WO2006103251A1 - Verwendung von proteinen als demulgatoren - Google Patents

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WO2006103251A1 PCT/EP2006/061132 EP2006061132W WO2006103251A1 WO 2006103251 A1 WO2006103251 A1 WO 2006103251A1 EP 2006061132 W EP2006061132 W EP 2006061132W WO 2006103251 A1 WO2006103251 A1 WO 2006103251A1
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Werner Schmitt
Marcus Guzmann
Claudius Kormann
Matthias Kiefer
Claus Bollschweiler
Thomas Subkowski
Hans-Georg Lemaire
Marvin Karos
Ulf Baus
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Definitions

  • Hydrophobins have a marked affinity for interfaces and are therefore suitable for coating surfaces to alter the properties of the interfaces by forming amphiphatic membranes.
  • Teflon can be coated by means of hydrophobins to obtain a hydrophilic surface.
  • GB 195,876 discloses a method of breaking water-in-oil emulsions using colloids.
  • colloids are proteins such as gelatin, casein, albumin or polysccharides such as gum arabic or gum tragacanth.
  • hydrophobins or derivatives thereof improve the phase separation of at least two liquid phases. This is particularly advantageous if rapid phase separation is to be achieved or the occurrence of emulsions is to be prevented. Here even small amounts are extremely effective. Likewise, this property can be used if already existing emulsions are to be broken up. Compounds that break emulsions are also referred to as demulsifiers.
  • the amino acids designated C 1 to C 8 are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least 5, more preferably at least 6 and in particular at least 7, of the positions C 1 to C 8 should consist of cysteines. Cysteines can either be reduced in the proteins according to the invention or can form disulfide bridges with one another.
  • X, C and the indices standing at X and C have the above meaning
  • the indices n and m are numbers between 0 and 300
  • the proteins are further characterized by the contact angle change mentioned above, and furthermore, at least 6 of the radicals named C are cysteine. Most preferably, all C radicals are cysteine.
  • the proteins are further characterized by the abovementioned contact angle change, and at least 6 of the C named residues are cysteine. Most preferably, all of the C radicals are cysteine.
  • radicals X n and X m may it be peptide sequences that are growing naturally, also linked to a hydrophobin. However, one or both residues may also be peptide sequences that are not naturally linked to a hydrophobin. Including such radicals X N and / or X are m to understand, in which a naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence is extended tidsequenz by a non-naturally occurring in a hydrophobin.
  • the fusion hydrophobin in addition to the fusion partner as a group X n or X n , nor a so-called affinity domain (affinity tag / affinity tail) on.
  • affinity domains include (His) k , (Arg) k , (Asp) k , (Phe) k or (Cys) k groups, where k is generally a natural number from 1 to 10. It may preferably be a (His) k group, where k is 4 to 6.
  • contact angle measurements is known in principle to the person skilled in the art.
  • the measurements refer to room temperature and water drops of 5 ⁇ l and the use of glass slides as substrate.
  • the exact experimental conditions for an exemplary method for measuring the contact angle are shown in the experimental part.
  • the fusion proteins used according to the invention have the property of increasing the contact angle by at least 20 °, preferably at least 25 °, particularly preferably at least 30 °, in each case compared with the contact angle of a water droplet of the same size with the uncoated glass surface.
  • hydrophobins for carrying out the present invention are the dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi, basf2 hydrophobins structurally characterized in the Sequence Listing below. It may also be just parts or derivatives thereof. It is also possible to link together a plurality of hydrophobin moieties, preferably 2 or 3, of the same or different structure and to link them together with a corresponding suitable polypeptide sequence which is not naturally associated with a hydrophobin.
  • proteins yaad-XadewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basf 1-his (SEQ ID NO: 24) with the polypeptide sequences given in parentheses and the nucleic acid sequences coding therefor, in particular the sequences according to SEQ ID NO: 19, 21, 23.
  • proteins which, starting from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO. 20, 22 or 24 shown by exchange, insertion or deletion of at least one, up to 10, preferably 5, more preferably 5% of all amino acids, and still have at least 50% of the biological property of the starting proteins particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is hereby understood as the change in the contact angle already described by at least 20 °.
  • fusion proteins can preferably be carried out by genetic engineering methods in which a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular DNA sequence, are combined in such a way that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence.
  • a production method is disclosed, for example, in DE 102005007480.4.
  • Suitable host organisms (production organisms) for said production process may be prokaryotes (including archaea) or eukaryotes, especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spe ⁇ , Lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (or related cells) and others.
  • prokaryotes including archaea
  • eukaryotes especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Asperg
  • the invention furthermore relates to the use of expression constructs containing, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide used according to the invention, as well as vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • operably linked sequences are targeting sequences as well as enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are for. As described in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more so-called “enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 "end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids may be contained in one or more copies in the construct.
  • the construct may also contain further markers, such as antibiotic resistances or genes that complement xanthropy, optionally for selection on the construct.
  • vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally.
  • Suitable plasmids are described, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL.24, pl_G200, pUR290 J plN-III lI 3-B1 J tgt11 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667, in fungi pALS1, plL2 or pBB116, in yeasts 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 or p
  • the plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). be removed.
  • nucleic acid construct for expression of the further genes contained additionally 3 'and / or 5 "-terminal regulatory sequences for increasing the expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • genes and protein expression are intended to allow the targeted expression of genes and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the vector containing the nucleic acid construct or the nucleic acid may also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA may consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or the nucleic acid.
  • An expression cassette is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator. or polyadenylation signal.
  • Common recombinant and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, EFFritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and TJ Silhavy, ML Berman and LW Enquist, Experiments with Gene Fusion, CoId Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is inserted for expression in a suitable host organism, advantageously into a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector and can be used to produce the hydrophobins or derivatives thereof used in the invention.
  • the recombinant constructs described above are introduced into a suitable host system and expressed.
  • the vector used for homologous recombination may be designed such that the endogenous gene is mutated or otherwise altered upon homologous recombination but still encodes the functional protein (eg, the upstream regulatory region may be altered such that expression the endogenous protein is changed).
  • the modified section of the invention according to The gene used is in the homologous recombination vector.
  • suitable vectors for homologous recombination is e.g. As described in Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503.
  • the cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the enzymes may be isolated from the organisms by the method described in the Examples or used as crude extract for the reaction.
  • the hydrophobins or functional, biologically active fragments thereof used according to the invention can be prepared by means of a process for recombinant production in which a polypeptide-producing microorganism is cultivated, optionally the expression of the proteins is induced and these are isolated from the culture.
  • the proteins can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant microorganism can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9. Specifically, suitable culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J.
  • the cells are then disrupted if the proteins are not secreted into the culture medium and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells can optionally by high-frequency ultrasound, by high pressure, such as. B. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods are digested.
  • Purification of the proteins can be achieved by known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as by other conventional methods, such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Water de Gruyer, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • the fusion hydrophobins with special anchor groups to facilitate isolation and purification, which can bind to corresponding complementary groups on solid supports, in particular suitable polymers.
  • Such solid carriers can be used, for example, as a filling for chromatography columns, and in this way the efficiency of the separation can generally be increased significantly.
  • separation methods are also known as affinity chromatography.
  • anchor groups can be used in the production of proteins vector systems or oligonucleotides that extend the cDNA to certain nucleotide sequences and thus encode altered proteins or fusion proteins. Proteins modified for ease of purification include so-called "tags" acting as anchors, such as the modification known as hexa-histidine anchors.
  • Histidine-anchored modified fusion hydrophobins can be purified chromatographically using, for example, nickel-Sepharose as column filling.
  • the fusion hydrophobin can then be eluted from the column by suitable means for elution, such as an imidazole solution.
  • the cells are first separated by means of a suitable method from the Fermetationsbrühe, for example by microfiltration or by centrifugation. Subsequently, the cells can be disrupted by means of suitable methods, for example by means of the methods already mentioned above, and the cell debris is separated from the inclusion bodies. The latter can be done advantageously by centrifuging. Finally, the inclusion bodies can be disrupted in a manner known in principle in order to liberate the fusion hydrophobins. This can be done for example by acids, bases and / or detergents.
  • the inclusion bodies with the fusion hydrophobins used according to the invention can generally be completely dissolved within about 1 h already using 0.1 M NaOH.
  • the purity of the fusion hydrophobins obtained by this simplified process is generally from 60 to 80% by weight with respect to the amount of all proteins.
  • the solutions obtained by the described simplified purification process can be used without further purification to carry out this invention.
  • hydrophobins prepared as described can be used as "pure" hydrophobins both directly as fusion proteins and after cleavage and separation of the fusion partner.
  • a potential cleavage site (specific recognition site for proteases) in the fusion protein between the hydrophobin part and the fusion partner part.
  • Suitable cleavage sites are, in particular, those peptide sequences which otherwise do not occur in the hydrophobin part or in the fusion partner part, which can be easily determined with bioinformatic tools.
  • Particularly suitable are, for example, BrCN cleavage on methionine, or protease-mediated cleavage with factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV cleavage (Tobacca etch virus protease).
  • the hydrophobins or derivatives thereof can be used to improve the phase separation in compositions containing at least two liquid phases.
  • These may be any compositions as long as they have at least two liquid phases.
  • compositions which are in the form of an emulsion prior to the addition of the at least one hydrophobin or derivative thereof.
  • composition may also have further phases in addition to the at least two liquid phases.
  • the at least two liquid phases are two liquid phases of different density, for example an oil and water, two aqueous solutions of different densities, two organic solutions of different densities, a fuel and water, a fuel and water or a solvent and water.
  • an aqueous solution is understood as meaning solutions which comprise water, optionally in combination with another solvent.
  • Each of the liquid phases may contain further substances in the context of the present invention.
  • an oil is preferably a crude oil.
  • the present invention therefore relates to a use as described above of at least one hydrophobin or at least one derivative thereof, wherein the composition containing at least two liquid phases is selected from the group consisting of
  • compositions containing oil preferably crude oil, and water
  • compositions containing fuel or water and water compositions containing fuel or water and water
  • Reaction mixtures containing at least two liquid phases Reaction mixtures containing at least two liquid phases.
  • composition may also contain other phases, for example a solid or liquid phase, in particular a solid phase.
  • the hydrophobins or derivatives thereof can be used for all applications known to those skilled in the art.
  • the use as a demulsifier in gasoline / water mixtures as a demulsifier in other fuel or fuel / water mixtures, the phase separation in chemical reactions, especially in large-scale processes, the emulsion cleavage between crude oil and water in the crude oil production or crude oil production, as well as the desalination of crude oil by extraction of crude oil with water and subsequent cleavage of the resulting emulsion.
  • large-scale chemical processes all of these are suitable in which a phase separation is to be brought about, for example the hydroforming of polyisobutene with cobalt catalysts, the catalyst removal taking place in an aqueous state.
  • hydrophobins or derivatives thereof are also used according to the invention for the phase separation of compositions containing at least two liquid Improve phases that occur in the course of a reaction, ie that form in the course of a reaction or occur by the addition of a solvent or a component.
  • extracted oil is generally present as a relatively stable water-in-oil emulsion which, depending on the type of deposit, may contain up to 90% by weight of water.
  • extracted oil falls after the separation of a major part of the water to a crude oil, which still contains about 2 to 3 wt.% Water.
  • This is problematic insofar as the water is on the one hand very saline and thus corrosive acts, on the other hand is increased by the residual water to be transported and stored volume, resulting in increased costs.
  • hydrophobins or derivatives thereof can be used to particular advantage in order to improve the phase separation in these compositions. It is achieved a very fast separation.
  • the demulsifier must be adjusted to the type of emulsified oils and fats as well as optionally contained emulsifiers and surfactants to achieve optimum effect.
  • Breaking of emulsions may be additionally supported by an elevated temperature, for example a temperature of 0 to 100 0 C, for example from 10 to 80 ° C, in particular from 20 to 60 ° C.
  • Other applications of the invention include, for example, the demulsification of impregnating emulsions in the chipboard and textile industry, as well as of Drug emulsions.
  • Another application is the demulsification of organically treated effluents, such as industrial and commercial effluents, particularly from metalworking, such as metalworking coolants, tanneries and oil refineries, and domestic sources that produce oil / water emulsions.
  • Such wastewater is produced, for example, in the processing of crude oil in refineries and petrochemical plants. Before these effluents can be fed to the treatment plant, it is necessary to separate oil residues, which are often in the form of an emulsion.
  • a further application according to the invention is the emulsion splitting of oil-in-water or water-in-oil mixtures, for example emulsions which have been used as cooling lubricants and are to be recycled.
  • emulsions which have been used as cooling lubricants and are to be recycled.
  • water / oil mixtures also occur on board seagoing vessels as bilgewater.
  • the separation of emulsions is necessary in order to be able to separate the water and to reduce the amount of the solvent to be disposed of.
  • the amount of hydrophobin or derivative thereof used can vary within wide limits, the amount advantageously being matched to the composition per se and optionally to other components contained in the composition.
  • the composition contains substances which retard or worsen a phase separation of the at least two liquid phases, for example surfactants or emulsifiers, it is advantageous to use a larger amount of a hydrophobin or a derivative thereof.
  • oils in particular crude oils, consist of a mixture of many chemical compounds, it is necessary, due to the different chemical composition of the oil, the water and salt fractions and the concrete conditions of emulsion splitting, such as temperature, duration of emulsion splitting, type of metered addition and interactions with other components of the mixture to tailor the demister to the specific conditions.
  • the at least one hydrophobin or derivative thereof can be used according to the invention in any suitable amount.
  • the at least one hydrophobin or derivative thereof is used in an amount of 0.0001 to 1000 ppm on the entire composition, used; preferably in an amount of 0.001 to 500 ppm, more preferably of 0.01 to 200 ppm or 0.01 to 100 ppm and most preferably 0.1 to 50 ppm.
  • the present invention relates to a use as described above, wherein the at least one hydrophobin or the at least one derivative thereof, in an amount of 0.0001 to 1000 ppm, based on the total composition, is used.
  • concentration used will be determined by one skilled in the art according to the nature of the composition to be demulsified.
  • the hydrophobin or derivative thereof will generally be present in an amount of from 0.001 to 10 ppm, preferably from 0.005 to 2 ppm, more preferably from 0.01 to 1 ppm, particularly preferably 0.05 to 0.5 ppm and more preferably used from 0.01 to 0.1 ppm.
  • the hydrophobin or derivative thereof will generally be present in an amount of from 1 to 1000 ppm, preferably from 1 to 800 ppm, more preferably from 5 to 500 ppm, most preferably 10 used to 200 ppm and more preferably from 15 to 100 ppm and used, for example 20 to 50 ppm.
  • the hydrophobin or derivative thereof will generally be present in an amount of from 1 to 1000 ppm, preferably from 1 to 500 ppm, in particular from 5 to 250 ppm, more preferably 10 to 200 ppm and more preferably used from 15 to 100 ppm.
  • the composition contains, in addition to the at least one hydrophobin or derivative thereof, further compounds which improve the phase separation.
  • further compounds which improve the phase separation.
  • suitable as a further compound for improving the phase separation are oxyalkylated phenol-formaldehyde resins, EO / PO block copolymers, crosslinked diepoxides, polyamides or their derivatives, in particular for use as emulsion breakers in crude oil production Alkoxylates, salts of sulfonic acids, ethoxylated fatty amines, succinates and the compounds mentioned in DE 10 2005 006 030.7 for such applications.
  • the present invention relates to a use as described above, wherein in addition to at least one hydrophobin or the at least one derivative thereof, at least one further compound is used which improves the phase separation.
  • the present invention also relates to a process for the separation of at least two liquid phases in a composition comprising at least two liquid phases, comprising the addition of at least one hydrophobin or at least one derivative thereof to the composition.
  • the composition may be a composition as described above containing at least two liquid phases.
  • the present invention therefore relates to such a process, wherein the composition containing at least two liquid phases is selected from the group consisting of
  • compositions containing oil preferably crude oil, and water, compositions containing fuel or water and fuel, reaction mixtures containing at least two liquid phases.
  • the hydrophobins or derivatives thereof can be used in any desired amounts, provided that an improvement in the phase separation is achieved. Particularly suitable is the use of a hydrophobin or derivative thereof in an amount of 0.0001 to 1000 ppm, based on the total composition.
  • the present invention relates to a method described above, wherein the at least one hydrophobin or the at least one derivative thereof, in an amount of 0.0001 to 1000 ppm, based on the total composition, is used. Preferred amounts for the respective systems have already been mentioned.
  • the process according to the invention may comprise further steps, for example those which improve a phase separation or the breaking of emulsions.
  • This may be, for example, a temperature increase or centrifugation.
  • Such a step may occur before, during or after the addition of the at least one hydrophobin or derivative thereof.
  • the present invention therefore relates to a method as described above, wherein the method comprises, before or after the addition of the at least one hydrophobin or the at least one derivative thereof, an increase in the temperature of the composition comprising at least two liquid phases.
  • hydrophobins or derivatives thereof for example formulations containing fuels or fuels, may be added. This allows for contact of the formulation with water rapid segregation or prevents the formation of emulsions.
  • the formulation comprising fuels or fuels may contain further additives which are customarily contained in such formulations.
  • Suitable additives are mentioned, for example, in WO 2004/087808.
  • the present invention therefore also relates to a formulation comprising at least one compound selected from the group consisting of fuels, fuels, crude oils or water- or oil-soluble polymer solutions and at least one hydrophobin or derivatives thereof.
  • the amount of hydrophobin or derivative thereof used may vary depending on the other additives, as long as an improvement of the phase separation upon contact of the formulation with water is ensured.
  • the amount of hydrophobin or derivative used is preferably in the range from 0.0001 to 1000 ppm, preferably from 0.001 to 500 ppm, more preferably from 0.01 to 100 ppm.
  • the present invention also relates to a formulation as described above wherein the hydrophobin or the derivative thereof is contained in the formulation in an amount of from 0.0001 to 1000 ppm, based on the total formulation. If the formulation is a mixture containing a crude oil, the hydrophobin or derivative thereof is usually added to this formulation in an amount of from 1 to 1000 ppm, preferably from 10 to 800 ppm, in particular from 10 to 500 ppm.
  • the hydrophobin or derivative thereof of this formulation is usually in an amount of 0.001 to 0.5 ppm, preferably from 0.005 to 0.3 ppm, in particular of 0 , 01 to 0.2 ppm added.
  • the present invention relates to a formulation as described above wherein the formulation contains at least one fuel or power and the hydrophobin or derivative thereof in an amount of 0.001 to 0.5 ppm, based on the total formulation, in the formulation is included.
  • fuels are understood as meaning, for example, light, medium or heavy fuel oils.
  • fuels are understood as meaning, for example, gasoline fuels, diesel fuels or turbine fuels. Particularly preferred are gasoline fuels.
  • the fuels may contain other additives.
  • Usual additives are generally known to the expert. Suitable additives and solvents are mentioned, for example, in WO 2004/087808.
  • additives with detergent action and / or with valve seat wear-inhibiting effect are additives with detergent action and / or with valve seat wear-inhibiting effect (hereinafter referred to as detergent additives).
  • This detergent additive has at least one hydrophobic hydrocarbon radical with a number-average molecular weight M n of 85 to 20 000 g / mol and at least one polar group selected from:
  • T polyoxy-C 2 to C 4 alkylene moieties terminated by hydroxyl groups, mono- or polyamino groups, wherein at least one nitrogen atom has basic properties, or terminated by carbamate groups;
  • the hydrophobic hydrocarbon radical in the above detergent additives which provides the sufficient solubility in the fuel, has a number average molecular weight (Mn) of 85 to 20,000, especially from 113 to 10,000, especially from 300 to 5000.
  • Mn number average molecular weight
  • Mono- or polyamino (a) -containing additives are preferably polyalkylene mono- or polyalkene polyamines based on polypropene or conventional (ie with predominantly intermediate double bonds) polybutene or polyisobutene having M n from 300 to 5000 g / mol. If one starts with the preparation of the additives of polybutene or polyisobutene with predominantly central double bonds (usually in the beta and gamma position), the preparation route by chlorination and subsequent amination or by oxidation of the double bond with air or ozone to carbonyl offers or carboxyl compound and subsequent amination under reductive (hydrogenating) conditions. For amination here amines, such as.
  • ammonia monoamines or polyamines, such as dimethylaminopropylamine, ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine or tetraethylenepentamine, are used.
  • Corresponding additives based on polypropene are described in particular in WO 94/24231.
  • monoamino groups (a) containing additives are the polyisobutene epoxides by reaction with amines and subsequent dehydration and reduction of the amino alcohols obtainable compounds, as described in particular in DE-A 196 20 262.
  • nitropolyisobutenes eg., Alpha-pha, beta-dinitropolyisobutene
  • mixed hydroxynitropolyisobutenes eg., Alpha-nitro-beta-hydroxypolyisobutene
  • Carboxyl groups or their alkali metal or alkaline earth metal salts (d) containing additives are preferably copolymers of C2-C40 olefins with maleic anhydride having a total molecular weight of 500 to 20,000 whose carboxyl groups wholly or partially to the alkali metal or alkaline earth metal salts and a remainder of the Carboxyl groups are reacted with alcohols or amines.
  • Such additives are known in particular from EP-A 0 307 815.
  • Such additives are mainly used to prevent valve seat wear and, as described in WO 87/01126, can be advantageously used in combination with conventional fuel detergents such as poly (iso) butenamines or polyetheramines.
  • Sulfonic acid groups or their alkali metal or alkaline earth metal salts (e) containing additives are preferably alkali metal or alkaline earth metal salts of a sulfosuccinic acid alkyl ester, as described in particular in EP-A 0 639 632.
  • Such additives are mainly used to prevent valve seat wear and can be used to advantage in combination with conventional fuel detergents such as poly (iso) butenamines or polyetheramines.
  • Polyoxy-C2-C4-alkylene (f) containing additives are preferably polyether or polyetheramines, which by reaction of C2-C60-alkanols, C6-C30-alkanediols, mono- or di-C2-C30-alkylamines, C1-C30 Alkylcyclohexanolen or C1-C30-alkylphenols with 1 to 30 moles of ethylene oxide and / or propylene oxide and / or butylene oxide per hydroxyl group or amino group and, in the case of polyether amines, by subsequent reductive amination with ammonia, monoamines or polyamines nen are available.
  • Such products are described in particular in EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 and US 4,877,416.
  • polyethers such products also meet carrier oil properties. Typical examples of these are tridecanol or Isotridecanolbutoxylate, Isononylphenolbutoxylate and Polyisobute- nolbutoxylate and propoxylates and the corresponding reaction products with ammonia.
  • Carboxyl ester groups (g) containing additives are preferably esters of mono-, di- or tricarboxylic acids with long-chain alkanols or polyols, especially those having a minimum viscosity of 2 mm 2 / s at 100 ° C, as described in particular in DE-A 38 38 918 are.
  • mono-, di- or tricarboxylic acids it is possible to use aliphatic or aromatic acids, especially suitable ester alcohols or polyols are long-chain representatives having, for example, 6 to 24 C atoms.
  • esters are adipates, phthalates, isophthalates, terephthalates and trimellitates of iso-octanol, iso-nonanol, iso-decanol and of isotridecanol. Such products also meet carrier oil properties.
  • derivatives with aliphatic polyamines such as ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine or tetraethylenepentamine.
  • Such Otto fuel additives are described in particular in US 4,849,572.
  • Mannich reaction of substituted phenols with aldehydes and mono- or polyamines generated groupings (i) containing additives are preferably reaction products of polyisobutene-substituted phenols with formaldehyde and Mono- or polyamines such as ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine or dimethylaminopropylamine.
  • Such "polyisobutene-Mannich bases" are described in particular in EP-A 0 831 141.
  • formulations according to the invention can moreover be combined with still further customary components and additives.
  • carrier oils without pronounced detergent action are to be mentioned here.
  • Suitable mineral carrier oils are fractions obtained in petroleum processing, such as bright stock or base oils with viscosities such as from class SN 500-2000; but also aromatic hydrocarbons, paraffinic hydrocarbons and alkoxyalkanols. According to the invention is suitable also is known as a "hydro-crack oil" and obtained in the refining of mineral oil fraction (vacuum distillate cut having a boiling range of about 360-500 0 C, available surfaces of high-pressure catalytically hydrogenated and isomerized and also deparaffinized natural mineral oil). Also suitable are mixtures of the abovementioned mineral carrier oils.
  • Examples of synthetic carrier oils which can be used according to the invention are selected from: polyolefins (polyalphaolefins or polyethylenemolefins), (poly) esters, (poly) alkoxylates, polyethers, aliphatic polyetheramines, alkylphenol-initiated polyethers, alkylphenol-initiated polyetheramines and carboxylic esters of long-chain alkanols.
  • polyethers or polyetheramines are preferably polyoxy-C2-
  • Such products are described in particular in EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 and US 4,877,416.
  • polyetheramines poly-C 2 -C 6 -alkylene oxide amines or functional derivatives thereof can be used. Typical examples of these are tridecanol or Isotridecanolbutoxylate, Isononylphenolbutoxylate and Polyisobutenolbu- toxylate and propoxylates and the corresponding reaction products with ammonia.
  • carboxylic acid esters of long-chain alkanols are in particular esters of mono-, di- or tricarboxylic acids with long-chain alkanols or polyols, as described in particular in DE-A 38 38 918.
  • mono-, di- or tricarboxylic acids it is possible to use aliphatic or aromatic acids, especially suitable ester alcohols or polyols are long-chain representatives having, for example, 6 to 24 carbon atoms.
  • suitable representatives of the esters are adipates, phthalates, isophthalates, terephthalates and trimellitates of isooctanol, isononanol, isodecanol and isotricanecanol, such as e.g. Di (n- or iso-tridecyl) phthalate.
  • suitable synthetic carrier oils are alcohol-started polyethers with about 5 to 35, such as. B. about 5 to 30, C3-C6 alkylene oxide units, such as. B. selected from propylene oxide, n-butylene oxide and i-butylene oxide units, or mixtures thereof.
  • suitable starter alcohols are long-chain alkanols or long-chain alkyl-substituted phenols, where the long-chain alkyl radical is in particular a straight-chain or branched C 6 -C 18 -alkyl radical.
  • Preferred examples are tridecanol and nonylphenol.
  • suitable synthetic carrier oils are alkoxylated alkylphenols, as described in DE-A 10 102 913.6.
  • ком ⁇ онентs are corrosion inhibitors, for example based on film-forming ammonium salts of organic carboxylic acids or of heterocyclic aromatics in the case of non-ferrous metal corrosion protection; Antioxidants or stabilizers, for example based on amines such as p-phenylenediamine, dicyclohexylamine or derivatives thereof or of phenols such as 2, 4-di-tert-butylphenol or 3, 5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenylpropionklare; other conventional demulsifiers; Antistatic agents; Metallocenes such as ferrocene; methylcyclopentadienyl; Lubricity additives such as certain fatty acids, alkenyl succinic acid esters, bis (hydroxyalkyl) fatty amines, hydroxyacetamides or castor oil; as well as dyes (markers).
  • amines are added to lower the pH of the fuel.
  • the said detergent additives with the polar groups (a) to (i) are added to the fuel usually in an amount of 10 to 5000 ppm by weight, in particular 50 to 1000 ppm by weight.
  • the other components and additives mentioned are added, if desired, in customary amounts.
  • fuels and fuels which are suitable according to the invention are all fuels and fuels known to the person skilled in the art, for example gasolines, as described, for example, in LJII-Mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th ed. 1990, Volume A16, p. 719ff. are described.
  • suitable fuels are also diesel fuel, kerosene and jet fuel.
  • a gasoline with an aromatics content of 60, such. B. maximum 42 vol .-% and a maximum sulfur content of 2000, such as. B. maximum 150 ppm by weight is suitable.
  • the aromatic content of the gasoline is for example 10 to 50, such as. B. 30 to 42 vol .-%, in particular 32 to 40 vol .-%.
  • the sulfur content of the gasoline is for example 2 to 500, such as. B. 5 to 150 ppm by weight, or 10 to 100 ppm by weight.
  • a suitable gasoline fuel for example, an olefin content up to 50 vol .-%, such as. B. from 6 to 21 vol .-%, in particular 7 to 18 vol .-%; a benzene content of up to 5 vol .-%, such as. B. 0.5 to 1.0 vol .-%, in particular 0.6 to 0.9 vol .-% and / or an oxygen content of up to 25 wt -.%, Such as. For example, up to 10% by weight or 1.0 to 2.7% by weight, in particular from 1.2 to 2.0% by weight.
  • the content of alcohols and ethers in gasoline can vary over a wide range. Examples of typical maximum contents are 15% by volume for methanol, 65% by volume for ethanol, 20% by volume for isopropanol, 15% by volume for tert-butanol, 20% by volume for isobutanol and 20% by weight for isobutanol for ethers with 5 or more C atoms in the molecule 30 vol .-%.
  • the summer vapor pressure of a gasoline suitable according to the invention is usually not more than 70 kPa, in particular 60 kPa (each at 37 ° C).
  • the ROZ of the gasoline is usually 75 to 105.
  • a common range for the corresponding MOZ is 65 to 95.
  • the specified specifications are determined by conventional methods (DIN EN 228).
  • Oligonucleotides Hal570 and Hal571 were used to perform a polymerase chain reaction.
  • the PCR fragment obtained contained the coding sequence of the gene yaaD / yaaE from Bacillus subtilis, and at the ends in each case an NcoI or BglII restriction cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonucleases NcoI and BglII. This DNA fragment was used as an insert, and in the previously linearized with the restriction endonucleases Ncol and BglII vector pQE60 from Qiagen Moniert.
  • the resulting vectors pQE60YAAD # 2 / pQE60YaaE # 5 can be used to express proteins consisting of, YAAD :: HIS 6 and YAAE :: HIS 6 , respectively.
  • Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
  • Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac
  • Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg
  • Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
  • the template DNA was genomic DNA of the mold
  • the resulting PCR fragment contained the coding
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonuclease Barn HI. This DNA fragment was used as an insert and cloned into the vector pQE60YAAD # 2 previously linearized with the restriction endonuclease BgIII.
  • the resulting vector # 508 can be used to express a fusion protein consisting of, YAAD :: Xa :: dewA :: HIS 6 .
  • KaM416 GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • plasmid # 513 The cloning of plasmid # 513 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 434 and KaM 435.
  • KaM434 GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
  • plasmid # 507 The cloning of plasmid # 507 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • the template DNA used was an artificially synthesized DNA sequence-hydrophobin BASF1 (see Appendix, SEQ ID NOS 11 and 12).
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-
  • Plasmid # 506 The cloning of plasmid # 506 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • Plasmid # 526 was analogous to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM464 and KaM465.
  • Schyzophyllum commune cDNA was used as template DNA (see Appendix, SEQ ID NOS: 9 and 10).
  • KaM464 CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
  • KaM465 GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
  • 100 g cell pellet (100-500 mg hydrophobin) are made up to 200 ml total volume with 50 ml sodium phosphate buffer, pH 7.5 and resuspended.
  • the suspension is treated with an Ultraturrax type T25 (Janke and Kunkel, IKA-Labortechnik) for 10 minutes and then for 1 hour at room temperature with 500 units of benzonase (Merck, Darmstadt, Order No. 1.01697.0001) to break down the nucleic acids incubated.
  • filter with a glass cartridge P1.
  • two homogenizer runs are carried out at 1500 bar (Microfluidizer M-110EH, Microfluidics Corp.).
  • the homogenate is centrifuged (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C, 12,000 rpm, 23,000 g), the supernatant placed on ice and the pellet resuspended in 100 ml sodium phosphate buffer, pH 7.5 , Centrifugation and resuspension are repeated 3 times with the sodium phosphate buffer containing 1% SDS at the third repetition. After resuspension, stir for one hour and perform a final centrifugation (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C, 12,000 rpm, 23,000 g).
  • the hydrophobin is contained in the supernatant after the final centrifugation ( Figure 1).
  • the experiments show that the hydrophobin is probably contained in the form of inclusion bodies in the corresponding E. coli cells.
  • 50 ml of the hydrophobin-containing supernatant are applied to a 50 ml nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 column (Amersham) equilibrated with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • the column is washed with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer and the hydrophobin is then eluted with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer containing 200 mM Imidazole.
  • the solution is dialyzed against 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • Figure 1 shows the purification of the prepared hydrophobin: Lane A: Nickel Sepharose column (1:10 dilution)
  • Lanes C - E OD 280 Maxima of elution fractions (WP1, WP2, WP3)
  • Lane F shows the applied marker
  • the hydrophobin of Figure 1 has a molecular weight of about 53 kD.
  • the smaller bands partially represent degradation products of hydrophobin.
  • the samples are air dried and the contact angle (in degrees) of a drop of 5 ⁇ l of water with the coated glass surface determined at room temperature.
  • the contact angle measurement was performed on a device Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). The measurement was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • hydrophobin concentrate yaad-Xa-dewA-HiS ⁇
  • additive packages Modern fuels usually contain a number of different additives (so-called additive packages). If the fuel comes in contact with water in the course of the production or distribution, these additives can develop emulsifying effect and lead to the formation of undesirable fuel-water emulsions. In order to avoid this effect, therefore, demulsifiers are usually added to the fuels.
  • the hydrophobin concentrate was diluted with ethanol and added to a commercial Eurosuper fuel (according to EN 228), which already contained 725 mg / kg of a special performance additive package A.
  • This additive package consists mainly of the polyisobutenamine Kerocom PIBA, carrier oil mixtures, solvents, corrosion inhibitor and friction modifier.
  • Fuel samples were prepared at 0.01, 0.03, 0.05, 0.07, 0.14 and 0.28 mg / kg of hydrophobin.
  • the reference (10-V1) was the A-additive fuel without hydrophobin.
  • 10-V2 1.45 mg / kg of a commercially available demulsifier D based on phenolic resins (ADX 606, from Lubrizol) were used.
  • Emulsion tests according to DIN 51415 were carried out in each case with the fuel samples. In each case 80 ml of fuel and 20 ml of water are intensively mixed with each other. Thereafter, the segregation process is observed as a function of time. The evaluation is based on standards specified in the standard, where 1 stands for a very good segregation and larger numbers for increasingly poorer segregation. The details are contained in the cited DIN standard. Table 1 summarizes results of the experiments. In each case, the assessments of the phase separation layers are listed after 1 min, 5 min, 30 min and 60 min. As a rule, a rating of 1 or 1 b is required after 5 minutes.
  • hydrophobins have a very good demulsifying effect even in extremely small amounts. Already 0.01 ppm of hydrophobin leads to an acceptable result within 1 min. The same effect as with 0.07 mg / kg of hydrophobin is achieved only by adding 1.45 mg / kg of the commercial demulsifier based on phenolic resins to the fuel. When using hydrophobin ity only about 1/20 of the amount of a conventional demulsifier to achieve the same effect required.
  • bovine serum albumin BSA
  • casein bovine serum albumin
  • SEQ ID NO 15 and 16 ie the non-hydrophobin-associated fusion partner alone.
  • the respective protein was added in a concentration of 0.07 mg / kg to a commercial Euro Super fuel (according to EN 228), which already contained 1000 mg / kg of the abovementioned performance additive package A.
  • the only fuel used as a reference was A, without protein.
  • the proteins used have a demulsifying effect, but the rate of demulsification is slower than with the use of hydrophobins.
  • hydrophobin concentrate in various amounts was added to 50 ml of crude oil (sample ex Wintershall AG, Emiichheim, probe 301, residual water content after the use of conventional emulsion breakers about 3%).
  • concentration of hydrophobin in the crude oil was 1 ppm, 10 ppm and 40 ppm. After homogenization, the mixtures were 10 min. at 2000 rpm, centrifuged. The results are shown in Table 3.
  • fusion hydrophobin Yaad-Xa-dewA-HiS ⁇
  • BSA bovine serum albumin
  • the experiment was carried out with a hydrophobin concentrate according to Example 8 (SEQ ID Nos. 19 and 20) and carried out with a commercially available solution of bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the demulsification test was carried out as follows:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens eines Proteins, insbesondere mindestens eines Hydrophobins oder mindestens eines Derivats davon, zur Verbesserung der Phasentrennung in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, Verfahren zur Trennung von mindestens zwei flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, sowie Formulierungen, enthaltend mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kraftstoffen, Brennstoffen, Rohölen oder wasser- oder öllöslichen Polymerlösungen und mindestens ein Protein, insbesondere mindestens ein Hydrophobin oder Derivate davon.

Description

Verwendung von Proteinen als Demulgatoren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens eines Hydrophobins oder mindestens eines Derivats davon zur Verbesserung der Phasentrennung in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, Verfahren zur Trennung von mindestens zwei flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, sowie Formulierungen, enthaltend mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kraftstoffen, Brennstoffen, Rohölen oder wasser- oder öllöslichen Polymerlösungen und mindestens ein Hydrophobin oder Derivate davon.
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteris- tisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf.
Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen, um die Eigenschaften der Grenzflächen durch Bildung von amphiphatischen Membranen zu verändern. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.
Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Ebenso sind Herstell- verfahren für Hydrophobine und Derivate davon bekannt. Beispielsweise DE 10 2005 007 480.4 offenbart ein Herstellverfahren für Hydrophobine und Derivate davon.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-öl-Emulsionen vor. Weiterhin werden phar- mazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen. WO 96/41882 beansprucht darüber hinaus Zusammensetzungen, insbesondere Zusammensetzungen für pharmazeutische Anwendungen, enthaltend Hydrophobine. EP-A 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiff rümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 800C.
WO 03/53383 offenbart die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Keratin- Materialien in kosmetischen Anwendungen.
WO 03/10331 offenbart, dass Hydrophobine oberflächenaktive Eigenschaften aufweisen. So wird ein mit Hydrophobin beschichteter Sensor offenbart, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Substanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.
WO 2004/000880 offenbart ebenfalls die Beschichtung von Oberflächen mit Hydrophobin oder Hydrophobin-ähnlichen Substanzen. Weiter wird offenbart, dass auch Öl-inWasser oder Wasser-in-öl Emulsionen durch Zugabe von Hydrophobinen stabilisiert werden können.
Auch WO 01/74864, die Hydrophobin-ähnliche Proteine betrifft, offenbart, dass diese zur Stabilisierung von Dispersionen und Emulsionen eingesetzt werden können.
Die Verwendung von Proteinen zur Phasentrennung ist prinzipiell bekannt.
GB 195,876 offenbart ein Verfahren zum Brechen von Wasser-in-öl-Emulsionen unter Verwendung von Kolloiden. Als Kolloide werden beispielhaft Proteine wie Gelatine, Casein, Albumin oder Polysccharide wie Gummi Arabicum oder Gummi Tragacanth genannt.
JP-A 11-169177 offenbart die Verwendung von Proteinen mit Lipase-Aktivität zum Brechen von Emulsionen.
WO 01/60916 offenbart die Verwendung von tensidfreien Mischungen aus mindestens einem wasserlöslichen Protein, mindestens einem wasserlöslichen Polysaccharid so- wie mindestens einem wasserlöslichen Polymer wie bspw. Polyethylenoxid für verschiedene Anwendungen, darunter auch zum Demulgieren von Rohöl.
Keine der zitierten Schriften offenbart die Verwendung von Hydrophobinen zur Phasentrennung. Die Verwendung von Proteinen hat den Vorteil, dass es sich um auch natürlich vorkommende Substanzen handelt, die biologisch abbaubar sind und damit nicht zu einer dauerhaften Belastung der Umwelt führen.
Bei vielen großtechnischen Anwendungen, beispielsweise bei der Trennung von Rohöl-Wasser-Emulsionen, kommt es auf eine möglichst schnelle Phasentrennung an. Aufgabe der Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Phasentrennung mit Proteinen bereit zu stellen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung mindestens eines Hydrophobins zur Verbesserung der Phasentrennung in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.
Dabei kann das Hydrophobin erfindungsgemäß grundsätzlich in beliebiger Menge eingesetzt werden, solange gewährleistet ist, dass die Phasentrennung in den Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen verbessert wird.
Unter „Verbesserung der Phasentrennung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfin- düng verstanden, dass die Trennung von zwei flüssigen Phasen bei Zusatz einer Substanz zu einem Gemisch schneller erfolgt, als in demselben Gemisch ohne den Zusatz der Substanz, bzw. dass durch den Zusatz der Substanz die Trennung von zwei flüssigen Phasen erst ermöglicht wird.
Unter einem Hydrophobin werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Derivate davon bzw. modifizierte Hydrophobin verstanden. Bei modifizierten bzw. derivatisier- ten Hydrophobinen kann es sich beispielsweise um Hydrophobinfusionsproteine handeln oder um Proteine, die eine Aminosäurensequenz aufweisen, die mindestens 60%, beispielsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevor- zugt mindestens 90 %, insbesondere bevorzugt mindestens 95 % Identität mit der Sequenz eines Hydrophobins aufweist, und die noch zu 50 %, beispielsweise zu 60 %, insbesondere zu 70 %, besonders bevorzugt zu 80 %, die biologischen Eigenschaften eines Hydrophobins erfüllt, insbesondere die Eigenschaft, dass die Oberflächeneigenschaften durch Beschichten mit diesen Proteinen derart geändert werden, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung einer Glasoberfläche mit dem Protein eine Vergrößerung um mindestens 20°, bevorzugt um mindestens 25°, insbesondere um mindestens 30° aufweist.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Hydrophobine oder Derivate davon, die Phasentrennung von mindestens zwei flüssigen Phasen verbessern. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn eine schnelle Phasentrennung erreicht werden soll, oder das Auftreten von Emulsionen verhindert werden soll. Hierbei sind schon geringe Mengen äußerst wirksam. Ebenso kann diese Eigenschaft genutzt werden, wenn bereits bestehende Emulsionen aufgebrochen werden sollen. Verbindungen, die Emulsionen brechen, werden auch als Demulgatoren bezeichnet.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch eine wie oben beschriebene Verwendung mindestens eines Hydrophobins oder mindestens eines Derivats davon, wobei das mindestens eine Hydrophobin oder mindestens eine Derivat davon, als Demulgator eingesetzt wird.
Für die Definition von Hydrophobinen ist dabei die Struktur- und nicht die Sequenzspe- zifität der Hydrophobine entscheidend. Die Aminosäuresequenz der natürlichen Hydrophobine ist sehr divers, sie haben jedoch alle ein hochcharakteristisches Muster von 8 konservierten Cysteinresten. Diese Reste bilden vier intramolekulare Disulfid- brücken.
Der N- und C-Terminus ist über einen größeren Bereich variabel. Hier können z. B. nach dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Techniken gefundene Fusionspartnerproteine mit einer Länge von 10 bis 500 Aminosäuren angefügt werden.
Darüber hinaus sind im Sinne der vorliegenden Erfindung unter Hydrophobinen und Derivaten davon Proteine mit einer ähnlichen Struktur und funktioneller Äquivalenz zu verstehen.
Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)
Xn-C -Xi_5o-C -Xo-5-C -Xi-ioo-C -Xi_ioo-C -Xi_5o-C -X0-S-C -Xi-S0-C -Xm (I)
verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300. Die Polypetide gemäß der Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der un beschichteten Glasoberfläche.
Die mit C1 bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C1 bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Di- sulfidbrücken ausbilden.
Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der ein- zelnen C-positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C -X3-25-C -Xθ-2"C -X5-50-C -X2-35"C -X2-15"C -Xθ-2"C -X3-35"C -Xm (H)
zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 300 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Reste C um Cystein.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (IM) Xn-C -Xδ-g-C -C -Xn-39-C -X2-23-C -Xδ-g-C -C -X6-18"C -Xm (III)
eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.
Bei den Resten Xn und Xm kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicher- weise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste Xn und/oder Xm zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptid- sequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz verlängert ist.
Falls es sich bei Xn und/oder Xn, um natürlicherweise nicht in Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders be- vorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.
Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xn,) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (Xn oder Xn,) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16), yaae (SEQ ID NO: 17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, beispielsweise 70 bis 99 %, bevorzugt 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt 10 bis 40 % der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Ami- nosäuren bezieht. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem Fusionspartner als eine Gruppe Xn oder Xn, noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affinity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirkend können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k- , (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- oder (Cys)k-Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht.
Die erfindungsgemäß als Hydrophobine oder Derivate davon verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielswei- se mit Glutardialdehyd.
Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine bzw. deren Derivate ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich ex- perimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 μl und die Verwendung von Glasplättchen als Substrat. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Fusionsproteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der un beschichteten Glasoberfläche.
Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi , basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobinteile, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden. Erfindungsgemäß besonders geeignet sind weiterhin die Fusionsproteine yaad-Xa- dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf 1 - his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deleti- on von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.
Besonders zur Ausführung der Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA- his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf 1 -his (SEQ
ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Reste. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürtzer yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis
150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden.
Eine Spaltstelle zwischen dem Hydrophobin und dem Fusionspartner bzw. den Fusionspartnern kann dazu genutzt, das reine Hydrophobin in underivatisierter Form frei- zusetzen (beispielsweise durch BrCN-Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.).
Es ist weiterhin möglich, Fusionsproteine aus einem Fusionspartner, beispielsweise yaad oder yaae, und mehreren Hydrophobinen, auch unterschiedlicher Sequenz, bei- spielsweise DewA-RodA oder Sc3-DewA, Sc3-RodA), hintereinander zu generieren. Ebenso können Hydrophobinfragmente (beispielsweise N- oder C-terminale Verkürzungen) oder Mutein, die bis zu 70% Homologie aufweisen, eingesetzt werden. Die Auswahl der optimalen Konstrukte erfolgt jeweils in Bezug auf die jeweilige Verwendung, d.h. die zu trennenden flüssigen Phasen.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine, bzw. die in den erfindungsgemäßen Formulierungen enthaltenen Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen. Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.
Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist bei- spielsweise in DE 102005007480.4 offenbart.
Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschließlich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insek- tenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas speα, Lactobacillen, Hansenula poly- morpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a..
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung von Expressionskonstrukten, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen, eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5"-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3"-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer "operativen Verknüpfung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann, verstanden.
Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie En- hancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Se- quenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere so- genannte "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3"-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.
Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Au- xotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für die Herstellung sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, Iaclq-T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara- , rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.
Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, TransposonsJS- EIe- mente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium- System zu verstehen.
Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL.24, pl_G200, pUR290JplN-llllI3-B1J tgt11 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Cory- nebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3"-und/oder 5"-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Re- kombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Pro- motors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor inser- tiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.
Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine oder Derivate davon eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfek- tion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscien- ce, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Ve k- tor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure- Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endo- genen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß ver- wendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503.
Als rekombinante Wirtsorganismen für derartige Nukleinsäuren oder derartige Nuklein- säurekonstrukte kommen prinzipiell alle prokarγontischen oder eukarγontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gramnegative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomo- nadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.
Die im soben beschriebenen Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Orga- nismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenen- falls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und 100 0C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon können mittels eines Verfahrens zur rekombinanten Herstellung hergestellt werden, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Proteine induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Proteine können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Ver- fahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Labo- ratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) be- schrieben. Die Zellen werden dann, falls die Proteine nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Proteine kann mit bekannten, chromatographischen Verfah- ren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden bei- spielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruy- ter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Besonders vorteilhaft kann es sein, die Fusions-Hydrophobine zur Erleichterung der Isolierung und Reinigung mit speziellen Ankergruppen zu versehen, die an entsprechende komplementäre Gruppen an festen Trägern, insbesondere geeigneten Polymeren anbinden können. Derartige feste Träger können beispielsweise als Füllung für Chromatographiesäulen verwendet werden, und auf diese Art und Weise kann die Effizienz der Trennung in der Regel deutlich gesteigert werden. Solche Trennverfahren sind auch als Affinitätschromatographie bekannt. Zum Einbau der Ankergruppen kann man bei der Herstellung der Proteine Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit veränderte Proteine oder Fusionsproteine kodieren. Zur leichteren Reinigung modifierte Proteine umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa- Histidin-Anker bekannte Modifikation. Mit Histidin-Ankem modifizierte Fusions-Hydrophobine lassen sich beispielsweise unter Verwendung von Nickel-Sepharose als Säulenfüllung chromatographisch reinigen. Das Fusions-Hydrophobin kann anschließend mittels geeigneten Mitteln zum Eluieren, wie beispielsweise einer Imidazol-Lösung, wieder von der Säule eluiert werden.
In einem vereinfachten Reinigungsverfahren kann auf die chromatographische Reinigung verzichtet werden. Hierzu werden die Zellen zunächst mittels einer geeigneten Methode aus der Fermetationsbrühe abgetrennt, beispielsweise durch Mikrofiltration oder durch Zentrifugieren. Anschließend können die Zellen mittels geeigneter Metho- den, beispielsweise mittels der bereits oben genannten Methoden, aufgeschlossen, und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern (inclusion bodies) getrennt werden. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Einschlusskörper in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Fusions - Hydrophobine freizusetzen. Dies kann beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergentien erfolgen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Fusion-Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 m NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden. Die Reinheit der nach diesem vereinfachten Verfahren erhaltenen Fusions-Hydrophobine liegt in der Regel bei 60 bis 80 Gew. % bzgl. der Menge aller Proteine. Die nach dem beschriebenen, vereinfachten Reinigungsverfahren erhaltenen Lösungen können ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden.
Die wie beschrieben hergestellten Hydrophobine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.
Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle ge- eignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltlung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).
Erfindungsgemäß können die Hydrophobine oder Derivate davon, zur Verbesserung der Phasentrennung in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen eingesetzt werden. Dabei kann es sich um beliebige Zusammensetzungen handeln, solange diese mindestens zwei flüssige Phasen aufweisen.
Insbesondere kann es sich auch um Zusammensetzungen handeln, die vor der Zugabe des mindestens einen Hydrophobins oder Derivats davon, in Form einer Emulsion vorliegen.
Die Zusammensetzung kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung neben den mindestens zwei flüssigen Phasen auch weitere Phasen aufweisen.
Bei den mindestens zwei flüssigen Phasen handelt es sich um zwei flüssige Phasen unterschiedlicher Dichte, beispielsweise um ein öl und Wasser, zwei wässrige Lösun- gen unterschiedlicher Dichte, zwei organische Lösungen unterschiedlicher Dichte, einen Kraftstoff und Wasser, einen Brennstoff und Wasser oder ein Lösungsmittel und Wasser. Dabei werden unter einer wässrigen Lösung im Rahmen der vorliegenden Erfindung Lösungen verstanden, die Wasser, gegebenenfalls in Kombination mit einem weiteren Lösungsmittel enthalten. Jede der flüssigen Phasen kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung weitere Stoffe enthalten.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei einem öl vorzugsweise um ein Rohöl.
Geeignete Lösungsmittel sind alle Flüssigkeiten, die mit Wasser zweiphasige Gemi- sehe ausbilden, insbesondere organische Lösungsmittel, beispielsweise Ether, aromatische Verbindungen wie Toluol oder Benzol, Alkohole, Alkane, Alkene, Cycloalkane, Cycloalkene, Ester, Ketone, Naphtene oder halogenierte Kohlenwasserstoffe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher eine wie zuvor beschriebene Verwendung mindestens eines Hydrophobins oder mindestens eines Derivats davon, wobei die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Zusammensetzungen enthaltend öl, bevorzugt Rohöl, und Wasser, - Zusammensetzungen enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser,
Reaktionsgemischen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung auch weitere Phasen enthalten, beispielsweise eine feste oder flüssige Phase, insbesondere eine feste Phase.
Die Hydrophobine oder Derivate davon können für alle dem Fachmann bekannten Anwendungen eingesetzt werden. Insbesondere sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung als Demulgator in Ottokraftstoff/Wasser-Mischungen, als De- mulgator in anderen Kraftstoff- oder Brennstoff/Wasser-Mischungen, die Phasentrennung bei chemischen Reaktionen, insbesondere bei großtechnischen Prozessen, die Emulsionsspaltung zwischen Rohöl und Wasser bei der Rohölförderung bzw. Rohölproduktion, sowie die Entsalzung von Rohöl durch Extraktion von Rohöl mit Wasser sowie anschließende Spaltung der resultierenden Emulsion zu nennen. Als großtech- nische chemische Prozesse kommen all diese in Frage, bei denen eine Phasentrennung herbeigeführt werden soll, beispielsweise die Hydroformulierung von Polyisobu- ten mit Kobalt-Katalysatoren, wobei die Katalysatorabtrennung wässerig erfolgt.
Die Hydrophobine oder Derivate davon werden erfindungsgemäß auch verwendet, um die Phasentrennung von Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssigen Phasen verbessern, die im Verlauf einer Reaktion auftreten, d.h. die sich im Verlauf einer Reaktion bilden oder die durch Zugabe eines Lösungsmittels oder einer Komponente auftreten. Durch die erfindungsgemäße Verwendung von Hydrophobinen oder Derivaten davon wird eine Verkürzung der Phasentrennzeit erreicht und der Verlust an Wertstoffen kann verringert werden.
Ebenso ist es erfindungsgemäß möglich, die Phasentrennung von Zusammensetzungen enthaltend zwei wässrige Phasen unterschiedlicher Dichte zu verbessern, wobei unter einer wässrigen Phase eine Phase verstanden wird, die Wasser, gegebenenfalls in Kombination mit einem weiteren Lösungsmittel enthält. Erfindungsgemäß können Hydrophobine oder Derivate davon beispielsweise eingesetzt werden, um die Phasentrennung bei der Fraktionierung von Polymeren in wässrigen Systemen zu verbessern. Dabei werden insbesondere wasserlösliche Polymere fraktioniert.
Generell sind sämtliche dem Fachmann bekannten wasser- und öllöslichen Polymere zu nennen, insbesondere Polyacrylate und deren Copolymere, die herstellbedingt mit einer Molmassenverteilung bzw. Polydispersität von größer 1,1 anfallen.
Durch Zugabe von Demulgatoren können Emulsionen gebrochen werden. So liegt bei- spielsweise gefördertes Erdöl in der Regel als relativ stabile Wasser-in-öl-Emulsion vor, welche je nach Art der Lagerstätte bis zu 90 Gew. % Wasser enthalten kann. Bei der Aufarbeitung und Reinigung des Rohöls fällt nach dem Abtrennen eines Großteils des Wassers ein Rohöl an, das immer noch ca. 2 bis 3 Gew. % Wasser enthält. Dieses bildet mit dem öl eine stabile Emulsion, die auch durch Zentrifugierung und Zugabe herkömmlicher Demulgatoren nicht vollständig abzutrennen ist. Dies ist insofern problematisch, als das Wasser einerseits stark salzhaltig ist und damit korrodierend wirkt, zum anderen wird durch das Restwasser das zu transportierende und zu lagernde Volumen erhöht, was zu erhöhten Kosten führt. Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass Hydrophobine oder Derivate davon besonders vorteilhaft eingesetzt werden können, um die Phasentrennung in diesen Zusammensetzungen zu verbessern. Es wird eine sehr schnelle Trennung erreicht.
Dabei muss der Demulgator auf die Art der emulgierten öle und Fette sowie auf gegebenenfalls enthaltene Emulgatoren und Tenside eingestellt werden, um eine optimale Wirkung zu erzielen. Das Brechen von Emulsionen kann durch eine erhöhte Temperatur zusätzlich unterstützt werden, beispielsweise eine Temperatur von 0 bis 1000C, beispielsweise von 10 bis 80 °C, insbesondere von 20 bis 60°C.
Weitere erfindungsgemäße Anwendungen umfassen beispielsweise das Demulgieren von Imprägnieremulsionen in der Spanplatten- und Textilindustrie, sowie von Medikamentemulsionen. Eine weitere Anwendung ist die Emulsionsspaltung organisch behandelter Abwässer, beispielsweise industrieller und gewerblicher Abwässer, insbesondere aus der Metallverarbeitung, beispielsweise Kühlschmiermittel aus der Metallverarbeitung, aus Gerbereien und Erdölraffinerien sowie häuslichen Quellen, bei denen Öl/Wasser-Emulsionen anfallen. Derartige Abwässer entstehen beispielsweise bei der Verarbeitung von Erdöl in Raffinerien und petrochemischen Anlagen. Bevor diese Abwässer zur Kläranlage geführt werden können, ist es nötig, ölreste abzutrennen, die häufig in Form einer Emulsion vorliegen.
Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung ist die Emulsionsspaltung von Öl-inWasser- oder Wasser-in-öl-Gemischen, beispielsweise Emulsionen, die als Kühlschmierstoffe eingesetzt wurden und recycelt werden sollen. Wasser/Öl-Gemische fallen beispielsweise auch an Bord von Seeschiffen als Bilgewasser an. Dabei ist die Trennung von Emulsionen nötig, um das Wasser abtrennen zu können und die Menge des zu entsorgenden Lösungsmittels zu reduzieren.
Die Menge des eingesetzten Hydrophobins oder Derivats davon kann in weiten Bereichen variieren, wobei die Menge vorteilhafterweise auf die Zusammensetzung an sich und gegebenenfalls in der Zusammensetzung enthaltene weitere Komponenten abge- stimmt wird.
Sofern beispielsweise die Zusammensetzung Stoffe enthält, die eine Phasentrennung der mindestens zwei flüssigen Phasen verzögern oder verschlechtern, beispielsweise Tenside oder Emulgatoren, wird vorteilhaft eine größere Menge eines Hydrophobins oder eines Derivats davon, eingesetzt.
Da öle, insbesondere Rohöle, aus einem Gemisch vieler chemischer Verbindungen bestehen, ist es erforderlich, aufgrund der unterschiedlichen chemischen Zusammensetzung des Öls, der Wasser- und Salzanteile sowie der konkreten Bedingungen der Emulsionsspaltung, wie Temperatur, Dauer der Emulsionsspaltung, Art der Zudosie- rung und Wechselwirkungen mit weiteren Komponenten des Gemischs, den Demuga- tor auf die konkreten Bedingungen abzustimmen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass bereits geringe Mengen eines eines Hydrophobins oder Derivats davon, zu einer Verbesserung der Phasentrennung führen.
Das mindestens eine eine Hydrophobin oder Derivat davon kann erfindungsgemäß in jeder geeigneten Menge eingesetzt werden. In der Regel wird das mindestens eine Hydrophobin oder Derivat davon in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt; bevorzugt in einer Menge von 0,001 bis 500 ppm, besonders bevorzugt von 0,01 bis 200 ppm oder 0,01 bis 100 ppm und ganz besonders bevorzugt 0,1 bis 50 ppm.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung bezeichnet die Angabe ppm mg pro kg.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine wie zuvor beschriebene Verwendung, wobei das mindestens eine Hydrophobin oder das mindestens eine Derivat davon, in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezo- gen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird. Die eingesetzte Konzentration wird vom Fachmann je nach der Art des zu demulgierenden Zusammensetzung festgelegt.
Sofern es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung enthaltend Kraft- oder Brennstoffe und Wasser handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon, in der Regel in einer Menge vom 0,001 bis 10 ppm, bevorzugt von 0,005 bis 2 ppm, insbesondere von 0,01 bis 1 ppm, besonders bevorzugt 0,05 bis 0,5 ppm und weiter bevorzugt von 0,01 bis 0,1 ppm eingesetzt.
Sofern es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung enthaltend Rohöl und Wasser handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon in der Regel in einer Menge vom 1 bis 1000 ppm, bevorzugt von 1 bis 800 ppm, insbesondere von 5 bis 500 ppm, besonders bevorzugt 10 bis 200 ppm und weiter bevorzugt von 15 bis 100 ppm eingesetzt und beispielsweise 20 bis 50 ppm eingesetzt.
Sofern es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung enthaltend zwei wässrige Phasen unterschiedlicher Dichte, die beispielsweise bei der Fraktionierung wasserlöslicher Polymere auftreten können, handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon in der Regel in einer Menge vom 1 bis 1000 ppm, bevorzugt von 1 bis 500 ppm, insbesondere von 5 bis 250 ppm, besonders bevorzugt 10 bis 200 ppm und weiter bevorzugt von 15 bis 100 ppm eingesetzt.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass die Zusammensetzung neben dem mindestens einen Hydrophobin oder Derivat davon, weitere Verbindungen enthält, die die Phasentrennung verbessern. Dabei kann es sich um alle Verbindungen handeln, die dem Fachmann für derartige Anwendungen bekannt sind. Beispielsweise geeignet als weitere Verbindung zur Verbesserung der Phasentrennung sind insbesondere für die Anwendung als Emulsionsspalter bei der Rohölproduktion oxyalkylierte Phenolformaldehydharze, EO/PO-Blockcopolymere, vernetzte Diepoxide, Polyamide bzw. deren Alkoxylate, Salze der Sulfonsäuren, ethoxylierte Fettamine, Succinate sowie die in DE 10 2005 006 030.7 für derartige Anwendungen genannten Verbindungen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine wie zuvor beschriebene Verwendung, wobei neben mindestens einen Hydrophobin oder dem mindestens einen Derivat davon mindestens eine weitere Verbindung eingesetzt wird, die die Phasentrennung verbessert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Trennung von mindestens zwei flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, umfassend die Zugabe von mindestens einem Hydrophobin bzw. mindestens einem Derivat davon zu der Zusammensetzung.
Dabei kann es sich bei der Zusammensetzung um eine wie zuvor beschriebene Zu- sammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen handeln.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher ein derartiges Verfahren, wobei die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Zusammensetzungen enthaltend öl, bevorzugt Rohöl, und Wasser, Zusammensetzungen enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser, Reaktionsgemischen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.
Grundsätzlich können im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Hydrophobine oder Derivate davon in beliebigen Mengen eingesetzt werden, sofern eine Verbesserung der Phasentrennung erreicht wird. Insbesondere geeignet ist der Einsatz eines Hydropho- bins oder Derivats davon in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung ein zuvor beschriebenes Verfahren, wobei das mindestens eine Hydrophobin oder das mindestens eine Derivat davon, in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird. Bevorzugte Mengen für die jeweiligen Systeme wurden bereits genannt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weitere Schritte umfassen, beispielsweise solche, die eine Phasentrennung oder das Brechen von Emulsionen verbessern. Dabei kann es sich beispielsweise um eine Temperaturerhöhung oder um Zentrifugieren handeln. Ein derartiger Schritt kann vor, während oder nach der Zugabe des mindestens einen Hydrophobins oder Derivats davon erfolgen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher ein wie zuvor beschriebenes Verfahren, wobei das Verfahren vor oder nach der Zugabe des mindestens einen Hydrophobins oder des mindestens einen Derivats davon eine Erhöhung der Temperatur der Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen umfasst.
Erfindungsgemäß können Hydrophobine oder Derivate davon, beispielsweise Formulierungen enthaltend Kraft- oder Brennstoffe zugesetzt werden. Dies ermöglicht bei Kontakt der Formulierung mit Wasser eine schnelle Entmischung bzw. verhindert die Bildung von Emulsionen. Die Bildung von Emulsionen beispielsweise in Lagertanks würde aufwendige Reinigungsschritte der Formulierung nötig machen.
Ebenso ist es vorteilhaft, Rohölen Hydrophobine oder Derivate davon zuzusetzen, um beispielsweise die Emulsionsbildung zu verhindern.
Die Formulierung enthaltend Kraft- oder Brennstoffe kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung weitere Additive enthalten, die üblicherweise in derartigen Formulierungen enthalten sind.
Geeignete Zusatzstoffe sind beispielsweise in WO 2004/087808 genannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine Formulierung, enthaltend mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kraftstoffen, Brenn- Stoffen, Rohölen oder wasser- oder öllöslichen Polymerlösungen und mindestens ein Hydrophobin oder Derivate davon.
Die Menge der eingesetzten Hydrophobins oder Derivats davon kann abhängig von den weiteren Zusatzstoffen variieren, solange eine Verbesserung der Phasentrennung bei Kontakt der Formulierung mit Wasser gewährleistet ist.
Erfindungsgemäß liegt die Menge des eingesetzten Hydrophobins oder Derivats davon vorzugsweise im Bereich von 0,0001 bis 1000 ppm eingesetzt, bevorzugt von 0,001 bis 500 ppm, besonders bevorzugt von 0,01 bis 100 ppm.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch eine wie zuvor beschriebene Formulierung, wobei das Hydrophobin oder das Derivat davon in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulierung enthalten ist. Sofern es sich bei der Formulierung um ein Gemisch enthaltend ein Rohöl handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon dieser Formulierung in der Regel in einer Menge vom 1 bis 1000 ppm, bevorzugt von 10 bis 800 ppm, insbesondere von 10 bis 500 ppm zugesetzt.
Sofern es sich bei der Formulierung um ein Gemisch enthaltend Kraft- oder Brennstoffe handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon dieser Formulierung in der Regel in einer Menge vom 0,001 bis 0,5 ppm, bevorzugt von 0,005 bis 0,3 ppm, insbesondere von 0,01 bis 0,2 ppm zugesetzt.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine wie zuvor beschriebene Formulierung, wobei die Formulierung mindestens einen Kraftoder Brennstoff enthält und das Hydrophobin oder das Derivat davon in einer Menge von 0,001 bis 0,5 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulierung enthalten ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Brennstoffen beispielsweise leichte, mittlere oder schwere Heizöle verstanden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Kraftstoffen beispielsweise Ottokraftstoffe, Dieselkraftstoffe oder Turbinenkraftstoffe verstanden. Besonders bevorzugt handelt es sich um Ottokraftstoffe.
Die Kraftstoffe können weitere Zusätze enthalten. Übliche Zusätze sind dem Fach- mann grundsätzlich bekannt. Geeignete Zusätze und Lösungsmittel sind beispielsweise in der WO 2004/087808 genannt.
Erfindungsgemäß beispielsweise geeignet als weitere Additivkomponenten sind Additive mit Detergenswirkung und/oder mit Ventilsitzverschleiß-hemmender Wirkung (im folgenden bezeichnet als Detergensadditive). Dieses Detergensadditiv besitzt mindestens einen hydrophoben Kohlenwasserstoffrest mit einem zahlengemittelten Molekulargewicht Mn von 85 bis 20 000 g/mol und mindestens eine polare Gruppierung ausgewählt aus :
(a) Mono- oder Polyaminogruppen mit bis zu 6 Stickstoffatomen, wobei mindestens ein Stickstoffatom basische Eigenschaften hat;
(b) Nitrogruppen, ggf. in Kombination mit Hydroxylgruppen; (c) Hydroxylgruppen in Kombination mit Mono- oder Polyaminogruppen, wobei mindestens ein Stickstoffatom basische Eigenschaften hat;
(d) Carboxylgruppen oder deren Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalzen;
(e) Sulfonsäuregruppen oder deren Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalzen;
(T) Polyoxy-C2-bis C4-alkylengruppierungen, die durch Hydroxylgruppen, Mono- oder Polyaminogruppen, wobei mindestens ein Stickstoffatom basische Eigenschaften hat, oder durch Carbamatgruppen terminiert sind;
(g) Carbonsäureestergruppen;
(h) aus Bernsteinsäureanhydrid abgeleiteten Gruppierungen mit Hydroxy- und/oder Amino- und/oder Amido- und/oder Imidogruppen; und/oder
(i) durch Mannich-Umsetzung von substituierten Phenolen mit Aldehyden und Mono- oder Polyaminen erzeugten Gruppierungen.
Der hydrophobe Kohlenwasserstoffrest in den obigen Detergensadditiven, welcher für die ausreichende Löslichkeit im Kraftstoff sorgt, hat ein zahlengemitteltes Molekulargewicht (Mn) von 85 bis 20000, insbesondere von 113 bis 10000, vor allem von 300 bis 5000. Als typischer hydrophober Kohlenwasserstoffrest, insbesondere in Verbindung mit den polaren Gruppierungen (a), (c), (h) und (i), kommen der Polypropenyl-, Polybu- tenyl- und Polyisobutenylrest mit jeweils Mn = 300 bis 5000, insbesondere 500 bis 2500, vor allem 700 bis 2300, in Betracht.
Als Beispiele für obige Gruppen von Detergensadditiven seien die folgenden genannt:
Mono- oder Polyaminogruppen (a) enthaltende Additive sind vorzugsweise Polyalken- mono- oder Polyalkenpolyamine auf Basis von Polypropen oder konventionellem (d. h. mit überwiegend mittenständigen Doppelbindungen) Polybuten oder Polyisobuten mit Mn von 300 bis 5000 g/mol. Geht man bei der Herstellung der Additive von Polybuten oder Polyisobuten mit überwiegend mittenständigen Doppelbindungen (meist in der beta- und gamma-Position) aus, bietet sich der Herstellweg durch Chlorierung und anschließende Aminierung oder durch Oxidation der Doppelbindung mit Luft oder Ozon zur Carbo-nyl- oder Carboxylverbindung und anschließende Aminierung unter redukti- ven (hydrierenden) Bedingungen an. Zur Aminierung können hier Amine, wie z. B. Ammoniak, Monoamine oder Polyamine, wie Dimethylaminopropylamin, Ethylendia- min,Diethylentriamin,Triethylentetramin oder Tetraethylenpentamin, eingesetzt werden. Entsprechende Additive auf Basis von Polypropen sind insbesondere in der WO 94/24231 beschrieben.
Weitere bevorzugte Monoaminogruppen (a) enthaltende Additive sind die Hydrierungs- produkte der Umsetzungsprodukte aus Polyisobutenen mit einem mittleren Polymerisationsgrad P = 5 bis 100 mit Stickoxiden oder Gemischen aus Stickoxiden und Sauerstoff, wie sie insbesondere in WO 97/03946 beschrieben sind.
Weitere bevorzugte Monoaminogruppen (a) enthaltende Additive sind die aus Polyiso- butenepoxiden durch Umsetzung mit Aminen und nachfolgender Dehydratisierung und Reduktion der Aminoalkohole erhältlichen Verbindungen, wie sie insbesondere in DE-A 196 20 262 beschrieben sind.
Nitrogruppen (b), ggf. in Kombination mit Hydroxylgruppen, enthaltende Additive sind vorzugsweise Umsetzungsprodukte aus Polyisobutenen des mittleren Polymerisationsgrades P = 5 bis 100 oder 10 bis 100 mit Stickoxiden oder Gemischen aus Stickoxiden und Sauerstoff, wie sie insbesondere in WO 96/03367 und WO 96/03479 beschrieben sind. Diese Umsetzungsprodukte stellen in der Regel Mischungen aus reinen Nitropolyisobutenen (z. B.alpha, beta-Dinitropolyisobuten) und gemischten Hydro- xynitropolyisobutenen (z. B.alpha-Nitro-beta-hydroxypolyisobuten) dar.
Hydroxylgruppen in Kombination mit Mono- oder Polyaminogruppen (c) enthaltende Additive sind insbesondere Umsetzungsprodukte von Polyisobutenepoxiden, erhältlich aus vorzugsweise überwiegend endständige Doppelbindungen aufweisendem Polyiso- buten mit Mn = 300 bis 5000, mit Ammoniak, Mono- oder Polyaminen, wie sie insbesondere in EP-A 0 476 485 beschrieben sind.
Carboxylgruppen oder deren Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze (d) enthaltende Additive sind vorzugsweise Copolymere von C2-C40-Olefinen mit Maleinsäureanhydrid mit einer Gesamt-Molmasse von 500 bis 20 000, deren Carboxylgruppen ganz oder teilweise zu den Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalzen und ein verbleibender Rest der Carboxylgruppen mit Alkoholen oder Aminen umgesetzt sind. Solche Additive sind insbesondere aus der EP-A 0 307 815 bekannt. Derartige Additive dienen hauptsächlich zur Verhinderung von Ventilsitzverschleiß und können, wie in der WO 87/01126 be- schrieben, mit Vorteil in Kombination mit üblichen Kraftstoffdetergenzien wie Po- ly(iso)butenaminen oder Polyetheraminen eingesetzt werden.
Sulfonsäuregruppen oder deren Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze (e) enthaltende Additive sind vorzugsweise Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze eines Sulfo- bemsteinsäurealkylesters, wie er insbesondere in der EP-A 0 639 632 beschrieben ist. Derartige Additive dienen hauptsächlich zur Verhinderung von Ventilsitzverschleiß und können mit Vorteil in Kombination mit üblichen Kraftstoffdetergenzien wie Po- ly(iso)butenaminen oder Polyetheraminen eingesetzt werden.
Polyoxy-C2-C4-alkylengruppierungen (f) enthaltende Additive sind vorzugsweise PoIy- ether oder Polyetheramine, welche durch Umsetzung von C2-C60-Alkanolen, C6-C30- Alkandiolen, Mono- oder Di-C2-C30-alkylaminen, C1-C30-Alkylcyclohexanolen oder C1-C30-Alkylphenolen mit 1 bis 30 mol Ethylenoxid und/oder Propylenoxid und/oder Butylenoxid pro Hydroxylgruppe oder Aminogruppe und, im Falle der Polyetheramine, durch anschließende reduktive Aminierung mit Ammoniak, Monoaminen oder Polyami- nen erhältlich sind. Derartige Produkte werden insbesondere in EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 und US 4,877,416 beschrieben. Im Falle von Polyethern erfüllen solche Produkte auch Trägeröleigenschaften. Typische Beispiele hierfür sind Tridecanol- oder Isotridecanolbutoxylate, Isononylphenolbutoxylate sowie Polyisobute- nolbutoxylate und -propoxylate sowie die entsprechenden Umsetzungsprodukte mit Ammoniak.
Carbonsäureestergruppen (g) enthaltende Additive sind vorzugsweise Ester aus Mono- , Di- oder Tricarbonsäuren mit langkettigen Alkanolen oder Polyolen, insbesondere solche mit einer Mindestviskosität von 2 mm2/s bei 100°C, wie sie insbesondere in DE- A 38 38 918 beschrieben sind. Als Mono-, Di- oder Tricarbonsäuren können aliphati- sche oder aromatische Säuren eingesetzt werden, als Esteralkohole bzw. -polyole eignen sich vor allem langkettige Vertreter mit beispielsweise 6 bis 24 C-Atomen. Typi- sehe Vertreter der Ester sind Adipate, Phthalate, iso-Phthalate, Terephthalate und Tri- mellitate des iso-Octanols, iso-Nonanols, iso-Decanols und des iso-Tridecanols. Derartige Produkte erfüllen auch Trägeröleigenschaften.
Aus Bernsteinsäureanhydrid abgeleitete Gruppierungen mit Hydroxy- und/oder Amino und/oder Amido- und/oder Imidogruppen (h) enthaltende Additive sind vorzugsweise entsprechende Derivate von Polyisobutenylbemsteinsäureanhydrid, welche durch Umsetzung von konventionellem oder hochreaktivem Polyisobuten mit Mn = 300 bis 5000 mit Maleinsäureanhydrid auf thermischen Wege oder über das chlorierte Polyisobuten erhältlich sind. Von besonderem Interesse sind hierbei Derivate mit aliphatischen PoIy- aminen wie Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin oder Tetraethylenpen- tamin. Derartige Otto kraftstoffadditive sind insbesondere in US 4,849,572 beschrieben.
Durch Mannich-Umsetzung von substituierten Phenolen mit Aldehyden und Mono- o- der Polyaminen erzeugte Gruppierungen (i) enthaltende Additive sind vorzugsweise Umsetzungsprodukte von polyisobutensubstituierten Phenolen mit Formaldehyd und Mono- oder Polyaminen wie Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin oder Dimethylaminopropylamin. Die polyisobutenylsubstituierten Phenole können aus konventionellem oder hochreaktivem Polyisobuten mit Mn = 300 bis 5000 stammen. Derartige "Polyisobuten-Mannichbasen" sind insbesondere in der EP-A 0 831 141 beschrieben.
Zur genaueren Definition der einzelnen aufgeführten Otto kraftstoffadditive wird hier auf die Offenbarungen der oben genannten Schriften des Standes der Technik ausdrücklich Bezug genommen.
Die genannten Additive werden dabei in dem Fachmann für die jeweilige Anwendung geeignet erscheinenden Mengen eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können darüber hinaus mit noch weiteren üblichen Komponenten und Additiven kombiniert werden. Hier sind in beispielsweise Trägeröle ohne ausgeprägte Detergenswirkung zu nennen.
Geeignete mineralische Trägeröle sind bei der Erdölverarbeitung anfallende Fraktionen, wie Brightstock oder Grundöle mit Viskositäten wie beispielsweise aus der Klasse SN 500-2000; aber auch aromatische Kohlenwasserstoffe, paraffinische Kohlenwasserstoffe und Alkoxyalkanole. Erfindungsgemäß geeignet ist ebenfalls eine als "hydro- crack oil" bekannte und bei der Raffination von Mineralöl anfallende Fraktion (Vakuumdestillatschnitt mit einem Siedebereich von etwa 360 bis 5000C, erhältlich aus unter Hochdruck katalytisch hydriertem und isomerisiertem sowie entparaffiniertem natürli- chen Mineralöl). Ebenfalls geeignet sind Mischungen oben genannter mineralischer Trägeröle.
Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare synthetische Trägeröle sind ausgewählt unter: Polyolefinen (Polyalphaolefine oder Polyintemalolefine), (Poly)estem, (Po- ly)alkoxylaten, Polyethem, aliphatischen Polyetheraminen, alkylphenolgestarteten Po- lyethem, alkylphenolgestarteten Polyetheraminen und Carbonsäureester langkettiger Alkanole.
Beispiele für geeignete Polyolefine sind Olefinpolymerisate mit Mn = 400 bis 1800, vor allem auf Polybuten- oder Polyisobuten-Basis (hydriert oder nicht hydriert).
Beispiele für geeignete Polyether oder Polyetheramine sind vorzugsweise Polyoxy-C2-
C4-alkylengruppierungen enthaltende Verbindungen, welche durch Umsetzung von
C2-C60-Alkanolen, C6-C30-Alkandiolen, Mono- oder Di-C2-C30-alkylaminen, C1-C30- Alkylcyclohexanolen oder C1-C30-Alkylphenolen mit 1 bis 30 mol Ethylenoxid und/oder Propylenoxid und/oder Butylenoxid pro Hydroxylgruppe oder Aminogruppe und, im Falle der Polyetheramine, durch anschließende reduktive Aminierung mit Ammoniak, Monoaminen oder Polyaminen erhältlich sind. Derartige Produkte werden insbesondere in EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 und US 4,877,416 beschrie- ben. Beispielsweise können als Polyetheramine Poly-C2-C6-Alkylenoxidamine oder funktionelle Derivate davon verwendet werden. Typische Beispiele hierfür sind Tride- canol- oder Isotridecanolbutoxylate, Isononylphenolbutoxylate sowie Polyisobutenolbu- toxylate und -propoxylate sowie die entsprechenden Umsetzungsprodukte mit Ammoniak.
Beispiele für Carbonsäureester langkettiger Alkanole sind insbesondere Ester aus Mono-, Di- oder Tricarbonsäuren mit langkettigen Alkanolen oder Polyolen, wie sie insbesondere in der DE-A 38 38 918 beschrieben sind. Als Mono-, Di- oder Tricarbonsäuren können aliphatische oder aromatische Säuren eingesetzt werden, als Esteralkohole bzw. -polyole eignen sich vor allem langkettige Vertreter mit beispielsweise 6 bis 24 C- Atomen. Typische Vertreter der Ester sind Adipate, Phthalate, iso-Phthalate, Te- rephthalate und Trimellitate des Isooctanols, Isononanols, Isodecanols und des Isotri- decanols, wie z.B. Di-(n- oder lso-tridecyl)-phthalat.
Weitere geeignete Trägerölsysteme sind beispielsweise beschrieben in DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, EP-A 0 452 328 und EP-A 0 548 617, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Beispiele für besonders geeignete synthetische Trägeröle sind alkoholgestartete PoIy- ether mit etwa 5 bis 35, wie z. B. etwa 5 bis 30, C3-C6-Alkylenoxideinheiten, wie z. B. ausgewählt unter Propylenoxid-, n-Butylenoxid-und i-Butylenoxid-Einheiten, oder Gemischen davon. Nichtlimitierende Beispiele für geeignete Starteralkohole sind langkettige Alkanole oder mit langkettigem Alkyl substituierte Phenole, wobei der langkettige Alkylrest insbesondere für einen geradkettigen oder verzweigten C6-C18-Alkylrest steht.
Als bevorzugte Beispiele sind zu nennen Tridecanol und Nonylphenol.
Weitere geeignete synthetische Trägeröle sind alkoxylierte Alkylphenole, wie sie in der DE-A 10 102 913.6 beschrieben sind.
Die genannten Trägeröle werden dabei in dem Fachmann für die jeweilige Anwendung geeignet erscheinenden Mengen eingesetzt. Weitere übliche Additive sind Korrosionsinhibitoren, beispielsweise auf Basis von zur Filmbildung neigenden Ammoniumsalzen organischer Carbonsäuren oder von hetero- cyclischen Aromaten im Falle von Buntmetallkorrosionsschutz; Antioxidantien oder Stabilisatoren, beispielsweise auf Basis von Aminen wie p-Phenylendiamin, Dicyclohe- xylamin oder Derivaten hiervon oder von Phenolen wie 2, 4-Di-tert.-butylphenol oder 3, 5-Di-tert.-butyl-4-hydroxyphenylpropionsäure; weitere herkömmliche Demulgatoren; Antistatikmittel; Metallocene wie Ferrocen; Methylcyclopentadienylmangantricarbonyl; Schmierfähigkeitsverbesserer (Lubricity-Additive) wie bestimmte Fettsäuren, Alkenyl- bemsteinsäureester, Bis(hydroxyalkyl)fettamine, Hydroxyacetamide oder Ricinusöl; sowie Farbstoffe (Marker). Gegebenenfalls werden auch Amine zur Absenkung des pH-Wertes des Kraftstoffes zugesetzt.
Die genannten Detergensadditive mit den polaren Gruppierungen (a) bis (i) werden dem Kraftstoff üblicherweise in einer Menge von 10 bis 5000 Gew.-ppm, insbesondere 50 bis 1000 Gew.-ppm, zugegeben. Die sonstigen erwähnten Komponenten und Additive werden, wenn gewünscht, in hierfür üblichen Mengen zugesetzt.
Als Kraft- und Brennstoffe sind erfindungsgemäß alle dem Fachmann bekannten Kraft- und Brennstoffe geeignet, beispielsweise Ottokraftstoffe, wie sie beispielsweise in LJII- mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5.Aufl. 1990, Band A16, S. 719ff. beschrieben sind. Geeignete Kraftstoffe sind erfindungsgemäß auch Dieselkraftstoff, Ke- rosin und Jet-Treibstoff.
Insbesondere ein Ottokraftstoff mit einem Aromatengehalt von maximal 60, wie z. B. maximal 42 Vol.-% und einem Schwefelgehalt von maximal 2000, wie z. B. maximal 150 Gew.-ppm ist geeignet.
Der Aromatengehalt des Ottokraftstoffes beträgt beispielsweise 10 bis 50, wie z. B. 30 bis 42 Vol.-%, insbesondere 32 bis 40 Vol.-%. Der Schwefelgehalt des Ottokraftstoffes beträgt beispielsweise 2 bis 500, wie z. B. 5 bis 150 Gew.-ppm, oder 10 bis 100 Gew.- ppm.
Weiterhin kann ein geeigneter Ottokraftstoff beispielsweise einen Olefingehalt bis zu 50 Vol.-%, wie z. B. von 6 bis 21 Vol.-%, insbesondere 7 bis 18 Vol.-%; einen Benzolge- halt von bis zu 5 Vol.-%, wie z. B. 0,5 bis 1,0 Vol.-%, insbesondere 0,6 bis 0,9 Vol.-% und/oder einen Sauerstoffgehalt von bis zu 25 Gew. -%, wie z. B. bis zu 10 Gew. -% oder 1,0 bis 2,7 Gew. -%, insbesondere von 1,2 bis 2,0 Gew. -%, aufweisen.
Insbesondere können solche Ottokraftstoffe beispielhaft genannt werden, welche gleichzeitig einen Aromatengehalt von maximal 38 Vol.-%, einen Olefingehalt von ma- ximal 21 Vol.-%, einen Schwefelgehalt von maximal 50 Gew. -ppm, eine Benzolgehalt von maximal 1 ,0 Vol.-% und eine Sauerstoffgehalt von 1 ,0 bis 2,7 Gew. -% aufweisen.
Der Gehalt an Alkoholen und Ethern im Ottokraftstoff kann über einem weiten Bereich variieren. Beispiele typischer maximaler Gehalte sind für Methanol 15 Vol.-%, für Etha- nol 65 Vol.-%, für Isopropanol 20 Vol.-%, für tert.-Butanol 15 Vol.-%, für Isobutanol 20 Vol.-% und für Ether mit 5 oder mehr C-Atomen im Molekül 30 Vol.-%.
Der Sommer-Dampfdruck eines erfindungsgemäß geeigneten Ottokraftstoffes beträgt üblicherweise maximal 70 kPa, insbesondere 60 kPa (jeweils bei 37°C).
Die ROZ des Ottokraftstoffes beträgt in der Regel 75 bis 105. Ein üblicher Bereich für die entsprechende MOZ liegt bei 65 bis 95.
Die genannten Spezifikationen werden nach üblichen Methoden bestimmt (DIN EN 228).
Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-HisJ vaaE-HiSg
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine PoIy- merase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen Moniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS6 bzw. YAAE::HIS6 verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573 : gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Beispiel 2
Klonierung von vaad-Hydrophobin DewA-HiSg
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenre- aktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes
Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende
Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase
Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se Barn H I geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.
Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS6 verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von vaad-Hvdrophobin RodA-HiSg
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von vaad-Hvdrophobin BASFI-HiSg
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 11 und 12). KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-
GAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 5
Klonierung von vaad-Hydrophobin BASF2-HiSfi
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 13 und 14).
KaM417!CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierung von vaad-Hvdrophobin SC3-HiSfi
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 9 und 10).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7 Fermentation des rekombinanten E.coli Stammes vaad-Hvdrophobin DewA-HiSg
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His6 expri- mierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1 ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.
13,51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur (OD6oonm 1 :10 gegen H2O gemessen) animpfen. Bei einer OD60nm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel e
Reinigung des rekombinanten Hvdrohobin-Fusionsproteins
(Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)
100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 rtiM Natriumphosphatpuf- fer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum ZeI- laufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA- Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (Abbildung 1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E. coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Ni- ckel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 rtiM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
Abbildung 1 zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins: Spur A: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1 :10 Verdünnung)
Spur B: Durchlauf = Eluat Waschschritt
Spuren C - E: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen (WP1 , WP2, WP3)
Spur F zeigt den aufgetragenen Marker.
Das Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
Beispiel 9
Anwendungstechnische Prüfung: Charakterisierung des Hvdrophobins durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat:
Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):
Es wurde das gemäß Beispiel 8 gereinigte Hydrophobin eingesetzt.
Konzentration des Hydrophobins in der Lösung: 100 μg/ml, die Lösung enthielt weiterhin 50 rtiM Na-Acetat-Puffer sowie 0,1% Polyoxyethylen(20)-sorbitan- monolaureat (Tween® 20)), pH-Wert der Lösung: 4
- Eintauchen von Glasplättchen in diese Lösung über Nacht (Temperatur 800C) - Danach wird das mit Hydrophobin beschichtete Glasplättchen der Lösung entnommen und in destilliertem Wasser gewachen,
- Danach Inkubation 10min / 800C / 1% SDS-Lösung in dest. Wasser
- Erneutes Waschen in dest. Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser mit der beschichteten Glasoberfläche bei Raumtemperatur bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5° Das mit dem Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his6) beschichtete Glasplätt- chen ergab einen Kontaktwinkel von 75 ± 5°.
==> Zunahme des Kontaktwinkels: 45°
Beispiel 10
Verwendung eines Hydrophobin-Konzentrats (yaad-Xa-dewA-HiSβ) als Additiv in Kraftstoffen
Versuchsprinzip:
Moderne Kraftstoffe enthalten üblicherweise eine Reihe verschiedener Additive (sogenannte Additivpakete). Sofern der Kraftstoff im Zuge des Herstell- bzw. Vertriebsweges mit Wasser in Kontakt kommt, können diese Additive emulgierende Wirkung entfalten und zur Bildung von unerwünschten Kraftstoff-Wasser-Emulsionen führen. Zur Vermei- düng dieses Effektes werden den Kraftstoffen daher üblicherweise Demulgatoren zugesetzt.
Die Demulgierversuche wurden mit einem Hydrophobin-Konzentrat gemäß Beispiel 8 (SEQ ID NO. 19 bzw. 20) durchgeführt.
Das Hydrophobin-Konzentrat wurde mit Ethanol verdünnt und einem handelsüblichen Eurosuper-Kraftstoff (gemäß EN 228) zugesetzt, der bereits 725 mg/kg eines speziellen Performance-Additivpakets A enthielt. Dieses Additivpaket besteht hauptsächlich aus dem Polyisobutenamin Kerocom PIBA, Trägerölmischungen, Lösungsmittel, Kor- rosionsinhibitor und Friction Modifier.
Es wurden Kraftstoff-Proben mit 0,01 , 0,03, 0,05, 0,07, 0,14 und 0,28 mg/kg Hydrophobin hergestellt. Als Referenz (10 - V1) diente der nur mit A additivierte Kraftstoff ohne Hydrophobin. In einem weiteren Vergleichsversuch (10 - V2) wurden 1 ,45 mg/kg eines handelsüblichen Demulgators D auf Basis von Phenolharzen (ADX 606, Fa. Lubrizol) eingesetzt.
Mit den Kraftstoff-Proben wurden jeweils Emulsionstests nach DIN 51415 durchgeführt. Hierbei werden jeweils 80 ml Kraftstoff und 20 ml Wasser intensiv miteinander ge- mischt. Danach wird der Entmischungsvorgang in Abhängigkeit der Zeit beobachtet. Die Auswertung geschieht anhand von in der Norm vorgegebenen Standards, wobei 1 für eine sehr gute Entmischung und größere Zahlen für zunehmend schlechtere Entmischung stehen. Die Einzelheiten sind in der zitieren DIN-Norm enthalten. In Tabelle 1 sind Ergebnisse der Versuche zusammengestellt. Aufgeführt sind jeweils die Beurteilungen der Phasentrennschichten nach 1 min, 5min, 30 min und 60 min. In der Regel wird eine Bewertung 1 oder 1 b nach 5 Minuten gefordert.
Tabelle 1
Figure imgf000036_0001
Kommentar:
Ohne Zusatz eines Demulgators wird nur eine ganz langsame Demulgierung beobach- ten. Die Bewertung 4 ist inakzeptabel, es tritt eine stabile Emulsion auf.
Die Hydrophobine weisen schon in äußerst geringen Mengen eine sehr gut demulgie- rende Wirkung auf. Schon 0,01 ppm Hydrophobin führen innerhalb von 1 min zu einem akzeptablen Ergebnis. Die gleiche Wirkung wie mit 0,07 mg/kg Hydrophobin wird erst durch Zugabe von 1,45 mg/kg des handelsüblichen Demulgators auf Basis von Phenolharzen zum Kraftstoff erzielt. Bei der Verwendung von Hydrophobin iat also nur ca. 1/20 der Menge eines konventionellen Demulgators zur Erzielung der gleichen Wirkung erforderlich.
Vergleichsbeispiel 11
Verwendung von anderen Proteinen als Additiv in Kraftstoffen
Analog Beispiel 10 wurde andere Proteine, bei denen es sich nicht um Hydrophobine handelt, zur Verwendung in Kraftstoffen gestest.
Die Versuche wurden mit Rinderserumalbumin (BSA) und Casein durchgeführt. Derartige Proteine sind kommerziell erhältlich. Weiterhin wurde yaad gemäß SEQ ID NO 15 und 16 eingesetzt, d.h. der nicht mit einem Hydrophobin verbundene Fusionspartner alleine. Das jeweilige Protein wurde in einer Konzentration von 0,07 mg/kg einem handelsüblichen Eurosuper-Kraftstoff (gemäß EN 228) zugesetzt, der bereits 1000 mg/kg des o- ben erwähnten Performance-Additivpakets A enthielt. Als Referenz diente der nur mit A additivierte Kraftstoff ohne Protein.
Es wurden jeweils Emulsionstests nach DIN 51415 wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2
Figure imgf000037_0001
Kommentar:
Die Trennung der Emulsion läuft ohne Zusatz eines Demulgators genauso langsam wird in Beispiel 10. Die Bewertung 4 ist inakzeptabel, es tritt eine stabile Emulsion auf.
Die eingesetzten Proteine wirken demulgierend, allerdings ist die Geschwindigkeit der Demulgierung langsamer als bei der Verwendung von Hydrophobinen.
Beispiel 12
Verwendung eines Hvdrophobin-Konzentrats (Yaad-Xa-dewA-HiSβ) als Emulsionsbre- cher für Rohöl
Der Versuch wurde mit einem Hydrophobin-Konzentrat gemäß Beispiel 8 (SEQ ID NO. 19 und 20) durchgeführt.
Bei den durchgeführten Versuchen wurden zu 50 ml Rohöl (Probe ex Wintershall AG, Emiichheim, Sonde 301 ; Restwassergehalt nach Einsatz von herkömmlichen Emulsionsspaltern ca. 3 %) Hydrophobin-Konzentrat in verschiedenen Mengen zugegeben. Die Konzentration des Hydrophobins im Rohöl betrug 1 ppm, 10 ppm und 40 ppm. Nach dem Homogenisieren wurden die Mischungen 10 min. bei 2000 U/min, zentrifu- giert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3
Figure imgf000038_0001
Bei Zugabe von 10 und 40 ppm Hydrophobin-Konzentrat bildete sich ein überwiegender Anteil der freien Wasserphase.
Beispiel 13
Verwendung eines Hvdrophobin-Konzentrats (Yaad-Xa-dewA-HiSβ) zur Fraktionierung von Polymeren
Der Versuch wurde mit einem Hydrophobin-Konzentrat gemäß Beispiel 8 (SEQ ID NO. 19 und 20) durchgeführt.
In zwei Bechergläsern wurden je 150 g einer Polyacrylsäure in Form ihres Natriumsalzes (Sokalan® CP 10 S; Mw 4000 g/mol, gemäß DE 199 50 941 A1) vorgelegt, anschließend je 75 g Isopropanol zugegeben. Es wurde für 5 min gerührt, anschließend wurden je 146 g Isopropanol/ Wasser (im Verhältnis 1/1) zugeben und für 5 min gerührt.
In Becherglas A wurden 50 ppm Hydrophobin (1,64 m, 11 ,3 mg/ml) zugegeben und für 5 min gerührt. Das Hydrophobin erzeugte weiße Schlieren in der klaren Lösung, die nach 5 min vollständig gelöst waren. In beide Bechergläser wurde 19,75 g 50%ige NaOH zugegeben und für 15 min gerührt.
Mit Hydrophobin entstand sofort eine milchige Lösung, ohne Zusatz von Hydrophobin eine stark opake Lösung. Nach 15 min Rührzeit wurde der Inhalt der Bechergläser in je einen 500 ml Scheidetrichter überführt, kurz geschüttelt und beobachtet wie lange die Trennung der Phasen dauerte.
Bei der Probe mit Hydrophobin zeigte sich nach 10 min eine deutliche Phasentrennung, ohne Zusatz des Hydrophobins bildete sich zunächst eine schaumartige „Zwischenschicht", also keine klare Phasengrenze. Ohne Zusatz eines Hydrophobins bildete sich erst nach 40 Minuten eine klare Phasengrenze. Dauer der Trennung bis zum Auftreten einer scharfen Phasengrenze:
- Mit Hydrophobin: 12 Minuten
- Ohne Hydrophobin: 40 Minuten
Beispiel 14, Vergleichsbeispiel 15
Verwendung von Fusions-Hydrophobin (Yaad-Xa-dewA-HiSβ) und Rinderserumalbumin (BSA) als Demulgator für eine Öl-Wasser-Emulsion bei 55°C
Der Versuch wurde mit einem Hydrophobin-Konzentrat gemäß Beispiel 8 (SEQ ID NO. 19 und 20) durchgeführt sowie mit einer kommerziell erhältlichen Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) durchgeführt.
Die Prüfung des Demulgiervermögens wurde wie folgt vorgenommen:
Als öl wurde ein Hydrauliköl eingesetzt.
40 ml destilliertes Wasser wurden in einem 100 ml Messzylinder vorgelegt und das jeweilige Protein einer Menge von 5 ppm bezüglich des Wassers bzw. 2,5 ppm bezüg- lieh des Gesamtsystems zugegeben. Anschließend wurden 40 ml Hydrauliköl zugegeben und das System bei 55°C in einem Wasserbad temperiert. Die Temperierzeit betrug 20 min. Danach wurden das öl und das Wasser mit einem Padelrührer 5 min bei 1500 U/min emulgiert. Hierdurch wird das öl in der Wasserphase emulgiert. Danach wurde die Phasenseparation beobachtet. Angegeben ist jeweils die Menge der wieder getrennten Wasserphase in ml.
In einer Versuchsserie wurde die wässrige Lösung der beiden Proteine unverändert eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Diagramm 1 dargestellt.
In einer zweiten Versuchsserie wurde die Lösung der beiden Proteine zunächst bei RT mit HCl auf pH 1 gestellt und 24 h bei pH 1 belassen. Danach wurde mit NaOH wieder auf pH 7 eingestellt. Die Ergebnisse sind in Diagramm 2 dargestellt. Demulgierung einer Öl - Wasser - Emulsion mit 2,5 ppm Proteinen
Figure imgf000040_0001
Zeit in min.
Diagramm 1 : Vergleich von Hydrophobin (H*Protein A) und Rinderserumalbumin, unveränderte Proben
Demulgierung einer Öl - Wasser - Emulsion mit 2,5 ppm Proteinen
Figure imgf000040_0002
Zeit in min.
Diagramm 2: Vergleich von Hydrophobin (H*Protein A) bezeichnet) und Rinderserumalbumin, Proben vor Versuch jeweils 24 h auf pH 1 gestellt. Kommentar:
Die Geschwindigkeit der Demulgierung der Öl-Wasser-Emulsion wird durch BSA im Vergleich zu einer Probe ohne Demulgator nur geringfügig verbessert. Beim Zusatz von Hydrophobinen wird hingegen eine sehr deutliche Beschleunigung der Demulgie- rung beobachtet.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens eines Hydrophobins zur Verbesserung der Phasentrennung in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei das mindestens eine Hydrophobin als De- mulgator eingesetzt wird.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das mindestens eine Hydrophobin ein Fusions-Hydrophobin ist.
4. Verwendung nach nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen ausgewählt ist aus der Gruppe be- stehend aus
Zusammensetzungen enthaltend öl und Wasser, Zusammensetzungen enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser, Reaktionsgemischen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das mindestens eine Hydrophobin in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
7. Verwendung nach Anspruch 6, daurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Rohöl-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das mindestens eine Hydrophobin in einer Menge von 1 bis 800 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
8. Verwendung nach Anspruch 6, daurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Kraft-/Brennstoff-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das mindestens eine
Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 10 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei neben dem mindestens einen Hydrophobin mindestens eine weitere Verbindung eingesetzt wird, die die Phasentrennung verbessert.
10. Verfahren zur Trennung von mindestens zwei flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, umfassend die Zugabe von mindestens einem Hydrophobin zu der Zusammensetzung.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das mindestens eine Hydrophobin ein Fusi- ons-Hydrophobin oder ein Derivat davon ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe von y- aad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder y- aad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen ausgewählt ist aus der Gruppe be- stehend aus
Zusammensetzungen enthaltend öl und Wasser, Zusammensetzungen enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser, Reaktionsgemischen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das mindestens eine Hydrophobin in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, daurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Rohöl-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das mindestens eine Hydrophobin in einer Menge von 1 bis 800 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14, daurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Kraft-/Brennstoff-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das mindestens eine
Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 10 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das Verfahren vor oder nach der Zugabe des mindestens einen Hydrophobins eine Erhöhung der Tem- peratur der Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen um- fasst.
18. Formulierung, enthaltend mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kraftstoffen, Brennstoffen, Rohölen oder wasser- oder öllöslichen Polymerlösungen und mindestens ein Hydrophobin.
19. Formulierung nach Anspruch 18, wobei das Hydrophobin in einer Menge von 0,0001 bis 1000 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulie- rung enthalten ist.
20. Formulierung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Formulierung mindestens einen Kraft- oder Brennstoff enthält und das Hydrophobin oder das Derivat davon in einer Menge von 0,001 bis 0,5 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulierung enthalten ist.
21. Formulierung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Kraft- oder Brennstoff um einen Kraftstoff ausgewählt aus der Gruppe von Ottokraftstoffen, Dieselkraftstoffen oder Turbinenkraftstoffen handelt.
22. Formulierung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , wobei das mindestens eine Protein ein Fusions-Hydrophobin oder ein Derivat davon ist.
23. Formulierung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.
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