WO2006004173A1 - 生理的条件下でのウイルス粒子様構造体及びその形成方法 - Google Patents

生理的条件下でのウイルス粒子様構造体及びその形成方法 Download PDF

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capsid protein
amino acid
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Hiroshi Handa
Akira Nakanishi
Masaaki Kawano
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The Circle For The Promotion Of Science And Engineering
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a virus particle-like structure using a Urus protein, and a method for forming the same. Since this virus particle-like structure can accommodate other substances in it, it is promising as a carrier for drug delivery and gene therapy. book
  • virus particle-like structures were formed by collecting virus-like particles formed in cells.
  • the virus-like particles can be purified from cells, then dissociated into particle components (eg, VP 1 pentamer for SV40 virus), and virus-like particles reconstituted in a test tube.
  • particle components eg, VP 1 pentamer for SV40 virus
  • the conventional reconstitution method is performed under non-physiological conditions with high salt concentration, but there are problems such as inactivation of physiologically active substances incorporated into the particles or difficulty in dissolving in the solvent. Conditions are not appropriate for incorporating bioactive substances into the particles. Even with this method, it was difficult to efficiently reconstitute virus-like particles of uniform size.
  • the present invention intends to provide a method for forming particles of uniform size efficiently under physiological conditions when reconstructing a virus particle-like structure in a test tube. .
  • the present invention also provides a method of forming a virus particle-like structure in a host cell.
  • the present invention has achieved the object by adding proteins found in natural virus particles to the reconstitution environment in order to efficiently form uniform virus-like particles under physiological conditions in vitro.
  • the present invention provides a virus particle-like structure of uniform size composed of a virus protein and a particle formation promoting factor.
  • the present invention also provides a virus particle-like structure having a uniform size, which is composed of a virus protein and a particle formation promoting factor and contains an encapsulated substance.
  • the present invention also provides viral proteins in the presence of 130 mM to 500 iiiM-valent cation and 2 M to 50 mM divalent cation at pH 5 to pH 10.0 and room temperature, and a particle formation promoting factor.
  • a method for forming a virus particle-like structure of uniform size composed of an encapsulated substance, a virus protein surrounding the substance and a particle formation promoting factor is provided.
  • the present invention is further characterized in that a viral protein and a capsid protein VP2 comprising a binding region for the viral protein and linked with a physiologically active substance or a portion thereof are co-expressed in a host cell.
  • the present invention also provides a method for producing a viral particle population comprising a viral protein encapsulating a negatively charged polymer on the surface, wherein the virus protein and 360 parts of the viral capsid protein are 0.
  • a method comprising mixing 01 to 100 parts (by weight) of a polymer and dialysis against an aqueous solution containing a monovalent metal salt and a divalent metal salt is provided.
  • the negatively charged polymer is preferably DNA, various RNAs, or a synthetic nucleic acid-like structure.
  • the weight ratio of the virus protein to the negatively charged polymer added to 360 parts of the virus capsid protein is preferably 0.2 or more.
  • the virus protein constituting the virus particle-like structure is preferably a VP1 capsid protein of SV40 virus, K virus or BK virus.
  • SV40 virus protein examples include VP1 capsid protein or a mutant thereof.
  • the VP 1 capsid protein variant is, for example, a protein having 1 to several amino acid deletions, additions or substitutions with other amino acids in the VP 1 capsid protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Is exemplified. Specific substitutions include: Glu at position 49, Glu at position 51, Glu at position 160, Glu at position 163, Ser at position 216, and position 217 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Of Lys, 219 at position Glu, 332 position at Glu, position 333 at position Glu, and position 348 at Asp.
  • the particle formation promoting factor constituting the virus particle-like structure is preferably a virus particle force psid protein, an N-terminal region having particle formation promoting activity of the protein, or one to a plurality of amino acids in the protein.
  • the virus particle capsid protein is preferably the SV40 virus, JC virus, or BK virus capsid protein VP2.
  • the virus particle capsid protein is the SV40 virus capsid protein VP2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the virus particle capsid protein is at least positions 1 to 272 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the virus particle capsid protein is at least positions 1 to 272 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the SV40 virus comprising an amino acid sequence or comprising an amino acid sequence of at least positions 1 to 58, 59 to 118, 1 19 to 152, or 153 to 272.
  • the viral particle capsid protein is a VP 1 at least at positions 273 to 307 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Part of the SV40 virus capsid protein VP 2 comprising the amino acid sequence of the binding region, preferably linked to the desired bioactive substance, non-bioactive substance or mixture thereof to be introduced .
  • the non-physiologically active substance is, for example, a low molecular weight substance, a high molecular weight substance, or a mixture thereof.
  • the encapsulated factor is typically a physiologically active substance, such as a nucleic acid, a protein, or a low molecular weight substance.
  • the monovalent cation forming the virus particle-like structure of the present invention is preferably a sodium ion and used as sodium chloride.
  • the divalent cation forming the virus particle-like structure of the present invention is preferably a calcium ion and used as calcium chloride.
  • the concentration of the monovalent cation is, for example, 150, and the concentration of the divalent cation is, for example, 2 mM.
  • the present invention also relates to a composition for introducing a physiologically active substance into cells, comprising as an active ingredient the above-mentioned viral structure comprising a physiologically active molecule.
  • FIG. 1 shows an electron micrograph of a virus particle-like structure formed by the method of the present invention in the presence of a particle formation promoting factor.
  • Figure 2 shows an electron micrograph of a viral protein treated under physiological conditions in the absence of a particle formation promoting factor.
  • FIG. 3 shows an electron micrograph showing the state of formation of a virus particle-like structure when the ratio between the virus protein VP1 and the particle formation promoting factor VP2 is changed.
  • FIG. 4 shows an electron micrograph of a virus particle-like structure produced using the particle formation promoting factor VP 2 with the C-terminal side deleted.
  • FIG. 5 shows an electron micrograph of a virus particle-like structure produced using the particle formation promoting factor VP 2 having a point mutation introduced on the C-terminal side.
  • Figure 6 shows that when incubated under non-physiological conditions at pH 8-10, a uniform spherical particle-like structure is formed even in the absence of a particle formation promoting factor. An electron micrograph showing is shown.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of fractionating the virus particles prepared in Example 2 by sucrose density centrifugation and detecting them by Southern blotting.
  • FIG. 8 shows the distribution of PEG MA after fractionation of virus-like particles composed of VPVPVP 2 protein in the presence of pEG by sucrose density gradient centrifugation in the presence of pEG, and anti-VP 1 antibody. The distribution of the protein detected in is shown.
  • Figure 9 shows COS-1 cells via virus-like particles in Example 3. It shows that the PEG introduced in is expressed in the cell and fluorescent protein is produced.
  • FIG. 10 shows the results of Example 4, showing the relationship between the VP2 protein portion as a particle formation promoting factor and particle formation.
  • FIG. 11 shows the results of Example 5 and shows the portion of VP2 required for incorporation into the virus-like structure from VP1.
  • FIG. 12 shows the results of Example 6 and shows that MA is incorporated into a virus-like structure formed from VP1 under given conditions.
  • FIG. 13 shows the result of electron microscope observation of the product obtained in Example 6.
  • FIG. 14 shows a mixture of total RNA that had been previously treated with Rnase and total RNA that had not been subjected to Rnase and purified VP 1 protein in Example 7, and this mixture was mixed with a pH 5, 150 mM NaCK 2 mM CaC 12 solution. Reconstitution was performed by dialysis for 16 hours at room temperature. After reconstitution, the assembly mode of the VP1 pentamer in the substituted solvent was observed using an electron microscope. The figure shows RNase + treated with RNase and RNase- treated without RNase. This figure suggested that the formation of spherical virus-like particles was caused by the presence of RNA.
  • the virus that can be used as a protein source for forming viral protein particles in the present invention is not particularly limited as long as it can form particles from its main structural protein or particle outer shell constituent protein.
  • simian virus 40 SV40
  • JBK virus which is a human poliovirus
  • SV40 VP1 is particularly preferred.
  • particle shell-forming proteins include force psid protein VP1 (S V40, a human poliovirus: iC virus, BK virus, etc.
  • SV40 VP1 may be native VP1 or a variant thereof.
  • the mutant include a protein having a deletion of 1 to several amino acids, addition, or substitution with other amino acids in the VP1 capsid protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are: Glu at position 49, GIu at position 51, Glu at position 160, Glu at position 163, Ser at 216 position, Lys at position 217, Glu at position 219, Examples include substitution of at least one amino acid among Glu at position 332, Glu at position 333, and Asp at position 348.
  • the present invention relates to a protein (variant A) in which the Glu at position 160 is substituted with another amino acid and can form a rigid or stable virus-like protein particle compared to the wild type. MtA).
  • said Glu is replaced by Gin.
  • the present invention relates to a protein (mutant B; mtB) in which Glu at position 163 is replaced with another amino acid and forms a virus-like protein particle that is harder or more stable than the wild type.
  • a protein mutant B; mtB
  • the Glu is replaced by Gin.
  • the present invention provides a protein (mutant C; mtC) in which Asp at position 348 is substituted with another amino acid and forms a virus-like protein particle that is harder or more stable than the wild type.
  • Asp is preferably substituted by Asn.
  • the present invention relates to a protein (mutant D) in which Glu at position 160 and Glu at position 163 are substituted with other amino acids and form a rigid virus-like protein particle compared to the wild type. ; MtD).
  • the above Glu is preferably replaced by Gin.
  • the present invention relates to a virus-like protein particle in which Glu at position 160, Glu at position 163 and Asp at position 348 are substituted with other amino acids, and are rigid or stable compared to the wild type.
  • a protein (mutant E; mtE) is provided.
  • the above Glu is preferably replaced by Gin, and Asp is preferably replaced by Asn.
  • the present invention relates to a protein capable of forming rod-like virus-like protein particles at a high frequency, wherein Glu at position 332, Glu at position 333 and Asp at position 348 are substituted with other amino acids.
  • Mutant F; mtF) is provided.
  • the above Glu is preferably replaced by Gin, and Asp is preferably replaced by Asn.
  • the present invention relates to a protein in which the Glu at position 49 and the Glu at position 51 are substituted with other amino acids and form a virus-like protein particle that is rigid or stable compared to the wild type.
  • the Glu is preferably replaced by Gin.
  • the present invention provides Glu at position 49, Glu at position 51, Gli at position 160, Glu at position 163, Ser at position 216, Lys at position 217, Glu at position 219, Glu at position 332, A Glu at position 333 and an Asp at position 348 are substituted with other amino acids to provide a protein (mutant H; mtH) that is less likely to form virus-like protein particles than the wild type.
  • Said Glu is preferably substituted by Gin, Asp is preferably substituted by Asn, Ser is preferably substituted by Ala, and Lys is preferably substituted by Ala.
  • a particle formation promoting factor under the condition of pH 5-10.
  • virus intraparticle protein is preferable.
  • a virus particle tongue examples of the protein include capsid protein VP2 such as SV40 virus, JC virus, BK virus, or its N-terminal portion, or histone protein.
  • capsid protein VP2 such as SV40 virus, JC virus, BK virus, or its N-terminal portion, or histone protein.
  • a particularly preferred intraviral particle protein is VP2 of SV40 or its N-terminal portion.
  • the amino acid sequence of SV40 VP2 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • a virus-like structure is formed in vitro using SV40 VP2 or a portion thereof as the particle formation promoting factor of the present invention, at least the first amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 To the 58th amino acid sequence, the 59th amino acid sequence to the 118th amino acid sequence, the 119th to 152th amino acid sequence, and the 153rd to 272nd amino acid sequence. .
  • this capsid protein contains at least the VP1 binding region at positions 273 to 307 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It only needs to contain an amino acid sequence.
  • the protein in the virus particle of the present invention also has, for example, 1 to several amino acid residues added, deleted, and / or substituted with other amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its N-terminal sequence. It may be modified by the above and maintain the particle formation promoting factor activity.
  • the number of amino acid residues to be modified is, for example, 1 to 20, for example, 1 to: 15, or 1 to several.
  • the concentration of the viral protein constituting the outer shell of the particles is 50 ng / iL to 500 ng / L, preferably 70 ng to 200 ng, and is a protein as a particle formation promoting factor.
  • the quality concentration is from 1 ng / L to: L g / L, preferably from 10 ng / iL to 100 ng / i.
  • the concentration of the encapsulated substance when encapsulating the encapsulated substance in the virus particle varies depending on the type of the substance. 0 g / ⁇ ⁇ is preferably 10 ng / L to 1 g / L.
  • the above viral protein is (1) ⁇ 5 to ⁇ 10 pH range, and (2) at room temperature, (3) 130mM to 500mM -valent cation, (4) 2 // Spherical, uniform-sized particles can be formed by incubating in the presence of M-50 mM divalent cation and (5) particle formation promoting factor.
  • a sodium ion such as sodium chloride is preferable, and the concentration of sodium ion is preferably 140 mM to 160 mM, particularly 150 mM.
  • calcium ion As the divalent cation, calcium ion, force domum ion, manganese ion, magnesium ion, zinc ion and the like can be used, but calcium ion is particularly preferable, for example, calcium chloride is used.
  • the concentration of calcium ions is preferably 1.75 mM to 2.25 mM, particularly 2 mM.
  • the substance to be encapsulated may coexist at the time of incubation in the virus particle forming method.
  • the encapsulated substance is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids, that is, DNA or RNA, particularly MA, proteins or peptides, and various low molecular substances such as pharmaceutically active substances.
  • the above-mentioned virus structure comprising a physiologically active molecule thus prepared can be used for introducing the physiologically active substance into cells.
  • This enables drug delivery, gene therapy, etc.
  • introduction of bioactive substances into living cells for example, gene transfer, gene therapy, application to regenerative medicine using specific gene expression and function suppression, tissue using virus-like particles containing labeling substances It can also be applied to organ-specific or lesion-specific labeling methods.
  • the sample was ultrasonically crushed for 10 minutes with ice cooling under conditions of CYCLE 50% and output 5. Next, the cell lysate was centrifuged at 14,000 g and 4 ° C for 20 minutes, and the supernatant was collected.
  • Virus-like particles were dissociated into VP1 pentamers by adding EGTA and 30 mM DTT to the virus-like particle solution and incubating at 37 ° C for 1 hour. After incubating, the mixture was centrifuged at 15,000 g, 4 ° C for 10 minutes, and the resulting supernatant was subjected to gel filtration chromatography to purify the VP1 pentamer.
  • This chromatography was performed using HiLoad 16/60 Superdex 200 pg column (Phaemacia) under the conditions of 20 mM Tris-HC1 (pH 7.9), 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 niM DTT, 4 ° C.
  • the gene was incorporated into a PET-14b vector and transformed into E. coli BL21 strain.
  • the transformed E. coli was inoculated into 250 ml of LB medium and cultured at 37 ° C.
  • the culture medium was inductively expressed with lmM IPTG in the logarithmic growth phase (turbidity; OD value 0.3 (wavelength 660 nm)).
  • a cooled phosphate buffer PBS
  • the collected supernatant was mixed with 500 L of His resin (Qiagen) that had been equilibrated with the binding buffer in advance, and the mixture was agitated by gently rotating in a rotor for 1 hour at 4 ° C.
  • the stirred solution was centrifuged, the resin was pelleted, and the supernatant was removed.
  • wash buffer (20niM Tris-HCl (pH7.9), 10% glycerol, 500 mM KC1, 0.2 mM EDTA, 0.1% NP-40, 0.5 mM DTT, 20 mM imidazole) was added and stirred. .
  • the stirred solution was centrifuged again and the supernatant was carefully removed. This washing operation was repeated three times.
  • an EliSion buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10% glycerol, 500 mM KC1, 0.2 mM EDTA, 0.1% NP-40, 0.5 mM DTT, 1M imidazole). 500 ⁇ L was added and stirred, the stirred solution was centrifuged, and the supernatant was carefully collected, and this operation was repeated twice to obtain a total of 1 ml of SV40-VP2 protein.
  • the prepared SV40-VP1 protein pentamer and SV40-VP2 protein pentamer were used to reconstitute virus particles in vitro under physiological conditions. That is, in the case of pH 5-7, for example, VP1 pentamer protein 82.5ng / L, 150M Reconstitution was performed by adding 800 ng / L, 3.41 of VP2 protein to L, incubating at 4 ° C for 30 minutes, and dialyzing with a solution of 150 mM NaCl and 2 mM CaCl 2 using a dialysis method. That is, VP1 protein and VP2 protein were added so that the molar ratio was 360: 84. Virus-like particles were detected using electron microscopy. The results are shown in Figure 1.
  • VP1 pentamer 150 zL was dialyzed at room temperature with 150 mM NaCK 2 mM CaCl 2 with a pH of 4, or 5, or 6, or 7. This solution was collected 16 hours after the start of dialysis and observed under an electron microscope to observe the mode of VP 1 pentamer assembly observed under each condition. The result is shown in figure 2.
  • the solution was replaced at room temperature using a dialysis method with a physiologic solvent at pH 5.0. By observing the substituted solvent with an electron microscope, the mode of assembly observed when the concentration of VP2 protein was changed was observed.
  • Purified VP1 pentameric protein and purified AC40 VP2 protein (molecular weight about 34 KDa) and AC80 VP2 protein (molecular weight about 30 KDa) in molecular weight ratio VP1: forced lupoxyl end deletion VP2 360: 84 ratio Mix and incubate at 4 ° C for 30 min. This mixture was dialyzed at room temperature with a solution of pH 5.0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 .
  • PGP ⁇ RER PGP ⁇ RER
  • Phe and 277 at 276 Lie of position mutated to Hu (hereinafter referred to as FI ⁇ EE)
  • the mixed solution was collected 16 hours after the start of dialysis and observed under an electron microscope to confirm the mode of VP1 pentamer assembly when VP2 protein introduced with a point mutation was added. The results are shown in Fig. 5. In any case, the virus-like particle formation effect was not inhibited by the introduction of VP2 point mutation.
  • Observation of VP1 pentamer assembly under pH conditions of pH 8.0 to pH 10.0 Dialyze a solution containing purified VP 1 pentamer protein under conditions of pH 8.0 to pH 10.0. , I examined the assembly style. PH5. Need particle formation promoting factor! ) ⁇ Unlike pH 7.0, virus-like particle formation was observed with VP1 pentamer alone at pH 8.0 ⁇ 10.0 under physiological conditions.
  • 150 L of VP1 pentamer with a concentration of 270 ngZ L was dialyzed at room temperature with 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , pH 8, 9 or 10 solutions. The solution was collected 16 hours after the start of dialysis and observed under an electron microscope to observe the aggregation mode of the VP 1 pentamer seen under each condition. The results are shown in Fig. 7.
  • Example 1 was repeated. However, in the in vitro reconstitution process of virus-like particles under physiological conditions (3), DNA was incorporated into the virus-like particles by coexisting 3000 bp of plasmid. The resulting virus-like particles were subjected to sucrose density gradient centrifugation and fractionated, and DNA was detected by Southern blotting. As shown in Fig. 7, DNA was incorporated into virus-like particles.
  • the prepared SV40-VP1 protein pentamer and SV40-VP2 protein pentamer were used to reconstitute virus-like particles in vitro under physiological conditions.
  • DNA was added. That is, in the case of pH 5.0 to 7.0, for example, VP1 pentameric protein 75.7 ngZ / i L, VP2 protein 800 ngZ / 2.8 L, and 3,000 base pairs of circular double-stranded plasmid DNA (pG5 vector ) 5.7ng / 1, 21L was added.
  • the mixed solution was incubated at 4 ° C. for 30 minutes, and reconstitution was performed by dialysis using a solution of 150 n NaCl and 2 mM CaCl 2 using a dialysis method.
  • Sucrose density gradient centrifugation was performed to confirm that the DNA added to the reconstituted virus-like particle fraction was detected.
  • the centrifuged sample was fractionated, and the fraction was subjected to protease treatment to decompose the VP 1 protein.
  • the samples were separated by agarose electrophoresis and the Southern blotting method was used to confirm that DNA could be detected in the fraction of virus-like particles.
  • fractions 8, 9 and 10 contain virus-like particles, but as shown in Fig. 7, DNA was able to be contained in Will-like particles because DNA was detected at 8, 9, and 10. It was confirmed that
  • Example 2 was repeated. However, as a plasmid, pEG capable of expressing fluorescent protein (GFP) in mammalian eukaryotic cells was used. Formation of virus-like particles containing pEG plasmid DNA was carried out by sucrose density gradient centrifugation, and it was confirmed that DNA was contained in the fraction containing virus-like particles. 150 mM sodium chloride, 2 mM calcium chloride, 20 mM Tris H Reconstitute virus-like particles with VP1 VP2 protein in the presence of pEG plasmid in CI (pH 7.2) solvent, and virus-like particles containing plasmid DNA by sucrose density gradient centrifugation. was fractionated.
  • GFP fluorescent protein
  • Virus-like particles were detected by the Western blot method using an anti-VP1 antibody (one VP1), and PEG was detected by the Southern plot method. The result is shown in FIG. The numbers on the figure indicate the number of the fraction, the first is the top of the density gradient (Top), the last is the Bottom (Bottom), and P is the pellet that settled as a pellet at the bottom of the tube when centrifuged. Show. This DNA is resistant to treatment with the DNA-degrading enzyme Dnase I, suggesting that it is contained in the shell of the VP1-VP2 protein.
  • pEG DNA was introduced into C0S-1 cells. That is, C0S-1 cells were seeded in a 6 cm diameter dish in an amount of 6.65 ⁇ 10 4 cells and cultured overnight. The culture solution was removed so that the cells did not peel off, and about 100 / zL of virus-like particles containing the above plasmid DNA was added to the cells. After incubating at 37 ° C for 2 hours, the cells were allowed to acclimate to the culture every 15 minutes so that the cells did not dry out. After culturing, 1.5 mL of the culture solution was added to the cells and cultured at 37 ° C for 48 hours.
  • Example 4 Identification of the portion of VP2 as a particle formation promoting factor involved in the formation of a virus-like structure of VP1 protein extracellularly
  • the VP2 protein (full-length amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: : As shown in 1), 0.44 M of various regions and 2.2 M of SV40 VP1 protein were incubated in a solution (pH 5.0) containing 150 mM NaCl and 2 mM CaC12, and the products were observed with an electron microscope. .
  • a solution pH 5.0
  • FIG. 1 The result is shown in FIG.
  • “V” indicates that a pentamer-like uniform virus-like structure was formed
  • Ti indicates a microscopic particle
  • “(1)” indicates that no particle was formed.
  • “Tu” indicates that a tubular structure was formed.
  • Example 5 Determining the region of VP2 required to incorporate VP2 into a virus-like structure in a cell
  • VP2 or VP3 protein (VP3 is a sequence common to C-terminal of VP2) is co-expressed with VP1 in insect cells, VP2 and VP3 are included in the VLP formed.
  • GFP was fused to VP2 or VP3 or various fragments thereof in order to confirm the possibility of encapsulating a bioactive substance in a virus-like structure composed of VP1, and this fusion protein and VP1 was co-expressed to investigate whether the fusion protein was included in the virus-like structure.
  • the fusion protein includes four C-terminal fragments of VP2 protein (VP3 protein) containing VP2 protein, VP3 protein (part of VP2 protein), and VP1 binding region (VP2 position 273-307) (total 6 types)
  • VP3 protein C-terminal fragments of VP2 protein
  • VP3 protein part of VP2 protein
  • VP1 binding region VP2 position 273-307
  • GFC was fused to each N-terminal or C-terminal (total 12 types of fusion proteins).
  • An outline of the structure of a class of fusion proteins is shown in FIG. Baculoviruses that express these fusion proteins were prepared, and insect cells were co-infected with the in situ virus that expresses the fusion protein and the baculovirus that expresses VP1.
  • the tube was fixed in the SW55Ti rotor using a special adapter and centrifuged at 50,000 rpm at 4 ° C for 1 hour. After centrifugation, 55 1 solutions were fractionated from the top of the tube, and the 12th fraction was collected by adding 20 mM Tris-HCL (pH 7.9) to the remaining sample to make 55 1 and washing the bottom of the tube. 101 of each fraction was separated by SDS-PAGE, followed by Western blotting with anti-VP1 polyclonal antibody and anti-GFP monoclonal antibody (Roche). If VLP is formed in an insect cell, the peak of VP1 protein is detected in the 7th to 10th fractions.
  • GFP fusion tamper The quality peaks detected in the 7th to 10th fractions, similar to the VLP peaks, are suggested to be included in the formed VLPs. Based on this, the inclusion of the fusion protein in a virus-like structure was examined.
  • Example 7 Formation of virus-like particles incorporating RNA RNA was mixed with the purified VP 1 pentamer protein. This mixed solution was replaced with a solvent under physiological conditions by dialysis at room temperature. The assembly mode of the VP1 pentamer in the substituted solvent was observed using an electron microscope.
  • VP 1 pentamer with a cocoon concentration of SV40 Even if a VP 1 pentamer with a cocoon concentration of SV40 is allowed to stand under physiological conditions, particles cannot be formed. For example, ⁇ 5 ⁇ 7, when you stand at about songz i L concentration VPl pentamer in a solution containing 150 ⁇ NaCl, 2 ⁇ CaCl 2, not only form a tubular structure or amorphous aggregates.
  • VP2 protein at a concentration of about 15-20 ng / L under the same conditions, particles of uniform size can be formed efficiently. Under high pH conditions, it was observed that virus-like particles of uniform size were formed even at pH 8.0 to 10.0 without VP2 protein. In other words, from low salt concentration, pH 5! ) Virus particle-like structures can be produced under physiological conditions between H10.

Abstract

生理的条件下で均一なウイルス粒子を形成するための新規な方法の提供。例えばSV40ウイルスのVP1の如きウイルスタンパク質を、pH5.0～pH7.0及び室温にて、130mM～170mM塩化ナトリウムおよび1.5mM～2.5mMの二価陽イオンの存在下で、且つSV40のVP2の如き粒子形成促進因子の存在下で、インキュベートすることを特徴とする、ウイルスタンパク質から構成される均一なサイズのウイルス粒子集団の形成方法。ウイルス粒子中に被封入物質を封入する場合には、上記インキュベーションの際に被封入物質を共存させればよい。

Description

生理的条件下でのウィルス粒子様構造体及びその形成方法
技術分野
本発明はウルス夕ンパク質を用いたウィルス粒子様構造体、 及び その形成方法に関する。 このウィルス粒子様構造体はその中に他の 物質を収容できるので、 ドラ明ッグデリバリー、 遺伝子治療における キャリア一などとして有望である。 書
背景技術
従来のウィルス粒子様構造体の形成は、 細胞内で形成させたウイ ルス様粒子を回収することにより作成していた。
またこのウィルス様粒子を細胞より精製し、 それから粒子構成単 位 （例えば SV40ウィルスでは VP 1五量体） に一旦解離させ、 試験管 内で再びウィルス様粒子を再構成させる方法もある。
従来の再構成方法は高塩濃度の非生理的な条件で行われるが、 粒 子内部に取り込ませる生理活性物質が失活したりあるいは溶媒に難 溶であったりするなどの問題があり、 この条件は生理活性物質を粒 子内に取り込ませるには適切ではない。 またこの方法を用いても均 一なサイズのウィルス様粒子を効率よく再構成させることが困難で あった。
発明の開示
本発明では試験管内でウィルス粒子様構造体を再構成する際、 生 理的条件下でかつ効率的に均一なサイズの粒子形成を行う ことがで きるための方法を提供しょうとするものである。 本発明はまた、 宿主細胞内でウィルス粒子様構造体を形成する方 法を提供する。
本発明は試験管内において生理的条件下で効率的にサイズが均一 なウィルス様粒子形成を行うために、 天然のウィルス粒子中に見ら れるタンパク質を再構成環境に加えることで、 目的を達成した。 従って、 本発明は、 ウィルスタンパク質と粒子形成促進因子とか ら構成される、 均一なサイズのウィルス粒子様構造体を提供する。 本発明はまた、 ウィルスタンパク質と粒子形成促進因子とから構成 され、 被封入物質を収容した、 均一なサイズのウィルス粒子様構造 体を提供する。
本発明はまた、 ウィルスタンパク質を、 pH5〜pH 1 0. 0及び室温に て、 1 30mM〜 500iiiM —価の陽イオン及び 2 M〜 50mMの二価陽イオン の存在下で、 且つ粒子形成促進因子の存在下でィンキュベ一卜する ことを特徴とする、 ウィルスタンパク質と粒子形成促進因子から構 成される均一なサイズのウィルス粒子集団の形成方法 ； 並びにウイ ルスタンパク質及び被封入物質を、 pH5〜pH 10及び室温にて、 OmM 〜 500mMの一価の陽ィオン及び 2 Μ〜50ΠΙΜの二価の陽ィオンの存在 下で、 且つ粒子型性促進因子の存在下でィンキュベー卜することを 特徴とする、 被封入物質とそれをとり巻く ウィルスタンパク質及び 粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウィルス粒子様構 造体の形成方法を提供する。
本発明は更に、 ウィルス蛋白質と、 当該ウィルス蛋白質について の結合領域を含んでなり且つ生理活性物質が連結されたキヤプシド 蛋白質 VP 2又はその部分とを、 宿主細胞中で共発現させることを特 徴とする、 ウィルス蛋白質とキヤプシド蛋白質 VP 2又はその部分と から構成されるウィルス様粒子に生理活性物質を導入する方法を提 供する。 本発明はまた、 表面が負に帯電した高分子を封入したウィルス蛋 白質とから構成されるウィルス粒子集団の製造方法において、 ウイ ルス蛋白質と、 当該ウィルスキヤプシド蛋白質 360部に対して 0. 01 〜 100部 （重量比） の高分子とを混合し、 一価の金属塩および 2価 の金属塩を含む水溶液に対して透析する、 ことを特徴とする方法を 提供する。
' 上記負に帯電した高分子は、 好ましくは、 DNA、 各種 RNA、 合成核 酸様構造体である。 上記ウィルス粒子集団の製造方法において、 ゥ ィルス蛋白質と、 当該ウィルスキヤプシド蛋白質 360部に対して加 える負に帯電した高分子の重量比は好ましくは 0. 2以上である。
ウィルス粒子様構造体を構成する前記ウィルス蛋白質は、 好まし くは、 SV40ウィルス、 Kウィルス又は BKウィルスの VP 1キヤプシド 蛋白質である。
前記 SV40ウィルスの蛋白質として、 VP 1キヤプシド蛋白質又はそ の変異体が挙げられる。 前記 VP 1キヤプシド蛋白質の変異体は、 例 えば、 配列番号 ： 2に示すアミノ酸配列を有する VP 1キヤプシド蛋 白質において、 1〜数個のアミノ酸の欠失、 付加又は他のアミノ酸 による置換を有する蛋白質が例示される。 具体的な置換としては、 配列番号 ： 2に記載のアミノ酸配列における、 49位の G l u、 51位の G l u、 160位の Gl u、 163位の Gl u、 216位の Se r、 217位の Lys、 2 19位の G l u、 332位の Gl u、 333位の Gl u及び 348位の Aspの内の少なく とも 1個 のアミノ酸の置換が例示される。
ウィルス粒子様構造体を構成する前記粒子形成促進因子は、 好ま しくは、 ウィルス粒子力プシド蛋白質、 当該蛋白質の粒子形成促進 活性を有する N-末端領域、 又は当該蛋白質において 1〜複数のアミ ノ酸が付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾さ れており、 且つ粒子形成促進活性を維持している蛋白質である。 前 記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質は、 好ましくは、 SV40ウィルス、 J Cウィルス又は BKウィルスのキヤプシド蛋白質 VP 2である。 より具 体的な例では、 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質は、 配列番号 ： 1 に示すアミノ酸配列を有する SV40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP 2である。
本発明のウィルス様構造体を生体外、 たとえば試験管内で形成さ せる場合、 好ましくは、 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質は、 配 列番号 ： 1 に示すアミノ酸配列中の、 少なく とも 1位〜 272位のァ ミノ酸配列を含んで成るか、 あるいは少なく とも 1位〜 58位、 59位 〜1 18位、 1 19位〜 152位、 又は 153位〜 272位のアミノ酸配列を含ん でなる、 SV40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP 2の部分である。
本発明のウィルス用構造体を、 宿主細胞内で形成させる場合、 好 ましくは、 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質は、 配列番号 ： 1 に 示すアミノ酸配列中の、 少なく とも 273位〜 307位の VP 1結合領域の アミノ酸配列を含んでなる、 SV40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP 2 の部分であり、 これには好ましくは所望の導入されるべき生理活性 物質、 非生理活性物質またはそれらの混合物が連結されている。
前記非生理活性物質は、 例えば低分子物質あるいは高分子物質あ るいはそれら混合物である。
前記被封入因子は、 典型的には、 生理活性物質であり、 例えば、 核酸、 蛋白質、 又は低分子物質である。
本発明のウィルス粒子様構造体を形成する前記一価の陽イオンは 、 好ましくは、 ナトリウムイオンであり、 塩化ナトリウムとして使 用される。 また、 本発明のウィルス粒子様構造体を形成する前記二 価の陽イオンは、 好ましくは、 カルシウムイオンであり、 塩化カル シゥムとして使用される。 前記一価の陽イオンの濃度は、 例えば 15 0 であり、 そして前記二価陽イオンの濃度は、 例えば 2mMである。 本発明はまた、 生理活性分子を含んで成る前記のウィルス構造体 を有効成分とする、 生理活性物質を細胞に導入するための組成物に 関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 粒子形成促進因子の存在下での本発明の方法により形成 したウィルス粒子様構造体の電子顕微鏡写真を示す。
図 2は、 粒子形成促進因子の非存在下で、 ウィルス蛋白質を生理 的条件下で処理した場合の、 電子顕微鏡写真を示す。
図 3は、 ウィルス蛋白質 VP 1と粒子形成促進因子 VP 2との比率を変 えた場合の、 ウィルス粒子様構造体の形成の状態を示す、 電子顕微 鏡写真を示す。
図 4は、 C-末端側を欠失させた粒子形成促進因子 VP 2を用いて生 成させたウィルス粒子様構造体の電子顕微鏡写真を示す。
図 5は、 C-末端側に点変異を導入した粒子形成促進因子 VP 2を用 いて生成させたウィルス粒子様構造体の電子顕微鏡写真を示す。 図 6は、 pH8〜 10の非生理的条件下でインキュべ一ショ ンを行な つた場合、 粒子形成促進因子の非存在下でも、 均一な球形のウィル ス粒子様構造体が形成されることを示す、 電子顕微鏡写真を示す。
図 7は、 実施例 2において調製したウィルス粒子を蔗糖密度遠心 分離により分画し、 サザンブロッテイ ングにより検出した結果を示 す図である。
図 8は、 実施例 3において、 pEGの存在下で VP卜 VP 2タンパク質か ら構成されたウィルス様粒子をショ糖密度勾配遠沈で分画した後の PEG MAの分布、 及び抗 VP 1抗体で検出されたタンパク質の分布を 示す。
図 9は、 実施例 3において、 ウィルス様粒子を介して COS- 1細胞 に導入された PEGが当該細胞で発現され蛍光タンパク質が産生され たことを示す。
図 10は、 実施例 4の結果を示し、 粒子形成促進因子としての VP2 タンパク質の部分と粒子形成との関係を示す。
図 11は、 実施例 5の結果を示し、 VP1からのウィルス様構造体へ の取り込みのために必要な VP2の部分を示す。
図 12は、 実施例 6の結果を示し、 所定の条件下で VP1から形成さ れるウィルス様構造体に MAが取り込まれることを示す。
図 13は、 実施例 6 において得られた生成物の電子顕微鏡観察の結 果を示す。
図 14は、 実施例 7 において、 予め Rnase処理を施した total RNA、 Rnase処理を施さない total RNAと精製した VP 1タンパク質を混合し 、 この混合液を pH5、 150 mM NaCK 2 mM CaC 12溶液に室温で 16時間 透析をすることで再構成を行った。 再構成を行った後、 電子顕微鏡 を用いて置換した溶媒中の VP1五量体の集合化様式を観察した。 図 は RNase処理を施したものを RNase+、 RNase処理を施さないものを R Nase- として表している。 この図から球状ウィルス様粒子の形成は RNAの存在によって起きていることが示唆された。 発明を実施するための最良の形態
本発明においてウィルスタンパク質粒子を形成するためのタンパ ク質源として使用しうるウィルスは、 その主要構造タンパク質また は粒子外殻構成タンパク質から粒子を形成しうるものであれば特に 限定されない。 例えば、 主要構造タンパク質として、 シミアンウイ ルス 40 (Simianvirus 40;SV40) 、 ヒ トポリオ一マウィルスである J BKウィルス、 等ががあげられる。 SV40の VP1が特に好ましい。 粒 子外殻形成タンパク質としては、 例えば力プシドタンパク質 VP1 (S V40、 ヒ トポリオ一マウィルスである： iCウィルス、 BKウィルス、 な どがあげられる。
SV40の VP1としては、 生来の VP1でもよく、 またその変異体であつ てもよい。 変異体としては、 配列番号 ： 2に示すアミノ酸配列を有 する VP 1キヤプシド蛋白質において、 1〜数個のアミノ酸の欠失、 付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質が例示され、 具体 的な置換の例として、 配列番号 ： 2に記載のアミノ酸配列における 、 49位の Glu、 51位の GIu、 160位の Glu、 163位の Glu、 216位の Ser、 217位の Lys、 219位の Glu、 332位の Glu、 333位の Glu及び 348位の Asp の内の少なく とも 1個のアミノ酸の置換が例示できる。
1つの態様において、 本発明は 160位の Gluが他のアミノ酸により 置換されており、 野性型に比べて硬い （rigid) 又は安定なウィル ス様タンパク質粒子を形成することができるタンパク質 （変異体 A ； mtA) を提供する。 好ましくは、 上記の Gluは、 Ginにより置換さ れる。
他の態様において、 本発明は 163位の Gluが他のアミノ酸により置 換されており、 野性型に比べて硬い （rigid) 又は安定なウィルス 様タンパク質粒子を形成するタンパク質 （変異体 B ； mtB) を提供 する。 好ましくは、 上記 Gluは Ginにより置換される。
他の態様において、 本発明は、 348位の Aspが他のアミノ酸により 置換されており、 野性型に比べて硬い又は安定なウィルス様タンパ ク質粒子を形成するタンパク質 （変異体 C ； mtC) を提供する。 上 記 Aspは好ましくは Asnにより置換される。
他の態様において、 本発明は、 160位の Glu及び 163位の Gluが他の アミノ酸により置換されており、 野性型に比べて硬い （rigid) ゥ ィルス様タンパク質粒子を形成するタンパク質 （変異体 D ； mtD) を提供する。 上記の Gluは好ましくは Ginにより置換される。 他の態様において、 本発明は、 160位の Glu、 163位の Glu及び 348 位の Aspが他のアミノ酸により置換されており、 野性型に比べて硬 い （rigid) 又は安定なウィルス様タンパク質粒子を形成するタン パク質 （変異体 E ; mtE) を提供する。 上記の Gluは好ましくは Gin により置換され、 そして Aspは好ましくは Asnにより置換される。 他の態様において、 本発明は、 332位の Glu、 333位の Glu及び 348 位の Aspが他のアミノ酸により置換されており、 棒状のウィルス様 タンパク質粒子を高頻度に形成することができるタンパク質 （変異 体 F ; mtF) を提供する。 上記の Gluは好ましくは Ginにより置換さ れ、 そして Aspは好ましくは Asnにより置換される。
他の態様において、 本発明は、 49位の Glu及び 51位の Gluが他のァ ミノ酸により置換されており、 野性型に比べて硬い （rigid) 又は 安定なウィルス様タンパク質粒子を形成するタンパク質 （変異体 G ； mtG) を提供する。 上記 Gluは好ましくは Ginにより置換される。 他の態様において、 本発明は、 49位の Glu、 51位の Glu、 160位の G li 163位の Glu、 216位の Ser、 217位の Lys、 219位の Glu、 332位の G lu、 333位の Glu及び 348位の Aspが他のアミノ酸により置換されてお り、 野性型に比べてウィルス様タンパク質粒子を形成しにく くなつ ているタンパク質 （変異体 H ; mtH) を提供する。 上記の Gluは好ま しくは Ginにより置換され、 Aspは好ましくは Asnにより置換され、 S erは好ましくは Alaにより置換され、 そして Lysは好ましくは Alaに より置換される。
なお、 上記の変異体の調製方法は特開 2002-360266に詳細に記載 されている。
本発明においては、 pH5〜10の条件下で、 粒子形成促進因子を使 用することが必要である。 粒子形成促進因子としては、 例えば、 ゥ ィルス粒子内タンパク質が好ましい。 例えば、 ウィルス粒子内タン パク質として、 SV40ウィルス、 JCウィルス、 BKウィルス、 などのキ ャプシドタンパク質 VP2又はその N-末端側部分、 あるいはヒス トン タンパク質などがあげられる。 特に好ましいウィルス粒子内タンパ ク質は SV40の VP2又はその N-末端側部分である。 SV40の VP2のアミノ 酸配列を配列番号 ： 1 に示す。 本発明の粒子形成促進因子として SV 40の VP2又はその部分を用いて生体外でウィルス様構造体を形成さ せる場合、 配列番号 ： 1 に記載のアミノ酸配列中、 少なく とも、 第 1位のアミノ酸から第 58位のアミノ酸までのアミノ酸配列、 第 59位 のアミノ酸から第 118位までのアミノ酸配列、 及び 119位から 152位 のアミノ酸配列、 及び第 153位から 272位のアミノ酸配列を含めばよ い。
Sv40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP2を用いて、 ウィルス様構造 体を細胞内で形成させる場合、 このキヤプシド蛋白質は、 配列番号 ： 1 に示すアミノ酸配列中の、 少なく とも 273位〜 307位の VP1結合 領域のアミノ酸配列を含んでいればよい。
本発明のウィルス粒子内蛋白質はまた、 例えば配列番号 ： 1 に示 すアミノ酸配列又はその N -末端配列において、 1〜数個のアミノ酸 残基が付加、 欠失、 及び/又は他のアミノ酸による置換によって修 飾されており、 且つ粒子形成促進因子活性を維持しているものであ つてもよい。 修飾されるアミノ酸残基の数はたとえば 1〜 20個、 例 えば 1〜： 15個、 あるいは 1〜数個である。
本願発明の方法によりウィルス粒子を形成する際の、 粒子の外殻 を構成するウィルスタンパク質の濃度は、 50ng/ iL〜 500ng/ L、 好ましくは 70ng〜200ngであり、 粒子形成促進因子としてのタンパ ク質の濃度は、 1 ng/ L〜： L g/ L、 好ましくは 10ng/ iL〜100ng / iである。 また、 ウィルス粒子に被封入物質を封入する場合の被 封入物質の濃度は、 その物質の種類により異なるが、 0. lng/ L〜l 0 g/ ΐ^ 好ましくは 10ng/ L〜 1 g/ Lである。
本発明によれば、 上記のウィルスタンパク質を、 （ 1 ) ρΗ5〜ρΗ1 0の pH範囲、 及び （ 2 ) 室温にて、 （ 3 ) 130mM〜 500mM —価の陽ィ オン、 （ 4 ) 2 //M〜50mMの二価陽イオン、 及び （ 5 ) 粒子形成促 進因子の存在下でインキュベートすることにより、 球状の均一なサ ィズの粒子を形成することができる。 一価の陽イオンとしてはナト リウムイオン、 例えば塩化ナトリウムが好ましく、 ナトリウムィォ ンの濃度は、 好ましくは 140mM〜 160mMであり、 特に 150mMが好まし い。
二価陽ィオンとしては、 カルシウムイオン、 力 ドミゥムイオン、 マンガンイオン、 マグネシウムイオン、 亜鉛イオンなどが使用でき るがカルシウムイオンが特に好ましく、 例えば塩化カルシウムとし て使用される。 カルシウムイオンの濃度は、 好ましくは 1.75mM〜2. 25mMであり、 とくに 2 mMが好ましい。
なお、 pH8〜pH10の範囲で、 室温にて、 130〜 170mMの塩化ナト リ ゥム、 1.5mM〜2.5mMの二価陽ィオンの存在下でィンキュベートする 場合、 粒子形成促進因子を添加しなくても、 球状の均一なサイズの ウィルス粒子様構造体を形成せしめることが出来る。
本発明の、 被封入物質を封入したウィルス粒子の形成方法におい ては、 上記のウィルス粒子形成方法において、 インキュベーショ ン の際に被封入物質を共存させればよい。 被封入物質としては特に限 定されないが、 例えば核酸、 即ち DNA又は RNA、 特に MA、 タンパク 質又はペプチド、 各種の低分子物質、 例えば医薬活性物質、 などが 挙げられる。
このようにして作製した、 生理活性分子を含んで成る前記のウイ ルス構造体は、 その生理活性物質を細胞に導入するために使用する ことが出来る。 これにより、 ドラッグデリバリ一、 遺伝子治療など のための、 生理活性物質の生細胞への導入、 例えば、 遺伝子導入、 遺伝子治療、 特定遺伝子発現及び機能抑制を用いた再生医療などへ の応用、 標識物質などを含むウイルス様粒子を用いた組織及び臓器 特異的又は病巣特異的な標識方法などに応用できる。 実施例
次に、 実施例により、 本発明を更に具体的に説明する。
実施例 1. ウィルス粒子の調製
( 1 ) ウィルスタンパク質 （VP1) 五量体の調製
10cm径の組織培養用ディ ッシュ 50枚に Sf 9細胞を IX 107個づっ蒔 き、 SV40のウィルスタンパク質 （VP1) を発現する組換えパキュ口 ウィルスを、 m.0. i. (Multiplicity of Infect ion； 重複感染度） 5 〜10で感染させた。
感染 72時間後に、 細胞を、 スクレイパーを用いて培地ごと回収し た後、 冷却したリン酸緩衝液 （PBS) により 2回洗浄した。 回収し た細胞に、 氷冷したソニケ一シヨン用緩衝液 （20mM Tris-HCl (pH7 .9) , 1% (w/v) デォキシコール酸ナトリウム （D0C) ， 2mM PMSF ) を 10mL加え、 TAITEC社の VP- 15S (ソニケ一タ一） を用いて、 DUTY
CYCLE 50%、 出力 5の条件で、 氷冷しながら 10分間超音波破砕し た。 次に、 細胞破砕液を 14, 000 g, 4 °Cにて 20分間遠心し、 その上 清を回収した。
SW41Ti用 Open Top Ultraclear Tube (Beckman) に 4種類の密度 の異なる塩化セシウム溶液 （50%、 40%、 30%、 20% (w/v) ) を 密度の高いほうから順番に 1.5mlづっ静かに重層し、 その上に、 上 記の細胞破砕液 5mLを重層し、 SW41Tiロー夕一 （BECKMAN) で 30， 000 rpm、 4 °Cにて 2.5時間遠心した。 遠心後、 密度勾配の中程に白く形 成される SV40ウィルスのウィルス様粒子 （Virus- like particle； V LP) の層を回収した。 回収した溶液を、 SW55Ti用 Open Top Ultrale ar Tube (BECKMAN) に移し、 37% (w/v) 塩化セシウム溶液を、 容 量チューブの先端から約 5 mmに達するまで添加し、 これを SW55Ti口 —ター （BECKMAN) で 50， 000rpm、 4 °Cにて 20時間遠心し、 再度形成 された VLP層を回収した。 '
得られた精製ウィルス様タンパク質の溶液に、 1/100量の 10% (V /v) 界面活性剤 NP- 40を添加し （最終濃度 0.1%) 、 20Mm Tris-HCl (pH7.9) ， 0.1%NP- 40の透析溶液中で 4 °Cにて 24時間透析を行い 、 塩化セシウムを除去した。 透析後、 15, 000 g, 4°Cにて 10分間遠 心し、 その上清を回収した。
次に、 0.25 Mエチレングリコールビス ( /3—アミノエチルエーテ ル） 一 Ν, Ν, Ν', Ν'—四酢酸 （EGTA) と 1 Μジチオスレィ トール （DTT ) とを、 各々の終濃度が 25mM EGTA及び 30mM DTTとなるようにウイ ルス様粒子溶液に添加し、 37°Cにて 1時間ィンキュベー卜すること により、 ウィルス様粒子を VP1の五量体へと解離させた。 インキュ ペートの後、 15， 000 g, 4 °Cにて 10分間遠心し、 得られた上清をゲ ル濾過クロマトグラフィーにかけて、 VP1の五量体の精製を行.つた 。 このクロマトグラフィーは、 HiLoad 16/60 Superdex 200 pgカラ ム （Phaemacia) を用い、 20mM Tris- HC1 (pH7.9) , 150mM NaCl, 5 mM EGTA, 5niM DTT, 4 °Cの条件下で行った。
得られたフラクショ ンのそれぞれの 1部分を取って SDSポリアク リルアミ ドゲル電気泳動にかけ、 分子量約 20 OkDaに検出された VP1 五量体とし、 このタンパク質を含むフラクショ ンを、 VP1五量体の 含有フラクションして、 液体窒素により凍結した後一 80°Cで保存し た。
( 2 ) SV40-VP2タンパク質の調製
ァミノ末端にヒスチジン配列および FLAG配列を挿入した SV40- VP 2 遺伝子を PET- 14bベクターに組込み大腸菌 BL21株に形質転換した。 形質転換した大腸菌を 250mlの LB培地に接種し、 37°Cでしんとう培 養した。 培養液が、 対数増殖期 （濁度 ； O.D.値 0.3 (波長 660nm) ) で lmM IPTGでタンパク質の誘導発現を行った。 誘導発現 4時間後 に、 大腸菌を遠心して回収した後、 冷却したリン酸緩衝液 （PBS) により 2回洗浄した。 回収した大腸菌に、 氷冷した結合緩衝液 （20 mM Tris-HCl (pH7.9) , 10%グリセロール， 500mM KCl, 0.2mM EDT A, 0.1¾ NP-40, 0.5mM DTT, lOmMイミダゾール） を 40ml加え、 TAIT EC社の VP-15S (ソニケ一夕一）を用いて、 DUTY CYCLE 50%、 出力 5の 条件で、 氷冷しながら 10分間超音波破砕した。 次に、 細胞破砕液を 14, 000g、 4°Cにて 20分間遠心し、 その上清を回収した。
回収した上清を、 予め結合緩衝液で平衡化しておいた 500 Lの Hi sレジン （Qiagen社） と混ぜ 4°C、 1時間ロータ一でゆっく りと回 転させることで攪拌した。 攪拌した溶液を遠心し、 レジンをペレツ トにし上清を除いた。 このレジンにゥォッシュ緩衝液 （20niM Tris- HCl (pH7.9) ， 10%グリセロール， 500mM KC1， 0.2mM EDTA, 0.1% N P-40, 0.5mM DTT, 20mMイミダゾ一ル） を lOmL加え、 攪拌した。 攪 拌した溶液を再び遠心し、 上清を注意深く除いた。 この洗浄操作を 3回繰り返した。 最後にこのレジンに、 エリュ一シヨ ン緩衝液 （ （ 20mM Tris-HCl (pH7.9) ， 10%グリセロール， 500mM KC1, 0.2mM E DTA， 0.1% NP-40, 0.5mM DTT, 1Mイミダゾール） を 500 ^L加え、 攪 拌した。 攪拌した溶液を遠心し、 上清を注意深く回収した。 この操 作を二回繰り返すことで、 計 lmlの SV40-VP2夕ンパク質を得た。
( 3) 生理的条件下でのウィルス粒子の試験管内再構成
調製した SV40- VP1夕ンパク質五量体と SV40- VP2夕ンパク質を用い て生理的条件下でのウィルス粒子の試験管内再構成を行った。 即ち 、 pH5〜7の場合、 例えば、 VP1五量体タンパク質 82.5ng/ L， 150M Lに、 VP2タンパク質 800ng/ L， 3.4 1を加えて、 4 °Cで 30分間ィ ンキュベーシヨンし、 150mM NaCl, 2mM CaCl2の溶液で透析法を用 いて透析することで再構成を行った。 即ち、 VP1タンパク質と VP2夕 ンパク質の mol比が 360 :84になるように加えた。 ウィルス様粒子の 検出は、 電子顕微鏡観察を用いて行った。 結果を図 1 に示す。
( 4 ) 生理的条件下での VP1五量体の集合化様式の検討
精製した VP 1五量体タンパク質を含む溶液を、 透析により生理的 条件の溶媒に置換し、 その集合化様式を調べた。 粒子形成が観察さ れた （ 3 ) の結果とは異なり、 生理的条件下での pH5.0〜7.0の場合 、 VP 1五量体のみではウィルス粒子様構造体の形成は殆ど見られな かった。 VP1、 例えば 270ngノ xL濃度の VP1五量体 150 zLを、 室温で 、 150mM NaCK 2 mM CaCl2で pHが 4、 または 5、 または 6、 または 7の溶液で透析した。 透析開始 16時間後にこの溶液を回収し、 電子 顕微鏡下で観察して、 各条件下で見られる VP 1五量体の集合化様式 を観察した。 結果を図 2に示す。
( 5 ) 生理的条件下において VP1五量体に VP2夕ンパク質を比率を 変えて加えた場合の集合化様式
精製した VP1五量体タンパク質に分子量比で VP1タンパク質 ： VP2 タンパク質 = 360： 10.5、 360： 21、 360 ： 42、 360： 84となるように タンパク質溶液を混合した。 その溶液を pH5.0の生理的条件の溶媒 に透析法を用いて室温で置換した。 置換した溶媒を電子顕微鏡観察 することで VP2タンパク質の濃度が変化した時に見られる集合化の 様式を観察した。
例えば、
Figure imgf000015_0001
1^濃度の^1五量体150 2レと 1. 1/i g / / L濃度 の VP2タンパク質を 1. 1 ^し 2.2/i L, 4.4 L、 8.8 Lとなるように それぞれタンパク質溶液を混合した。 その溶液を 4 °C、 30m inイン キュベーシヨンして、 pH5、 150mM NaCK 2 mM CaCl2の溶液で 16時 間、 室温で透析した。 この溶液を回収し、 電子顕微鏡下での観察に 供し、 VP2夕ンパク質の濃度変化に伴う VP1五量体の集合化の様式を 観察した。 結果を図 3に示す。 幾つかの実験区ではこの pH条件下で 特徴的な桿状構造体が見られるがそれと同時に球状のウィルス様粒 子が形成されているのがわかる。
(6 ) 力ルポキシル末端を欠失した AC13 VP2タンパク質、 AC4 0 VP2タンパク質、 AC80 VP2タンパク質を加えた場合の VP1五量 体の集合化様式
精製した VP1五量体タンパク質と精製した AC40 VP2夕ンパク質 (分子量約 34KDa) 、 AC80 VP2タンパク質 （分子量約 30KDa) を分 子量比で VP1： 力ルポキシル末端欠失 VP2=360： 84の比で混ぜ、 4 °Cで 30minインキュベーションした。 この混合液を pH5.0、 150mM Na Cl、 2mM CaCl2の溶液で室温にて透析した。
例えば、 75.7ng/ 濃度の VP1、 150 ^ Uこ 763ng/ L濃度の厶 C4 0 2を2.6/2し 又は 758ng/ L濃度の A C80VP2を 2.3 Lを加ええ 、 30min、 4 °Cでインキュベーショ ンした。 この混合液を上記の溶 液を用いて室温で 16時間透析したのち、 この混合液を回収、 電子顕 微鏡下での観察に供して、 カルボキシル末端を欠失した VP2タンパ ク質を加えた場合の VP1五量体の集合化の様式を観察した。 結果を 図 4に示す。 共に VP2アミノ酸配列を一部欠損しているのにも関わ らず、 ウィルス様粒子形成を誘起することができることがわかる。
( 7 ) 点変異を導入した VP2タンパク質を加えた場合の VP 1五量体 集合化の観察
VP1五量体タンパク質と各種の点変異を導入した VP2タンパク質、 283位から 285位の Pro, Gly, G が Arg， Glu, Argに変異したもの （ 以下 PGP→RER) 、 276位の Pheと 277位の lieが (Huに変異したもの （ 以下 FI→EE) 、 あるいは Alaに変異したもの （以下 FI— AA) 、 296位 の Leuと 300位の Leuが Alaに変異したもの （以下 LPLLL—APLLA) 等の 各種 VP2夕ンパク質を分子量比で、 VP1 ： 点変異体 VP2 = 360： 84の比 で混合し、 4 °Cで 30min静置し、 その後、 室温で pH5.0、 150mM NaCl 、 2 mM CaCl2の溶液に透析した。
例えば 82.5ngZ L濃度の VP1 150 2 Lに 984ngZ L濃度の PGP— R ER VP2を 2.7 L、 又は 1. 18 x g / L濃度の FI→EE VP2を 2.3/iL 、 又は 779ngZ x L濃度の LRLLL→ARLLA VP2を 3.5 し 又は 1. 13/ g / L濃度の FI→AA VP2を 2.4 Lを加え、 30min、 4 °Cで静置し 、 この混合液を上記の条件で透析した。 透析開始 16時間後にこの混 合液を回収し、 電子顕微鏡下での観察に供して、 点変異を導入した VP2夕ンパク質を加えた場合の VP1五量体集合化の様式を確認した。 結果を図 5 に示す。 いずれの場合も VP2の点変異導入によってウイ ルス様粒子の形成効果が阻害されることはなかった。
( 8 ) pH8.0〜pH10.0の pH条件下での VP1五量体集合化の観察 精製した VP 1五量体タンパク質を含む溶液を、 pH8.0〜pH10.0の条 件で透析し、 その集合化様式を調べた。 粒子形成促進因子が必要な PH5.！)〜 pH7.0の条件とは異なり、 生理的条件下での pH8.0〜 10.0の 場合、 VP1五量体のみでもウィルス様粒子形成が観察された。 例え ば 270ngZ L濃度の VP1五量体 150 Lを、 室温で、 150mM NaCl、 2 m M CaCl2で pHが 8、 または 9、 または 10の溶液で透析した。 透析開 始 16時間後にこの溶液を回収し、 電子顕微鏡下で観察して、 各条件 下で見られる VP 1五量体の集合化様式を観察した。 結果を図 7 に示 す。
実施例 2. DNAを取り込んだウィルス様粒子の形成
実施例 1 を反復した。 ただし、 生理的条件下でのウィルス様粒子 の試験管内再構成の工程 （ 3 ) において、 3000bpのプラスミ ドを共 存させる事により、 ウィルス様粒子への DNA取り込みを行った、 形 成されたウィルス様粒子をショ糖密度勾配遠心分離にかけて分画、 サザンブロッテイ ング法により、 DNAの検出を行った。 図 7 に示す とおり、 ウィルス様粒子中に DNAが取り込まれた。
調製した SV40-VP1夕ンパク質五量体と SV40- VP2夕ンパク質を用い て生理的条件下でのウィルス様粒子の試験管内再構成を行った。 そ の際に、 DNAを加えた。 即ち、 pH5.0〜7.0の場合、 例えば、 VP1五量 体タンパク質 75.7ngZ /i L、 に、 VP2タンパク質 800ngZ / し 2.8 Lを加え、 さらに 3000塩基対の環状二本鎖プラスミ ド DNA (pG5 vector) 5.7ng/ 1 , 21 Lを加えた。 その混合溶液を 4 °Cで 30分 間インキュベーショ ンし、 150n NaCl、 2 mMCaCl2の溶液で透析法を 用いて透析することで再構成を行った。
再構成をしたウィルス様粒子の画分に加えた DNAが検出されるこ とを確認するために、 ショ糖密度勾配遠心を行った。 遠心したサン プルを分画し、 その画分をプロテア一ゼ処理することで VP 1タンパ ク質を分解した。 そのサンプルをァガロース電気泳動で分離し、 サ ザンブロッテイ ング法を行うことで、 DNAがウィルス様粒子の画分 に検出できることを確認した。 通常は 8、 9及び 10番の画分がウイ ルス様粒子を含むが、 図 7で示す通り、 DNAが 8 , 9， 10番に検出 できたことでウィル 様粒子の中に DNAが包含できていることを確 認した。
実施例 3. DNAを取り込んだウイルス様粒子を用いての細胞への 遺伝子導入
実施例 2を反復した。 但し、 プラスミ ドとして、 哺乳類真核細胞 内で蛍光タンパク質 （GFP) を発現できる pEGを用いた。 pEGプラス ミ ド DNAを含むウィルス様粒子の形成はショ糖密度勾配遠沈により 行い、 ウィルス様粒子を含む画分に DNAが含まれることを確認した 。 即ち、 150mM塩化ナトリウム、 2 mM塩化カルシウム、 20mM Tris H CI (pH7.2) の溶媒中、 pEGプラスミ ドの存在下で、 VP1 VP2タンパ ク質を用いてウィルス様粒子を再構成し、 ショ糖密度勾配遠沈でプ ラスミ ド DNAを含むウィルス様粒子を分画した。
ウィルス様粒子は抗 VP1抗体 （ 一 VP1) を用いた Westernブロッ ト法で、 PEGは Southernプロッ ト法で検出した。 結果を図 8に示す 。 図上の数字はフラクショ ンの番号を示し、 最初が密度勾配の トツ プ （Top) 最後がボトム （Bottom) であり、 Pは遠沈した際にチュ —ブ底にペレッ トとして沈澱したものを示す。 この DNAは、 DNA分解 酵素 Dnase I による処理に耐性であるため、 VP 1-VP2タンパク質の 殻に含まれていることが示唆された。
上記ウィルス様粒子を用いて、 pEG DNAを C0S-1細胞に導入した 。 即ち、 C0S-1細胞を、 直径 6 cmのディ ッシュに 6.65X 104細胞の量 でまき、 一晩培養した。 細胞が剥がれないように培養液を除き、 上 記のプラスミ ド DNAを含むウィルス様粒子約 100/zLを細胞に加えた 。 37°Cにて 2時間インキュベーションした後、 その際細胞が乾かな いように 15分間おきに培養液に細胞をなじませた。 培養後、 培養液 1.5mLを細胞に加え、 37°Cにて 48時間培養した。 この後、 細胞の GFP タンパク質の発現を蛍光顕微鏡で確認し、 細胞へのプラスミ ド DNA の導入を確認した。 結果を図 9に示す。 pEGによりコードされる蛍 光タンパク質の発現が多くの細胞に見られ、 （図 9において、 白く 不定形に見えるものが蛍光タンパク質を発現した細胞） DNAを含む ウィルス粒子により高効率の遺伝子導入が確認された。
実施例 4. 細胞外での VP1蛋白質のウィルス様構造体の形成に関 与する粒子形成促進因子としての VP2の部分の特定
SV40の VP1蛋白質からのウィルス様構造体の形成に必要な、 粒子 形成促進因子としての SV40のキヤプシド蛋白質 VP2の領域を特定す るため、 図 10に示す、 VP2蛋白質 （全長アミノ酸配列は、 配列番号 ： 1 に示す通り） の種々の領域 0.44 Mと SV40の VP1蛋白質 2.2 Mと を、 150mM NaCl及び 2 mM CaC12を含む溶液 （pH 5.0) 中でインキュ ベー卜し、 生成物を電子顕微鏡で観察した。 結果を図 10に示す。 図 中、 「V」 は 5量体の均一なウィルス様構造体が形成されたことを 示し、 「Ti」 は微小形粒子を示し、 「（一）」 は粒子が形成されなか つたことを示し、 「Tu」 は、 チューブ状の構造体が形成されたこと を示す。
図 10の結果から明らかな通り、 SV40のキヤプシド蛋白質 VP2が粒 子形成促進因子として機能するためには、 配列番号 ： 1 のアミノ酸 配列中の、 少なく とも 1位〜 58位のアミノ酸配列及び 119位〜 272位 のアミノ酸配列が必要である。
実施例 5. 細胞内で、 ウィルス様構造体に VP2を取り込む場合に 必要な VP2の領域の決定
SV40の VP2または VP3夕ンパク質 （VP3は VP2の C末端と共通な配列 である） を昆虫細胞内で VP1と共発現させると、 形成される VLPの内 部に VP2、 VP3が包含されることが報告されている。 これをこの現象 を利用して、 VP1から構成されるウィルス様構造体に生理活性物質 を封入する可能性を確かめるため、 VP2もしくは VP3又はその種々の 断片に GFPを融合させ、 この融合タンパク質と VP1とを共発現させる ことにより、 当該融合タンパク質がウィルス様構造体に包含される か検討した。
実験方法
融合タンパク質としては、 VP2タンパク質、 VP3タンパク質 （VP2 タンパク質の部分） 、 及び VP1結合領域 （VP2の 273位— 307位） を含 む VP2タンパク質 （VP3タンパク質） の 4種類の C末端断片 （合計 6 種類のタンパク質） にっき、 夫々の N-末端又は C-末端に GFCを融合 させたもの （合計 12種類の融合タンパク質） を用いた。 これら 12種 類の融合タンパク質の構造の概略を図 11に示す。 これらの融合夕ン パク質を発現させるバキュロウィルスを作製し、 当該融合タンパク 質を発現させる場居路ウィルスと、 VP 1を発現させるバキュロウィ ルスとを昆虫細胞に共感染させた。
84時間後に細胞をスクレイパーで回収した後、 氷冷した PBS (-)で 細胞を洗浄した。 細胞の破砕は超音波破砕により行った。 10cm径の ディ ッシユー枚当たり 500 1のソニケ一ショ ンバッファー （ 20mM T ris-HCL (pH7.9) 、 1% sodium deoxycholate (DOC) 、 2mM phenyl me thy 1 sul f onyl fluoride (PMSF)、 1 n g/ml chymos tat in, aprot i nin leupept in, ant ipain, peps tat in) をカロえ、 超音波破砕装置 を用いて氷冷しながら溶液が透明になるまで行った。 超音波破砕後 15, OOOxg, 4°Cで 10分間遠心し、 その上清を細胞溶解液とした。 細 胞溶解液の一部を、 SDS- PAGEで分離後、 抗 VP1ポリクローナル抗体 と抗 GFPモノクローナル抗体 (Roche製) でウエスタンブロッテイ ン グを行い V P 1タンパク質及び G F P融合タンパク質の発現を確認した。 調製した細胞溶解液を 20 Tris-HCL (pH7.9) とあわせて 20 l とし、 5X41 mm open top tube (Bekman社製） 内にあらかじめ形成 させておいた 20mM Tris-HCL (pH7.9) に溶解させた 20 % -40 % (w/v ) ショ糖密度勾配溶液 0.6ml上に静かに重層した。 専用のアダプタ 一を用いてチューブを SW55Tiローター内に固定し、 50， 000rpm、 4°C で 1時間遠心を行った。 遠心後、 チューブの上端より 55 1ずつ溶液 を分画し、 12フラクション目は残ったサンプルに 20mM Tris-HCL (p H7.9) を加え 55 1としチューブの底を洗うようにして回収した。 各々の画分の 10 1を SDS- PAGEで分離した後、 抗 VP1ポリクローナル 抗体と抗 GFPモノクローナル抗体 （Roche製） でウエスタンブロッテ イ ングを行った。 昆虫細胞内で VLPが形成されれば、 7-10番目のフ ラクシヨ ンに VP1タンパク質のピークが検出される。 GFP融合タンパ ク質のピークが VLPのピークと同様に 7- 10番目のフラクショ ンに検 出されたものは、 形成された VLP中に包含されていることが示唆さ れる。 これによつて融合タンパク質のウィルス様構造体への包含を 検討した。
結果を図 11に示す。
この結果から明らかな通り、 少なく とも VP1結合領域を含む VP2夕 ンパク質の断片の C-末端側に GFPを融合させた場合、 VP 1から形成さ れるウィルス様構造体は融合タンパク質を取り込むことができた。
この結果は、 GFPに代えて目的とする生理活性物質を VL2または Vs onoPl結合領域を含む断片に連結すれば、 その生理活性物質をウイ ルス様構造体中に取り込むことができることを示唆している。
実施例 6. 生体外での、 ウィルス様構造体への DNAの取り込み
SV40の VP1タンパク質と MAとを、 VP1 : MA= 600 : 0〜 1の重量 比で混合し、 30分間、 氷上で冷却した後、 150mM NaCl及び 2 mM CaC 12を含む溶液 （pH 5) に対して、 室温にて 16時間透析した。 この 透析物の一部は、 電子顕微鏡観察のため、 及びタンパク質の定量 （ inputタンパク質） のために使用し、 他の一部はシユ ークロースク ッシヨ ンを用いる遠心分離にかけ、 粒状物及び DNAを回収した。 こ の回収物を用いて、 （ 1 ) タンパク質の定量 （粒子を形成したタン パク質の量） 、 （ 2 ) プロナーゼ Kによりタンパク質を分解下後の MAの量 （inputDNAの量） 、 及び （3 ) Maseによる封入されていな い DNAの分解除去及びプロナ一ゼ Kによる夕ンパク質分解の後に残 つた DNA (粒子中に封入されていた DAN) の量を測定した。
結果を図 12及び図 13に示す。 図 12から明らかな通り、 VP1タンパ ク質 600重量部に対して MAの量が 0.2重量部以上である場合に MAが VP1ウィルス様構造体に取り込まれた。
実施例 7. RNAを取り込んだウィルス様粒子の形成 精製した VP 1五量体夕ンパク質に RNAを混合した。 この混合液を生 理的条件の溶媒に透析法を用いて室温で置換した。 電子顕微鏡を用 いて置換した溶媒中の VP1五量体の集合化様式を観察した。
例えば、 500ng//i 1濃度の VP1五量体 20 1と 938.7ng/ /21濃度の to tal MAO.79 1を混合し、 20mM Tris-HCl (pH7.9) , 150mM NaCl、 5m M EGTA、 5mM DTT溶液で、 メスアップすることで体積を 100 / 1とし た。 その溶液を 4°C、 30minインキュベーショ ンして、 pH5、 150mM N aCl、 2πιΜ CaCl2の溶液に 16時間、 室温で透析することで置換した。 この溶液を回収し、 電子顕微鏡を用いて、 置換した溶媒中の VP1五 量体の集合化様式を観察した。 結果を図 14に示す。 Total RNAの添 加によつ.て球状のウィルス様粒子が形成されているのが分かる。 産業上の利用可能性
髙濃度の SV40の VP 1五量体を生理的条件下において静置しても、 粒子を形成させることはできない。 例えば、 ρΗ5〜 7、 150πιΜ NaCl 、 2 πιΜ CaCl2を含む溶液中で VPl五量体を約 SOngZ i L濃度で静置す ると、 チューブ状構造体または不定形の凝集体しか形成しない。 一 方、 同じ条件で VP2夕ンパク質約 15— 20ng/ / Lの濃度で加えること により、 効率よく均一なサイズの粒子が形成できる。 また高 pH条件 下、 pH8.0〜10.0では VP2夕ンパク質無しでも均一なサイズのウイル ス様粒子を形成することが観察された。 つまり低塩濃度、 pH5から！) H10の間での生理的条件下で、 ウィルス粒子様構造体の作製ができ るようになった。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ウィルスタンパク質と粒子形成促進因子とから構成される、 均一なサイズのウィルス粒子様構造体。
2. ウィルスタンパク質と粒子形成促進因子とから構成され、 被 封入物質を収容した、 均一なサイズのウィルス粒子様構造体。
3. 前記ウィルス蛋白質が、 SV40ウィルス、 JCウィルス又は BKゥ ィルスの VP1キヤプシド蛋白質である、 請求項 1又は 2に記載のゥ ィルス粒子様構造体。
4. 前記 SV40ウィルスの蛋白質が、 VP1キヤプシド蛋白質又はそ の変異体である、 請求項 3に記載のウィルス素粒子様構造体。
5. 前記 VP1キヤプシド蛋白質の変異体が、 配列番号 ： 2 に示す アミノ酸配列を有する VP 1キヤプシド蛋白質において、 1〜数個の アミノ酸の欠失、 付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質 である、 請求項 4に記載のウィルス様粒子構造体。
6. 前記置換が、 配列番号 ： 2に記載のアミノ酸配列における、 49位の Glu、 51位の Glu、 160位の Glu、 163位の Glu、 216位の Ser、 21 7位の Lys、 219位の Glu、 332位の Glu、 333位の Glu及び 348位の Aspの 内の少なく とも 1個のアミノ酸の置換である、 請求項 5に記載のゥ ィルス様粒子構造体。
7. 前記粒子形成促進因子が、 ウィルス粒子のキヤプシド蛋白質 、 当該蛋白質の粒子形成促進活性を有する N-末端領域、 又は当該蛋 白質において 1〜複数のアミノ酸が付加、 欠失及び/又は他のアミ ノ酸による置換により修飾されており、 且つ粒子形成促進活性を維 持している蛋白質である、 請求項 1 〜 6のいずれか 1項に記載のゥ ィルス粒子様構造体。
8. 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質が、 SV40ウィルス、 JCゥ ィルス又は BKウィルスのキヤプシド蛋白質 VP2である、 請求項 7 に 記載のウィルス粒子様構造体。
9 . 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質が、 配列番号 ： 1 に示す アミ ノ酸配列を有する SV40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP2である
、 請求項 7又は 8 に記載のウィルス粒子様構造体。
10. 前記ウィルス粒子キヤプシドタンパク質が、 配列番号 ： 1 の 示すアミ ノ酸配列中の、 少なく とも 1 — 272位のアミ ノ酸を含んで なる、 SV40ウイルスのキヤプシドタンパク質 VP2の部分である請求 項 7 または 8 に記載のウィルス粒子様構造体。
11. 前記ウィルス粒子キヤプシ ドタンパク質が、 配列番号 ： 1 の 示すアミ ノ酸配列中の少なく とも、 1 一 58位、 あるいは 59— 118位
、 あるいは 119一 152位、 あるいは 153位から 272位のアミ ノ酸を含ん でなる、 SV40ウィルスのキヤプシドタンパク質 VP2の部分である請 求項 7 または 8 に記載のウィルス粒子様構造体。
12. 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質が、 配列番号 ： 1 に示す アミノ酸配列中の、 少なく とも 273位〜 307位の VP 1結合領域のァミ ノ酸配列を含んでなる、 SV40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP2の部 分である、 請求項 7又は 8 に記載のウィルス粒子様構造体。
13. 前記被封入因子が生理活性物質または非生理活性物質または それらの混合物である、 請求項 2〜 12のいずれか 1項に記載のウイ ルス粒子構造体。
14. 前記非生理活性物質が低分子物質あるいは高分子物質あるい はそれら混合物である、 請求項 2〜 12のいずれか 1項に記載のウイ ルス粒子構造体。
15. 前記生理活性物質が、 核酸、 蛋白質、 又は低分子物質である 、 請求項 13に記載のウィルス様粒子構造体。
16. ウィルスタンパク質を、 pH5〜pH10及び室温にて、 130mM〜50 OmM 一価の陽イオン及び 2 M〜50mMの二価陽ィオンの存在下で、 且つ粒子形成促進因子の存在下でィンキュベ一卜することを特徴と する、 ウィルスタンパク質と粒子形成促進因子から構成される均一 なサイズのウィルス粒子集団の形成方法。
17. ウィルスタンパク質及び被封入物質を、 pH5〜pH 10及び室温 にて、 130mM〜 500niMの一価の陽ィオン及び 2 M〜 50mMの二価の陽ィ オンの存在下で、 且つ粒子型性促進因子の存在下でィンキュペート することを特徴とする、 被封入物質とそれをとり巻くウィルスタン パク質及び粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウィル ス粒子様構造体の形成方法。
18. 前記一価の陽イオンがナトリウムイオンである、 請求項 16又 は Πに記載の方法。
19. 前記二価の陽イオンがカルシウムイオンである、 請求項 16〜 18のいずれか 1項に記載の方法。
20. 前記一価の陽イオンの濃度力 Π 50ιηΜであり、 そして前記二価 陽ィオンの濃度力 mMである、 請求項 16〜 19のいずれか 1項に記載 の方法。
21. 前記ウィルス蛋白質が、 SV40ウィルス、 J Cウィルス又は BKゥ ィルズの VP 1キヤプシド蛋白質である、 請求項 16〜 20のいずれか 1 項に記載の方法。
22. 前記粒子形成促進因子が、 ウィルス粒子力プシド蛋白質、 当 該蛋白質の粒子形成促進活性を有する N-末端領域、 又は当該蛋白質 において 1〜複数のアミノ酸が付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸 による置換により修飾されており、 且つ粒子形成促進活性を維持し ている、 請求項 16〜21のいずれか 1項に記載の方法。
23. 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質が、 SV40ウィルス、 ウ ィルス又は BKウィルスのキヤプシド蛋白質 VP2である、 請求項 22に 記載の方法。
24. 前記ウィルス粒子キヤプシド蛋白質が、 配列番号 ： 1 に示す アミノ酸配列を有する SV40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP 2である
、 請求項 22又は 23に記載の方法。
25. 前記ウィルス粒子キヤプシドタンパク質が、 配列番号 ： 1の 示すアミノ酸配列中の、 少なく とも 1 一 272位のアミノ酸を含んで なる、 SV40ウィルスのキヤプシドタンパク質 VP2の部分である請求 項 23または 24に記載の方法。
26. 前記ウィルス粒子キヤプシドタンパク質が、 配列番号 ： 1 の 示すアミノ酸配列中の少なく とも、 1 一 58位、 あるいは 59— 1 18位
、 あるいは 1 19一 152位、 あるいは 153位から 272位のアミノ酸を含ん でなる、 SV40ウィルスのキヤプシドタンパク質 VP 2の部分である請 求項 23または 24に記載の方法。
27. 前記被封入因子が生理活性物質または非生理活性物質または それらの混合物である、 請求項 17〜 26のいずれか 1項に記載の方法
28. 前記非生理活性物質が低分子物質あるいは高分子物質あるい はそれら混合物である、 請求項 17〜26のいずれか 1項に記載の方法
29. 前記生理活性物質が、 核酸、 蛋白質、 又は低分子物質である 、 請求項 27に記載の方法。
30. ウィルス蛋白質と、 当該ウィルス蛋白質についての結合領域 を含んでなり且つ生理活性物質が連結されたキヤプシド蛋白質 VP2 又はその部分とを、 宿主細胞中で共発現させることを特徴とする、 ウィルス蛋白質から構成されるウィルス様粒子に生理活性物質を導 入する方法。
31. 前記ウィルス蛋白質が SV40ウィルスの VP 1キヤプシド蛋白質 又はその変異体であり、 前記 VP2タンパク質が、 配列番号 ： 1 に示 すアミノ酸配列中の、 少なく とも 273位〜 307位の VP 1結合領域のァ ミノ酸配列を含んでなる、 SV40ウィルスのキヤプシド蛋白質 VP 2の 部分である、 請求項 30に記載の方法。
32. 請求項 13〜 15のいずれか 1項に記載のウィルス粒子構造体を 有効成分とする、 生理活性物質を細胞に導入するための組成物。
33. 表面が負に帯電した高分子を封入したウィルス蛋白質とから 構成されるウィルス粒子集団の製造方法において、 ウィルス蛋白質 と、 当該ウィルスキヤプシド蛋白質 360部に対して 0. 01〜 100部 （重 量比） の高分子とを混合し、 一価の金属塩および 2価の金属塩を含 む水溶液に対して透析する、 ことを特徴とする方法。
34. 上記負に帯電した高分子が MA、 各種 RNA、 合成核酸様構造体 である、 請求項 33に記載される方法。
35. 上記ウィルス粒子集団の製造方法において、 ウィルス蛋白質 と、 当該ウィルスキヤプシド蛋白質 360部に対して加える負に帯電 した高分子の重量比が 0. 2以上である、 請求項 33に記載される方法
36. 前記ウィルス蛋白質が、 SV40ウィルス、 J Cウィルス又は BKゥ ィルスの VP 1キヤプシド蛋白質である、 請求項 33に記載の方法。
37. 前記ウィルス蛋白質が、 配列番号 ： 2に示す、 SV40ウィルス の VP 1キヤプシド蛋白質又はその変異体である、 請求項 36に記載の 方法。
38. 前記 1価金属イオンがナトリウムイオンであり、 前記 2価金 属イオンがカルシウムイオンである、 請求項 33〜 37のいずれか 1項 に記載の方法。
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