WO2006021410A1 - Mikrofluidisches system zur isolierung biologischer partikel unter verwendung der immunomagnetischen separation - Google Patents

Mikrofluidisches system zur isolierung biologischer partikel unter verwendung der immunomagnetischen separation Download PDF

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channel
immunomagnetic
separation device
particles
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Jungtae Kim
Ute Steinfeld
Jörg Schuhmacher
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Kist-Europe Forschungsgesellschaft Mbh
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Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for isolating biological particles.
  • Biological particles are particles or materials on a particulate or molecular basis. These include cells, such as, for example, viruses or bacteria, but in particular also human and animal isolated cells, such as leukocytes or tumor cells, and low molecular and high molecular weight chemical compounds, such as proteins and molecules, in particular immunologically active compounds, such as antigens, Antibodies and nucleic acids or antigen-specific tetramers, such as MHC tetramers or Streptamer- re.
  • cells such as, for example, viruses or bacteria, but in particular also human and animal isolated cells, such as leukocytes or tumor cells, and low molecular and high molecular weight chemical compounds, such as proteins and molecules, in particular immunologically active compounds, such as antigens, Antibodies and nucleic acids or antigen-specific tetramers, such as MHC tetramers or Streptamer- re.
  • the present invention relates in particular to these include immunomagnetic separation techniques (IMS) for human or animal cells, automatic sample preparation techniques, and (electro) magnetic or magnetic separation techniques (EMS) and microfluidic techniques.
  • the immunomagnetic separation techniques are carried out using immunomagnetic particles.
  • Magnetic or magnetic for example ferromagnetic or superparamagnetic particles or else soft magnetic materials, such as, for example, ferrites, are understood to be immunomagnetic particles which are characterized in this way (for example by coupling with an antibody or a specific antigen) Tetramer) that they are capable of specific binding to a particular biological material or to a particular biological particle.
  • the immunomagnetic particles which are capable of binding preferably have a substantially spherical form (and are therefore also referred to below as immunomagnetic beads or antibody-coupled magnetic beads) and preferably have particle sizes of less than 100 ⁇ m.
  • certain particles for example antigens or antigen-specific tetramers or streptamers
  • T cells As tetramers, structures are described in immunology which consist of four MHC molecules and antigen. T cells bind to these structures a thousand times better than to the individual complexes. The tetramers bind to the corresponding T cell receptors. This corresponds to the T-cell mediated, secondary immune response by recognition of cell-bound anti ⁇ gene, in the form of peptides that are bound by MHC complexes on antigen-presenting cells.
  • recombinant, soluble MHC molecules can be produced and linked to a known antigen that can be tetramized by streptavidin.
  • the resulting peptide-specific tetrameric MHC molecules can be labeled with fluorescent dyes and used for measurements in the flow cytometer.
  • Frequencies of antigen-specific T cells can be identified on the basis of the tetramer technique in order to be able to make a statement about the antigens involved in a clinical picture.
  • MHC molecules sorting and analysis of, for example, T cells that recognize tumor antigens is possible.
  • Peptide MHC tetramers therefore have great therapeutic potential in the detection of antigen-specific T cells in human autoimmune diseases using the example of artritis.
  • Binding of the tetramers to particles would ensure a better binding of antigen-specific T cells to the particles, which in turn can be separated from other unbound cells due to the particles.
  • Reversible MHC peptide multimers are a new technology for the preparation and isolation of cytotoxic T lymphocytes. In contrast to the previously used tetramers, they can be detached again from the T cells and thus do not affect the function of the cells. If these particles are bound to magnetic beads, then due to an immunospecific reaction to these particles, coupled biological particles then also have magnetic, preferably superparamagnetic or ferromagnetic properties as bound biological particles. Thus, by using magnets such as electromagnets or permanent magnets, biological particles bound to magnetic particle-coupled antibodies can be separated and isolated.
  • the object of the present invention is to provide a separation apparatus operating in the flow-through method or a corresponding separation method with which an automatic and continuous isolation of biological particles is possible in a simple manner.
  • the device according to the invention uses a simple microfluidic channel with two inlets or inlet channels and two outlets or two outlet channels and one or more magnets, for example electromagnets or permanent magnets. Below a channel (this applies both to the throughflow channel and to the inlet channels opening into it and the discharge channels leading away from it), a volume through which a fluid can flow is understood below, including the wall surrounding this volume.
  • a liquid which contains various biological and / or non-biological materials (including the biological reaction to be determined via the specific immune reaction)
  • a liquid which initiates the immunomagnetic particles which are designed for specific binding to the biological material to be determined is introduced through the other inlet channel.
  • the specific binding can be achieved by the fact that the biological material to be separated by means of the immune reaction is an antigen and that the immunomagnetic particles are ferromagnetic or superparamagnetic beads which are bound to the corresponding antibody or to antigen-specific tetramers or streptamers (Anti gene antibody / tetramer / streptamer reaction).
  • the immunomagnetic particles With the aid of the first magnet (or its magnetic field or field gradient), the immunomagnetic particles now receive, in the region of the inlet channels, a velocity complex due to their ferromagnetic or superparamagnetic character. perpendicular to the flow direction.
  • the immunomagnetic particles can thereby overcome the boundary of the two laminar flows or be drawn from one liquid stream into the other liquid stream. The latter then contains the specific biological particles to be segregated to which the immunomagnetic particles bind.
  • the immunomagnetic particles bound at least partially to the biological particles to be separated are then applied by application of an oppositely directed magnetic field or field gradients retracted back into the original liquid flow.
  • the liquid stream containing the immunomagnetic particles bound to the biological material to be separated is then removed via one of the outlet channels, while the other liquid stream (which contains the remaining biological and / or non-biological materials and unbound particles of the biological material to be separated) is discharged with the help of the other outlet channel.
  • the immunomagnetic particles are thus introduced separately to the liquid containing biological particles to be separated, then change from their liquid stream into the adjacent liquid stream of the biological materials for a certain period of time, where they bind to the biological particles to be separated and are then drawn back into their original stream with the aid of the second magnetic field with the biological particles bound to them.
  • the liquid containing the unbound biological particles and other biological materials is then removed via one outlet or discharge channel, while the bound and thus isolated biological particles can be discharged from the other outlet.
  • the device according to the invention can be provided with a reaction chamber.
  • the latter is arranged on the flow-through channel on the side of the liquid stream containing the biological materials or of the first magnet and serves to prolong the time required for this liquid flow to flow through the flow-through channel.
  • the reaction chamber is arranged in the flow direction between the two magnets, resulting in an increased residence time of the immunomagnetic particles drawn into the stream, and thus a higher probability of binding of the immunomagnetic particles to the specific biological material.
  • the immunomagnetic separation device described above has a number of advantages:
  • the device allows a simple Isola ⁇ tion, without additional mixing, incubation and washing steps, which would otherwise have to be performed by hand and therefore zeitauf ⁇ maneuverable and require additional fluids er ⁇ .
  • With the device an automatic and continuous particle isolation or separation is possible, with only small or no amounts of buffer, transport and / or
  • Dilution liquid are necessary. Sample dilution solutions and extra buffer solutions are thus not necessary in the present device.
  • the bound biological particles can thus be isolated and separated from the original mixed biological material without additional wash-out processes.
  • the separated biological particles are obtained via a separate Abnaturalka ⁇ channel.
  • the antibody-coupled magnetic particles or immunomagnetic particles can be fed directly to their associated inlet channel without additionally requiring a premixing step or an incubation step.
  • the device may be provided with an automatic control device for controlling the magnetic field strengths or magnetic field gradients.
  • the device can also be provided with a control device which regulates the control of the flow rate in the flow channel or the quantities of liquid flowing through per unit time.
  • the regulation of the flow rate or the quantity of liquid flowing through per unit time can also be effected by means of suitable control devices in the region of the inlet channels and / or outlet channels.
  • the device according to the invention can be used as a medical diagnostic system inside or outside the human or animal body.
  • the device according to the invention can also be used for therapeutic purposes, e.g. for isolating certain cell types from blood or patient tissue and the like.
  • the device can thus be particularly implantable and enable continuous separation or measurement processes.
  • these and their control electronics can be manufactured integrated and thus have a size which is suitable for implantation, and are manufactured in a cost-efficient manner.
  • the device according to the invention is used outside the human or animal body, it can be designed as a laboratory device.
  • the laboratory device can then be used for cell separation, e.g. from blood samples, mixed cell populations (e.g., from patient tissue), or from cells having particular characteristics (e.g., certain surface markers or physiological conditions).
  • FIG. 1 shows a first immunomagnetic separation device according to the invention
  • FIG. 2 shows a second immunomagnetic separation device according to the invention with a reaction chamber
  • FIG. 3 shows a third immunomagnetic separation device according to the invention.
  • FIG. 4 shows a further fourth immunomagnetic separation device according to the invention.
  • FIG. 1 shows an immunomagnetic separation device.
  • FIG. 1 shows a section through an immunomagnetic separation device according to the invention in a central plane running through the center of gravity of the device.
  • the device has a microfluidic throughflow channel 5 with a junction E and a discharge region A arranged downstream thereof.
  • a first inlet channel 1 and a second inlet channel 2 open into the throughflow channel 5.
  • the second inlet channel opens in the direction of the flow direction through the throughflow channel 5.
  • two discharge channels 3 and 4 lead away from the flow channel 5.
  • the diameter of the inlet channels 1, 2 and the discharge channels 3, 4 perpendicular to the respective through-flow direction is approximately half of the
  • a first electromagnet 6 arranged an ⁇ . Downstream of this first electromagnet 6 and immediately upstream of the discharge area A, a second solenoid 7 is also outside the flow channel 5 and laterally next to the
  • Throughflow channel 5 is arranged.
  • the two electromagnets 6 and 7 are arranged on different sides, in the present case on opposite sides of the flow channel 5.
  • the two electromagnets 6 and 7 can also be integrated at least partially into the wall 5a of the flow channel 5. In this case, the two electromagnets 6 and 7 are then integrated on substantially opposite sides in the wall 5a of the flow channel 5. However, it is also possible to arrange the two electromagnets 6 and 7 completely within the flow channel 5 or within the wall 5a of the flow channel 5 in the volume of the flow channel 5 enclosed by the wall 5a. The two electromagnets 6 and 7 are then also disposed within the flow channel 5 substantially on opposite sides of the flow channel (this is preferably done in the wall region of the flow channel or even so that the Electromagnets 6 and 7 auf ⁇ sets on the channel inner wall or be attached there).
  • the electromagnet 6 can be arranged completely outside the wall 5a of the channel, while the electromagnet 7 is located on the opposite side Side of the flow channel 5 is integrated in the wall or within the channel on the opposite side of the In ⁇ nenober simulation the wall 5a is placed.
  • the inlet channels 1, 2, the discharge channels 3, 4, the fürstr ⁇ mungskanal 5 and the two electromagnets 6 and 7 are arranged in the present case in a plane.
  • the conditions in the flow channels are designed such that due to sufficiently small diameters of the inlet channels, outlet channels and the flow channel and due to sufficiently small flow velocities, two liquid streams or liquid layers sliding one above the other can form, without each other to swirl (laminar flow). If, therefore, a different biological particle 11, 12 containing mixed liquid 9 is introduced through the first inlet channel 1 and a liquid 10 containing immunomagnetic particles 8 passes through the second inlet channel 2, then the two introduced liquid streams do not mix (except for diffusion processes), but slide in the direction of the discharge area A as separate liquid layers parallel to each other. The first liquid flow of the mixing liquid 9 then becomes without mixing with the second liquid stream 10 of the immunomagnetic particles 8, discharged via the first discharge channel 3. The second liquid stream 10 correspondingly via the second discharge channel 4.
  • the liquids flowing through have such a low Reynolds number that the flow conditions in the throughflow channel 5 can be regarded as laminar.
  • inertial effects which cause turbulence and secondary currents or vortices are negligible and mixing is possible only on the basis of diffusion processes.
  • the micro-flow channel 5 has a width of 0.1 to 0, 3 mm and a height of 0.1 to 0.2 mm (rectangular flow channel, width and height perpendicular to the longitudinal direction or to the flow direction).
  • the mixed liquid 9 contains further biological (or else other) particles 12, from which the particles 11 to be separated are to be separated.
  • further particles 12 do not have to be present, so that the present invention can also be used to change the concentration of the particles 11 to be separated in the liquid stream 9.
  • Liquid stream 9 drawn the mixed liquid.
  • the immunomagnetic particles 8 thus mix with the particles 11, 12 present in the mixed liquid stream 9, and can thus bind to the particles 11 to be separated by the specific antigen-antibody reaction (this results in combined or bound particles 13, which in each case at least one immunomagnetic particle 8 and a biological particle 11 have).
  • the field strength or the gradient strength of the electromagnet 6 can be controlled or adjusted such that the forces generated are just sufficient to draw the immunomagnetic particles 8 from the second liquid stream 10 into the first liquid stream 9.
  • the magnetic field of the electromagnet 6 (this also applies to the electromagnet 7) can be pulsed or si- be modulated nusförmig.
  • the immunomagnetic particles then flow freely with a balanced ratio between the flow velocity in the flow direction and the velocity induced perpendicularly thereto by the magnetic field.
  • the immunomagnetic particles 8 After the immunomagnetic particles 8 have been drawn into the first liquid stream of the mixed liquid 9, they combine, as already described, by an immunospecific reaction with the biological particles 11 to be separated to form the bound particles 13. Das Schmalheit °. the small cross-sectional area of the micro-flow channel 5 (sufficiently small diameter) and sufficiently low flow rates through the
  • Throughflow channel 5 increase the probability that the individual immunomagnetic particles 8 bind to the associated biological particles 11 (increase in the time available for the immune reaction).
  • the second electromagnet 7 On the downstream side of the first electromagnet 6, the second electromagnet 7 is now arranged on the side of the flow channel 5 opposite this magnet, immediately before the discharge area A. With the aid of this second electromagnet 7, the bound particles 13 and also immunomagnetic particles 8, which have not been bound to biological particles 11 on the flow path between the electromagnet 6 and the electromagnet 7, will flow again from the first liquid flow 9 over the liquid flow limit the second liquid stream 10 is withdrawn. This is done via an electromagnetic field or a field gradient of the electromagnet 7, which is opposite to the field or gradient of the first electromagnet 6. is directed. The immunomagnetically bound or labeled biological particles 13 and the unbound immunomagnetic particles 8 or the second liquid flow 10 are then discharged via the second discharge channel 4. The first liquid stream 9 or the remaining unbound biological particles 11 and the other biological materials 12 are conducted off via the first discharge channel 3. The (bound) biological particles 11 and 13 have thus been separated from the other biological Mate ⁇ materials 12.
  • FIG. 2 shows an immunomagnetic separation device whose basic structure corresponds to the separation device shown in FIG.
  • the through-flow channel 5 has a bulge (reaction chamber) 14 arranged on the side of the first electromagnet 6.
  • the flow-through channel 5 is integrally formed with the reaction chamber 14.
  • the reaction chamber 14 can also be realized as a separate component at a corresponding opening in the flow channel 5.
  • the reaction chamber 14 has an ⁇ -shaped cross-section.
  • a T-shaped flow breaker 15 in the throughflow channel 5 is arranged in the illustrated section.
  • the flow breaker 15 is arranged in the direction of flow at the level of the chamber 14 in such a way that it only engages in the first liquid flow of the mixing liquid 9 and deflects this liquid flow into the reaction chamber 14.
  • Flow breaker 15 and the reaction chamber 14 best- The reaction device is the path of the first liquid flow 9 through the flow channel
  • the residence time of the first liquid stream 9 in the flow channel 5 is increased in proportion to the volume of the reaction chamber 14.
  • an increased contact efficiency or an extension of the time available to the immunomagnetic particles 8 for binding to the specific biological particles 11 is given.
  • the probability that an immune reaction takes place or that the immunomagnetic particles 8 bind is thus increased.
  • the separation efficiency is thus increased by the increased immune reaction efficiency of the device.
  • the presented reaction chamber 14 causes high flow velocity gradients and a good micro-mixing of the first liquid stream 9. This also increases the probability of binding of the immunomagnetic particle 8. Decisive here is that the reaction device 14, 15 in
  • FIG. 3 shows a further separation device according to the invention which is configured as much as that in FIG.
  • a partition wall 17 which separates the two liquid streams which are fed through the inlet channel 1 and the inlet channel 2 of the separation device from one another , So it is only in the Region E of the two inlets 1 and 2 possible that the magnetic particles due to the magnetic force exerted by the Mag ⁇ 6 magnetic force from one liquid flow in the other change and the same change in the reverse direction in the area A er ⁇ follows. No further mixing of the liquid streams can take place between these two regions E and A, so that only an attachment between the immunomagnetic particle and the particle with antigens takes place in this region.
  • FIG. 4 shows a further separation device according to the invention.
  • the supply of immunomagnetic particles 11 takes place via an inlet channel 2 and the supply of the sample via an inlet channel 1, which communicate with each other in an area designated E, so that there due to an applied magnetic field Fmag the immunomagnetic particles 11 can pass into the sample ,
  • the generated magnetic field Fmag is represented by an arrow.
  • the sample with the immunomagnetic particles 11 is then guided in a spiral 18 over a long distance, so that there the immunomagnetic particles 11 can be coupled to antigens 8.
  • the spiral 18 is then returned again and hits in one area

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vor­richtung und ein Verfahren zur Isolation biologischer Partikel. Diese Vorrichtung weist einen Durchströ­mungskanal (5) sowie ein erstes und zweites Magnetfeld sowie zwei Einlasskanäle (1, 2) und zwei Auslasskanäle (3, 4) auf. Das erste Magnetfeld ist stromabwärts des Einmündungsbereichs der Einlasskanäle seitlich des Durchströmungskanals (5) angeordnet, das zweite Magnet­feld (7) stromabwärts des ersten Magnetfeldes (6) und auf der gegenüberliegenden Seite des Durchströmungskanals (5). Die beiden Magnetfelder können bei geeigneter An­ordnung auch durch einen einzigen Magneten erzeugt werden.

Description

Mikrofluidisches System zur Isolierung biologischer Partikel unter Verwendung der immunomagnetisehen
Separation
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vor¬ richtung und ein Verfahren zur Isolation biologischer Partikel. Unter biologischen Partikeln (im folgenden auch alternativ als biologische Materialien bezeich¬ net) werden Partikel bzw. Materialien auf partikulä- rer oder molekularer Basis verstanden. Hierzu gehören Zellen, wie beispielsweise Viren oder Bakterien, ins¬ besondere jedoch auch humane und tierische isolierte Zellen, wie Leukozyten oder Tumorzellen, sowie nie¬ der- und hochmolekulare chemische Verbindungen, wie Proteine und Moleküle, insbesondere immunologisch ak¬ tive Verbindungen wie Antigene, Antikörper und Nuk¬ leinsäuren oder auch antigenspezifische Tetramere, wie beispielsweise MHC-Tetramere oder auch Streptame- re . Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbeson- dere auf immunomagnetische Separationstechniken (IMS) für menschliche oder tierische Zellen, automatische Probenpräparationstechniken sowie (elektro)magne¬ tische bzw. magnetische Separationstechniken (EMS) und mikrofluidische Techniken. Die immunomagnetisehen Separationstechniken werden unter Einsatz von immuno- magnetischen Partikeln durchgeführt. Unter immuno- magnetischen Partikeln werden magnetisierbare oder magnetische, beispielsweise ferromagnetische oder su- perparamagnetische Partikel oder auch weichmagneti¬ sche Materialien, wie beispielsweise Ferrite, ver¬ standen, welche so gekennzeichnet sind (beispielswei¬ se durch Kopplung mit einem Antikörper oder einem an- tigenspezifischen Tetramer) , dass sie zur spezifi- sehen Bindung an ein bestimmtes biologisches Material bzw. an einen bestimmten biologischen Partikel fähig sind. Die zur Bindung befähigten, immunomagnetisehen Partikel haben bevorzugt im wesentlichen Kugelform (und werden daher alternativ im folgenden auch als immunomagnetische Kügelchen bzw. Antikörper¬ gekoppelte, magnetische Kügelchen bezeichnet) und weisen bevorzugt Korngrößen von weniger als 100 μm auf.
Aufgrund der unterschiedlichen Immuncharakteristiken von biologischen Partikeln können bestimmte Partikel (beispielsweise Antigene oder antigenspezifische Tetramere oder Streptamere) durch bestimmte Antikör¬ per gekennzeichnet werden bzw. an bestimmte Antikör- per gebunden werden (Immunreaktion bzw. Antigen-
Antikörper-Reaktion) .
Als Tetramere werden in der Immunologie Gebilde be¬ zeichnet, die aus vier MHC-Molekülen und Antigen be- stehen. An diese Gebilde binden T-Zellen tausend mal besser als an die einzelnen Komplexe. Die Tetramere binden dabei an die entsprechenden T-Zellrezeptoren. Dies entspricht der T-ZeIl vermittelten, sekundären Immunantwort durch Erkennung von zellgebundenen Anti¬ genen, in Form von Peptiden, die von MHC-Komplexen auf Antigen-präsentierender Zellen gebunden sind.
Inzwischen können rekombinante, lösliche MHC-Moleküle hergestellt und an ein bekanntes Antigen gebunden werden, die durch Streptavidin tetramisiert werden können. Die so entstandenen peptid-spezifischen tetrameren MHC-Moleküle können mit Fluoreszenz¬ farbstoffen markiert werden und für Messungen im Durchflusszytometer eingesetzt werden. Anhand der Tetramer-Technik können Frequenzen antigen- spezifischer T-Zellen ausgemacht werden, um somit ei¬ ne Aussage über die beteiligten Antigene in einem Krankheitsbild treffen zu können. Durch MHC-Moleküle ist das Sortieren und die Analyse von beispielsweise T-Zellen möglich, die Tumorantigene erkennen. Peptid- MHC-Tetramere besitzen daher großes therapeutisches Potential bei der Aufspürung antigen-spezifischer T-Zellen in humanen Autoimmun-Krankheiten am Beispiel der Artritis.
Eine Bindung der Tetramere an Partikel würde eine bessere Bindung von antigen-spezifischen T-Zellen an die Partikel gewährleisten, die dann wiederum auf¬ grund der Partikel von übrigen, nicht gebundenen Zel¬ len, separiert werden können.
Reversible MHC-Peptid-Multimere, sog. Streptamere, sind eine neue Technologie zur Darstellung und Iso¬ lierung von cytotoxischen T-Lymphozyten. Im Gegensatz zu den bisher verwendeten Tetrameren, können sie von den T-Zellen wieder abgelöst werden und beeinflussen somit nicht die Funktion der Zellen. Bindet man diese Partikel an magnetische Kügelchen, so haben aufgrund einer immunspezifischen Reaktion an diese Partikel gekoppelte biologische Partikel dann als gebundene biologische Partikel ebenfalls magneti¬ sche, bevorzugt superparamagnetische oder ferromagne- tische Eigenschaften. Daher können durch Verwendung von Magneten, beispielsweise Elektromagneten oder Permanentmagneten, solchermaßen an mit magnetischen Partikeln gekoppelte Antikörper gebundene biologische Partikel separiert und isoliert werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine im Durchflussverfahren arbeitende Separationsvorrichtung bzw. ein entsprechendes Separationsverfahren zur Ver¬ fügung zu stellen, mit der bzw. mit dem eine automa¬ tische und kontinuierliche Isolation biologischer Partikel auf einfache Art und Weise möglich ist.
Zur Lösung dieser Aufgabe verwendet die erfindungsge¬ mäße Vorrichtung einen einfachen mikrofluidischen Ka¬ nal mit zwei Einlassen bzw. Einlasskanälen und zwei Auslässen bzw. zwei Auslasskanälen sowie ein oder mehrere Magnete, beispielsweise Elektromagnete oder Permanentmagnete. Unter einem Kanal (dies gilt sowohl für den Durchströmungskanal als auch für die in ihn einmündenden Einlasskanäle und die aus ihm wegführen¬ den Abführkanäle) wird im Folgenden ein von einem Fluid durchströmbares Volumen samt der dieses Volumen umgebenden Wandung verstanden.
Durch den ersten Einlasskanal wird eine Flüssigkeit, welche verschiedene biologische und/oder auch nicht biologische Materialien (inklusive der über die spe- zifische Immunreaktion zu bestimmenden biologischen
Partikel) enthält, in den mikrofluidischen Durchströ- mungskanal eingeleitet. Durch den anderen Einlasska¬ nal wird eine Flüssigkeit, welche die immunomagneti- schen Partikel, die zur spezifischen Bindung an das zu bestimmende biologische Material ausgebildet sind, eingeleitet. Die spezifische Bindung kann dadurch er¬ reicht werden, dass das mittels der Immunreaktion zu separierende biologische Material ein Antigen ist und dass die immunomagnetisehen Partikel ferromagnetische oder superparamagnetische Kügelchen sind, welche an den entsprechenden Antikörper oder an antigenspezifi- sche Tetramere oder Streptamere gebunden sind (Anti- gen-Antikörper/Tetramer/Streptamer-Reaktion) .
Die rheologischen Eigenschaften der beiden Flüssig- keiten sowie die geometrischen Verhältnisse (insbe¬ sondere die Querschnittsflächen der beiden Einlasska¬ näle sowie die Querschnittsfläche des Durchströmungs- kanals) sind nun so ausgebildet, dass die durch die beiden Einlasskanäle zugeführten Flüssigkeitsströme sich im Durchströmungskanal nicht vermischen (bis auf
Diffusionsprozesse) . Dies kann auch dadurch erreicht werden, dass zwischen dem Bereich der Einlasskanäle und dem Bereich der Auslasskanäle im Durchströmungs- kanal eine Trennwand derart vorgesehen ist, dass Ie- diglich im Bereich der Einlasskanäle und im Bereich der Auslasskanäle die jeweils zugeführten bzw. abge¬ leiteten Flüssigkeitsströme sich kontaktieren. Da¬ durch werden unerwünschte Diffusionseffekte zwischen den Strömen minimiert und eine noch reinere Separati- on der abzutrennenden biologischen Partikel möglich.
Mit Hilfe des ersten Magneten (bzw. dessen magneti¬ schen Feldes oder Feldgradienten) erhalten nun im Be¬ reich der Einlasskanäle die immunomagnetisehen Parti- kel aufgrund ihres ferromagnetischen oder superpara- magnetischen Charakters eine Geschwindigkeitskompo- nenten senkrecht zur Flussrichtung. Die immunomagne- tischen Partikel können dadurch die Grenze der beiden laminaren Strömungen überwinden bzw. werden vom einen Flüssigkeitsstrom in den anderen Flüssigkeitsstrom gezogen. In letzterem befinden sich dann die zu sepa¬ rierenden spezifischen biologischen Partikel, an die die immunomagnetischen Partikel binden. Durch den ge¬ eignet angeordneten ersten Magneten oder einen weite¬ ren stromabwärts angeordneten, zweiten Magneten wer- den im Bereich der Auslasskanäle die zumindest teil¬ weise an die zu separierenden biologischen Partikel gebundenen immunomagnetischen Partikel dann durch An¬ wendung eines entgegengesetzt gerichteten Magnetfel¬ des bzw. Feldgradienten wieder in den ursprünglichen Flüssigkeitsstrom zurückgezogen. Der die an das zu separierende biologische Material gebundenen immuno¬ magnetischen Partikel enthaltende Flüssigkeitsstrom wird dann über einen der Auslasskanäle abgeführt, während der andere Flüssigkeitsstrom (welcher die restlichen biologischen und/oder nicht biologischen Materialien und ungebundene Partikel des zu separie¬ renden biologischen Materials enthält) mit Hilfe des anderen Auslasskanals abgeführt wird.
Entscheidend ist, dass im mikrofluidischen Durchströ¬ mungskanal aufgrund der dort herrschenden Verhältnis¬ se (rheologische Eigenschaften der Flüssigkeiten so¬ wie insbesondere die Querschnittsfläche des Kanals) laminare Strömungsverhältnisse vorliegen..Aus diesem Grunde vermischen sich die beiden Flüssigkeitsströme nicht bzw. nicht wesentlich. Daher überwinden im we¬ sentlichen nur die immunomagnetischen Partikel mit Hilfe des ersten magnetischen Feldes die Grenze zwi¬ schen den beiden Flüssigkeitsströmen und die gebunde- nen sowie die ungebunden verbliebenen immunomagneti¬ schen Partikel überwinden mit Hilfe des magnetischen Feldes des zweiten Elektromagneten die Grenzen der beiden Flüssigkeitsströmungen erneut in umgekehrter Richtung. Die immunomagnetisehen Partikel werden so¬ mit getrennt zu der die zu separierenden biologischen Partikel enthaltenden Flüssigkeit eingeleitet, wech¬ seln dann für eine bestimmte Zeit aus ihrem Flüssig¬ keitsstrom in den benachbarten Flüssigkeitsstrom der biologischen Materialien, binden dort an die zu sepa¬ rierenden biologischen Partikel und werden anschlie- ßend mit Hilfe des zweiten magnetischen Feldes mit den an sie gebundenen biologischen Partikeln wieder zurück in ihren ursprünglichen Strom gezogen. Die die nicht gebundenen biologischen Partikel sowie andere biologische Materialien enthaltende Flüssigkeit wird dann über den einen Auslass bzw. Abführkanal abgelei¬ tet, während die gebundenen und somit isolierten bio¬ logischen Partikel aus dem anderen Auslass abgeleitet werden können.
In einer vorteilhaften Ausgestaltungsvariante kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Reaktions- kammer versehen sein. Diese ist am Durchströmungska¬ nal auf der Seite des die biologischen Materialien enthaltenden Flüssigkeitsstroms bzw. des ersten Mag- neten angeordnet und dient der Verlängerung der Zeit, die dieser Flüssigkeitsstrom für das Durchströmen des Durchstrδmungskanals benötigt. Die Reaktionskammer ist in Strömungsrichtung zwischen den beiden Magneten angeordnet, so dass sich eine erhöhte Aufenthaltsdau- er der in den Strom gezogenen immunomagnetisehen Par¬ tikel ergibt und somit eine höhere Wahrscheinlichkeit der Bindung der immunomagnetischen Partikel an das spezifische biologische Material .
Die vorstehend beschriebene immunomagnetisehe Separa¬ tionsvorrichtung weist eine Reihe von Vorteilen auf: • Die Vorrichtung ermöglicht eine einfache Isola¬ tion, ohne zusätzliche Mischungs-, Inkubations¬ und Waschschritte, welche ansonsten per Hand durchgeführt werden müssten und daher zeitauf¬ wendig sind sowie zusätzliche Flüssigkeiten er¬ fordern. Mit der Vorrichtung ist eine automati¬ sche und kontinuierliche Partikelisolation bzw. Separation möglich, wobei nur geringe oder gar keine Mengen an Puffer-, Transport- und/oder
Verdünnungsflüssigkeit notwendig sind. Proben¬ verdünnungslösungen und extra Pufferlösungen sind somit nicht notwendig in der vorliegenden Vorrichtung. • Die gebundenen biologischen Partikel können so¬ mit ohne zusätzliche Auswaschprozesse aus der ursprünglichen, verschiedene biologische Materi¬ alien enthaltenden Mischflüssigkeit isoliert und separiert werden. Die separierten biologischen Partikel werden über einen getrennten Abführka¬ nal erhalten.
• Die antikörpergekoppelten magnetischen Partikel bzw. immunomagnetisehen Partikel können ihrem zugehörigen Einlasskanal direkt zugeführt wer- den, ohne dass zusätzlich ein Vormischungs¬ schritt oder ein Inkubationsschritt notwendig ist .
• Die Vorrichtung kann mit einer automatischen Kontrollvorrichtung zur Steuerung der Magnet- feldstärken bzw. Magnetfeldgradienten versehen sein. Die Vorrichtung kann darüberhinaus auch mit einer Regelungsvorrichtung versehen sein, welche die Steuerung der Durchflussgeschwindig¬ keit im Durchströmungskanal bzw. der pro Zeit- einheit durchströmenden Flüssigkeitsmengen re¬ gelt. Die Regelung der Durchflussgeschwindigkeit bzw. die pro Zeiteinheit durchströmende Flüssig¬ keitsmenge kann auch durch geeignete Regelungs¬ vorrichtungen im Bereich der Einlasskanäle und/oder Auslasskanäle erfolgen. Somit ist auf einfache und kontrollierte Art und Weise die
Markierung bzw. Bindung der biologischen Parti¬ kel und ihre Isolierung möglich.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann als medizini- sches Diagnosesystem innerhalb oder außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers eingesetzt wer¬ den. Auf eben solche Art und Weise kann die erfin¬ dungsgemäße Vorrichtung auch zu therapeutischen Zwe¬ cken, z.B. zum Isolieren bestimmter Zellarten aus Blut oder Patientengewebe und ähnlichem, eingesetzt werden. Die Vorrichtung kann somit insbesondere im¬ plantierbar sein und kontinuierliche Separations¬ bzw. Messprozesse ermöglichen. Insbesondere für eine implantierbare Vorrichtung können diese sowie ihre Kontrollelektronik integriert gefertigt werden und somit eine Größe aufweisen, welche zur Implantierung geeignet ist, und auf kosteneffiziente Art und Weise gefertigt werden. Wird die erfindungsgemäße Vorrich¬ tung außerhalb des menschlichen oder tierischen Kör- pers eingesetzt, so kann diese als Laborgerät ausges¬ taltet sein. Das Laborgerät kann dann zur Zellsepara¬ tion z.B. von Blutproben, gemischten Zellpopulationen (z.B. aus Patientengewebe) oder von Zellen mit be¬ stimmten Charakteristiken (z.B. bestimmten Oberflä- chenmarkern oder physiologischen Zuständen) verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann, wie in einem der beiden folgenden Beispiele dargestellt, aufgebaut sein oder verwendet werden. Es zeigt Figur 1 eine erste erfindungsgemäße immuno- magnetische Separationsvorrichtung;
Figur 2 eine zweite erfindungsgemäße immunomagneti- sehe Separationsvorrichtung mit einer Reaktionskam¬ mer;
Figur 3 eine dritte erfindungsgemäße immunomagneti- sche Separationsvorrichtung; und
Figur 4 eine weitere vierte erfindungsgemäße immuno- magnetische Separationsvorrichtung.
In den den Beispielen entsprechenden, im folgenden beschriebenen Figuren werden für gleiche oder identi¬ sche Bestandteile der Vorrichtung identische Bezugs¬ zeichen verwendet .
Figur 1 zeigt eine immunomagnetische Separationsvor- richtung. Die Figur 1 zeigt einen Schnitt durch eine erfindungsgemäße immunomagnetische Separationsvor¬ richtung in einer zentralen, durch den Schwerpunkt der Vorrichtung verlaufenden Ebene. Die Vorrichtung weist einen mikrofluidischen Durchströmungskanal 5 mit einem Einmündungsbereich E und einem stromabwärts davon angeordneten Abführungsbereich A auf. Im Ein¬ mündungsbereich E münden ein erster Einlasskanal 1 und ein zweiter Einlasskanal 2 in den Durchströmungs- kanal 5. Der zweite Einlasskanal mündet hierbei in Richtung der Strömungsrichtung durch den Durchströ¬ mungskanal 5 ein. Der erste Einlasskanal 1 mündet un¬ ter einem Winkel von α = 30° zur Durchströmungsrich¬ tung durch den Durchströmungskanal 5 ein. Im Abfüh¬ rungsbereich A führen zwei Abführkanäle 3 und 4 aus dem Durchströmungskanal 5 weg. Der Abführkanal 3 führt hierbei in Richtung der Strömungsrichtung durch den Durchströmungskanal 5 weg, der Abführkanal 4 führt unter einem Winkel von α = 30° zu dieser Rich¬ tung weg. Der Durchmesser der Einlasskanäle 1, 2 und der Abführkanäle 3, 4 senkrecht zur jeweiligen Durch- Strömungsrichtung beträgt in etwa die Hälfte des
Durchmessers des Durchströmungskanals 5 senkrecht zu dessen Durchströmungsrichtung.
Stromabwärts vom Einmündungsbereich E ist außerhalb des Durchströmungskanals 5 und seitlich neben dem
Durchströmungskanal 5 ein erster Elektromagnet 6 an¬ geordnet. Stromabwärts dieses ersten Elektromagneten 6 und unmittelbar stromaufwärts des Abführbereiches A ist ein zweiter Elektromagnet 7 ebenfalls außerhalb des Durchströmungskanals 5 und seitlich neben dem
Durchströmungskanal 5 angeordnet. Die beiden Elektro- magnete 6 und 7 sind auf unterschiedlichen Seiten, im vorliegenden Fall auf gegenüberliegenden Seiten des Durchströmungskanals 5 angeordnet.
Die beiden Elektromagneten 6 und 7 können alternativ hierzu jedoch auch zumindest teilweise in die Wandung 5a des Durchströmungskanals 5 integriert werden. In diesem Fall werden die beiden Elektromagneten 6 und 7 dann auf im Wesentlichen gegenüberliegenden Seiten in die Wandung 5a des Durchströmungskanals 5 integriert. Es ist jedoch auch möglich, die beiden Elektromagne¬ ten 6 und 7 vollständig innerhalb des Durchströmungs- kanals 5 bzw. innerhalb der Wandung 5a des Durchströ- mungskanals 5 im von der Wandung 5a umschlossenen Vo¬ lumen des Durchströmungskanals 5 anzuordnen. Die bei¬ den Elektromagneten 6 und 7 werden dann innerhalb des Durchströmungskanals 5 ebenfalls im wesentlichen auf gegenüberliegenden Seiten des Durchströmungskanals angeordnet (dies geschieht bevorzugt im Wandbereich des Durchströmungskanals oder auch so, dass die Elektromagneten 6 und 7 auf der Kanalinnenwand aufge¬ setzt bzw. dort befestigt werden) . Es ist jedoch auch möglich, jeweils eine unterschiedliche der beschrie¬ benen Varianten für den Elektromagneten 6 und den Elektromagneten 7 einzusetzen: So kann der Elektro¬ magnet 6 vollständig außerhalb der Wandung 5a des Ka¬ nals angeordnet sein, während der Elektromagnet 7 auf der gegenüberliegenden Seite des Durchströmungskanals 5 in dessen Wandung integriert ist oder innerhalb des Kanals auf der gegenüberliegenden Seite auf die In¬ nenoberfläche der Wandung 5a aufgesetzt ist.
Die Einlasskanäle 1, 2, die Abführkanäle 3, 4, der Durchstrδmungskanal 5 sowie die beiden Elektromagne- ten 6 und 7 (bzw. die entsprechenden Zentralachsen bzw. Schwerpunkte) sind im vorliegenden Fall in einer Ebene angeordnet .
Entscheidend ist nun, dass die Verhältnisse in den Strömungskanälen aufgrund ausreichend kleiner Durch¬ messer der Einlasskanäle, Auslasskanäle und des Durchströmungskanals sowie aufgrund von ausreichend kleinen Strömungsgeschwindigkeiten so ausgestaltet sind, dass sich zwei getrennt übereinander gleitende Flüssigkeitsströme bzw. Flüssigkeitsschichten ausbil¬ den können, ohne miteinander zu verwirbeln (laminare Strömung) . Wird somit durch den ersten Einlasskanal 1 eine verschiedene biologische Partikel 11, 12 enthal¬ tende Mischflüssigkeit 9 eingeleitet und durch den zweiten Einlasskanal 2 eine Flüssigkeit 10, welche immunomagnetische Partikel 8 enthält, so durchmischen sich die beiden eingeleiteten Flüssigkeitsströmungen (bis auf Diffusionsprozesse) nicht, sondern gleiten in Richtung des Abführungsbereiches A als getrennte Flüssigkeitsschichten parallel zueinander. Der erste Flüssigkeitsstrom der Mischflüssigkeit 9 wird dann ohne sich mit dem zweiten Flüssigkeitsstrom 10 der immunomagnetisehen Partikel 8 zu vermischen, über den ersten Abführkanal 3 abgeführt. Der zweite Flüssig¬ keitsstrom 10 entsprechend über den zweiten Abführka- nal 4.
Entscheidend ist also, dass im mikrofluidischen Durchströmungskanal 5 die durchströmenden Flüssigkei¬ ten eine so geringe Reynolds-Zahl aufweisen, dass die Strömungsverhältnisse im Durchströmungskanal 5 als laminar angesehen werden können. Damit sind Träg¬ heitseffekte, welche Turbulenzen und sekundäre Ströme bzw. Wirbel verursachen, vernachlässigbar und eine Vermischung ist lediglich aufgrund von Diffusionspro- zessen möglich. Um dies zu gewährleisten', besitzt in dem dargestellten Fall der Mikro-Durchströmungskanal 5 eine Breite von 0,1 bis 0, 3 mm und eine Höhe von 0,1 bis 0,2 mm (rechteckförmiger Durchströmungskanal, Breite und Höhe senkrecht zur Längsrichtung bzw. zur Durchströmungsrichtung) . Die Gesamtdurchflussrate
(geregelt über eine nicht dargestellte Regelungsvor¬ richtung) beträgt für den Mikro-Durchströmungskanal 5 zwischen 1 und 200 μl/min. Diese mikrofluidischen Strömungscharakteristika erfüllen die notwendigen Voraussetzungen für laminare Strömungsverhältnisse im Mikro-Durchströmungskanal 5. Aus diesem Grund vermi¬ schen sich die über den ersten Einlasskanal 1 einge¬ führte Mischflüssigkeit 9 und die über den zweiten Einlasskanal 2 eingeführte, die immunomagnetisehen Partikel 8 enthaltende Flüssigkeit 10 im Durchströ¬ mungskanal 5 nicht, sondern bilden zwei getrennte Strömungsschichten aus. Somit werden auch die unter¬ schiedlichen Partikel (biologische Partikel 11, 12 und immunomagnetisehe Partikel 8) eines jeden Flüs- sigkeitsstroms bei ausgeschalteten Elektromagneten 6, 7 nicht vermischt, sondern fließen kontinuierlich in ihrem jeweiligen Flüssigkeitsstrom bis zu ihrem je¬ weiligen Abführkanal 3 oder 4.
Neben den zu separierenden biologischen Partikeln 11 enthält im vorliegenden Fall die Mischflüssigkeit 9 weitere biologische (oder auch andere) Partikel 12, von denen die zu separierenden Partikel 11 getrennt werden sollen. Solche weiteren Partikel 12 müssen je¬ doch nicht vorhanden sein, so dass die vorliegende Erfindung auch zur Änderung der Konzentration der zu separierenden Partikel 11 im Flüssigkeitsstrom 9 ein¬ gesetzt werden kann. Wird nun der erste Elektromagnet 6 aktiviert, so werden die immunomagnetisehen Parti¬ kel 8 einem elektromagnetischen Feld bzw. Feldgra- dienten unterworfen, welcher eine Kraft senkrecht zur Durchströmungsrichtung durch den Durchströmungskanal 5 und in Richtung auf den ersten Elektromagneten 6 hin ausübt. Hierdurch werden die immunomagnetisehen Partikel 8 aus ihrem zweiten Flüssigkeitsstrom 10 über die Flüssigkeitsstromgrenze hinweg in den ersten
Flüssigkeitsstrom 9 der Mischflüssigkeit gezogen. Die immunomagnetisehen Partikel 8 vermischen sich damit mit den im Mischflüssigkeitsstrom 9 befindlichen Par¬ tikeln 11, 12, und können somit durch die spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion an die zu separierenden Partikel 11 anbinden (so entstehen kombinierte bzw. gebundene Partikel 13, welche jeweils mindestens ei¬ nen immunomagnetisehen Partikel 8 und einen biologi¬ schen Partikel 11 aufweisen) . Die Feldstärke bzw. die Gradientenstärke des Elektromagneten 6 kann so kon¬ trolliert bzw. eingestellt werden, dass die erzeugten Kräfte gerade ausreichen, um die immunomagnetisehen Partikel 8 vom zweiten Flüssigkeitsstrom 10 in den ersten Flüssigkeitsstrom 9 zu ziehen. Das magnetische Feld des Elektromagneten 6 (dies gilt ebenso für den Elektromagneten 7) kann hierbei pulsförmig oder si- nusförmig moduliert werden. Die immunomagnetisehen Partikel fließen dann frei mit einem ausgeglichenen Verhältnis zwischen der Strömungsgeschwindigkeit in Durchströmungsrichtung und der senkrecht dazu durch das magnetische Feld induzierten Geschwindigkeit.
Nachdem die immunomagnetischen Partikel 8 in den ers¬ ten Flüssigkeitsstrom der Mischflüssigkeit 9 gezogen worden sind, kombinieren sie, wie bereits beschrie- ben, durch eine immunspezifische Reaktion mit den zu separierenden biologischen Partikeln 11 zu den gebun¬ denen Partikeln 13. Die Schmalheit bzw. die geringe Querschnittsfläche des Mikro-Durchströmungskanals 5 (ausreichend geringer Durchmesser) und ausreichend geringe Durchströmungsgeschwindigkeiten durch den
Durchströmungskanal 5 erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass die einzelnen immunomagnetischen Partikel 8 an die zugehörigen biologischen Partikel 11 binden (Er¬ höhung der Zeit, die für die Immunreaktion zur Verfü- gung steht) .
Stromabwärtsseitig zum ersten Elektromagneten 6 ist auf der diesem Magneten gegenüberliegenden Seite des Durchströmungskanals 5 nun unmittelbar vor dem Abfüh- rungsbereich A der zweite Elektromagnet 7 angeordnet. Mit Hilfe dieses zweiten Elektromagneten 7 werden nun die gebundenen Partikel 13 und auch immunomagnetische Partikel 8, die auf dem Strömungsweg zwischen dem Elektromagneten 6 und dem Elektromagneten 7 nicht an biologische Partikel 11 gebunden worden sind, vom ersten Flüssigkeitsstrom 9 wieder über die Flüssig¬ keitsstromgrenze in den zweiten Flüssigkeitsstrom 10 zurückgezogen. Dies geschieht über ein elektromagne¬ tisches Feld bzw. einen Feldgradienten des Elektro- magneten 7, welches bzw. welcher entgegengesetzt zum Feld bzw. Gradienten des ersten Elektromagneten 6 ge- richtet ist. Die immunomagnetisch gebundenen bzw. ge¬ kennzeichneten biologischen Partikel 13 sowie die un¬ gebundenen immunomagnetischen Partikel 8 bzw. der zweite Flüssigkeitsstrom 10 wird dann über den zwei- ten Abführkanal 4 abgeleitet. Der erste Flüssigkeits¬ strom 9 bzw. die restlichen nicht gebundenen biologi¬ schen Partikel 11 sowie die anderen biologischen Ma¬ terialien 12 werden über den ersten Abführkanal 3 ab¬ geführt. Die (gebundenen) biologischen Partikel 11 bzw. 13 sind somit von den anderen biologischen Mate¬ rialien 12 getrennt worden.
Figur 2 zeigt eine immunomagnetische Separationsvor¬ richtung, deren Grundaufbau der in Figur 1 gezeigten Separationsvorrichtung entspricht. In Strömungsrich¬ tung nach dem ersten Elektromagneten 6 und vor dem zweiten Elektromagneten 7 weist der Durchströmungska¬ nal 5 jedoch eine auf der Seite des ersten Elektro¬ magneten 6 angeordnete Ausbuchtung (Reaktionskammer) 14 auf. Im vorliegenden Fall ist der Durchströmungs- kanal 5 mit der Reaktionskammer 14 einstückig ausge¬ bildet. Die Reaktionskammer 14 kann jedoch auch als separates Bauteil an einer entsprechenden Öffnung im Durchströmungskanal 5 realisiert sein. In der gezeig- ten Schnittebene (Anordnungsebene der Einlasskanäle
1, 2, der Auslasskanäle 3, 4 sowie der beiden Elekt¬ romagneten 6, 7) weist die Reaktionskammer 14 einen Ω-förmigen Querschnitt auf. Auf Höhe der Reaktions¬ kammer 14 ist ein im dargestellten Schnitt T-förmiger Strömungsbrecher 15 im Durchströmungskanal 5 angeord¬ net. Der Strömungsbrecher 15 ist in Strömungsrichtung auf Höhe der Kammer 14 so angeordnet, dass er ledig¬ lich in den ersten Flüssigkeitsstrom der Mischflüs¬ sigkeit 9 eingreift und diesen Flüssigkeitsstrom in die Reaktionskammer 14 ablenkt. Durch die aus dem
Strömungsbrecher 15 und der Reaktionskammer 14 beste- hende Reaktionsvorrichtung wird der Weg der ersten Flüssigkeitsströmung 9 durch den Durchströmungskanal
5 verlängert. Durch diese Reaktionsvorrichtung wird die Aufenthaltsdauer des ersten Flüssigkeitsstroms 9 im Durchströmungskanal 5 proportional zum Volumen der Reaktionskammer 14 erhöht. Hierdurch ist eine erhöhte Kontakteffizienz bzw. eine Verlängerung der Zeit, die den immunomagnetisehen Partikeln 8 zur Bindung an die spezifischen biologischen Partikel 11 zur Verfügung steht, gegeben. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Im¬ munreaktion stattfindet bzw. dass die immunomagneti- sehen Partikel 8 binden, wird somit erhöht . Die Sepa- rierungseffizienz wird somit durch die erhöhte Immun- reaktionseffizient der Vorrichtung erhöht. Die vorge- stellte Reaktionskammer 14 bedingt hohe Flussge- schwindigkeitsgradienten und eine gute Mikro- Durchmischung des ersten Flüssigkeitsstroms 9. Auch hierdurch wird die Bindungswahrscheinlichkeit der im¬ munomagnetisehen Partikel 8 erhöht. Entscheidend ist hierbei, dass die Reaktionsvorrichtung 14, 15 in
Strömungsrichtung zwischen den beiden Elektromagneten
6 und 7 zur Verfügung gestellt wird, so dass der ers¬ te Flüssigkeitsstrom, wenn er bereits die eingezoge¬ nen immunomagnetischen Partikel 8 aufweist, in diese den Bindungszeitraum verlängernde Reaktionskammer 14 eingeleitet wird.
Figur 3 zeigt eine weitere erfindungsgemäße Separati¬ onsvorrichtung, die weitestgehend wie diejenige in Figur 1 ausgestaltet ist. Im Unterschied zu Figur 1 befindet sich nun jedoch zwischen dem Einmündungsbe¬ reich E und dem stromabwärts davon angeordneten Ab¬ führungsbereich A eine Trennwand 17, die die beiden Flüssigkeitsströme, die durch den Einlasskanal 1 bzw. den Einlasskanal 2 der Trennvorrichtung zugeleitet werden, voneinander separiert. So ist es lediglich im Bereich E der beiden Einlasse 1 und 2 möglich, dass die magnetischen Partikel aufgrund der durch den Mag¬ neten 6 ausgeübten magnetischen Kraft von dem einen Flüssigkeitsstrom in den anderen wechseln und dersel- be Wechsel in umgekehrter Richtung im Bereich A er¬ folgt. Zwischen diesen beiden Bereichen E und A kann keine weitere Vermischung der Flüssigkeitsströme er¬ folgen, sodass in diesem Bereich lediglich eine Anla¬ gerung zwischen immunomagnetischem Partikel und anti- genbehaftetem Partikel erfolgt.
Figur 4 zeigt eine weitere erfindungsgemäße Separati¬ onsvorrichtung. Hier erfolgt die Zufuhr von immuno- magnetischen Partikeln 11 über einen Einlasskanal 2 und die Zufuhr der Probe über einen Einlasskanal 1, die in einem mit E bezeichneten Bereich miteinander kommunizieren, sodass dort aufgrund eines angelegten Magnetfeldes Fmag die immunomagnetischen Partikel 11 in die Probe übertreten können. Das erzeugte Magnet- feld Fmag wird durch einen Pfeil dargestellt. Die Probe mit den immunomagnetischen Partikeln 11 wird dann in einer Spirale 18 über eine lange Strecke ge¬ führt, sodass dort die immunomagnetischen Partikel 11 an Antigene 8 ankoppeln können. Die Spirale 18 wird dann wieder zurückgeführt und trifft in einem Bereich
A auf die zwischenzeitlich umgelenkte Flüssigkeit, die ursprünglich die immunomagnetischen Partikel 11 enthielt. In diesem Bereich A werden die Immunoparti¬ kel 8 beladenen Partikel 11 wiederum in den ursprüng- liehen .Flüssigkeitsstrom durch das Magnetfeld Fmag zurückgezogen und anschließend über den Auslass 4 ab¬ geführt. Die von den immunomagnetischen Partikeln 11 damit wieder weitgehend befreite Probe wird in einem großen Bogen 19 um die Spirale 18 herum geführt und zuletzt über den Auslass 3 abgeführt. Diese Anordnung hat den Vorteil, dass der Mischbereich zwischen den magnetischen Partikeln 11 und den Antikörpern 8 eine sehr lange Strecke aufweist. Weiterhin hat sie den Vorteil, dass lediglich ein Magnet benötigt wird, um das Magnetfeld im Bereich E und das Magnetfeld im Be¬ reich A zu erzeugen und damit sämtliche Misch- und Trennvorgänge zu bewerkstelligen.

Claims

Patentansprüche
1. Separationsvorrichtung
mit einem Durchströmungskanal (5) mit einer Wan¬ dung (5a) , einem Einmündungsbereich (E) und ei¬ nem stromabwärts davon angeordneten Abführungs- bereich (A) und
mindestens einem Magneten (7) zur Erzeugung ei¬ nes ersten magnetischen Feldes über zumindest einen Teil des Querschnitts des Durchströmungs- kanals (5) ,
wobei im Einmündungsbereich (E) zwei Einlasska¬ näle (1, 2) zur Zufuhr von Fluiden in den Durch¬ strömungskanal (5) münden und wobei zwei Abführ¬ kanäle (3, 4) zum Abtransport von Fluiden aus dem Abführungsbereich (A) wegführen,
wobei einer der Magnete (6,7) stromabwärts des Einmündungsbereiches (E) ein erstes Magnetfeld erzeugt,
wobei einer Magnete (6,7) stromabwärts des ers- ten Magnetfeldes und stromaufwärts des Abfüh¬ rungsbereiches (A) ein zweites Magnetfeld er¬ zeugt, wobei das erste und das zweite Magnetfeld im Wesentlichen bezüglich ihrer Richtung bzw. Polarität entgegengesetzt sind.
2. Separationsvorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch,
gekennzeichnet durch einen ersten Magneten (6) und einen zweiten Mag¬ neten (7) zur Erzeugung von magnetischen Feldern über zumindest einen Teil des Querschnitts des Durchströmungskanals (5) ,
wobei im Einmündungsbereich (E) zwei Einlasska¬ näle (1, 2) zur Zufuhr von Fluiden in den Durch¬ strömungskanal (5) münden und wobei zwei Abführ- kanäle (3, 4) zum Abtransport von Fluiden aus dem Abführungsbereich (A) wegführen,
wobei der erste Magnet (6) stromabwärts des Ein¬ mündungsbereiches (E) seitlich außerhalb des Durchströmungskanals (5) oder zumindest teilwei¬ se integriert in die Wandung (5a) des Durchströ¬ mungskanals (5) oder innerhalb der Wandung (5a) im Durchströmungskanal angeordnet ist,
wobei stromabwärts des ersten Magneten (6) und stromaufwärts des Abführungsbereiches (A) der zweite Magnet (7) seitlich außerhalb des Durch- strömungskanals (5) oder zumindest teilweise in¬ tegriert in die Wandung (5a) des Durchströmungs- kanals (5) oder innerhalb der Wandung (5a) im
Durchströmungskanal angeordnet ist, und
wobei der erste und der zweite Magnet auf im we¬ sentlichen gegenüberliegenden Seiten des Durch- Strömungskanals (5) außerhalb bzw. innerhalb des
Durchströmungskanals angeordnet bzw. in dessen Wandung (5a) integriert sind.
3. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
die zwei Einlasskanäle (1, 2) und die zwei Ab¬ führkanäle (3, 4) sowie bevorzugt auch der erste und der zweite Magnet im Wesentlichen in einer
Ebene in Strömungsrichtung des Durchströmungska¬ nals (5) angeordnet sind.
4. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
mindestens einer der Einlasskanäle (1, 2) und/oder mindestens einer der Auslasskanäle (3, 4) im wesentlichen in Strömungsrichtung des
Durchströmungskanals (5) oder unter einem Winkel α mit 0 < α < 180°, insbesondere mit 0 < α < 90°, insbesondere mit 0 < α < 45°, geneigt hier¬ zu einmündet bzw. wegführt.
5. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
jeweils einer der Einlasskanäle und einer der
Auslasskanäle senkrecht zur Strömungsrichtung des Durchströmungskanals gesehen auf derselben Seite des Durchströmungskanals angeordnet sind.
6. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge- henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass der erste und/oder der zweite Magnet (6, 7) ein Permanentmagnet oder ein Elektromagnet ist.
7. Separationsvorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Feldstärke und/oder der Feldgradient des E- lektromagneten zeitlich und/oder örtlich vari- ierbar ist oder konstant haltbar ist.
8. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Durchströmungskanal und/oder die Einlasska¬ näle und/oder die Auslasskanäle so angeordnet und/oder insbesondere in Bezug auf ihren Quer¬ schnitt senkrecht zur Durchströmungsrichtung räumlich so ausgebildet sind, dass im Durchströ¬ mungskanal bei Durchströmung von zur immuno- magnetischen Separation einsetzbarer Fluide eine laminare Strömung bzw. eine Strömung mit einer Reynoldszahl R kleiner als der kritischen Rey- noldszahl Rkrit erzeugbar ist.
9. Separationsvorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Durchströmungskanal und/oder die Einlasska¬ näle und/oder die Auslasskanäle so angeordnet und/oder ausgebildet sind, dass im Durchstrδ- mungskanal auf der Seite des ersten Magnets (6) ein erster Flüssigkeitsstrom ausbildbar ist und dass im Durchströmungskanal auf der Seite des zweiten Magnets (7) ein zweiter, vom ersten Flüssigkeitsstrom bis auf Diffusionsprozesse ge- trennter Flüssigkeitsstrom ausbildbar ist.
10. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Durchströmungskanal ein Mikrofluidkanal, insbesondere mit einer Querschnittsfläche senk¬ recht zur Durchströmungsrichtung von über 0.002 mm2 und/oder unter 1 mm2 , bevorzugt von über 0.01 mm2 und/oder unter 0.06 mm2 ist.
11. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Durchströmungskanal ein im Querschnitt im wesentlichen kreisförmiges, elliptisches, recht- eckförmiges oder quadratisches Rohr ist.
12. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge- henden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
eine in Strömungsrichtung nach dem ersten Magnet und vor dem zweiten Magnet angeordnete, strö- mungswegverlängernde Reaktionsvorrichtung (14, 15) .
13. Separationsvorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
die strömungswegverlängernde Reaktionsvorrich¬ tung eine bevorzugt im wesentlichen auf der Sei¬ te des ersten Magnets (6) angeordnete Reaktions¬ kammer (14) und einen im Innern des Durchströ- mungskanals (5) angeordneten Strömungsbrecher
(15) aufweist.
14. Separationsvorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch und nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, dass
mit dem Strömungsbrecher (15) der erste Flüssig¬ keitsstrom in die Reaktionskammer (14) lenkbar ist.
15. Immunomagnetische Separationsvorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Reaktionskammer (14) in einer Ebene parallel zur Strömungsrichtung des Durchströmungskanals einen im wesentlichen Ω-förmigen, halbkreisför¬ migen oder trapezförmigen Querschnitt aufweist und/oder dass der Strömungsbrecher (15) in die- ser Ebene im wesentlichen einen dreiecksförmigen oder T-förmigen Querschnitt aufweist.
16. Separationsvorrichtung nach einem der drei vor¬ hergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Reaktionskammer (14) als Auswölbung der Wan¬ dung (5a) des Durchströmungskanals (5) bzw. einstückig mit diesem ausgebildet ist oder dass die Reaktionskammer (14) als separates, an einer Öffnung der Wandung (5a) des Durchströmungska¬ nals (5) angeordnetes Bauteil ausgebildet ist.
17. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
eine Kontrollvorrichtung, insbesondere eine Kon¬ trollelektronik zur Steuerung des ersten und/oder zweiten Magneten (6, 7) und/oder eine Regelungsvorrichtung zur Regelung der Durch¬ flussgeschwindigkeit im Durchströmungskanal (5) und/oder in den Einlasskanälen (1, 2) und/oder Abführkanälen (3, 4) .
18. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge- henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Separationsvorrichtung in den menschlichen oder tierischen Körper implantierbar ist oder dass die Separationsvorrichtung außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers, insbeson¬ dere als Laborgerät, einsetzbar ist.
19. Separationsvorrichtung nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
in dem Durchströmungskanal (5) in Strömungsrich¬ tung des Fluids zwischen dem Bereich der Ein¬ lasskanäle (1, 2) und dem Bereich der Abführka¬ näle (3, 4) zumindest bereichsweise eine Trenn- wand angeordnet ist, die eine Vermischung be¬ nachbarter, getrennt voneinander eingeleiteter Fluidströme verhindert .
20. Separationsanordnung mit
einer immunomagnetisehen Separationsvorrichtung und
einem eine Mehrzahl von immunomagnetisehen, ins¬ besondere antikörpergekoppelten oder mit anti- genspezifischen Tetrameren gekoppelten Partikeln
(8) aufweisenden Fluid, insbesondere einer Flüs¬ sigkeit,
dadurch gekennzeichnet, dass
die immunomagnetische Separationsvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausge¬ bildet ist.
21. Separationsanordnung nach dem vorhergehenden An- spruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Partikel (8) ferromagnetische und/oder su- perparamagnetische Eigenschaften und/oder im we¬ sentlichen Kugelform aufweisen.
22. Separationsanordnung nach einem der beiden vor¬ hergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Durchströmungskanal (5) und/oder die Ein¬ lasskanäle (1, 2) und/oder die Auslasskanäle (3, 4) der Separationsvorrichtung so ausgebildet sind und/oder dass das Fluid bzw. die Flüssig¬ keit eine Viskosität, Dichte, Temperatur und mittlere Strömungsgeschwindigkeit im Durchströ¬ mungskanal (5) so aufweist, dass im Durchströ- mungskanal eine laminare Strömung bzw. eine
Strömung mit einer Reynoldszahl R kleiner als der kritischen Reynoldszahl Rkrit vorliegt.
23. Separationsanordnung nach einem der drei vorher¬ gehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Durchströmungsrate des die Partikel (8) auf¬ weisenden Fluids bzw. der die Partikel aufwei- senden Flüssigkeit durch den Durchströmungskanal über 0.1 μl/min und/oder unter 2000 μl/min, ins¬ besondere über 1 μl/min und/oder unter 200 μl/min, beträgt.
24. Separationsanordnung nach einem der vier vorher- gehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die mittlere Durchströmungsgeschwindigkeit des die Partikel (8) aufweisenden Fluids bzw. der die Partikel aufweisenden Flüssigkeit im Durch¬ strömungskanal über 0.03 mm/s und/oder unter 3000 mm/s, insbesondere über 0.3 mm/s und/oder unter 300 mm/s, beträgt.
25. Isolationsverfahren zur Isolation eines bestimm¬ ten biologischen Materials (11) , insbesondere eines Antigens, aus einem neben diesem biologi¬ schen Material (11) gegebenenfalls weitere bio- logische und/oder andere Materialien (12) auf¬ weisenden ersten Fluid (9) , insbesondere einer Flüssigkeit, mit Hilfe eines eine Mehrzahl von immunomagnetisehen, insbesondere mit den zu die¬ sem Antigen spezifischen Antikörpern, Tetrameren und/oder Streptameren gekoppelten Partikeln (8) aufweisenden zweiten Fluids (10) , insbesondere einer Flüssigkeit,
wobei das erste Fluid (9) und gleichzeitig das zweite Fluid (10) so in einen Durchströmungska¬ nal (5) eingeleitet werden, dass sich im Durch¬ strömungskanal (5) zwischen den beiden eingelei¬ teten Fluidströmen laminare Strömungsverhältnis¬ se ausbilden und das erste Fluid (9) in einem ersten Flüssigkeitsstrom und das zweite Fluid
(10) in einem zweiten, benachbarten Flüssig¬ keitsstrom durch den Durchströmungskanal fließt,
wobei mit Hilfe eines ersten magnetischen Feldes die immunomagnetisehen Partikel (8) zumindest teilweise aus dem zweiten Flüssigkeitsstrom in den ersten Flüssigkeitsstrom gezogen werden, dort anschließend zur Bindung an das bestimmte biologische Material (11) über einen Bindungs- Zeitraum entsprechend einem Teil des zum Durch- fließen des Durchströmungskanals benötigten Zeitraums belassen werden, bevor die gegebenen¬ falls zumindest teilweise an das bestimmte bio¬ logische Material gebundenen immunomagnetisehen Partikel (8, 13) mit Hilfe eines zweiten magne¬ tischen Feldes zumindest teilweise vom ersten Flüssigkeitsstrom in den zweiten Flüssigkeits¬ strom gezogen werden,
und wobei die beiden Flüssigkeitsströme getrennt aus dem Durchströmungskanal (5) abgeführt wer¬ den.
26. Isolationsverfahren nach dem vorhergehenden An¬ spruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
eine immunomagnetisehe Separationsvorrichtung oder eine immunomagnetisehe Separationsanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 22 verwendet wird.
27. Isolationsverfahren nach einem der beiden vor¬ hergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Feldstärke und/oder die Gradientenstärke des ersten und/oder zweiten magnetischen Feldes so gewählt wird, dass sie für den Übergang der im- munomagnetisehen Partikel (8) aus dem zweiten in den ersten Flüssigkeitsstrom bzw. für den Über¬ gang der zumindest teilweise an das bestimmte biologische Material gebundenen immunomagneti- sehen Partikel (13) aus dem ersten in den zwei- ten Flüssigkeitsstrom gerade ausreichend ist.
28. Isolationsverfahren nach einem der drei vorher¬ gehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das erste und/oder zweite magnetische Feld ge¬ pulst erzeugt wird oder sinusförmig moduliert wird.
29. Immunomagnetisches Isolationsverfahren nach ei- nem der vier vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Bindungszeitraum dadurch erhöht wird, dass der Strömungsweg des ersten Flüssigkeitsstroms durch den Durchströmungskanal verlängert wird.
30. Immunomagnetisches Isolationsverfahren nach ei¬ nem der fünf vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Isolationsverfahren außerhalb oder innerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers durch¬ geführt wird.
31. Verwendung einer immunomagnetisehen Separations¬ vorrichtung und/oder einer immunomagnetisehen Separationsanordnung und/oder eines immunomagne- tischen Isolationsverfahrens nach einem der vor¬ hergehenden Ansprüche zur medizinischen Diagnose oder Therapie außerhalb oder innerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
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