KR101587609B1

KR101587609B1 - 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 신규한 안약 제형

Info

Publication number: KR101587609B1
Application number: KR1020140149567A
Authority: KR
Inventors: 김응권; 황성주; 김현도; 최승일; 안준현; 진수언
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-01-22

Abstract

본 발명은 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 안구 투여(ocular administration)용 액상 제제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 멜라토닌과 특정 구조의 사이클로덱스트린이 특정 조성비를 이룸으로써 약리활성 성분인 멜라토닌에 의한 안구 자극이 크게 감소하여 투약 순응도가 향상되며, 안정성 및 보존성이 유의하게 개선되었다. 본 발명의 조성물은 병변부위에 멜라토닌의 치료적 유효량을 효율적으로 전달하기 위한 안구 투여용 액상 제형으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

베타-사이클로덱스트린을 포함하는 신규한 안약 제형{Novel Ophthalmic Formulations Comprising beta-Cyclodextrin}

본 발명은 멜라토닌과 β-사이클로덱스트린을 특정 비율로 포함하여 안정성, 보존성 및 투약 순응도가 향상된 신규한 안약 제형에 관한 것이다.

과립형 각막이상증 2형(GCD2 혹은 아벨리노 각막이상증)은 5q31 염색체 상의 TGFBI(transforming growth factor-β-induced) 유전자의 점돌연변이(R124H)에 의해 발생하는 상염색체 우성 질환이다[1]. 결과적으로, 124번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환되어(Arg124His) 비정상적인 케라토에피텔린이 히알린(hyaline)과 함께 각막에 축적된다[1-3]. 축적의 결과, 각막은 투과성을 점차 상실하고 연령이 증가함에 따라 이러한 증상이 심각해진다[4, 5]. 질환 초기에, 투명한 경계를 가지는 과립의 축적이 각막 상피 뒷부분 및 각막 기질 앞부분에서 관찰되고, 질환이 진행될수록 과립 또는 격자형의 축적이 각막 기질의 중간부 또는 뒷부분에서 형성된다[6]. GCD2의 발병 기작에 대해 다양한 가설이 존재한다. Akiya 등[7]에 따르면, GCD2에서의 각막 축적물은 각막 상피세포에서 유래한다고 보고한 반면, Kim[7] 등은 광굴절 각막절제술을 받은 환자의 활성화된 기질세포의 손상에 기인한다고 보고하였다.

멜라토닌은 모든 척추동물의 송과선(pineal gland)에서 분비되는 호르몬으로[9], 수면 주기의 조절, 항-염증 반응, 항암 작용, 항산화 안압(intraocular pressure, IOP) 감소 등과 같은 다양한 생리적 기능의 조절에 관여한다[10-15]. 멜라토닌의 화학구조는 다음과 같다:

멜라토닌의 기능에 기반하여, 멜라토닌의 투여는 mTOR-의존성 경로를 통해 자식작용(autophagy)을 유도하여 GCD2 각막 섬유아세포에서 변이 TGFBI 단백질(TGFBIp)을 제거한다[16].

포유류에서, 멜라토닌은 두 개의 상이한 아형의 G 단백질 결합 수용체인 MT₁ 및 MT₂에 작용함으로써 다양한 기능을 수행한다[17]. 아울러, 또 다른 멜라토닌 수용체 아형인 MT₃가 동정되었으며[18]. 이들 3가지 멜라토닌 막 수용체 아형은 망막, 홍채, 수정체 및 각막을 포함하는 안구 조직에 존재한다[21]. 특히, 인간 각막의 상피세포층에는 MT₁가 존재한다[21]. 이러한 사실에 기초하여, 멜라토닌을 안구질환 치료에 사용하고자 하는 임상적 시도들이 있어왔다[22-24]

사이클릭 올리고사카라이드라고도 불리우는 사이클로덱스트린(CD)은 약 100여년 전 발견되었다. CD는 약제학적 활성 성분(API), 효소 모델 등을 위한 용해제(solubilizers), 크로마토그래피 또는 배치(batch) 과정에서의 분리용 물질, 촉매 또는 점도 조절제 등의 용도로 사용되어 왔다[25].

안과 의약품의 제형(formulation)으로 사용하기 위한 신규한 담체(vehicle)의 중요한 전제 조건은, 상기 담체가 안구 표면에 자극을 주어서는 안된다는 것이다. 이는 이러한 자극은 눈물과 눈 깜박임을 유도하여 주입된 약물을 씻어내기 때문이다[26].

α-CD, β-CD 및 γ-CD의 세가지 타입의 CD 및 이들의 유도체가 알려져 있다.

사이클로 덱스트린의 특성

특성	α-CD	β-CD	HPβCD	γ-CD
글루코피라노즈 유닛수	6	7	7	8
분자량 (g/mol)	972	1135	1250-1480	1297
25℃ 물에서의 용해도(mg/mL)	14.5	1.85	>60	23.2
외부 직경 (Å)	14.6	15.4	15.4	17.5
내부 직경 (Å)	4.7-5.3	6.0-6.5	6.0-6.5	7.5-8.3
토러스 높이 (Å)	7.9	7.9	7.9	7.9
공동(Cavity) 부피(Å³)	174	262	262	427

현재까지, 상용화된 GCD2 치료제는 존재하지 않으며, 이에 GCD2의 증상을 완화 및 개선하기 위한 의약의 개발이 절실히 요구된다. 본 발명자들의 선행연구에서 멜라토닌이 GCD2 치료를 위한 유망한 후보물질이 될 수 있음이 제안되었으나, 멜라토닌 안약(eyedrops)의 개발에는 여러 난점이 존재한다. 첫째로, 래빗의 안구를 이용한 예비실험에서 포화 농도에서의 심각한 안구 자극이 관찰되었다. 다음으로, 안약의 가장 일반적인 pH 값인 pH 7.4에서, 상온(20℃) 및 37℃의 수용액에서 멜라토닌 안정성이 매우 낮았다[28]. 이에, 멜라토닌의 눈 자극을 감소시키고 임상적 사용에 있어서의 멜라토토닌의 안정성을 개선시켜 궁극적으로 멜라토닌이 각막으로 치료학적 농도로 전달될 수 있도록 하는 효율적인 제형의 개발이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록 제1370659호

본 발명자들은 자식작용(autophagy)을 유도하여 각막 섬유아세포에서의 변이 TGFBI 단백질(TGFBIp)을 제거하는 멜라토닌의 임상적 적용을 위하여, 눈에 대한 자극이 적고 안정성이 뛰어나며 보존성이 우수한 멜라토닌의 안구 투여용 액상 제제 조성물을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 멜라토닌과 특정 구조의 사이클로덱스트린이 특정 조성비를 이루는 경우 멜라토닌의 안구 자극이 크게 감소하여 투약 순응도가 향상되며, 안정성 및 보존성이 유의하게 개선되어 궁극적으로 병변부위에 멜라토닌의 치료적 유효량을 효율적으로 전달하기 위한 최적의 안구 투여용 액상 제형으로 적용될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 안구 투여(ocular administration)용 액상 제제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 안구 투여(ocular administration)용 액상 제제 조성물을 제공한다:

(a) 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및

(b) 상기 멜라토닌과의 몰비율이 4:6 - 6:4인 다음의 화학식 1로 표시되는 화합물:

화학식 1

상기 화학식 1에서, R₁-R₂₁은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록시 C₁-C₅알킬이며, 상기 R₁-R₂₁중 수소인 것은 14개 미만이다.

본 발명자들은 자식작용(autophagy)을 유도하여 각막 섬유아세포에서의 변이 TGFBI 단백질(TGFBIp)을 제거하는 멜라토닌의 임상적 적용을 위하여, 눈에 대한 자극이 적고 안정성이 뛰어나며 보존성이 우수한 멜라토닌의 안구 투여용 액상 제제 조성물을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 멜라토닌과 특정 구조의 사이클로덱스트린이 특정 조성비를 이루는 경우 멜라토닌의 안구 자극이 크게 감소하여 투약 순응도가 향상되며, 안정성 및 보존성이 유의하게 개선되어 궁극적으로 병변부위에 멜라토닌의 치료적 유효량을 효율적으로 전달하기 위한 최적의 안구 투여용 액상 제형으로 적용될 수 있음을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 멜라토닌의 안구 투여용 제제에 멜라토닌과 상기 화학식 1로 표시되는 사이클로덱스트린이 4:6 - 6:4의 몰비율로 포함될 경우 대상체의 안구 자극이 유의하게 감소되며, 안정화 상수(K_1:1) 및 CE(complexation efficiency)가 크게 개선되고, 각막으로 전달된 멜라토닌이 모든 조직(상피, 기질 및 내피)에서 높은 함량으로 유지됨을 관찰함으로써 본 발명의 제형이 멜라토닌에 의한 치료 효율성을 극대화시킨다는 것을 다각적으로 확인하였다.

본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 약리성분(예를 들어 멜라토닌)을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 추출물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 용어“알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 등을 포함한다. C₁-C₅알킬은 탄소수 1 내지 5의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미한다.

본 발명의 멜라토닌은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다.

구체적으로는, 멜라토닌의 약제학적 허용 가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 젖산염, 주석산염, 말레인산염, 푸마린산염, 글루콘산염, 메탄설폰산염, 글리콘산염, 숙신산염, 4-톨루엔설폰산염, 글루투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 또는 아스파트산염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함된다. 또한, 본 발명의 멜라토닌은 용매화물(예를 들면 수화물)의 형태로도 존재할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 R₁-R₂₁은 수소 또는 2-하이드록시 프로필이며, 상기 R₁-R₂₁중 수소인 것은 7개 미만이다.

보다 구체적으로는, 상기 화학식 1의 R₁-R₂₁은 2-하이드록시 프로필이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 몰비율은 4.5:5.5 - 5.5:4.5이며, 보다 구체적으로는 1:1이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 TGFBIp(TGF beta induced protein) 유전자 변이 각막 이상증(corneal dystrophy)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어“TGFBIp 유전자 변이 각막 이상증”은 TGFBIp 유전자 변이에 의해 변이 TGFBIp 단백질이 각막에 축적됨으로써 각막 중심에 혼탁이 발생하여 시력이 상실되는 질환을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a)질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b)질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c)질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 자식작용을 유도하여 각막 섬유아세포에 축적된 변이 TGFBI 단백질을 제거함으로써 TGFBIp 유전자 변이를 원인으로 하는 질환 또는 이의 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 TGFBIp 유전자 변이 각막 이상증의 안구 투여용 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 약리성분과 함께 투여되어 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서, 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증은 아벨리노(Avellino type) 각막이상증, 라이스-뷔클러(Reis-Bucklers type) 각막이상증, 격자(lattice type) 각막이상증, 과립(granular type) 각막이상증, 티엘-벵케(Thiel-Behnke type) 각막이상증, 상피기저막(epithelial basement membrane) 각막이상증 및 그로에노우브(Groenouw type) 각막이상증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이들 각막 이상증은 TGFBIp 단백질의 아미노산 서열 중 변이가 생긴 위치에 따라 다양한 표현형을 나타내는 관계로 상기와 같이 분류된 것이지만, 단백질의 컨포메이션 변화로 인해 변이 TGFBI 단백질이 정상적으로 분비 또는 분해되지 못하여 각막에 축적되어 발생하는 질병이라는 점에서 그 발병 원인이 동일하다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증은 TGFBIp 단백질에 R124H, R124C, R555W, R555Q, I522N, N544S, M619K, F547S, A546D, V625D, G623D, V505D, P551Q, L558P, V624M, H626P, L173P, H572R, T538P, H572del, L527R, L569R, H626R, R124L, T125del, E126del 및 R124S로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변이가 일어난다.

예를 들어 R124H는 정상 TGFBIp 단백질을 구성하는 아미노산 중 124번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 변이를 의미하고, R124C는 124번째 아르기닌이 시스티딘으로 치환된 변이를 의미하며, 또한 H572del는 572번째 히스티딘이 결여된 변이를 의미한다. 상기 열거한 아미노산의 변이 이외에도 지금까지 총 38개의 다른 TGFBI 유전자 변이가 보고되고 있으며, 이들 모두는 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되는 유전적 소인의 안과적 난치성 질환이라는 점에서 발병원인이 공통된다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증은 TGFBIp 단백질에 R124H의 아미노산 변이가 일어난다. R124H 변이는 아벨리노 각막이상증(제2형 과립형 각막이상증)을 유발하는 아미노산 변이이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제,유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 예를 들어 0.0001-10 mg/㎏(체중)으로 투여할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 안구 투여(ocular administration)용 액상 제제 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 멜라토닌과 특정 구조의 사이클로덱스트린이 특정 조성비를 이룸으로써 약리활성 성분인 멜라토닌에 의한 안구 자극이 크게 감소하여 투약 순응도가 향상되며, 안정성 및 보존성이 유의하게 개선되었다.

(c) 본 발명의 조성물은 병변부위에 멜라토닌의 치료적 유효량을 효율적으로 전달하기 위한 안구 투여용 액상 제형으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 Higuchi 및 Conors(1965)에 따른 복합체의 상-용해도 특성 및 그 분류 결과를 보여주는 그림이다. S₀는 액상 복합체에서 기질(약물)의 고유 용해도, 즉 말해 리간드(예를 들어 CD)가 없을 때의 용해도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 이용된 Franz 확산 세포의 모식도를 나타낸 그림이다(Logan Instrument Corp.의 사용자 설명서).
도 3은 1000 ng/mL 멜라토닌 용액에 대한 크로마토그램을 보여주는 그림이다.
도 4는 500 ng/mL 멜라토닌 용액에 대한 크로마토그램을 보여주는 그림이다.
도 5는 15.6 ng/mL 멜라토닌 용액에 대한 크로마토그램을 보여주는 그림이다.
도 6은 7.8 ng/mL 멜라토닌 용액에 대한 크로마토그램을 보여주는 그림이다.
도 7은 Blank의 크로마토그램을 보여주는 그림이다.
도 8은 멜라토닌 농도(n=3)에 기초한 교정곡선(Calibration curve)을 보여주는 그래프이다.
도 9는 다양한 농도의 α-CD에서의 멜라토닌 용해도를 나타낸 그림이다.
도 10은 다양한 농도의 β-CD에서의 멜라토닌 용해도를 나타낸 그림이다.
도 11은 다양한 농도의 HP-β-CD에서의 멜라토닌 용해도를 나타낸 그림이다.
도 12는 다양한 농도의 γ-CD에서의 멜라토닌 용해도를 나타낸 그림이다.
도 13은 라토닌/HPβCD 복합체에 대한 Job의 연속변형 플롯을 보여주는 그래프이다.
도 14는 F1 및 F6에서 투과된 멜라토닌의 누적 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 15는 3개 세포주에서 F12-F15에 의한 인 비보에서의 멜라토닌의 각막 내 유지(함량)을 보여주는 그림이다.
도 16은 Solvable에서 멜라토닌의 안정성을 나타낸 그림이다.
도 17은 상온에 보관된 S1-S8의 pH 값을 나타낸 그림이다.
도 18은 4℃에 보관된 S1-S8의 pH 값을 나타낸 그림이다.
도 19는 상온에 보관된 S1-S8의 삼투질 농도를 나타낸 그림이다.
도 20은 4℃에 보관된 S1-S8의 삼투질 농도를 나타낸 그림이다.
도 21은 상온에 보관된 S1-S8의 멜라토닌 함량(%)을 나타낸 그림이다.
도 22는 4℃에 보관된 S1-S8의 멜라토닌 함량(%)을 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험재료

멜라토닌은 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd(Japan)에서 구입하였다. 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(HPβCD)은 Alfa Aesar(USA) 및 Sigma Aldrich(USA)에서 구입하였다. α-사이클로덱스트린(Sigma Aldrich, USA), β-사이클로덱스트린(Sigma Aldrich, USA), γ-사이클로덱스트린(Sigma Aldrich, USA), 소듐 포스페이트 이염 무수물(Samchun Pure Chemicals Co. Ltd, Korea), 소듐 포스페이트 단염 탈수물(Samchun Pure Chemicals Co. Ltd, Korea), 소듐 포스페이트 단염 무수물(Duksan Pure Chemicals, Korea), 소듐 클로라이드(Samchun Pure Chemicals Co. Ltd, Korea), 포타슘 클로라이드(Samchun Pure Chemicals Co. Ltd, Korea), 칼슘 클로라이드 탈수물(Duksan Pure Chemicals, Korea), Solvable(PerkinElmer, INC., USA), 투석막(분자량 컷오프 12,400 Da, Sigma Aldrich, USA)를 실험에 사용하였다. 용액들은 0.2μm 포어 크기를 가지는 PVDF 주사기 필터(Whatman International Ltd)로 여과하였다. 그 밖의 모든 화합물은 분석용 등급을 사용하였으며, 정제수는 Milli-Q 품질(Milli-Q Reference, Millipore, Molsheim, France)을 사용하였다.

HPLC

HPLC는 Agilent-HPLC 시스템 1200 인피니티 시리즈(Agilent Technologies, Germany)를 이용하여 수행하였다. 시스템은 펌프(Model 1260 Quat Pump VL), 자동 샘플러(Model 1260 ALS), 컬럼 히터(Model 1260 TCC) 및 형광 검출기(Model 1260 FLD)로 구성되어 있다. 크로마토그래프 분리를 Kromasil C8 컬럼(250ⅹ4.6mm i.d., 5-μm 입자크기, 100-포어 크기)에서 수행하였다. 컬럼은 AkzoNobel에서 구입하였으며, 컬럼 온도는 22℃로 유지하였다. 이동상은 60:40 HPLC-grade 메탄올-물이며 0.6mL/min의 유속으로 펌핑하였다. 여기(excitation) 및 발광(emission) 파장은 각각 286 및 352 nm로 세팅하였다. 용리(eluent)는 증류수 내 10μl 멜라토닌 표준용액을 주입한 뒤 286 및 352 nm에서 모니터링하였다.

사이클로 덱스트린의 스크리닝

다양한 사이클로덱스트린(CD)에서의 멜라닌 용해도 분석

액상 제형에 적합한 사이클로덱스트린(CD)을 탐색하기 위하여, 다양한 CD(α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린)에서의 멜라토닌 용해도를 측정하였다. 과량의 멜라토닌을 2 mL Milli-Q 워터 내에 다양한 농도의 CD를 함유한 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 파라필름(Parafilm)으로 상부를 덮음으로써 증발을 방지하였다. 모든 시료는 25℃에서 200 rpm으로 3일간 배양한 뒤 평형을 이룰 때 까지 24시간 동안 상온에서 보관하였다. 시료들은 빛으로부터 차단시켰으며, 평형에 도달한 후 각 시료는 0.2μm PVDF 주사기 필터(whatmam intermational Ltd)로 여과하고, Milli-Q 워터로 희석한 뒤 HPLC로 멜라토닌의 농도를 측정하였다.

안정화 상수(K _1:1 ) 및 CE(complexation efficiency)의 계산

안정화 상수(K_1:1) 및 CE(complexation efficiency)의 계산은 Higuchi 및 Connors(1965)[33]의 방법에 따라 수행하였다. Higuchi-Conor의 복합체는 상 용해도 다이아그램-예를 들어 용질 분자(예를 들어 약물)의 용해도가 용해된 리간드(예를 들어 CD)의 농도가 증가함에 따라 얼마나 명확히 변화하는가-에 기반하여 분류된다(도 4).

(1)

이러한 조건에서 기울기를 가지는 A_L-형 상-용해도 다이아그램을 관찰하고 기울기 및 약물의 고유 용해도(S₀)(즉, CD가 없을 때의 약물 용해도)로부터 안정화 상수를 계산할 수 있다.

(2)

1:1 약물/CD 복합체에 대하여, CE(complexation efficiency)는 상-용해도 다이아그램의 기울기로부터 계산할 수 있다[34]:

(3)

HPβCD 기반 멜라토닌 제형의 제작

HPβCD 기반 멜라토닌 용액을 다음과 같이 제작하였다. 우선, 멜라토닌을 PBS에 용해시켰다(용액 A). 다음으로, 멜라토닌에 대해 다양한 몰분율을 가지는 HPβCD를 PBS에 용해시켰다(용액 B). 이들 용액을 각각 균질 상태가 될 때까지 자성 막대로 교반하였다. 균질 혼합물을 육안 관찰을 통해 골라내었으며, 각각의 용액 A 및 B의 균질용액을 수득한 뒤 이들을 혼합하였다. pH는 포스페이트 비율을 통해 국소 투여에 적합한 7.4로 조절하였다. 삼투질 농도(osmolarity)는 약 290 mOsm(일반 염의 삼투농도)로 조절하였다. 제형은 이후 0.2μm 포어 크기를 가지는 PVDF 필터로 여과하였다. 제형은 전형적인 조성은 표 2에, 각 제형은 pH는 표 3에 표시하였다.

HPβCD 기반 멜라토닌 용액의 조성 (%, w/v)

	F1	F2	F3	F4	F5	F6	F7	F8	F9	F10	F11
멜라토닌	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	-
HPβCD	-	0.033	0.074	0.126	0.196	0.294	0.440	0.686	1.175	2.644	-
PBS	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s
R	1.0	0.9	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	0

HPβCD 기반 멜라토닌 용액의 pH, 삼투질 농도(평균±표준편차 n=3)

	pH	삼투질 농도	R
F1	7.3 ± 0.006	290.7 ± 0.58	1.0
F2	7.37 ± 0.006	291.3 ± 0.58	0.9
F3	7.36 ± 0.012	290.7 ± 0.58	0.8
F4	7.36 ± 0.012	291.0 ± 1.00	0.7
F5	7.37 ± 0.006	291.7 ± 0.58	0.6
F6	7.36 ± 0.01	291.3 ± 0.58	0.5
F7	7.36 ± 0.012	291.7 ± 1.15	0.4
F8	7.35 ± 0.006	291.7 ± 0.58	0.3
F9	7.36 ± 0.006	291 ± 1.00	0.2
F10	7.36 ± 0.012	292.7 ± 0.58	0.1
F11	7.36 ± 0.006	290.7 ± 0.58	0.0

화학양론의 결정: Job의 방법

복합체의 화학양론을 확인하기 위하여 계속적인 변형을 수행하였다. 양 구성성분의 농도 합은 일정하게 유지한 반면([멜라토닌] + [CD] = 3.4×10 M), 멜라토닌의 몰분율(R = [멜라토닌 / [멜라토닌] + [CD])은 0.0에서 1.0까지 다양하게 변화시켰다. 배양 쉐이커에서 25℃ 200 rpm으로 48시간 동안 교반한 뒤에 모든 시료를 평형에 도달할 때까지 24시간 동안 보관하였다. 평형 과정동안 시료를 차광시켰으며, 평형에 도달한 뒤 여기 및 발광 파장이 각각 286 nm 및 352 nm로 하여 형광을 검출하였다. CD의 존재(A) 및 부재(A₀)하의 흡광도 차이(ΔA=AA₀)를 몰 분율 R에 대해 그래프를 그렸다. 복합체의 최대값은 화학양론 비율에서 나타나야 한다.

인 비투로 투과 실험

Franz 확산 세포 분석

투과 분석은 15 mm 구멍 및 1.77 cm²면적을 가지는 Franz 확산 세포(Semi-Automated Franz Diffusion Cell Drive Console System, Model FDC-6T, Logan Instruments Corp., USA)를 이용하여 Aksungur et al.(2012)의 방법에 따라 수행하였다(도 5). 12,400Da의 분자량 컷오프를 가지는 투석 튜브 셀룰로오즈 막(D9777-100FT, Sigma-Aldrich Inc., USA)을 사용하였다. Franz 확산 세포에 마운팅하기 전에 막을 SLF(stimulated lacrimal fluid)에 24시간 동안 담구었다. 1L Milli-Q 워터에 8.3g NaCl, 0.084g CaCl₂·2H₂O, 1.4g KCl를 용해시켜 SLF를 제작하였으며, 12mL SLF를 각각의 세포의 여섯 개의 수용부에 위치시키고 온도의 안구 표면과 같은 32℃로 유지하였다. 교반 속도는 실험 전반에 걸쳐 300rpm으로 일정하게 유지하였다(각각의 멜라토닌 용액을 적절하게 희석하여 실험 전 전체 조성을 HPLC로 분석하였다). 2 ml 부피의 각 시료를 공여부에 조심스럽게 위치시켰다. 일정한 시간 간격으로 1 mL 시료를 HPLC 분석을 위해 꺼내고 동일한 부피의 SLF 용액을 즉시 채워 넣었다.

유속(J) 및 투과 계수(P)의 계산

유속은 단위면적 및 단위시간 당 막을 투과한 약물의 양으로 정의될 수 있다. 제형의 유속은 기울기(dM/dt) 및 약물에 노출된 막 면적(A)으로부터 계산할 수 있다. M은 막을 통과한 약물의 양을 나타낸다.

(4)

이후, 투과 계수는 유속으로부터 구할 수 있다.

(5)

C_d는 공여 농도이다.

인 비보 연구

시료의 제작

두 개의 다른 제형 F1 및 F6(표 2)를 인 비보 실험에 이용하였다. 멜라토닌의 눈 자극 및 HPβCD에 의한 눈 자극의 감소를 관찰하기 위하여 두배 농도의 멜라토닌 및 HPβCD를 함유하는 제형(F1 및 F6)을 제작하였다. 안구 자극 실험에 사용된 각 제형들의 조성은 표 4, 각 제형들의 pH 및 삼투질 농도는 표 5에 각각 나타내었다.

안구 자극 실험에 사용된 HPβCD 기반 멜라토닌 용액의 조성(%, w/v)

	F1	F6	F12	F13
멜라토닌	0.05	0,05	0.1	0.1
HPβCD	-	0.294	-	0.588
PBS	q.s	q.s	q.s	q.s
R	1.0	0.5	1.0	0.5
Concⁿ(mg/mL)	0.5	0.5	1.0	1.0

안구 자극 실험에 사용된 제형의 pH 및 삼투질 농도(평균±표준편차, n=3)

	F1	F6	F12	F13
pH	7.37 ± 0.00	7.36 ± 0.011	7.37 ± 0.006	7.37 ± 0.006
삼투질농도	290.3 ± 0.58	290.7 ± 0.58	290 ± 1.00	290.3 ± 0.58
R	1.0	0.5	1.0	0.5
Conc ⁿ (mg/mL)	0.5	0.5	1.0	1.0

안구 자극 시험

1.5 kg, 9주령의 건강한 암컷 알비노 래빗 12마리를 Samtako Biokorea, Inc에서 구입하였다. 모든 처리 및 실험은 연세대학교 동물실험 윤리위원회의 지침을 준수하여 수행하였다. 모든 래빗은 표준 케이지에서 한 마리씩 표준 온도(19±1℃), 습도(50-60%) 및 광조건(12h 명-암) 하에서 길러졌으며 음식과 물에 제한을 두지 않았다. 동물들을 4 그룹으로 나누었는데, 각 그룹은 최소 3마리로 구성되었다. 각 개체의 오른쪽 눈을 실험군으로, 왼쪽 눈을 대응 대조군으로 하였다. 첫 번째 군은 오른쪽 눈에 40μl F1 제형을, 왼쪽 눈에 40μl 컨트롤을 8:00 a.m., 1:00 p.m., 6:00 p.m. 및 11:00 p.m.에 주입하였다. 두 번째 군은 오른쪽 눈(test eye)에 40μl F2 제형, 왼쪽 눈에 컨트롤을 8:00 a.m., 1:00 p.m., 6:00 p.m. 및 11:00 p.m.에 주입하였다. 세 번째 군은 오른쪽 눈(test eye)에 40μl F9 제형, 왼쪽 눈에 컨트롤을 8:00 a.m., 1:00 p.m., 6:00 p.m. 및 11:00 p.m.에 주입하였다. 네 번째 군은 오른쪽 눈(test eye)에 40μl F10 제형, 왼쪽 눈에 컨트롤을 8:00 a.m., 1:00 p.m., 6:00 p.m. 및 11:00 p.m.에 주입하였다. 자극의 정도는 동물의 증상 및 각막, 홍채 및 결막에서의 징후를 통해 변형된 Friedenwalds 및 Draize 방법[35]에 따라 평가하였다(표 6).

변형된 Friedenwald 및 Draize 방법, 총점 범위: 0~110 (Kirk R. Wilhelmus, Surv Ophthalmol. 45, (6), (2001)

평가	점수
각막
A. 조밀한 부위의 불투명 정도(가장 고밀도 부위를 측정)
흩어지거나 확산된 면적; 홍채가 명확하게 보임	1
반투명 면적이 쉽게 식별됨; 홍채가 조금 가려짐	2
유백광 면적; 관찰가능한 홍채, 동공의 크기가 거의 식별되지 않음	3
불투명; 홍채가 보이지 않음	4
B. 해당 각막의 면적
0 초과 1/4 이하	1
1/4 초과, 절반 미만	2
절반 초과, 3/4 미만	3
3/4 초과에서 전체 면적까지	4
점수 = A X B X 5 (범위는 0-80)
홍채
A. 값
정상에 비해 충혈, 팽창 및/또는 각막주위 충혈 정도(Folds above normal); 홍채가 여전히 빛에 반응함(느린 반응이 양성)	1
빛에 반응하지 않음, 출혈 및/또는 전체적인 손상	2
점수 = A X 5 (범위는 0-10)
결막
A. 눈꺼풀 결막의 붉은기(redness)
혈관이 정상에 비하여 명확히 충혈됨	1
보다 확산되고, 진한 심홍색의 붉은색; 각각의 혈관을 쉽게 식별할 수 없음	2
붉은 쇠고기 색(beefy red)이 확산	3
B. 결막수종(Chemosis)
정상 이상으로 팽창[순막(nictitating membrane)포함]	1
눈꺼풀이 뒤집히면서 명확히 팽창	2
눈꺼풀이 반쯤 닫히며 팽창	3
눈꺼풀이 반쯤에서 모두 닫히며 팽창	4
C. 방출(Discharge)
정상에서 벗어난 모든 양(amount)	1
눈꺼풀 및 부근의 눈썹이 촉촉해지면서 방출됨	2
눈꺼풀 및 눈 부근의 상당 부위가 촉촉해지면서 방출됨	3
점수 = (A + B + C) X 2 (범위는 0-20)
총점= 각막, 홍채 및 결막에서 획득한 점수를 모두 합산

생체 내 각막에서의 멜라토닌의 유지

멜라토닌을 검출하기 위하여, F1 및 F5의 멜라토닌 및 HPβCD 농도를 2배에서 4배로 증가시키고 이들 제형을 F12, F13, F14 및 F15로 명명하였다. 각 제형의 조성은 표 7에, 이들의 pH와 삼투질 농도는 표 8에 각각 나타내었다.

각막 내 멜라토닌 함량 분석에 사용된 HPβCD 기반 멜라토닌 용액의 조성(%, w/v)

	F12	F13	F14	F15
멜라토닌	0.1	0.1	0.2	0.2
HPβCD	-	0.588	-	1.175
PBS	q.s	q.s	q.s	q.s
R	1.0	0.5	1.0	0.5
농도ⁿ(mg/mL)	1.0	1.0	2.0	2.0

각막 내 멜라토닌 함량 분석에 사용된 HPβCD 기반 멜라토닌 용액의 pH 및 삼투질 농도(평균 ± 표준편차, n=3)

	F12	F13	F14	F15
pH	7.37 ± 0.006	7.37 ± 0.006	7.36 ± 0.010	7.38 ± 0.006
삼투질 농도	290 ± 1	290.3 ± 0.58	290.7 ± 0.58	290.7 ± 1.15
R	1.0	0.5	1.0	0.5
농도ⁿ(mg/mL)	1.0	1.0	2.0	2.0

1.5kg의 9주령인 건강한 암컷 알비노 래빗을 Samtako Biokorea Inc.에서 구입하였다. 모든 처리 및 실험은 연세대학교 동물실험 윤리위원회의 지침을 준수하여 수행하였다. 모든 래빗은 표준 케이지에서 한 마리씩 표준 온도(19±1℃), 습도(50-60%) 및 광조건(12h 명-암) 하에서 길러졌으며 음식과 물에 제한을 두지 않았다. 동물들을 4 그룹으로 나누었는데, 각 그룹은 최소 3마리로 구성되었다. 각 개체의 오른쪽 눈을 실험군으로, 왼쪽 눈을 대응 대조군으로 하였다. 40μl F12, F13, F14 및 F15를 각 래빗의 오른쪽 눈에 주입하였다. 30분 후, 귀 정맥에 5 ml 공기를 주입하여 래빗을 희생시키고 각막을 적출하였다. 적출된 각막을 상피세포, 기질세포 및 내피세포의 3가지 세포주로 분리하였다. 각각의 세포주를 Solvable로 용해시켰다. 각 시료는 0.2μm 포어 크기의 PVDF 주사기 필터로 여과하고 최종적으로 시료 내 멜라토닌 함량을 HPLC로 분석하였다.

Solvable ^(R) 에서의 멜라토닌의 안정성

멜라토닌의 인 비보 각막내 유지 분석에 사용되는 Solvable^(R)은 강한 알칼리 물질이다. 멜라토닌이 Solvable내에서 안정적인지를 조사하기 위하여, 4000mg의 멜라토닌을 8mL의 Solvable^(R)또는 희석된 Solvable에 용해시켰다. Solvable^(R)의 희석은 Milli-Q 워터를 이용하여 다양한 비율(Solvable^(R)정제수, 1:1,1:3, 1:7 및 1:15)로 이루어졌다. 모든 시료는 인큐베이터 쉐이커(Model SI-600R, Jeio Tech Co., Ltd, Korea)에서 60℃, 200rpm으로 7일간 배양하였다. 특정 시점에, 각 시료 200μL를 취하여 HPLC로 멜라토닌 함량을 측정하였다.

안정성의 평가

각 제형들을 pH, HPβCD 함유여부 및 저장 온도에 따라 분류하였다. pH 값은 6.0, 7.0, 7.4 및 8.0으로 맞추었다. 저장 온도는 4℃ 및 상온을 하였다. 각 제형의 조성은 표 9에 나타내었다. 시료는 멸균된 발열성 물질 제거 팔콘 튜브에 저장하였다. 각 제형의 약물 함량, pH 및 삼투질 농도를 1개월 이상 모니터링하였다. 모든 과정은 멜라토닌의 광분해성 특징을 고려하여 차광된 조건에서 수행하였다.

안정성 평가에 사용된 제형의 조성

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8
멜라토닌	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
HPβCD	-	-	-	-	2.9	2.9	2.9	2.9
PBS	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s	q.s
R	1.0	1.0	1.0	1.0	0.5	0.5	0.5	0.5

실험결과

HPLC

본 발명에서 HPLC 방법에 의한 검출 범위를 조사하기 위하여, 고농도 멜라토닌 용액을 연속적으로 두 번 희석한 뒤 시료를 HPLC로 분석하였다. 구 결과, 1000 ng/mL에서 처음으로 날카로운 피크 부위가 관찰되었으며, 7.8 ng/mL까지 분석이 가능하였다. 이에, 본 발명자들은 멜라토닌 용액의 검출 범위를 10 - 1000 ng/ml로 결론지었다. 다양한 멜라토닌 농도에 대한 크로마토그램을 도 6 내지 10에 나타내었다. 멜라토닌 농도에 대한 피크 면적의 기울기 R²은 1이었으며(도 11), 이를 통해 피크 면적이 멜라토닌 농도에 비례함을 알 수 있다. 이에, 본 발명자들은 수학식을 통해 시료 내 멜라토닌 농도를 추정할 수 있었다.

다양한 사이클로덱스트린 내 멜라토닌의 용해도 분석 및 안정화 상수(K _1:1 )와 CE(complexationefficiency)의 계산

최적의 사이클로덱스트린을 결정하기 위하여 본 발명자들은 다양한 사이클로덱스트린(α-CD, β-CD, HPβCD 및 γ-CD) 내 멜라토닌의 용해도를 조사하고, 상기 용해도 데이터로부터 각 CD의 안정화 상수(K_1:1) 및 CE (complexation efficiency)를 계산하였다. 25℃ 물(1.85mg/mL)에서 β-CD의 용해도 한계로 인하여 용해도 분석은 1.5% 미만이 진행되었으며, γ-CD에 대해서는 3.0% 미만이 진행되었다. α-CD, β-CD, HPβCD 및 γ-CD에 대한 용해도 그래프는 도 12 내지 15에 각각 에 표시하였다. Higuchi 및 Connor의 이론[33]에 따라 이들의 관계는 전형적인 A_L-형으로 분류되어, α-CD, β-CD, HPβCD 및 γ-CD 복합체 내의 멜라토닌의 화학양론은 1:1임을 알 수 있었다. 결론적으로, K_1:1및 CE는 기울기로부터 계산이 가능하며 이를 표 10에 나타내었다.

다양한 CD 내 멜라토닌의 안정화 상수(K_1:1) 및 CE

	K_1:1	CE
α-CD	37.89	0.26
β-CD	412.26	2.79
HPβCD	436.60	2.95
γ-CD	70.61	0.69

K_1:1및 CE가 높을수록 우수한 안약의 담체로 적용될 수 있다.

본 발명에서, β-CD 및 HPβCD와 혼합된 멜라토닌의 CE는 각각 2.79 및 2.95로서 α-CD 및 γ-CD와 혼합된 경우(각각 0.26 및 0.69)보다 유의하게 높았다. 이에, CE 값이 가장 높은 HPβCD를 본 발명의 약물 제형 후보물질로 선정하고 추가 실험을 진행하였다.

화학양론의 결정: Job의 방법

최적의 CD를 선정한 뒤, 효율적인 복합체를 형성하는 최적의 비율(melatoin : CD)을 탐색하고자 하였다. 약물과 CD 간의 최적의 비율을 조사하는 방법 중 하나는 Job의 방법이다. 도 16 및 표 11에서 보여주는 Job의 곡선에서처럼, 멜라토닌 및 HPβCD 간의 비율이 1:1인 경우를 나타내는 R=0.5에서 최대 피크가 관찰되어 용해도 분석에서와 일치하는 결과를 보였다. 이에, 본 발명자들은 1:1 몰비를 가지는 HPβCD-기반 안약 제형을 제작하였다.

멜라토닌/HPβCD 복합체에 대한 Job의 연속변형 수치값

R	ΔA
0.0	14 ± 147.7
0.1	469 ± 434.2
0.2	2444 ± 300.0
0.3	4923 ± 910.3
0.4	5373 ± 1131.3
0.5	5436 ± + 602.2
0.6	5303 ± 369.9
0.7	3611 ± 522.3
0.8	2147 ± 519.9
0.9	1471 ± 949.5
1.0	0 ± 500.1

인 비트로 투과 연구

화학양론 결정의 결과, HPβCD과 1:1 몰비를 이루는 멜라토닌 안약 제형을 제작하였다. 이후, 멜라토닌 용액 및 HPβCD를 이용한 멜라토닌 제형의 투과도 차이를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 F1 및 F6에 대한 Franz 확산세포 분석을 수행하였다. 도 17은 Franz 확산세포 분석에서 투석 투브 셀룰로오즈 막를 통한 SLF로의 약물 방출을 보여준다. 유속(J) 및 투과 계수(P)는 Franz 확산세포 분석 결과를 통해 구했으며, 이를 표 12에 나타내었다. F1 및 F6의 유속은 각각 4.498 및 4.537으로, 거의 차이가 없었다. 도 17에서 보는 바와 같이, 약물의 확산은 F1 및 F6에서 유사하였다. 이에, 복합체 제형에 CD가 포함됨으로 인해 투과도가 감소하지는 않음을 확인하였다.

F1 및 F6의 유속 및 투과도 값 (평균± 표쥰편자, n=3)

제형	유속 (μg/cm²s)	투과도 (cm /s)
F1	4.498 ⅹ 10^-3± 1.415 ⅹ 10^-5	8.996 ⅹ 10^-6± 2.831 ⅹ 10^-8
F6	4.537 ⅹ 10^-3± 1.424 ⅹ 10^-4	9.075 ⅹ 10^-6± 2.849 ⅹ 10^-7

인 비보 연구

안구 자극 시험

표 4의 제형에 대해 안구 자극 실험을 수행하고 이를 Friedenwald 및 Draize의 방법을 변형한 등급 체계로 평가하였다. 총점 범위는 0에서 110이나, 자극 시험 결과 각막 및 홍채에 자극의 신호가 없는 것으로 나타났다. 안구 자극 시험 결과는 표 13에 표시하였다.

72시간 동안의 안구 자극 점수(평균 ± 표준편차, n=6)

	1 h	6 h	24 h	48 h	72 h
F1	0	0	0	0	0
F6	0	0	0	0	0
F12	3.3 ± 1.03	3.3 ± 1.03	2.0 ± 1.26	1.0 ± 1.10	1.0 ± 1.10
F13	1.0 ± 1.10	1.7 ± 0.82	0.7 ± 1.03	0	0

표 13에서 보는 바와 같이, 0.5 mg/mL 멜라토닌 용액 및 HPβCD가 첨가된 동일한 농도의 제형은 자극이 발생하지 않았다. 그러나, 1.0 mg/mL 멜라토닌 용액(F12)은 래빗의 안구에 자극을 유발하였으며, 1.0 mg/mL 농도를 가지는 HPβCD 첨가 제형(F13)은 안구 자극을 경감시켰다. F12 제형은 안구 자극이 72시간 동안 지속되었으나, F13은 24시간 째에 거의 자극을 유발하지 않았다. 이러한 결과는 자극유발 농도의 멜라토닌에 의한 안구 자극을 HPβCD가 감소시킨다는 본 발명자들의 가설을 뒷받침하는 것이다.

인 비보 에서 각막 내 멜라토닌의 함량

멜라토닌 용액(F12, F14)과 비교하여, 멜라토닌-HPβCD 제형을 사용할 경우 멜라토닌의 함량은 모든 조직(상피, 기질 및 내피)에서 크게 증가하였다. 멜라토닌-HPβCD 제형은 상피층에서 약 50-130%, 기질세포에서 약 30-60%, 그리고 내피조직에서 약 30-140%가 각각 증가하였다.

멜라토닌-HPβCD 제형에 의한 안구자극의 감소는 눈물 및 눈 깜박임 반응을 감소시켜 약물이 씻겨나가는 것을 막아줌으로써 약물의 접촉시간을 증가시킨다. 결과적으로 더 많은 약물이 막을 통과하여 안구에 축적될 수 있다. 축적된 멜라토닌의 양은 도 18 및 표 14에 표시하였다.

F12-F15에 의한 3개의 세포주에서의 인 비보 멜라토닌 함량(평균±표준편차, n=3)

세포주	F12	F13	F14	F15
상피	55.5±9.24	127.2±21.01	139.7±103.81	208.7±5.22
기질	26.7±2.66	43.7±16.93	70.5±53.01	92.7±10.46
내피	21.1±1.77	51.0±13.91	55.5±41.36	71.3±13.08

Solvable ^(R) 에서의 멜라토닌의 용해도

본 발명은 멜라토닌이 Solvable및 희석된 Solvable에서 불안정하며, 멜라토닌의 안정성은 시간 의존적이고 Solvable농도 의존적인 패턴을 나타냄을 밝혔다. 이러한 함량의 감소를 도 19 및 표 15에 나타내었다. 이러한 데이터에 기초하여, 멜라토닌 함량 값을 각막을 용해하는 데 사용된 용매(원래 용매, 2배 희석 등)에 따라 보정할 수 있다. 본 발명자들은 4배 희석된 Solvable^(R)을 선정하였으며, 이 용매 내에서 각막은 12시간 안에 확실히 용해되었다.

Solvable^(R)에서의 멜라토닌 안정성 (평균±표준편차, n=3)

시간	Solvable^(R) (Original)	2배 희석	4배 희석	8배 희석	16배 희석
0	100±0.08	100±0.69	100±0.46	100±0.13	100±0.85
6	98.8±0.20	94.0±0.79	95.1±0.73	96.6±0.98	98.2±0.59
12	94.7±9.16	89.3±0.79	92.6±1.39	94.5±0.81	96.6±1.52
24	82.1±0.74	79.6±1.52	84.6±0.40	89.8±0.76	93.9±1.21
48	62.0±0.69	66.9±0.57	76.8±0.11	86.1±0.50	92.9±0.48
72	48.5±0.23	54.8±0.29	66.4±1.14	77.7±0.35	89.5±0.72
168	41.3±0.26	48.3±1.60	59.5±0.38	71.6±0.14	83.3±0.44

안정성 분석

안정성 측정을 위해 S1-S8 제형을 선택하였다. 빛에 노출되었을 때 멜라토닌은 광분해성 특성으로 인해 용액상태에서 낮은 안정성을 보이므로, 모든 시료를 차광 처리하였다. S1-S8의 각 시료의 pH값, 삼투질 농도 및 함량을 측정하여 표 16-21 및 도 20-25에 나타내었다.

pH, 삼투질 농도 및 함량(%)에 있어서 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 각 시료의 pH 값은 조절된 값에서 거의 변화가 없었으며, 각 시료의 삼투질 농도는 280-290 mOsmol 범위를 오갔다. 각 시료의 함량은 95%- 110% 였다. 변색 및 오염과 같은 육안 상의 변화는 관찰되지 않았다.

상온에 보관된 S1-S8의 pH 값(평균±표준편차, n=3)

	대조군 (pH)	초기	4 일	7 일	10 일	14 일	21 일	30 일
S1	6.0	5.89 ± 0.000	5.89 ± 0.012	5.92 ± 0.006	5.93 ± 0.010	5.91 ± 0.006	5.88 ± 0.000	5.92 ± 0.010
S2	7.0	6.91 ± 0.010	6.92 ± 0.000	6.93 ± 0.006	6.95 ± 0.021	6.91 ± 0.000	6.90 ± 0.000	6.92 ± 0.000
S3	7.4	7.34 ± 0.006	7.34 ± 0.000	7.36 ± 0.006	7.36 ± 0.010	7.34 ± 0.000	7.34 ± 0.000	7.35 ± 0.000
S4	8.0	8.07 ± 0.020	8.07 ± 0.000	8.06 ± 0.020	8.04 ± 0.015	8.04 ± 0.012	8.07 ± 0.015	8.06 ± 0.006
S5	6.0	5.90 ± 0.006	5.88 ± 0.000	5.91 ± 0.015	5.91 ± 0.006	5.91 ± 0.000	5.89 ± 0.012	5.92 ± 0.006
S6	7.0	6.90 ± 0.006	6.89 ± 0.000	6.93 ± 0.000	6.92 ± 0.006	6.91 ± 0.006	6.89 ± 0.006	6.91 ± 0.006
S7	7.4	7.35 ± 0.006	7.33 ± 0.000	7.36 ± 0.006	7.35 ± 0.006	7.34 ± 0.000	7.34 ± 0.006	7.35 ± 0.006
S8	8.0	8.06 ± 0.006	8.04 ± 0.012	8.04 ± 0.017	8.04 ± 0.021	8.03 ± 0.010	8.06 ± 0.015	8.04 ± 0.012

4℃에 보관된 S1-S8의 pH 값(평균±표준편차, n=3)

	대조군 (pH)	초기	4 일	7 일	10 일	14 일	21 일	30 일
S1	6.0	5.89 ± 0.006	5.88 ± 0.006	5.92 ± 0.006	5.93 ± 0.010	5.90 ± 0.006	5.91 ± 0.006	5.91 ± 0.006
S2	7.0	6.91 ± 0.010	6.90 ± 0.000	6.93 ± 0.012	6.92 ± 0.006	6.91 ± 0.006	6.91 ± 0.006	6.91 ± 0.006
S3	7.4	7.35 ± 0.012	7.33 ± 0.000	7.35 ± 0.000	7.35 ± 0.006	7.33 ± 0.000	7.37 ± 0.000	7.35 ± 0.010
S4	8.0	8.05 ± 0.012	8.05 ± 0.006	8.04 ± 0.006	8.04 ± 0.017	8.03 ± 0.006	8.09 ± 0.010	8.07 ± 0.006
S5	6.0	5.88 ± 0.006	5.87 ± 0.006	5.91 ± 0.006	5.92 ± 0.006	5.90 ± 0.010	5.91 ± 0.006	5.91 ± 0.015
S6	7.0	6.90 ± 0.000	6.89 ± 0.015	6.92 ± 0.006	6.93 ± 0.006	6.89 ± 0.006	6.92 ± 0.006	6.91 ± 0.010
S7	7.4	7.34 ± 0.012	7.33 ± 0.000	7.36 ± 0.006	7.36 ± 0.000	7.33 ± 0.000	7.35 ± 0.010	7.34 ± 0.006
S8	8.0	8.05 ± 0.012	8.04 ± 0.006	8.04 ± 0.006	8.03 ± 0.006	8.03 ± 0.006	8.08 ± 0.015	8.05 ± 0.010

상온에 보관된 S1-S8의 삼투질 농도(평균±표준편차, n=3)

	대조군 (pH)	초기	4 일	7 일	10 일	14 일	21 일	30 일
S1	6.0	284.3 ± 1.53	283.0 ± 0.00	283.0 ± 2.00	284.0 ± 1.73	281.7 ± 1.15	282.3 ± 1.15	286.3 ± 1.53
S2	7.0	285.0 ± 1.00	280.7 ± 1.53	280.7 ± 0.58	281.3 ± 0.58	280.3 ± 0.58	281.3 ± 0.58	286.7 ± 1.53
S3	7.4	285.0 ± 1.00	282.7 ± 0.58	281.0 ± 1.00	283.3 ± 2.52	281.0 ± 1.00	281.3 ± 0.58	285.3 ± 0.58
S4	8.0	284.7 ± 2.52	285.0 ± 0.00	284.0 ± 1.00	283.7 ± 0.58	282.7 ± 0.58	283.3 ± 0.58	288.7 ± 2.52
S5	6.0	284.7 ± 0.58	285.0 ± 0.00	284.0 ± 1.00	283.7 ± 0.58	282.7 ± 0.58	283.3 ± 0.58	288.7 ± 2.52
S6	7.0	285.0 ± 1.00	282.7 ± 0.58	281.7 ± 1.15	282.7 ± 0.58	281.3 ± 0.58	283.0 ± 0.00	287.0 ± 0.00
S7	7.4	286.7 ± 1.15	283.3 ± 0.58	281.0 ± 1.00	282.7 ± 0.58	281.3 ± 0.58	282.7 ± 0.58	287.0 ± 1.73
S8	8.0	285.0 ± 0.00	283.7 ± 0.58	281.7 ± 1.15	282.0 ± 0.00	281.0 ± 1.00	283.0 ± 2.00	284.3 ± 2.31

4℃에 보관된 S1-S8의 삼투질 농도(평균±표준편차, n=3)

	대조군(pH)	초기	4 일	7 일	10 일	14 일	21 일	30 일
S1	6.0	285.0 ± 1.00	284.3 ± 1.53	282.7 ± 0.58	282.0 ± 1.00	281.7 ± 0.58	285.3 ± 0.58	288.0 ± 1.00
S2	7.0	284.0 ± 1.00	283.0 ± 0.00	280.7 ± 1.15	280.3 ± 0.58	281.0 ± 1.00	283.0 ± 0.00	284.7 ± 2.52
S3	7.4	283.3 ± 0.58	282.7 ± 0.58	281.7 ± 1.15	282.0 ± 0.00	280.3 ± 0.58	281.7 ± 1.53	286.3 ± 1.15
S4	8.0	282.7 ± 0.58	282.0 ± 1.00	281.7 ± 1.15	281.0 ± 1.00	280.3 ± 0.58	281.3 ± 1.53	285.0 ± 0.00
S5	6.0	286.0 ± 1.00	285.0 ± 1.00	284.0 ± 1.00	283.3 ± 0.58	284.0 ± 1.00	284.7 ± 0.58	288.7 ± 1.53
S6	7.0	284.3 ± 0.58	284.0 ± 0.00	282.3 ± 0.58	282.0 ± 2.65	282.0 ± 1.00	282.7 ± 0.58	287.0 ± 1.00
S7	7.4	285.3 ± 0.58	283.3 ± 0.58	281.0 ± 0.00	283.0 ± 0.00	281.0 ± 0.00	283.0 ± 1.00	286.7 ± 0.58
S8	8.0	284.7 ± 0.58	284.0 ± 1.00	280.7 ± 0.58	283.0 ± 1.00	280.7 ± 0.58	282.3 ± 1.15	286.0 ± 1.73

상온에 보관된 S1-S8의 멜라토닌 함량(%)(평균±표준편차, n=3)

	대조군 (pH)	초기	4 일	7 일	10 일	14 일	21 일	30 일
S1	6.0	100.0 ± 0.87	98.5 ± 0.74	97.0 ± 1.24	107.6 ± 1.27	102.5 ± 0.70	99.2 ± 0.86	98.3 ± 0.58
S2	7.0	100.0 ± 1.56	98.4 ± 1.38	97.5 ± 1.01	103.1 ± 1.91	102.8 ± 0.56	100.0 ± 1.33	99.2 ± 1.40
S3	7.4	100.0 ± 0.98	99.3 ± 0.49	96.1 ± 1.25	103.8 ± 0.63	101.6± 0.86	99.9 ± 0.34	96.7 ± 0.54
S4	8.0	100.0 ± 3.51	98.3 ± 3.34	99.4 ± 0.86	102.9 ± 2.37	101.8 ± 6.41	96.8 ± 2.25	97.7 ± 6.82
S5	6.0	100.0 ± 2.91	101.2 ± 3.02	104.4 ± 0.80	107.3 ± 3.78	107.9 ± 4.40	101.5 ± 1.88	102.1 ± 2.76
S6	7.0	100.0 ± 0.50	98.3 ± 0.90	100.6 ± 3.63	105.6 ± 2.15	107.1 ± 2.82	99.8 ± 0.59	99.6 ± 1.08
S7	7.4	100.0 ± 3.14	100.4 ± 1.15	102.9 ± 2.42	104.4 ± 1.48	106.4 ± 2.03	100.8 ± 1.01	99.4 ± 3.61
S8	8.0	100.0 ± 3.54	101.6 ± 3.81	105.6 ± 1.24	102.1 ± 12.06	106.7 ± 3.65	100.2 ± 1.23	102.7 ± 3.97

4℃에 보관된 S1-S8의 멜라토닌 함량(%)(평균±표준편차, n=3)

	대조군 (pH)	초기	4 일	7 일	10 일	14 일	21 일	30 일
S1	6.0	100.0 ± 1.16	103.3 ± 1.06	102.9 ± 1.34	109.3 ± 0.35	101.9 ± 1.88	99.3 ± 0.61	99.4 ± 1.13
S2	7.0	100.0 ± 1.09	103.0 ± 0.32	103.7 ± 0.38	108.3 ± 0.57	107.8 ± 2.41	99.1 ± 1.34	100.4 ± 2.68
S3	7.4	100.0 ± 1.03	101.9 ± 0.43	105.8 ± 0.80	108.1 ± 0.89	106.6± 1.32	99.5 ± 0.64	98.1 ± 2.72
S4	8.0	100.0 ± 0.91	101.5 ± 0.23	103.5 ± 3.02	107.8 ± 1.28	109.8 ± 1.20	100.0 ± 1.07	98.1 ± 4.24
S5	6.0	100.0 ± 1.79	104.1 ± 3.00	103.7 ± 0.59	108.1 ± 2.92	108.9 ± 4.76	101.0 ± 1.68	102.6 ± 5.39
S6	7.0	100.0 ± 0.99	105.8 ± 2.67	102.8 ± 1.34	109.2 ± 5.02	104.6 ± 4.85	104.7 ± 2.34	103.2 ± 3.11
S7	7.4	100.0 ± 4.98	107.1 ± 6.13	105.0 ± 0.41	108.5 ± 1.39	104.6 ± 10.95	105.3 ± 5.44	102.5 ± 1.43
S8	8.0	100.0 ± 1.34	104.8 ± 1.04	106.3 ± 4.81	110.2 ± 0.25	104.0 ± 5.74	102.7 ± 3.43	100.3 ± 3.58

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

다음을 포함하는 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 안구 투여(ocular administration)용 액상 제제 조성물:
(a) 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
(b) 상기 멜라토닌과의 몰비율이 4:6 - 6:4인 다음의 화학식 1로 표시되는 화합물:
화학식 1

상기 화학식 1에서, R₁-R₂₁은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록시 C₁-C₅알킬이며, 상기 R₁-R₂₁중 수소인 것은 14개 미만이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R₁-R₂₁은 수소 또는 2-하이드록시 프로필이며, 상기 R₁-R₂₁중 수소인 것은 7개 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R₁-R₂₁은 2-하이드록시 프로필인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 몰비율은 4.5:5.5 - 5.5:4.5인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 화학식 멜라토닌 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 몰비율은 1:1인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 TGFBIp (TGF beta induced protein) 유전자 변이 각막 이상증(corneal dystrophy)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증은 아벨리노(Avellino type) 각막이상증, 라이스-뷔클러(Reis-Bucklers type) 각막이상증, 격자(lattice type) 각막이상증, 과립(granular type) 각막이상증, 티엘-벵케(Thiel-Behnke type) 각막이상증, 상피기저막(epithelial basement membrane) 각막이상증 및 그로에노우브(Groenouw type) 각막이상증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증은 TGFBIp 단백질에 R124H, R124C, R555W, R555Q, I522N, N544S, M619K, F547S, A546D, V625D, G623D, V505D, P551Q, L558P, V624M, H626P, L173P, H572R, T538P, H572del, L527R, L569R, H626R, R124L, T125del, E126del 및 R124S로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변이가 일어난 것을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증은 TGFBIp 단백질에 R124H의 아미노산 변이가 일어난 것을 특징으로 하는 조성물.