the first measurement unit and the second measurement unit after binding.
  • an antibody that binds to the substance to be measured is immobilized in advance on the first measurement unit and the second measurement unit, and the immune complex is captured by the first measurement unit and the second measurement unit. An example is shown.
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of the measurement kit according to Embodiment 2 of the present invention.
  • the same components as those in the measurement kit according to Embodiment 1 are denoted by the same reference numerals, and descriptions of the duplicated portions are omitted.
  • the measurement kit 110 has a test piece 202, a chemiluminescent substrate support film 300, and an chemiluminescence enhancer support film 400.
  • the chemiluminescent substrate support film 300 and the chemiluminescence enhancer support film 400 are the same as those in the first embodiment.
  • the test piece 202 includes a support 210, a specimen injection unit 220, a labeled antibody holding unit 236, a first measurement unit 244, a second measurement unit 254, and an absorption unit 260.
  • the support 210, the specimen injection unit 220, and the absorption unit 260 are the same as those in the first embodiment.
  • the labeled antibody holding unit 236 is a member including the enzyme labeled antibody 232 in a movable state.
  • the enzyme-labeled antibody 232 contained in the labeled-antibody holding unit 236 is the same as the enzyme-labeled antibody of Embodiment 1, and is preferably dried.
  • the substance to be measured and the enzyme-labeled antibody 232 contained in the test sample are combined to form an immune complex.
  • the first measurement unit 244 is a band-like or dot-like site that captures the immune complex formed by the labeled antibody holding unit 236, as in the first measurement unit of the first embodiment. is there.
  • a capture antibody 246 that binds to the substance to be measured is fixed to the first measurement unit 240.
  • the first measuring unit 244 binds to the substance to be measured contained in the immune complex and captures the immune complex.
  • the second measurement unit 254 is in the form of a band or dot that captures a strong immune complex that is not captured by the first measurement unit 244. It is a part. Similar to the first measurement unit 244, the second measurement unit 254 has a capture antibody 256 that binds to the substance to be measured immobilized thereon. Capture coalescence [0051] Next, the principle of measuring a substance to be measured with the measurement kit of Embodiment 2 will be described with reference to the schematic diagram of FIG. In FIG. 4, the solvent of the test sample is not shown for convenience of explanation.
  • test sample containing the substance 500 to be measured is applied to the sample injection unit 220 (Fig. 4A)
  • the test sample passes through the surface of the labeled antibody holding unit 236 and the membrane 210-1 due to capillary action, and the absorption unit. Move to 260.
  • the labeled antibody holding unit 236 the analyte 500 and the enzyme-labeled antibody 232 contained in the test sample are combined to form an immune complex 510.
  • the formed immune complex 510 moves on the surface of the membrane 210-1 toward the absorption part 260.
  • the capture antibody 246 fixed to the first measurement unit 244 binds to the immune complex 510, most of the immune complex 510 is captured by the first measurement unit 244 (FIG. 4B). The remaining immune complex 510 further moves toward the absorption unit 260 on the surface of the membrane 210-1, and is captured by the second measurement unit 254 (FIG. 4B).
  • the enzyme-labeled antibody 232 is obtained.
  • the enzyme to be labeled acts on the substrate contained in the chemiluminescent substrate support film 300, and the first measurement unit 244 and the second measurement unit 254 generate the fluorescence (FIG. 4C).
  • an optical means such as a cooled CCD camera or a photomultiplier tube, the measurement substance 500 contained in the test sample can be measured.
  • the state of the reaction system (for example, the presence or absence of the prozone phenomenon) can be examined by comparing the light emission amount of the first measurement unit 244 with the light emission amount of the second measurement unit 254. Further, the concentration (amount) of the substance 500 to be measured in the test sample can be measured by applying the luminescence amount of the first measurement unit 244 to the calibration curve prepared in advance.
  • the capture antibody is fixed in advance to the first measurement unit and the second measurement unit, and the first measurement unit and the second measurement unit To capture immune complexes. According to the present embodiment, the same effect as in the first embodiment can be obtained.
  • the number of force measuring units showing an aspect in which the first measuring unit and the second measuring unit are provided is not limited to this, and one or three force measuring units are provided. It may be above.
  • the capture antibody immobilized on the second measurement unit is an antibody that binds to the substance to be measured, but the capture antibody immobilized on the second measurement unit is an enzyme-labeled antibody. It may be an antibody that binds to. In this case, if chemiluminescence occurs on the first measuring part, it can be seen that the substance to be measured is contained in the specimen.
  • the reaction system may not operate normally.
  • the reaction system may not operate normally, so the test sample contains the substance to be measured. That is why you should not judge it.
  • Embodiment 3 shows an example in which a plurality of types of test materials are measured simultaneously by using a plurality of types of test pieces.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a configuration of a measuring apparatus according to Embodiment 3 of the present invention.
  • a measuring apparatus 600 includes a plurality of test pieces 610a to 610d, a central specimen injection part 620, a chemiluminescence enhancer support film storage part 630, a chemiluminescence substrate support film storage part 640, and a support base 6 50. And a detector 660.
  • Test pieces 610a to 610d are the same as the test pieces of the first embodiment or the second embodiment. Each test piece corresponds to a different test item and measures different substances to be measured. For example, test piece 610a corresponds to myoglobin, test piece 610b corresponds to troponin T, test piece 610c corresponds to troponin I, and test piece 610d corresponds to CK-MB. By doing so, four items called myocardial infarction markers can be measured at a time with a small sampling. This makes it possible to analyze the pathophysiology of myocardial infarction more quickly, which is indispensable for selecting treatment methods and determining prognosis.
  • the central sample injection unit 620 is a portion to which a test sample is applied, and is composed of, for example, a rayon nonwoven cloth, filter paper, cotton cloth (absorbent cotton), or the like.
  • the central specimen injection section 620 has each test piece 6 10a to 610d are common specimen injection parts.
  • the chemiluminescence enhancer support film storage unit 630 is a container for storing a chemiluminescence enhancer support film to be superimposed on each of the test pieces 610a to 610d.
  • the chemiluminescent substrate support membrane storage unit 640 is a container that stores and holds the chemiluminescent substrate support membrane to be superimposed on each of the test pieces 610a to 610d.
  • the support base 650 is a disk-shaped member that radially arranges the test pieces 610a to 610d on the same plane.
  • the support base 650 is rotatably provided.
  • the detection unit 660 detects the amount of chemiluminescence generated on each of the test pieces 610a to 610d.
  • the detection unit 660 is, for example, a cooled CCD camera.
  • each test piece 610a to 610d is placed on the support base 650 and the test sample is applied to the central sample injection portion 620, an immune complex is formed and formed on each test piece 610a to 610d.
  • the immune complex is captured by the first measurement unit and the second measurement unit.
  • the detection unit 660 detects the light emission amount of each of the test pieces 610a to 610d over time while rotating the support base 650.
  • the detection result is printed out by an output unit (not shown). At this time, the output unit may print out the concentration of each substance to be measured, which is the detection result power that is not the detection result of the light emission amount.
  • the measurement apparatus measures a plurality of types of substances to be measured using a plurality of types of test pieces.
  • the present embodiment in addition to the effect of the first embodiment, it is possible to simultaneously measure a plurality of items by one sampling. For example, according to the present embodiment, 5 to 10 items can be measured simultaneously with a 50 L test sample.
  • Example 1 shows an example in which a prostate-specific antigen (hereinafter abbreviated as "PSA") is measured using the measurement kit of the mode of Embodiment 1.
  • PSA prostate-specific antigen
  • a trocellulose membrane (length 25 mm x width 5 mm x thickness 0.2 mm) was used as the support, and filter paper (length 20 mm x width 5 mm x thickness lmm) was used as the specimen injection part.
  • Glass fiber (length 7 mm x width 5 mm x thickness 0.8 mm) was used as the antibody holding part, and filter paper (length 18 mm x width 5 mm x thickness lmm) was used as the absorption part.
  • the specimen injection part and the labeled antibody holding part are brought into contact, the distance between the labeled antibody holding part and the first measuring part is 6 mm, the distance between the first measuring part and the second measuring part is 4 mm, and the second The distance between the measurement part and the absorption part was 8 mm.
  • Streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was fixed to the first measurement unit and the second measurement unit.
  • ALP-labeled anti-human PSA mouse monoclonal antibody (Shibayagi) was used as the enzyme-labeled antibody, and piotin-labeled anti-human PSA mouse monoclonal antibody (made in-house) was used as the binding substance-labeled antibody for the measurement part.
  • PSA was measured.
  • a dilution series (0, 0.001, O.lOOngZmL) of PSA (International Immunology Corporation dlC)) was prepared in PBS and used as a test sample.
  • test specimens (20 IX L) of each concentration prepared in (2) were dropped on the specimen injection parts of different test pieces. Five minutes after dropping, a chemiluminescence enhancer support film was superimposed on the first measurement part and the second measurement part of the test piece, and a chemiluminescence substrate support film was further superimposed. Then, using a cooled CCD camera (Hamamatsu Photonics: C4742-95), the amount of light emitted from the first measurement unit and the second measurement unit was measured every 10 seconds for 2 hours.
  • CCD camera Haamamatsu Photonics: C4742-95
  • FIG. 6 is a graph showing the change over time of the measured light emission amount.
  • PSA concentration was OngZmL
  • almost no change in the amount of luminescence was observed.
  • PSA 0.001, O.lOOngZmL
  • the amount of luminescence increased with the passage of time, saturated after a certain amount of time, and reached a constant value.
  • the higher the PSA concentration the stronger the amount of luminescence was observed. From this result, it is possible to calculate the rate of change in the amount of luminescence at an arbitrary time and create a calibration curve showing the relationship between the PSA concentration and the amount of luminescence.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention can measure a test substance with high sensitivity (O.OOlngZmL or less) with a small amount of test sample.
  • Example 2 shows an example in which alpha-fetoprotein (hereinafter abbreviated as "AFP"), which is a liver cancer marker, was measured using the measurement kit according to the embodiment 2. .
  • AFP alpha-fetoprotein
  • a trocellulose membrane (length 25 mm x width 5 mm x thickness 0.2 mm) was used as the support, and filter paper (length 20 mm x width 5 mm x thickness lmm) was used as the specimen injection part.
  • Glass fiber (length 7 mm x width 5 mm x thickness 0.8 mm) was used as the antibody holding part, and filter paper (length 18 mm x width 5 mm x thickness lmm) was used as the absorption part.
  • the specimen injection part and the labeled antibody holding part are brought into contact, the distance between the labeled antibody holding part and the first measuring part is 6 mm, the distance between the first measuring part and the second measuring part is 4 mm, and the second The distance between the measurement part and the absorption part was 8 mm.
  • An anti-human AFP mouse monoclonal antibody (IIC) was immobilized on the first measurement part and the second measurement part.
  • ALP-labeled anti-human AFP mouse monoclonal antibody (Shibayagi) was used as the enzyme-labeled antibody.
  • CDP-Star 0.25 mM: Roche Diagnostics
  • AFP was the measurement target.
  • AFP dlC dilution series with PBS (0, 0.01 0, 0.100, l.OOOngZmU was prepared and used as a test sample.
  • test specimens (20 IX L) of each concentration prepared in (2) were dropped on the specimen injection parts of different test pieces. Five minutes after dropping, a chemiluminescence enhancer support film was superimposed on the first measurement part and the second measurement part of the test piece, and a chemiluminescence substrate support film was further superimposed. Then, using a cooled CCD camera (Hamamatsu Photonics: C4742-95), the amount of light emitted from the first measurement unit and the second measurement unit was measured every 10 seconds for 2 hours.
  • CCD camera Haamamatsu Photonics: C4742-95
  • FIG. 7 is a graph showing the change over time of the measured light emission amount.
  • the AFP concentration was OngZmL, almost no change in the amount of luminescence was observed.
  • the amount of luminescence increased with the passage of time, and saturated and reached a constant value after a certain amount of time.
  • the higher the AFP concentration the stronger the amount of luminescence was observed. From this result, it is possible to calculate the rate of change in the amount of luminescence at an arbitrary time and create a calibration curve showing the relationship between the concentration of AFP and the amount of luminescence.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention can measure a test substance with high sensitivity (O.OlOngZmL or less) with a small amount of test sample.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention performs a highly sensitive chemiluminescent enzyme immunoassay method using a simple non-liquid phase reaction system. It is useful as a bedside inspection method.
  • the measurement kit of the present invention is 100-: LOOO times more sensitive than the conventional immunochromatography method, it is possible to produce a test piece in a very small size and to use an antibody and an immunoluminescent substrate. The amount can be reduced.
  • specimens (antigens) that use high-sensitivity measurement point power can be diluted before use, so if the blood volume collected from the patient is, for example, 10 L, diluting 10-fold, several items can be adjusted at the same time. It can be measured at the same time.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method of the present invention does not require complicated procedures, it can be applied to a small and low-priced measuring apparatus.

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Abstract

　本発明は、タンパク質などの被測定物質を測定する化学発光酵素免疫測定法に関する。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体と被測定物質とを含む免疫複合体を溶液層のない支持体上に捕捉するステップと、捕捉された免疫複合体の上に化学発光基質を含む支持膜を重ねるステップと、酵素標識抗体と化学発光基質との反応により生ずる発光量を検出することにより、被測定物質の量を測定するステップとを含む。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、高感度な化学発光酵素免疫測定法を非液相型の反応系を用いて行うので、微量の検体で多項目の測定が出来る他、試薬の分注などの煩雑な手順を踏むことなく被測定物質を高感度に測定することができる。

Description

非液相型化学発光酵素免疫測定法および測定キット
技術分野
[0001] 本発明は、化学発光酵素免疫測定法および測定キットに関し、特に、タンパク質な どの生体成分を測定する非液相型化学発光酵素免疫測定法およびそれを用いる測 定キットに関する。
背景技術
[0002] 免疫測定法 (immunoassay)は、抗体が被測定物質 (抗原）に対して特異的に結合 する性質を利用した測定法である。代表的な免疫測定法として、酵素免疫測定法 (e nzyme immunoassay :EIA)が一般的に知られている。酵素免疫測定法は、測定感度 が数 ngZmLと高感度であり、がん関連タンパク質やウィルスなどの検査法として研 究ゃ臨床検査などに幅広く使用されている。また、最近では、 IngZmL以下の測定 感度を必要とする項目があることや使用する検体量の微量ィヒなどによりさらなる高感 度測定法が注目を浴び、化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescent enzyme imm unoassay： CLEIA)が普及し始めて 、る（例えば、特許文献 1および特許文献 2を参 照)。
[0003] 従来の酵素免疫測定法および化学発光酵素免疫測定法では、タンパク質などの 被測定物質に選択的に結合する特異抗体を、試験管や合成樹脂製の 96穴マイクロ プレートなどの容器、合成樹脂製ビーズまたはフェライトなどの磁気性担体や磁気担 体に固定して、被測定物質を液層中から選択的に取り出す方法が採られている。こ のような試験管やマイクロプレートなどの中で反応を行な 、液層中に現れた色調また は蛍光物質、発光物質を測定するものを液相型の測定法といい、試薬類の注入や 排水などの測定手順が煩雑であり、測定機器が大型になるという問題点を有している
[0004] 一方、非液相型の免疫測定法も開発されており、その代表例としてィムノクロマト法
(immunochromatography)がある。ィムノクロマト法は、被測定物質と標識抗体 (金コ口 イド粒子やカラーラテックスなどの可視的な物質で標識されて 、る）との免疫複合体 を、試験片上の線状に抗体を配置した部分で集中的に捕捉し、捕捉された免疫複合 体 (色付きのラインとして出現する）を目視または光学的に読み取ることで被測定物 質を測定する方法である（例えば、特許文献 3を参照)。ィムノクロマト法によれば、尿 や血液などの検体を検体注入部に入れて、出現したラインを観察するだけで被測定 物質のおおよその濃度を知ることができるので、操作が簡便である。ィムノクロマト法 の必要検体量は 100 L前後と比較的多いが、その測定感度は IngZmL前後であ る。
特許文献 1：特開平 3— 53897号公報
特許文献 2：特開 2001— 249079号公報
特許文献 3：特許第 3481894号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 前述の通り、化学発光酵素免疫測定法は、非常に高感度であり、微量タンパク質な どの測定に使用されている。し力しながら、従来の化学発光酵素免疫測定法には、 自動測定装置に適用すると、測定装置が大型かつ高価になってしまうという問題があ つた。すなわち、従来の化学発光酵素免疫測定法は、液相型の測定法のため、自動 測定装置に適用しょうとすると、検体および試薬の分注機構や BZF分離のための洗 浄機構などの煩雑な機構が必要となる。その結果、従来の化学発光酵素免疫測定 法を適用した測定装置は、大型かつ高価になってしまうのである。
[0006] そこで、本発明者は、液相型の化学発光酵素免疫測定法の特徴 (例えば、外部光 の影響をほとんど受けないことや高感度であること）と、非液相型のィムノクロマト法の 特徴 (例えば、 BZF分離のための洗浄工程が不要であること）とを併せ持つ免疫測 定法の開発を検討した。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は、非液相型のィムノクロマト法に化学発光の原理を応用することを検討 した。化学発光 (chemiluminescence)は、酵素の触媒作用などにより励起された分子 力 安定状態に戻るときにエネルギーとして光を放出する現象である。化学発光を利 用した測定法では、一般的に、酵素、化学発光基質および化学発光増強剤を溶液 中で混和して、溶液全体を発光させ、その発光量を測定する。特許文献 1や特許文 献 2などに記載されている化学発光酵素免疫測定法は、この液相型の化学発光反 応系を利用した免疫測定法である。
[0008] 本発明者は、ィムノクロマト法における抗体の標識物質を可視的な金コロイドでなく 化学発光基質に作用する酵素とすることで、非液相型の化学発光酵素免疫測定法 を開発することを検討した。研究の結果、試験片上で捕捉された免疫複合体 (酵素 標識抗体を含む)を化学発光により測定するために、化学発光基質の溶液や化学発 光増強剤の溶液を試験片上にアプライしても、生成した発光生成物は、免疫複合体 周辺に固定されずに拡散してしまうため、安定した測定対象物にならないことがわか つた o
[0009] 本発明者は、化学発光基質の溶液を試験片上に直接アプライするのではなぐ化 学発光基質を含む支持膜を試験片上に重ね合わせることで、支持膜上に安定して 発光生成物を残せることを見出し、本発明を完成させた。
[0010] また、本発明者は、化学発光増強剤を含む支持膜を試験片上に重ね合わせ、さら に化学発光基質を含む支持膜をその化学発光増強剤を含む支持膜の上に重ね合 わせることで、化学発光増強剤を必要とする反応系にお 、ても化学発光増強剤がな い場合と同様支持膜上に安定して発光生成物を残せることを見出し、本発明を完成 させた。
[0011] すなわち、本発明の第一は、以下に示される化学発光酵素免疫測定法に関する。
[1]化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体および被測定物質 を含む免疫複合体を支持体上に捕捉するステップと、前記免疫複合体の上に、前記 化学発光基質を含む支持膜を重ねるステップと、前記酵素標識抗体と前記化学発 光基質との反応により生ずる発光量を検出して、被測定物質の量を測定するステツ プとを含む、非液相型化学発光酵素免疫測定法。
[2]前記支持膜は透明または半透明である [1]に記載の非液相型化学発光酵素 免疫測定法。
[3]前記支持膜は、ァガロースゲル、ポリアクリノレアミドゲノレまたはセノレロースァセテ ート膜のいずれかである、 [2]に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。 [4]前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、 [1]〜[3]に記載の非液相型化 学発光酵素免疫測定法。
[5]前記免疫複合体の上に、化学発光増強剤を含む支持膜を重ねるステップをさ らに含む、 [1]〜[3]に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
[6]前記化学発光増強剤を含む支持膜は、前記免疫複合体と前記化学発光基質 を含む支持膜との間に置かれる、 [5]に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法
[7]前記被測定物質はタンパク質または化学物質を含む、 [1]〜[6]に記載の非 液相型化学発光酵素免疫測定法。
[8]前記測定するステップは、前記検出された発光量およびあらかじめ作成した検 量線から、前記被測定物質の濃度を定量するステップを含む、 [1]〜[7]に記載の 非液相型化学発光酵素免疫測定法。
本発明の第二は、以下に示される測定キットに関する。
[9]被測定物質を含む検体を注入する検体注入部、化学発光基質に作用する酵 素で標識された酵素標識抗体を含む標識抗体保持部、前記被測定物質および前記 酵素標識抗体を含む免疫複合体を捕捉する測定部、ならびに前記検体注入部、前 記標識抗体保持部および前記測定部を配置される支持体を有する試験片と、前記 化学発光基質を含む支持膜とを有する、非液相型化学発光酵素免疫測定法を用い る測定キット。
[10]前記試験片は、前記抗体または前記免疫複合体を捕捉する第二の測定部を 前記支持体上にさらに有する、 [9]に記載の測定キット。
[11]前記支持体は、ァガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースァセ テート膜のいずれかである、 [9]または [10]に記載の測定キット。
[12]前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、 [9]〜[11]に記載の測定キット
[13]化学発光増強剤を含む支持膜をさらに有する、 [9]〜[12]に記載の測定キッ 発明の効果 [0013] 本発明によれば、非液相型の化学発光酵素免疫測定法を用いるので、試薬の分 注や洗浄および攪拌などの煩雑な手順を踏むことなく被測定物質を高感度に測定 することができる。また、本発明によれば、上記煩雑な手順を必要としないので、小型 で低価格の測定装置を製造することができる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]本発明の実施の形態 1に係る測定キットの構成を示す模式図である。
[図 2]本発明の実施の形態 1に係る非液相型化学発光酵素免疫測定法の原理を示 す図である。
[図 3]本発明の実施の形態 2に係る測定キットの構成を示す模式図である。
[図 4]本発明の実施の形態 2に係る非液相型化学発光酵素免疫測定法の原理を示 す図である。
[図 5]本発明の非液相型化学発光酵素免疫測定法により、多項目同時測定を行う測 定装置の例を示す図である。
[図 6]実施例 1の結果を示すグラフである。
[図 7]実施例 2の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明の非液相型化学発光酵素免疫測定法では、化学発光基質を触媒する酵素 で標識された抗体を用い、その酵素標識抗体と化学発光基質とを支持膜上で反応さ せることを特徴とする。これにより、反応生成物を支持膜上に留めおくことができる。 本明細書にぉ ヽて、容器内で試薬溶液を反応させて化学発光を発生させる反応 系を「液相型の反応系」といい、液相型の反応系を用いる従来の化学発光酵素免疫 測定法を「液相型化学発光酵素免疫測定法」という。また、本発明者は、溶液層のな Vヽ支持体上の酵素標識抗体の上に化学発光基質を含む支持膜を重ね、支持膜上 で化学発光を発生させる反応系を「非液相型の反応系」と規定し、非液相型の反応 系を用いる本発明の化学発光酵素免疫測定法を「非液相型化学発光酵素免疫測定 法」と規定した。本発明の化学発光酵素免疫測定法 (すなわち、非液相型化学発光 酵素免疫測定法)は、試験管やマイクロプレートなどの容器を使用しなくても化学発 光を発生させ安定してそれを保持することができる。 [0016] 本発明の化学発光酵素免疫測定法は、非液相型の反応系を用いてタンパク質や 化学物質などの被測定物質を測定する。本明細書において「測定する」とは、被測定 物質の濃度 (量)を測定するだけではなぐ被測定物質の有無を検出することを含む
[0017] 本発明の化学発光酵素免疫測定法は、反応生成物を支持体上に拡散させずに支 持膜上にとどめることができるため、被測定物質を安定して測定することができる。ま た、本発明の化学発光酵素免疫測定法は、液相型の化学発光酵素免疫測定法のよ うに洗浄工程を必要としな ヽので、緩衝溶液などの溶液を交換する手順が不要であ り、簡便な手順で行うことができる。
[0018] 以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。
[0019] (実施の形態 1)
図 1は、本発明の実施の形態 1に係る測定キットの構成を示す図である。
[0020] 図 1において、測定キット 100は、試験片 200、化学発光基質支持膜 300およびィ匕 学発光増強剤支持膜 400を有する。
[0021] 試験片 200は、支持体 210、検体注入部 220、標識抗体保持部 230、第一の測定 部 240、第二の測定部 250および吸収部 260を有する。検体注入部 220、標識抗体 保持部 230、第一の測定部 240、第二の測定部 250および吸収部 260は、支持体 2 10上に形成されており、この順番に配置されることが好ましい。
[0022] 支持体 210は、被検検体を毛細管現象により展開するための膜 210— 1を含み、 膜 210— 1の例には、ニトロセルロース膜もしくはナイロン膜が挙げられる。支持体 21 0は、強度を確保するため、膜 210— 1を貼り付けたサポート板 210— 2をさらに有し ていることが好ましい。サポート板 210— 2の例には、板ガラスまたは合成樹脂板など が挙げられる。支持体 210に、溶液層がある必要はない。したがって、支持体に槽が 形成されて 、る必要もな 、。
[0023] 検体注入部 220は、被検検体をアプライする箇所であり、例えばレーヨンの不織布 や濾紙、綿布 (脱脂綿)などで構成される。検体注入部 220は、標識抗体保持部 230 に接触して 、ることが好まし!/、。
[0024] 標識抗体保持部 230は、酵素標識抗体 232ならびに第一の測定部 240および第 二の測定部 250に結合する物質で標識された抗体 (以下「測定部結合物質標識抗 体」という） 234を移動可能な状態で含む部材であり、例えばグラスファイバーの不織 布などである。標識抗体保持部 230に含まれる酵素標識抗体 232および測定部結 合物質標識抗体 234は、試験片の保存を容易にするため、乾燥していることが好ま しい。
[0025] 酵素標識抗体 232は、化学発光反応を触媒する酵素で標識されて!ヽる、被測定物 質に結合する抗体である。酵素標識抗体 232は、被測定物質に直接結合する一次 抗体でもよ!/、し、他の抗体を介して被測定物質に結合する二次抗体や三次抗体など でもよい。
[0026] 酵素標識抗体 232を標識する酵素は、化学発光基質支持膜 300に含まれる化学 発光基質に応じて適宜選択すればよぐ例えば、アルカリフォスファターゼ (alkaline p hosphatase :以下「ALP」と略記する）や、ルシフェラーゼ、西洋ヮサビペルォキシダ ーゼ（Horseradish peroxidase：以下「HRP」と略記する）などである。
[0027] 測定部結合物質標識抗体 234は、第一の測定部 240および第二の測定部 250に 結合する物質で標識されている、被測定物質に結合する抗体である。例えば、第一 の測定部 240および第二の測定部 250にピオチン特異的結合タンパク質であるアビ ジンまたはストレプトアビジンが固定されて 、る場合、測定部結合物質標識抗体 234 は、ピオチンで標識された、被測定物質に結合する抗体である。
[0028] 標識抗体保持部 230では、検体注入部 220から移動してきた被検検体に含まれる 被測定物質、酵素標識抗体 232および測定部結合物質標識抗体 234が結合し、免 疫複合体が形成される。
[0029] 第一の測定部 240は、標識抗体保持部 230で形成された免疫複合体を捕捉する、 バンド状またはドット状の部位である。第一の測定部 240には、測定部結合物質標識 抗体 234に結合できる物質 242が固定されていることが好ましい。例えば、測定部結 合物質標識抗体がピオチンで標識された抗体の場合、第一の測定部 240にはアビ ジンまたはストレプトアビジンが固定されていることが好ましい。第一の測定部 240は 、被測定物質に結合した測定部結合物質標識抗体 234に結合して、免疫複合体を 捕捉する。 [0030] 第二の測定部 250は、第一の測定部 240で捕捉されな力つた免疫複合体を捕捉 する、バンド状またはドット状の部位である。第二の測定部 250は、第一の測定部 24 0と同様に、測定部結合物質標識抗体に結合できる物質 252が固定されており、被 測定物質に結合した測定部結合物質標識抗体 234に結合して、免疫複合体を捕捉 する。
[0031] 吸収部 260は、被検検体に含まれる液体 (通常は水）を吸収する箇所であり、例え ば濾紙などで構成される。
[0032] 化学発光基質支持膜 300は、化学発光基質を含む、乾式または湿式の支持膜で ある。化学発光基質支持膜 300は、酵素標識抗体 232を標識する酵素と化学発光 基質との反応による発光を測定する観点から、透明または半透明のものであることが 好ましぐ例えばァガロースゲルやポリアクリルアミドゲル、セルロースアセテート膜な どである。ァガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどのゲルを用いる場合、これらの ゲルは、ゲルサポート用の透明なポリエステルフィルムやポリエチレンフィルムなどに 固定されることが好ましい。例えば、ァガロースゲルについては Gel Bond Film (Camb rex社）、ポリアクリルアミドゲルにつ!ヽては Gel Bond PAG Film (Cambrex社）などがあ る。
[0033] 化学発光基質支持膜 300に含まれる化学発光基質は、酵素標識抗体 232を標識 する酵素に応じて適宜選択すればよい。例えば、酵素標識抗体 232を標識する酵素 が ALPの場合には、 CDP - Starや CSPD (ロシュ ·ダイァグノスティックス社）などの ジォキセタン系化合物などを化学発光基質として選択すればよい。また、酵素標識 抗体 232を標識する酵素がルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン（同仁ィ匕学研究 所など)などを化学発光基質として選択すればよい。また、酵素標識抗体 232を標識 する酵素が HRPの場合には、ルミノール (ピアス社など)などをィ匕学発光基質として 選択すればよい。
[0034] 化学発光基質支持膜 300に化学発光基質を含ませるには、例えばァガロースゲル やポリアクリルアミドゲルなどの場合、ゲルを製造するための組成物に化学発光基質 を加えて、前記組成物を固ィ匕もしくは重合させればよい。また、セルロースアセテート 膜の場合、セルロースアセテート膜に化学発光基質を含浸させた後、余分な化学発 光基質を除去すればよい。
[0035] 化学発光増強剤支持膜 400は、化学発光増強剤を含む、乾式または湿式の支持 膜である。化学発光増強剤支持膜 400は、例えばァガロースゲルやポリアクリルアミ ドゲル、セルロースアセテート膜、濾紙などである。
[0036] 化学発光増強剤支持膜 400に含まれる化学発光増強剤は、化学発光の反応系に 応じて適宜選択すればよい。例えば、酵素標識抗体 232を標識する酵素が ALPの 場合には、ミリスチルトリメチルアンモ -ゥムブロマイドやセチルトリメチルアンモ -ゥム ブロマイド、ポリビュルべンジルベンジルジメチルアンモ -ゥムクロライド、ポリビュル ベンジルトリブチルアンモ -ゥムクロライドなどの 4級アンモ-ゥム基を含む水溶性ポリ マーまたは-トロブロック（トロピックス社)などをィ匕学発光増強剤として選択すればよ い。また、酵素標識抗体 232を標識する酵素がルシフェラーゼの場合には、 ATPな どをィ匕学発光増強剤として選択すればよい。また、酵素標識抗体 232を標識する酵 素が HRPの場合には、フエノールなどをィ匕学発光増強剤として選択すればよ!、。
[0037] 化学発光増強剤支持膜 400に化学発光増強剤を含ませるには、例えばァガロース ゲルやポリアクリルアミドゲルなどの場合、ゲルを製造するための組成物に化学発光 増強剤を加えて、前記組成物を固ィ匕もしくは重合させればよい。また、セルロースァ セテート膜や濾紙などの場合、セルロースアセテート膜または濾紙に化学発光増強 剤を含浸させた後、余分な化学発光増強剤を除去すればょ 、。
[0038] なお、化学発光の反応系によっては、化学発光増強剤を必要としな!ヽ場合がある。
この場合、化学発光増強剤支持膜 400は不要である。また、化学発光基質を含む支 持膜 (化学発光基質支持膜 300)と化学発光増強剤を含む支持膜 (化学発光増強剤 支持膜 400)とを別個のものとして説明したが、一つの支持膜に化学発光基質および 化学発光増強剤を含むようにしてもよい。この場合、化学発光基質および化学発光 増強剤を含む支持膜は、例えばァガロースゲルやポリアクリルアミドゲル、セルロース アセテート膜、濾紙などである。化学発光基質と化学発光増強剤との比率は適宜調 整すればよぐ例えばィ匕学発光基質:ィ匕学発光増強剤 = 1 : 10とすればよい。
[0039] 次に、図 2の模式図を参照しながら、実施の形態 1の測定キットで被測定物質を測 定する原理を説明する。図 2では、被検検体の溶媒を、説明の便宜上図示しない。 [0040] 被測定物質 500を含む被検検体を検体注入部 220にアプライすると（図 2A)、被 検検体は、毛細管現象により標識抗体保持部 230および膜 210— 1表面を通り、吸 収部 260まで移動する。このとき、標識抗体保持部 230では、被検検体に含まれる被 測定物質 500、酵素標識抗体 232および測定部結合物質標識抗体 234が結合し、 免疫複合体 510が形成される。
[0041] 形成された免疫複合体 510は、膜 210—1表面を吸収部 260に向けて移動する。
免疫複合体 510に含まれる測定部結合物質標識抗体 234は第一の測定部 240に 結合するため、免疫複合体 510の多くは第一の測定部 240で捕捉される（図 2B)。 残りの免疫複合体 510は、膜 210—1表面を吸収部 260に向けてさらに移動し、第二 の測定部 250で捕捉される（図 2B)。
[0042] 第一の測定部 240および第二の測定部 250の上に化学発光増強剤支持膜 400を 重ね合わせ、さらにその上に化学発光基質支持膜 300を重ね合わせると、酵素標識 抗体 232を標識する酵素が化学発光基質支持膜 300に含まれる基質に作用して、 第一の測定部 240および第二の測定部 250でィ匕学発光が生じる（図 2C)。これらの 化学発光を冷却 CCDカメラや光電子倍増管などの光学的手段で検出することで、 被検検体に含まれる被測定物質 500を測定することができる。このとき、第一の測定 部 240の発光量と第二の測定部 250の発光量とを比較することにより、反応系の状 態 (例えば、プロゾーン現象の有無）を調べることができる。また、第一の測定部 240 の発光量をあら力じめ作成した検量線に当てはめることにより、被検検体中の被測定 物質 500の濃度（量)を測定することができる。
[0043] 以上説明したように、本実施の形態に係る化学発光酵素免疫測定法および測定キ ットでは、化学発光基質およびィ匕学発光増強剤を溶液ではなく支持膜に含ませた状 態で、酵素標識抗体を含む免疫複合体を捕捉した第一の測定部および第二の測定 部の上に供給する。これにより、本実施の形態に係る化学発光酵素免疫測定法およ び測定キットは、高感度な化学発光酵素免疫測定法を簡便な非液相型の反応系を 用いて実現することができる。
[0044] (実施の形態 2)
実施の形態 1では、標識抗体保持部で被測定物質に測定部結合物質標識抗体を 結合させて、第一の測定部および第二の測定部で免疫複合体を捕捉する例を示し た。実施の形態 2では、第一の測定部および第二の測定部に被測定物質に結合す る抗体をあらかじめ固定して、第一の測定部および第二の測定部で免疫複合体を捕 捉する例を示す。
[0045] 図 3は、本発明の実施の形態 2に係る測定キットの構成を示す図である。実施の形 態 1に係る測定キットと同じ構成要素については同一の符号を付し、重複箇所の説 明を省略する。
[0046] 図 3において、測定キット 110は、試験片 202、化学発光基質支持膜 300およびィ匕 学発光増強剤支持膜 400を有する。化学発光基質支持膜 300および化学発光増強 剤支持膜 400は、実施の形態 1と同様のものである。
[0047] 試験片 202は、支持体 210、検体注入部 220、標識抗体保持部 236、第一の測定 部 244、第二の測定部 254および吸収部 260を有する。支持体 210、検体注入部 2 20および吸収部 260は、実施の形態 1と同様のものである。
[0048] 標識抗体保持部 236は、酵素標識抗体 232を移動可能な状態で含む部材である 。標識抗体保持部 236に含まれる酵素標識抗体 232は、実施の形態 1の酵素標識 抗体と同様のものであり、乾燥していることが好ましい。標識抗体保持部 236では、 被検検体に含まれる被測定物質および酵素標識抗体 232が結合し、免疫複合体が 形成される。
[0049] 第一の測定部 244は、実施の形態 1の第一の測定部と同様に、標識抗体保持部 2 36で形成された免疫複合体を捕捉する、バンド状またはドット状の部位である。第一 の測定部 240には、被測定物質に結合する捕捉抗体 246が固定されている。第一の 測定部 244は、免疫複合体に含まれる被測定物質に結合して、免疫複合体を捕捉 する。
[0050] 第二の測定部 254は、実施の形態 1の第二の測定部と同様に、第一の測定部 244 で捕捉されな力つた免疫複合体を捕捉する、バンド状またはドット状の部位である。 第二の測定部 254には、第一の測定部 244と同様に、被測定物質に結合する捕捉 抗体 256が固定されており、免疫複合体に含まれる被測定物質に結合して、免疫複 合体を捕捉する [0051] 次に、図 4の模式図を参照しながら、実施の形態 2の測定キットで被測定物質を測 定する原理を説明する。図 4では、被検検体の溶媒を、説明の便宜上図示しない。
[0052] 被測定物質 500を含む被検検体を検体注入部 220にアプライすると（図 4A)、被 検検体は、毛細管現象により標識抗体保持部 236および膜 210— 1表面を通り、吸 収部 260まで移動する。このとき、標識抗体保持部 236では、被検検体に含まれる被 測定物質 500および酵素標識抗体 232が結合し、免疫複合体 510が形成される。
[0053] 形成された免疫複合体 510は、膜 210—1表面を吸収部 260に向けて移動する。
第一の測定部 244に固定された捕捉抗体 246は免疫複合体 510に結合するため、 免疫複合体 510の多くは第一の測定部 244で捕捉される（図 4B)。残りの免疫複合 体 510は、膜 210— 1表面を吸収部 260に向けてさらに移動し、第二の測定部 254 で捕捉される（図 4B)。
[0054] 第一の測定部 244および第二の測定部 254の上に化学発光増強剤支持膜 400を 重ね合わせ、さらにその上に化学発光基質支持膜 300を重ね合わせると、酵素標識 抗体 232を標識する酵素が化学発光基質支持膜 300に含まれる基質に作用して、 第一の測定部 244および第二の測定部 254でィ匕学発光が生じる（図 4C)。これらの 化学発光を冷却 CCDカメラや光電子倍増管などの光学的手段で検出することで、 被検検体に含まれる被測定物質 500を測定することができる。このとき、第一の測定 部 244の発光量と第二の測定部 254の発光量とを比較することにより、反応系の状 態 (例えば、プロゾーン現象の有無）を調べることができる。また、第一の測定部 244 の発光量をあら力じめ作成した検量線に当てはめることにより、被検検体中の被測定 物質 500の濃度（量)を測定することができる。
[0055] 以上説明したように、本実施の形態に係る測定キットは、第一の測定部および第二 の測定部にあらかじめ捕捉抗体を固定して、第一の測定部および第二の測定部で 免疫複合体を捕捉する。本実施の形態によれば、実施の形態 1と同様の効果を得る ことができる。
[0056] なお、実施の形態 1および実施の形態 2では、第一の測定部および第二の測定部 を設ける態様を示した力 測定部の数はこれに限定されず、 1つまたは 3つ以上であ つてもよい。 [0057] また、実施の形態 2では、第二の測定部に固定される捕捉抗体を被測定物質に結 合する抗体としたが、第二の測定部に固定される捕捉抗体を酵素標識抗体に結合 する抗体としてもよい。この場合、第一の測定部の上で化学発光が生じれば、被検検 体に被測定物質が含まれていることがわかる。ただし、第一の測定部の上で化学発 光が生じても、第二の測定部の上で化学発光が生じなければ、反応系が正常に動い ていない可能性がある。また、第一の測定部の上で化学発光が生じなければ、被検 検体に被測定物質が含まれていないことがわかる。ただし、第一の測定部だけでなく 第二の測定部の上でも化学発光が生じなければ、反応系が正常に動いていない可 能性があるので、被検検体に被測定物質が含まれて 、な 、と判断するべきではな ヽ ことがわ力ゝる。
[0058] (実施の形態 3)
実施の形態 1および実施の形態 2では、一の試験片を使用して一種類の被測定物 質を測定する例を示した。実施の形態 3では、複数種の試験片を同時に使用して、 複数種の被測定物質を 1回のサンプリングで測定する例を示す。
[0059] 図 5は、本発明の実施の形態 3に係る測定装置の構成を示す模式図である。
[0060] 図 5において、測定装置 600は、複数の試験片 610a〜610d、中心検体注入部 62 0、化学発光増強剤支持膜格納部 630、化学発光基質支持膜格納部 640、支持台 6 50および検出部 660を有する。
[0061] 試験片 610a〜610dは、実施の形態 1または実施の形態 2の試験片と同様のもの である。各試験片は、それぞれ異なる試験項目に対応しており、それぞれ異なる被測 定物質を測定する。例えば、試験片 610aをミオグロビンに対応するものとし、試験片 610bをトロポニン Tに対応するものとし、試験片 610cをトロポニン Iに対応するものと し、試験片 610dを CK— MBに対応するものとすることで、 1回の少ないサンプリング で心筋梗塞マーカーと呼ばれる 4項目を一度に測定することができる。このため心筋 梗塞の病態解析をより早くすることができるため、治療法の選択、予後の判定に欠か せないものとなる。
[0062] 中心検体注入部 620は、被検検体をアプライする箇所であり、例えばレーヨンの不 織布や濾紙、綿布 (脱脂綿)などで構成される。中心検体注入部 620は、各試験片 6 10a〜610dの共通の検体注入部である。
[0063] 化学発光増強剤支持膜格納部 630は、各試験片 610a〜610dに重ね合わせる化 学発光増強剤支持膜を格納して 、る容器である。
[0064] 化学発光基質支持膜格納部 640は、各試験片 610a〜610dに重ね合わせる化学 発光基質支持膜を格納して ヽる容器である。
[0065] 支持台 650は、各試験片 610a〜610dを同一平面状に放射状に配置する円板状 の部材である。支持台 650は、回転可能に設けられている。
[0066] 検出部 660は、各試験片 610a〜610d上で生じる化学発光の発光量を検出する。
検出部 660は、例えば冷却 CCDカメラである。
[0067] 次に、上記測定装置が、一の被検検体から複数種の被測定物質を測定する動作 を説明する。
[0068] 支持台 650上に各試験片 610a〜610dを配置して、中心検体注入部 620に被検 検体をアプライすると、各試験片 610a〜610d上で免疫複合体が形成され、形成さ れた免疫複合体は第一の測定部および第二の測定部で捕捉される。化学発光増強 剤支持膜格納部 630およびィ匕学発光基質支持膜格納部 640が、化学発光増強剤 支持膜およびィ匕学発光基質支持膜を各試験片 610a〜610d上に重ね合わせた後、 検出部 660は、支持台 650を回転させながら、経時的に各試験片 610a〜610dの 発光量を検出する。検出結果は、出力部（図示せず）によりプリントアウトされる。この とき、出力部は、発光量の検出結果ではなぐ検出結果力 算出した各被測定物質 の濃度をプリントアウトしてもよ 、。
[0069] 以上説明したように、実施の形態 3に係る測定装置は、複数種の試験片を使用して 複数種の被測定物質を測定する。本実施の形態によれば、実施の形態 1の効果に カロえて、 1回のサンプリングで複数項目について同時に測定することができる。例え ば、本実施の形態によれば、 50 Lの被検検体で 5〜10項目について同時に測定 することができる。
[0070] 以下、本発明を実施例を参照してさらに説明する。なお、本発明の範囲は、本実施 例により限定して解釈されな ヽ。
実施例 1 [0071] 実施例 1では、実施の形態 1の態様の測定キットを用いて、前立腺特異抗原 (prost ate-specific antigen：以下「PSA」と略記する）を測定した例を示す。
[0072] (1)測定キット
本実施例では、支持体として-トロセルロース膜（縦 25mm X横 5mm X厚さ 0.2m m)を使用し、検体注入部として濾紙 (縦 20mm X横 5mm X厚さ lmm)を使用し、標 識抗体保持部としてグラスファイバー（縦 7mm X横 5mm X厚さ 0.8mm)を使用し、 吸収部として濾紙 (縦 18mm X横 5mm X厚さ lmm)を使用した。検体注入部と標識 抗体保持部は接触させ、標識抗体保持部と第一の測定部との間隔を 6mmとし、第 一の測定部と第二の測定部との間隔を 4mmとし、第二の測定部と吸収部との間隔を 8mmとした。第一の測定部および第二の測定部には、ストレプトアビジン (和光純薬 工業社)を固定した。酵素標識抗体として ALP標識抗ヒト PSAマウスモノクローナル 抗体 (シバヤギ社)を使用し、測定部結合物質標識抗体としてピオチン標識抗ヒト PS Aマウスモノクローナル抗体（自社製)を使用した。化学発光基質支持膜として CDP - Star (0.25mM：ロシュ ·ダイァグノスティックス社）を含浸させたセルロースァセテ ート膜 (縦 2mm X横 7mm X厚さ 0. lmm)を使用し、化学発光増強剤支持膜として ニトロブロック Π (10% (v/v)：トロピックス社)を含浸させたセルロースアセテート膜 (縦 1.5mm X横 7mm X厚さ 0. lmm)を使用した。
[0073] (2)被検検体
本実施例では、 PSAを測定対象とした。 PBSで PS A (International Immunology Co rporation dlC社））の希釈系列（0, 0.001, O.lOOngZmL)を作製して、被検検体と した。
[0074] (3)測定
(2)で用意した各濃度の被検検体 (20 IX L)をそれぞれ異なる試験片の検体注入 部に滴下した。滴下して 5分後に、試験片の第一の測定部および第二の測定部の上 に、化学発光増強剤支持膜を重ね合わせ、さらに化学発光基質支持膜を重ね合わ せた。その後、冷却 CCDカメラ（浜松ホトニタス社: C4742— 95)を用いて、第一の 測定部および第二の測定部における発光量を 10秒ごとに 2時間測定した。
[0075] (4)結果 図 6は、測定した発光量の経時変化を示すグラフである。 PSAの濃度が OngZmL の場合、発光量の変化はほとんど観察されなカゝつた。一方、 PSAが存在する場合 (0 .001, O.lOOngZmL)、発光量は時間の経過と共に上昇し、ある程度時間が経過 すると飽和して一定値に達した。また、 PSAの濃度が高いほど、より強い発光量が観 察された。この結果から、任意の時間における発光量の変化率を算出して、 PSAの 濃度と発光量の関係を示す検量線を作成することができる。このように、本発明の化 学発光酵素免疫測定法は、少量の被検検体で高感度 (O.OOlngZmL以下）に被 測定物質を測定できることがわかる。
実施例 2
[0076] 実施例 2では、実施の形態 2の態様の測定キットを用いて、肝がんマーカーである アルファフエトプロテイン（alpha-fetoprotein：以下「AFP」と略記する）を測定した例を 示す。
[0077] (1)測定キット
本実施例では、支持体として-トロセルロース膜（縦 25mm X横 5mm X厚さ 0.2m m)を使用し、検体注入部として濾紙 (縦 20mm X横 5mm X厚さ lmm)を使用し、標 識抗体保持部としてグラスファイバー（縦 7mm X横 5mm X厚さ 0.8mm)を使用し、 吸収部として濾紙 (縦 18mm X横 5mm X厚さ lmm)を使用した。検体注入部と標識 抗体保持部は接触させ、標識抗体保持部と第一の測定部との間隔を 6mmとし、第 一の測定部と第二の測定部との間隔を 4mmとし、第二の測定部と吸収部との間隔を 8mmとした。第一の測定部および第二の測定部には、抗ヒト AFPマウスモノクローナ ル抗体 (IIC社)を固定した。酵素標識抗体として ALP標識抗ヒト AFPマウスモノクロ ーナル抗体 (シバヤギ社)を使用した。化学発光基質支持膜として CDP— Star (0.2 5mM :ロシュ'ダイァグノスティックス社）を含浸させたセルロースアセテート膜（縦 2m m X横 7mm X厚さ 0. lmm)を使用し、化学発光増強剤支持膜として-トロブロック II (10% (v/v)：トロピックス社)を含浸させたセルロースアセテート膜 (縦 1.5mm X横 7 mm X厚さ 0. lmm)を使用した。
[0078] (2)被検検体
本実施例では、 AFPを測定対象とした。 PBSで AFP dlC社)の希釈系列（0, 0.01 0, 0.100, l.OOOngZmUを作製して、被検検体とした。
[0079] (3)測定
(2)で用意した各濃度の被検検体 (20 IX L)をそれぞれ異なる試験片の検体注入 部に滴下した。滴下して 5分後に、試験片の第一の測定部および第二の測定部の上 に、化学発光増強剤支持膜を重ね合わせ、さらに化学発光基質支持膜を重ね合わ せた。その後、冷却 CCDカメラ（浜松ホトニタス社: C4742— 95)を用いて、第一の 測定部および第二の測定部における発光量を 10秒ごとに 2時間測定した。
[0080] (4)結果
図 7は、測定した発光量の経時変化を示すグラフである。 AFPの濃度が OngZmL の場合、発光量の変化はほとんど観察されなカゝつた。一方、 AFPが存在する場合 (0 .010〜1.000ngZmL)、発光量は時間の経過と共に上昇し、ある程度時間が経過 すると飽和して一定値に達した。また、 AFPの濃度が高いほど、より強い発光量が観 察された。この結果から、任意の時間における発光量の変化率を算出して、 AFPの 濃度と発光量の関係を示す検量線を作成することができる。このように、本発明の化 学発光酵素免疫測定法は、少量の被検検体で高感度 (O.OlOngZmL以下）に被 測定物質を測定できることがわかる。
[0081] 本願は、 2005年 10月 31日出願の特願 2005— 342785に基づく優先権を主張す る。当該出願明細書に記載された内容はすべて、本願明細書に援用される。
産業上の利用可能性
[0082] 本発明の化学発光酵素免疫測定法は、高感度な化学発光酵素免疫測定法を簡 便な非液相型の反応系を用いて行うので、試薬の分注回数が少なくかつ小型のべッ ドサイド検査法として有用である。また、本発明の測定キットは、従来のィムノクロマト 法に比べて 100〜： LOOO倍高感度であるため、試験片を超小型に作製することがで き、かつ抗体およびィ匕学発光基質の使用量を少なくすることができる。また高感度測 定の点力も使用する検体 (抗原)をあらかじめ希釈して使用できるので、結局患者か ら採血する血液量が例えば 10 Lとしても 10倍希釈することで、同時にいくつかの 項目を同時に測定できる。さらに、本発明の化学発光酵素免疫測定法は、煩雑な手 順を必要としないので、小型で低価格の測定装置に適用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体および被測定物質を含 む免疫複合体を溶液層のない支持体上に捕捉するステップと、
前記免疫複合体の上に、前記化学発光基質を含む支持膜を重ねるステップと、 前記酵素標識抗体と前記化学発光基質との反応により生ずる発光量を検出するこ とにより、被測定物質の量を測定するステップと、
を含む、非液相型化学発光酵素免疫測定法。
[2] 前記支持膜は透明または半透明である、請求項 1記載の非液相型化学発光酵素 免疫測定法。
[3] 前記支持膜は、ァガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート 膜の ヽずれかである、請求項 2記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
[4] 前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、請求項 1記載の非液相型化学発光 酵素免疫測定法。
[5] 前記免疫複合体の上に、化学発光増強剤を含む支持膜を重ねるステップをさらに 含む、請求項 1記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
[6] 前記化学発光増強剤を含む支持膜は、前記免疫複合体と前記化学発光基質を含 む支持膜との間に置かれる、請求項 5記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
[7] 前記被測定物質はタンパク質または化学物質を含む、請求項 1記載の非液相型化 学発光酵素免疫測定法。
[8] 前記測定するステップは、前記検出された発光量およびあらかじめ作成した検量線 から、前記被測定物質の濃度を定量するステップを含む、請求項 1記載の非液相型 化学発光酵素免疫測定法。
[9] 被測定物質を含む検体を注入される検体注入部、化学発光基質に作用する酵素 で標識された酵素標識抗体を含む標識抗体保持部、前記被測定物質および前記酵 素標識抗体を含む免疫複合体を捕捉する測定部、ならびに前記検体注入部、前記 標識抗体保持部および前記測定部を配置される支持体を有する試験片と、 前記化学発光基質を含む支持膜と、
を有する、非液相型化学発光酵素免疫測定法を用いる測定キット。
[10] 前記試験片は、前記酵素標識抗体または前記免疫複合体を捕捉する第二の測定 部を前記支持体上にさらに有する、請求項 9記載の測定キット。
[11] 前記支持膜は、ァガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート 膜の 、ずれかである、請求項 9記載の測定キット。
[12] 前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、請求項 9記載の測定キット。
[13] 化学発光増強剤を含む支持膜をさらに有する、請求項 9記載の測定キット。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009270923A (ja) * 2008-05-07 2009-11-19 Seiko Epson Corp 生体物質検出方法
US8137986B2 (en) 2005-10-31 2012-03-20 National University Corporation Hokkaido University Non-liquid phase type chemiluminescent enzyme immunoassay method and assay kit
JP2012529645A (ja) * 2009-06-12 2012-11-22 スーパーノヴァ・ダイアグノスティクス、インコーポレイティド 固相をベースとする生物学的検定におけるシグナル可読性の改善のためのシグナル生成とシグナル局在化の方法
JP5621846B2 (ja) * 2010-06-21 2014-11-12 コニカミノルタ株式会社 蛍光測定方法
WO2016163494A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 株式会社パートナーファーム 固相反応チップ及びこれを用いた測定方法
JP6976621B1 (ja) * 2021-02-04 2021-12-08 株式会社Icst 検査器具、検査キットおよび検査方法
JP2022119706A (ja) * 2021-02-04 2022-08-17 株式会社Icst 検査器具、検査キットおよび検査方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008006086A1 (de) * 2008-01-25 2009-09-03 Evonik Goldschmidt Gmbh Biomimetische Modellsysteme zur Nachstellung von Spreitungsphänomenen kosmetischer und pharmazeutischer Formulierungen auf menschlicher Haut
CN103874924B (zh) 2011-10-06 2016-01-06 认智生物 通过一次的试样注入就能够依次改变反应条件的膜传感器
CN110412265B (zh) * 2012-11-15 2023-04-11 奥索临床诊断有限公司 使用反应时间的校准分析
CN103513036B (zh) * 2013-07-29 2016-01-20 徐静 沙门氏菌的cleia检测试剂盒及检测方法
CN104330553B (zh) * 2014-11-20 2016-03-09 扬州大学 一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法
US10191044B2 (en) * 2017-01-04 2019-01-29 David R. Hall Flushable test strip
KR102015360B1 (ko) * 2017-01-10 2019-08-28 광주과학기술원 측방 유동 분석에서의 신호 증폭 키트 및 그의 제작 방법

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61247965A (ja) * 1985-04-25 1986-11-05 Susumu Kogyo Kk 酵素免疫測定法
JPH0238971A (ja) * 1988-07-29 1990-02-08 Nitto Denko Corp 酸素免疫測定法用試薬及びこれを用いる酵素免疫測定法
JPH0353897A (ja) 1989-06-27 1991-03-07 Tropix Inc エンハンサーを用いる化学発光測定法
JPH03503928A (ja) * 1988-01-21 1991-08-29 ボーリンガー・マンハイム・コーポレイション 液体サンプル中の分析物の定量測定装置および定量測定方法
JPH04303769A (ja) * 1991-03-30 1992-10-27 Konica Corp 免疫学的測定装置及び測定方法
JPH10185921A (ja) * 1996-12-25 1998-07-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 免疫学的定量装置
JP2001249079A (ja) 1999-12-28 2001-09-14 Fujirebio Inc 発光量調節剤を用いた化学発光測定方法及び酵素免疫測定方法
WO2003014740A1 (fr) * 2001-08-09 2003-02-20 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biocapteurs et procede de mesure
JP3481894B2 (ja) 1999-09-10 2003-12-22 株式会社常光 免疫学的クロマト方式を利用した測定方法
JP2005061910A (ja) * 2003-08-08 2005-03-10 Fujirebio Inc Ｈｉｖ抗原抗体測定用免疫測定器具及び測定方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8526741D0 (en) 1985-10-30 1985-12-04 Boots Celltech Diagnostics Binding assay device
US6306642B1 (en) * 1997-11-24 2001-10-23 Quidel Corporation Enzyme substrate delivery and product registration in one step enzyme immunoassays
US6670115B1 (en) * 1999-11-24 2003-12-30 Biotronic Technologies, Inc. Devices and methods for detecting analytes using electrosensor having capture reagent
US20040259182A1 (en) * 2003-06-17 2004-12-23 Brooks Edwards Arrays for chemiluminescent assays, methods of making the arrays and methods of detecting chemiluminescent emissions on solid supports
WO2007052613A1 (ja) 2005-10-31 2007-05-10 National University Corporation Hokkaido University 非液相型化学発光酵素免疫測定法および測定キット

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61247965A (ja) * 1985-04-25 1986-11-05 Susumu Kogyo Kk 酵素免疫測定法
JPH03503928A (ja) * 1988-01-21 1991-08-29 ボーリンガー・マンハイム・コーポレイション 液体サンプル中の分析物の定量測定装置および定量測定方法
JPH0238971A (ja) * 1988-07-29 1990-02-08 Nitto Denko Corp 酸素免疫測定法用試薬及びこれを用いる酵素免疫測定法
JPH0353897A (ja) 1989-06-27 1991-03-07 Tropix Inc エンハンサーを用いる化学発光測定法
JPH04303769A (ja) * 1991-03-30 1992-10-27 Konica Corp 免疫学的測定装置及び測定方法
JPH10185921A (ja) * 1996-12-25 1998-07-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 免疫学的定量装置
JP3481894B2 (ja) 1999-09-10 2003-12-22 株式会社常光 免疫学的クロマト方式を利用した測定方法
JP2001249079A (ja) 1999-12-28 2001-09-14 Fujirebio Inc 発光量調節剤を用いた化学発光測定方法及び酵素免疫測定方法
WO2003014740A1 (fr) * 2001-08-09 2003-02-20 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biocapteurs et procede de mesure
JP2005061910A (ja) * 2003-08-08 2005-03-10 Fujirebio Inc Ｈｉｖ抗原抗体測定用免疫測定器具及び測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1965212A4

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8137986B2 (en) 2005-10-31 2012-03-20 National University Corporation Hokkaido University Non-liquid phase type chemiluminescent enzyme immunoassay method and assay kit
JP2009270923A (ja) * 2008-05-07 2009-11-19 Seiko Epson Corp 生体物質検出方法
JP2012529645A (ja) * 2009-06-12 2012-11-22 スーパーノヴァ・ダイアグノスティクス、インコーポレイティド 固相をベースとする生物学的検定におけるシグナル可読性の改善のためのシグナル生成とシグナル局在化の方法
JP5621846B2 (ja) * 2010-06-21 2014-11-12 コニカミノルタ株式会社 蛍光測定方法
WO2016163494A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 株式会社パートナーファーム 固相反応チップ及びこれを用いた測定方法
JP6976621B1 (ja) * 2021-02-04 2021-12-08 株式会社Icst 検査器具、検査キットおよび検査方法
JP2022119435A (ja) * 2021-02-04 2022-08-17 株式会社Icst 検査器具、検査キットおよび検査方法
JP2022119706A (ja) * 2021-02-04 2022-08-17 株式会社Icst 検査器具、検査キットおよび検査方法
JP7133247B2 (ja) 2021-02-04 2022-09-08 株式会社Icst 検査器具、検査キットおよび検査方法

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