WO2006040025A1 - Vorrichtung und verfahren zur rastersondenmikroskopie - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur rastersondenmikroskopie Download PDF

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Jens Struckmeier
Karl Schlagenhauf
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    • G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders
    • G01Q60/42—Functionalisation

Definitions

  • the present invention generally relates to devices and methods for studying biological systems, and more particularly to those enabling scanning probe microscopic and, in particular, force spectroscopic investigations.
  • Biological systems and their processes are based on molecular interactions. Molecular forces in biological systems differ from other molecular systems, in particular with regard to chemical reactions and physical changes of an overall system. However, statements about molecular interactions in biological systems are the prerequisite for analyzing such systems and making further statements.
  • lateral resolution is to be understood as the resolution in a plane of a surface of a biological system to be examined, while the resolution perpendicular to this plane is referred to as vertical resolution.
  • scanning probe microscopy approaches include raster-force microscopic approaches, such as, for example, scanning force microscopy (SFM) or atomic force microscopy (AFM).
  • SFM scanning force microscopy
  • AFM atomic force microscopy
  • v ⁇ force spectroscopy vs denotes determined moleku ⁇ lare forces a sample using a probe, with which the sample is scanned to, for example, interactions between individual molecules to characterize quantitatively.
  • the probe is scanned over the surface of the sample, the lateral and vertical positions and / or deflections of the probe being ascertained Due to the elastic properties of the probe and in particular of the cantilever, movements of the probe relative to the specimen are possible On the basis of detected lateral and vertical positions and / or deflections of the specimen, molecular forces on the part of the specimen and its surface topography are determined ,
  • movements of the sample are determined by means of optical measuring devices which have resolutions in the range of 0.1 nm and enable detection of forces of a few pN.
  • the surfaces of the sample and the probe of an atomic force microscope are brought into contact with one another in such a way that a force acting therebetween is set to a predetermined value (eg 50-100 pN). Thereafter, the sample will laterally move the probe relative to each other so that a raster scan of the surface sample by the probe will occur. In this case, the sample and / or the probe are also moved vertically, in order to keep the intermediate force at the predetermined value. Movements of the sample and the probe relative to each other can be effected by a piezoceramic-comprising arrangement.
  • An advantage of atomic force microscopy is that biological samples can be examined in buffer solutions at physiologically rele vant temperatures (eg between 4 ° C and 60 ° C).
  • a probe S is used to probe the surface of a biological sample BP.
  • the probe S may be considered as comprising a probe tip Sp "suspended" by a spring C. With movements of the probe S and the sample BP relative to each other (for example along the path W), the probe S and the sample BP are moved relative to each other in the vertical direction so that the deflection of the spring C is constant, depending on the respective surface topography is.
  • the object of the present invention is to provide means for eliminating the disadvantages of known scanning microscopy approaches, in particular with regard to personnel expenditure and time expenditure, and to provide the measurements required for a sound examination of biological samples. Furthermore, the present invention is intended to make it possible to use data obtained in scanning probe microscopy comparisons with the prior art in an improved manner to be able to.
  • the present invention provides an apparatus for scanning probe microscopy and a method for performing a scanning probe microscopic measurement according to independent claims 1 and 32, respectively. Preferred embodiments will become apparent from the appended claims, the following description and the drawings.
  • the device according to the invention is used for scanning probe microscopy and comprises a scanning microscopy measuring device which comprises a measuring probe for scanning microscopy measurements and a sample carrier for arranging a sample to be measured by scanning microscopy. Furthermore, a control device and / or an evaluation device is provided.
  • the controller is system integrated, i. as an integrable component of the device according to the invention with the ra ⁇ stermikroskopischen measuring device connected, andiserich ⁇ tet, the measuring device for performing a rastermikro ⁇ scopic measurement according to predetermined control parameters au ⁇ automatically control.
  • the evaluation device is also system-integrated connected to the scanning microscopic measuring device, thus forming an integral part of the device according to the invention, and is adapted to automatically evaluate measurements by means of rastermikroskopi- see measuring device according to predetermined evaluation parameters.
  • the device according to the invention provides a platform for automatically carrying out and / or analyzing examinations of biological samples by means of raster probe microscopy. Furthermore, the device according to the invention makes it possible to carry out measurements on the respective biological gische sample or adapt their system by appropriate control parameters and / or evaluation parameters are used. An advantage, for example, based on this is that such measurements can be carried out essentially without personnel all day and simultaneously analyzed.
  • control device and / or the evaluation device is set up to identify measurements of the measurement and / or evaluation device indicating data for determining input parameters or parameter sets of the measurement.
  • This feature can also be referred to as the feedback of measurements of the measuring and / or evaluation device indicating data as control and / or evaluation parameters.
  • the identification of parameters or parameter sets can be carried out using iterative search algorithms.
  • the control device and the evaluation device are logically connected to one another.
  • the evaluation device analyzes the force-spectroscopic data during an experiment. When a significant number of data is reached, the next experimental parameters are set and the experiment is continued.
  • the experimental parameters can be changed so that, for example, certain changes in the measured forces (and the energies and bonding constants determined therefrom) are examined in more detail. So it becomes e.g. it is possible to automatically investigate the areas of molecular interactions of interest to the user.
  • This embodiment of the device according to the invention makes it possible to classify measurements and samples, to compare measurements on a sample with one another, to develop and / or to use optimized measurement strategies, and to optimize measurement strategies used.
  • the device comprises a data storage device for storing the data generated by the evaluation device, which results from an evaluation of measurements by means of the scanning probe microscopic measuring device.
  • a data storage device for storing the data generated by the evaluation device, which results from an evaluation of measurements by means of the scanning probe microscopic measuring device.
  • This embodiment makes it possible, for example, to set up a database with information about measurements on samples to be surveyed by means of a scanning probe microscope, which can be used before, during and after an ongoing measurement.
  • the data storage device can also be used for returned measurement results, whereby comparisons are also provided with information already present in the data storage device.
  • the data storage device is designed, the predetermined control parameters and / or the predetermined
  • the probe comprises a resilient unit.
  • the spring-elastic unit may have an overall elastic design or have a resilient area.
  • a resilient unit for example, a (katra ⁇ gender) boom or measuring beam (cantilever) can be used.
  • the measuring device is capable of evaluating forces acting on the measuring probe.
  • the measuring device interacts with the sample and resulting forces acting on the probe, using an optical measuring system (eg laser beam system). Deflection system, beam bouncing) and / or piezoelectric Ef fects and / or _ _
  • the device according to the invention can also comprise a unit for generating a light field acting on the measuring probe and / or electric field and / or magnetic field.
  • the field (s) may be static or dynamic fields, with alternate operation between static and dynamic.
  • a spring which preferably has a length in the range between 1 and 400 micrometers, and / or an elastic cantilever (cantilever) is provided as the spring-elastic element.
  • control device is able to control the spring-elastic unit in such a way that the measuring probe is vibrated with a predetermined amplitude. For example, amplitudes in the range between 0.1 and 2000 nanometers are provided.
  • the device according to the invention may comprise a power generating unit, which may be associated with the measuring device and / or the control device.
  • control device is able to control the power generation unit automatically so that changes of an effective quality factor (Q factor) for the measuring probe can be achieved by applying corresponding forces to the resilient element.
  • Q factor effective quality factor
  • the use of the force-generating unit is particularly preferred if the measuring probe is to vibrate.
  • the evaluation device can be set up, such changes in the form of resonance shifts and / or
  • the measuring device comprises a probe positioning unit in order to position the measuring probe in all translational and / or rotational axes of the room.
  • the control device can automatically position and / or move the measuring probe by controlling the positioning unit in accordance with predetermined probe positioning parameters.
  • probe positioning parameters that include:
  • Movements of the probe for the raster scanning of a sample to be arranged on the sample carrier such Be ⁇ movements lateral movements and / or movements in the range between 0.1 nanometers and a few millimeters, preferably in the range between 0.1 nanometers and 500 microns, comprising movements the measuring probe in the vertical direction, it being provided that such movements may be in the range between 0.01 nanometers and 50 microns,
  • Movements of the measuring probe in the vertical direction as a function of a predetermined minimum distance between the measuring probe and the sample it being possible to use a distance control, for example a PID and / or a phase-logic control, for motion control, a maximum time duration for a contact of the probe with a sample to be arranged on the sample carrier, a maximum contact frequency of contacts of the Messson ⁇ de with a sample to be arranged on the sample carrier, a maximum and / or a minimum Meßsondengeschwin ⁇ speed for movements of the probe relative to a a sample to be arranged on the sample carrier, a maximum and / or a minimum distance between the measuring probe and a sample to be arranged on the sample carrier, a predetermined, between the probe and a sample to be arranged on the sample carrier to be held constant force, for example, in the range between 0, 1 and 3000 pN can be a maxima le and / or a minimum tensile force of the measuring _ _
  • a maximum and / or a minimum pressure force of the measuring probe on a sample to be arranged on the sample carrier a maximum and / or a minimum tensile force change rate for from the measuring probe to a sample to be arranged on the sample carrier acting tensile forces, a maximum and / or a minimum pressure force change rate for pressure forces acting on a sample carrier by the measuring probe, a maximum and / or a minimum shearing force of the measuring probe on a sample to be arranged on the sample carrier, and / or a maximum and / or a minimum shearing force change rate for shearing forces acting on a sample to be placed on the sample carrier by the measuring probe.
  • a first detector unit is vor ⁇ seen, the positions of the probe and / or movements of the probe, preferably also the deflection, and / or forces acting on the probe regularly, e.g. repetitive with a frequency of a few tens or a few hundred kHz can detect.
  • the control device is preferably designed to automatically control the first detector unit in accordance with predetermined detection parameters.
  • the first detector unit comprises position sensors for detecting the position and / or movement of the measuring probe.
  • position sensors for detecting the position and / or movement of the measuring probe.
  • LVDT sensors LVDT sensors, strain gauges, optical sensors, interferometric sensors, capacitive sensors can be used for this purpose.
  • an optical beam deflection detector for detecting the deflection of the measuring probe is provided.
  • the first detector unit is connected to the control device at least in this respect.
  • control device is able to control the first detector unit in accordance with predetermined detection parameters, which include a predetermined detection rate with regard to individual, several and / or all variables to be detected, and / or a frequency at which the first detector unit positions - Ons, motion and / or force measurements should perform.
  • predetermined detection parameters include a predetermined detection rate with regard to individual, several and / or all variables to be detected, and / or a frequency at which the first detector unit positions - Ons, motion and / or force measurements should perform.
  • the evaluation device can automatically evaluate variables detected by the first detector unit. This can be done analytically and / or statistically.
  • the evaluation device can be set up in such a way that variables detected by the first detection unit are classified. It is preferred that classified quantities or data indicating this to the evaluation device, as explained above, be fed back into the measuring process, for example to identify special parameter sets of the measurement.
  • the measuring device comprises a sample carrier positioning unit in order to enable positioning of the sample carrier.
  • the control device can be embodied such that the sample carrier can be automatically positioned and / or moved by means of control of the sample carrier positioning unit in accordance with predetermined sample carrier positioning parameters.
  • sample carrier positioning parameters used are those comprising:
  • Movement of the sample carrier for the screened scanning of a sample to be arranged on the sample carrier sample by the probe wherein movements can occur laterally and / or may be in the range between 0.1 and 500 microns, _ n _
  • a maximum time duration for a contact of a sample to be arranged on the sample carrier with the measuring probe a maximum contact frequency of contacts of a sample to be arranged on the sample carrier sample with the probe, - a maximum and / or a minimal Probenenoughgeschwin ⁇ speed for movements of the sample carrier relative to the measurement ⁇ a probe, a maximum and / or a minimum distance between ei ⁇ ner to be arranged on the sample carrier sample and the probe, - a predetermined, between a an ⁇ on the sample carrier an ⁇ speculating sample and the probe to be held constant force, for example, in the range between 0.1 and 3000 pN, a maximum and / or a minimum tensile force on a sample to be arranged on the sample carrier by the probe, a maximum and / or a minimum pressure force on a sample carrier to be arranged sample by the probe, a maximum and / or a minimum rate of tensile change for one on the sample a maximum and / or a minimum
  • the sample carrier positioning unit comprises a piezoelectric actuator and / or a linear drive, which may be, for example, a voice coil drive (voice coil drive).
  • a piezoelectric actuator and / or a linear drive which may be, for example, a voice coil drive (voice coil drive).
  • the sample carrier positioning unit can additionally be designed such that "large" positioning movements and / or movements of the sample carrier are made possible, for example in the range between 100 nm and 30 cm.
  • the advantage of such a sample carrier positioning unit with coarse positioning is that pre-positioning and larger movements can be carried out quickly. Exact positioning and movements can then join.
  • the sample carrier positioning unit is assigned position and / or movement detection sensors that provide information for controlling the sample carrier positioning unit, for example using a closed control loop.
  • the above-mentioned position sensors and / or further sensors can be used.
  • the measuring device comprises a sample chamber in which a fluid can be received, with which a sample to be arranged on the sample carrier is to be surrounded.
  • surrounded is meant that at least the region of the sample to be examined is surrounded by fluid, for example a certain surface of the sample.
  • the control device can be designed to monitor predetermined fluid parameters for the respective fluid used and, if necessary, to adjust them.
  • fluid parameters for example, those are provided which comprise: a predetermined temperature, a predetermined temperature profile, a predetermined pH value, a predetermined pH profile a predetermined electrolyte content, a predetermined electrolyte content profile, a predetermined volume flow, a predetermined volume flow change, a predetermined level of fluid, and / or a predetermined amount of biological and / or chemical markers.
  • markers When using a predetermined amount of biological and / or chemical markers as fluid parameters, quantities for fluorescent markers and / or radioactive markers may be predetermined.
  • markers are used which are chemically and / or biologically functionalized, ie have selective properties with respect to the sample to be examined.
  • a delivery unit with which fluid (e.g., buffer solution (s), reagent (s)) to be delivered to the sample chamber can be provided.
  • the control device can be designed such that the supply unit is monitored and, if appropriate, controlled in such a way that predetermined boundary conditions for the respective fluid, preferably also its composition, are maintained in the sample chamber. For example, certain reagents are automatically mixed together to adjust fluid parameters such as pH, etc.
  • the supply unit allows a supply of fluid to the sample carrier in the area in which samples are to be arranged during measurements. It is further preferred that the Zubigein ⁇ unit is automatically controlled by the control device.
  • the supply unit may comprise a pump and / or a multi-channel pump.
  • a second detector unit For monitoring fluid in the sample chamber and / or given boundary conditions for the respective fluid, a second detector unit may be provided which is capable of detecting a current fluid level in the sample chamber.
  • the control device can be designed so that in response to the second detector unit detected Pluidpegel the first Zufuh ⁇ purity is automatically controlled.
  • a temperature chamber which surrounds at least the measuring probe and the sample carrier. It is further provided that the temperature chamber also surrounds further components of the measuring device, such as, if present, the force generating unit, the probe positioning unit, the sample carrier positioning unit, the sample chamber, the first supply unit and / or the second feed unit referred to below. In this case, it is preferable for the temperature chamber to be controlled by the control device in accordance with predefined temperature parameters.
  • the Steuereinrich ⁇ device is able to control the temperature chamber so that a vor ⁇ given temperature is maintained and / or at least a predetermined temperature profile is achieved.
  • the control of the temperature chamber it is possible for the control of the temperature chamber to occur so that constant temperature periods alternate with periods in which temperature changes take place.
  • the scanning microscopic measuring device is a force-microscopic measuring device, preferably for detecting force-displacement curves. From this information on interactions and binding forces of single molecules can be gained.
  • the measuring device also comprises an optical detection unit, preferably a unit based on fluorescence and / or transmitted-light microscopy technology (for example DIC and / or phase contrast, bright field and / or dark field).
  • an optical detection unit preferably a unit based on fluorescence and / or transmitted-light microscopy technology (for example DIC and / or phase contrast, bright field and / or dark field).
  • Fig. 1 is a schematic representation of the principle of a raster power microscope (AFM),
  • FIG. 2 schematically illustrates an embodiment 1 of the scanning probe microscopy apparatus according to the invention
  • Fig. 3 shows an illustration of a measuring probe arrangement for use in the device according to the invention.
  • embodiment 1 comprises a raster probe microscopic measuring device 2, such as an atomic force microscopic measuring device (AFM), which comprises a measuring probe 4 for atomic force microscopy and force microscopy measurements and a sample carrier 6, on which for carrying out a measurement, a biological sample 8 is arranged.
  • a raster probe microscopic measuring device 2 such as an atomic force microscopic measuring device (AFM)
  • AFM atomic force microscopic measuring device
  • AFM atomic force microscopic measuring device
  • the measuring probe 4 is constructed as a cantilever, which serves as a spring-elastic unit of the measuring probe 4 and integrated in the same construction at its free end or has a special tip (not designated) connected to it.
  • the illustration of FIG. 2 shows only one measuring probe. However, it is intended to use more than one measuring probe 4 in the measuring device 2.
  • the measuring device 2 may have two, four, six, eight and up to a hundred or more measuring probes 4.
  • the measuring device 2 may have two, four, six, eight and up to a hundred or more measuring probes 4.
  • cantilever chips By constructing a plurality of measuring probes to be used in the measuring device 2, for example so-called cantilever chips can be used.
  • FIG. 3 shows an electron micrograph of a can-tilever chip which has eight spring-elastic units 4 ⁇ ,... 4s in the form of cantilevers. Using nanotechnological approaches, such chips with a hundred or more cantilevers are possible.
  • the measuring device comprises a force-generating unit (not shown) cooperating with the measuring probe 4 and in particular with its spring-elastic unit.
  • the force-generating unit makes it possible, for example, to move the measuring probe 4 in such a way that a quality factor (Q-factor) desired for a measurement is achieved.
  • the measuring device has a probe positioning unit (not shown) in order to position the measuring probe 4 relative to the sample 8.
  • the probe 4 can be correspondingly positioned and moved by means of the probe positioning unit.
  • the first detector unit 12 is constructed as an optical detector and comprises a radiation source 14, for example a radiation source emitting laser light, and a receiver 16 which receives light from the radiation source 14 after interaction with the measuring probe 4.
  • the radiation source 14 irradiates the measuring probe 4 with For example, in the area of their free end. Interactions, in particular reflections of the light from the radiation source 14 are detected by the receiver 16 in order to conclude, after evaluation, on positions and movements of the measuring probe 4.
  • the measuring device 2 further comprises a Probenippopositio- nierhimssen 10, the one component may be the same 'carrier constructional unit provide the samples inte ⁇ grated or.
  • the sample carrier 6 and the sample carrier positioning unit 18 can also be designed as separate components.
  • the sample carrier positioning unit 18 uses a piezoelectric actuator which enables movements and positions of the sample carrier 6 and thus the sample 8 arranged thereon in the room.
  • a sample chamber 20 surrounds the measuring probe 4 and the sample 8 or at least? the area of the sample 8 to be examined, for example its upper surface.
  • the sample chamber 20 is closed in a fluid-tight manner, apart from the inflows and outflows described below, and thus provides a closed space in relation to surrounding areas.
  • the sample chamber 20 can altogether serve to receive fluid or, as shown in FIG. 2, have a fluid chamber 22 for this purpose, which is designed such that the measuring probe 4 and the
  • Sample 8 or whose area to be analyzed are surrounded by fluid.
  • the second detector unit 24 is embodied here as an optical measuring unit which comprises a light source 26, for example in the form of a laser light emitting light source, and a receiver 28 which receives light from the light source 26 after interaction with fluid in the sample chamber 20. Statements about the fluid level in the
  • Sample chamber 20 are possible based on the light that receiver 28 receives.
  • the sample chamber 20 is connected to a supply line 30, via which fluid can be supplied to the sample chamber 20. Fluid can be removed from the sample chamber 20 via a discharge line 32.
  • the supply line 30 is connected on the input side to a supply unit 34, via which individual, several, mixed and mixed fluids can be supplied to the supply line 30 and thus to the sample chamber 20.
  • the supply unit 34 comprises for this purpose one or more pumps or multi-channel pumps and devices (not shown) for mixing and mixing fluids. Via feed line 36... 36 n , the feed unit 34 receives fluid from fluid reservoirs (not shown). In the embodiment 1, any desired, desired and / or required fluids in an analysis of the sample 8 are supplied via the supply unit 34, for example buffer solutions and reagent substances.
  • the temperature chamber 38 ensures a close to the environment at least in terms of temperature.
  • the embodiment 1 further comprises a control device 40 and an evaluation device 42.
  • the control device 40 serves to control the components arranged in the temperature chamber 38 and the temperature chamber 38 itself.
  • connections 44 and 46 between the control device 40 and the supply unit 34 or the sample unit are representative of the connections required for this purpose.
  • carrier positioning unit 18 shown. - -
  • the evaluation device 42 receives from all the components enclosed by the temperature chamber 38, if so designed, and from the temperature chamber 38 itself, data, measuring signals and the like in order to determine the respective current operating state or state. To be able to determine and evaluate current measurement results. '
  • connections 48. 50 and 52 between the evaluation device 42 and the supply unit 34, the sample carrier positioning unit 18 and the second detector unit 24 are shown.
  • the embodiment 1 comprises a data storage device 54, which is connected to the control device 40 and the evaluation device 42.
  • the data storage device 54 serves to store current data obtained by the evaluation device 42, measurement signals and the like, current data provided by the evaluation device 42, parameters that can be used by the control device 40 to control the embodiment 1, and others, data described below.
  • the data storage device 54 is set up in such a way that it is used as a database in which evaluated data and data of third parties acquired with the embodiment 1 can be stored.
  • the control device 40 controls not only the actual force spectroscopic experiment, but also all experimental conditions, such as temperature, the pH effective for the sample 8, the electrolyte interacting with the sample 8, and the addition of pharmaceutical, biochemical and chemical reagents. Furthermore, the control device 40 checks at predetermined times, at predetermined time intervals or continuously for the measurement effective parameters and boundary conditions and controls the measurement such that specifications for the measurement are met.
  • the evaluation device 42 analyzes the force spectra detected in the measurement by means of the measuring probe 4 with respect to the sample 8 and can analyze the force spectra. Depending on this, it is possible, for example when a setpoint is reached, to terminate the current measurement and to initiate a new measurement with changed specifications (eg environmental conditions).
  • the control device 40 and the data provided by the evaluation device 42 also make it possible to perform iterative measurement cycles in order to determine boundary conditions that favor certain interactions.
  • the measuring probe 4 is scanned over the sample 8, wherein (biological) molecules on the surface of the sample 8 can be detected on the basis of interactions between the measuring sonometer 4 and the sample 8.
  • certain contact times and / or contact frequencies between the measuring probe 4 and the sample are required. These parameters are set by the control device 40, monitored and corrected if necessary. In this case, it may be advantageous, in particular to carry out a completely automated measurement, to prepare sample 8 in an optimized manner. Further details on this can be found below.
  • control device 40 controls all relevant experimental conditions, such as maximum and / or minimum pressure and / or tensile forces between the measuring probe 4 and the sample 8, speeds with the movements relatively between the measuring probe 4 and 8, the number of measuring points (resolution) and maximum and / or minimum distances between the measuring probe 4 and the sample 8.
  • the data obtained may be assigned to a data set. Further data sets can then be created and compared with each other under changed experimental conditions. This makes it possible to analyze different biological and / or medically relevant experimental conditions with regard to their influence on molecular interactions.
  • thermo changes In order in particular to minimize the thermal drift in the case of changes in experimental conditions, such as, for example, changes with respect to buffer solutions which interact with the sample 8, the temperature chamber 38 is provided. Furthermore, a heating or cooling element (for example Peltier element) can be used in order to control the temperature of the sample 8 itself. Such a heating or cooling element can be arranged, for example, under the sample carrier 6.
  • a heating or cooling element for example Peltier element
  • Biomolecular interactions usually depend heavily on the prevailing physiological environmental conditions. These should therefore be controlled during a measurement and controlled in such a way that desired environmental conditions are maintained or native states of the sample 8 are stimulated. For example, during a measurement, it is provided to control the level of a buffer solution present in the sample chamber 20 at predetermined time intervals by means of the second detector system 24, or to continuously control the supply unit 34 and possibly to operate the supply unit 34 in such a way maintaining or attaining a desired level. In this way it is possible, for example, during a measurement to reduce the buffer level. "*
  • pH fluctuations and changes in terms of electrolytes used and other substances interacting with the sample 8 can be controlled and optionally controlled.
  • drying and desalting can also be prevented.
  • fluid movements for example, vortices
  • fluid movements in the sample chamber 20 can cause vibrations of the measuring probe 4.
  • the control device 40 to interrupt an ongoing measurement if such disturbances are to be expected and / or such disturbances are detected or predicted by the evaluation device 42.
  • the speed with which a measurement can be carried out plays an essential role. However, faster measurements can affect their quality.
  • the invention allows the measuring probe 4 to be moved and / or positioned at relatively high speeds. It is intended to use different speeds for moving and / or positioning the measuring probe 4 during a measurement at different and / or identical measuring points. This makes it possible, for example, to make more detailed statements about molecular interactions from force spectra acquired at different speeds (eg force distance curves).
  • measurements can be optimized by increasing the resolution at which force spectra are acquired. This can be achieved by minimizing the smallest force that can be detected by the measuring probe 4. The smallest detectable force depends inter alia on the elastic property of the measuring probe 4. In order to achieve the smallest possible detectable forces, it is therefore necessary to use measuring probes which have as soft a spring as possible. _ -
  • Another possibility is to increase the pull-up speeds of the probe.
  • High velocities can in particular cause hydrodynamic flows and undesirable movements of the measuring probe 4 resulting therefrom.
  • increased noise may occur in the measurement data, thereby degrading the sensitivity to low forces between probe 4 and sample 8.
  • Such measuring probes show a significantly improved hydrodynamic behavior compared to conventional measuring probes and allow significantly higher drawing speeds. However, such probes are deflected less. Therefore, in the invention, as the detector system 12, a possible high-resolution optical detection system with special optics is used.
  • the measuring probe 4 is set into low-amplitude oscillations (eg 0.1-10 nm) during a measurement.
  • low-amplitude oscillations eg 0.1-10 nm
  • the probes surrounded by buffer fluid usually have low Q factors.
  • molecular interactions are detected by resonance shifts or resonance maxima of the probe.
  • Resonance properties of the probe are proportional to the Q-factor, with a low Q-factor leading to a broad resonance maximum. Therefore, the sensitivity of force detection is low with low Q-factor.
  • dissipative interactions for example caused by hydrodynamic flows of a fluid surrounding the measuring probe, influence the spring-elastic properties of the measuring probe (eg damping constant).
  • Form 1 it is provided to increase the Q-factor by applying an external force to the measuring probe 4 by means of a positive feedback loop.
  • the Q factor can be improved by three or more orders of magnitude, with the force sensitivity being in the range of a few pN.
  • the force curves are processed so that they can be compared with each other. This can be done, for example, by defining a common zero line (reference values) and a corresponding displacement and / or extension of the individual force curves.
  • the entire measurement can be analyzed statistically to obtain, for example, in folded proteins insight into the probability distribution of individual deployment processes and forces required for deployments.
  • the force curves can be classified, superimposed on each other and averaged.
  • the length of the respective force curve and the number and position of force maxima present there can be used.
  • the length of a force curve indicates the area over which interactions occur.
  • the number and position of force maxima permits statements about collective and / or singular interaction processes.
  • a classification of force curves, the averaging of force curves of a common class and thus mutually related or comparable interaction processes as well as a subsequent statistical analysis allow comparisons of interaction processes of different samples under the same experimental conditions and identical or comparable samples with the same experimental Conditions.
  • three mutants of the same receptor which differ in a point mutation can be identified on the basis of their interaction spectra and compared with one another. It is also possible to make statements about the influence of mutations on local interactions of a protein and of the protein with other molecules.
  • the data storage device 54 By means of the data storage device 54 it is possible to create a database for force spectra, for example to characterize typical interaction processes of different samples and different experimental conditions. For accesses to a database of the data storage device 54, it is intended to use different search strategies. For example, structural data of a depleted protein can be used to localize structurally related proteins and compare their unfolding pathways. In order to compare different deconvolution spectra, it is possible to also evaluate data of the data storage device by means of the evaluation device 42 in order, for example, to superimpose and compare different force spectra. This makes it possible to make statements about interdependencies of interaction conditions of experimental conditions. Also, interaction processes of different samples can be judged as to whether their interaction processes occur indicate comparable, similar or identical properties of the samples.

Abstract

Vorrichtung zur Rastersondenmikroskopie, mit einer rastermikroskopischen Messeinrichtung, die eine Messsonde für rastermikroskopische Messungen und einen Probenträger zur Anordnung einer rastermikroskopisch zu vermessenden Probe umfasst, einer Steuereinrichtung, die systemintegriert mit der rastermikroskopischen Messeinrichtung verbunden ist, wobei die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die Messeinrichtung zur Durchführung einer rastermikroskopischen Messung gemäss vorgegebener Steuerungsparameter automatisch zu steuern, und/oder einer Auswerteeinrichtung, die systemintegriert mit der rastermikroskopischen Messeinrichtung verbunden ist, wobei die Auswerteinrichtung eingerichtet ist, Messungen mittels der rastermikroskopischen Messeinrichtung gemäss vorgegebener Auswertungsparameter automatisch auszuwerten.

Description

VORRICHTUNG UND VERFAHREN ZUR RASTERSO2STDENMIKROSKOPIE
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Vorrichtun¬ gen und Verfahren zur Untersuchung biologischer Systeme und insbesondere solche, die rastersondenmikroskopische und im ' Speziellen kraftspektroskopische Untersuchungen ermöglichen.
Hintergrund der Erfindung
Biologische Systeme und darin ablaufende Prozesse beruhen auf molekularen Wechselwirkungen. Molekulare Kräfte in biologi¬ schen Systemen unterscheiden sich von anderen Molekularsyste¬ men, insbesondere hinsichtlich chemischer Reaktionen und phy¬ sikalischer Änderungen eines Gesamtsystems. Aussagen über mo- lekulare Wechselwirkungen in biologischen Systemen stellen aber die Voraussetzung dar, um derartige Systeme zu analysie¬ ren und weiterführende Aussagen machen zu können.
Zur Messung molekularer Wechselwirkungen in biologischen Sy- stemen werden unter anderem rastersondenmikroskopische Ansätze verwendet, um Oberflächentopografien mit hoher lateraler und vertikaler Auflösung zu bestimmen. Unter lateraler Auflösung ist hierbei die Auflösung in einer Ebene einer zu untersuchen¬ den Oberfläche eines biologischen Systems zu verstehen, wäh- rend die Auflösung senkrecht zu dieser Ebene als vertikale Auflösung bezeichnet wird.
Beispiele für rastersondenmikroskopische Ansätze umfassen ra- sterkraftmikroskopische Ansätze, wie zum Beispiel die Raster- kraftmikroskopie (SFM, engl. : scanning force microscopy oder AFM, engl. : atomic force microscopy) . _ _
Mit solchen rasterkraftmikroskopischen Ansätzen können neben der Topologie einer Oberfläche einer biologischen Probe auch deren Elastizität oder dort wirkende Adhäsionskräfte erfasst werden. Die Rasterkraftmikroskopie, in diesem Falle üblicher- weise als v^KraftSpektroskopievs" bezeichnet, ermittelt moleku¬ lare Kräfte einer Probe mittels einer Sonde, mit der die Probe abgetastet wird, um z.B. Wechselwirkungen zwischen einzelnen Molekülen quantitativ zu charakterisieren. Üblicherweise um- fasst die Sonde eine an einem freitragenden Ausleger oder Messbalken, der auch als Cantilever bezeichnet wird, befestig¬ te Spitze. Zur Untersuchung der Probe wird z.B. die Sonde über die Oberfläche der Probe gerastert, wobei die lateralen und vertikalen Positionen und/oder Auslenkungen der Sonde aufge¬ zeichnet werden. Bewegungen der Sonde relativ zu der Probe sind aufgrund der elastischen Eigenschaften der Sonde und ins¬ besondere des Cantilever möglich. Auf der Grundlage erfasster lateraler und vertikaler Positionen und/oder Auslenkungen der Probe werden molekulare Kräfte seitens der Probe und daraus deren Oberflächentopografie ermittelt.
Üblicherweise werden Bewegungen der Probe mittels optischer Messeinrichtungen ermittelt, die Auflösungen im Bereich von 0,1 nm haben und eine Detektion von Kräften von einigen pN er¬ möglichen.
Um die Oberflächentopografie einer biologischen Probe zu er¬ mitteln, werden die Oberflächen der Probe und die Sonde eines Rasterkraftmikroskops derart miteinander in Kontakt gebracht, dass eine zwischen diesen wirkende Kraft auf einen vorbestimm- ten Wert (z.B. 50 - 100 pN) festgelegt wird. Danach werden die Probe die Sonde relativ zu einander lateral so bewegt, dass eine gerasterte Abtastung der Oberflächenprobe durch die Sonde erfolgt. Dabei werden die Probe und/oder die Sonde auch verti¬ kal bewegt, um die zwischen wirkende Kraft auf dem vorgegebe- nen Wert zu halten. Bewegungen der Probe und der Sonde relativ zu einander können durch eine Piezokeramik umfassende Anordnung bewirkt. Ein Vorteil der Rasterkraftmikroskopie besteht darin, dass biologische Proben in Pufferlösungen bei physiologisch rele¬ vanten Temperaturen (z.B. zwischen 4° C und 60° C) untersucht werden können.
Fig. 1 veranschaulicht vereinfachend dass Prinzip eines Ra- sterkraftmikroskops. Zur Untersuchung der Oberfläche einer biologischen Probe BP wird eine Sonde S verwendet. Die Sonde S kann als eine Sondenspitze Sp umfassend betrachtet werden, die an einer Feder C "aufgehängt" ist. Bei Bewegungen der Sonde S und der Probe BP relativ zu einander (beispielsweise längs des Wegs W) werden in Abhängigkeit der jeweiligen Oberflächentopo- grafie die Sonde S und die Probe BP relativ zu einander in vertikaler Richtung so bewegt, dass die Auslenkung der Feder C konstant ist.
Derzeit stellt die Rastersondenmikroskopie ein zeitaufw ndiges und personalintensives Vorgehen dar ist. Angesichts der hohen Anzahl von Messungen, die für eine fundierte Analyse erforder¬ lich sind, stellen derzeitige Ansätze zur Rastersondenmikro¬ skopie aufgrund der geringen Anzahl von Messungen pro Zeitein¬ heit (z.B. 1 Tag) keine befriedigende Vorgehensweise dar. Auch die eingeschränkten Möglichkeiten der Analyse, Auswertung und Weiterverwendung der Messdaten stellen bedeutsame Nachteile dar.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel bereit zu stellen, um die Nachteile bekannter rastermikroskopischer An¬ sätze, insbesondere hinsichtlich Personalaufwand und Zeitauf¬ wand, zu beseitigen und die für eine fundierte Untersuchung biologischer Proben erforderlichen Messungen bereitzustellen. Des Weiteren soll es die vorliegende Erfindung ermöglichen, bei rastersondenmikroskopischen Messungen erhaltene Daten ver¬ glichen mit dem Stand der Technik in verbesserter Weise nutzen zu können.
Zusammenfassung der Erfindung
Zur Lösung der obigen Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zu Rastersondenmikroskopie sowie ein Verfah¬ ren zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung gemäß den unabhängigen Ansprüchen 1 bzw. 32 bereit. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den anhängigen Ansprüchen, der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient zur Rastersondenmikro¬ skopie und umfasst eine rastermikroskopische Messeinrichtung, die eine Messsonde für rastermikroskopische Messungen und ei- nen Probenträger zur Anordnung einer rastermikroskopisch zu vermessenden Probe umfasst. Ferner ist eine Steuereinrichtung und/oder eine Auswerteeinrichtung vorgesehen.
Die Steuereinrichtung ist systemintegriert, d.h. als integra- ler Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit der ra¬ stermikroskopischen Messeinrichtung verbunden, und eingerich¬ tet, die Messeinrichtung zur Durchführung einer rastermikro¬ skopischen Messung gemäß vorgegebener Steuerungsparameter au¬ tomatisch zu steuern.
Die Auswerteeinrichtung ist ebenfalls systemintegriert mit der rastermikroskopischen Messeinrichtung verbunden, bildet also einen integralen Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung, und ist eingerichtet, Messungen mittels der rastermikroskopi- sehen Messeinrichtung gemäß vorgegebner Auswertungsparameter automatisch auszuwerten.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird eine Plattform be¬ reitgestellt, Untersuchungen biologischer Proben mittels Ra- stersondenmikroskopie automatisiert durchzuführen und/oder zu analysieren. Des Weiteren ermöglicht es die erfindungsgemäße Vorrichtung, Messungen auf die jeweils zu untersuchende biolo- gische Probe bzw. deren System anzupassen, indem entsprechende Steuerungsparameter und/oder Auswertungsparameter verwendet werden. Ein Vorteil besteht beispielsweise darauf basierend darin, dass derartige Messungen im Wesentlichen ohne Personal ganztägig durchgeführt und gleichzeitig analysiert werden kön¬ nen.
Vorzugsweise ist die Steuereinrichtung und/oder die Auswerte- einrichtung eingerichtet, Messungen der Mess- und/oder Auswer- teeinrichtung angebende Daten zur Bestimmung von Eingangspara¬ metern oder Parametersätzen der Messung zu identifizieren. Dieses Merkmal kann auch als Rückführung von Messungen der Mess- und/oder Auswerteeinrichtung angebenden Daten als Steue- rungs- und/oder Auswertungsparameter bezeichnet werden. Die Identifikation von Parametern bzw. Parametersätzen kann unter Verwendung iterativer Suchalgorithmen ausgeführt werden. Des Weiteren ist es möglich, dass wenigstens hinsichtlich dieses Merkmals die Steuereinrichtung und die Auswerteeinrichtung lo¬ gisch miteinander verbunden sind. Bei einem Ausführungsbei- spiel analysiert die Auswerteeinrichtung die kraftspektrosko¬ pischen Daten während eines Experiments. Bei Erreichen einer signifikanten Anzahl von Daten werden die nächsten experimen¬ tellen Parameter eingestellt und das Experiment fortgeführt. Die experimentellen Parameter können dabei so verändert werden, dass beispielsweise bestimmte Veränderungen der gemessenen Kräfte (und die daraus bestimmten Energien und Bindungskon¬ stanten) genauer untersucht werden. So wird es z.B. möglich, automatisch die für den Benutzer interessanten Bereiche mole¬ kularer Interaktionen zu untersuchen.
Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermög¬ licht es, wie im Folgenden näher ausgeführt, Messungen und Proben zu klassifizieren, Messungen an einer Probe miteinander zu vergleichen, optimierte Messstrategien zu entwickeln und/oder zu verwenden sowie verwendete Messstrategien zu opti¬ mieren. _ _
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung eine Datenspeicherein¬ richtung zur Speicherung der von der Auswerteeinrichtung er¬ zeugten Daten, die aus einer Auswertung von Messungen mittels der rastersondenmikroskopischen Messeinrichtung resultieren . Diese Aus führungs form ermöglicht beispielsweise den Aufbau ei¬ ner Datenbank mit Informationen über Messungen an rasterson- denmikroskopisch zu vermessenden Proben, auf die vor, während und nach einer laufenden Messung zurückgegriffen werden können . Die Datenspeichereinrichtung kann auch für zurückgeführte Mes- sergebnisse verwendet werden, wobei auch Vergleiche mit be¬ reits in der Datenspeichereinrichtung vorhandenen Informatio¬ nen vorgesehen ist .
Vorzugsweise ist die Datenspeichereinrichtung ausgelegt , die vorgegebenen Steuerungsparameter und/oder die vorgegebenen
Auswertungsparameter und/oder bei der j eweiligen Messung vor¬ liegenden Messbedingungen so zu speichern, dass eine eindeuti¬ ge Zuordnung zu den entsprechenden, von der Auswerteeinrich¬ tung erzeugten Daten erreicht wird .
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Messsonde eine federelastische Einheit .
Die federelastische Einheit kann insgesamt federelastisch aus- gestaltet sein oder einen federelastischen Bereich aufweisen . Als federelastische Einheit kann beispielsweise ein (freitra¬ gender) Ausleger oder Messbalken (Cantilever) verwendet werden . Bei dieser Aus führungs form ist es ferner vorgesehen, dass die Messeinrichtung Kräfte, die auf die Messsonde wirken, auszu- werten vermag .
Bei einer Weiterbildung der Aus führungs form mit federelasti¬ scher Einheit ist es vorgesehen, dass die Messeinrichtung Wechselwirkungen der Messsonde mit der Probe und daraus resul - tierende , auf die Messsonde wirkende Kräfte unter Verwendung eines optischen Messsystems ( z . B . Laser-Beam-Deflection-System, Beam Bouncing) und/oder über piezoelektrische Ef fekte und/oder _ _
über magnetische Wechselwirkungen zu erfassen vermag.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch eine Einheit zur Erzeugung eines auf die Messsonde wirkenden Lichtfeldes und/oder elektrischen Feldes und/oder magnetischen Feldes um¬ fassen. Das bzw. die Felder können statische oder dynamische Felder sein, wobei auch ein wechselweiser Betrieb zwischen statisch und dynamisch vorgesehen ist.
Vorzugsweise ist als federelastisches Element eine Feder, die vorzugsweise eine Länge im Bereich zwischen 1 und 400 Mikrome¬ ter aufweist, und/oder ein elastischer Ausleger (Cantilever) vorgesehen.
Des Weiteren ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die federelastische Einheit so zu steuern vermag, dass die Mess- sonde mit einer vorgegebenen Amplitude in Schwingung versetzt wird. Beispielsweise sind Amplituden im Bereich zwischen 0,1 und 2000 Nanometern vorgesehen.
Ferner kann die erfiήdungsgemäße Vorrichtung eine Krafterzeu¬ gungseinheit umfassen, die der Messeinrichtung und/oder der Steuereinrichtung zugeordnet sein kann.
Dabei ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die Kraf¬ terzeugungseinheit automatisch so zu steuern vermag, dass Än¬ derungen eines für die Messsonde wirksamen Qualitätsfaktors (Q-Faktors) erreicht werden können, indem entsprechende Kräfte an das federelastische Element angelegt werden.
Die Verwendung der Krafterzeugungseinheit ist insbesondere dann bevorzugt, wenn die Messsonde in Schwingung versetzt wer¬ den soll . Zur Erfassung von Schwingungsänderungen der Messson¬ de, kann die Auswerteeinrichtung eingerichtet sein, solche Än- derungen in Form von Resonanzverschiebungen und/oder
Amplitudenänderungen und/oder Phasenänderungen zu detektieren. - o -
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Messeinrichtung eine Sondenpositioniereinheit, um die Messsonde in allen Translations- und/oder Rotationsachsen des Raums zu positio¬ nieren. Dabei ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die Messsonde durch Steuerung der Positioniereinheit gemäß vorgegebener Sondenpositionierungsparameter automatisch zu po¬ sitionieren und/oder zu bewegen vermag.
Bei Verwendung einer Sondenpositioniereinheit ist es vorgese- hen, Sondenpositionierungsparameter zu verwenden, die umfassen:
Bewegungen der Messsonde zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, wobei derartige Be¬ wegungen laterale Bewegungen und/oder Bewegungen im Bereich zwischen 0,1 Nanometern und einige Millimeter, vorzugsweise im Bereich zwischen 0,1 Nanometern und 500 Mikrometern, umfassen, Bewegungen der Messsonde in vertikaler Richtung, wobei es vorgesehen ist, dass derartige Bewegungen im Bereich zwischen 0,01 Nanometer und 50 Mikrometer liegen können,
Bewegungen der Messsonde in vertikaler Richtung in Abhän- gigkeit von einem vorgegebenen minimalen Abstand zwischen der Messsonde und der Probe, wobei es möglich ist, eine Abstands¬ regelung, beispielsweise einen PID und/oder eine Phase-Logic- Regelung, zur BewegungsSteuerung zu verwenden, eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt der Messsonde mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten der Messson¬ de mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine maximale und/oder eine minimale Messsondengeschwin¬ digkeit für Bewegungen der Messsonde relativ zu einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine vorgegebene, zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Proben konstant zu haltenden Kraft, die beispielsweise im Bereich zwischen 0,1 und 3000 pN liegen kann, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft der Messson- _ _
de auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft der Mess¬ sonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuord¬ nenden Probe wirkende Zugkräfte, eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungs- rate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzu¬ ordnenden Probe wirkende Druckkräfte, - eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft der Mess¬ sonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, und/oder eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungs- rate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzu- ordnenden Probe wirkende Scherkräfte.
Bei einer Ausführungsform ist eine erste Detektoreinheit vor¬ gesehen, die Positionen der Messsonde und/oder Bewegungen der Messsonde, bevorzugt auch deren Auslenkung, und/oder auf die Messsonde wirkende Kräfte regelmäßig, z.B. repetitiv mit einer Frequenz von einigen zehn oder einigen hundert kHz, zu erfas¬ sen vermag. Dabei ist die Steuereinrichtung vorzugsweise ein¬ gerichtet, die erste Detektoreinheit gemäß vorgegebener Detek- tionsparameter automatisch zu steuern.
Vorzugsweise umfasst die erste Detektoreinheit Positionssenso¬ ren zur Positions- und/oder Bewegungsdetektion der Messsonde. Beispielsweise können LVDT-Sensoren, Dehnungsmessstreifen, op¬ tische Sensoren, interferometrische Sensoren, kapazitive Sen- soren hierfür verwendet werden. Besonders bevorzugt ist ein optischer Strahlablenkungsdetektor zum Erfassen der Auslenkung der Messsonde vorgesehen.
Ferner ist es bevorzugt, dass auf der Grundlage von der ersten Detektoreinheit bereitgestellter Daten die Positionssteuerung und/oder die Bewegungssteuerung der Messsonde und/oder der Probe unter Verwendung eines oder mehrerer geschlossener Re- gelkreise erfolgt. Hierfür ist es vorgesehen, dass die erste Detektoreinheit wenigstens in dieser Hinsicht mit der Steuer¬ einrichtung verbunden ist.
Des Weiteren ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung die erste Detektoreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter zu steuern vermag, die umfassen, eine vorgegebene Detektionsrate hinsichtlich einzelner, mehrerer und/oder aller zu erfassender Größen, und/oder - eine Häufigkeit, mit der die erste Detektoreinheit Positi- ons-, Bewegungs- und/oder Kraftmessungen durchführen soll.
Vorzugsweise vermag die Auswerteeinrichtung von der ersten De¬ tektoreinheit erfasste Größen automatisch auszuwerten. Dies kann analytisch und/oder statistisch erfolgen.
Die Auswerteeinrichtung kann so eingerichtet sein, dass von der ersten Detektoxeinheit erfasste Größen klassifiziert wer¬ den. Dabei ist bevorzugt, dass klassifizierte Größen bzw. die- se angebende Daten der Auswerteeinrichtung, wie oben ausge¬ führt, in den Messprozess zurück geführt werden, beispielswei¬ se um spezielle Parametersätze der Messung zu identifizieren.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Messeinrichtung eine Probenträgerpositioniereinheit, um Positionierungen des Probenträgers zu ermöglichen. Dabei kann die Steuereinrichtung so ausgeführt sein, dass der Probenträger mittels Steuerung der Probenträgerpositioniereinheit gemäß vorgegebener Proben- trägerpositionierungsparameter automatisch positioniert und/oder bewegt werden kann.
Vorzugsweise werden als Probenträgerpositionierungsparameter solche verwendet, die umfassen:
Bewegung des Probenträgers zur gerasterten Abtastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe durch die Messsonde, wobei Bewegungen lateral erfolgen können und/oder im Bereich zwischen 0,1 und 500 Mikrometer liegen können, _ n _
eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde, eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde, - eine maximale und/oder eine minimale Probenträgergeschwin¬ digkeit für Bewegungen des Probenträgers relativ zu der Mess¬ sonde, ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen ei¬ ner auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde, - eine vorgegebene, zwischen einer auf dem Probenträger an¬ zuordnenden Probe und der Messsonde konstant zu haltende Kraft, die beispielsweise im Bereich zwischen 0,1 und 3000 pN liegen kann, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungs- rate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe ■ wirkende Druckkräfte durch die Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zug¬ kräfte durch die Messsonde, und/oder eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungs- rate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Scherkräfte durch die Messsonde.
Vorzugsweise umfasst die Probenträgerpositioniereinheit einen piezoelektrischen Aktuator und/oder einen Linearantrieb, der beispielsweise ein Voice-Coil-Antrieb (Schwingspulenantrieb) sein kann.
Die oben genannten Ausführungsformen- der Probenträgerpositio¬ niereinheit sorgen für eine sehr exakte Positionierung _
und/oder Bewegungen des Probenträgers. Die Probenträgerposi- tioniereinheit kann zusätzlich so ausgeführt sein, dass "gro¬ be" Positionierungen unά/oder -bewegungen des Probenträgers ermöglicht werden, beispielsweise im Bereich zwischen 100 nm und 30 cm. Der Vorteil einer solchen Probenträgerpositio- niereinheit mit Grobpositionierung besteht darin, dass Vorab¬ positionierungen und größere Bewegungen schnell durchgeführt werden können. Exakte Positionierungen und Bewegungen können sich dann anschließen.
Vorzugsweise sind der Probenträgerpositioniereinheit Positi- ons- und/oder Bewegungserfassungssensoren zugeordnet, die, beispielsweise unter Verwendung eines geschlossenen Regelkrei¬ ses, Informationen zur Steuerung der Probenträgerpositio- niereinheit bereitstellen. Dabei können die oben genannten Po¬ sitionssensoren und/oder weitere Sensoren verwendet werden.
Vorzugsweise urαfasst die Messeinrichtung eine Probenkammer, in der ein Fluid aufgenommen werden kann, mit dem eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe umgeben werden soll. Hierbei ist unter "umgeben" zu verstehen, dass wenigstens der Bereich der Probe, der untersucht werden soll, von Fluid umgeben ist, beispielsweise eine bestimmte Oberfläche der Probe. Dabei kann die Steuereinrichtung ausgeführt sein, für das jeweilig ver- wendete Fluid vorgegebene Fluidparameter zu überwachen und, falls erforderlich, einzustellen.
Als Fluidparameter sind beispielsweise solche vorgesehen, die umfassen: - eine vorgegebene Temperatur, einen vorgegebenen Temperaturverlauf, einen vorgegebenen pH-Wert, einen vorgegebenen pH-Wertverlauf einen vorgegebenen Elektrolytgehalt, - einen vorgegebenen Elektrolytgehaltverlauf, einen vorgegebenen Volumenstrom, eine vorgegebene Volumenstromänderung, einen vorgegebenen Fluidpegel, und/oder eine vorgegebene Menge an biologischen und/oder chemischen Markern.
Bei Verwendung einer vorgegebenen Menge an biologischen und/oder chemischen Markern als Fluidparameter können Mengen für Fluoreszenzmarker und/oder radioaktive Marker vorgegeben sein. Vorzugsweise werden Marker eingesetzt, die chemisch und/oder biologisch funktionalisiert sind, also hinsichtlich der jeweils zu untersuchenden Probe selektive Eigenschaften aufweisen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine Zufuhreinheit vor- gesehen, mit der der Probenkammer zuzuführendes Fluid (z.B. Pufferlösung(en) , Reagenz (ien) ) bereitgestellt werden kann. Hierbei kann die Steuereinrichtung derart ausgelegt sein, dass die Zufuhreinheit überwacht und gegebenenfalls so gesteuert wird, dass für das jeweilige Fluid vorgegebene Randbedingungen, vorzugsweise auch deren Zusammensetzung, in der Probenkammer eingehalten werden. Beispielsweise werden automatisch bestimm¬ te Reagenzien miteinander vermischt, um Fluidparameter wie ph- Wert, etc. einzustellen.
Vorzugsweise erlaubt die Zufuhreinheit eine Zufuhr von Fluid zu dem Probenträger in den Bereich, in dem bei Messungen Pro¬ ben anzuordnen sind. Ferner ist bevorzugt, dass die Zufuhrein¬ heit von der Steuereinrichtung automatisch gesteuert wird.
Die Zufuhreinheit kann eine Pumpe und/oder eine Multikanalpum- pe umfassen.
Zur Überwachung von Fluid in der Probenkammer und/oder für das jeweilige Fluid vorgegebenen Randbedingungen eine zweite De- tektoreinheit vorgesehen sein, die einen aktuellen Fluidpegel in der Probenkammer zu erfassen vermag. Dabei kann die Steuer¬ einrichtung so ausgeführt sein, dass in Antwort auf von der zweiten Detektoreinheit erfasste Pluidpegel die erste Zufuh¬ reinheit automatisch gesteuert wird.
Vorzugsweise ist eine Temperaturkammer vorgesehen, die wenig- stens die Messsonde und den Probenträger umgibt. Ferner ist vorgesehen, dass die Temperaturkammer auch weitere Bestandteile, der Messeinrichtung umgibt, wie zum Beispiel, sofern vorhanden, die Krafterzeugungseinheit, die Sondenpositioniereinheit, die Probenträgerpositioniereinheit, die Probenkammer, die erste Zufuhreinheit und/oder die im Folgenden genannte zweite Zufuh¬ reinheit. Hierbei ist es bevorzugt, dass die Steuerung der Temperaturkammer durch die Steuereinrichtung gemäß vorgegebe¬ ner Temperaturparameter erfolgt.
Vorzugsweise ist es dabei vorgesehen, dass die Steuereinrich¬ tung die Temperaturkammer so zu steuern vermag, dass eine vor¬ gegebene Temperatur beibehalten wird und/oder wenigstens ein vorgegebener Temperaturverlauf erreicht wird. Beispielsweise ist es möglich, dass die Steuerung der Temperaturkammer so er- folgt, dass sich konstante TemperaturZeiträume mit Zeiträumen abwechseln, in denen Temperaturänderungen erfolgen.
Insbesondere ist es bevorzugt, dass die rastermikroskopische Messeinrichtung eine kraftmikroskopische Messeinrichtung ist, vorzugsweise zum Erfassen von Kraftabstandskurven. Hieraus lassen sich Erkenntnisse über Wechselwirkungen und Bindungs- kräfte von einzelnen Molekülen gewinnen.
Des Weiteren ist bevorzugt, dass die Messeinrichtung außerdem eine optische Detektionseinheit, vorzugsweise eine auf Fluo¬ reszenz- und/oder Durchlichtmikroskopietechnik (z.B. DIC und/oder Phasenkontrast, Hellfeld und/oder Dunkelfeld) basie¬ rende Einheit umfasst.
Die obige Aufgabe wird auch durch das erfindungsgemäße Verfah¬ ren zur Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren sowie bevorzugte Aus- _ _
führungsformen derselben sind in den Verfahrensansprüchen de¬ finiert .
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
In der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, von denen zeigen :
Fig . 1 eine schematische Darstellung des Prinzip eines Raster- kraf tmikroskops (AFM) ,
Fig . 2 veranschaulicht schematisσh eine Aus führungs form 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Rastersondenmikroskopie , und
Fig . 3 zeigt eine Abbildung einer Messsondenanordnung zur Ver¬ wendung bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung .
Beschreibung bevorzugter Aus führungs formen
Wie in Fig. 2 gezeigt, umfasst die Ausführungsform 1 eine ra- stersondenmikroskopische Messeinrichtung 2, wie etwa eine ato¬ mare kraftmikrokopische Messeinrichtung (AFM) , die eine Mess- sonde 4 für rasterkraftmikroskopische bzw. kraftmikroskopische Messungen und einen Probenträger 6 umfasst, auf dem zur Durch¬ führung einer Messung eine biologische Probe 8 angeordnet ist .
Die Messsonde 4 ist als Cantilever aufgebaut, der als federe¬ lastische Einheit der Messsonde 4 dient und an seinem freien Ende baueinheitlich integriert oder damit verbunden eine Son¬ denspitze (nicht bezeichnet) aufweist. Die Darstellung von Fig. 2 zeigt lediglich eine Messsonde. Allerdings ist es vorgesehen, mehr als eine Messsonde 4 in der Messeinrichtung 2 zu verwen¬ den.
Insbesondere kann die Messeinrichtung 2 zwei, vier, sechs, acht und bis zu hundert und mehr Messsonden 4 aufweisen. Zum _ _
Aufbau mehrerer in der Messeinrichtung 2 zu verwendenden Mess¬ sonden können beispielsweise sogenannte Cantilever-Chips ver¬ wendet werden.
Fig. 3 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Can¬ tilever-Chips, der acht federelastische Einheiten 4χ, ... 4s in Form von Cantilever aufweist. Unter Verwendung nanotechno- logischer Ansätze sind derartige Chips mit hundert und mehr Cantilever möglich.
In Abhängigkeit von einer zu analysierenden Probe und in Ab¬ hängigkeit der jeweiligen Analyse kann es erforderlich sein, die Messsonde 4 in Schwingungen mit einer vorgegebenen Ampli¬ tude zu versetzen. Hierfür umfasst die Messeinrichtung eine mit der Messsonde 4 und insbesondere mit deren federelasti¬ schen Einheit zusammenwirkende Krafterzeugungseinheit (nicht gezeigt) auf. Die Krafterzeugungseinheit ermöglicht es bei¬ spielsweise, die Messsonde 4 derart zu bewegen, dass ein für eine Messung gewünschter Qualitätsfaktor (Q-Faktor) erreicht wird.
Ferner weist die Messeinrichtung eine Sondenpositioniereinheit (nicht gezeigt) auf, um die Messsonde 4 relativ zu der Probe 8 zu positionieren. Abhängig von der zu analysierenden Probe und der jeweiligen Analyse kann mittels der Sondenpositionierein¬ heit die Messsonde 4 entsprechend positioniert und bewegt wer¬ den.
Mittels einer ersten Detektoreinheit 12, die von der Messein- richtung 2 umfasst ist oder dieser zugeordnet ist, können Po¬ sitionen und Bewegungen der Messsonde 4, insbesondere relativ zu der Probe 8 erfasst werden. Die erste Detektoreinheit 12 ist als optischer Detektor aufgebaut und umfasste eine Strah¬ lungsquelle 14, beispielsweise eine Laserlicht abgebende Strahlungβquelle, und einen Empfänger 16, der Licht der Strah¬ lungsquelle 14 nach Wechselwirkung mit der Messsonde 4 emp¬ fängt. Die Strahlungsquelle 14 bestrahlt die Messsonde 4 bei- spielsweise im Bereich ihres freien Endes. Wechselwirkungen, insbesondere Reflexionen des Lichts von der Strahlungsquelle 14 werden von dem Empfänger 16 erfasst, um nach Auswertung auf Positionen und Bewegungen der Messsonde 4 zu schließen.
Die Messeinrichtung 2 weist ferner eine Probenträgerpositio- niereinheit 10 auf, die den Proben'träger baueinheitlich inte¬ griert bereitstellen oder ein Bestandteil desselben sein kann. Der Probenträger 6 und die Probenträgerpositioniereinheit 18 können auch als separate Komponenten ausgeführt sein.
Die hier vorgesehene Probenträgerpositioniereinheit 18 verwen¬ det einen piezoelektrischen Aktuator, der Bewegungen und Posi¬ tionierungen des Probenträgers 6 und damit der darauf angeord- neten Probe 8 im Raum ermöglicht.
Eine Probenkammer 20 umgibt die Messsonde 4 und die Probe 8 oder wenigstens? den zu untersuchenden Bereich der Probe 8, beispielsweise deren obere Oberfläche. Die Probenkammer 20 ist abgesehen von den im Folgenden beschriebenen Zu- und Ableitun¬ gen fluiddicht verschlossen und stellt somit einen gegenüber umgebenden Bereichen abgeschlossenen Raum bereit. Die Proben¬ kammer 20 kann insgesamt zur Aufnahme von Fluid dienen oder, wie in Fig. 2 dargestellt, hierfür eine Fluidkammer 22 aufwei- sen, die so ausgestaltet ist, dass die Messsonde 4 und die
Probe 8 oder deren zu analysierender Bereich von Fluid umgeben sind.
Mittels einer zweiten Detektoreinheit 24 kann ein Fluidpegel in der Probenkammer 20 erfasst werden. Die zweite Detektorein¬ heit 24 ist hier als optische Messeinheit ausgeführt, die eine Lichtquelle 26, beispielsweise in Form einer Laserlicht abge¬ benden Lichtquelle, und einen Empfänger 28 umfasst, der Licht von der Lichtquelle 26 nach Wechselwirkung mit Fluid in der Probenkammer 20 erhält. Aussagen über den Fluidpegel in der
Probenkammer 20 sind auf der Grundlage des Lichts möglich, das der Empfänger 28 erhält. Die Probenkamtner 20 ist mit einer Zufuhrleitung 30 verbunden, über die Fluid der Probenkamtner 20 zugeführt werden kann. Über eine Abfuhrleitung 32 kann Fluid von der Probenkammer 20 ent- fernt werden.
Die Zufuhrleitung 30 ist eingangsseitig mit einer Zufuhrein¬ heit 34 verbunden, über die einzelne, mehrere, gemischte und vermengte Fluide der Zufuhrleitung 30 und damit der Probenkam- mer 20 zugeführt werden können. Die Zufuhreinheit 34 umfasst hierfür eine oder mehrere Pumpen oder Multikanalpumpen und Einrichtungen (nicht gezeigt) , um Fluide zu vermischen und zu vermengen. Über Speiseleitung 36^ ... 36n erhält die Zufuh¬ reinheit 34 aus Fluidreservoirs (nicht dargestellt) unter- schiedliche Fluide. Bei der Ausführungsform 1 werden über die Zufuhreinheit 34 beliebige, bei einer Analyse der Probe 8 ge¬ wünschte und/oder erforderliche Fluide zugeführt, wie zum Bei¬ spiel Pufferlösungen und Reagenzstoffe.
Die Messeinrichtung 2 und die weiter oben beschriebenen Kompo¬ nenten der Ausführungsform 1 abgesehen von den mit den Speise¬ leitungen 36χ, ... 36n verbundenen Fluidquellen und Teilen der Speiseleitungen 36lf ..., 36n sind von einer Temperaturkammer 38 umgeben. Die Temperaturkammer 38 sorgt für einen wenigstens hinsichtlich der Temperatur dichten Abschluss gegenüber der Umgebung.
Die Ausführungsform 1 weist ferner eine Steuereinrichtung 40 und eine Auswerteeinrichtung 42 auf.
Die Steuereinrichtung 40 dient zur Steuerung der in der Tempe¬ raturkammer 38 angeordneten Komponenten sowie der Temperatur¬ kammer 38 selbst. In Fig. 2 sind stellvertretend für hierfür erforderliche Verbindungen Verbindungen 44 und 46 zwischen der Steuereinrichtung 40 und der Zufuhreinheit 34 bzw. der Proben- trägerpositioniereinheit 18 dargestellt. - -
Die Auswerteeinrichtung 42 erhält von allen von der Tempera- turkammer 38 umschlossenen Komponenten, soweit dafür ausgelegt , und von der Temperaturkammer 38 selbst Daten, Messsignale und dergleichen, um den j eweiligen aktuellen Betriebszustand bzw . aktuelle Messergebnisse ermitteln und auswerten zu können . '
Stellvertretend für hierfür erforderliche Verbindungen sind in Fig . 2 Verbindungen 48 . 50 und 52 zwischen der Auswerteein¬ richtung 42 und der Zufuhreinheit 34 , der Probenträgerpositio- niereinheit 18 und der zweiten Detektoreinheit 24 gezeigt .
Des Weiteren umfasst die Ausführungsform 1 eine Datenspei¬ chereinrichtung 54, die mit der Steuereinrichtung 40 und der Auswerteeinrichtung 42 verbunden ist. Die Datenspeicherein¬ richtung 54 dient zur Speicherung aktueller von der Auswerte- einrichtung 42 erhaltener Daten, Messsignale und dergleichen, aktueller von der Auswerteeinrichtung 42 bereitgestellter Da¬ ten, Parameter, die von der Steuereinrichtung 40 zur Steuerung der Ausführungsform 1 verwenden werden können sowie weitere, im Folgenden beschriebene Daten.
Insbesondere ist die Datenspeichereinrichtung 54 so eingerich¬ tet, dass sie als Datenbank verwendet wird, in der mit der Ausführungsform 1 erfasste, ausgewertete Daten und Daten Drit¬ ter gespeichert werden können.
Bei Durchführung einer rastersondenmikroskopischen Messung steuert die Steuereinrichtung 40 neben dem eigentlichen kraf tspektroskopischen Experiment auch alle experimentellen Bedingungen, wie Temperatur, den für die Probe 8 wirksamen pH- Wert , das oder die mit der Probe 8 zusammenwirkende Elektroly- te sowie die Zugabe pharmazeutischer, biochemischer und chemi¬ scher Reagenzien . Des Weiteren überprüft die Steuereinrichtung 40 zu vorbestimmten Zeitpunkten, in vorbestimmten Zeitinter¬ vallen oder laufend für die Messung wirksame Parameter und Randbedingungen und steuert die Messung derart , dass Vorgaben für die Messung eingehalten werden . Die Auswerteeinrichtung 42 analysiert die bei der Messung mit¬ tels der Messsonde 4 erfassten Kraftspektren hinsichtlich der Probe 8 und kann die Kraftspektren analysieren. In Abhängig¬ keit davon ist es möglich, beispielsweise beim Erreichen eines Sollwerts, die laufende Messung zu beenden und eine neue Mes¬ sung mit geänderten Vorgaben (z.B. Umgebungsbedingungen) ein¬ zuleiten. Die Steuereinrichtung 40 und die von der Auswerte¬ einrichtung 42 bereitgestellten Daten ermöglichen es auch, iterative Messzyklen durchzuführen, um Randbedingungen zu er- mittein, die bestimmte Wechselwirkungen begünstigen.
Während der Messung wird die Messsonde 4 über die Probe 8 ge¬ rastert, wobei anhand von Wechselwirkungen zwischen der Mess- sohne 4 und der Probe 8 (biologische) Moleküle auf der Ober- fläche der Probe 8 detektiert werden können. In Abhängigkeit der Ausgestaltung der Messsonde 4 und der Art der Probe 8 sind bestimmte Kontaktzeiten und/oder Kontakthäufigkeiten zwischen der Messsonde 4 und der Probe erforderlich. Diese Parameter werden von der Steuereinrichtung 40 eingestellt, überwacht und gegebenenfalls korrigiert. Hierbei kann es vorteilhaft sein, insbesondere um eine vollständig automatisierte Messung durch¬ zuführen, die Probe 8 optimiert zu präparieren. Nähere Ausfüh¬ rungen hierzu finden sich im Folgenden.
Während der Messung steuert die Steuereinrichtung 40 sämtliche relevanten experimentellen Bedingungen, wie zum Beispiel maxi¬ male und/oder minimale Druck- und/oder Zugkräfte zwischen der Messsonde 4 und der Probe 8, Geschwindigkeiten, mit der Bewe¬ gungen relativ zwischen der Messsonde 4 und der Probe 8 erfol- gen, die Anzahl von Messpunkten (Auflösung) -und maximale und/oder minimale Abstände zwischen der Messsonde 4 und der Probe 8.
Dabei ist es möglich, Messungen durchzuführen, bei denen ein- zelne, mehrere oder alle experimentellen Bedingungen konstant gehalten und/oder systematisch und/oder chaotisch verändert werden. So ist es beispielsweise möglich, eine Messung durch- zuführen, bei der abgesehen von der Zuggeschwindigkeit der Messsonde 4 alle experimentellen Bedingungen konstant gehalten werden.
Sobald beispielsweise eine vorgegebne Anzahl (z.B. tausend) an Messungen an einer einzelnen Probe aufgenommen sind, können die erhaltenen Daten einem Datensatz zugeordnet werden. Weite¬ re Datensätze können dann bei geänderten experimentellen Be¬ dingungen erstellt und miteinander verglichen werden. Dies er- möglicht es, unterschiedliche biologische und/oder medizinisch relevante experimentelle Bedingungen hinsichtlich ihres Ein¬ flusses auf molekulare Wechselwirkungen zu analysieren.
Eine Größe, die Analysen von biologischen Proben beeinflussen können, sind thermische Änderungen. Um insbesondere die ther¬ mische Drift bei Änderungen experimenteller Bedingungen, wie zum Beispiel Änderungen hinsichtlich mit der Probe 8 zusammen¬ wirkender Pufferlösungen, zu minimieren, ist die Temperatur¬ kammer 38 vorgesehen. Des Weiteren kann ein Heiz- bzw. Kühle- lement (z.B. Peltier-Element) verwendet werden, um die Tempe¬ ratur der Probe 8 selbst zu steuern. Ein solches Heiz- bzw. Kühlelement kann beispielsweise unter dem Probenträger 6 ange¬ ordnet sein.
Biomolekulare Wechselwirkungen hängen in der Regel stark von den vorherrschenden physiologischen Umgebungsbedingungen ab. Diese sollten daher während einer Messung kontrolliert und so gesteuert werden, dass gewünschte Umgebungsbedingungen einge¬ halten bzw. native Zustände der Probe 8 stimuliert werden. So ist es beispielsweise vorgesehen, während einer Messung den Pegel einer in der Probenkammer 20 vorhandenen Pufferlösung mittels des zweiten Detektorsystems 24 zu vorbestimmten Zeit¬ punkten, in vorgegeben Zeitintervallen oder laufend zu kon¬ trollieren und gegebenenfalls die Zufuhreinheit 34 so zu be- treiben, dass ein gewünschter Pegel aufrecht erhalten oder er¬ reicht wird. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, während einer Messung eine Verringerung des Pufferpegels auf- "*
grund von Verdunstung zu kompensieren; auch pH-Schwankungen sowie Änderungen hinsichtlich verwendeter Elektrolyte und an¬ derer mit der Probe 8 zusammenwirkender Stoffe können so kon¬ trolliert und gegebenenfalls gesteuert werden. Durch eine ge- eignete Steuerung von Pufferlösungen in der Probenkammer 20 kann auch ein Austrocknen und Entsalzen verhindert werden.
Bei der Steuerung von in der Probenkammer 20 vorliegenden Puf¬ ferlösungen kann es zu Fluidbewegungen, beispielsweise Wirbel, führen, die die Messung beeinflussen können. Beispielsweise können Fluidbewegungen in der Probenkammer 20 Schwingungen der Messsonde 4 bewirken. Um dies zu verhindern, ist es vorgesehen, dass die Steuereinrichtung 40 eine laufende Messung unter¬ bricht, wenn mit derartigen Störungen zur rechnen ist und/oder derartige Störungen von der Auswerteinrichtung 42 detektiert oder vorhergesagt werden.
Die Geschwindigkeit, mit der eine Messung durchgeführt werden kann, spielt eine wesentliche Rolle. Allerdings können schnel- lere Messungen deren Qualität beeinflussen. Um eine hohe Mess¬ qualität bei hoher Messgeschwindigkeit zu erreichen, erlaubt die Erfindung, die Messsonde 4 mit größeren Geschwindigkeiten zu bewegen und/oder zu positionieren. Dabei ist es vorgesehen, während einer Messung an unterschiedlichen und/oder gleichen Messpunkten unterschiedliche Geschwindigkeiten zur Bewegung und/oder Positionierung der Messsonde 4 zu verwenden. Dies er¬ möglicht es beispielsweise aus bei unterschiedlichen Geschwin¬ digkeiten erfassten Kraftspektren (z.B. Kraftabstandskurven) detailliertere Aussagen über molekulare Wechselwirkungen zu machen. Ferner können Messungen optimiert werden, indem die Auflösung, mit der Kraftspektren erfasst werden, erhöht wird. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die kleinste Kraft, die von der Messsonde 4 detektiert werden kann, minimiert wird. Die kleinste detektierbare Kraft hängt unter anderem von der federelastischen Eigenschaft der Messsonde 4 ab. Um möglichst kleine detektierbare Kräfte zu erreichen, ist es daher vorge¬ sehen, Messsonden zu verwenden, die möglichst weiche federela- _ -
stische Eigenschaften aufweisen und eine hohe Resonanzfrequenz aufweisen.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Ziehgeschwindig- keiten der Messsonde, zu erhöhen. Hohe Geschwindigkeiten kön¬ nen insbesondere hydrodynamische Strömungen und daraus resul¬ tierende unerwünschte Bewegungen der Messsonde 4 verursachen. Im Ergebnis können bei hohen Zielgeschwindigkeiten erhöhte Rauschanteile in den Messdaten auftreten, wodurch die Sensiti- vität hinsichtlich geringer Kräfte zwischen Messsonde 4 und Probe 8 verschlechtert wird. Dies kann durch die Verwendung von Messsonden vermieden werden, die eine möglichst kurze Län¬ ge insgesamt oder einen möglichst kurzen elastischen Bereich aufweisen. Derartige Messsonden zeigen ein gegenüber herkömm- liehen Messsonden deutlich verbessertes hydrodynamisches Ver¬ halten und erlauben deutlich erhöhte Ziehgeschwindigkeiten. Allerdings werden derartige Messsonden geringer ausgelenkt. Daher wird bei der Erfindung als Detektorsystem 12 ein möglich hochauflösendes optisches Detektorsystem mit spezieller Optik verwendet.
Um neben statischen auch dynamische rastersondenmikroskopische Messungen durchzuführen, wird die Messsonde 4 während einer Messung in Schwingungen mit geringer Amplitude (z.B. 0,1 - 10 nm) versetzt. Eine Schwierigkeit bei dynamischen rastersonden- mikroskopischen Messungen besteht darin, dass die von Puffer- fluid umgebenen Messsonden üblicherweise niedrige Qualitäts- faktoren (Q-Faktoren) haben. Üblicherweise werden molekulare Wechselwirkungen über Resonanzverschiebungen bzw. Resonanzma- xima der Messsonde erfasst. Resonanzeigenschaften der Messson¬ de sind proportional zum Q-Faktor, wobei ein geringer Q-Faktor zu einem breiten Resonanzmaximum führt. Daher ist die Sensiti- vität der Kraftdetektion bei geringem Q-Faktor gering. Des Weiteren beeinflussen dissipative Wechselwirkungen, beispiels- weise hervorgerufen durch hydrodynamische Strömungen von einem die Messsonde umgebenden Fluids, federelastische Eigenschaften der Messsonde (z.B. Dämpfungskonstante) . Bei der Ausführungs- form 1 ist es vorgesehen, den Q-Faktor dadurch zu erhöhen, dass mittels einer positiven Rückkopplungsschleife eine exter¬ ne Kraft an die Messsonde 4 angelegt wird . Dadurch kann der Q- Faktor um drei und mehr Größenordnungen verbessert werden, wo- bei die Kraftsensibilität im Bereich von wenigen pN liegt .
Für eine automatisierte Analyse von Messergebnissen ist es vorgesehen, während einer Messung einzelne Kraftkurven unter Verwendung der Auswerteeinrichtung 42 zu analysieren. Zur sta- tistischen Analyse kann dabei wie folgt vorgegangen werden :
Zunächst werden die Kraftkurven so verarbeitet , dass sie mit¬ einander verglichen werden können . Dies kann beispielsweise durch Festlegung einer gemeinsamen Nulllinie (Referenzwerte) und einer entsprechenden Verschiebung und/oder Streckung der einzelnen Kraftkurven erfolgen .
Danach kann die gesamte Messung statistisch analysiert werden, um beispielsweise bei gefalteten Proteinen Einblick in die Wahrscheinlichkeitsverteilung einzelner Entfaltungsvorgänge und für Entfaltungen erforderliche Kräfte zu erhalten.
Ferner können die Kraftkurven klassifiziert , einander zu über¬ lagert und gemittelt werden. Zur Klassif izierung von Kraftkur- ven kann beispielsweise die Länge der j eweiligen Kraftkurve und die Anzahl und Position dort vorhandener Kraftmaxima her¬ angezogen werden . Die Länge einer Kraftkurve gibt an, über welchen Bereich Wechselwirkungen auftreten . Die Anzahl und Po¬ sition von Kraftmaxima erlaubt Aussagen über kollektive und/oder singuläre Wechselwirkungsvorgänge . Über eine Klassi¬ f izierung von Kraftkurven können Informationen, insbesondere graf isch visualisierbare Informationen, über unterschiedliche Wechselwirkungsprozesse erhalten werden .
Durch Mittelung von einer Klasse zugeordneten Kraftspektren wird das Rauschen der einzelnen Kraftkurven reduziert . Dadurch werden die eigentlichen Wechselwirkungsvorgänge , die durch die Kraftkurven jeweils für sich betrachtet beschrieben werden, ersichtlich. Ferner können Aussagen über mögliche Variationen der Wechselwirkungsvorgänge auf der Grundlage von Standardab¬ weichungen gemittelter Kraftspektren gemacht werden.
Eine Klassifikation von Kraftkurven, die Mittelung von Kraft- kurven einer gemeinsamen Klasse und damit von einander ver¬ wandten oder untereinander vergleichbaren Wechselwirkungsvor¬ gängen sowie eine nachfolgende statistische Analyse erlauben Vergleiche von Wechselwirkungsvorgängen verschiedener Proben bei gleichen experimentellen Bedingungen und gleichen oder vergleichbaren Proben bei gleichen experimentellen Bedingungen. So können mit der Ausführungsform 1 beispielsweise drei Mutan¬ ten desselben Rezeptors, die sich in einer Punktmutation un- terscheiden, anhand ihrer Wechselwirkungsspektren identifi¬ ziert und mit einander verglichen werden. Auch können Aussagen über den Einfluss von Mutationen auf lokale Wechselwirkungen eines Proteins sowie des Proteins mit anderen Molekülen ge¬ macht werden.
Mittels der Datenspeichereinrichtung 54 ist es möglich, eine Datenbank für Kraftspektren zu erstellen, um beispielsweise typische Wechselwirkungsvorgänge unterschiedlicher Proben und unterschiedlicher experimenteller Bedingungen zu Charakteri- sieren. Für Zugriffe auf eine Datenbank der Datenspeicherein¬ richtung 54 ist es vorgesehen, unterschiedliche Suchstrategien zu verwenden. Beispielsweise können Strukturdaten eines ent¬ falteten Proteins verwendet werden, um strukturell verwandte Proteine zu lokalisieren und deren Entfaltungswege zu verglei- chen. Um unterschiedliche Entfaltungsspektren zu vergleichen, ist es möglich, mittels der Auswerteeinrichtung 42 auch Daten der Datenspeichereinrichtung auszuwerten, um beispielsweise verschiedene Kraftspektren zu überlagern und zu vergleichen. Dies erlaubt es, Aussagen über Abhängigkeiten von Wechselwir- kungsvorgängen von experimentellen Bedingungen zu machen. Auch können Wechselwirkungsvorgänge unterschiedlicher Proben dahin¬ gehend beurteilt werden, ob deren Wechselwirkungsvorgänge auf vergleichbare, ähnliche oder gleiche Eigenschaften der Proben hindeuten.
Des Weiteren ist es vorgesehen, Datenbankzugriffe in Abhängig¬ keit von Kräften, physiologischen Abhängigkeiten, Wechselwir¬ kungsspektren und experimentellen Bedingungen zu ermöglichen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Vorrichtung zur Rastersondenmikroskopie, mit: einer rastermikroskopischen Messeinrichtung, die eine Messsonde für rastermikroskopische Messungen und einen Proben¬ träger zur Anordnung einer rastermikroskopisch zu vermessenden Probe umfasst, einer Steuereinrichtung, die systemintegriert mit der ra¬ stermikroskopischen Messeinrichtung verbunden ist, wobei die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die Messeinrichtung zur Durchführung einer rastermikroskopischen Messung gemäß vorge¬ gebener Steuerungsparameter automatisch zu steuern, und/oder einer Auswerteeinrichtung, die systemintegriert mit der rastermikroskopischen Messeinrichtung verbunden ist, wobei die Auswerteinrichtung eingerichtet ist, Messungen mittels der ra¬ stermikroskopischen Messeinrichtung gemäß vorgegebener Auswer¬ tungsparameter automatisch auszuwerten.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der - die Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung eingerichtet ist, um Messungen der Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung angeben¬ de Daten zu erhalten und diese zur Bestimmung von Steuerungs- und/oder Auswertungsparametern in eine laufende Messung zu¬ rückzuführen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, mit einer Datenspeichereinrichtung zur Speicherung der von der Auswerteeinrichtung durch Auswertung von Messungen mittels der rastermikroskopischen Messeinrichtung erzeugten Daten.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der die Dateneinspeichereinrichtung zur Speicherung der vorge¬ gebenen Steuerungsparameter und/oder von bei der Messung vor¬ liegenden Messbedingungen in Zuordnung zu den entsprechenden von der Auswerteeinrichtung erzeugten Daten ausgelegt ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der die Messsonde eine federelastische Einheit umfasst, und die Auswerteeinrichtung eingerichtet ist, auf die Messson¬ de wirkende Kräfte auszuwerten.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der die Messeinrichtung eingerichtet ist, Wechselwirkungen zwischen der Messsonde und der Probe mittels eines optischen Messsystems und/oder über piezoelektrische Effekte und/oder magnetische Wechselwirkungen zu erfassen.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5, mit einer Einheit zur Erzeugung eines auf die Messsonde wir¬ kenden Lichtfeldes und/oder elektrischen Feld und/oder magne¬ tischen Feldes.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der die Felderzeugungs- einheit statische und/oder dynamische Felder zu erzeugen ver¬ mag.
9. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 8, bei der die federelastische Einheit eine Feder und/oder einen Aus¬ leger umfasst.
10. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 9, bei der die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die federelasti¬ sche Einheit so zu steuern, dass die Messsonde mit einer vor¬ gegebenen Amplitude in Schwingung versetzt wird.
11 . Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 10 , mit einer mit der federelastischen Einheit zusammenwirkenden Krafterzeugungseinheit , wobei - die Steuereinrichtung eingerichtet ist , die Krafterzeu¬ gungseinheit automatisch so zu steuern, dass eine zur Änderung eines für die Messsonde wirksamen Q-Faktors geeignete Kraft an das federelastische Element angelegt wird.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, bei der die Auswerteeinrichtung eingerichtet ist, Schwingungsände- rungen in Form von Resonanzverschiebungen und/oder Amplitu¬ denänderungen der Messsonde zu erfassen.
13. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der die Messeinrichtung eine Sondenpositioniereinheit zur Po- sitionierung der Messsonde in allen Translations- und Rotati¬ onsachsen des Raumes umfasst, und die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die Messsonde durch Steuerung der Positioniereinheit gemäß vorgegebener Son¬ denpositionierungsparameter automatisch/ zu positionieren und/oder zu bewegen.
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14. Vorrichtung nach Anspruch 13, bei der die Steuereinrich¬ tung eingerichtet ist, die Sondenpositioniereinheit gemäß vor¬ gegebener Sondenpositionierungsparameter der Steuerungsparame- tergruppe zu steuern, die umfasst:
Bewegungen der Messsonde zur gerasterten Abstastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe,
Bewegungen der Messsonde in vertikaler Richtung, Bewegen der Messsonde in vertikaler Richtung in Abhängig- keit von einem vorgegebenen minimalen Abstand zwischen Mess¬ sonde und Probe, eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt der Messsonde mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten der Messson- de mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine maximale und/oder eine minimale Messsondengeschwin¬ digkeit für Bewegungen der Messsonde relativ zu einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine konstante Messsondengeschwindigkeit, - eine konstante Messsondengeschwindigkeitsänderung, ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, - -
eine vorgegebene, zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe konstant zu haltende Kraft, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft der Messson¬ de auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, - eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft der Mess- sonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuord¬ nenden Probe wirkende Zugkräfte, - eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungs- rate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzu¬ ordnenden Probe wirkende Druckkräfte, eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft der Mess- sonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, und/oder eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungs- rate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzu¬ ordnenden Probe wirkende Scherkräfte
15. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, mit einer ersten Detektoreinheit zur Detektion von Positionen der Messsonde und/oder Bewegungen der Messsonde und/oder auf die Messsonde wirkenden Kräften, wobei die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die erste Detek- toreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter automatisch zu steuern.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der die erste Detektoreinheit Positionssensoren zur Erzeugung von Positionen und/oder Bewegungen der Messsonde umfasst.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, bei der die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die erste Detek¬ toreinheit gemäß vorgegebener Detektionsparameter der Steue- rungsparametergruppe zu steuern, die umfasst: eine vorgegebene Detektionsrate, und/oder eine Häufigkeit, mit der Detektionen für Positionen der Messsonde und/oder Bewegungen der Messsonde und/oder auf die Messsonde wirkende Kräfte durchzuführen sind,
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, bei der - die Auswerteeinrichtung eingerichtet ist, von der ersten Detektoreinheit erfasste Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte automatisch auszuwerten.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, bei der - die Auswerteeinrichtung eingerichtet ist, von der ersten
Detektoreinheit erfasste Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte zu klassifizieren.
20. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der - die Messeinrichtung eine Probenträgerpositioniereinheit zur Positionierung des Probenträgers umfasst, und die Steuereinrichtung eingerichtet ist, den Probenträger mittels Steuerung der Probenträgerpositioniereinheit gemäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter automatisch zur positionieren und/oder zu bewegen.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, bei der die Steuereinrich¬ tung eingerichtet ist, die Probenträgerpositioniereinheit ge¬ mäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter der Steuerungsparametergruppe zu steuern, die umfasst:
Bewegungen des Probenträgers zur gerasterten Abstastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe durch die Mess¬ sonde, eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde, eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Probenträgergeschwin¬ digkeit für Bewegungen des Probenträgers relativ zu der Mess- sonde, ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen ei¬ ner auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde, eine vorgegebene, zwischen einer auf dem Probenträger an¬ zuordnenden Probe und der Messsonde konstant zu haltende Kraft, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde, - eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde, - eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungs- rate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte durch die Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Scherkraft für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zug- kräfte durch die Messsonde, und/oder eine maximale und/oder eine minimale Scherkraftänderungs- rate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Scherkräfte durch die Messsonde.
22, Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, bei der die Probenträgerpositioniereinheit einen piezoelektrischen Aktuator und/oder einen Linearantrieb umfasst.
23. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der - die Messeinrichtung eine Probenkammer zur Aufnahme eines zum Umgeben einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe vorgesehenen Fluids umfasst, und die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die für das Fluid vorgegebene Fluidparameter zu steuern.
24. Vorrichtung nach Anspruch 24, bei der die Steuereinrich¬ tung eingerichtet ist, für das Fluid vorgegebene Fluidparame¬ ter der Steuerungsparametergruppe zu steuern, die umfasst : eine vorgegebene Temperatur, - einen vorgegebenen Temperaturverlauf, einen vorgegebenen pH-Wert, einen vorgegebenen pH-Wertverlauf einen vorgegebenen Elektrolytgehalt, einen vorgegebenen Elektrolytgehaltverlauf, einen vorgegebenen Volumenstrom, eine vorgegebene Volumenstromänderung, - einen vorgegebenen Fluidpegel, und/oder eine vorgegebene Menge an biologischen und/oder chemischen Markern.
25. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, mit - einer Zufuhreineinheit für der Probenkammer zuzuführendes Fluid, wobei die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die Zufuhreinein¬ heit so zu steuern, dass für Fluid in der Probenkammer vorge¬ gebene Randbedingungen eingehalten werden.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, bei der die zweite Zufuhreinheit eine Pumpe und/oder eine MuIti- kanalpumpe umfasst.
27. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, mit einer zweiten Detektoreinheit zur Detektion eines Fluidpe¬ gels in der Probenkammer umfasst, wobei die Steuereinrichtung eingerichtet ist, in Antwort auf ei¬ nen von der zweiten Detektoreinheit detektierten Fluidpegel die erste Zufuhreineinheit automatisch zu steuern.
28. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, mit einer die Messsonde und den Probenträger umgebendenden
Temperaturkammer umfasst, und - die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die Temperaturkam¬ mer gemäß vorgegebener Temperaturparameter zu steuern.
29. Vorrichtung nach Anspruch 28, bei der die Steuereinrichtung eingerichtet ist, die Temperaturkam- mer so zu steuern, dass eine vorgegebene Temperatur beibehal¬ ten wird oder wenigstens ein vorgegebener Temperaturverlauf erreicht wird.
30. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der die rastermikroskopische Messeinrichtung eine rasterkraft- mikroskopische Messeinrichtung ist.
31. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei der die Messeinrichtung eine optische Detektionseinheit um- fasst .
32. Verfahren zur Durchführung einer rastersondenmikroskopi- schen Messung, mit folgenden Schritten:
Vorgeben von Steuerungsparametern und/oder Auswertungspa¬ rametern für die rastersondenmikroskopische Messung, und
Anordnen einer rastermikroskopisch zu vermessenden Probe auf einem von einer Messeinrichtung umfassten Probenträger und Durchführen der rastersondenmikroskopischen Messung unter Ver¬ wendung einer von der Messeinrichtung umfassten Messsonde, wobei die Messeinrichtung zur Durchführung der rastermi¬ kroskopischen Messung gemäß den vorgegebenen Steuerungsparame- tern von einer Steuereinrichtung automatisch gesteuert wird, und/oder die rastermikroskopische Messung gemäß den vorgegebe¬ nen Auswertungsparametern von einer Auswerteeinrichtung auto¬ matisch ausgewertet wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem
- Messungen der Mess- und/oder Auswerteeinrichtung angebende Daten in das Messverfahren zurückgeführt werden, um Steue- rungs- und/oder Auswertungsparameter für das Verfahren zu er¬ mitteln.
34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, bei dem durch Auswertung von der Auswerteeinrichtung erzeugte Da¬ ten automatisch in einer Datenspeichereinrichtung gespeichert werden.
35. Verfahren nach Anspruch 35, bei dem die vorgegebenen Steuerungsparameter und/oder von bei der rastermikroskopischen Messung vorliegende Messbedingungen in Zuordnung zu den entsprechenden von der Auswerteeinrichtung erzeugten Daten automatisch in der Datenspeichereinrichtung gespeichert werden.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 35, bei dem auf die Messsonde wirkende Kräfte von der Auswerteeinrich¬ tung ausgewertet werden.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 36, bei dem die Messsonde unter Steuerung der Steuereinrichtung mit einer vorgegebenen Amplitude in Schwingung versetzt wird.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 37, bei dem - eine zur Änderung eines für die Messsonde wirksamen Q-
Faktors geeignete Kraft unter Steuerung der Steuereinrichtung der Messsonde zugeführt wird.
39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, bei dem - für die Messsonde wirksame Schwingungsänderungen mittels der Auswerteeinrichtung erfasst werden.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 39, bei dem die Messsonde gemäß vorgegebener Sondenpositionierungspa- rameter von der Steuereinrichtung automatisch positioniert und/oder bewegt wird.
41. Verfahren nach Anspruch 40, bei dem die Positionierung und/oder Bewegung der Messsonde gemäß- vorgegebener Sondenposi- tionierungsparameter der Steuerungsparametergruppe durchge¬ führt wird, die umfasst:
Bewegungen der Messsonde zur gerasterten Abstastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe,
Bewegungen der Messsonden in vertikaler Richtung, - eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt der Messsonde mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten der Messson- _ _
de mit einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine maximale und/oder eine minimale Messsondengeschwin- digkeit für Bewegungen der Messsonde relativ zu einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, - eine konstante Messsondengeschwindigkeit, eine konstante Messsondengeschwindigkeitsänderung, ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe, eine vorgegebene, zwischen der Messsonde und einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe konstant zu haltende Kraft, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft der Messson¬ de auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft der Mess- sonde auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe, - eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzuord¬ nenden Probe wirkende Zugkräfte, und/oder eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungs¬ rate für von der Messsonde auf eine auf dem Probenträger anzu- ordnenden Probe wirkende Druckkräfte.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 41, bei dem Positionen der Messsonde und/oder Bewegungen der Messsonde und/oder auf die Messsonde wirkenden Kräfte mittels einer er- sten Detektoreinheit detektiert werden, und die erste Detektoreinheit gemäß vorgegebener Detektionspa- rameter von der Steuereinrichtung automatisch gesteuert wird.
43. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem das Detektieren von Positionen der Messsonde und/oder Bewegungen der Messsonde und/oder auf die Messsonde wirkenden Kräften gemäß vorgegebe¬ ner Detektionsparameter der Steuerungsparametergruppe durchge¬ führt wird, die umfasst: eine vorgegebene Detektionsrate, und/oder - eine Häufigkeit, mit der Detektionen für Positionen der Messsonde und/oder Bewegungen der Messsonde und/oder auf die Messsonde wirkende Kräfte durchzuführen sind. _ _
44. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, bei dem detektierte Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte automatisch von der Auswerteeinrichtung ausgewertet werden.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 44, bei dem detektierte Positionen und/oder Bewegungen und/oder Kräfte automatisch von der Auswerteeinrichtung klassifiziert werden.
46. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 45, bei dem der Probenträger mittels Steuerung einer Probenträgerposi- tioniereinheit durch die Steuereinrichtung gemäß vorgegebener Probenträgerpositionierungsparameter automatisch positioniert und/oder bewegt wird.
47. Verfahren nach Anspruch 46, bei dem die Steuerung der Pro- benträgerpositioniereinheit gemäß vorgegebener Probenträgerpo- sitionierungsparameter der Steuerungsparametergruppe durchge¬ führt wird, die umfasst : - Bewegungen des Probenträgers zur gerasterten Abstastung einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe durch die Mess- sonde, eine maximale Zeitdauer für einen Kontakt einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde, - eine maximale Kontakthäufigkeit von Kontakten einer auf dem Probenträger anzuordnenden Probe mit der Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Probenträgergeschwin¬ digkeit für Bewegungen des Probenträgers relativ zu der Mess¬ sonde, - ein maximaler und/oder ein minimaler Abstand zwischen ei¬ ner auf dem Probenträger anzuordnenden Probe und der Messsonde, eine vorgegebene, zwischen einer auf dem Probenträger an¬ zuordnenden Probe und der Messsonde konstant zu haltende Kraft, eine maximale und/oder eine minimale Zugkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde, eine maximale und/oder eine minimale Druckkraft auf eine auf dem Probenträger anzuordnende Probe durch die Messsonde, - -
eine maximale und/oder eine minimale Zugkraftänderungsrate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Zugkräfte durch die Messsonde, und/oder eine maximale und/oder eine minimale Druckkraftänderungs- rate für auf eine auf dem Probenträger anzuordnenden Probe wirkende Druckkräfte durch die Messsonde.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 47, bei dem für ein in einer von der Messeinrichtung umfassten Proben- kammer vorhandenes Fluid, das die Probe umgibt, unter Steue¬ rung der Steuereinrichtung vorgegebene Fluidparameter automa¬ tisch gesteuert werden.
49. Verfahren nach Anspruch 48, bei dem die Steuerung der Fluidparameter gemäß der Steuerungsparametergruppe durchge¬ führt wird, die umfasst : eine vorgegebene Temperatur, einen vorgegebenen Temperaturverlauf, einen vorgegebenen pH-Wert, - einen vorgegebenen Elektrolytgehalt, einen vorgegebenen Elektrolytgehaltverlauf, einen vorgegebenen Volumenstrom, eine vorgegebene Volumenstromänderung, einen vorgegebenen Fluidpegel, und/oder - eine vorgegebene Menge an biologischen und/oder chemischen Markern.
50. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, bei dem mittels einer ersten Zufuhreineinheit der Probenkammer Fluid unter Steuerung der Steuereinrichtung automatisch so zu¬ geführt wird, dass für Fluid in der Probenkammer vorgegebene Randbedingungen eingehalten werden.
51. Verfahren nach Anspruch 50, bei dem - mittels einer zweiten Detektoreinheit ein Fluidpegel in der Probenkammer detektiert wird, und in Antwort auf einen von der zweiten Detektoreinheit de- tektierten Fluidpegel die erste Zufuhreineinheit von der Steu¬ ereinrichtung automatisch gesteuert wird.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 52, bei dem - eine die Messsonde und den Probenträger umgebendende Tem¬ peraturkammer von der Steuereinrichtung gemäß vorgegebener Temperaturparameter gesteuert wird.
53. Verfahren nach Anspruch 52, bei dem - die Temperaturkammer so gesteuert wird, dass eine vorgege¬ bene Temperatur beibehalten wird oder wenigstens ein vorgege¬ bener Temperaturverlauf erreicht wird.
54. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 53, bei dem - als rastermikroskopische Messung eine rasterkraftmikrosko- pische Messung durchgeführt wird.
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