WO2003009889A1

WO2003009889A1 - Verfahren zur anreicherung von zellen

Info

Publication number: WO2003009889A1
Application number: PCT/EP2002/007172
Authority: WO
Inventors: Stefan Thoma; Gregor Schulz; Roland Bosse; Olivier Waridel; Claude Fell
Original assignee: Cellgenix Technologie Transfer Gmbh; Biosafe S.A.
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2003-02-06
Also published as: DE10136375A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Zellen, bei dem man eine Zusammensetzung, die ein Gemisch unterschiedlicher Zelltypen enthält, mit Partikeln in Kontakt bringt, die an eine Subpopulation unerwünschter Zellen in der Zusammensetzung binden ; das Gemisch aus Zellen und Partikeln zentrifugiert und die gewünschte Zellfraktion gewonnen, bevor die Zentrifugation beedet ist. Das Verfahren ist besonders geeignet zur Gewinnung von therapeutischen Zellen.

Description

Verfahren zur Anreicherung von Zellen

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Zellseparation und Gewinnung bestimmter Zelltypen, insbesondere aus Blut.

Für die klinische Zelltherapie werden je nach Indikation und Therapieansatz verschiedene Zelltypen (z.B. hämatopoetische Stamm- oder Progenitorzellen, Monozyten/dendritische Zellen, T- und NK-Zellen) eingesetzt. In der Regel werden diese Zellen aus dem Blut oder Knochenmark von Patienten oder Spendern gewonnen. Dort machen sie aber nur einen geringen Prozentsatz des Ausgangsmaterials aus. Aus diesem Grund ist eine Anreicherung dieser "therapeutischen" Zellpopulationen notwendig.

Die Anreicherung von Zellen aus einem heterogenen Ausgangsmaterial wird seit vielen Jahren in Routineverfahren zur klinischen Zelltherapie durchgeführt. Die Anreicherung kann direkt erfolgen durch Selektion und Zurückhalten der gewünschten Zellen aus dem Ausgangsmaterial mittels geeigneter Verfahren (positive Selektion der therapeutischen Zellen) oder indirekt durch Selektion und Entfernung der nicht gewünschten Zellen (negative Selektion, das heißt Entfernung der Zielzellen, z.B. Tumorzellen). Bei diesen spezifischen Verfahren wird die Spezifität der Trennverfahren in der Regel durch monoklonale Antiköφer (z.B. aus der Maus) gewährleistet, die spezifische auf der Zelloberfläche exprimierte Antigene erkennen und an diese binden. Um die mit Antikörper beladenen Zellen abtrennen zu können, sind die verwendeten Antiköφer mit Partikeln (sogenannten "Beads") gekoppelt, die je nach Hersteller aus unterschiedlichem Material bestehen. Allen Partikeln gemeinsam ist ein metallischer Kern aus Eisen oder Nickel und dadurch die Eigenschaft, in einem magnetischen Feld zurückgehalten werden zu können. Die verfügbaren kommerziellen- Systeme verwenden zur Auftrennung der Zellen einen Magneten. Somit können die mit Antiköφer und "Beads" beladenen Zellen selektiv durch Einwirkung eines magnetischen Feldes abgetrennt werden. Solche Systeme werden von den Firmen Nexell, Miltenyi oder Eligix bereitgestellt.

Bei der positiven Selektion unter Verwendung von monoklonalen Antiköφem besteht der Nachteil darin, daß auf den therapeutischen Zellen Antiköφer inklusive Partikel gebunden sind, die bei Rückführung der Zellen in den Patienten ebenfalls in den Köφer gelangen und dort Nebenwirkungen wie unerwünschte Immunreaktionen hervorrufen können (Nickelallergie, Immunisierung gegen Mausantiköφer). Demgegenüber binden Antiköφer bei der negativen Selektion nur an Zielzellen, die depletiert, aber nicht für den therapeutischen Einsatz verwendet werden. Somit gelangt kein zellgebundener Antiköφer ungewollt in den Patienten.

Ein anderes Prinzip der Zellanreicherung besteht in der Auftrennung des Ausgangsmaterials nach unterschiedlicher Dichte der Zellen. Dabei erfolgt die Auftrennung der Zellen meist mittels eines Dichtegradienten. Eine häufig verwendete Dichtegradientenlösung ist das Ficoll, das aufgrund toxischer Eigenschaften für Zellen bei längerer Inkubation aber nicht für die klinische Anwendung zugelassen ist. Mangels Alternativen wird es jedoch in vielen Verfahren routinemäßig klinisch eingesetzt. In dem DACS^®SC-Kit der Firma Dendreon wird durch Zentrifugation die Separation der Zellen in Anwesenheit des Dichtegradienten induziert und beschleunigt. Gemäß ihrer spezifischen Dichte und deren Relation zur Dichte des verwendeten Gradientenmaterials bleiben die verschiedenen Zellfraktionen oberhalb oder unterhalb des Dichtegradienten. Die Reinheit und Ausbeute der Zellfraktionen bei Auftrennung mittels Dichtegradienten ist in der Regel aber deutlich geringer als bei spezifischen Verfahren. Zeilseparationsverfahren sollten kostengünstig, effizient und wenig zeitaufwendig sein. Ein weiteres Problemfeld stellt bei der Gewinnung von therapeutischen Zellen die Kontaminationsgefahr während des Isolierungsverfahrens dar.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vorteilhaftes Verfahren zur Anreicherung von Zellen bereitzustellen.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß aus einer Mischpopulation von Zellen unerwünschte Zellen dadurch abgereichert werden können, daß die Mischpopulation mit Antiköφer-gekoppelten magnetischen Kügelchen ("Beads"), die Antigene auf der Oberfläche der unerwünschten Zellen erkennen, in Kontakt gebracht werden und anschließend das Gemisch aus Kügelchen und Zellen zentrifugiert wird, wobei noch während der Zentrifugation die gewünschte Zellfraktion gewonnen wird. Anstelle von Antiköφern können auch andere an "Beads" gebundene Moleküle wie z.B. Liganden oder Rezeptoren verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Anreicherung von Zellen, bei dem man eine Zusammensetzung, die ein Gemisch unterschiedlicher Zelltypen enthält, mit Partikeln in Kontakt bringt, die an eine Subpopulation unerwünschter Zellen in der Zusammensetzung binden, das Gemisch aus Zellen und Partikeln zentrifugiert und die gewünschte Zellfraktion gewinnt, bevor die Zentrifugation beendet ist.

Die Zusammensetzung, die ein Gemisch unterschiedlicher Zelltypen enthält, kann verschiedenster Art sein. Als Ausgangsmaterial kommt vorzugsweise Nabelschnurblut, peripheres Blut, Leukapheresat oder Knochenmark in Frage. Diese Zusammensetzungen können in der Form eingesetzt werden, wie sie zunächst isoliert wurden, sie können aber auch durch geeignete Puffer und/oder Salzlösungen verdünnt worden sein. Die Verfahren zur Gewinnung der genannten Ausgangsmaterialien sind dem Fachmann bekannt.

Die Partikel, die mit der Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden, haben üblicherweise eine höhere Dichte als die Dichte der anzureichernden Zellen. Die Dichte der Partikel ist vorzugsweise 1,1 bis 2 g/cm³, bevorzugter 1 ,3 bis 1 ,6 g/cm³, am bevorzugtesten ungefähr 1 ,5 g/cm³.

Die Partikel haben vorzugsweise eine Größe von 2,8 bis 5 μm, bevorzugter von 4,5 ± 0,2 μm. Als Größe ist bei annähernd kugelförmigen Partikeln der Durchmesser anzusehen, ansonsten die größte räumliche Ausdehnung des Partikels. Bei einer heterogenen Partikelpopulation ist der Durchschnittswert anzunehmen.

Die Form der Partikel ist nicht besonders eingeschränkt, es kann sich um längliche oder auch amorph geformte Partikel handeln. Vorzugsweise handelt es sich aber um Partikel, die im wesentlichen kugelförmig sind. Das Material der Partikel kann unterschiedlich sein. Vorzugsweise handelt es sich um ein Material hoher Dichte wie z.B. um ein Metall. Beispiele geeigneter Materialien sind Eisen und Nickel, andere Metalle können aber ebenfalls verwendet werden. Die Partikel müssen nicht in homogener Weise aus einem einzigen Material bestehen, es kann sich auch um Partikel handeln, die aus einem Gemisch unterschiedlicher Materialien oder um Partikel mit mehreren Schichten unterschiedlicher Materialien handeln. So ist es vorstellbar, daß die Partikel einen metallhaltigen Kern aufweisen und mit einer nicht-metallischen Oberfläche überzogen sind.

Die Partikel binden an eine Subpopulation unerwünschter Zellen in der Zusammensetzung. Die geschieht vorzugsweise dadurch, daß die Partikel auf ihrer Oberfläche fest gebunden Antikörpermoleküle tragen. Diese Antiköφermoleküle erkennen Antigene auf der Oberfläche der abzureichernden Zellen. Vorzugsweise ist die Bindung der Antikörper an die Oberflächenantigene spezifisch. Das bedeutet, daß die Partikel nur an die abzureichernden Zellen binden. Es ist möglich, daß die Antiköφer Oberflächenantigene von mehreren Zelltypen erkennen. Ebenfalls ist es möglich, daß die Zusammensetzung mit Partikeln in Kontakt gebracht wird, die mehrere Antiköφer mit unterschiedlichen Spezifitäten gegen unterschiedliche Oberflächenantigene tragen. Dadurch ist die Abreicherung mehrerer unerwünschter Zelltypen in einem Schritt möglich. Anstelle von Antiköφern können auch andere an "Beads" gebundene Moleküle wie z.B. Liganden oder Rezeptoren verwendet werden.

Die spezifischen Antiköφer, die Oberflächenantigene auf den Zielzellen erkennen, müssen nicht unmittelbar an die Oberfläche der Partikel gebunden sein. Vielmehr ist es bevorzugt, daß diese Antiköφer (= Primärantikörper) über weitere Antiköφermoleküle (= Sekundärantiköφer), die ihrerseits fest mit der Partikeloberfläche gekoppelt sind, an die Partikel gebunden werden. So kann der Primärantiköφer beispielsweise ein Maus-anti- Human-Antiköφer sein, während der Sekundärantiköφer den Primärantikörper aus Maus erkennt. Partikel und "Beads" mit gekoppelten Sekundärantikörpern sind kommerziell erhältlich. Die Herstellung von Partikeln und Kügelchen mit immobilisierten Antikörpern auf ihrer Oberfläche ist dem Fachmann an sich bekannt. Die Auswahl der spezifischen Antikörper oder anderer Moleküle erfolgt aufgrund der auf der Oberfläche der zu depletierenden Zellen exprimierten Antigene. Folgende Zielzelltypen können durch Antikörper gegen die genannten Antigene auf ihrer Oberfläche depletiert werden:

Tabelle 1

Diese Aufzählung ist nicht erschöpfend, vielmehr soll die Erfindung beispielhaft erläutert werden.

Bei den Antiköφermolekülen handelt es sich vorzugsweise um monoklonale Antiköφer. Der Begriff "Antiköφer" oder "Antiköφermoleküle" umfaßt komplette Antiköφermoleküle, aber auch funktionelle Fragmente und Derivate davon. Die Fragmente und Derivate sind funktionell, wenn sie an "ihr" Antigen binden können, das heißt an das Antigen, an das der Antiköφer bindet, von dem sie abgeleitet sind. Beispiele für Fragmente und Derivate sind Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, "single-chain antibody fragments", bispezifische Antiköφer, Chimäre Antiköφer, humanisierte Antikörper sowie Fragmente, die CDRs (complementarity determining regions) enthalten, die ein Epitop erkennen. In einem ersten Schritt des Verfahrens werden beispielsweise die ausgewählten monoklonalen Maus-Anti-Human-Antikörper (Primärantikörper), die an Antigene wie z.B. CD10 (Expression auf B-Vorläuferzellen und neoplastischen Zellen), CD19 (Expression auf allen B-Zelldifferenzierungsstadien) oder CD20 (Expression auf frühen, ruhenden und aktivierten B-Zellen) binden, mit den magnetischen Kügelchen ("Beads") vorinkubiert. An die "Beads" sind vom Hersteller bereits Sekundärantikörper gekoppelt, die Primärantiköφer aus der Maus erkennen. Durch Vorinkubation binden die monoklonalen Maus-Anti-Human- Antiköφer an die auf den magnetischen "Beads" befindlichen Sekundärantikörper.

In einem zweiten Schritt werden die Zellen (Ausgangsmaterial) mit den vorbereiteten "Beads" (mit Primär- und Sekundärantiköφer) inkubiert. Durch die spezifische Bindung der Primärantikörper an die zu entfernenden Zellen werden diese mit den "Beads" beladen und erhalten dadurch eine andere Dichte. Dieses Gemisch aus Zellen und Partikeln wird dann in das Zentrifugationssystem überführt und aufgearbeitet.

Die Zentrifugation des Zell-Partikelgemisches erfolgt in einem dazu geeigneten System. Vorzugsweise handelt es sich um ein geschlossenes System, so daß keine Kontaminationen möglich sind. Es kann sich dabei vorteilhafterweise um ein System handeln, das eine Wegwerfgarnitur (zur einmaligen Verwendung) enthält. Die Wegwerfgarnitur kann ein Zentrifugationsgefäß mit einem Einlaß/Auslaß für die zu verarbeitende Mischung und die verarbeiteten Bestandteile der Mischung umfassen. Am bevorzugtesten wird das Sepax™-System der Firma Biosafe S.A. verwendet, das beispielsweise in WO 00/38762 offenbart ist. Das Sepax™-System wurde in zahlreichen Anwendungen zur Verarbeitung biologischer Flüssigkeiten erfolgreich eingesetzt, einschließlich der Konzentration von Progenitorzellen, die aus Nabelschnurblut, Leukapheresaten oder Knochenmark stammen. Es war aber völlig unerwartet, dass durch das System die Effizienz der Zellselektion deutlich erhöht werden konnte, wenn es zusammen mit der Technologie Antikörper-gekoppelter Mikrobeads ("microbeads antibody coated technology") eingesetzt wurde.

Die Zentrifugation erfolgt vorzugsweise bei 200 bis 800 G, bevorzugter bei 400 bis 700 G, am bevorzugtesten bei ungefähr 600 G.

Die Zentrifugationsdauer, bevor mit der Gewinnung der gewünschten Zellfraktion begonnen wird, ist üblicherweise 5 bis 20 Minuten, vorzugsweise 5 bis 10 Minuten, am bevorzugtesten ungefähr 7 Minuten. In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Zentrifugationsbehältnis um ein längliches Gefäß, vorzugsweise zylinderförmig, das während der Zentrifugation um seine Längsachse rotiert. Dabei ist es möglich, während der Zentrifugation an der Position der Längsachse Fraktionen zu entnehmen. Erfindungsgemäß wird nämlich die gewünschte Zellfraktion gewonnen, bevor die Zentrifugation beendet ist. Das bedeutet in der Regel, daß die Zellfraktion gewonnen wird, solange sich das Zentrifugationsgefäß dreht. Darin eingeschlossen ist die Gewinnung während der Zentrifugation und die Gewinnung während des Abbremsens bzw. "Auslaufens" der Zentrifuge. Die Entnahme kann somit "online" erfolgen. Das hat den Vorteil, daß keine Vermischung der Schichten erfolgt, darüber hinaus kann die Kontaminationsgefahr stark reduziert werden. Insbesondere kann die Gewinnung der gewünschten Zellfraktion kontinuierlich während der Rotation des Zentrifugationsgefäßes erfolgen. Alternativ kann aber auch eine bestimmte Zeit zentrifugiert werden, ohne daß die gewünschte Zellfraktion gewonnen wird. Die Gewinnung erfolgt dann erst kurz vor dem Ende der Zentrifugation. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine nur teilweise Gewinnung der gewünschten Zellfraktion während der Zentrifugation. So kann ein Teil der gewünschten Zellfraktion während der Zentrifugation des Gemisches gewonnen werden, ein weiterer Teil nach Ende der Zentrifugation. Als weitere Alternative kann die Zentrifuge zwischendurch angehalten werden, um die gewünschte Zellfraktion oder einen Teil davon zu entnehmen, und dann weiterzentrifugiert werden, um die Zentrifugation zu beenden.

Das Zentrifugationsgefäß kann beispielsweise aufgebaut sein, wie es schematisch in Figur 4 dargestellt ist. Es umfaßt in dieser Ausführungsfonm einen axialen Einlaß/Auslaß (1) für die zu verarbeitende Flüssigkeit bzw. für die verarbeiteten Flüssigkeitskomponenten. Der Einlaß/Auslaß (1) führt zu einem Trennungsraum (2) veränderbaren Rauminhalts, in dem die zentrifugale Verarbeitung der biologischen Flüssigkeit stattfindet. Die Zentrifugation/Rotation erfolgt um die zentrale Längsachse des Gefäßes. Das Gefäß enthält ein bewegbares Glied (3), üblicherweise einen Kolben, dessen Bewegung den Rauminhalt des Trennungsraums (2) verändert, wobei das Glied (3) innerhalb des Gefäßes bewegt werden kann, um eine gewählte Menge an zu verarbeitender Flüssigkeit vor oder während der zentrifugalen Verarbeitung über den Einlaß (1) in den Trennungsraum (2) hereinzunehmen und während der zentrifugalen Verarbeitung über den Auslaß (1 ) die verarbeiteten biologischen Flüssigkeitskomponenten (4, 5, 6) aus dem Trennungsraum hinauszudrücken. Vorzugsweise ist das bewegbare Glied ein Kolben, der in dem Zentrifugationsbehältnis so angeordnet ist, daß er flüssigkeitsdicht bewegt werden kann. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zentrifugation demnach in einem Zentrifugationsbehältnis mit variablem Rauminhalt durchgeführt, wobei der Rauminhalt erhöht wird, um eine gewählte Menge des zu verarbeitenden Gemisches aufzunehmen, und erniedrigt wird, um die gewünschte Zellfraktion aus dem Zentrifugationsbehältnis zu drücken.

Eine genaue Beschreibung derartiger Behältnisse kann EP 0 912 250 B1 entnommen werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines derartigen Zentrifugationsbehältnisses zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines hohlen Zentrifugationsbehältnisses, das um eine Drehachse drehbar ist und einen axialen Einlaß/Auslaß für die zu verarbeitende Mischung und die verarbeiteten Bestandteile der Mischung hat, wobei das Zentrifugationsbehältnis ein bewegbares Glied enthält, das einen Trennungsraum variabler Größe zur Aufnahme der Mischung definiert und bewegbar ist, um eine gewählte Menge der zu verarbeitenden Mischung durch den Einlaß in den Trennungsraum aufzunehmen und verarbeitete Bestandteile der Mischung während der Zentrifugation durch den Auslaß aus dem Trennungsraum herauszudrücken, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vorzugsweise wird dabei ein allgemein zylindrisches Zentrifugationsgefäß verwendet, dessen bewegbares Glied ein Kolben ist, der in dem Zentrifugationsbehältnis so angeordnet ist, daß er flüssigkeitsdicht bewegt werden kann.

Durch die Zentrifugation werden die Zellen nach Dichte aufgetrennt. Hierbei muß kein zusätzliches Dichtegrad ientenmaterial verwendet werden, es,kann aber dennoch eingesetzt werden. Die mit "Beads" beladenen Zielzellen haben in der Regel eine deutlich höhere Dichte als die unbeladenen Zellen und können somit einfacher und schneller abgetrennt werden. Die nicht-beladenen therapeutischen Zellen stehen nach der Auftrennung für die weitere Verwendung zur Verfügung.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Anreicherung von Zellen zur Verfügung, das die schnelle Gewinnung von gewünschten Zellen ermöglicht. Weiterhin wird die effiziente Anreicherung von therapeutischen Zellen bzw. die Abreicherung von zu depletierenden Zellen in einem einzigen Schritt ermöglicht. Außerdem ist in einem einzigen Schritt die Depletion mehrerer Zellpopulationen möglich. Das Verfahren läßt sich vorteilhafterweise in einem geschlossenen System, das vorzugsweise eine Wegwerfgarnitur (zur einmaligen Verwendung) enthält, durchführen, was steriles Arbeiten ermöglicht. Das Verfahren läßt sich als Software-gesteuertes Verfahren durchführen, somit ist eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei geringer Benutzerabhängigkeit gewährleistet.

Die Anreicherung der Zellen erfolgt durch negative Selektion, daher befinden sich keine Antikörper bzw. "Beads" in der gewünschten Zellfraktion. Dies ist insbesondere wichtig bei therapeutischen Zellen, die in den Patienten zurückgegeben werden. Die gewonnenen Zellen werden darüber hinaus in ihren Eigenschaften wie Vitalität, Antigenexpressionsmusterfunktion usw. nicht verändert und stehen anschließend für weitere Verfahren, beispielsweise Expansion, Gentransfer, Differenzierung usw. unmittelbar zur Verfügung.

Die Figuren 1 bis 3 zeigen Ergebnisse der Beispiele 1 bis 3.

Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung eines Zentrifugationsgefäßes, das erfindungsgemäß verwendet werden kann. Das Gefäß ist im wesentlichen zylinderförmig und umfaßt einen axialen Einlaß/Auslaß (1). Die Zentrifugation/Rotation erfolgt um die Längsachse, wie es im oberen Teil der Figur angedeutet ist, so daß ein Gradient von der zentralen Längsachse des Gefäßes bis an dessen Außenwand aufgebaut wird. Dadurch erfolgt die Trennung der Flüssigkeitskomponenten (z.B. 4, 5, 6). Noch während der Zentrifugation kann das beweglbare Glied (3) von unten (dem vom Einlaß/Auslaß (1) entfernt gelegenen Gefäßboden) nach oben in Richtung des Einlaß/Auslaßes (1) bewegt werden. Dadurch werden die Flüssigkeitskomponenten (4, 5, 6) nacheinander durch den Auslaß (1) herausgedrückt und können entsprechend separiert werden. Komponente (4) könnte z.B. die gewünschte Zellfraktion sein, Komponente (6) könnte die unerwünschten Zellen, die an Partikel gebunden sind, enthalten. Die Doppelpfeile im unteren Teil der Figur sind keine Bestandteile des Gefäßes, sondern sollen die Beweglichkeit des bewegbaren Glieds (3) andeuten. Durch Bewegung des bewegbaren Glieds (3) kann der Rauminhalt des Trennungsraums (2) verändert werden.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Beispiel 1

Als Ausgangsmaterial wurde Nabelschnurblut verwendet. Zunächst wurde der Anteil der B- Zellen im Ausgangsmaterial bestimmt (Figur 1a bis 1e).

Vor Inkubation mit Antiköφer-konjugierten magnetischen "Beads" wurde der Anteil der B- Zellen im Nabelschnurblut bestimmt. Figur 1a zeigt die Verteilung der Zellen bezüglich forward scatter (FSC; Größenverteilung) und side scatter (SSC; Granularität) sowie die zugehörige Negativkontrolle (Figur 1b). Der Anteil der CD10⁺-Zellen im Ausgangsmaterial lag im Bereich der Nachweisgrenze (< 0,1%) (Figur 1c), der Anteil der CD19⁺- bzw. CD20⁺- B-Zellen betrug 7,3% bzw. 7,9% (Figur 1d bzw. 1e).

Beispiel 2

Das gleiche Ausgangsmaterial wie in Beispiel 1 wurde mit CD10-, CD19- und CD20- Antiköφer-konjugierten "Beads" inkubiert und anschließend mit dem Biosafe Sepax™ prozessiert. Dazu wurde 50 ml Nabelschnurblut (ca. 3,5 x 10⁸ Zellen) für 15 Minuten mit 1 ,4 x 10⁹ "Beads" inkubiert.

Der Dichtegradient wurde während der 7-minütigen Zentrifugation mit einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 600 g aufgebaut.

Anschließend erfolgte die Separation in Plasma, Erythrozytenkonzentrat und "Buffy Coat" (Fraktion der mononukleären Zellen). Es wurde der Anteil der verbliebenen B-Zellen in den einzelnen Fraktionen bestimmt.

Das Ergebnis ist in Figur 2 gezeigt. Der Anteil der CD10⁺-Zellen lag nach wie vor im Bereich der Nachweisgrenze (0,2%) (Figur 2c), während der Anteil derCD19⁺- bzw. CD20⁺-B-Zellen auf 1 ,9% bzw.2,2% erniedrigt war (Figur 2d bzw. 2e). Tabelle 2: FACS-Analyse vor und nach Depletion der B-Zellen

Beispiel 3

Es wurde eine Depletion von B-Zellen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Zentrifugation für 7 Minuten bei 1250 g erfolgte.

Das Ergebnis ist in Figur 3 gezeigt. Figur 3a zeigt die Größenverteilung bzw. Granularität der Zellen, in Figur 3b ist die zugehörige Negativkontrolle (Figur 1b) zu sehen. Der Anteil der CD10⁺-Zellen lag nach wie vor im Bereich der Nachweisgrenze (0,1%) (Figur 3c), der Anteil der CD19⁺- bzw. CD20⁺-B-Zellen war auf 6,1% bzw. 7,5% reduziert (Figur 3d bzw. 3e).

Die nicht erfolgte bzw. nur geringe Abreicherung der B-Zellen scheint damit zusammenzuhängen, daß die Bindung Zelle-Primärantiköφer-Sekundärantiköφer-Beads höheren Zentrifugationsgeschwindigkeiten nicht standhält und zerbricht.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Anreicherung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Zusammensetzung, die ein Gemisch unterschiedlicher Zelltypen enthält, mit Partikeln in Kontakt bringt, die an eine Subpopulation unerwünschter Zellen in der Zusammensetzung binden;

b) das Gemisch aus Zellen und Partikeln zentrifugiert; und

c) die gewünschte Zellfraktion gewinnt, bevor die Zentrifugation beendet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung, die ein Gemisch unterschiedlicher Zelltypen enthält, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nabelschnurblut, peripherem Blut, Leukapheresat und Knochenmark.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Partikel höher ist als die Dichte der anzureichernden Zellen.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel im wesentlichen kugelförmig sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einen Durchmesser von 2,8 bis 5 μm haben.-

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel im wesentlichen Metallpartikel sind, insbesondere aus Eisen und/oder Nickel.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Moleküle, die an Antigene auf der Oberfläche der unerwünschten Zellen binden können, fest mit der Oberfläche der Partikel verbunden sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, die an Antigene auf der Oberfläche der unerwünschten Zellen binden können, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antiköφern, Liganden und Rezeptoren.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper, die an die Partikel gekoppelt sind, an andere Antikörper binden können, die wiederum an Antigene auf der Oberfläche der unerwünschten Zellen binden können.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zentrifugation durchschnittlich bei 200 bis 800 g durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zentrifugation für wenigstens 5 Minuten durchgeführt wird, bevor die gewünschte Zellfraktion gewonnen wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zentrifugation in einem Zentrifugationsbehältnis mit variablem Rauminhalt durchgeführt wird, wobei der Rauminhalt erhöht wird, um eine gewählte Menge des zu verarbeitenden Gemisches aufzunehmen, und erniedrigt wird, um die gewünschte Zellfraktion aus dem Zentrifugationsbehältnis zu drücken.

13. Verwendung eines hohlen Zentrifugationsbehältnisses, das um eine Drehachse drehbar ist und einen axialen Einlaß/Auslaß für die zu verarbeitende Mischung und die verarbeiteten Bestandteile der Mischung hat, wobei das Zentrifugationsbehältnis ein bewegbares Glied enthält, das einen Trennungsraum variabler Größe zur Aufnahme der Mischung definiert und bewegbar ist, um eine gewählte Menge der zu verarbeitenden Mischung durch den Einlaß in den Trennungsraum aufzunehmen und verarbeitete Bestandteile der Mischung während der Zentrifugation durch den Auslaß aus dem Trennungsraum herauszudrücken, zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Zentrifugationsbehältnis ein allgemein zylindrisches Zentrifugationsbehältnis ist, dessen bewegbares Glied ein Kolben ist, der in dem Zentrifugationsbehältnis so angeordnet ist, daß er flüssigkeitsdicht bewegt werden kann.