DE10393612B4

DE10393612B4 - Rasterkraftmikroskop und Betriebsverfahren zur Topographie- und Erkennungsbildgebung

Info

Publication number: DE10393612B4
Application number: DE10393612.2T
Authority: DE
Inventors: Peter Hinterdorfer; Jeremy Nelson; Stuart M. Lindsay
Original assignee: Keysight Technologies Inc
Current assignee: Keysight Technologies Inc
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2016-08-18
Anticipated expiration: 2023-11-01
Also published as: US7152462B2; GB2414547B; GB2414547A; AU2003286828A1; US20060016251A1; US20040129064A1; DE10393612T5; US6952952B2; WO2004042741A3; GB0509288D0; WO2004042741A2

Abstract

Raster-Kraftmikroskop zum Feststellen von Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einem nachzuweisenden Medium (32) auf einer gescannten Fläche (34) einer Probe, welches aufweist: eine Tastsonde mit einer Spitze (30), welche gegenüber einer Eigenschaft der Fläche (34) empfindlich ist, wobei die Sonde geeignet ist, um mit einem mechanischen Q-Faktor von 20 oder weniger zu oszillieren; eine Einrichtung (40, 42) zum Erfassen der Auslenkung der Sondenspitze (30) als eine Funktion der Zeit, wobei die Amplitude der nach oben gerichteten Auslenkung und die Amplitude der nach unten gerichteten Auslenkung der Sondenspitze (30) gemessen und erfasst werden; eine Einrichtung (50) zum Aufnehmen sowohl topographischer Bilder als auch der räumlichen Anordnung von Wechselwirkungen zwischen der Sonde und einem oder mehreren nachzuweisenden Medien (32) auf der Fläche (34) der Probe; eine Rückführ-Steuerung (60) zum Steuern der Höhe der Sonde zum Bestimmen der Topographie der Probe unter Verwendung des Wertes der nach unten gerichteten Auslenkung; und eine Einrichtung (50) zum Bestimmen des Wertes der nach oben gerichteten Auslenkung aus der nach oben gerichteten Amplitude und dem Mittelwert der Auslenkung zur Erzeugung eines den Interaktionen bzw. Wechselwirkungen zwischen der Sondenspitze (30) und dem nachzuweisenden Medium (32) auf der gescannten Oberfläche (34) entsprechenden Signals.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Rasterkraftmikroskop und Verfahren zum Betreiben dieses Mikroskops zur sowohl topographischen Bildgebung als auch Erkennungsbildgebung, und insbesondere ein Rasterkraftmikroskop zum Erkennen bzw. Erfassen von Wechselwirkungen bzw. von Interaktionen zwischen einer Sonde und einem erkannten bzw. erfaßten Agens auf der Fläche eines Substrats, um zeitgleich bzw. gleichzeitig topographische Bilder und Erkennungsbilder zu erzeugen.
Es ist seit langem bekannt, daß Rasterkraftmikroskope für spezifische chemische Wechselwirkungen bzw. Interaktionen zwischen einer Sondenspitze und einer Fläche bzw. Oberfläche sensibilisiert werden können. Lee et al. haben beispielsweise in „Sensing discrete streptavidin-biotin interactions with atomic force microscopy” Langmuir 10: 354–357 (1994) eine spezifische Bindung zwischen Biotin und Streptavidin unter Verwendung von modifizierten Cantileversonden demonstriert. Ein weiteres Beispiel einer spezifischen Wechselwirkung zwischen chemisch reaktiven Gruppen geben Kienberger et al. in „Static and dynamical properties of single poly (ethylene glycol) molecules investigated by force microscopy” Single Molecules 1: 123–128 (2000).
Von Hinterdorfer et al. wurde ein Verfahren zum Befestigen von Antikörpern an einer Tastsonde bzw. Scan-Sonde beschrieben, „Detection and localization of individual antibody-antigen recognition events by atomic force microscopy” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 3477–3481 (1996); „Force spectroscopy of anti-body-antigen recognition measured by scanning force microscopy. ”Biophys. J. 74: 186 (1998); und „A mechanistic study of the dissociation of indivdual antibody-antigen pairs by atomic force microscopy.” Nanobiology 4: 39–50 (1998). Dieses Verfahren wurde zur Charakterisierung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Antikörper-Antigen-Paaren verwendet. Das Verfahren wurde auch zum Charakterisieren von Wechselwirkungen zwischen Bindeproteinen (Baumgartner, Hinterdorfer et al., „Cadherin interaction probed by atomic force microscopy.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) und zwischen Liganden und Transportmolekülen, welche in native Proteinmembrane eingebettet sind, verwendet.
Fachleute erkennen, daß die Technik sehr allgemein und auf jedes Paar bzw. jeden Satz von Materialien anwendbar ist, welche aneinander binden – Rezeptoren mit ihren entsprechenden Proteinen, Wirkstoffe mit ihren Liganden, und Antikörper mit Antigenen. Die mit der Sonde verbundene Chemikalie kann als Nachweismedium bzw. Sensor bezeichnet werden, wohin gegen die auf einer Probenfläche erkannte Chemikalie als erkanntes Agens bzw. nachgewiesenes Medium bezeichnet werden kann.
Bei den oben beschriebenen Verfahren des Standes der Technik werden Wechselwirkungskräfte von einzelnen Molekülen mit chemikalisch modifizierten Cantilever-Sondenspitzen in Molecular Recognition Force Spectroscopy(MRFS)-Experimenten unter Verwendung sogenannter Kraft-Abstands-Zyklen gemessen: Hochselektive Liganden (vorzugsweise einer pro Spitze) werden kovalent am Spitzenende, wie in 1A gezeigt, befestigt. Mit Bezug auf 1A ist eine Cantilever-Sondenspitze 1 mit einem spezifischen Reagenz (wie etwa Ethanolamin oder Aminopropyltriethhxysilan) bestückt, um reaktive Gruppen (wie etwa Amine) auf der Fläche bzw. Oberfläche der Sonde 2 anzuordnen. Eine Amin-Reaktivgruppe 3, welche mit einem Ende eines flexiblen 8-nm langen Quervernetzer 4 verbunden ist, bindet den Quervernetzer (welcher Polyethylenglykol (PEG) sein kann) an der Sonde. Eine zweite Reaktivgruppe (für Schwefel in diesem Fall Pyridindithioproprionat (PDP) 5 reagiert mit der thiolierten Fläche des Sensors bzw. Nachweismediums wie dies beispielsweise mit dem thiolierenden Medium N-Succinimidyl 3-(Acethyltio) Proprionat (SATP) 6 durchgeführt wird.
Das Nachweismedium, in diesem Falle ein Antikörper 7, wird auf diese Weise am Ende des Quervernetzers 4 getragen. Diese Anordnung hat den Vorteil, daß sich das gebundene Nachweismedium (der Antikörper 7) in dem Maß frei bewegen kann, in welchem der Quervernetzer 4 flexibel ist, wodurch es dem Nachweismedium ermöglicht wird, sich auf der untersuchten Fläche mit seinem erkannten nachzuweisenden Medium (in diesem Fall das spezifische Antigen für den Antikörper) auszurichten. Die Bindung des Nachweismediums 7 auf der Spitze 1 mit einem spezifischen nachgewiesenen Medium auf der Fläche kann in der Kraft-Abstand-Kurve beobachtet werden, welche man erhält, wenn die Spitze in Richtung zur Fläche bewegt und zurückgezogen wird, wie in 1B gezeigt ist.
Die Spitze 1 wird in Richtung auf die Fläche einer Probe bewegt, was zur Bildung einer einzelnen Rezeptor-Ligand-Bindung zwischen dem gebundenen Antikörper und dem spezifischen Antigen auf der Probenfläche führt. Die Kraftkurve zeigt bei der Annäherung kein Anzeichen der Bildung dieser Verbindung bzw. Bindung („zur Probe hin” 8). Beim Zurückziehen der Spitze wird jedoch eine charakteristische Kurve beobachtet („von der Probe weg” 9), was eine zunehmende Anziehungskraft zeigt, wenn der Quervernetzer 4 gestreckt wird, bis die Bindung aufgebrochen wird, wenn die Distanz, um welche zurückgezogen wird, gleich der nahezu völlig ausgestreckten Länge des Quervernetzers bei 10 ist. Die charakteristische Form beim Zurückziehen bzw. beim Wegziehen von der Probe spiegelt die viskoelastischen Eigenschaften des Quervernetzers 4 wider, durch welche der Antikörper 7 an der Spitze gebunden wird.
Im bislang beschriebenen Stand der Technik muß die Fläche mittels Durchführen von Kraft-Abstand-Kurven an jedem möglicherweise interessanten Punkt untersucht werden. Im US-Patent US 5 519 212 A , Elings et al., geben die Patentinhaber an, daß die Wechselwirkung zwischen einem Antikörper und einem Antigen durch Veränderungen in der Oszillation einer vibrierten bzw. in Schwingung versetzten Spitze erfaßt werden kann, obwohl dort nicht beschrieben ist, wie dies umgesetzt bzw. ausgeführt werden kann. Raab et al. haben die erste praktische Demonstration einer Antikörper-Antigen-Erkennung in einem gescannten Bild geschaffen (A. Raab et al., „Antibody recognition imaging by force microscopy”, Nature Biotech. 901–905 (1999)). In dieser Arbeit wurde ein dynamisches Kraftmikroskop im MACMODE (eine Marke der Molekular Imaging Corp.) betrieben, einem Modus, in welchem die Bewegung der Spitze mittels eines angelegten Magnetfeldes gesteuert wird. Dieser Betriebsmodus ist in Lindsay, US 5 515 719 A und US 5 513 518 A und in Han, Lindsay et al., „A magnetically-driven oscillating probe microscope for Operation in liquids”, Appl. Phys. Letts. 69: 4111–4114 (1996), detaillierter beschrieben.
Raab, Han et al. beschreiben, daß die Spitze mit einer Amplitude zum Oszillieren gebracht wurde, welche gleich der Länge des Quervernetzers (4 in 1A) war, welche zum Binden eines Antikörpers an das Ende der Spitze verwendet wurde. Der Antikörper war Antilysozym, und das Antigen auf dem Substrat war Lysozym. Mit Bezug auf 2A gilt, daß man, wenn eine nackte bzw. blanke Spitze 21 zum Darstellen des Lysozyms 22 verwendet wird, Bilder wie jene in 2C erhält. Wird eine modifizierte Spitze 23 mit gebundenem Antilysozym 24 (wie in 2B gezeigt ist) verwendet, so werden die Darstellungen des Lysozyms deutlich breiter und in der sichtbaren bzw. offensichtlichen Höhe erhöht, wie im Bild der 2E gezeigt ist. Die Differenz der Erscheinung der Bilder ist durch die Linienanalyse in 2D dargestellt. Die Spur 25 über Lysozym, mit der blanken Spitze 21 durchgeführt, ist enger und niedriger als die mit der Antikörperspitze 23 zurückgelegten Spur 26, was die Anheftung von Antikörper an Antigen und ein anschließendes Strecken des Quervernetzers, wie durch Raab, Han et al. beschrieben ist, widerspiegelt.
Eine Rezeptor-Ligand-Erkennung wird basierend auf einer erhöhten Verringerung der Oszillationsamplitude als eine Folge von Antikörper-Antigen-Bindung überwacht. Diese Bindungssignale sind als helle und breite Punkte im Erkennungsbild sichtbar und spiegeln die Position von Ligandenbindungsstellen mit lateraler Nanometer(nm)-Genauigkeit wider. Der Nachteil dieser Methodik besteht darin, daß die Antikörper-Enzym-Bindungssignale im Erkennungsbild durch Signale überlagert werden, welche zu den topographischen Merkmalen der ”Enzyme zählen. Topographie- und Erkennungsbilder können nur durch Vergleich eines Paares von Bildern erfaßt werden, welche jeweils mit blanken und antikörpergebundenen Spitzen aufgenommen werden, und daher nicht gleichzeitig erhalten werden.
Eine Zunahme der Geschwindigkeit molekularer Erkennungsbildgebung ist in höchstem Maße wünschenswert, nicht nur zur erhöhten Effektivität der Mikroskopie, sondern auch, weil ein schnelles molekulares Erkennungsverfahren die Untersuchung einer großen Anzahl von Vertiefungen von Mikrotitertüpfelplatten auf Bindungsaffinität ermöglichen würde, was einen Weg für ein schnelles Arzneimittelscreening eröffnen würde. Es besteht daher im Stand der Technik das Bedürfnis, daß ein Rasterkraftmikroskop und ein Betriebsverfahren vorgeschlagen wird, welches getrennte und dennoch simultane Topographie- und Erkennungsbilder schafft. Es besteht auch ein Bedürfnis nach einem Verfahren für die schnelle quantitative Messung von Molekularbindung mit hoher räumlicher Auflösung.
Weitere Raster-Kraftmikroskope und Ansätze zum Aufnehmen sowohl topographischer Bilder als auch der räumlichen Anordnung von Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einem nachzuweisenden Medium werden in folgenden Veröffentlichungen erläutert:
O. H. Willemsen et al.: „Simultaneous Height and Adhesion Imaging of Antibody-Antigen Interactions by Atomic Force Microscopy”, Biophysical Journal 75, pp. 2220–2228 (1998); H. Schindler et al.: ”Optimal sensitivity for molecular recognition MAC-mode AFM”, Ultramicroscopy 82, pp. 227–235 (2000);
V. P. Pastushenko et al.: „Effects of Viscoelastic Cantilever-Sample Interaction on Laser Beam Deflection in MAC Mode MRFM”, Single Mol. 1, pp. 165–110 (2000);
P. Hinterdorfer et al.: ”Poly(Ethylene Glycol): An Ideal Spacer for Molecular Recognition Force Microscopy/Spectroscopy”, Single Mol. 1, pp. 99–103 (2000);
S. S. Wong et al.: ”Covalently functionalized nanotubes as nanometer-sized probes in chemistry and biology”, Nature 394, pp. 52–55 (1998); DE 692 15 784 T2 .
Die vorliegende Erfindung wird diesen Bedürfnissen gerecht, indem sie ein Rasterkraftmikroskop und ein Verfahren zu dessen Betrieb, welches getrennte und dennoch Topographie- und Erkennungsbilder erzeugt, und ebenso eine rasche quantitative Messung von molekularen Wechselwirkungen mit hoher räumlicher Auflösung, vorschlägt. Die vorliegende Erfindung kann durch das Erzielen hoher räumlicher Auflösung bei vielen physikalischen, chemischen und biologischen Interaktionen bei sowohl harten als auch weichen Flächen nützlich sein.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Erkennungs-Kraftmikroskop zum Erkennen von Interaktionen bzw. Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einem nachzuweisenden Medium auf einer gescannten Fläche vorgeschlagen, und es weist eine Tastsonde bzw. Sonde zum Scannen mit einer Spitze auf, welche gegenüber einer Eigenschaft einer Fläche empfindlich ist, wobei die Sonde geeignet ist, um mit einem niedrigen mechanischen Q-Faktor zu oszillieren. Mit „Q-Faktor” meinen wir den Qualitätsfaktor einer Cantileversonde, bei welcher Q = f₁/Δf₁ ist, wobei f₁ die erste Resonanzfrequenz des Cantilevers und Δf₁ die gesamte Breite der Resonanzspitze bei halbem Maximum ist. Unter „niedrigem mechanischem Q-Faktor” meinen wir einen Q-Faktor größer als Null und gleich oder kleiner als etwa 20. Der Q-Faktor des Trägers wird immer durch die Steifheit des Cantilevers und die Viskosität des Mediums bestimmt, in welchem er oszilliert, und bis zu einem gewissen Grad auch durch die Geometrie des Cantilevers. Ein Q-Faktor von gleich oder weniger als 20 ist typisch für das, was für Cantilever mit einer Steifheit von ein paar Newton pro Meter, welche im Wasser oszilliert werden, gemessen werden kann. Dies ist typisch für die Bedingungen bzw. Konditionen, welche zur Darstellung von biologischen Materialien mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) verwendet werden.
Das Mikroskop weist auch eine Einrichtung zum Aufnehmen des Ausschlags bzw. der Auslenkung der Sondenspitze als eine Funktion der Zeit, und eine Einrichtung zum Aufnehmen sowohl topographischer Daten als auch Erkennungsdaten auf, d. h. die räumliche Anordnung von Wechselwirkungen zwischen der Sonde und nachgewiesenem Medium auf der Fläche bzw. Oberfläche. In einer Ausführungsform enthält die Einrichtung zum Aufnehmen der Auslenkung der Sondenspitze als eine Funktion der Zeit eine Strahlungsquelle wie einen Laser, welcher auf die Sonde gerichtet ist, einen positionsempfindlichen Detektor bzw. Positionsdetektor, welcher von der Fläche der Sonde reflektierte Strahlung erfaßt, und einen Controller, welcher die erfaßte Strahlung verarbeitet. Die Einrichtung zum Erkennen bzw. Aufnehmen sowohl der topographischen Daten als auch der Erkennungsdaten weist eine Verarbeitungsschaltung auf, welche separate topographische Signale und Erkennungssignale erzeugt. In einer Ausführungsform werden die Amplituden der jeweils nach oben und nach unten gerichteten Schwingungen (Auslenkungen) der Sondenspitze gespeichert und zur Bestimmung sowohl der topographischen Daten als auch der Erkennungsdaten verwendet, um die räumliche Anordnung von Orten der Wechselwirkung zwischen der Sondenspitze und dem auf einer Probenfläche nachgewiesenen bzw. nachzuweisendem Medium zu erkennen bzw. zu identifizieren.
Die Sondenspitze ist vorzugsweise mit einem Sensormedium bzw. Nachweismedium sensibilisiert, welches speziell das nachzuweisende Medium bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nachweismedium ein Antikörper, und das nachgewiesene Medium ist ein Antigen. Das Nachweismedium, welches beispielsweise ein Antikörper ist, kann mittels eines flexiblen Quervernetzers (d. h. einem chemischen Mittel, welches das Nachweismedium an die Sondenspitze bindet) an die Sondenspitze gebunden sein. Es können andere Nachweismedium/nachgewiesenes Medium-Paare verwendet werden. Im Stand der Technik sind beispielsweise eine Vielzahl von Paaren aus Ligand und Rezeptor bekannt. Von einer Reihe von Wirkstoffen, Toxinen, Haptenen, Transmittern und Agonisten ist bekannt, daß sie mit Rezeptormolekülen interagieren bzw. Wechselwirkungen zeigen. Auch Sens- und Antisens-DNA und DNA/RNA-Proteine sind interaktiv. Die Vorrichtung und die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht auf molekulare Bindung oder Anhaftung bzw. bonding limitiert, sondern weisen auch andere chemische und physikalische Interaktionen bzw. Wechselwirkungen wie beispielsweise elektrostatische Ladungs-Wechselwirkungen und hydrophobe/hydrophile Wechselwirkungen auf. Das „Nachweismedium” der Sondenspitze kann somit elektrische und/oder chemische Modifikationen an der Spitze ebenso wie Anhaften bzw. Binden von Molekülen an der Spitze umfassen.
In einer Ausführungsform wird ein über die Zeit variierendes magnetisches Feld unter Verwendung eines magnetischen Materials, welches wenigstens einen Abschnitt der Sonde bildet, verwendet, um die Sonde in Bewegung zu versetzen. Die topographischen Signale und die Erkennungsdaten-Signale, welche erfaßt und gespeichert werden, werden in einer bevorzugten Form mittels einer elektronischen Schaltung, welche eine Einrichtung zum Bestimmen des Mittelwertes der Sondenauslenkung (unter Verwendung eines vom positionsempfindlichen Detektor erzeugten Auslenkungssignals) auf der Zeitachse, welche, verglichen mit Änderungen, welche durch Tomographie oder Bindungsvorgänge verursacht sind ausreichend lang ist, derart getrennt, daß diese Vorgänge getrennt erkannt und gemessen werden. Die elektronische Schaltung weist zudem eine Einrichtung zur Nutzung des Mittelwerts der Auslenkung der Sonde auf, um die nach unten gerichtete Amplitude der Sonde aus der Differenz zwischen dem Mittelwert und dem Wert der nach unten gerichteten Auslenkung zu bestimmen. Diese Einrichtung weist in einer bevorzugten Form einen digitalen Signalprozessor auf, welcher unter Verwendung eines Erkennungsbildgebungs-Algorithmus arbeitet.
Die elektronische Schaltung weist zudem eine Einrichtung zum Steuern der Höhe der Sonde auf. Die Einrichtung zum Steuern der Höhe der Sonde weist in einer bevorzugten Form ein piezoelektrisch angetriebenes Tast- bzw. Scan-Element in Verbindung mit einem Controller auf. Die Topographie wird unter Verwendung des nach unten gerichteten Wertes der Auslenkung der Sondenspitze bestimmt. Die elektronische Schaltung weist zudem eine Einrichtung zum Bestimmen des Wertes der nach oben gerichteten Auslenkung der Sonde aus der gemessenen Amplitude und dem Mittelwert der Auslenkung zum Erzeugen eines Signals entsprechend den Wechselwirkungen zwischen einem Nachweismedium und einem nachgewiesenen Medium auf der gescannten Fläche auf. Die Einrichtung zum Bestimmen dieser Werte weist in einer bevorzugten Ausführungsform einen digitalen Signalprozessor auf, welcher unter Verwendung eines Erkennungsbildgebungs-Algorithmus arbeitet.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die topographischen Signale und die Erkennungssignale mittels einer elektronischen Schaltung getrennt, welche eine Einrichtung zum Digitalisieren der aufgenommenen Auslenkung der Sondenspitze, und eine Berechnungseinrichtung zum Bestimmen des Mittelwertes der Auslenkung der Sondenspitze auf einer Zeitskala, welche verglichen mit durch Topographie oder Bindungsvorgänge verursachte Änderungen derart ausreichend lang genug ist, daß diese Vorgänge getrennt erkannt und gemessen werden, aufweist. In einer bevorzugten Form weist die Digitalisierungseinrichtung einen oder mehrere Wechselstrom-Gleichstrom-Konverter bzw. -Wandler auf. Die elektronische Schaltung weist auch eine Einrichtung zur Verwendung des Mittelwertes der Auslenkung der Sonde zum Bestimmen der nach unten gerichteten Amplitude aus der Differenz zwischen dem Mittelwert und dem Wert der nach unten gerichteten Auslenkung auf. Die Einrichtung zum Bestimmen dieser Werte weist in einer bevorzugten Form bzw. Ausführungsform einen digitalen Signalprozessor auf, welcher unter Verwendung bzw. Einsatz eines Erkennungs- bzw. Bildgebungsalgorithmus arbeitet.
Die elektronische Schaltung weist auch eine Einrichtung zum Steuern der Höhe der Sonde zum Bestimmen der Topographie der Probe unter Verwendung des Wertes der nach unten gerichteten Auslenkung, und eine Einrichtung zum Bestimmen des Wertes der nach oben gerichteten Auslenkung aus der nach oben gerichteten Amplitude und dem Mittelwert der Auslenkung zur Erzeugung eines den Interaktionen bzw. Wechselwirkungen zwischen einem Nachweismedium auf der Sondenspitze und einem nachgewiesenen Medium auf der gescannten Oberfläche entsprechenden Signals auf.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die als eine Funktion der Zeit gemessene Auslenkung der Sondenspitze zur Bestimmung der räumlichen Anordnung von Erkennungsfällen mittels Vergleichs mit einem vorausgesagten oder gespeicherten bzw. aufgenommenen Auslenkungsmuster verwendet, welches für den Fall erzeugt wurde, in welchem es keine Erkennung gibt.
Die vorliegende Erfindung schlägt zudem ein Verfahren zum Betreiben eines Rasterkraftmikroskops einschließlich dem Scannen einer Sonde, welche mit einem niedrigen mechanischen Q-Faktor oszilliert, welche gegenüber einer Eigenschaft einer Fläche empfindlich ist, dem Aufnehmen der Auslenkung der Sondenspitze als eine Funktion der Zeit, und dem simultanen Aufnehmen von sowohl topographischen Bildern als auch der räumlichen Lokalisierung von Interaktionen bzw. Wechselwirkungen zwischen der Sonde und dem nachgewiesenen Medium auf der Fläche einer Probe. Das Verfahren verwendet erfindungsgemäß das Maß der nach oben gerichteten Auslenkung der Sondenspitze zum Messen von Interaktionen bzw. Wechselwirkungen zwischen der Sondenspitze und der Probenfläche. Die Höhe der Sondenspitze über der Probenfläche wird entweder durch das Maß der nach unten gerichteten Auslenkung der Sondenspitze (d. h. die Bodenamplitude), der Gesamtamplitude der Sondenspitze (d. h. die Summe der oberen und unteren Amplitude der Spitze geteilt durch zwei) oder dem mittleren Auslenkungssignal (d. h. die Differenz zwischen der oberen und der unteren Amplitude der Spitze) gesteuert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für das Screening von Reagenzien zum Binden an ein spezielles Zielmolekül vorgeschlagen. Es umfaßt das Befestigen des Zielmoleküls an der Spitze einer Sonde, das Scannen wenigstens eines potentiellen Reagenz mit einer mit einem niedrigen mechanischen Q-Faktor arbeitenden oszillierenden Kraft-Meß-Sonde, unter Verwendung des Ausmaßes der nach unten gerichteten Auslenkung der Sonde, um die Höhe der Sonde über der Probenfläche zu steuern, und unter Verwendung des Ausmaßes der nach oben gerichteten Auslenkung, um Wechselwirkungen zwischen dem Zielmolekül und dem potentiellen Reagenz zu messen. Das Verfahren wird vorzugsweise verwendet, um verschiedene potentielle Reagenzien nacheinander bzw. sequentiell zu screenen. Die potentiellen Reagenzien können beispielsweise in einem Array plaziert und nacheinander untersucht werden.
In einer wiederum weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen von Liganden zum Binden an ein spezielles Ziel auf einer Zelloberfläche bzw. -fläche vorgeschlagen, und es umfaßt das Befestigen des Liganden an der Sondenspitze, das Scannen einer Zellfläche mit einer mit einem niedrigen mechanischen Q-Faktor betriebenen oszillierenden Kraftmeßsonde, die Nutzung des Maßes der nach unten gerichteten Auslenkung, um die Höhe der Sonde über der Probenfläche zu steuern, und das Nutzen bzw. Verwenden des Maßes der nach oben gerichteten Auslenkung, um Wechselwirkungen zwischen wenigstens einem Zielmolekül auf der Zellfläche und dem möglichen Liganden zu messen.
Es ist dementsprechend eine Aufgabe bzw. ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, ein Rasterkraftmikroskop und ein Verfahren zu dessen Betrieb vorzuschlagen, welches separate und gleichzeitige Topographie- und Erkennungsbilder ebenso wie eine schnelle quantitative Messung molekularer Bindung mit hoher räumlicher Auflösung schafft. Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung, der angehängten Zeichnung und den angehängten Ansprüchen offensichtlich.
Im folgenden wird exemplarisch Bezug auf die Zeichnung genommen, in welcher gilt:
1A ist eine schematische Darstellung einer chemisch-modifizierten Cantilever-Sondenspitze;
1B ist ein Graph einer Kraft-Abstand-Kurve, welcher die Bildung einer Bindung und das Aufbrechen einer Bindung zeigt, wenn die chemisch-modifizierte Cantilever-Sondenspitze aus 1A in Richtung auf eine Probenfläche und von dieser weg bewegt wird;
2A ist eine schematische Darstellung einer nicht modifizierten bzw. unveränderten Sondenspitze, welche mit einem Lysozym interagiert, was ein Bild erzeugt, wie es in 2C gezeigt ist;
2B ist eine schematische Darstellung einer chemisch-modifizierten Sondenspitze, welche mit einem Lysozym interagiert, was ein Bild ergibt, wie es in 2E gezeigt ist;
2D zeigt einen Vergleich der Höhe und Breite von Bildern, welche mit den in 2A und 2B dargestellten Sondenspitzen erzeugt sind;
3A–3C stellen charakteristische Wellenformen für die Oszillation einer freien Sondenspitze (A), einer Sondenspitze, welche eine Fläche (B) berührt, und einer Sondenspitze, welche sowohl eine Fläche berührt als auch an diese gebunden wird (C), dar;
4A und 4B stellen Zeichnungen einer Auslenkung der Sondenspitze dar, wenn die Sondenspitze über eine Fläche bewegt wird, wobei 4A eine Zeichnung für eine blanke Spitze und 4B eine Zeichnung für eine Spitze mit einem hieran befestigten Nachweismedium ist;
5 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer elektronischen Schaltung, welche Topographiesignale und Erkennungssignale trennt;
6A und 6B sind jeweils simultane bzw. gleichzeitige Topographie- und Erkennungsbilder, welche erzeugt werden, wenn eine Sondenspitze mit einem hieran gebundenen Nachweismedium zur Darstellung einer Fläche bzw. Oberfläche, welche nachzuweisende Medien enthält, verwendet wird;
7A und 7B sind jeweils gleichzeitige Topographie- und Adhäsionsbilder, welche erzeugt werden, wenn eine blanke Sondenspitze zum Darstellen einer Fläche verwendet wird, welche nachzuweisende Medien enthält;
8 ist eine schematische Darstellung einer digitalen elektronischen Schaltung für eine erfindungsgemäße Ausführungsform, welche Topographie- und Erkennungsbilder trennt;
9 ist ein Flußdiagramm, welches einen Algorithmus darstellt, welcher in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform zur Erkennungsbildgebung verwendet wird;
10 ist eine Darstellung von Erkennungs- und Topographiesignalen, welche aus der Verzerrung bzw. Verformung einer Oszillationswellenform der Sondenspitze erhalten werden;
11 ist eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit scannender Sonde, welches bei der Ausführung einer oder mehrerer erfindungsgemäßen Ausführungsformen nützlich ist;
12A–12C sind Diagramme, welche ein grobes bzw. unbearbeitetes Auslenkungssignal aus einem Oberflächenscan mit oberen und unteren Peaks darstellt, wobei 12A eine Sondenspitze darstellt, welche mit einer Änderung in der Flächentopographie zusammenfällt, wobei 12B einen Auslenkungsfall darstellt, wenn eine funktionalisierte Sondenspitze auf ein nachgewiesenes bzw. nachzuweisendes Medium auf einer Fläche trifft und bindet, und wobei 12C den absoluten Wert des Peaks und Peak-Differenzsignale, welche von 12B herrühren, darstellt;
13 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Peak-Differenzdetektors, welcher ein Erkennungssignal schafft;
14 ist eine schematische Darstellung einer analogen elektronischen Schaltung für eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform, welche Topographie und Erkennungsbilder trennt; und
15A u. 15B sind Pläne, welche jeweils eine Auslenkung der Sondenspitze darstellen, wenn eine Sondenspitze über harte und weiche Flächen bewegt bzw. gescannt wird.
Die vorliegende Erfindung schafft eine neue Vorrichtung und ein neues Verfahren für einen Molekular-Kraft-Erkennungsmikroskopie(MFRM)-Betriebsmodus, welcher in der Lage ist, Erkennungs- und Topographiebilder zeitgleich und unabhängig voneinander aufzunehmen. Wenn ein Rasterkraftmikroskop-Cantilever mit einem geringen bzw. niedrigen mechanischen Q-Faktor in einem Fluid oszilliert wird, hat die Amplitude im oberen Bereich der Cantilever-Schwingung keinen Bezug zur Amplitude am Boden dieser Schwingung, wenn die Spitze intermittierend eine Fläche berührt. Eine solche Unabhängigkeit ist nahezu vollständig gegeben für Cantilever, welche mit einem Q-Faktor von größer als 0, jedoch kleiner als etwa 2–3 betrieben werden, und ist jedoch noch immer bis zu einem gewissen Grad für Cantilever mit einem Q-Faktor von weniger als etwa 20 gegeben bzw. nachweisbar. Cantilever mit geringen Q-Faktoren (ungefähr 1 in Flüssigkeit), welche mit Frequenzen unterhalb der Resonanz betrieben werden, enthalten Erkennungs- und topographische Informationen, welche gut getrennt sind. Die nach der Zeit aufgelösten Oszillationssignale werden speziell bearbeitet, bevor sie in eine Mikroskop-Feedbackloop bzw. -Rückführschleife zurückgeführt werden, wie es weiter unten detailliert erklärt wird.
Wie in 11 schematisch gezeigt wird, weist ein Rasterkraftmikroskop (AFM), welches für die Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, einen Cantilever 28 mit einem Film 29 auf, welcher ein magnetisches oder magnetostriktives Material an seiner oberen Fläche aufweist. Der Cantilever 28 weist eine Sondenspitze 30 auf, welche sich von der Bodenfläche hiervon in Richtung zur Probe 32 erstreckt. Die Sondenspitze 30 wird mittels eines piezo-elektrischen Scanners 36 über die Fläche 34 der Probe 32 gescannt. Auslenkungen des Cantilevers 28 werden dadurch erkannt bzw. erfaßt, daß ein fokusierter Strahl einer Strahlung 38a von beispielsweise einem Laser 4 auf die reflektierende Fläche des Films 29 fokusiert wird, um einen reflektierten Strahl 38b zu erzeugen. Ein positionsempfindlicher Detektor bzw. Positionsdetektor 42 mißt die Winkelstellung des Strahls 38b.
Ein Solenoid 64, welches in der Nähe des Cantilevers 28 angeordnet ist, wird mittels eines Wechselstrom-Signals von einem Oszillator 66, wie es genauer in Lindsay, US 6 121 611 A ausgeführt ist, angetrieben, dessen Offenbarung hiermit mittels Bezug aufgenommen ist. Das sich ergebene alternierende Magnetfeld bringt den Cantilever 28 zum Oszillieren, wobei sowohl eine nach oben gerichtete als auch eine nach unten gerichtete Auslenkung der Sondenspitze erzeugt wird. Diese oszillierende Bewegung erscheint als eine Wechselstrom-Signal-Komponente in dem vom Positionsdetektor 42 erfaßten Signal. Das Signal, welches sowohl die nach oben als auch die nach unten gerichteten Peak-Werte der Schwingung enthält, wird einer Verarbeitungsschaltung 50 zugeführt, welche sowohl topographische als auch Erkennungsbild-Signale erzeugt, wie weiter unten detailliert beschrieben wird.
Die Spannung des Positionsdetektors 42 wird zum Erfassen der Biegung des AFM-Cantilevers (Detektorspannung) verwendet und ist als eine Funktion der Zeit für drei spezifische bzw. spezielle Fälle in 3 aufgezeichnet. 3A zeigt das Signal, wenn die Cantilever-Sonde die Fläche während einer Oszillation zu keiner Zeit berührt bzw. mit dieser in Kontakt steht. Die Wellenform ist sinusförmig mit einem Peak-Auslenkungswert U₊ und einem unteren Auslenkungswert U_–. Der Mittelwert U_M liegt auf halbem Wege zwischen U₊ und U_–. Es beträgt im Allgemeinen nicht Null, da das Detektorsignal für bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikroskops gleichstromgekoppelt ist. Wenn die Sondenspitze die Fläche (3B) berührt, so wird die untere Amplitude in einen Differenzwert U_–' geändert. Die Spannung U₊, welche dem oberen Maß der Cantilever-Schwingung (Auslenkung) entspricht, ist unverändert. Der neue mittlere Wert bzw. Mittelwert ist U_M', und der neue Peak-to-Peak-Wert beträgt (U₊ – U_–'). Dieser Peak-to-Peak-Wert (oder eine proportionale Größe, die Wurzel des quadrierten Mittelwerts) wird zur Steuerung des Mikroskops verwendet, wenn topographische Bilder erzeugt werden.
Eine automatische Rückführ- bzw. Feedback-Steuerung durch eine Servoloop bzw. schleife in Verbindung mit dem Mikroskop-Controller dient der Erhaltung der in 3B gezeigten Wellenform, wenn die Sonde über die Fläche bewegt bzw. gescannt wird, wobei die Höhenänderungen, die hierzu nötig sind, als das topographische Bild aufgenommen werden. Wie in 11 gezeigt ist, wird beispielsweise ein Höhenfehlersignal 57 vom Controller 60 erzeugt bzw. verarbeitet, welches zu einem Z-Höhen-Korrektur-Signal führt, welches durch einen Hochspannungsverstärker 62 zum piezoelektrischen Scanner 36 gesendet wird. Falls die Servo-Höhensteuerung ausgelöst wird, weil die Sonde auf eine Bindungsstelle (auf einer ansonsten flachen Fläche) trifft, so erhält man die in 3C gezeigte Wellenform. Da von der Fläche ausgegangen wurde, daß sie flach ist, behält U_– seinen vorangegangenen Wert.
Ist die Gesamtamplitude der Oszillation jedoch mit der Länge des Quervernetzers (4 in 1A) vergleichbar, dann wird die Amplitude der Aufwärtsschwingung verringert, falls das gebundene Nachweismedium ein nachzuweisendes Medium auf der Fläche bindet. Die positive Peak-Spannung wird somit auf einen neuen Wert U₊' abgeändert. Veränderungen in U₊' bezogen auf ein Baseline-Signal vor der Bindung, U_M', spiegeln Wechselwirkungen zwischen dem Nachweismedium an der Spitze und dem nachgewiesenen Medium auf der Fläche wider, jedoch nicht die Flächentopographie, falls der Cantilever Q niedrig genug ist, d. h. weniger als etwa 20 und vorzugsweise weniger als etwa 3. Veränderungen in der unteren Spannung U_–' bezogen auf U_M' spiegeln die Topographie, nicht jedoch Wechselwirkungen zwischen dem Nachweismedium und dem nachgewiesenen Medium wider.
Diese Sensibilität wird beispielhaft in Aufnahmen der Abweichung der oszillierenden Spitze dargestellt, wenn sie über eine Linie bzw. entlang einer Linie über eine Fläche scannt, welche mit vereinzelt verteilten, einzeln verteilten Enzymmolekülen bedeckt ist, welche spezifische Antigene für Antilysozym auf der Sonde sind. Um diese Wirkung darzustellen, wurden Scans durchgeführt, bei welcher die Servosteuerung der Höhe ausgeschaltet war. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Das Auslenkungssignal, welches aufgenommen wurde, als die Sondenspitze beim Scannen mit einer blanken Spitze (kein gebundener Antikörper, beispielsweise 21 in 2A) in einem Durchlauf über die Probe gescannt hat bzw. geführt wurde, wird in 4A gezeigt. Da die Mikroskop-Servoloop bzw. -Regelungsschleife ausgeschaltet ist, schwankt bzw. fluktuiert die untere Amplitude (U_–', 41), wenn die Sonde über Enzyme auf einer ansonsten flachen Fläche scannt. Da die Spitze einen niedrigen mechanischen Q-Faktor hat, bleibt die obere Amplitude U₊' 42 unberührt. Wenn jedoch eine mit Antikörper bestückte Sondenspitze über dieselbe Fläche scannt (4B), so schwanken bzw. fluktuieren sowohl U_–' (43) als auch U₊' (44).
Die Daten in 4 sind in komprimierter Form (insgesamt sind 20000 volle Oszillationsperioden gezeigt) derart dargestellt, daß die Minima (untere Grenzlinie der Hüllkurve) und Maxima (obere Grenzlinie der Hüllkurve) der entsprechenden Oszillationsperioden sichtbar sind. Der Flächenkontakt beeinflußt nur die nach unten gerichteten Auslenkungen (Minima) der Oszillationen. Enzyme auf der Fläche werden daher lediglich durch die Oszillationsminima (Wölbungen in der unteren Linie der Hüllkurve) erfaßt, und die Maxima bleiben innerhalb des thermischen Rauschens der Cantilever-Auslenkung konstant.
Wird jedoch dieselbe Probe mit einer Antikörper aufweisenden Spitze gescannt, so sind Wölbungen auch in der oberen Grenzlinie 44 (4B) sichtbar. Eine Bindung des Antikörpers an der Spitze mit dem Enzym auf der Fläche verringert die Auslenkung nach oben, da die Spitze mit der Fläche mittels des flexiblen Quervernetzers (4, 1A) physikalisch verbunden ist. Die Amplitude der Oszillation der Spitze wird idealerweise derart ausgewählt, daß sie gerade derart geringfügig kleiner als die Länge des gestreckten Quervernetzers ist, daß sowohl der Antikörper gebunden bleibt, während eine Bindungsstelle passiert wird, als auch die Verringerung der Auslenkung nach oben von ausreichender Signifikanz verglichen mit dem zu messenden thermischen Rauschen ist. Da die Federkonstante des Quervernetzers nicht linear mit dem Spitzen-Flächen-Abstand zunimmt, wird die Bindungskraft nur nahe der vollständigen Streckung des Quervernetzers (an den Maxima der Oszillationsperiode gegeben) nachgewiesen bzw. erfaßt. Die Erkennungssignale sind bzw. werden daher sowohl in Raum (Δz von ungefähr 5 Nanometer) als auch Zeit (halbe Oszillationsperiode von ungefähr 0,1 Millisekunde) gut von den von der Fläche herrührenden topographischen Signalen getrennt.
Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, die vorliegende Erfindung in die Praxis umzusetzen, und Fachleute erkennen, daß diese Erfindung nicht auf die hier beschriebenen spezifischen elektrische Schaltkreise beschränkt ist. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden unter Verwendung der in 5 dargestellten Schaltung 50 zugleich bzw. gleichzeitig Topographie- und Erkennungsbilder erstellt bzw. erhalten. Das Signal vom Detektor 42 wird an einen Peak-Detektor 52 geleitet, und Maxima (U₊) und Minima (U.) einer jeden sinusförmigen Cantilever-Auslenkungsperiode werden erfaßt, gefiltert und verstärkt. Gleichstrom-Offset-Signale 53 und 54 werden verwendet, um thermischen Drift zu kompensieren. Die Signale sind nahe bei U_M' ausgewählt, sie werden jedoch während des Scans falls nötig angepaßt, um langsame Drifts in U_M' zu kompensieren. Werte für U₊ und U_– werden in den AFM-Controller 56 eingegeben, wobei U_– die Rückführschleife 55 treibt, um ein Höhen-(Topographie)Bild 57 auf normale Weise aufzunehmen, und wobei U₊ die Daten zum Erstellen eines Erkennungsbildes 58 durch Anzeigen von U₊ als eine Funktion der Position auf der Fläche liefert. Auf diese Weise werden Topographie- und Erkennungsbilder gleichzeitig und unabhängig voneinander erhalten bzw. erzeugt.
Ergebnisse des Betriebs der Schaltung aus 5 mit einem gebundenen Antikörper sind in 6 gezeigt. Das Topographiebild 57 ist in 6A gezeigt, und es zeigt eine Vielzahl von Enzymen, welche auf der Fläche angeordnet sind, mit Dimensionen, welche jenen gleichen, welche in Bildern erhalten werden, welche die Peak-to-Peak-Amplitude als Steuerungsparameter verwenden (beispielsweise 2C). Das Bild in 6A wurde mit einem gebundenen Antikörper erstellt. Das Erkennungsbild 58 ist in 6B gezeigt. Bei einigen der Molekülen sieht man dunkle Punkte, was einem Abfall in U₊ entspricht, wenn Antikörper und Antigen aneinander binden. Für ein gegebenes Cluster von Molekülen 61 zeigt nur eine Fraktion zugleich Erkennungsbildgebungs-Ereignisse 62. Die lateralen Positionen von Enzymen, welche in der Topographie erfaßt bzw. aufgenommen wurden, korrelieren jedoch räumlich mit den Erkennungssignalen des Erkennungsbildes.
Dieses Verfahren einer erfindungsgemäßen Ausführungsform funktioniert selbst in Fällen, in welchen keine flexible Anbindung verwendet wird, und dies wird durch Erkennungsbilder von Ferritin dargestellt, einem in hohem Maße positiv geladenen Protein. Es wurde mit einer negativ geladenen AFM-Cantilever-Sondenspitze nachgewiesen (welche jedoch nicht speziell chemisch modifiziert war, im Gegensatz zu den zuvor oben beschriebenen Beispielen). Wenn die AFM-Spitze ein Ferritin-Molekül berührt, so führt die Spitzen-Protein-Adhäsion aufgrund der elektrostatischen Anziehung zu einer Abnahme der nach oben gerichteten Auslenkung. Eine nahezu perfekte Übereinstimmung zwischen Positionen von Proteinen im Topographiebild 57 (7A) und der Lokalisation von Spannungswechselwirkung im Adhäsionsbild 58 (7B) ist sichtbar. Die Amplitude der Oszillation wird in diesem Fall derart niedrig gewählt, daß die Spitze niemals vollständig frei vom Protein bei der nach aufwärts gerichteten Schwingung ist, ungeachtet dessen, daß kein flexibler Quervernetzer vorhanden ist.
Das Verfahren ist gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform sensibel gegenüber chemischer Adhäsion zwischen der Sonde und der Fläche, selbst wenn kein Verbinder vorhanden ist. Dies rührt daher, daß die obere Auslenkung bzw. die nach oben gerichtete Schwingung des Cantilevers bis zu einem gewissen Grad durch Ereignisse gedämpft wird, welche Energie bei der unteren Auslenkung bzw. der nach unten gerichteten Schwingung des Cantilever vernichten (da Q im Bereich von 1 oder ein wenig höher liegt). Lokale Punkte hoher Adhäsion führen somit zur Verringerung der Amplitude der unteren Auslenkung. Die gesamte Dämpfung (sowohl obere als untere Teile der Schwingung bzw. der Auslenkung) führen zu einem offensichtlich hohem Punkt in der Topographie, da der Controller die Spitze vom Substrat wegzieht, um die Oszillationsamplitude wieder herzustellen. Mittels Überwachung des Erkennungssignals zugleich mit dem Topographiesignal erlauben erfindungsgemäße Ausführungsformen die Unterscheidung zwischen wirklichen bzw. tatsächlich gegebenen topographischen Merkmalen (d. h. von einer tatsächlichen Höhenänderung verursacht) und solchen, welche eine Konsequenz lokaler Änderungen in der Adhäsion sind (d. h. eine Veränderung in der Oberflächenchemie ohne Höhenänderung).
Diese alternativen Betriebsmodi zeigen, daß die beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung einen breiten Anwendungsbereich als eine Nachweisvorrichtung von hoher Auflösung für die Korrelation zwischen topographischen Strukturen und der Lokalisation von spezifischen Wechselwirkungen im allgemeinen haben. Die oben beschriebenen Ausführungsformen arbeiten jedoch am besten bei flachen Flächen bzw. Oberflächen, und wenn der Drift des Instruments nicht zu groß ist. Dies erklärt sich dadurch, daß der mittlere Gleichstrom-Wert des Rohauslenkungssignals selbst dann variiert, wenn die Peak-to-Peak-Amplitude unter Servosteuerung ist, bzw. steht als ein Ergebnis von Drift und Fehlern in der Servo, wenn rauhes Gebiet gescannt wird.
Diesem Nachteil wird in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform abgeholfen, welche schematisch in 8 gezeigt ist. Die Rohsignale (A und B, welche jeweils die Signale von den oberen und unteren Segmenten des Photodetektors, von den Segmenten des Diodendetektors bzw. Diodengleichrichters 42 darstellen) werden gleichstromgekoppelt in die Analog-Digitalkonverter 82 und 83 eingegeben und einem Prozessor 84 für digitale Signale zugeführt, wobei das Auslenkungssignal durch Berechnen der Differenz der Segmentspannungen dividiert durch ihre Summe, wie in 85 gezeigt, gebildet wird. Das Höhensteuerungssignal 87, ein Topographiebild-Datenstrom 88 und ein Erkennungsbild-Datenstrom 89 werden nachfolgend von einem Algorithmus 86, welcher weiter unten beschrieben wird, ausgegeben. Die Auslenkungswellenform könnte alternativ durch analoge Verfahren erzielt werden und dann in eine digitale Form für eine sich anschließende Verarbeitung konvertiert werden.
Der Erkennungsbild-Algorithmus 86 wird anhand des Flußdiagramms in 9 beschrieben. In einem ersten Schritt 92 werden die folgenden Werte unter Verwendung der wie oben beschrieben erzielten digitalisierten Detektor-Wellenform 91 in DSP 84 (8) errechnet: U₊, der gleitende Mittelwert des positiven Peak-Wertes des Auslenkungssignals, wobei das Signal derart polarisiert ist, daß positive Spannungen nach oben gerichteten Auslenkungen bzw. Schwingungen des Cantilevers entsprechen. Die Zeitdauer des gleitenden Durchschnitts ist τ.
U_–, der geringste gleitende Mittelwert des Zeitwerts des Auslenkungssignals. Die Zeitdauer des gleitenden Durchschnitts beträgt τ.
U_M, der Spannungsmittelwert, welcher durch ein gleitendes Zeitmittel von (U₊ – U_–)/2 gegeben ist. Die Zeitdauer dieses gleitenden Mittels bzw. Mittelwerts beträgt T > τ.
τ wird ausgewählt, um eine schnelle Antwort der Regelung bzw. Servo unter Minimierung des Rauschens zu erlauben. Wird beispielsweise ein Linienscan von 512 Pixel pro Sekunde gefahren, dann beträgt τ = 1/512 s = 0,0195 Sekunden. Eine Vibrationssequenz der Spitze von 5 kHz ergibt dann 0,0195/0,0002 = 10 Zyklen über jeden Wert von U₊ und U_– gemittelt. T ist derart ausgewählt, um einen statistischen Wert für U_M bei Abwesenheit von Erkennungsfällen zu ergeben. Da die Servo-Rückführ-Steuerungsschleife U_– aufrecht erhält, sollte U_M bei Abwesenheit von Erkennungsfällen eine Konstante sein. Jedoch verursachen mechanische und thermische Drifts eine langsame Veränderung der mittleren Position der Sonde. U_M muß daher über eine Dauer gemittelt werden, welche bezogen auf die gesamte Scannzeit für ein Bild klein ist, jedoch größer als die Zeit, welche von der Sonde verbracht bzw. gebraucht wird, wenn sie auf ein Erkennungsereignis stößt. Eine geeignete Zeit beträgt etwa 1/20 einer Linienscanzeit oder in diesem Fall 0,05 Sekunden. Diese Zeit kann vom Benutzer eingestellt werden, wobei sie verkürzt wird, wenn der Bildbereich eine hohe Dichte an Bindungsstellen aufweist.
Die Werte von U_–(t) und U₊(t) werden alle τ-Sekunden in temporären Speicherorten 93 gespeichert, in welchen auch die beiden vorangegangenen Werte U_–(t – τ) und U₊(t – τ) gespeichert sind. U_M(t) wird alle τ-Sekunden erneuert bzw. überspielt (als ein gleitender Durchschnitt über T Sekunden berechnet), und der aktuelle Wert U_M(t) und der vorangegangene Wert U_M(t – τ) werden ebenfalls gespeichert. Der Wert U₊(t – τ) – U₊(t) wird erst bzw. nur gebildet, wenn zuerst ein Scan begonnen wurde (94). Beträgt dieser Wert weniger als Null (so daß die obere Spannung mit der Zeit ansteigt), so wurde der Scan an einer Erkennungsstelle begonnen. Der Mikroskopservo wird in diesem Fall unter Verwendung der R = 0-Leitung (97, 98) eingeschaltet bzw. hinzugeschaltet, und der Scan wird fortgeführt, bis U₊ einen stabilen Wert (U₊(t – τ) – U₊(t) ≥ 0) annimmt, woraufhin das Signal anschließend auf bzw. bis U₊(t – τ) – U₊(t) ≥ 0 (96) getestet wird. Falls das Signal abfällt (U₊(t – τ) – U₊(t) > 0), so ist ein Erkennungsfall aufgetreten, und die Steuerung zweigt ab zu 900. Falls nicht, so wird von der Differenz eines festgesetzten Punktwertes (vom Benutzer gesteuert), SP und U_M(t) – U_–(t), dem nach unten gerichteten Wert der Auslenkung, ein Fehlersignal berechnet. Dieses wird zur Steuerung der Höhe der Sonde auf herkömmliche Weise verwendet und bestimmt somit die Probentopographie (und das Höhensteuerungssignal) mittels der im Stand der Technik bekannten üblichen Rückführ-Steuerung 99. Diese Rückführ-Leitung kommt nur ins Spiel, wenn kein Erkennungsfall bearbeitet wird. In diesem Fall steht der Marker bzw. die Flag R auf Null, so daß das U_M(t) – U_–(t) Signal mittels des Schalters 98 mit dem Servo bzw. der Regelung verbunden wird.
Tritt der Fall U₊(t – τ) – U₊(t) > 0 auf, was einen Erkennungsfall markiert, so wird der Erkennungsmarker auf R = 1 gesetzt, der Wert des mittleren Signals bzw. Mittelsignals wird auf den Wert unmittelbar vor der Erkennung gesetzt, d. h. S_M = U_M(t – τ), so daß S_M nicht wie U_M abgedated bzw. überspielt wird, sondern dem Wert von U_M unmittelbar vor der Erkennung entspricht. Der Wert der Peak-Amplitude unmittelbar bei der Erkennung wird als UP = U₊(t₀) gespeichert, wobei t₀ die Startzeit widerspiegelt. Schließlich wird unter der Verwendung von S_M ein neuer positiver Peak-Wert S_P entsprechend S_P(t) = U₊(t) – S_M wie in 900 gezeigt, berechnet. Während die obere Amplitude unter dem Wert beim Einsetzen der Erfassung (S_P(t) – UP < 0) bleibt, fährt die Steuerung im Erkennungsmodus (901) fort. S_P(t) wird in einem separaten Bildspeicher gespeichert, um ein Erkennungsdisplay wie jene in den 6B und 7B gezeigten zu erzeugen. Die Höhenregelung wird nun vom Signal SP – (S_M – U_–(t)) bei 904 gesteuert und geht mittels des Schalters 905 auf den Servo bzw. die Regelung 99 über. Erreicht die obere Amplitude ihren Wert beim Start der Erkennung, S_P(t) – UP > 0, so kehrt der Steuerungsmodus in den Normalzustand (R = 0) bei 902 zurück, und U_M wird erneut beginnend mit dem gespeicherten Wert S_M als ein gleitender Durchschnitt berechnet.
Es ist offensichtlich, daß dieselben Ergebnisse mit anderen Algorithmen zu erzielen sind. Beispielsweise kann die Servo-Rückführsteuerung unter Verwendung von U_M auf nur einer Leitung bzw. Weg fortgesetzt werden, solange T viel mehr als die bei einem Erkennungsfall verbrauchte Zeit beträgt. Dies würde zu einem gewissen Fehler im Topographiesignal führen, Erkennungsereignisse würden jedoch korrekt erkannt werden.
Ein weiteres, rechentechnisch intensiveres, jedoch schnelleres Verfahren ist es, jeden Zyklus der Oszillationsamplitude mit einer Ausgleichs-Sinuswelle zu vergleichen, wie in 10 dargestellt ist. Die durchgezogene Linie zeigt hier den unmittelbaren Wert des Datenstroms 101 der Auslenkung, wohingegen die Punkte der Ausgleichs-Sinuswelle 102 entsprechen. Die Peak-Differenz zwischen dem oberen Wert der Daten und dem oberen Teil der Anpassung (ΔU₊) bei 103 gibt den Amplitudenrückgang aufgrund einer Erkennungsbindung an und kann als das Erkennungssignal gezeichnet werden. Die Peak-Differenz zwischen dem unteren Wert der Daten und dem oberen Teil der Anpassung (ΔU_–) bei 104 ergibt den Amplitudenrückgang aufgrund der Topographie an und kann zum Steuern der Höhenregelungsschleife verwendet werden.
In einer in den 12A–12C und 13 gezeigten weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Mikroskop auf normale Weise zum Erzeugen topographischer Signale betrieben. Eine im Mikroskop enthaltene Schaltung zeigt Veränderungen im oberen Abschnitt des Roh-Auslenkungssignals als eine Funktion der Zeit an, um räumliche Erkennung von Bindungsfällen und ein Erkennungsbild zeitgleich mit topographischen Signalen zu ermöglichen bzw. zu erzeugen.
Mit Bezug auf die 12A–12C und 13 wird die Servo-Rückführ-Steuerungsschleife vom wechselstromgekoppelten Auslenkungssignal auf normale Art und Weise betrieben, um das beste Bild zu erzielen. Es wird als Beispiel angenommen, daß das Mikroskop mit einer ±5 nm-Amplitude arbeitet, wenn es in Kontakt mit der Fläche steht (vor dem Kontakt mit größerer Amplitude). 12A zeigt das Roh-Auslenkungssignal wenn ein 1 nm hohes Objekt, welches 40 bis 60 ms auf der Zeitachse überspannt, gescannt wird. Bei 201 verringert die Fläche das untere Maß der Auslenkung bzw. der Schwingung der Cantilever-Sonde. Bei 202 wird die Servosteuerung aktiviert, welche die Probe von der Sondenspitze wegzieht und die volle Amplitude der oszillierenden Sonde wiederherstellt. Bei 203 fällt die Fläche des gescannten Objekts weg, wodurch die untere Amplitude der Oszillation erhöht wird. Bei 204 schaltet sich die Servosteuerung erneut ein und drückt die Probe wieder in Richtung zur Sondenspitze, um die Arbeitsamplitude zu erreichen.
12B zeigt als ein Beispiel die Sequenz bzw. Abfolge von Fällen, wenn eine antikörperbestückte Spitze mit einem gebundenen Antikörper auf einem 3 nm Verbinder über ein Antigen-Objekt auf einer gescannten Fläche, welches 40 bis 60 ms auf der Zeitachse überspannt, hinwegfährt. Bei 205 bindet der Antikörper, was eine Verringerung der Peak-Amplitude beim Aufschwung der Sonde bzw. dem nach oben gerichteten Anteil der Schwingung der Sonde bewirkt. Bei 206 wird die Servosteuerung aktiv und zieht die Probe von der Sondenspitze weg. Dies führt dazu, daß die negative Peak-Amplitude noch negativer wird. Die in 12B aufgenommene offenkundige Auslenkung hat nichts zu tun mit der Verschiebung der Probe, ein Ereignis, welches eine vernachlässigbare bzw. unerhebliche Änderung in der Biegung des Cantilevers verursacht. Der Amplitudenverlust stammt vielmehr vom oberen Abschnitt der Schwingung. Die Servosteuerung setzt den Bodenabschnitt wieder auf seine vorangegangene negative Amplitude zurück. Bei 207 trifft die Sondenspitze auf die Probe, was die Amplitude der unteren Schwingung bzw. die untere Schwingungsamplitude verringert. Bei 208 wird die Servosteuerung erneut aktiv und zieht die Probe weiter weg von der Sondenspitze. Bei 209 erreicht die Sondenspitze den Rand des Objekts, wobei die untere Amplitude des Auslenkungssignals erhöht wird. Bei 210 wird die Servosteuerung erneut aktiv und drückt die Probe in Richtung zur Sondenspitze, um die untere Amplitude wiederherzustellen. Bei 211 löst sich der Antikörper von der Sondenspitze, und bei 212 wirkt die Servosteuerung, um die Probe zum Kompensieren von der Sondenspitze weg zu ziehen.
12C zeigt den absoluten Wert der Peak-Amplitude. Er sinkt, wenn die Sonde über dem Antigen der gescannten Fläche steht, weist jedoch Spitzen auf, wenn die Servosteuerung reagiert. Das Peak-Signal bietet eine hilfreiche Erkennung von Bindungs- und Lösungsvorgängen. Das Signal sollte jedoch um einen Drift korrigiert werden. Eine Möglichkeit, Drift zu korrigieren (ein tatsächliches Zeitsignal angenommen) ist, die Echtzeit-Point-to-Point-Abweichung des Peak-Signals zu nehmen, wie in 12C als Strichlinie dargestellt. Dieses Signal ist erst überwiegend negativ, wenn das Objekt bzw. Ziel (beispielsweise Antigen) bindet, ist Null und wird dann überwiegend positiv. Ein aus diesem Signal erzeugtes Bild würde somit den Bindungsvorgang bzw. den Fall einer Bindung als von einem schwarzen Ring auf dem Näherungsumfang und von einem weißen Ring auf der Seite des abgewandten Umfangs umringt zeigen.
13 zeigt eine Ausführungsform einer Detektorschaltung, welche das oben genannte Erfassungsschema implementiert. Mit Bezug auf 13 wird das gleichstromgekoppelte Auslenkungssignal 301 einem Rechteckwellengenerator 302 zugeführt, welcher eine Wechselstrom-Kopplung und einen Schmidt-Trigger aufweist. Dieser erzeugt eine mit dem Auslenkungssignal synchronisierten digitalen Takt 303. Der RS (reset/set) Flip-Flop teilt das Ergebnis wie gezeigt durch zwei. Die Ausgaben des Flip-Flops, Q und Q treiben analoge Schalter 304, 305, jeweils in Serie mit zwei Peak-Detektoren 306, 307 derart an, daß der positive Peak-Wert in alternatierenden Zyklen an den zwei Peak-Detektoren gehalten wird. Das fallende Ende bzw. der Rand des Q -Ausgangs erzeugt einen kurzen Verzögerungspuls 308 (klein im Vergleich mit einem Zyklus) und betreibt den Tastspeicher 309 zum Speichern der Differenz P_n+1 – P_n zwischen den Peak-Werten. Ein zweiter Verzögerungspuls 310 setzt die Peak-Detektoren zurück. Eine RC-Zeitkonstante wird zur Signalmittelung verwendet. Sie sollte vom Benutzer schaltbar sein und zwischen einem einzelnen Zyklus und ein paar Zyklen derart abdecken, daß servo-bezogene Diskontinuitäten geglättet werden (d. h. eine Zeitkonstante zwischen 0,1–10 ms in 5 Schritten).
In wiederum einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform schafft die Erkennungsbildschaltung sowohl topographische als auch Erkennungsbild-Signale für ein MFRM. Wie in 14 dargestellt ist, wird das Roh-Auslenkungs-Signal vom Detektor (beispielsweise 42 in 11) durch einen Low-Pass-Filter 101 zu einer Subtraktionsschaltung 102 gesendet, wobei der Output die Differenz zwischen dem Low-Pass gefilterten Signal und dem ungefilterten Signal ist. Eine Eigenschaft dieser Schaltung ist es, den Offset des Auslenkungssignals der oszillierenden Spitze, welcher durch Drift und andere Faktoren verursacht ist, zu beseitigen. Die Zeitkonstante (RC) des Low-Pass-Filters ist bzw. wird somit auf einen Wert festgesetzt, welcher mit der Zeit vergleichbar ist, welche zum Scannen einer Linie im Mikroskop aufgewandt wird (beispielsweise von etwa 0,1 bis etwa 1,0 Sekunden).
Das Roh-Auslenkungs-Signal weist eine Sinuswelle entsprechend der Oszillation der Sondenspitze auf, überlagert von einem fluktuierenden Gleichstrom-Level, welches mit lokalen Änderungen in der Umgebung assoziiert ist. Auf der Ausgangsseite des Low-Pass-Filters 101 und der Subtraktionsschaltung 102 weist das Signal nur das Sinuswellensignal auf, welches um etwa Null Volt oszilliert. Die Schaltung „filtert” somit die langsame Komponente der Veränderung im Roh-Auslenkungs-Signal heraus und läßt jedoch den absoluten Gleichstrom-Wert des Signals intakt. Die Verwendung einer Kapazität an diesem Punkt der Schaltung würde die Wellenform entstellen.
Dieses gefilterte oder stabilisierte Signal wird nun an eine Peak-Detektorschaltung 103 geleitet. Eine Peak-Detektorschaltung registriert das erreichte Peak-Level mittels der Eingangsspannung. Es ist jedoch wünschenswert, die Veränderung in der Peak-Spannung von Zyklus zu Zyklus zu registrieren, da diese Änderung mit dem Erkennungssignal korrespondiert. Das stabilisierte Signal wird an einen Komparator 105 übermittelt, um aus dem Sinuswelleneingang des stabilisierten Signals ein digitales Signal zu erzeugen. Die Schwellenwertspannung, bei welcher der Komparator anspricht, sollte so angesetzt sein, daß Schaltungsrauschen keinen Output begünstigt bzw. triggert. Ist die Schwellenwertspannung jedoch zu hoch angesetzt, so triggert die Eingangssinsuswelle des stabilisierten Signals den Komparator nicht.
Um eine Erkennungsbildgebung zu erhalten, muß die Oszillationsamplitude der Sondenspitze gleich der Länge des flexiblen Verbinders sein, welcher zum Halten des Antikörpers (oder eines anderen Erkennungselements) an der Spitze verwendet wird. Dies schreibt wiederum die Amplitude des stabilisierten Auslenkssignals vor, welches am Komparator 105 ankommt, vorausgesetzt, daß die elektronische Zunahme vor dieser Stufe bzw. Stadium für jede ausgewählte, zu scannende Probe feststeht. Wir haben herausgefunden, daß durch Einstellen der Schwellenwertspannung zum Triggern des Komparators 105 auf etwa 10 bis etwa 70 Prozent des positiven Teils des stabilisierten Signals ein brauchbares Erkennungsbildgebungs-Signal erzeugt wird. Beträgt der oszillierende Teil des stabilisierten Auslenkungssignals 1 Volt von Peak-to-Peak am Eingang zum Komparator 105, dann sollte die Schwellenwertspannung auf 0,1–0,7 V und vorzugsweise auf 0,25–0,34 V eingestellt sein bzw. werden.
Die digitalen Wellenformen, welche vom Komparator 105 kommen, steuern eine duale D-Typ Flip-Flop-Schaltung 106 an. Diese Anordnung verursacht ein Pulsieren des Ausgangs Q1, wenn das Auslenkungssignal die Schwellenwertspannung passiert bzw. übersteigt, welche hinauf geht, und ein Pulsieren des Ausgangs Q2, wenn das Auslenkungssignal die Schwellenwertspannung, welche nach unten geht, passiert bzw. überschreitet. Diese Signale (Q2 ist auf Linie 107 und Q1 ist auf Linie 108 gezeigt) werden einem Rückstellsignal am positiven Peak-Detektor 103 und dem Registriersteuerungseingang einer Registrierspeicherschaltung 104 zugeführt. Somit wird in einem Zyklus der Ausgang des positiven Peak-Detektors 103 gesampelt bzw. registriert und dann mittels der Registrierspeicherschaltung 104 gehalten. Im nächsten Zyklus wird der positive Peak-Detektor 103 zurückgestellt. Er wird dann wieder im darauffolgenden Zyklus registriert.
Die Folge ist, daß der Wert des positiven Peaks in jedem anderen Zyklus am Ausgang der Registrierspeicherschaltung 104 angezeigt wird. Dies ist das Erkennungssignal. Die Registrier- und Rückstellvorgänge erzeugen ein gewisses Maß an hochfrequentem Rauschen, so daß das Erkennungssignal dann durch einen Low-Pass-Filter 109 zum Erzeugen eines endgültigen Erkennungssignals 110 geschickt werden kann, welches dann einem zusätzlichen bzw. Hilfs-Anzeigekanal des Mikroskop-Controllers (nicht gezeigt) zugeführt wird. Dieser zweite Low-Pass-Filter 109 wird typischerweise eingestellt um Frequenzen entsprechend der Dauer des Erkennungssignals passieren zu lassen, höhere Frequenzen jedoch abzuschneiden. Erstreckt sich das Erkennungssignal über 1% des Linienscans des Bildes, und beträgt die Linien-Scangeschwindigkeit 0,1 Sekunden, so würde der Filter somit eingestellt werden, um Signale unter etwa 1,0 kHz (1/(0.1 × 0.001)) passieren zu lassen.
Eine parallele Schaltung mit einem Negativ-Peak-Detektor 111, einer Registrierspeicherschaltung 112 und einem Filter 113 erzeugt ein Signal entsprechend der Bodenamplitude des Auslenksignals. Die Bodenamplitude könnte zur Steuerung des Betriebs des Mikroskops verwendet werden. In der Praxis kann jedoch eine bessere Performance erzielt werden, wenn das Roh-Auslenksignal zum Steuern der Servo-Rückführ-Schleife der Probenhöhe des Mikroskops auf die für die AFM-Bildgebung übliche Weise verwendet wird. Die Gesamtamplitude des Signals kann alternativ zur Steuerung für die Rückführ-Regelungsschleife verwendet werden. In diesen Fällen kann das Bodenpeaksignal 114 als ein diagnostisches Werkzeug genutzt werden. Beim normalen Betrieb sollte das Bodenpeaksignal 114 das „Auslenkungs”- oder „Fehler”-Signal widerspiegeln, welches durch Anzeigen der Amplitude des Auslenksignals erhalten wird, ein Signal, welches üblicherweise im Mikroskopcontroller verfügbar ist. Ein geregelter Betrieb des Mikroskops kann durch die Überprüfung bzw. Kontrolle, daß der Bodenpeak-Signalausgang 114 und das Mikroskopfehlersignal aufeinander folgen, überwacht werden.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wurden bezüglich der Amplitudenänderungen, welche an Erkennungsstellen auftreten, bezogen auf harte Flächen dargestellt. Die vorliegende Erfindung ist auch bei der Durchführung von MRFM an weichen Flächen nützlich. 15 faßt eine graphische Darstellung der Oszillationsamplitude zusammen, wenn eine oszillierte Probe einer harten Fläche (durchgehende Linie) genähert wird und dann nach einem Erkennungsfall (beispielsweise eine Antikörperbindung – gestrichelte Linie) zurückgezogen wird. Die gestrichelte horizontale Linie (4) zeigt die Verringerung der Festwertamplitude, bei bzw. unter welcher das Mikroskop arbeitet.
Vor einem Bindungsfall ruht die Sondenspitze unter einer mittleren Distanz Z1 entfernt von der Fläche bzw. Oberfläche der Probe. Ein Bindungsfall verursacht einen Abfall in der Gesamtoszillationsamplitude aufgrund der Verringerung des oberen Teils der Schwingung. Die steile Zunahme der Gesamtamplitude beim Wegdrücken von einer harten Fläche (der Abschnitt der bei 1 gezeigten Kurve) kompensiert den Amplitudenverlust aufgrund der Bindung mit einer nur kleinen Bewegung der Sonde weg von der Fläche. Der neue Arbeitspunkt des Mikroskops (Distanz Z2) wird somit an einem Punkt (beispielsweise Z2) festgelegt, welcher sicher innerhalb des Bereichs liegt, in welchem der Antikörper gebunden bleibt (d. h. bevor die Bindung wie in 3 gezeigt bricht.)
Im Falle, daß die Probe wie in 15B gezeigt eine weiche Fläche wie eine Zellmembran oder ein weiches Polymer ist, ist die Amplitudenzunahme mit der Distanz, um welche von der Fläche wegbewegt wird, wesentlich kleiner (d. h. die Steigung der Kurve im Bereich 5). Die gestrichelte Linie 6 zeigt wiederum den Sollwert, und der Betriebsabstand in Abwesenheit einer Bindung beträgt Z1. Kommt nun eine Bindung zustande, so muß sich die Sondenspitze wesentlich weiter von der weichen Fläche entfernen bzw. wegbewegen, um sich von einem gegebenen Maß an Schwächung bzw. Dämpfung „zu erholen”, welche beispielsweise durch Antikörperbindung verursacht ist. In solchen Fällen, in welchem die Probenfläche wesentlich weicher als die Antikörperbindung ist, findet das Wegziehen über große Distanzen so lange statt, bis die Antikörper-Antigen-Bindung vollständig ausgebrochen bzw. gelöst ist, wie bei 7 gezeigt ist, bevor ein neuer stabiler Arbeitspunkt erreicht ist. Die Sondenspitze wird an diesem Punkt erneut auf die Fläche zu gefahren, um zu der festgesetzten Amplitude bzw. Festwertamplitude 6 zurückzukehren, ohne daß eine erneute Bindung eine Wiederholung des Zykluses verursacht.
Im Falle einer weichen Fläche ist ein Erkennungsfall daher durch eine Reihe von Spitzen bzw. Zacken in der Amplitude gekennzeichnet. Da die Position der Sondenspitze während eines Erkennungsfalles nicht stabil ist, ist es nicht mehr möglich, ein wahres Topographiesignal zu erhalten. Die große Amplitudenserie von Zacken dient nichtsdestotrotz als Basis zum Erkennen eines Erkennungsfalls durch Überwachen des Auslenkungssignals, wenn die Probe gescannt wird.
Der Fachmann erkennt, daß die vorliegende Erfindung ein sehr schnelles Screening-Verfahren für molekulare Erkennungsbildgebung ermöglicht. Das Augenmerk liegt hierbei bei einer AFM-Cantilever-Sondenspitze unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren (beispielsweise die Verwendung der heterobifunktionalen Links bzw. Verbinder wie von Hinterdorfer et al. (1996) gezeigt). Die betrachteten Liganden werden in Vertiefungen von Mikrotüpfelplatten bzw. Mikrotiter-Wells (welche mittels nanolithopraphischen Dip-Pen-Verfahren gedruckt sein können) als ein dicht gepacktes Array auf einem bildgebendem Substrat angeordnet. Dieses Array wird unter Registrierung des Erkennungssignals als ein Marker der Bindungsstärke abgebildet, wobei gleichzeitig die Topographie als ein Index derart registriert wird, daß Erkennungssignale mit bestimmten Vertiefungen assoziiert werden können.
Das Verfahren kann alternativ zum Überprüfen bzw. Screenen der Effektivität verwendet werden, mit welcher bestimmte Ligandenstellen an kranken Zellen binden. Der Ligand wird an die Cantilever-Sondenspitze gebunden, und Zellflächen werden gescannt. Ein Vergleich zwischen den Erkennungssignalen an gesunden und normalen Zellen zeigt die Unterscheidung des Liganden für erkrankte Zellen zusätzlich zur Lokalisierung des spezifischen Ortes von Bindungsstellen auf den kranken Zellen auf.
Die Erfindung wurde mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen gemacht, es ist offensichtlich, daß sie auf verschiedene Weisen abgeändert werden kann. Solche Variationen bzw. Abänderungen werden nicht als Abweichung vom Geist und Umfang der Erfindung angesehen, und alle solchen Modifikationen, welche für Fachleute offensichtlich sind, gelten als vom Umfang der Erfindung umfaßt.

Claims

Raster-Kraftmikroskop zum Feststellen von Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einem nachzuweisenden Medium (32) auf einer gescannten Fläche (34) einer Probe, welches aufweist: eine Tastsonde mit einer Spitze (30), welche gegenüber einer Eigenschaft der Fläche (34) empfindlich ist, wobei die Sonde geeignet ist, um mit einem mechanischen Q-Faktor von 20 oder weniger zu oszillieren; eine Einrichtung (40, 42) zum Erfassen der Auslenkung der Sondenspitze (30) als eine Funktion der Zeit, wobei die Amplitude der nach oben gerichteten Auslenkung und die Amplitude der nach unten gerichteten Auslenkung der Sondenspitze (30) gemessen und erfasst werden; eine Einrichtung (50) zum Aufnehmen sowohl topographischer Bilder als auch der räumlichen Anordnung von Wechselwirkungen zwischen der Sonde und einem oder mehreren nachzuweisenden Medien (32) auf der Fläche (34) der Probe; eine Rückführ-Steuerung (60) zum Steuern der Höhe der Sonde zum Bestimmen der Topographie der Probe unter Verwendung des Wertes der nach unten gerichteten Auslenkung; und eine Einrichtung (50) zum Bestimmen des Wertes der nach oben gerichteten Auslenkung aus der nach oben gerichteten Amplitude und dem Mittelwert der Auslenkung zur Erzeugung eines den Interaktionen bzw. Wechselwirkungen zwischen der Sondenspitze (30) und dem nachzuweisenden Medium (32) auf der gescannten Oberfläche (34) entsprechenden Signals.
Mikroskop nach Anspruch 1, bei welchem die Einrichtung zum Erfassen der Auslenkung der Sondenspitze (30) als eine Funktion der Zeit eine Quelle (40) einer auf die Sonde gerichteten Strahlung, einen positionsempfindlichen Detektor (42), welcher die von der Sonde reflektierte Strahlung erfasst, und einen Controller (60), welcher die erfasste Strahlung verarbeitet, aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 1 bei welchem die Einrichtung (50) zum Aufnehmen sowohl topographischer Bilder als auch der räumlichen Anordnung von Bindungsfällen zwischen der Sonde und den nachzuweisenden Medien (32) eine Schaltungsanordnung aufweist, welche getrennte topographische Signale und Erkennungssignale erzeugt.
Mikroskop nach Anspruch 1, bei welchem die Sondenspitze (30) mit einem Nachweismedium sensibilisiert ist, welches speziell an das nachzuweisende Medium (32) bindet.
Mikroskop nach Anspruch 4, wobei das Nachweismedium ein Antikörper ist.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei der Antikörper mittels eines flexiblen Quervernetzers verbunden ist.
Mikroskop nach Anspruch 4, wobei das Nachweismedium mittels eines flexiblen Quervernetzers verbunden ist.
Mikroskop nach Anspruch 1, bei welchem die Sonde ein magnetisches Material umfasst, und wobei das Mikroskop ferner ein über die Zeit variierendes Magnetfeld aufweist, welches geeignet ist, um die Sonde in Bewegung zu versetzen.
Mikroskop nach Anspruch 1, welches eine elektronische Schaltung zum Trennen der topographischen Signale und der Erkennungssignale aufweist, wobei die Schaltung aufweist: eine Einrichtung zum Bestimmen des mittleren Wertes der Auslenkung der Sonde auf einer Zeitskala, welche ausreichend lang verglichen mit den durch Topographie oder Bindungsfälle verursachten Änderungen derart ist, dass solche Fälle einzeln erkannt werden; eine Einrichtung zum Verwenden des mittleren Werts der Auslenkung, um die nach unten gerichtete Amplitude der Sonde aus der Differenz zwischen dem mittleren Wert und dem Wert der nach unten gerichteten Auslenkung zu bestimmen; eine Einrichtung zum Steuern der Höhe der Sonde, wodurch die Topographie unter Verwendung des Wertes der nach unten gerichteten Auslenkung der Sonde bestimmt wird; und eine Einrichtung zum Bestimmen des Wertes der nach oben gerichteten Auslenkung der Sonde aus der nach oben gerichteten Amplitude und des mittleren Wertes der Auslenkung, um ein Signal zu erzeugen, welches Wechselwirkungen zwischen der Sonde und dem nachzuweisenden Medium (32) auf der gescannten Fläche (34) entspricht.
Mikroskop nach Anspruch 1, bei welchem die topographischen Bilder und die räumliche Anordnung von Bindungsfällen mittels einer elektronischen Schaltung getrennt werden, welche aufweist, eine Einrichtung zum Digitalisieren der erfassten Auslenkung der Sondenspitze (30); eine Einrichtung zum Bestimmen des mittleren Wertes der Auslenkung der Sonde auf einer Zeitskala, welche ausreichend lang verglichen mit Änderungen ist, welche durch Topographie oder Bindungsfälle verursacht sind, derart dass solche Fälle separat erkannt werden; eine Einrichtung zum Verwenden des mittleren Werts der Auslenkung, um die nach unten gerichtete Amplitude der Sonde aus der Differenz zwischen dem mittleren Wert und dem Wert der nach unten gerichteten Auslenkung zu bestimmen; eine Einrichtung zum Steuern der Höhe der Sonde, wodurch die Topographie unter Verwendung des Wertes der nach unten gerichteten Auslenkung der Sonde bestimmt wird; und eine Einrichtung zum Bestimmen des Wertes der nach oben gerichteten Auslenkung der Sonde aus der nach oben gerichteten Amplitude und des mittleren Wertes der Auslenkung, um ein Signal zu erzeugen, welches Wechselwirkungen zwischen der Sonde und dem nachzuweisenden Medium (32) auf der gescannten Fläche (34) entspricht.
Verfahren zum Betreiben eines Raster-Kraftmikroskops, welches umfasst: Scannen einer Sonde mit einer Spitze (30), welche für eine Eigenschaft einer Fläche (34) einer Probe empfindlich ist, über eine Fläche (34), während die Sonde mit einem Q-Faktor von 20 oder weniger oszilliert wird; Erfassen der Auslenkung der Sondenspitze (30) als eine Funktion der Zeit, wobei die Amplitude der nach oben gerichteten Auslenkung und die Amplitude der nach unten gerichteten Auslenkung der Sondenspitze (30) gemessen und erfasst werden; gleichzeitiges Erfassen sowohl topographischer Bilder als auch der räumlichen Anordnung von Wechselwirkungen zwischen der Sonde und nachzuweisenden Medien (32) auf der Fläche (34); Steuern der Höhe der Sonde durch eine Rückführ-Steuerung zum Bestimmen der Topographie der Probe unter Verwendung des Wertes der nach unten gerichteten Auslenkung; und Bestimmen des Wertes der nach oben gerichteten Auslenkung aus der nach oben gerichteten Amplitude und dem Mittelwert der Auslenkung zur Erzeugung eines den Interaktionen bzw. Wechselwirkungen zwischen der Sondenspitze (30) und dem nachzuweisenden Medium (32) auf der gescannten Oberfläche (34) entsprechenden Signals.
Verfahren zum Screenen von Reagentien zum Binden an ein bestimmtes Zielmolekül, welches umfasst: Befestigen des Zielmoleküls an der Spitze (30) einer Sonde eines Raster-Kraftmikroskops nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und Scannen der Fläche (34) einer Probe durch Betreiben des Raster-Kraftmikroskops nach Anspruch 11.
Verfahren nach Anspruch 12, bei welchem potentielle Reagentien in Vertiefungen von Mikrotüpfelplatten angeordnet sind, welche auf einem Substrat in einem Array angeordnet sind.
Verfahren zum Screenen von Liganden zum Binden an einem speziellen Ziel auf einer Zellfläche (34), welches umfasst: Befestigen des Liganden an der Sondenspitze (30) eines Raster-Kraftmikroskops nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und Scannen der Zellfläche (34) durch Betreiben des Raster-Kraftmikroskops nach Anspruch 11.