WO2006132205A1 - ラジカルスカベンジャー及び活性酸素消去剤 - Google Patents

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WO2006132205A1
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amino acid
acid residue
dihydroxyphenylalanine
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Shunji Natori
Kunimiki Ootsu
Hajime Okuyama
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Inbiotex Inc.
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    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu

Definitions

  • the present invention relates to a novel 3,4-dihydroxyphenylalanine derivative or a salt thereof such as N- ⁇ -alanyl_5_S-glutathionyl_3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD).
  • Application radical scavenger, active oxygen scavenger, etc.).
  • Lipids, sugars, nucleic acids, enzymes, proteins, etc. are important as target molecules in vivo for free radical damage.
  • polyunsaturated fatty acids localized in lipids of all cell membranes are attacked by free radicals to produce lipid peroxides via a lipid peroxidation chain reaction. This direct or indirect action by lipid peroxide is considered to contribute to biological membrane damage caused by free radicals.
  • Biological membranes are composed of lipids and proteins. They are not only used as partition walls to partition cells and organelles, but also as diverse materials such as materials for bioactive substances or as scaffolds for receptors on enzymes and membrane surfaces.
  • chain lipid peroxidation by free radicals causes a major obstacle not only to the destruction of the membrane structure but also to the enzyme action and receptor function of the proteins that work there. If such a chain lipid peroxidation reaction occurs in any organ or cell, the site naturally becomes damaged, and in some cases, a specific disease is caused. It is also known that lipid peroxides flow into the blood from the local area and cause secondary lesions such as vascular lesions.
  • Methionine, histidine, cystine, tyrosine and tryptophan residues in proteins are amino acid residues that are susceptible to oxidation by free radicals and / or active oxygen. This oxidative modification causes irreversible inactivation for enzymes, and at the same time is susceptible to degradation by proteases. (Such oxidative inactivation of enzymes leads to leukocyte bactericidal action at the same time.)
  • nucleic acid damage due to free radicals and / or active oxygen is related to cancer and aging. In particular, it is particularly important. It has been clarified that free radicals and Z or active oxygen react and oxidize with any of the base part, sugar part and ester bond part of the nucleic acid. It has been reported that DNA is cleaved by active oxygen generated from leukocytes activated by xanthine-xanthine oxidase system or phorbol ester or tobacco smoke. Regarding the role of free radicals in sugar in vivo, glucose autoreoxidation, lipid peroxidation, intracellular sugar metabolism, etc. show high reactivity compared to glucose, such as glyoxal, methyldarixol, glyconole.
  • Aldehyde, 3-deoxydarcosone, dalcosone and other aldehydes are known to be deeply involved in protein AGE (Advanced glycation endproducts).
  • Depolymerization reaction force of hyaluronic acid by active oxygen It is thought to cause a decrease in the synovial fluid viscosity of rheumatoid arthritis.
  • the main diseases specifically related to free radicals and / or active oxygen are as follows.
  • Cataract injury due to ophthalmic surgery, injury due to use of contour lens, injury due to corneal transplantation, open angle glaucoma (POAG), corneal disease, dry eye, blurred vision, macular degeneration, retinal degenerative disease (Age-related macular degeneration), retinopathy of prematurity, eyelid erosion, uveopathy, cerebral infarction, cerebral ischemia, cerebral edema, myocardial infarction, ischemia reperfusion injury, renal reperfusion, arrhythmia, arteriosclerosis , Head trauma, brain trauma, spinal cord trauma, arthritis, inflammation, periodontal disease, pulpitis, uveitis, eczema / dermatitis, UV (skin) disorder, autoimmune disease (rheumatic etc.), diabetes, gastritis / Gastric ulcer (gastric mucosal disorder), liver disease (drug-induced liver disorder), ulcerative colitis, Crohn's disease (IBD), ischemic enteritis, adult respiratory
  • POAG
  • Cataract is a disease in which visual acuity is reduced due to opacity of the lens, and its cause has been pointed to the involvement of oxidative stress in addition to structural changes due to glycosylation of lens proteins (Non-Patent Document 3).
  • 300-400 nm near-ultraviolet light absorbed by the lens produces active oxygen, which promotes lens protein association and lipid peroxidation As a result, polymer substances and insoluble proteins are generated, and it is considered that the scattered light Z yellow color tone is increased (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 3 In cataractous eyes, compared to normal human lenses of the same age, decreased enzyme activities such as superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) or catalase, and ascorbic acid or reduced gnoretati It has been pointed out that a decrease in ON (GSH), etc., and an increase in lipid peroxide are observed (Non-patent Document 3).
  • SOD superoxide dismutase
  • GPx glutathione peroxidase
  • catalase catalase
  • ascorbic acid or reduced gnoretati Ascorbic acid or reduced gnoretati
  • N ⁇ -Varanyl _ 5 _
  • S Glutathionyl 1,4-dihydroxyphenylalanine
  • (5-S-GAD) is a known compound, and its pharmacological action includes, for example, antibacterial action and antitumor action (Patent Document 1, Non-Patent Document 4), osteoclast formation inhibitory action (Patent Document 2), black Antitumor action against chromoma or breast cancer (Patent Document 3) is known.
  • Non-patent literature l Pharma Medica, 8 (4), 11-14 (1990).
  • Non-patent document 2 Clinical Neuroscience, 19 (5), 520-525 (2001).
  • Non-Patent Document 3 Exp Eye Res. 2000, 70 (1): 81-8.
  • Non-Patent Document 4 J. Biol. Chem. 1996, 271: 13573-13577.
  • Non-Patent Document 5 Cancer Sci. 2003, 94 (4): 400-4.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3634894
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3586809
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-213799
  • radical scavengers for example, synthetic low molecular weight compounds having strong actions such as dibutylhydroxyl toluene (BHT), butylhydroxylazole (BHA), and EDTA-2Na are safe.
  • synthetic low molecular weight compounds having strong actions such as dibutylhydroxyl toluene (BHT), butylhydroxylazole (BHA), and EDTA-2Na are safe.
  • natural compounds that excel in safety, absorption, metabolism, etc. such as vitamin E derivatives, ascorbic acid, quercetin, and various polyphenols, have problems with weak action. I got it.
  • the present invention provides a novel radical scavenger, active oxygen scavenger, antioxidant, preventive / therapeutic agent for diseases or symptoms caused by free radicals or active oxygen, an ophthalmic pharmaceutical composition, and an organ preservation or perfusion composition.
  • the purpose is to provide goods.
  • R 1 represents a hydrogen atom or an arbitrary amino acid residue
  • R 2 represents a hydrogen atom or the following formula ( ⁇ ):
  • R 3 represents a hydrogen atom or any amino acid residue
  • R 4 represents a hydroxyl group or any amino acid residue
  • ⁇ represents 1 or 2.
  • a prophylactic / therapeutic agent, ophthalmic pharmaceutical composition, organ preservation or perfusion composition for symptoms is provided.
  • the 3,4-dihydroxyphenylalanine derivative power N- ⁇ -alanyl-1-5-S-glutathionyl_3,4-dihydroxyphenylalanine is preferable.
  • a novel radical scavenger, active oxygen scavenger, antioxidant, prevention / treatment agent for diseases or symptoms caused by free radicals or active oxygen, ophthalmic pharmaceutical composition, and organ preservation or perfusion A composition is provided.
  • FIG. 1 Comparison of lipid peroxide inhibitory action of ⁇ - ⁇ -alanil-5-S glutathioninole 3,4 dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) and a control compound.
  • FIG. 2 A comparison of DPPH radical scavenging activity of ⁇ - ⁇ -alanyl-5-S glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) and a control compound.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of N- ⁇ -alanyl-1,5-S glutathione 3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) in a galactose-loaded cataract model mouse.
  • FIG. 5 is a graph comparing DPPH radical scavenging activity of ⁇ _ ⁇ -alanyl_5_S-glutathionyl_3,4-dihydroxyphenylalanine (5_S-GAD) and a control compound.
  • FIG. 7 is a diagram comparing the action of N_ ⁇ -valanyl_5_S-glutathionyl_3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) and a control compound with 2 2 elimination activity.
  • ⁇ _ ⁇ - Araniru _ 5 _S- Gurutachioniru _ 3 is a graph comparing the ⁇ 2_ scavenging activity action of 4-dihydroxy-phenylene Ruara Nin (5-S- GAD) and control compounds.
  • FIG. 9 is a diagram showing an angiogenesis-inhibiting action of ⁇ _ ⁇ -valanyl_5_S-glutathionyl_3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) induced by VEGF.
  • FIG. 10 is a diagram comparing the angiogenesis inhibitory action of ⁇ - ⁇ -alanyl-5 S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) and a control compound.
  • FIG. 11 is a diagram comparing the antioxidant activity of ⁇ - ⁇ -alanyl-5 S glutathionyl-3,4 dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) and a control compound.
  • Arbitrary amino acid residues represented by R 3 or R 4 include les, and other types of amino acid residues
  • Examples of amino acid residues represented by R 3 or R 4 include amino acid residues, ⁇ -amino acid residues, ⁇ -amino acid residues, and neutral amino acids (monoamino mono force such as glycine, norin, and leucine).
  • Norebonic acid) residue acidic amino acid (monoaminodicarboxylic acid such as glutamic acid and aspartic acid) residue, basic amino acid (diaminomonocarboxylic acid such as arginine and phenylalanin) and the like.
  • the binding mode of any amino acid residue represented by R 1 R 3 or R 4 is an amide bond.
  • the amino acid residue represented by R 1 is preferably a ⁇ -alanine residue, and the amino acid residue represented by R 3 is preferably a glutamic acid residue, represented by R 4
  • the amino acid residue is preferably a glycine residue, and ⁇ is preferably 1.
  • the 3,4 dihydroxyphenylalanine derivative (I compound (1)) represented by the formula (I) is preferably ⁇ - ⁇ -alanyl-5-S glutathionyl-3,4-dihydroxyphenol.
  • N-alananine (5-S-GAD) ⁇ -alanil-3,4-dihydroxyphenylalanine-AD) or 5-S cystineil 3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD).
  • compound (I) is 5-S-GAD
  • R 1 is a; 3-alanine residue
  • R 2 is a group represented by the formula (II)
  • R 3 is a gnoretamine residue
  • R 4 is glycine.
  • n 1, and compound (I) is In the case of ⁇ _AD, R 1 is a / 3--alanine residue, R 2 is a hydrogen atom, and when compound (I) is 5 _S—CD, R 1 is a hydrogen atom, R 2 is a formula ( ⁇ ) R 3 is a hydrogen atom, R 4 is a hydroxyl group, and n is 1.
  • Compound (I) has an asymmetric carbon, but the configuration of these asymmetric carbons is not particularly limited, and may be either S_ or R_ configuration.
  • compound (I) can be any stereoisomerically pure isomer (optical isomer, diastereoisomer). Etc.), a mixture of arbitrary isomers, a racemate and the like.
  • 5-S-GAD has three asymmetric carbon atoms in the molecule, and there are isomers such as various optically active substances, partially optically active substances, and racemates. Although it may be one kind of force or a mixture of two or more kinds, it is preferably an optically active substance represented by the following formula.
  • Pharmaceutically acceptable salts of compound (I) include, for example, acid addition salts, base addition salts, amino acid addition salts, and the like.
  • acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate and phosphate, formate, acetate, oxalate, benzoate, methanesulfonate, p -Organic acid salts such as toluene sulfonate, maleate, fumarate, tartrate, citrate, succinate, lactate, etc.
  • base addition salts include sodium salt, potassium salt, etc.
  • Metal salts such as salts, magnesium salts, calcium salts, and amine salts such as ammonium salts, methylamine salts, and triethylamine salts.
  • amino acid addition salts include glycine, phenylalanine, aspartic acid, and glutamic acid. Addition salt Is mentioned.
  • a specific production method of the compound (I) is as follows.
  • a certain compound (I) can be produced.
  • 1N hydrochloric acid is added to the reaction mixture, and after extraction with ethyl acetate under acidic conditions, the ethyl acetate layer is concentrated under reduced pressure. This can be done by collecting the precipitated crystals and subjecting them to HPLC treatment.
  • a compound (I) in which R is an arbitrary amino acid and R is a hydrogen atom is represented by the following formula (III):
  • R 1 is a hydrogen atom and R 2 is a group represented by the formula (II)
  • Compound (I) can be produced. Purification of compound (I) from the reaction solution can be performed by HPLC treatment.
  • n is as defined above.
  • 5-S-GAD can be obtained by extraction from natural products according to the method described in Japanese Patent No. 3634894, for example, as described in J. Biol. Chem. 1996,271: 13573-13577. It can also be chemically synthesized according to established methods. For example, 5-S-GAD is homogenized by collecting bodily fluids after damaging adult centrifugal fowls and used as a raw material, which is separated and fractionated by ion column chromatography and reverse phase HPLC. It can be obtained by collecting a fraction having antibacterial activity.
  • Compound (I) has a free radical (free radical) scavenging action, an active oxygen scavenging action, and the like.
  • the free radical (free radical) that can be captured by the compound (I) is not particularly limited, and examples thereof include superoxide, hydroxy radical, DPPH and the like.
  • the active oxygen species that can be eliminated by the compound (I) is not particularly limited, and examples thereof include superoxide, hydrogen peroxide, hydroxy radical, and singlet oxygen. Since compound (I) has a free radical (free radical) scavenging action or an active oxygen scavenging action, it can be used as a radical force generator or an active oxygen scavenger.
  • Compound (I) also prevents oxidation of a substance by free radicals or active oxygen through free radical (free radical) scavenging action or active oxygen scavenging action, and prevention of diseases or symptoms caused by free radicals or active oxygen.
  • Diseases caused by antioxidants, free radicals or active oxygen because they can be effective for treatment, prevention of damage to organs (eg, organs for transplantation) due to free radicals or active oxygen (eg damage to endothelial cells) Alternatively, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for symptoms, organ preservation or perfusion composition.
  • Diseases or symptoms caused by free radicals or active oxygen that can be prevented or treated through free radical (free radical) scavenging action or active oxygen scavenging action include, for example, cataracts; injuries associated with ophthalmic surgery; Injury associated with external lens use; Injury associated with corneal transplantation; Open-angle glaucoma (POAG); Corneal disease; Dry eye; Blurred eye; Macular degeneration; Retinal degenerative disease (age-related macular degeneration); Retinopathy; eyelid disease; uveopathy; cerebral infarction; cerebral ischemia; cerebral edema; myocardial infarction; ischemia reperfusion injury; renal reperfusion; arrhythmia;
  • the target composition may be prepared using only the compound (I), but usually one or more pharmaceutically acceptable substances together with the compound (I).
  • the desired composition is prepared by formulating with the above carriers and Z or additives. In that case, the amount of compound (I) can be adjusted as appropriate.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polybutyl alcohol, polybutylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran. , Sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum anolebumin, mannitol, sorbitol, ratatoose Etc.
  • Additives commonly used in the formulation include, for example, excipients, binders, lubricants, dispersants, suspending agents, emulsifiers, buffers, antioxidants, preservatives, etc. Tonicity agent, pH regulator
  • routes of administration include oral administration and parenteral administration such as intracerebral, intraperitoneal, intraoral, intratracheal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • routes of administration include tablets, granules, fine granules, capsules, powders, solutions, suspensions, syrups, sprays, ribosomes, emulsions, suppositories, injections, eye drops, Examples include ointments and tapes.
  • the ophthalmic pharmaceutical composition includes, for example, a pH adjuster, isotonic agent, chelating agent, thickener, surfactant, water-soluble polymer, polyhydric alcohol, inorganic salt, saccharide, amino acid, vitamin, It can be prepared as a dosage form such as an eye drop, an eye wash, an eye ointment, an implant (in the sclera) using an antiseptic Z antifungal agent, an antioxidant, an ultraviolet absorber and the like.
  • Compound (I) content is Force that can be adjusted appropriately according to the dosage form. the amount is usually 0. 0005-2. 0 wt 0/0, 0.001 to 0, preferably in the case of a point-th UshitoraHitoshi (J.
  • the compound (I) can be stored in a container, and an ophthalmic pharmaceutical composition such as an ophthalmic solution can be prepared by adding a dissolving solution at the time of use.
  • the ophthalmic pharmaceutical composition is preferably adjusted to physicochemical conditions (pH, osmotic pressure, etc.) within a biologically acceptable range.
  • the pH is usually 4.0 to 9.0, preferably 4.3 to 8.5, more preferably 4.5 to 8.0
  • the osmotic pressure is usually 100 to: 1,200 mOsm, preferably 100.
  • To 600 mOsm, more preferably 150 to 400 mOsm, and the osmotic pressure ratio with respect to physiological saline is usually 0.3 to 4.1, preferably 0.4 to 2.1, particularly preferably 0.5 to 1.6.
  • Adjustment of pH, osmotic pressure, etc. can be performed by a conventional method using a pH adjuster, an isotonic agent, salts and the like.
  • an ophthalmic pharmaceutical composition When an ophthalmic pharmaceutical composition is administered to an eye containing a cornea, an injection containing Compound (I) as an active ingredient is prepared, and thin injection is performed in an affected tissue such as the cornea or vitreous body or its adjacent tissue. Can be injected directly with a needle. It can also be administered as an intraocular perfusate using a pump or the like. Further, by pre-impregnating Compound (I) as a component of a contact lens, administration to the eye including the cornea can be performed.
  • the sclera is a thin avascular layer of highly ordered collagen network surrounding most of the vertebrate eye circumference. Because the sclera is avascular, injections that do not inherently pose a risk of bleeding can be quickly lost from the eye. Thus, the sclera can be used as a natural drug storage location. In addition, by using the sclera as a natural drug storage location, it is possible to supply drugs to the underlying tissue.
  • sustained-release polymers include ethylene butyrate, polyhydrometatalylate, and polymer. Forces such as reacryl amide, polybutylpyrrolidone, methyl cellulose, lactic acid polymer, lactic acid 'dallylic acid copolymer, etc. Of these, lactic acid polymer and lactic acid' glycolic acid copolymer, which are biodegradable polymers, are preferred. Cases that can be referred to when using sustained-release agents include the use of inserts and implants (US Pat. No.
  • Inserts are devices that are inserted on the eye, such as on the conjunctival layer, and generally consist of a polymer matrix containing an activated compound.
  • the sustained-release agent When the sustained-release agent is transplanted into the sclera, the compound (I) released from the sustained-release agent can diffuse into the eye through the sclera.
  • the number of administrations per day is not limited, but is usually 1 to 10 times a day depending on the condition such as symptoms / onset site, age, etc. Can be administered to both eyes.
  • the dose is about 0.2 mL for both eyes per eye drop, about 10 mL for both eyes for eye wash, and about 0.1 lg for both eyes for eye ointment.
  • it is about 0.1 mL.
  • the desired effect can be obtained by instilling 1 to 2 drops at a time, 3 to 5 times a day.
  • the oral pharmaceutical composition comprises, for example, an excipient, an antioxidant, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent, etc., and a powder, fine granule, granule, It can be prepared as a dosage form such as tablet, coated tablet, capsule.
  • excipients include lactose, corn starch, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol, crystalline cellulose, silicon dioxide, and the like
  • binders include polybulal alcohol, polybutyl ether, methylcellulose, ethylcellulose, and gum arabic.
  • Disintegrants include starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose , Calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, calcium citrate, dextrin, pectin, carboxymethylcellulose, etc., and lubricants include magnesium stearate.
  • Talc polyethylene render, silica, hydrogenated vegetable oil, and the like.
  • Coloring agents include those permitted to be added to pharmaceuticals. Flavoring agents include cocoa powder, powder, Examples include brain, fragrance powder, heart power oil, dragon brain, and cinnamon powder. For tablets, granules, etc., sugar Apply clothing and other coatings as appropriate.
  • composition for injection can be prepared using, for example, a pH adjuster, a solubilizer, an isotonic agent, a solubilizing agent, a stabilizer, an antioxidant and the like.
  • External preparations are various bases commonly used in pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, etc., such as animal and vegetable oils, mineral oils, ester oils, waxes, higher alcohols, fatty acids, silicone oils, surfactants, Using phospholipids, alcohols, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, clay minerals, purified water, pH adjusters, antioxidants, chelating agents, antiseptic Z antifungal agents, coloring agents, fragrances, etc. Can be prepared. If necessary, components such as blood flow promoters, bactericides, anti-inflammatory agents, cell activators, vitamins, amino acids, moisturizers, and keratolytic agents can be combined in the external preparation.
  • a pharmaceutical composition When a pharmaceutical composition is administered orally, intravenously, intramuscularly, rectally, or transdermally, the dosage is appropriately increased or decreased depending on conditions such as the age, sex, body weight, symptoms, and administration route of the patient. Generally, it should be in the range of 0.1 to 1000 mg / kg per adult day, preferably in the range of 10 to 500 mg / kg, particularly preferably in the range of 50 to 100 mg / kg. It is a range.
  • the drug of the above dosage may be administered every day or may be administered at intervals of several days. For example, it can be administered every day!
  • a composition for organ preservation or perfusion containing compound (I) as an active ingredient can be prepared into a dosage form such as a liquid by a conventional method.
  • the compounding amount of the compound (I) is not particularly limited, but is usually 0.01 to 0.2% by mass, preferably 0.02 to 0.1% by mass.
  • the same composition as the high potassium intracellular fluid such as UW (University of Wisconsin) greed, ET_Kyoto greed, Collins greed, Euro- Collins greed, Sachs solution, etc. It is preferable to prepare a composition for organ preservation or perfusion by adding Compound (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to the organ preservation composition.
  • the physicochemical properties of the S container storage or perfusion composition are similar to the base organ preservation composition.
  • the pH is usually about 6-9, preferably about 7.4, and the potassium concentration is usually About 1 to: 10 mM, preferably about 2 to 8 mM, more preferably about 4 to 6 mM.
  • Example 1 Lipid peroxide inhibitory action As an effect of scavenging free radicals (free radical force change), we investigated the effect of N- ⁇ -valanyl _ 5 -S -glutathionyl _ 3,4-dihydroxyphenylalanine (5 _S _GAD) on LDL oxidation . As controls, dopamine and carnosine (registered trademark, component name: N-acetyl carnosin) used as an eye drop treatment for cataract were used.
  • a fraction with a specific gravity of 1.019 to 1.063 g / mL in serum was defined as human LDL by differential centrifugation. 0. 2 mg / mL LDL with 5 ⁇ M CuSO and 5—S—GAD
  • TBA reaction is a non-specific reaction, it is a method for detecting various lipid peroxidation products such as malondialdehyde.
  • TBA Thiobarbituric acid
  • TCA Trichloroacetic acid
  • HCl Hydrochloric acid
  • N- ⁇ -alanyl-5-S glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine is equivalent to dopamine and carnosine (registered trademark). Compared to the above, it showed an antioxidant effect more than 10 times.
  • DPPH 1, l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl
  • DPPH radical ⁇ _ ⁇ -Aranilou 5 _S-Glutathionyl _3,4-Dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) (see Table 2) or Carnosine (registered trademark) (see Table 3) )
  • 5-S-GAD 50 mM DPPH radical
  • Carnosine registered trademark
  • Table 3 Carnosine (registered trademark)
  • distilled water was added instead of the test reagent.
  • Radical scavenging rate (%) [(measured value of background (average) 1 measured value of each concentration solution) / measured value of background (average)] X 100
  • N- ⁇ -monoalanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine is a powerful DPPH radical scavenging action. However, no effect was observed with Carnosine (registered trademark).
  • ophthalmic solutions whose pH deviated from the allowable range were not used for administration.
  • the pH of the 1.0% ophthalmic solution actually used for administration was 5.2 to 8.0, and that of the 0.1% ophthalmic solution was 6.2 to 7.4.
  • a physiological saline solution as a control substance was used as it was.
  • the above three groups were divided into (A) vehicle control group, (B) 0.1% 5-S-GAD ophthalmic solution group, (C) l. 0% 5 _S _GAD ophthalmic solution group was administered.
  • the administration route was ophthalmic administration, which is a clinically estimated route of application.
  • the number of instillations per day is 4 times, and the instillation frequency is about every 2 hours.
  • Each instillation time zone is around 9:30 (specified time range: 9-: 10:00), around 11:30 (specified) Time range: 11 ⁇ : 12:00), around 13:30 (specified time range: 13 ⁇ : 14:00), around 15:30 (specified time range: 15 ⁇ : 16:00).
  • the instillation period was 28 days.
  • Ophthalmic examinations were performed from about 30 minutes after the last instillation on the 1st, 7th, 14th, 21st and 28th days of instillation.
  • the observation method was performed on the right eye of the eye drop treatment and the left eye of the no treatment, and the lens was observed using a slit lamp (SL-15, Kowa Co., Ltd.).
  • the evaluation of the degree of cataract is based on Cotlier (Arch Ophthalmol., (67) 476-82,1962.
  • the right eye treated with the eye was evaluated on a 9-point (score) scale with an interval of 0.5 from 1 to 5. If no abnormality was observed in the slit lamp, the evaluation was zero.
  • the average score obtained in the 1.0% 5-S-GAD ophthalmic solution group was lower than that in the 0.1% 5-S-GAD ophthalmic solution group after 7 days of instillation. there were.
  • 0.1% 5-S-GAD ophthalmic group and 1.0% 5-S-GAD ophthalmic group in both cases, general condition before instillation and about 1 hour after the last instillation. No abnormalities were observed.
  • N- ⁇ -alanyl_5_S-gnoletathionyl 1,3-dihydroxyphenylalanine (-S-GAD) is not effective in the rat cataract model due to galactose load. It showed a clear improvement effect on the pathology.
  • N- ⁇ -alanyl _ 5 _S-glutathionyl _ 3,4-dihydroxyphenylalanine is superior to N-acetyl-1-L-carnosine.
  • the DPPH radical scavenging action was demonstrated.
  • N- ⁇ -alanyl-5-S glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine is superior to N-acetyl-L-carnosine.
  • ON ( ⁇ 2_ ) showed erasing action.
  • 5-S-GAD was added to a Matrigel plug containing 100 ng / mL VEGF and injected into C57BL Z6 female mice. Six days later, the Matrigel plug was cut out and the hemoglobin content in the Matrigel was quantified. The results are shown as mean values and standard errors. The test was performed by Student's t test (* ⁇ ⁇ 0 ⁇ 05). As shown in Fig. 9, 5-S-GAD was 40 ⁇ , and it inhibited angiogenesis induced by VEGF with a significant difference ( ⁇ 0.05).
  • a 3 mm diameter ring was placed on the egg embryo chorioallantoic membrane on the 5th day of egg laying, and a drug diluted with 1% methylcellulose was added into the 10 a L ring. After incubation at 37 ° C for 48 hours, the fat emulsion was injected into the chorioallantoic membrane, and the part where the ring was removed was photographed. The blood vessel area was measured using image analysis software (Kurabo).
  • 5-S-GAD inhibited angiogenesis with a significant difference (* P ⁇ 0. 05, ** P ⁇ 0.01).
  • a specific gravity fraction of 1.001 to 1.006 g / mL in serum was defined as human LDL using differential centrifugation. 0. 2 mg / mL LDL with 5 / i M CuS ⁇ and 5— S—GAD (3: 100 ⁇
  • T BARS thiobarbituric acid reactive substance
  • TBA Thiobarbituric acid
  • TCA Trichloroacetic acid
  • HCI Hydrochloric acid
  • N- ⁇ -alanyl _ 5_ S-glutathionyl _ 3 4-dihydroxyphenylalanine
  • 5-S-GAD 4-dihydroxyphenylalanine

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Abstract

　臨床における有用性の高い新たなラジカルスカベンジャー、活性酸素消去剤等を提供することを目的とし、この目的を達成するために、Ｎ－β－アラニル－５－Ｓ－グルタチオニル－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（５－Ｓ－ＧＡＤ）等の３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有させる。

Description

明 細 書
ラジカルスカベンジャー及び活性酸素消去剤
技術分野
[0001] 本発明は、 N- β—ァラニル _ 5 _ S—グルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエ二 ルァラニン（5— S— GAD)等の 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体又はその 塩の新規な用途 (ラジカルスカベンジャー、活性酸素消去剤等）に関する。
背景技術
[0002] フリーラジカルによる障害の生体内標的分子としては、脂質、糖、核酸、酵素、タン パク質等が重要である。特に、すべての細胞膜の脂質中に局在する高度不飽和脂 肪酸はフリーラジカルにより攻撃され、脂質過酸化連鎖反応を介し過酸化脂質を生 成する。この過酸化脂質による直接的又は間接的な作用が、フリーラジカルによる生 体膜障害の一因として考えられている。生体膜は、脂質及びタンパク質で構成されて いる力 それらは細胞及び小器官を仕切る隔壁としてのみならず、生理活性物質の 素材として、又は酵素及び膜表面の受容体の足場として等、多様な機能を集約した 場を形成している。そのため、フリーラジカルによる連鎖的脂質過酸化反応は、膜構 造の破壊だけでなぐそこで働くタンパクの酵素作用及び受容体機能にも大きな障害 をもたらすことになる。このような連鎖的脂質過酸化反応がいずれかの臓器又は細胞 に生じれば、当然その部位に障害が生じ、場合によっては特定の疾患が引き起こさ れる。さらに、過酸化脂質は局所より血液中に流出し、血管病変をはじめとする二次 的病変の原因となることも知られている。
[0003] 糖尿病の合併症、腎不全の合併症、ショック時の多臓器不全等は、その代表例で ある。タンパク質中のメチォニン、ヒスチジン、シスチン、チロシン及びトリプトファン残 基は、フリーラジカル及び/又は活性酸素によって酸化を受けやすいアミノ酸残基で ある。この酸化修飾により、酵素ならば不可逆的不活性化を引き起こす同時に、プロ テアーゼによる分解を受けやすくなる。 （このような酵素の酸化的不活性化は、同時 に白血球の殺菌作用にもつながるものである。 )
[0004] 一方、フリーラジカル及び/又は活性酸素による核酸障害は、癌及び老化との関 わりにおいて特に重要である。フリーラジカル及び Z又は活性酸素は、核酸の塩基 部、糖部、エステル結合部いずれとも反応し酸化することが明らかとなっている。キサ ンチン—キサンチン酸化酵素系、ホルボールエステルにより活性化された白血球又 はタバコの煙等から発生する活性酸素により、 DNAが切断されることが報告されてい る。糖のフリーラジカルの生体内における役割については、グルコースの自己酸化、 脂質の過酸化、細胞内の糖代謝等から、グルコースに比較して高い反応性を示すグ リオキサール、メチルダリオキサール、グリコーノレアノレデヒド、 3—デォキシダルコソン 、ダルコソン等のアルデヒドがタンパクの AGE (Advanced glycation endproducts)ィ匕 に深く関与していることが知られている。ヒアルロン酸の活性酸素による解重合反応 力 慢性関節リウマチの滑液粘度の低下の原因と考えられている。フリーラジカル及 び/又は活性酸素が具体的に関連する主な疾患は、下記の通りである。
[0005] 白内障、眼科手術に伴う傷害、コンタ外レンズ使用に伴う傷害、角膜移植に伴う傷 害、開放隅角緑内障 (POAG)、角膜疾患、ドライアイ、かすみ目、黄斑変性症、網膜 変性疾患 (加齢性黄斑変性症）、未熟児網膜症、眼鉄鲭症、ぶどう膜症、脳梗塞、脳 虚血、脳浮腫、心筋梗塞、虚血再灌流障害、腎再灌流、不整脈、動脈硬化、頭部外 傷、脳外傷、脊髄外傷、関節炎、炎症、歯周病、歯髄炎、ぶどう膜炎、湿疹/皮膚炎 、紫外線による (皮膚)障害、自己免疫疾患 (リウマチ等）、糖尿病、胃炎/胃潰瘍（ 胃粘膜障害)、肝疾患 (薬剤性肝障害)、潰瘍性大腸炎、クローン病 (IBD)、虚血性 腸炎、成人呼吸窮迫症候群 (ARDS)、ダウン症、統合失調症 (精神分裂病）、てんか ん、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、老化、筋萎縮性側策硬化 症 (ALS)、溶血性疾患、播種性血管内凝固症候群（DIC)、敗血症性ショック、外傷 性ショック、皮弁壊死、浮腫、パラコート中毒、血管透過性亢進、肺気腫、急性膝炎、 ポルフィリン血症、地中海性貧血、及び熱傷、凍傷、放射線、薬物又は血液透析によ り誘発される活性酸素又は他のフリーラジカル上昇等（非特許文献 1， 2)。
[0006] 白内障は水晶体の混濁によって視力が低下する疾患であり、その成因には水晶体 タンパク質の糖ィ匕反応（glycation)による構造上の変化以外に、酸化的ストレスの関 与が指摘されている（非特許文献 3)。水晶体で吸収される 300〜400nmの近紫外 線は、活性酸素を産生し、水晶体タンパク質の会合及び脂質の過酸化を進行させる 結果、高分子物質や不溶性タンパク質が生じ、散乱光 Z黄色色調の増加をきたすと 考えられる（非特許文献 3)。また白内障眼においては、同年齢のヒトの正常水晶体と 比較して、スーパーォキシドジスムターゼ（S〇D)、グルタチオンペルォキシダーゼ（ GPx)又はカタラーゼ等の酵素活性低下、及びァスコルビン酸又は還元型グノレタチ オン (GSH)等の減少、並びに過酸化脂質の増加等が認められることが指摘されてい る (非特許文献 3)。
[0007] N— β—ァラニル _ 5 _ S—グルタチォニル一3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン
(5— S— GAD)は公知化合物であり、その薬理作用として、例えば、抗菌作用及び 抗腫瘍作用（特許文献 1，非特許文献 4)、破骨細胞形成阻害作用（特許文献 2)、黒 色腫又は乳癌に対する抗腫瘍作用（特許文献 3)が知られている。
非特許文献 l : Pharma Medica, 8 (4) , 11-14 (1990) .
非特許文献 2： Clinical Neuroscience, 19 (5) ,520-525 (2001) .
非特許文献 3 : Exp Eye Res. 2000， 70 (1) :81-8.
非特許文献 4 : J. Biol. Chem. 1996， 271 : 13573-13577.
非特許文献 5： Cancer Sci. 2003, 94 (4) :400-4.
特許文献 1：特許第 3634894号公報
特許文献 2：特許第 3586809号公報
特許文献 3：特開 2001-213799号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] しかしながら、従来知られているラジカルスカベンジャーのうち、例えば、ジブチルヒ ドロキシルトルエン（BHT)、ブチルヒドロキシァ二ソール（BHA)、 EDTA— 2Na等 の作用の強力な合成低分子化合物は安全性、吸収、代謝等に問題がある一方、ビ タミン E誘導体、ァスコルビン酸、ケルセチン、各種ポリフエノール類等の安全性、吸 収、代謝等に優れる天然化合物は作用が弱いとレ、う問題点を有してレ、た。
そこで、本発明は、新規なラジカルスカベンジャー、活性酸素消去剤、抗酸化剤、 フリーラジカル又は活性酸素に起因する疾患又は症状の予防 ·治療剤、眼科用医薬 組成物、並びに臓器保存又は灌流用組成物を提供することを目的とする。 Γ解決するための手段
上記課題を解決するために、本発明は、次式 (I)
[化 1]
Figure imgf000005_0001
[式中、 R1は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R2は水素原子又は次式 (Π)： [化 2]
Figure imgf000005_0002
[式中、 R3は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R4は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 ηは 1又は 2を表す。 ]
で表される基を表す。但し、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]
で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有するラジカルスカベンジャー、活性酸素消去剤、抗酸化剤、 フリーラジカル又は活性酸素に起因する疾患又は症状の予防 ·治療剤、眼科用医薬 組成物、臓器保存又は灌流用組成物を提供する。
本発明において、前記 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N - β—ァラ ニル一5— S—グルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニンであることが好 ましい。
発明の効果
[0010] 本発明により、新規なラジカルスカベンジャー、活性酸素消去剤、抗酸化剤、フリー ラジカル又は活性酸素に起因する疾患又は症状の予防 ·治療剤、眼科用医薬組成 物、並びに臓器保存又は灌流用組成物が提供される。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]Ν— β ァラニルー 5— S グルタチォニノレー 3, 4 ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン (5— S— GAD)及び対照化合物の過酸化脂質抑制作用を比較した図である。
[図 2]Ν— β ァラニルー 5— S グルタチォニルー 3, 4 ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)及び対照化合物の DPPHラジカル消去活性を比較した図であ る。
[図 3]Ν— β ァラニルー 5— S グルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)及び対照化合物の〇2_消去活性作用を比較した図である。
[図 4]ガラクトース負荷白内障モデルマウスにおける、 N— β—ァラニル一 5— S グ ルタチォニル 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S— GAD)の効果した図で ある。
[図 5]Ν _ β—ァラニル _ 5 _ S—グルタチォニル _ 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5 _ S— GAD)及び対照化合物の DPPHラジカル消去活性を比較した図であ る。
[図 6]Ν _ β—ァラニル _ 5 _ S—グルタチォニル _ 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5 _ S— GAD)及び対照化合物の DPPHラジカル消去活性を比較した図であ る。
[図 7]N_ β—ァラニル _ 5 _S—グルタチォニル _ 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)及び対照化合物の〇2_消去活性作用を比較した図である。
[図 8]Ν_ β—ァラニル _ 5 _S—グルタチォニル _ 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)及び対照化合物の〇2_消去活性作用を比較した図である。
[図 9]Ν_ β—ァラニル _ 5 _S—グルタチォニル _ 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)の、 VEGF惹起による血管新生の抑制作用を示す図である。
[図 10]Ν— β ァラニルー 5 S グルタチォニルー 3, 4 ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)及び対照化合物の血管新生抑制作用を比較した図である。
[図 11]Ν— β ァラニルー 5 S グルタチォニルー 3, 4 ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)及び対照化合物の抗酸化作用を比較した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] R3又は R4で表される任意のアミノ酸残基には、レ、かなる種類のアミノ酸残基も 含まれ、
Figure imgf000007_0001
R3又は R4で表されるアミノ酸残基としては、例えば、 ひ—アミノ酸残基、 β—アミノ酸残基、 Ί—アミノ酸残基、中性アミノ酸 (グリシン、ノ リン、ロイシン等のモ ノアミノモノ力ノレボン酸）残基、酸性アミノ酸（グルタミン酸、ァスパラギン酸等のモノァ ミノジカルボン酸）残基、塩基性アミノ酸（アルギニン、フエ二ルァラニン等のジアミノモ ノカルボン酸)等が挙げられる。なお、 R1 R3又は R4で表される任意のアミノ酸残基 の結合様式はアミド結合である。
[0013] R1で表されるアミノ酸残基は、好ましくは β—ァラニン残基であり、 R3で表されるアミ ノ酸残基は、好ましくはグルタミン酸残基であり、 R4で表されるアミノ酸残基は、好まし くはグリシン残基であり、 ηは好ましくは 1である。
[0014] 式 (I)で表される 3, 4 ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体 (ィ匕合物（1) )は、好まし くは、 Ν— β ァラニルー 5— S グルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)、 β ァラニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン —AD )又は 5— S システィ二ルー 3 , 4 -ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S - CD)であ る。なお、化合物（I)が 5— S— GADである場合、 R1は ;3—ァラニン残基、 R2は式（II )で表される基、 R3はグノレタミン残基、 R4はグリシン残基、 nは 1であり、化合物（I)が β _ADである場合、 R1は /3—ァラニン残基、 R2は水素原子であり、化合物（I)が 5 _S— CDである場合、 R1は水素原子、 R2は式 (Π)で表される基、 R3は水素原子、 R4 は水酸基、 nは 1である。
[0015] 化合物（I)には不斉炭素が存在するが、それらの不斉炭素の立体配置は特に限定 されず、 S _又は R_配置のいずれであってもよレ、。化合物（I)が 1又は 2個以上の不 斉炭素に基づく異性体として存在する場合、化合物 (I)は、立体化学的に純粋な形 態の任意の異性体（光学異性体、ジァステレオ異性体等）であってもよいし、任意の 異性体の混合物、ラセミ体等であってもよい。例えば、 5— S— GADは、分子内に不 斉炭素原子を 3箇所有しており、各種光学活性体、部分光学活性体、ラセミ体等の 異性体が存在するが、それらのうち、いずれ力 1種であってもよいし、 2種以上の混合 物であってもよいが、次式で表される光学活性体であることが好ましい。
[化 3]
Figure imgf000008_0001
5-S-GAD
[0016] 化合物（I)の薬学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、塩基付加塩、アミ ノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫 酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シユウ酸塩、安息香酸塩、メタンスル ホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クェン 酸塩、コハク酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等が挙げられ、塩基付加塩としては、例え ば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニゥ ム塩、メチルァミン塩、トリェチルァミン塩等のアミン塩が挙げられ、アミノ酸付加塩とし ては、例えば、グリシン、フエ二ルァラニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩 が挙げられる。
[0017] 5 _ S _GAD、 β _AD、 5— S— CD等に代表される化合物（I)は、特開平 8— 33 7594号公報、特開 2001— 213799、特開 2001— 226283、 Leem JY等， J Biol Ch em, 271, 13573-13577 (1996)、 Ito S等， J Med Chem, 124, 673-677 (1981)、 Natori S.， Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects. London, Chapman&Hal 1, 245-260 (1998)等に記載された公知の製造方法に準じて製造することができる。
[0018] 化合物（I)の具体的製造方法は次の通りである。
任意のアミノ酸のアミノ基を t—ブトキシカルボニル基 (Boc基）で保護するとともに、 当該アミノ酸のカルボキシル基を N—ヒドロキシスクシンイミド（NHS)で活性エステル 化した後、 Dopaと反応させることにより、 Rが任意のアミノ酸であり、 Rが水素原子で
1 2
ある化合物 (I)を製造することができる。反応混合物からの化合物 (I)の精製は、例え ば、反応混合物に 1N塩酸を添加し、酸性条件下、酢酸ェチルを用いて抽出処理を 行った後、酢酸ェチル層を減圧下で濃縮して析出する結晶を回収し、 HPLC処理す ることにより行うこと力 Sできる。
[0019] また、 Rが任意のアミノ酸であり、 Rが水素原子である化合物（I)を次式 (III)：
1 2
[化 4]
Figure imgf000009_0001
(CH2)n [式中、 R3、 R4及び nは前記と同義である。 ]
で表される化合物（ΠΙ)とともにリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼで処理すること により、 R1が任意のアミノ酸であり、 R2が式 (II)で表される基である化合物（I)を製造 することができる。反応液からの化合物（I)の精製は、 HPLC処理することにより行うこ とがでさる。
[0020] また、 Dopaを化合物（ΠΙ)とともにリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼで処理するこ とにより、 R1が水素原子であり、 R2が式 (II)で表される基である化合物（I)を製造する ことができる。反応液からの化合物（I)の精製は、 HPLC処理することにより行うことが できる。
[0021] 化合物（III)は、次式 (IV)：
[化 5]
Figure imgf000010_0001
[式中、 nは前記と同義である。 ]
で表される化合物（IV) (例えば、システィン、ホモシスティン）のァミノ基及びカルボキ シル基に任意のアミノ酸をアミド結合させることにより製造することができる。
5— S— GADは、特許第 3634894号公報に記載された方法に従って天然物から 抽出して得ることもできるし、例えば J. Biol. Chem. 1996,271:13573- 13577.に記載さ れた方法に従って化学的に合成することもできる。例えば、 5— S— GADは、センチ ニクバエの成虫に傷を与えて飼育した後に体液を採取するカ ホモジネート化して原 料とし、これをイオンカラムクロマトグラフィー及び逆相 HPLCにより分離'分画処理し 、抗菌活性を有する画分を採取することにより得ることができる。
[0023] 化合物 (I)は、フリーラジカル (遊離基)捕捉作用、活性酸素消去作用等を有する。
化合物（I)が捕捉し得るフリーラジカル (遊離基）は特に限定されるものではないが、 例えば、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、 DPPH等が挙げられる。化合物（I) が消去し得る活性酸素種は特に限定されるものではないが、スーパーオキサイド、過 酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素等が挙げられる。化合物（I)は、フリーラ ジカル (遊離基)捕捉作用又は活性酸素消去作用を有するので、ラジカルス力べンジ ヤー又は活性酸素消去剤として使用することができる。また、化合物（I)は、フリーラジ カル (遊離基)捕捉作用又は活性酸素消去作用を通じて、フリーラジカル又は活性 酸素による物質の酸化の防止、フリーラジカル又は活性酸素に起因する疾患又は症 状の予防'治療、フリーラジカル又は活性酸素による臓器 (例えば移植用臓器）のダ メージ (例えば内皮細胞へのダメージ）の防止等の効果を発揮し得るので、抗酸化剤 、フリーラジカル又は活性酸素に起因する疾患又は症状の予防 ·治療剤、臓器保存 又は灌流用組成物等として使用することができる。
[0024] フリーラジカル (遊離基)捕捉作用又は活性酸素消去作用を通じて予防又は治療し 得る、フリーラジカル又は活性酸素に起因する疾患又は症状としては、例えば、白内 障；眼科手術に伴う傷害；コンタ外レンズ使用に伴う傷害；角膜移植に伴う傷害；開 放隅角緑内障 (POAG)；角膜疾患；ドライアイ;かすみ目；黄斑変性症;網膜変性疾 患 (加齢性黄斑変性症）；未熟児網膜症；眼鉄鲭症；ぶどう膜症;脳梗塞；脳虚血；脳 浮腫；心筋梗塞；虚血再灌流障害；腎再灌流；不整脈；動脈硬化；頭部外傷；脳外傷
；脊髄外傷；関節炎；炎症;歯周病;歯髄炎；ぶどう膜炎；湿疹 Z皮膚炎；紫外線によ る (皮膚)障害；自己免疫疾患 (リウマチ等）；糖尿病；胃炎/胃潰瘍（胃粘膜障害）； 肝疾患 (薬剤性肝障害）；潰瘍性大腸炎;クローン病 (IBD)；虚血性腸炎;成人呼吸 窮迫症候群 (ARDS)；ダウン症;統合失調症 (精神分裂病）；てんかん;神経変性疾患 ；アルツハイマー病；パーキンソン病；老化；筋萎縮性側策硬化症 (ALS)；溶血性疾 患；播種性血管内凝固症候群（DIC)；敗血症性ショック；外傷性ショック；皮弁壊死； 浮腫;パラコート中毒；血管透過性亢進；肺気腫；急性膝炎；ポルフィリン血症；地中 海性貧血;熱傷、凍傷、放射線、薬物又は血液透析により誘発される活性酸素又は 他のフリーラジカル上昇等が挙げられる。
[0025] 各種用途の組成物を調製する際、化合物（I)のみを用いて目的の組成物を調製し てもよいが、通常は、化合物（I)とともに、医薬上許容される 1種以上の担体及び Z又 は添加剤を用いて製剤化することにより目的の組成物を調製する。その場合、化合 物（I)の配合量は適宜調節することができる。
[0026] 医薬上許容される担体としては、例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラ 一ゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、ァ ルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチ ン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレング リコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステア リン酸、ヒト血清ァノレブミン、マンニトール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。
[0027] 製剤化に際して一般的に使用される添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑 沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、 pH調節剤
、溶解剤、安定化剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じ て適宜選択することができる。
[0028] 投与経路及び投与剤形は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望まし レ、。投与経路の一般例としては、経口投与の他、脳内、腹腔内、 口腔内、気道内、直 腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与が挙げられ、投与剤形の一般例と しては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロッ プ剤、噴霧剤、リボソーム剤、乳剤、座剤、注射剤、点眼剤、軟膏、テープ剤等が挙 げられる。
[0029] 眼科用医薬組成物は、例えば、 pH調整剤、等張化剤、キレート剤、増粘剤、界面 活性剤、水溶性高分子、多価アルコール、無機塩類、糖類、アミノ酸、ビタミン、防腐 Z防黴剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤等を用いて、例えば、点眼剤、洗眼剤、眼軟膏 、インプラント（強膜内）等の剤形として調製することができる。化合物 (I)の配合量は 剤形に応じて適宜調節することができる力 例えば、 N- β—ァラニル _ 5 _S—グ ルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S— GAD)を配合する場合 、その酉己合量は通常 0. 0005-2. 0質量0 /0、点目艮斉 (Jの場合には好ましくは 0. 001 〜0. 5質量％、洗眼剤の場合には好ましくは 0. 001〜0. 2質量％、眼軟膏の場合 には好ましくは 0. 001〜： 1. 0質量％、硝子体内投与等に使用する注射剤の場合に は好ましくは 0. 0：!〜 5. 0質量％の範囲である。化合物（I)を容器保存しておき、使 用時に溶解液を加えて点眼液等の眼科用医薬組成物を調製することもできる。調製 後の眼科用医薬組成物は遮光条件にて冷蔵保管することが好ましレ、。眼科用医薬 組成物は、生体許容範囲内の物理化学的条件 (pH、浸透圧等）に調節されることが 好ましい。 pHは通常 4. 0〜9. 0、好ましくは 4. 3〜8. 5、さらに好ましくは 4. 5〜8. 0であり、浸透圧は通常 100〜： 1, 200m〇sm、好ましくは 100〜600mOsm、さらに 好ましくは 150〜400mOsmであり、生理食塩液に対する浸透圧比は、通常 0. 3〜 4. 1、好ましくは 0. 4〜2. 1、特に好ましくは 0. 5〜： 1. 6である。 pH、浸透圧等の調 節は、 pH調整剤、等張化剤、塩類等を用い常法により行うことができる。
[0030] 眼科用医薬組成物を角膜を含む眼へ投与する場合、化合物 (I)を有効成分として 含有する注射剤を調製し、角膜、硝子体等の患部組織又はその隣接組織中に細い 注射針で直接注入することができる。また、ポンプ等を用いて眼内灌流液として投与 することができる。また、化合物（I)をコンタクトレンズの成分として予め含浸させておく ことにより、角膜を含む眼への投与を行うことができる。
[0031] 強膜は、脊椎動物の眼周囲の大部分を包囲している、高度に規則化したコラーゲ ン網目組織からなる薄い無血管性の層である。強膜は無血管性であるので、そこに 注射しても、本質的に出血の危険性はなぐ注射剤は眼からすぐに失われることがな レ、。したがって、強膜を天然の薬剤貯蔵場所として利用することができる。また、強膜 を天然の薬剤貯蔵場所として利用することにより、下層の組織への薬剤供給が可能 となる。
[0032] また、化合物（I)を徐放性ポリマーのペレット又はマイクロカプセルに取り込ませて 徐放剤とし、当該徐放剤を治療すべき組織中に外科的に移植することができる。徐 放性ポリマーとしては、例えば、エチレンビュルアセテート、ポリヒドロメタタリレート、ポ リアクリルアマイド、ポリビュルピロリドン、メチルセルロース、乳酸ポリマー、乳酸 'ダリ コール酸コポリマー等が挙げられる力 これらのうち、生分解性ポリマーである乳酸ポ リマー、乳酸 'グリコール酸コポリマー等が好ましい。徐放剤の使用にあたり参照する ことができる事例としては、インサート剤やインプラント剤の使用（米国特許第 4,863, 457号)がある。これらは眼上又は眼内へ長期にわたって薬剤を放出する。インサー ト剤とは、結膜層上といった眼上に差し込まれた器材であり、これは一般に活性化合 物を含有するポリマーマトリックスからなる。徐放剤を強膜中に移植した場合、徐放剤 力 放出された化合物 (I)は強膜を通って眼内に拡散することができる。
[0033] 眼科用医薬組成物を投与する場合、一日あたりの投与回数は限定されないが、通 常は 1日 1〜： 10回を症状/発症部位、年齢等の状況に応じて片眼又は両眼に投与 することができる。投与量は、点眼剤の場合、 1回の点眼あたり両眼で約 0. 2mL、洗 眼剤の場合、両眼で約 10mL、眼軟膏の場合、両眼で約 0. lgであり、注射剤の場 合、約 0. lmLである。点眼剤の場合、例えば、 1回 1〜2滴、 1日 3〜5回点眼するこ とにより、所望する効果を得ることができる。
[0034] 経口用医薬組成物は、例えば、賦形剤、酸化防止剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、 着色剤、矯味矯臭剤等を用いて、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセ ル剤等の剤形として調製することができる。賦形剤としては、乳糖、コーンスターチ、 白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が挙げら れ、結合剤としては、ポリビュルアルコール、ポリビュルエーテル、メチルセルロース、 ェチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピル メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロリドン、ポリプロピレ ングリコール.ポリオキシエチレン.ブロックポリマー、メダルミン等が挙げられ、崩壊剤 としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナト リウム、クェン酸カルシウム、デキストリン、ぺクチン、カルボキシメチルセルロース '力 ルシゥム等が挙げられ、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリェチ レンダリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられ、着色剤としては、医薬品に添カロ することが許可されているもの等が挙げられ、矯味矯臭剤としては、ココア末、ノ、ッカ 脳、芳香散、ハツ力油、竜脳、桂皮末等が挙げられる。錠剤、顆粒剤等に対して、糖 衣等のコーティングを適宜施してもょレ、。
[0035] 注射用組成物は、例えば、 pH調整剤、溶解剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤 、酸化防止剤等を用いて調製することができる。
外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種基剤、例えば、 動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン 油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、 粘土鉱物類、精製水、 pH調整剤、酸化防止剤、キレート剤、防腐 Z防黴剤、着色料 、香料等を用いて調製することができる。外用剤には、必要に応じて、血流促進剤、 殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分 を酉己合することもできる。
[0036] 医薬組成物を経口、静脈内、筋肉内、経直腸又は経皮投与する場合、その投与量 は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路等の条件に応じて適宜増減される べきであるが、一般的には、成人一日あたり 0. 1〜： 1000mg/kgの範囲であり、好ま しくは 10〜500mg/kgの範囲であり、特に好ましくは 50〜100mg/kgの範囲であ る。上記投与量の薬剤は、毎日投与してもよいし、数日間隔で投与してもよぐ例え ば：!〜 4日毎に投与することができる。
[0037] 化合物 (I)を有効成分として含有する臓器保存又は灌流用組成物は、常法により液 剤等の剤形に調製することができる。化合物（I)の配合量は特に限定されるものでは ないが、通常 0. 01〜0. 2質量％、好ましくは 0. 02-0. 1質量％である。移植臓器 の保存又は灌流用である場合、高カリウム細胞内液と同様の組成物、例えば、 UW ( University of Wisconsin)欲、 ET_Kyoto欲、 Collins欲、 Euro— Collins欲、 S achs液等の公知の臓器保存組成物に、化合物（I)又はその薬学的に許容される塩 を加えることにより、臓器保存又は灌流用組成物を調製することが好ましい。 S蔵器保 存又は灌流用組成物の物理化学的性質は、ベースとなる臓器保存組成物と同様で ある力 pHは通常約 6〜9、好ましくは約 7. 4であり、カリウム濃度は通常約 1〜： 10m M、好ましくは約 2〜8mM、さらに好ましくは約 4〜6mMである。
実施例
[0038] 〔実施例 1〕過酸化脂質抑制作用 遊離基捕捉作用（フリーラジカルス力べンジ作用）として、 LDL酸化に対する N— β -ァラニル _ 5 -S -グルタチォニル _ 3, 4 -ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5 _ S _ GAD)の効果を調べた。対照として、ドパミン (dopamine)及び白内障点眼治療薬と して使用されているカルノシン（Carnosine :登録商標、成分名： N-ァセチルカルノシ ン）を用いた。 LDLの調製は、分画遠心法を用いて血清中 1. 019〜1. 063g/mL の比重分画をヒト LDLとした。 0. 2mg/mL LDLに 5 μ M CuSOと、 5— S— GAD
4
(3〜100 μ Μ)、 Ν_ァセチノレ一カノレノシン（100 μ M〜10mM)又は L—カノレノシ ン（10 x M〜10mM)とを添加し、 37°Cで 3時間インキュベートした。インキュベーシ ヨン終了後、 TBARS (チォバルビツール酸反応性物質）を測定した。 TBA反応は非 特異的な反応であるが、マロンジアルデヒドをはじめとする種々の脂質過酸化生成物 を検出する方法である。硫酸銅による過酸化反応実験は N = 2で 2回行った。 3. 75 mg/mLチォバルビツール酸（Thiobarbituric acid ; TBA) , 150mg/mLトリクロ口 酢酸（Trichloroacetic acid ;TCA)及び 0· 25Ν塩酸（Hydrochloric acid ; HCl)を含 む水溶液を TBA試薬として調製するとともに、標準液としてテトラメトキシプロパン（2 , 5, 10, 20, 40 μ Μ)を調製し、エツペンドルフチューブ（1. 5mL)中に LDLサンプ ル又は標準液各 100 μ Lと TBA試薬を 200 μ Lとを添加し、キャップをしてよく混和し た。 95°Cで 15分間加熱した後、水冷し、 3000rpmで 5分間遠心した。上清の吸光 度（535nm)を測定した。標準液の吸光度から検量線を作成し、検量線に基づいて LDLサンプルの TBARS量（nmol/mg LDL protein)を計算した（平均値、 n= 2 、表 1及び図 1参照)。
[表 1] TB AR S量
添加サンプル
(nraol/mg LDL protein)
- CuS04 3.387
+CuS04 92.165
10 zM 5 - S - GAD 85.683
30^M 5-S-GAD 4.290
IOO M 5-S-GAD 2.649
lO^M ドパミン 58.853
30 M ドパミン 4.454
IOO M ドパミン 4.208
100/xM カルノシン 84.781
lmM カルノシン 23.900
lOmM カルノシン 7.079
[0040] 表 1及び図 1に示すように、 N— β ァラニルー 5— S グルタチォニルー 3， 4ージ ヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S— GAD)は、ドパミンと同等、カルノシン（Carnosine ：登録商標）と比較して 10倍以上の抗酸化作用を示した。
[0041] 〔実施例 2〕DPPH消去活性
DPPH ( 1 , l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)は窒素ラジカルの一種であり，きわめて安 定なラジカルで，黒紫色の結晶として市販されている（和光純薬株式会社等）。 50m M DPPHラジカルのエタノール溶液に Ν_ β—ァラ二ルー 5 _S—グルタチォニル _3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S— GAD) (表 2参照）又はカルノシン（登 録商標）（表 3参照）を添加し、室温下 5分間反応させた（下記反応式参照）。被験試 薬の代わりに蒸留水を添カ卩したものをバックグラウンドとした。 517nmにおける DPP Hの吸光度を測定し、 DPPHラジカルの消去率（％)を下式により算出し、ラジカルス 力ベンジャー活性とした（平均値、 n = 2、表 2、表 3及び図 2参照）。
[0042] [化 3]
Figure imgf000018_0001
無 色
[0043] ラジカル消去率（％) = [ (バックグラウンドの測定値（平均）一各濃度液の測定値) /バックグラウンドの測定値（平均）] X 100
[0044] [表 2]
1 ) 5-S-GAD
[0045] [表 3]
Figure imgf000018_0002
[0046] 表 2、表 3及び図 2に示すように、 N— β 一ァラニルー 5— S—グルタチォニルー 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S— GAD)は、強力な DPPHラジカルの消去 作用を示したが、カルノシン (登録商標）には全く効果が認められなかった。
[0047] 〔実施例 3〕スーパーォキシドア二オン (Ο2— )消去活性作用 200 μ Mルシゲニン含有 50mM炭酸バッファー（ρΗΙΟ)中にて、 100 μ Mキサ ンチンと、 lmU/mLキサンチンォキシダーゼとを反応させ、産生するスーパーォキ シドア二オン（O2— )依存の化学発光量を BIOLUMAT (登録商標）（型式 LB9505、 EG&G BERTHORD社製）を用いて 10分間測定した。 10分間の化学発光総量を 示す曲線下面積を計算し、被試験薬液の代わりに同量の PBS (-)を添加した群（コ ントロール）の曲線下面積を 100として、 N— β—ァラ二ノレ一 5— S—ダルタチォニル - 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S— GAD) (表 4)又はカルノシン（登録商 標）（表 5)を添加して化学発光上昇に対する影響を検討し、その抑制活性をスーパ 一ォキシドア二オン消去活性（％)とした（平均値、 n= 2、表 4、表 5及び図 3参照）。
[表 4コ
1) 5-S-GAD
[0049] [表 5」
Figure imgf000019_0001
[0050] 表 4、表 5及び図 3に示すように、 N- β—ァラ二ノレ _ 5_ S—グルタチォニル一 3，
4ージヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S— GAD)は、強力なスーパーォキシドアニォ ン (〇2_)消去作用を示したが、カルノシン (登録商標）には全く効果が認められなか つた。
[0051] 〔実施例 4〕ガラクトース負荷白内障モデル
[点眼液の調製] 被験物質 352mgを枰量後、 1. lmLの lN_Na〇H (lmolZL水酸化ナトリウム、 和光純薬工業株式会社）に溶解した。溶解後、 pH試験紙 (Duotest :登録商標、 M ACHEREY— NAGEL)で pHが許容範囲（5〜8)内であることを確認した。その後 、 2mL容のチューブに 0. 03mL X 30本（1日 4回の 7日間分 28本 +予備 2本）に分 注した。これらを液体窒素で直ちに凍結し、冷凍 (設定： _ 85°C、許容範囲： - 90〜 -75°C) Z遮光条件下で保管した。この保管した溶液を 320mgZmLのストック液と した。このストック液の使用は、調製後 8日間以内とした。調製後 8日間を越したストツ ク液は廃棄処分した。
[0052] 点眼前の調製としては、 320mg/mLストック液のチューブ 1本を室温に戻した後 、生理食塩液 0. 93mLをチューブに直接カ卩えて希釈した。希釈調製後、 pH試験紙 で pHが許容範囲（5〜8)内であることを確認し、この点眼液を 1. 0%点眼液とし、投 与に使用した。さらに、この 1. 0%点眼液から 2mL容チューブに 0. 09mLを分注し、 生理食塩液 0. 8 lmLをチューブに直接カ卩えて希釈調製後、 pH試験紙で pHが許容 範囲（5〜8)内であることを確認し、この点眼液を 0. 1 %点眼液とし、投与に使用した 。なお、 pHが許容範囲内から逸脱した点眼液は投与に使用しなかった。実際に投与 に使用した 1. 0%点眼液の pHは 5. 2〜8. 0であり、 0. 1 %点眼液では 6. 2〜7. 4 であった。媒体は、対照物質の生理食塩液をそのまま使用した。
[0053] [白内障モデルの作製]
3週齢の雄性 Crj : CD (SD) IGS系ラット（SPF)に対して 5日間の検疫期間をおき、 その後 8日間の馴化期間を設けた。無作為抽出法により、各群の平均体重及び分散 がほぼ等しくなるよう 1群 10匹の 3群に群分けした。群分け後は 50%ガラクトース含 有粉末飼料〔CRF_ 1粉末飼料（ロット番号： 041104、製造元：オリエンタル酵母ェ 業株式会社）とガラクトース（D—ガラクトース、ロット番号: QYG0223、製造元：米山 薬品工業株式会社)との等量混合粉末飼料 (ロット番号 : 050107)であり、オリエンタ ル酵母工業株式会社で混合したもの。以下「ガラタトース飼料」と略す。〕を粉末給餌 器に入れ、自由に摂餌させた。また、飲料水も自由に摂取させた。
[0054] [投与方法]
上記 3群を、（A)媒体対照群、 (B) 0. 1 % 5— S— GAD点眼液群、（C) l . 0% 5 _S _GAD点眼液群として投与した。投与経路は、臨床推定適用経路である点眼 投与とした。 1日の点眼回数は 4回とし、その点眼頻度は約 2時間間隔とし、それぞれ の点眼時間帯は 9時 30分前後（規定時間範囲: 9〜： 10時）、 11時 30分前後（規定時 間範囲: 11〜： 12時）、 13時 30分前後（規定時間範囲: 13〜： 14時）、 15時 30分前後（ 規定時間範囲: 15〜： 16時）とした。点眼期間は 28日間とした。
[0055] 眼科的検查は、点眼 1日、 7日、 14日、 21日及び 28日の最終点眼終了後、約 30 分から実施した。観察方法は、点眼処置の右眼と無処置の左眼について行い、水晶 体をスリットランプ（SL— 15、興和株式会社)を用いて観察した。 白内障程度の評価 は、 Cotlier(Arch Ophthalmol., (67) 476- 82,1962.の Fig. 1 - Development of galacto se cataract m the rat, showing Diomicroscopic rront and slit viewノの 準 (こ従レヽ、 ？?、 眼処置した右眼について、 1から 5まで 0. 5間隔の 9段階（スコア）評価で行った。な お、スリットランプで異常が認められなレ、場合の評価はゼロとした。
[0056] [表 6]
Figure imgf000022_0001
[0057] [結果]
(1)眼科的検査
眼科的検査により、各群の白内障程度を経時的に観察/評価した結果を表 7及び 図 4に示す (n=10、平均土標準誤差、表 7及び図 4参照）。
[0058] [表 7]
Figure imgf000022_0002
[0059] (A)媒体対照群、 （B)0. 1% 5— S— GAD点眼液群、 (C)l.0% 5— S— GAD点 眼液群 Wilcoxon検定による、各群と媒体対照群との有意差（* : pく 0.05、 ** : pく 0.01)
[0060] 媒体対照群では、点目艮 1日には糖白内障は 10例全例に観察されなかったが、点眼
7日では、軽度な糖白内障 (評点 1. 5〜2. 5)が 10例全例に見られた。点眼 14日で は、糖白内障は軽度から中程度（評点 3. 0〜4. 5)へと進行し、点目艮 21日では、重 度（評点 5. 0)例が 10例中 2例に認められ、残りの 8例では中程度であった。点眼 28 日では、 10例中 4例が重度な糖白内障を示し、残りの 6例は中程度を示し、点眼日 数すなわちガラクトース飼料での飼育日数の増加に伴って糖白内障の程度は進行し た。
[0061] 0. 1 % 5— S— GAD点眼液群では、点眼 21日以降に中程度の糖白内障例が出 現したが、点眼 28日まで重度な糖白内障を呈する例は出現しなかった。媒体対照群 との比較では、点眼 14日以降は評点は低値で推移し、点眼 14日（P = 0. 039)及び 点眼 28日（Ρ = 0· 002)に、いずれも有意差が認められた。
[0062] 1. 0% 5— S— GAD点眼液群では、 0. 1 % 5— S— GAD点眼液群とほぼ同様で あり、点眼 28日まで重度な糖白内障を呈する例は出現しなかった。媒体対照群との 比較では、点眼 14日以降は評点は低値で推移し、点眼 7日（P = 0. 017)、点眼 14 日（P = 0. 012)及び点眼 28日（P = 0. 001)に、いずれも有意差が認められた。
[0063] なお、 1. 0% 5— S— GAD点眼液群で得られた平均評点は、 0. 1 % 5— S— GA D点眼液群と比較して点眼 7日以降に低値であった。媒体対照群、 0. 1% 5 -S - GAD点眼群及び 1. 0% 5— S— GAD点眼群とも、いずれの例にも点眼期間中の 点眼前及び最終点眼後約 1時間に一般状態の異常は観察されなかった。
[0064] (2)病理解析
ガラクトース負荷白内障モデルにおける最終日（28日後）に眼球を摘出し、病理所 見を解析した。
[0065] [表 8] 白内 モデルラツトの病理解析結果
Figure imgf000024_0001
[0066] (A)媒体対照群、 （B) O. 1 % 5— S— GAD点眼液群、 (C) l . 0% 5— S— GAD点 眼液群 水晶体病理所見：一：変化なし、 ±：微変、 +：軽度変化、 2 +：中等度変化 、 3 + :著変
[0067] 上記病理所見から明らかなように、 N— β—ァラニル _ 5 _ S—グノレタチォニル一 3 , 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5- S-GAD)は、ガラクトース負荷によるラット白内 障モデルにおいて、病理上明らかな改善効果を示した。
[0068] 〔実施例 5〕DPPH消去活性
60 μ M DPPHエタノール溶液に、 5— S— GAD又はTEMP〇Lを最終濃度1〜1 000 μ Μとなるように添カロし、 5分間室温で反応させた後に、 DPPHラジカルの濃度 を 517nmにおける吸光度として測定した。被試験薬の代わりに PBS (―)を添加した 反応液の DPPHラジカル濃度をコントロールとした。実施例 2と同様にして、 DPPHラ ジカルの消去率（％)を算出し、ラジカルスカベンジャー活性とした（図 5参照）。 図 5に示すように、 N - ァラニルー 5— S グルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキ シフエ二ルァラニン（5— S— GAD)は、 TEMPOLと比較して優れた DPPHラジカル の消去作用を示した。
[0069] 〔実施例 6〕 DPPH消去活性
60 μ Μ DPPHエタノール溶液に、 5— S— GAD又は N—ァセチル一L—カルノシ ンを添カ卩し、 5分間室温で反応させた後に、 DPPHラジカルの濃度を 517nmにおけ る吸光度として測定した。被試験薬液の代わりに蒸留水を添加した反応液の DPPH ラジカル濃度をコントロールとした。実施例 2と同様にして、 DPPHラジカルの消去率 (%)を算出し、ラジカルスカベンジャー活性とした（図 6参照）。
図 6に示すように、 N - β—ァラニル _ 5 _ S—グルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキ シフエ二ルァラニン（5— S— GAD)は、 N—ァセチル一 L—カルノシンと比較して優 れた DPPHラジカルの消去作用を示した。
[0070] 〔実施例 7〕スーパーォキシドア二オン (O2— )消去活性作用
200 μ Μルシゲニン含有 50mM炭酸バッファー (pHIO)中で、 100 μ Mキサン チンと lmUZmLキサンチンォキシダーゼとを反応させ、産生されるスーパーォキシ ドア二オン依存の化学発光量を 10分間測定した。 10分間の化学発光総量を示す曲 線下面積を計算し、被試験薬液の代わりに同量の PBS (-)を添加した群をコントロー ノレとした。実施例 3と同様にして、 5-S-GAD又は N ァセチル一 L カルノシンを添 加して化学発光上昇に対する影響を検討し、その抑制活性をスーパーォキシドア二 オン消去活性（％)とした（図 7参照）。
図 7に示すように、 N- β ァラニルー 5— S グルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキ シフエ二ルァラニン（5— S— GAD)は、 N ァセチル - L—カルノシンと比較して優 れたスーパーォキシドア二オン (〇2_)消去作用を示した。
[0071] 〔実施例 8〕スーパーォキシドア二オン (02_)消去活性作用
50mMリン酸バッファー（ρΗ7· 8)中で、 500 μ Μキサンチンと 75mU/mLキサ ンチンォキシダーゼとを反応させ、産生するスーパーォキシドア二オン（〇2Ίをスピ ントラッピング剤（DMPO)を用いて電子スピン共鳴法 (ESR)で検出した。得られた 信号強度 (I)を内部標準のマンガンの信号強度（S)で規格化した値を相対強度比 (R elative Intensity : RI)として求め、薬剤添加時の値を PBS添加時と比較した。 ESRの 測定条件は以下の通りである。 MicroWavePower 8mW; Field 335± 5mT; Scan Time 2min; Mod. O.lmT; Amplitude X 125—400; Time Constant 0.03 sec.
図 8に示すように、 Ν- β—ァラニル _ 5_ S—グルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキ シフエ二ルァラニン（5 _ S— GAD)は、 TEMPOLと比較して優れたスーパーォキシ ドア二オン (o2_)消去作用を示した。
[0072] 〔実施例 9〕血管新生抑制作用
100ng/mLの VEGFを含んだマトリゲルプラグに 5— S— GADを添加し、 C57BL Z6の雌マウスに注射した。 6日後、マトリゲルプラグを切り出し、マトリゲル中のへモ グロビン含有量を定量した。結果は平均値と標準誤差で示した。 Studentの t検定に より、検定を行った（* Ρ< 0· 05)。 図 9に示すように、 5— S— GADは 40 μ Μで、 VEGF惹起による血管新生を有意 差（Ρく 0. 05)をもって抑制した。
[0073] 〔実施例 10〕血管新生抑制作用
産卵 5日目の鶏卵胚漿尿膜に直径 3mmのリングを置き、 1 %メチルセルロースで希 釈した薬剤を 10 a Lリング内に添加した。 37°Cで 48時間インキュベーションした後、 漿尿膜に脂肪乳剤を注入し、リングを除去した部分を写真撮影した。画像解析ソフト (クラボウ）を用いて血管面積を測定した。
図 10に示すように、 5— S— GADは血管新生を有意差（* P< 0. 05, * * P< 0. 01)をもって抑制した。
[0074] 〔実施例 11〕ヒト血液中 LDLの酸化反応に対する効果
LDLの調製は、分画遠心法を用いて血清中 1. 019〜： 1. 063g/mLの比重分画 をヒト LDLとした。 0. 2mg/mL LDLに 5 /i M CuS〇と、 5— S— GAD (3〜： 100 μ
4
Μ)、 Ν—ァセチルーカルノシン（100 μ Μ〜： !OmM)又は L—カルノシン（10 μ Μ〜 10mM)とを添加し、 37°Cで 3時間インキュベートした。インキュベーション終了後、 T BARS (チォバルビツール酸反応性物質）を測定した。 TBA反応は非特異的な反応 であるが、マロンジアルデヒドをはじめとする種々の脂質過酸化生成物を検出する方 法である。硫酸銅による過酸化反応実験は N = 2で 2回行った。
3. 75mg/mLチォバルビツール酸（Thiobarbituric acid ; TBA) , 150mg/mL トリクロ口酢酸（Trichloroacetic acid ;TCA)及び 0. 25N塩酸（Hydrochloric acid ; H CI)を含む水溶液を TBA試薬として調製するとともに、標準液としてテトラメトキシプロ パン（2， 5, 10, 20, 40 μ Μ)を調製し、エツペンドルフチューブ（1. 5mL)中に LD Lサンプル又は標準液各 100 μ Lと TBA試薬を 200 μ Lとを添カロし、キャップをしてよ く混和した。 95°Cで 15分間加熱した後、水冷し、 3000rpmで 5分間遠心した。上清 の吸光度（535nm)を測定した。標準液の吸光度から検量線を作成し、検量線に基 づいて LDLサンプルの TBARS量（nmol/mg LDL protein)を計算した（図 11参 照）。
図 11に示すように、 N— β—ァラニル _ 5_ S—グルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキ シフエ二ルァラニン（5— S— GAD)は、 N—ァセチルーカルノシン及び L—カルノシ ンと比較して優れた抗酸化作用を示した。

Claims

請求の範囲
次式 (I)
Figure imgf000028_0001
[式中、 R1は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R2は水素原子又は次式 (Π) [化 2]
Figure imgf000028_0002
[式中、 R3は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R4は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]
で表される基を表す。但し、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]
で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有するラジカルスカベンジャー。
[2] 前記 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5— S—グ ルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニンである請求項 1記載のラジカルス 力ベンジャー。
[3] 次式 (I) :
[化 3]
Figure imgf000029_0001
[式中、 R1は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R2は水素原子又は次式 (Π)： [化 4]
Figure imgf000030_0001
[式中、 R3は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R4は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]
で表される基を表す。但し、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]
で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する活性酸素消去剤。
[4] 前記 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5— S—グ ルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニンである請求項 3記載の活性酸素 消去剤。
[5] 次式 (I) :
[化 5]
Figure imgf000031_0001
[式中、 R1は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R2は水素原子又は次式 (Π) [化 6]
Figure imgf000031_0002
[式中、 R3は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R4は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]
で表される基を表す。但し、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]
で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する抗酸化剤。
[6] 前記 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5— S—グ ルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニンである請求項 5記載の抗酸化剤
[7] 次式 (I) :
[化 7]
Figure imgf000032_0001
[式中、 R1は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R2は水素原子又は次式 (Π)： [化 8]
Figure imgf000032_0002
[式中、 ITは水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R4は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]
で表される基を表す。但し、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]
で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する、フリーラジカル又は活性酸素に起因する疾患又は症 状の予防 ·治療剤。
[8] 前記 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5— S—グ ルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニンである請求項 7記載の予防'治療 剤。
[9] 次式 (I) :
[化 9]
Figure imgf000033_0001
[式中、 R1は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R2は水素原子又は次式 (Π) [化 10]
Figure imgf000034_0001
[式中、 R3は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R4は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]
で表される基を表す。但し、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]
で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する眼科用医薬組成物。
[10] 前記 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5— S—グ ルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニンである請求項 9記載の眼科用医 薬組成物。
[11] 次式 (I) :
[化 11]
Figure imgf000035_0001
[式中、 R1は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R2は水素原子又は次式 (Π)： [化 12]
Figure imgf000035_0002
[式中、 R3は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R4は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]
で表される基を表す。但し、 R1及び R2のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]
で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する臓器保存又は灌流用組成物。 前記 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N- β—ァラニル _5_S—グ ルタチォニル _3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニンである請求項 11記載の臓器保 存又は灌流用組成物。
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