CN105566100B - 一种苯乙烯酸类化合物，包含其的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有式(I)结构的苯丙烯酸类化合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄和R₅各自独立地选自由氢、羟基和甲氧基组成的组，R₆为具有3‑6个碳原子的直链烷基。同时还涉及一种药物组合物，其包含所述的苯乙烯酸类化合物、有机羧酸、pH调节剂以及任选的一种或多种药学上可接受的辅料，且所述药物组合物的pH值为6‑8；其中所述苯乙烯酸类化合物按重量计占所述药物组合物的0.05‑1.00％，所述有机羧酸按重量计占所述药物组合物的0.01‑0.50％。更涉及了所述苯丙烯酸类化合物与所述药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的应用。

Description

一种苯乙烯酸类化合物，包含其的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种苯乙烯酸类化合物，包含其的组合物及其应用，特别涉及其在制备预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一种内分泌代谢病，以高血糖为主要症状，其患病率随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变逐年增高。糖尿病可影响全身各器官，但与眼睛关系更为密切，可引起白内障、视网膜病变、青光眼、暂时性屈光不正和眼外肌麻痹等。

糖尿病眼病是糖尿病最为常见的慢性并发症之一，它能使患者视力减退，最终导致失明，失明率是正常人的25倍。据国内报道，病程在5年以下者眼底改变率为38％-39％；病程5-10年者，发病率为50％-56.7％；病程在10年以上者，发病率增至69％-90％。临床研究表明，糖尿病眼病的原因是糖代谢紊乱。糖代谢紊乱引起视网膜微血管系统受损，从而造成视网膜毛细血管病理改变，主要包括血管舒缩调节功能失常、血管周细胞凋亡和血管基底膜增厚，最终导致视网膜一系列病理改变。同时一些全身和眼局部因素能促进糖尿病眼病的发生，如红细胞及血小板聚集性增高、血液黏度增高、血浆纤维蛋白原水平升高等。糖尿病视网膜病变是糖尿病性微血管病变最为重要表现，其为一种特异性的眼底病变。目前临床上有很多针对糖尿病眼病的药物和技术，但是这些技术对于视网膜毛细血管病变都没有很好的预防和/或治疗作用。

Combretastain A-4(CA4)是一种具有抗肿瘤活性的二苯乙烯类天然产物，其通过抑制血管形成发挥药效，因此在治疗眼科疾病中异常血管形成方面亦取得突破性进展。大量文献对CA4衍生物进行了构效关系研究，如《中国新药杂志》2007年16(17)期和2013年22(3)期、中国药学杂志2012年47(3)期等。但所报道药物均局限于顺式二苯乙烯结构。

中国专利CN1526713A公开了CA4磷酰胆碱类前体药物、其合成方法及其在制备血管抑制剂中的应用。其为CA4的前药，在患者体内释放天然活性成分CA4，以CA4为活性化合物发挥药效。该药物需以CA4为原料进行制备，原料昂贵且制备方法复杂。

专利CN101074189A涉及苯乙烯酸类化合物及其在制备抑制眼底血管增生药物中的应用。其中的苯乙烯酸类化合物具有略优于前述的CA4磷酰胆碱类前体药物的药效，且该苯乙烯酸类化合物可使用常规工业原料进行合成，可降低成本并提高效率。

然而，已公开的文献或专利仅涉及苯乙烯酸类化合物在治疗眼底血管增生的用途，并未对糖尿病眼病进行进一步研究，且在后续研究中发现，这些已公开的苯乙烯酸类化合物药物作用时间较短，需提升给药频率从而增加用药风险。

由此可见，本领域急需一种药物，其对预防和/或治疗糖尿病眼病具有理想的效果且具有更长的药物作用时间。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种化合物，其可用于预防和/或治疗糖尿病眼病，为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种苯乙烯酸类化合物，其具有式(I)的结构：

其中R₁、R₂、R₃、R₄和R₅各自独立地选自由氢、羟基和甲氧基组成的组，R₆为具有3-6个碳原子的直链烷基。

例如，在本发明所述的丙烯酸类化合物的结构中，R₁-R₅的组合可为R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为甲氧基；R₁、R₄、R₅为氢，R₂为羟基，R₃为甲氧基；R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为甲氧基；R₁、R₃、R₄为氢，R₂为羟基、R₅为甲氧基。R₆可为正丙基、正丁基、正戊基或正己基。

本发明提供的苯乙烯酸类化合物通过抑制眼底新生血管增生，可预防和/或治疗视网膜毛细血管病变，改善视神经病变或脉络膜病变，可对糖尿病相关眼病有明显的预防和/或治疗作用。

本发明所述的苯丙烯酸类化合物可使用任意本领域已公开的方法进行制备。以(E)-3-(3’-羟基-4’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵盐为例，其对应式(I)结构，R₁、R₄、R₅为氢，R₂为羟基，R₃为甲氧基，R₆为正丁基，该化合物的制备方法如下：混合3,4,5-三甲氧基苯乙酸，3-羟基-4甲氧基苯甲醛、醋酸酐和三乙胺，在150℃下搅拌回流2.5h，减压蒸馏出去溶剂，加入足量1N盐酸，室温搅拌过夜，过滤所得的固体使用乙醇重结晶，制得(E)-3-(3’-羟基-4’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸。将所得的苯丙烯酸衍生物溶于丙酮，在0℃氩气保护下滴加等当量的正丁胺丙酮溶于，升温至20℃反应1h，减压浓缩除去溶剂后加入乙酸乙酯，加热至80℃进行回流，再冷却至0℃，过滤并干燥，制得(E)-3-(3’-羟基-4’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵。

本发明通过一系列实验，证明当R₆为具有3-6个碳原子的直链烷基时，所述苯丙烯酸类化合物具有更好的治疗和/或预防糖尿病眼病的效果，并且具有更长的药物作用时间。

所述苯乙烯酸类化合物可与任意药学上可接受的辅料相组合，并通过药剂学常规加工方法制备成各种药物制剂通过口服给药、注射给药(静脉注射、肌肉注射、皮下注射)、灌注给药、经皮给药或眼部给药向患者施用。例如。所述苯乙烯酸类化合物可与崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等相组合制备成片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂用于口服给药；与分散剂、溶剂相组合制备成针剂或进一步冻干成粉针剂用于注射给药；与溶剂、非溶剂、稳定剂、表面活性剂组合制备成乳剂、膏剂、凝胶剂、擦剂用于经皮给药。所述辅料为药学上可用的赋形剂、载体以及对于特定制剂的常规添加成分。本领域技术人员可根据所选的制剂类型和给药方式结合本领域公知常识选择适合的辅料。任何由本发明所述的苯丙烯酸类化合物与药学上常规辅料组合而成的制剂都属于本发明公开的范围。

由于眼部给药可特异性地作用于眼部，可提高药物的吸收率，减少给药次数，降低药物的不良反应，因而特别适用于糖尿病眼病。本发明所述的苯丙烯酸类化合物优选地用于眼部给药。

虽然用于眼部给药的制剂可直接作用于眼部病变部位，但由于眼部的生理结构特殊，药物在眼部的生物利用度偏低。本发明所述的苯乙烯酸类化合物通过与含有机羧酸组合，在一定pH下出乎意料地显著提高了所述苯乙烯酸类化合物在眼部的渗透性，延长作用时间。由此制备的药物组合物可特别地作为眼用制剂使用，其能克服现有技术中眼部给药的弊端。

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，其包含本发明所述的苯乙烯酸类化合物、有机羧酸、pH调节剂以及任选的一种或多种药学上可接受的辅料，且所述药物组合物的pH值为6-8；其中所述苯乙烯酸类化合物按重量计占所述药物组合物的0.05-1.00％，所述有机羧酸按重量计占所述药物组合物的0.01-0.50％。

所述有机羧酸为氨基酸、牛磺酸和甲磺酸中的一种或至少两种的混合物，优选地，所述有机羧酸为牛磺酸。牛磺酸可治疗对代谢失调引起的白内障，也可用于急性结膜炎、疱疹性结膜炎、病毒性结膜炎的辅助治疗，但本领域尚未有牛磺酸对糖尿病眼病具有治疗和/或预防作用的相关报道，更未有牛磺酸可增加药物渗透性的描述。本发明首次将有机羧酸如牛磺酸与苯丙烯酸类化合物相结合，在治疗和/或预防糖尿病眼部中表现出良好的效果。

由于所述苯丙烯酸类化合物为苯丙烯酸有机铵盐，其以羧酸根负离子COO^-和铵正离子NH₃R₆ ⁺的阴阳离子对形式发挥药效。当体系pH过高时，体系呈碱性，此时的铵正离子NH₃R₆ ⁺将转化成有机胺NH₂R₆；当体系pH过低时，体系呈酸性，此时部分羧酸根负离子COO-将与体系中的H⁺结合形成COOH。在以上两种情况中，羧酸根负离子COO-和铵正离子NH₃R₆ ⁺都将转化或部分转化成分子的形式，不能相互结合成离子对，从而不能发挥药效。由此可见，所述药物组合物需具有接近中性的特定的pH值，使得活性成分苯丙烯酸有机铵盐能以阴阳离子对的形式存在于体系中。本发明通过比较一系列具有不同pH的组合物的渗透性，得知所述药物组合物的pH值为6-8时渗透性最佳，同时此pH值接近中性，对眼部的刺激性小。优选地，所述药物组合物的pH值为6.5-7.5。

所述pH调节剂为药学上可接受的，与所述药物组合物相容性且本身无特殊药理作用的pH调节剂，由于体系中存在有机羧酸，体系pH偏酸性，需加入适量pH调节剂使得所述药物组合物的pH值在6-8范围内。因而可用的pH调节剂为碱性化合物，包括氢氧化钠、氢氧化钾、二乙醇胺和三乙醇胺。优选地，所述pH调节剂为毒性较小的三乙醇胺。所述pH调节剂的添加量为将体系pH值调节到适合范围所需的用量，其具体添加量视实际操作的情况而定。本领域技术人员可根据本领域公知常识选择具体的pH调节剂并可容易地对其添加量进行计算或调节。

在所述药物组合物中，活性成分包括所述苯乙烯酸类化合物和所述有机羧酸，当所述药物组合物特别地作为眼用制剂施用时，所述苯乙烯酸类化合物按重量计占所述药物组合物的0.05-1.00％，所述有机羧酸按重量计占所述药物组合物的0.01-0.50％。优选地，所述苯乙烯酸类化合物按重量计占所述药物组合物的0.20-0.50％，所述有机羧酸按重量计占所述药物组合物的0.20-0.50％。所述药物组合物的非活性成分包括pH调节剂和药学上可接受的辅料，其用量可根据所述组合物将制备成的剂型和给药方式进行调节。

本发明所提供的药物组合物为眼用制剂，其通过眼部给药的方式进行施用。其可制备成任意适用于眼部给药的剂型，包括滴眼剂、眼膏、眼用凝胶、纳米制剂、微球制剂和脂质体制剂。优选的剂型为滴眼剂，所述的滴眼剂包括水溶液、混悬剂和乳剂。为将所述药物组合物制备成上述适用于眼部给药的剂型，所述药物组合物可进一步包含任选的一种或多种药学上可接受的辅料，例如缓冲剂、等渗剂、防腐剂、增稠剂、金属螯合剂以及其他眼用制剂的常规辅料。

所述缓冲剂可为磷酸-磷酸盐缓冲剂、硼酸-硼酸盐缓冲剂、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂、酒石酸-酒石酸盐缓冲剂、醋酸-醋酸盐缓冲剂和氨基酸中的一种或至少两种的混合物。在本发明优选的实施例中，所用缓冲剂为硼酸-硼砂缓冲剂。

所述等渗剂可为葡萄糖、甘露醇、甘油、丙二醇和氯化钠中的一种或至少两种的混合物。

所述防腐剂可为季铵盐例如氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、氯化十六烷基吡啶等，对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等，苄醇，山梨酸，乙基汞硫代水杨酸钠和三氯叔丁醇中的一种或至少两种的混合物。

所述增稠剂可为水溶性聚合物例如聚维酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、卡波普等，纤维素例如羟乙级纤维素、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，以及环糊精例如甲基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺甲基醚-β-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精中一种或至少两种的混合物。

所述金属鏊合剂可为乙二胺四乙酸及其衍生物例如乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、和乙二胺四乙酸钙钠，其可防止制备或储存过程中产生的金属离子破坏苯丙烯酸有机铵盐的离子对形式。

特别地，本发明所提供的药物组合物还可包括高分子材料聚乳酸、聚氧化烯、聚酰胺、明胶、泊洛沙姆、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、壳聚糖中的一种或多种以制成眼用凝胶或微球达到长效的作用。还可采用天然或合成的磷脂等类脂制备成脂质体以获得缓释效果，提高组织相容性或降低药物副作用等。

应当注意的是，本发明所提供的药物组合物还可进一步包含其它眼用制剂的常规活性成分，例如清凉剂，包括薄荷、薄荷脑、冰片、樟脑和桉树油等；可减轻炎症的维生素和氨酸酸如维生素B12、维生素B6、天冬氨酸、氨基乙磺酸等。这些活性成分属于眼用制剂的常规添加成分，在本发明中也落入药学上可接受的辅料的范围。因此任意眼用制剂常规活性成分与本发明所述的苯丙烯酸类化合物的组合也落入本发明要求保护的范围。

本发明所提供的药物组合物可根据其将制备成的剂型及预期的给药方式，按照药剂学常规方法进行制备。例如，当所述药物组合物的剂型为滴眼剂时，其制备方法为：将所述丙烯酸类化合物过80目筛溶于注射用水，加入增稠剂甲基纤维素、缓冲剂硼砂-硼酸和牛磺酸，振摇使溶解，补加注射用水，使用pH调节剂三乙醇胺将pH调节至6.5-7.0，使用0.45um微孔滤膜过滤，即得滴眼剂。当所述药物组合物的剂型为眼用凝胶时，其制备方法如下：将增稠剂卡波普分次撒入注射用水中，使其缓慢溶胀得水分散体，所述丙烯酸类化合物过80目筛后与防腐剂尼泊金乙酯、缓冲剂硼砂-硼酸、有机羧酸精氨酸和增稠剂β-环糊精一起加入水中，振摇使其完全溶解，用pH调节剂三乙醇胺调pH为7.5-8.0后，加入到卡波普水分散体中，补加注射用水，搅拌均匀，将上述药液分装在多剂量给药装置中，流通蒸汽灭菌即得眼用凝胶。

本发明所提供的药物组合物通过将所述苯丙烯酸类化合与有机羧酸的结合，在一定的pH下可具有优异的眼部渗透作用，可特别地作为眼用制剂施用。且所述药物组合物符合药剂学所要求达到的指标，具有良好的应用前景。

本发明的又一目的还在于提供所述苯乙烯酸类化合物，所述药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的应用，所述糖尿病眼病包括与糖尿病相关的眼底血管瘤、眼底出血、泪囊炎、青光眼、白内障、玻璃体浑浊、视神经萎缩、黄斑变性和视网膜脱落中的一种或多种的组合。

本发明所述的苯乙烯酸类化合物及包含其的组合物对糖尿病眼病，尤其是糖尿病引起的视网膜病变具有良好的治疗作用，而且该化合物通过一定的给药剂量和给药方法对糖尿病眼病也具有预防作用。所述药物组合物在治疗糖尿病眼病时可以采用低剂量每天连续给药的方式，也可采用一次给予高剂量药物后，间隔若干天后再次给药，即以较低频次给药的方式，且同时可维持高药效，由此可降低药物的副作用。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明所提供的苯丙烯酸类化合物合成方法简单，在大鼠糖尿病视网膜病变新生血管作用研究中其治疗效果为本领域已公开的苯丙烯酸类化合物的近2倍，在动物糖尿病脉络膜病变引起的血管增生的抑制作用研究中其治疗效果为本领域已公开的泵丙烯酸类化合物的约4倍。

2)本发明所提供的苯丙烯酸类化合物具有更长的药物作用时间，其在低频次间隔给药中仍然能表现与高频给药相似的效果，药物作用时间为本领域已公开的苯丙烯酸类化合物药物作用时间的至少3倍。

3)本发明将所述苯丙烯酸类化合物与有机羧酸及药学上可接受的辅料相结合形成具有一定pH值的药物组合物，其能显著增加药物对角膜的渗透性，与不添加有机羧酸的单一苯丙烯酸类化合物组分相比。渗透性最高可增加10倍，使得药物能够迅速渗透达到眼部病灶部位并起到长效作用。

4)本发明所述的药物组合物的各项指标均符合药剂学标准，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但不应将此理解为本发明仅限于以下实施例。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域公知常识和管用技术手段做出的各种替换或变更均应包括在本发明的范围内。

实施例1：(E)-3-(3’-羟基-4’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵盐的制备

混合3,4,5-三甲氧基苯乙酸(610mmol)，3-羟基-4甲氧基苯甲醛(724mmol)、醋酸酐(200mmol)和三乙胺(717mmol)，在150℃下搅拌回流2.5h，减压蒸馏出去溶剂，加入足量1N盐酸(约300ml)，室温搅拌过夜，过滤所得的固体使用乙醇重结晶，制得(E)-3-(3’-羟基-4’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸。将所得的苯丙烯酸衍生物溶于丙酮(约30ml)，在0℃氩气保护下滴加等当量的正丁胺丙酮溶液，升温至20℃反应1h，减压浓缩除去溶剂后加入乙酸乙酯(约30ml)，加热至80℃进行回流，再冷却至0℃，过滤并干燥，制得(E)-3-(3’-羟基-4’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵。

本发明所述的其它丙烯酸类化合物可通过使用具有不同取代基的原料，按照上述方法进行制备。

实施例2：苯丙烯酸类化合物对大鼠糖尿病视网膜病变新生血管的作用

实验动物：选鼠龄为6周的健康雄性Wistar大鼠180只，体重180-220g。饲养条件保存在室温18-25℃，空气流通，相对湿度55-75％，12小时光照维持。

造模方法：以上正常成年雄性Wistar大鼠，双眼晶状体完全透明，无任何混浊。喂养一周，禁食12h后称量体重。将链脲佐菌素(购自莱博生物实验材料研究所)溶于0.1ml/L，pH4.2的柠檬酸缓冲液中配制成1％的链脲佐菌素溶液，实验组按60mg/kg体重一次性腹腔注射上述溶液，之后给予充足的饮水及食物，诱发糖尿病视网膜病变进行造模。正常对照组给予等体积的柠檬酸缓冲液。实验组注射链脲佐菌素后于第4天，第7天分别测定空腹血糖，大于16.65mmol/L者为稳定模型，饲养3个月后用于下一步试验。

分组方法：饲养3个月后，将存活的实验组大鼠随机分成8组，每组10只，分别为正常对照组、实验对照组(通过造模患糖尿病但不进行药物治疗的组)、治疗组A-F，各个治疗组将施用具有式(I)的结构的苯丙烯酸类化合物，各组所用的苯丙烯酸类化合物结构中R₁-R₅相同，R₆不同，具体情况如下：

治疗组A：R₆为乙基；

治疗组B：R₆为正丙基；

治疗组C：R₆为正丁基；

治疗组D：R₆为正已基；

治疗组E：R₆为正庚基；

治疗组F：用钠离子替换式(I)结构中的铵离子，即为苯丙烯酸钠盐。

以上各治疗组的结构中R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为甲氧基。

给药方法：各组采用每天给药。正常对照组和实验对照组每天眼内注射1.0μL磷酸缓冲溶液，治疗给药组A-F每天眼内注射1.0μL药物溶液，药物浓度1.0μg/μL。

操作方法：

1)制备石蜡切片：各组大鼠试验给药后1.5个月，用过量戊巴比妥钠麻醉腹腔注射处死，立即摘除眼球，将眼球固定于10％中性甲醛48h，经乙醇常规脱水，二甲苯透明后浸蜡包埋，4μm切片用于免疫组化染色；

2)免疫组织化学检测：用SABC法免疫组织化学染色试剂盒检测，具体操作步骤：①脱蜡和水化；②1体积3％H₂O₂加10体积蒸馏水混合，滴加在切片上，室温静置10min；③抗原修复；④滴加5％的牛血清白蛋白封闭液；⑤滴加一抗RabbitAnti-VEGF、bFGF，4℃过夜；⑥滴加生物素化山羊抗小鼠IgG；⑦滴加试剂链霉卵白素和辣根酶标记生物素；⑧辣根酶底物显色；⑨苏木精复染，脱水、透明、封片、镜检；

3)统计学分析：数据均以(x±s)表示，组建比较采用t检验，采用SPSS统计软件进行统计。

实验结果：

1)免疫化结果：

正常对照组中血管内皮生长因子(即VEGF)、成纤维细胞生产椅子(即bFGF)均无阳性表达，视网膜细胞排列整齐，细胞形态正常；实验对照组中视网膜全层均可见VEGF、bFGF强阳性表达，视网膜细胞排列紊乱，节细胞变性加重，结构模糊；治疗组A中可见VEGF、bFGF弱阳性表达，视网膜细胞排列紊乱不明显，节细胞变性稍微好于实验对照组；治疗组B和治疗组C可见VEGF阳性表达不明显，bFGF弱阳性表达，视网膜细胞排列紊乱不明显，节细胞变性好于实验对照组；治疗组D中可见VEGF、bFGF弱阳性表达；治疗组E中可见VEGF、bFGF弱阳性表达，视网膜细胞排列紊乱不明显，节细胞变性稍微好于实验对照组；治疗组F可见VEGF、bFGF阳性表达明显。

由此可见治疗组A-E都对糖尿病眼病模型能产生一定的抑制作用，其中以治疗组B和治疗组C的效果最佳，治疗组F不能产生明显的效果。

2)计算机图像分析系统检测各组VEGF、bFGF阳性产物的平均光密度值：所得结果见表1

表1 各组VEGF、bFGF阳性表达去平均光密度

组别	VEGF	bFGF
			正常对照组	166.59±5.22	113.44±2.68

实验对照组	82.46±6.44	69.95±2.58
			治疗组A	142.66±1.69	87.56±3.11
治疗组B	158.05±1.98	89.23±1.06
			治疗组C	161.22±3.31	93.06±2.21
治疗组D	145.35±2.33	88.54±2.26
			治疗组E	139.21±2.01	83.62±0.98
治疗组F	123.26±1.32	79.61±3.31

上表的结果明确地显示出治疗组B、C和D的抑制效果优于治疗组A、E和F，其中治疗组B和C对VEGF修复作用明显，对bFGF也有一定修复作用。从而得知，对于式(I)的苯丙烯酸类化合物，R₆的碳链长度为3-6时，该苯丙烯酸类化合物能取得更优的抑制糖尿病视网膜病变新生血管的作用。

实施例3：基于苯丙烯酸类化合物对大鼠糖尿病视网膜病变新生血管作用的药物作用时间研究

按照实施例2的方法重复试验，仅将给药方式替换为各组采用每隔两天给药一次。正常对照组和实验对照组每隔两天眼内注射1.0μL磷酸缓冲溶液，治疗给药组A-F每隔两天眼内注射1.0μL药物溶液，药物浓度1.0μg/μL。

试验结果：

1)免疫化结果：

正常对照组中血管内皮生长因子(即VEGF)、成纤维细胞生产椅子(即bFGF)均无阳性表达，视网膜细胞排列整齐，细胞形态正常；试验对照组中视网膜全层均可见VEGF、bFGF强阳性表达，视网膜细胞排列紊乱，节细胞变性加重，结构模糊；治疗组B和治疗组C中VEGF阳性表达不明显，bFGF弱阳性表达，视网膜细胞排列紊乱不明显，节细胞变性好于模型组；治疗组D可见VEGF、bFGF弱阳性表达；治疗组A和E组VEGF强阳性表达，bFGF弱阳性表达，视网膜细胞排列紊乱明显，节细胞变性与模型组无明显区别；治疗组F可见VEGF、bFGF强阳性表达。其中治疗组E和F与实验对照组染色情况无明显区别。且将各组的染色效果与实施例2中对应组的染色结果相比时，治疗组B和C的染色情况无明显区别。

由此可见，将给药方式替换成同剂量的低频次给药时，治疗组B、C和D仍然具有可取的效果，而治疗组A、E和F的效果大大减小。可推断出治疗组B、C和D的化合物具有更长的药物作用时间，至少为治疗组A、E和F的化合物的作用时间的三倍。其中治疗组B和C在保持长效作用的情况下，依旧能保持良好的药效。

2)计算机图像分析系统检测各组VEGF、bFGF阳性产物的平均光密度值：所得结果见表2

表2 各组VEGF、bFGF阳性表达去平均光密度

组别	VEGF	bFGF
			正常对照组	166.59±5.22	113.44±2.68
实验对照组	82.46±6.44	69.95±2.58
			治疗组A	85.66±2.69	73.69±2.43
治疗组B	156.32±2.05	90.08±3.11
			治疗组C	160.46±1.86	95.33±6.22
治疗组D	139.65±3.33	88.51±2.86
			治疗组E	84.79±3.53	73.56±1.11

治疗组F

79.44±3.46

71.56±2.33

将上表的结果与实施例2的结果进行对比，显示出对于治疗B、C和D组，每天给药与间隔2天给药的区别不明显，表明可通过间隔给药达到小剂量实现最佳治疗效果的目的，这三个组的化合物具有更长的药物作用效果。而治疗组A、E和F的化合物连续给药对VEGF和bFGF具有一定修复作用，但间断给药时其VEGF、bFGF数据与实验对照组差别不明显，说明该组化合物作用时间短，需要长期给药。即对于具有式(I)结构的苯丙烯酸类化合物，其R₆的碳原子数为3-6时，可具有更长的作用时间，至少高于其他苯丙烯酸类化合物的三倍。

实施例4：苯丙烯酸类化合物对动物糖尿病脉络膜病变引起的血管增生的抑制作用

按照实施例2的方法选取实验动物、造模、分组和给药。

操作方法：

1)石蜡切片的制备：各组大鼠试验给药后1.5个月，每组取5只大鼠用过量戊巴比妥钠麻醉腹腔注射处死，立即摘除眼球，将眼球固定于10％中性甲醛48h，经乙醇常规脱水，二甲苯透明后浸蜡包埋，4μm切片用于HE染色。

2)血管增生面积的观察：观察试验性糖尿病脉络膜病变中脉络膜血管增生区域的大小。每组另取5只大鼠用过量戊巴比妥钠腹腔给药处死，立即摘除试验眼，分别精密测量脉络膜的血管增生面积。

实验结果

1)组织学观察

光镜下模型组新生血管增生、游离伴炎症细胞浸润。B、C、D给药组与模型组相比，新生血管几乎未见增加且未见膜脱离和炎症性细胞浸润，A、E、F给药组与模型组相比新生血管有所增加。

2)血管增生面积对比，见表3。

表3 各组脉络膜血管增生面积(单位：mm²，n＝5)

组别	脉络膜血管增生面积
		实验对照组	3.41±0.29
治疗组A	1.49±0.39
		治疗组B	0.26±0.22
治疗组C	0.22±0.16
		治疗组D	0.36±0.08
治疗组E	1.36±0.27
		治疗组F	1.09±0.33

血管增生的面积直接反映发生病变的情况，实验对照组脉络膜血管增生面积较大，各个治疗组均能在不同的程度上缩小脉络膜血管增生面积，其中以治疗组B、C和D的效果最佳。因此当所述式(I)的苯丙烯酸化合物的R₆的碳原子数为3-6时，可取的更好地抑眼部制脉络膜血管增生。

实施例5：基于苯丙烯酸类化合物对动物糖尿病脉络膜病变引起的血管增生的抑制作用的药物作用时间研究

按照实施例4的方法重复试验，仅将给药方式替换为各组采用每隔两天给药一次。正常对照组和实验对照组每隔两天眼内注射1.0μL磷酸缓冲溶液，治疗组A-F每隔两天眼内注射1.0μL药物溶液，药物浓度1.0μg/μL。

实验结果：血管增生面积对比，见表4。

表4 各组脉络膜血管增生面积(单位：mm²，n＝5)

组别

脉络膜血管增生面积

实验对照组	3.41±0.29
		治疗组A	2.76±0.63
治疗组B	0.21±0.22
		治疗组C	0.19±0.19
治疗组D	0.41±0.13
		治疗组E	2.91±0.36
治疗组F	3.09±0.41

由表4可知，将给药方式替换成隔两天给药1次后，仅有治疗组B、C和D依旧能保持良好的脉络膜血管增生抑制作用，而治疗组A、E和F的效果与实验对照组差别不大。表4中的数据与实施例4中的数据进行对比可知，在大鼠眼部血管增生面积的试验中，治疗组B、C和D的化合物每天给药与间断给药在减少大鼠脉络膜增生面积方面无明显区别。而治疗组A、E和F的化合物需连续给药才能缩小血管增生面积，间隔给药组与实验对照组无明显区别。由此可见即对于具有式(I)结构的苯丙烯酸类化合物，其R₆的碳原子数为3-6时，可具有更长的作用时间，至少高于其他苯丙烯酸类化合物的3倍。

实施例6：含有(E)-3-(3’,4’-二甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵盐的药物组合物滴眼剂的制备

式(I)的结构中R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为甲氧基，R₆为正丁基，该苯丙烯酸有机铵盐为(E)-3-(3’,4’-二甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵盐，以其为主药，按以下配比和操作将本发明所述的药物组合物制备成滴眼剂。

制备方法：将主药过80目筛，溶于800mL注射用水中，然后加入甲基纤维素、硼砂、硼酸、牛磺酸，振摇使其溶解，补加注射用水至1000g，三乙醇胺调节pH至6.5-7.0，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得滴眼液药液。

实施例7：含有(E)-3-(3’,4’-二甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵盐的药物组合物眼用凝胶的制备

式(I)的结构中R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为甲氧基，R₆为正丁基，该苯丙烯酸有机铵盐为(E)-3-(3’,4’-二甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵盐，以其为主药，按以下配比和操作将本发明所述的药物组合物制备成眼用凝胶。

制备肪法：将卡波普分次撒入适量蒸馏水中，使其缓慢溶胀得卡波普浓度为0.05％的水分散体，将主药过80目筛后与尼泊金乙酯、硼砂、硼酸、精氨酸和β-环糊精一起加入800mL注射用水中，振摇使其完全溶解，用三乙醇胺将pH调至7.5-8.0后，加入到上述卡波普水分散体中，补加注射用水至1000g，搅拌均匀，分装在多剂量给药装置中，流通蒸汽灭菌即得眼用凝胶。

实施例8：含有(E)-3-(3’-羟基,5’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丙铵盐的药物组合物的制备

式(I)的结构中R₁、R₃、R₅为氢，R₂为羟基、R₄为甲氧基，R₆为正丙基，该苯丙烯酸有机铵盐为(E)-3-(3’-羟基,5’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丙铵盐，以其为主药，按以下配比和操作将本发明所述的药物组合物制备成滴眼液。

制法：将主药过80目筛，注射用水溶解，然后将牛磺酸、三氯叔丁醇、硼砂、硼酸和羟丙甲基纤维素置于600mL水中，超声使其溶解后，所得液体补加注射用水至1000g，调节pH控至6.5-7.5，将上述药液分装在多剂量给药装置中，流通蒸汽灭菌即得。

实施例9：含有(E)-3-(3’,4’-二甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正戊铵盐的药物组合物的制备

式(I)的结构中R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为甲氧基，R₆为正戊基，该苯丙烯酸有机铵盐为(E)-3-(3’,4’-二甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正戊铵盐，以其为主药，按以下配比和操作将本发明所述的药物组合物制备成滴眼剂。

制备方法：取牛磺酸、尼泊金乙酯、乙二胺四乙酸二钠溶于约200mL热注射用水中，加注射用水至500ml，搅匀，再加入主药、硼酸、硼砂，搅拌溶解后过滤，最后补加注射用水至1000g，调节pH至6.5—7.5，混匀，经质量检测合格后，于流通蒸气30min灭菌，无菌条件下分装于眼药瓶中，即得滴眼剂。

实施例10：含有(E)-3-(3’-羟基,6’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正己铵盐的药物组合物的制备

式(I)的结构中R₁、R₃、R₄为氢，R₂为羟基，R₅为甲氧基，R₆为正戊基，该苯丙烯酸有机铵盐为(E)-3-(3’-羟基,6’-甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正己铵盐，以其为主药，按以下配比和操作将本发明所述的药物组合物制备成滴眼剂。

取尼泊金乙酯、乙二胺四乙酸二钠溶于约200mL热注射用水中，加注射用水至500ml，搅匀，再加入主药、亮氨酸、硼酸、硼砂，搅拌溶解后过滤，最后补加注射用水至1000g，混匀，经质量检测合格后，置于流通蒸气30min灭菌，无菌条件下分装于眼药瓶中，即得滴眼剂。

实施例11：不同pH的药物组合物的兔角膜离体渗透性试验比较

取体重2.5-3.0kg的家兔30只作为实验动物，分为6组，记为A-F组。使用实施例6或7中的苯丙烯酸类化合物(E)-3-(3’,4’-二甲氧基苯基)-2-(3”,4”,5”-三甲氧基苯基)2-丙烯酸正丁铵盐配置成六种不同的溶液，分别标记为A-F溶液，并对应以上A-F组家兔进行给药。

A溶液：所述化合物水溶液，pH为7.0；

B溶液：所述化合物水溶液，加0.1mg/ml牛磺酸，pH为4.0；

C溶液：所述化合物水溶液，加0.1mg/ml牛磺酸，pH为6.0；

D溶液：所述化合物水溶液，加0.1mg/ml牛磺酸，调pH为7.0；

E溶液：所述化合物水溶液，加0.1mg/ml牛磺酸，pH为8.0；

F溶液：所述化合物水溶液，加0.1mg/ml牛磺酸，pH为9.0；

该化合物在各组溶液中的浓度均为浓度为0.5mg/ml。

试验方法：将家兔从耳缘静脉注射空气使之安乐死，立即摘取眼球放入培养液中，然后分离角膜,，用BSS溶液冲洗后，夹于扩散池两个半池之间，上皮层面向样品池，内皮层面向接受池。首先向接受池加入4.5ml的BSS溶液(含10％乙醇，pH7.4)，样品池放入4.0ml所述化合物水溶液。两个半池分别用磁力搅拌器进行搅拌，扩散池进行水浴使温度保持在37℃。由此模拟眼部角膜渗透。于1小时后从接受池取出0.2ml液体，高效液相色谱法测定药物含量，结果见表5。各组分别按照以上操作测定药物的角膜渗透性，实验重复五次。

表5 各组药物兔角膜渗透试验结果(n＝5)

组别	接受池药物浓度(ng/ml)
		A组	109.32±3.94
B组	369.58±13.26
		C组	613.43±11.73
D组	976.94±17.63
		E组	868.44±19.22
F组	548.52±14.68

从表1可知，B-F组药物的角膜渗透性都显著高于A组，表面添加牛磺酸的滴眼液对家兔角膜渗透性显著增加，最高可增加10倍。B-F组之间的对比表明通过改变药物组合物的pH值，可进一步增加药物对角膜的渗透性，pH为6.0-8.0时，都能取得较好的药物渗透性，其中pH值为7.0时，渗透性最大。

实施例12：眼部刺激性试验

家兔20只作为实验动物。将动物分为2组，每组10只，分别为实验组和正常对照组。实验组将实施例6所制备的滴眼液施用于家兔左右眼，5次/天，1-2滴/次，连续7天；空白对照组不滴任何药液，作为对照。

观察方法：观察并记录动物有无躁动不安、食欲不振、抓鼻现象；于末次给药2h后用眼科反光镜检查大白兔眼结膜、角膜、眼睑，观察有无充血、水肿现象。

结果：两组均未见试验家兔的眼结膜、角膜、眼睑有明显充血、水肿等现象，表明本发明所提供的苯丙烯酸类化合物及包含其的组合物经多次给药未见对动物有眼部刺激性反应。

实施例13：滴眼剂稳定性试验

按实施例6方法配置三批滴眼液用于稳定性考察试验。

考察指标：外观性状、含量测定、有关物质。

1)影响因素试验：将滴眼剂分别放置于60℃、4500Lx条件，于第5、10天取样检定各项考察指标。结果见表6和表7。

表6 高温试验结果

表7 反光照试验结果

实验结果表明，该滴眼剂稳定性较好，各项考察指标均符合规定。

2)低温冻融试验

取一批实施例6的滴眼剂置-10℃至-20℃的条件下放置2天，取出后置于40℃条件下放置2天，即完成一个循环，共进行三个循环。于第一循环结束(4天)及第三循环结束(12天)时取样测定各项指标，与0天的数据比较，结果见表8。

表8 低温冻融试验结果

试验结果表明：经三个循环后，该滴眼剂与0天数据相比各项指标没有改变。

3)加速试验

将三批实施例6的滴眼剂按市售包装置于40℃的恒温箱中6个月，于1、2、3、6个月末取样测定。结果表明：滴眼剂在市售包装条件下，于40℃的条件下保存6个月，各组分含量与0月相比无明显变化。具体数据见表9。

4)长期试验

将实施例6滴眼剂按市售包装置于留样室(温度25℃±2℃，于0、3、6、12月末取样测定。长期试验结果表明：该滴眼剂在室温条件下保存6个月，样品的质量与0月相比无明显变化，具体数据间表9。

表9 加速试验和长期试验结果

影响因素实验、加速实验和长期留样实验表明，该滴眼剂稳定性良好，各项考察指标均符合规定。

另外，肿瘤试验的结果显示，当式(I)中的R₆为正丙胺基时，化合物的毒性比式(I)中的R₆为异丙胺基时的毒性小。

本发明提供一种苯乙烯酸类化合物，其具有在眼内作用时间长的优点，并通过与特定的化合物及药学上可接受的辅料形成组合物，在一定pH下能显著增加药物对角膜的渗透性，使药物能够迅速渗透达到眼部病灶部位起到长效作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.一种苯乙烯酸化合物，其特征在于，所述苯乙烯酸化合物具有式(I)的结构：

其中R₁、R₄和R₅为氢，R₂和R₃为甲氧基，R₆为具有3-6个碳原子的直链烷基。

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：根据权利要求1所述的苯乙烯酸化合物、有机羧酸、pH调节剂以及任选的一种或多种药学上可接受的辅料，且所述药物组合物的pH值为6-8；其中所述苯乙烯酸化合物按重量计占所述药物组合物的0.05-1.00％，所述有机羧酸按重量计占所述药物组合物的0.01-0.50％。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述有机羧酸为氨基酸、牛磺酸和甲磺酸中的一种或至少两种的混合物。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述有机羧酸为牛磺酸。

5.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述pH调节剂包括氢氧化钠、氢氧化钾、二乙醇胺和三乙醇胺。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述pH调节剂为三乙醇胺。

7.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的pH值为6.5-7.5。

8.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述苯乙烯酸化合物按重量计占所述药物组合物的0.20-0.50％，所述有机羧酸按重量计占所述药物组合物的0.20-0.50％。

9.根据权利要求2-8任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过眼部给药的方式进行施用。

10.根据权利要求2-8任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括滴眼剂、眼膏、眼用凝胶、纳米制剂、微球制剂和脂质体制剂，所述的滴眼剂包括水溶液、混悬剂和乳剂。

11.根据权利要求1所述的苯乙烯酸化合物在制备预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病眼病包括眼底血管瘤、眼底出血、泪囊炎、青光眼、白内障、玻璃体浑浊、视神经萎缩、黄斑变性和视网膜脱落中的一种或多种的组合。

12.根据权利要求2所述的药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病眼病包括与糖尿病相关的视网膜病变、眼底血管瘤、眼底出血、泪囊炎、青光眼、白内障、玻璃体浑浊、视神经萎缩、黄斑变性和视网膜脱落中的一种或多种的组合。