WO2005102268A2 - Cholinesterase-inhibitoren in liposomen sowie deren herstellung und verwendung - Google Patents

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WO2005102268A2
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Werner Frantsits
Eberhard Pirich
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Definitions

  • compositions based on cholinesterase inhibitors in liposomes on the preparation of such compositions and on their therapeutic applications.
  • Central inhibitors of cholinesterases are used for the pharmacotherapy of mild and moderate Alzheimer's disease in order to partially restore the reduced function of the cholinergic conduction system in the brain caused by this syndrome.
  • Recent research has shown that many cholinesterase inhibitors not only block acetyl and butyryl cholinesterase through different mechanisms, but also have direct effects on neuronal nicotinic acetylcholine receptors. These receptors, the natural ligand of which is acetylcholine, are found not only on cholinergic nerves, but also in the serotonergic and gluta-atergenic nervous system, where they control the release of the respective neurotransmitter.
  • This effect occurs at very different concentrations of the agent in question, occurs at different receptor binding sites of the receptor, and can - in part depending on the concentration of the cholinesterase inhibitor itself and / or on the concurrent acetylcholine concentration - in one Blockage or an increase in the action of acetylcholine on the receptor result.
  • galantamine since at concentrations that produce a therapeutically effective cholinesterase inhibition, it is an allosterically modulating ligand at a binding site distinct from the acetylcholine binding site (Samochocki et al., Acta Neurol Scand Suppl. 2000/176: 68-73; Dalas-Bailador et al., Mol Pharmacol. 2003; 64 (5): 1217-26). This will have the effect of inhibiting cholinesterase of galantamine potentiated increased concentration of acetylcholine additionally. Tacrine apparently also binds to this and another binding site of the receptor (Svensson and Nordberg, Neuroreport 1996; 7 (13): 2201-5).
  • Nicotinic agonists have also been shown to be impaired in their therapeutic applicability by side effects such as high blood pressure and neurosuscular paralysis.
  • Peripheral cholinesterase inhibitors are considered unsuitable for analgesic therapy in humans, mainly due to the problem of side effects (Ghelardini et al., Presynaptic Auto- and Heteroreceptors in the Cholinergic Regulation of Pain. In: Trends in Receptor Research, Elsevier Science Publishers BV , 1992).
  • Transdermal formulations of cholinesterase inhibitors based on plasters which contain the active ingredient dissolved or distributed in a dermal penetration enhancer are known.
  • passive transdermal systems include: EP-0376067, EP-0377147, EP-0667774, EP-0599952 and EP0517840 for Physostig in; WO-9934782 for rivastigmine; EP-0680325 for galantamine and WO-0132115 for huperzine.
  • Moriearty et al. (Methods Find Exp Clin Pharmacol 1993; 15 (6): 407-12) describe such systems for metrifonate or its hydrolysis product, which is active as a cholinesterase inhibitor
  • transdermal systems are all designed for applications that require systemic administration of the respective active ingredient.
  • the choice of the transdermal route is given by the desire to release the active substance slowly and evenly into the bloodstream and / or to avoid the "first pass" breakdown in the liver that occurs when taken orally, so that therapeutically optimal plasma levels over a long period of time
  • the systemic effect is achieved in that the active ingredient penetrates the skin by means of passive diffusion and is absorbed into the blood stream by subdermal capillary vessels.
  • the active ingredient can also be temporarily deposited or bound in the subcutaneous fatty tissue in order to get from there In the skin itself there is intentionally only little retention of the active substance, and the systems mentioned are therefore unsuitable for the therapy of neuropathic pain or the impairment of the dermal sensory function by neurodegeneration controlled fre Is known active pharmaceutical ingredients (eg see overview in Ulrich, Biosci Rep. 2002; 22 (2): 129-50), in particular also for use in special transdermal “plaster” systems (for example disclosed in WO-8701938 and US-5718914) and in gels (US-5064655). Also the formulation of local anesthetics in topical applied liposomes are known to the person skilled in the art, eg describes US-4937078 Liposomes containing common sodium channel blockers such as tetracaine, lidocaine, etc.
  • a liposomal formulation of the cholinesterase inhibitor neostigmine for use as an analgesic has been described (Grant et al., Acta Anaesthesiol Scand. 2002; 46 (1): 90-4), but was administered intrathecally (ie into the connective tissue) so that the observed analgesic effect was a central.
  • composition which produces an active substance depot in the skin from which substance is continuously released, which also achieves better bioavailability and a longer half-life compared to systemic use.
  • these goals are achieved by providing a liposomal system for the topical administration of cholinesterase inhibitors.
  • cholinesterase inhibitors in liposomes of a certain composition and size and subsequent formulation of these liposomes in suitable galenical systems for transdermal administration can achieve the aforementioned goals.
  • the scalable process for active substance encapsulation disclosed in WO-0236257 has proven to be particularly advantageous for the production and loading of the liposomes with active substance on account of its high efficiency and at the same time extremely gentle process conditions.
  • other methods known in the art for the production and loading of liposomes can also be used.
  • the loading of liposomes with active substances can be divided into two main categories: loading the membrane and loading the intraliposomal aqueous phase.
  • galantamine base is soluble in ethanol
  • the proportion of membrane-bound and unbound galantamine was about the same. For this reason, an attempt was subsequently made to include the intraliposomal aqueous phase
  • galantamine has chemical properties similar to doxorubicin and can be enclosed in liposomes by pH gradient-controlled loading.
  • the most important characteristic is the liposome membrane / liposome medium distribution coefficient.
  • the octanol / buffer distribution coefficient was found to be a good one
  • the active ingredient must contain protonatable amino groups, so that the active ingredient is hydrophilic at low pH and lipophilic at neutral or alkaline pH.
  • liposomes with different lipid compositions were prepared in a suitable loading buffer, preferably in a citric acid / sodium carbonate buffer. After the liposomes were made at low pH, the surrounding medium was alkalized and a pH gradient was created. After adding galantamine to the alkalized medium, the active ingredient migrated into the liposomes thanks to this pH gradient, where it was protonated and remained stable in the liposomes.
  • the extent of the loading or the loading capacity is primarily determined by the ratio of the pH values inside and outside the liposomes.
  • active substance / lipid ratios in the range of 200-400 nmol active substance per ⁇ mol lipid were able to achieve values similar to those known from the literature on actively loaded liposomes.
  • An increase in the active substance concentration in the loading medium did not lead to an increase in the loading capacity.
  • the active loading described above is a three-stage process consisting of vesicle formation, addition of active ingredients and alkalization. It was therefore a further object of the invention to establish a one-step manufacturing process which could be implemented using the cross-flow module disclosed in WO-0236257. For this purpose, galantamine was dissolved in citric acid solution using
  • the examples below show, among other things, that the quality of the liposomes loaded with active ingredients can be improved by variation, in particular by reducing the cholesterol content in the vesicle membrane, especially with regard to their ability to penetrate the skin.
  • stability tests for the products from the three-stage and the one-stage process prove that both products even after more than six months Storage, the product stability and quality has remained unchanged.
  • the loading capacity can be further increased by increasing the average liposome size from approximately 150-200 nm (as is mostly used in the experiments described herein) to 300 to 500 nm.
  • the efficiency of the process i.e. the amount of liposomally enclosed active ingredient per ml of suspension, by increasing the
  • Fig.l shows a schematic representation of a device for producing the liposomes.
  • Fig.2 shows HPLC results from galantamine inclusion experiments in liposomes. Dark bars represent galantamine in the retentate (i.e. liposomal galantamine), light bars on the other hand in the filtrate (not included galantamine) and the empty bar the total amount of galantamine; Ordinate: galantamine in ⁇ g / ml.
  • Fig.3 shows HPLC results of galantamine inclusion experiments in liposomes. Dark bars represent galantamine in the retentate (i.e.
  • liposomal galantamine liposomal galantamine
  • light bars on the other hand, in the filtrate (not included galantamine) and the empty bars represent the total amount of galantamine; first three bars: positively charged liposomes with stearylamine; last three bars: negatively charged liposomes with E-PG; 3A: galantamine HBr; 3B: Galantamine base.
  • Fig.4 shows HPLC results of galantamine inclusion experiments in liposomes. Dark bars represent galantamine in the retentate (ie liposomal galantamine), light bars on the other hand in the filtrate (not included galantamine) and the empty bar the total amount of galantamine.
  • Fig.5 shows the results of a stability test with actively loaded galantamine liposomes at different pH values aqueous phase; Ordinate: active substance concentration in nmol active substance per ⁇ mol lipid; Abscissa: period in weeks since the preparation of the preparations.
  • Fig.6 shows HPLC data of loading preformed liposomes with galantamine as a function of temperature and loading time. Data in percent of the presented galantamine concentration.
  • Fig.7 shows HPLC data of actively loaded liposomes in the presence of an excess of galantamine from two production attempts. Dark bars represent the amount of non-trapped, light bars that of liposomally trapped galantamine. The light line between the triangle symbols (associated values: right ordinate) indicates the stable lipid / drug ratio.
  • Fig.8 shows stability data of a liposome preparation, in which the liposomes were actively loaded with galantamine in a one-step process.
  • Ordinate active substance concentration in nmol active substance per ⁇ mol lipid; Abscissa: period in weeks since the preparation of the preparations.
  • Fig. 9 shows stability data of actively loaded galantamine liposomes: A) produced in a three-step process; B) produced in a one-step process.
  • Fig.10 shows galantamine inclusion rates and stability of actively loaded DMPC liposomes.
  • Fig.11 shows the galantamine intake in DPPC liposomes depending on the cholesterol content.
  • Fig.12 shows a stability test of galantamine liposomes, produced according to the ammonium sulfate gradient method.
  • Fl, F2, F3 denote filtrate samples, R stands for retentate.
  • Fig.13 shows the stability of galantamine liposomes with lipids of different chain lengths (A: C16 and B: C14) in hydrogel formulations.
  • Fig. 14 shows the result of in vitro skin penetration studies with liposomal galantamine preparations with different lipid compositions. Ordinate: ng galantamine absolutely in the respective sample; Abscissa: variations in lipid composition.
  • Fig.15 shows the result of in vitro skin penetration studies with liposomal galantamine preparations after repeated application.
  • Fig. 16 shows the result of in vitro skin penetration studies with liposomal galantamine preparations depending on the amount of sample and the duration of penetration.
  • Fig.17 shows the result of in vitro skin penetration studies with liposomal galantamine preparations depending on the hydrogel concentration.
  • Fig. 18 shows the result of in vitro skin penetration studies with galantamine preparations in the form of microemulsions.
  • Fig. 19 shows the result of in vitro skin penetration studies with hydrogel preparations based on freely available galantamine in comparison to galantamine enclosed in liposomes.
  • Fig.20 shows the result of in vitro skin penetration studies with liposomal galantamine preparations in the form of a suspension or as a gel.
  • Fig. 21 shows the result of in vitro skin penetration studies with liposomal galantamine preparations on various skin samples.
  • Liposomes can be adapted to the physicochemical properties of these molecules.
  • Synthetic dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC, Genzyme, Switzerland) and cholesterol (Solvay, The Netherlands) were used to produce the vesicles.
  • the liposomes were preferred by means of the shear force-free ones
  • the detection of entrapped galantamine was carried out after ultrafiltration and / or diafiltration in a stirred cell (Amicon, USA) or after gel filtration over Sephadex G25 columns (Pharmacia, Germany) by means of rp-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography).
  • rp-HPLC reversed phase high performance liquid chromatography
  • the in-house rp-HPLC technology allows the quantitative determination of the membrane component cholesterol and the active ingredient galantamine within a single run. Liposome size and distribution were determined using photon correlation spectroscopy (PCS).
  • the liposomes are preferably produced using cross-flow technology.
  • the device for liposome production consists of a cross-flow injection module 1, containers for the polar phase (injection buffer 2 and dilution buffer 3), a container for the ethanol / lipid solution 4 and a nitrogen compressor 5.
  • the injection opening in Cross-flow module has a diameter of approx. 250 ⁇ m.
  • the lipid mixture is preferably dissolved in 96% ethanol at a temperature in the range of - depending on the lipid selection or lipid composition - 25 to 60 ° C, for example in the case of DPPC liposomes at a temperature of 50 to 55 ° C, with stirring.
  • the buffer solutions are also preferably heated to the same temperature, for example 55 ° C.
  • a pump 6 e.g. a peristaltic pump
  • the ethanol / lipid solution is simultaneously injected into the polar phase under any preselectable pressure.
  • DPPC cholesterol and stearylamine (molar ratio 7: 2: 1) are dissolved together with galantamine in 96% ethanol and in PBS- Buffer injected. After the liposomes have formed spontaneously, they are filtered and both the retentate and the filtrate are analyzed by rp-HPLC. As can be seen from Fig. 2, galantamine cannot be integrated into the liposomes in a stable manner. Filtrate (not included galantamine) and retentate (liposomally included galantamine) show identical drug concentrations. In Fig. 2, the 1st bar means: the total amount of galantamine provided; the 2nd and 3rd bars: the active ingredient distribution in filtrate and retentate after the first (2nd bar) and after a further diafiltration (3rd bar).
  • Variant II The lipids were again dissolved in ethanol.
  • stearylamine was replaced by hen's egg phosphatidylglycerol (E-PG).
  • E-PG hen's egg phosphatidylglycerol
  • the ethanol / lipid solution is injected either into a solution of PBS / galantamine base or into a PBS / galantamine HBr solution.
  • the proportion of galantamine in the filtrate is considerably lower than in the retentate, which confirms that a large part of the galantamine obviously migrates into the liposomes along this pH gradient, is protonated and remains in the acidic environment within the liposomes.
  • the 1st bar means: the total amount of galantamine provided; the 2nd and 3rd bars: the active ingredient distribution in filtrate and retentate after the first (2nd bar) or after a further diafiltration (3rd bar).
  • Fig. 5 shows the product stability over a period of 9 weeks.
  • Fig. 6 shows that the entire amount of galantamine migrates into the liposomes within about 15 minutes and that an incubation temperature in the region of room temperature (18 - 22 ° C) is favorable for both the absorption of active substances and the retention of active substances within the liposomes.
  • the differences determined for a range of 22 - 40 ° C are small and in any case do not play a significant role.
  • the negative influence of higher incubation temperatures appears to have an impact primarily on the stability of the loaded liposomes, whereby at a temperature of 60 ° C the loss of active ingredient is already in a range of approx. 20 - 25% after 3 h incubation (Fig. 6).
  • Galantamine prepared per ml of solution. As can be seen from Fig.7, however, an excess of galantamine (dark bars; left ordinate) cannot improve the ratio of active substance / lipid, which remains constant in this experiment at around 200 - 300 nmol galantamine per ⁇ mol lipid (light line between the triangle symbols ; right Ordinate).
  • the effective loading amount with active external loading via a pH gradient thus appears to be primarily dependent on the gradient and less on the active substance concentration presented.
  • Buffer solution pH 9.0 - 9.5
  • the amount of galantamine taken up in such a liposomal manner - depending on the pH value or pH gradient - was in a range of at least 100 nmol galantamine per ⁇ mol lipid, preferably in a range of at least 150-400, for example at a pH value of 3 , 5 often in the range of 250 to 350 ( Figures 8-11).
  • the stability of this product was fully preserved over an observation period of 6 weeks (see Fig.8).
  • Example 2 Preparation and comparison of galantamine preparations in the form of liposomes or microemulsions with a variable lipid composition
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • DMPC dimyristoylphosphatidylcholine
  • cholesterol Solvay, Netherlands
  • Galantamine Sanochemia AG, Austria
  • Citric acid / sodium carbonate was used as the buffer solution.
  • the ammonium sulfate gradient method was used as the second option for active loading.
  • Cross-current technology was used again.
  • preparations in the form of microemulsions were also produced by vigorous mixing with gradual heating with several heating cycles (heating up to 80 ° C).
  • IPM Isopropyl myristate
  • Tween and Span 20 were used as emulsifiers and co-emulsifiers.
  • Fig.9A shows stability data of the first liposome sample successfully loaded with galantamine using the active method (three-stage method).
  • the liposomes were prepared in the presence of 0.3 mol of citric acid (pH 3.5-4.5). After vesicle formation, galantamine was added and at the same time the pH of the solution outside the liposomes was raised to 7.5. The resulting pH gradient between the inside and outside of the liposomes led to the uptake of galantamine in the liposomes, depending on the H + ion concentration within the liposomes.
  • Fig. 9B shows stability data of liposome samples with a similar composition, but the vesicle formation and galantamine loading were carried out using the cross-flow technique in a one-step process.
  • the data clearly show that the pH gradient and thus the content of liposomally entrapped galantamine has remained constant over a period of more than half a year.
  • various liposome suspensions with different lipid compositions were prepared and tested. In the first place
  • Phospholipids optionally in combination with cholesterol, are used. However, it is within the scope of the invention to replace or supplement phospholipids with other lipids, for example with glycolipids, cerebrosides, sulfatides or galactosides.
  • Typical representatives of the lipids that can be used are e.g. Phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyeline, plasmalogens, glyceroglycolipids, ceramide, glycosphingolipids, neutral glycosphingolipids.
  • DPPC a phospholipid with an acyl chain length of 16 carbon atoms
  • DMPC chain length of 14 carbon atoms
  • Fig.10 shows inclusion rates of such liposome suspensions, which were prepared using pH gradients of 3.5 - 7.5 and 4.0 - 7.5. After satisfactory inclusion rates (comparable to those when using DPPC) were achieved, samples were taken and checked for their stability (Fig.10).
  • a second way to lower the membrane rigidity and to increase the fluidity is to reduce the cholesterol content in the membrane.
  • DPPC cholesterol ratio of 55: 45 mol% (as described in the literature for liposome loading)
  • the amount of cholesterol was successively reduced to 38 or 30%, based on the total lipid content.
  • Figure 11 shows a slight decrease in the galantamine load compared to previous data with higher cholesterol levels. These liposomes showed however, improved skin penetration properties, as will be described below.
  • Fig.11 also shows that the loaded liposomes remained stable in the long-term experiment and no galantamine was lost.
  • cholesterol-free liposomes could also be produced stably and successfully loaded with active substance, so that, according to the invention, the cholesterol content is in a range from 0 to 50 mol%, based on the total lipid content.
  • a third way to make liposomal membranes more flexible is to replace the fully saturated DPPC or DMPC lipids with chicken egg phosphatidylcholine (E-PC), a natural lipid mixture with unsaturated phospholipids.
  • E-PC chicken egg phosphatidylcholine
  • the ammonium sulfate gradient method is also frequently used. With this method, liposomes are formed in the presence of an ammonium sulfate buffer (125 mmol). After vesicle formation, the ammonium sulfate solution outside the liposomes is replaced by a 5% glucose solution by means of diafiltration, as a result of which small amphiphilic molecules can be loaded into the liposomes and protonated there, while in turn NH3 escapes from the liposomes. This process is known to be the milder process compared to the citric acid / sodium carbonate process.
  • citric acid could also be replaced by another suitable, pharmaceutically acceptable acid, for example a mineral acid such as phosphoric acid, or preferably by an organic acid, in particular from the group of edible organic acids, such as malic acid, fumaric acid, tartaric acid
  • sodium carbonate could also be replaced by another base, in particular by another alkali or alkaline earth carbonate or bicarbonate.
  • “functionally equivalent” is to be understood as the ability to be able to form a pH gradient across the lipid bilayer membrane of the liposomes and not to destroy the membrane integrity, so that the enclosed, in particular protonated, active ingredient is stable - in the sense of the stability criteria disclosed herein - remains in the liposomes.
  • a liposomal galantamine composition As a topical therapeutic agent, the liposomes are preferably mixed into a hydrogel which is easier to apply to the skin than a pure suspension.
  • it is within the scope of the present invention to also produce and topically apply other galenical formulations for the galantamine liposomes in particular formulations in the form of solutions, lotions, emulsions, tinctures, sprays, ointments, creams or optionally also in the form of impregnated textile fabrics or dressing materials.
  • Other possibilities are familiar to the person skilled in the art, as are the pharmaceutically permissible accompanying substances and additives required for producing the various pharmaceutical formulations.
  • Carbopol 981NF a hydrogel that can be used in very low concentrations, has proven itself in previous experiments. It is approved for pharmaceutical use, relatively cheap to buy and in large quantities available.
  • the vesicle suspensions were concentrated by ultrafiltration and subsequently stirred with a prefabricated, sterile gel base mixed. With this method, the liposomal galantamine concentrations can be varied either via the ultrafiltration or via the initial concentration of the gel base, which is diluted to a carbopol concentration of 0.5% with the vesicle suspension.
  • microemulsions In addition to liposomes, microemulsions have also attracted increasing attention for topical applications of certain active ingredients in recent years. Microemulsions are dispersions of two immiscible components that are stabilized by a third, amphoteric component. However, due to the presence of surface-active substances such as emulsifiers and co-emulsifiers, microemulsions can damage the skin in a similar way to transdermal patches.
  • Microemulsions prepared with galantamine as the active ingredient and then subjected to penetration tests with the Franz diffusion cell (results see Examples 3 to 10).
  • Table 1 Microemulsions lecithin ME W / O ME O / W ME 10 ml IPM 7.2 ml IPM 5.5 g H20 1.9 g SPC 0.2 g Chol 2.5 g IPM 135 ⁇ l H20 0.5 g H20 2 g Tween / Span20 10 mg Gal 2g Tween / Span20 11 mg Gal-HBr 10 mg Gal 5 mg Gal
  • the diffusion cell was from PermGear, USA.
  • the equipment included three diffusion cells, each with a double jacket filled with water, mounted on a stirrer console and connected to a water bath for temperature control.
  • the cells themselves have a volume of 8 ml each, a skin holder with a surface area of 0.78 cm2 and a feed chamber with 2 ml Volume capacity.
  • Pig skin was used for the tests in the Franz diffusion cell. To ensure an intact skin surface, each piece of skin was tested before and after the experiment. After the skin had been attached to the skin holder of the diffusion cell, 2 ml of buffer were applied to the skin and the temperature was raised to 32 ° C. +1. After 30 minutes, electrical conductivity, a measure of skin resistance and skin quality, was measured. The measured value depends on the origin of the skin, its thickness, the buffer system used and the equipment used for the measurement. On the basis of several basic experiments, a limit value for the electrical conductivity of the intact skin of ⁇ 1 mS / cm2 was determined before the application of a sample. Skin samples that did not meet this requirement were not approved for the penetration experiments.
  • Penetration buffer After the liposomes according to the invention had been prepared in 0.3 M citric acid buffer, adjusted to pH 7.5 with 1 M sodium carbonate solution, the same buffer was also used for all penetration experiments.
  • the excess galantamine sample was removed by washing the surface with buffer.
  • the electrical conductivity was then measured again and the skin sample removed from the holder.
  • Membrane compositions of the liposomes were obtained by using different lipids and different cholesterol contents (see Examples 1 and 2).
  • the following penetration studies were carried out with different sample volumes, single and multiple sample tasks, samples being taken at intervals to determine galantamine.
  • the results shown in Figures 14 to 21 are each based on a triple penetration experiment.
  • the diagrams show the results in ng galantamine absolutely for each sample analyzed.
  • Example 3 the results of various DPPC (C16) liposomes with different cholesterol contents are compared to those of DMPC (C14) liposomes and E-PC liposomes.
  • a sample volume of 50 ⁇ l was applied once and allowed to penetrate over a period of 4 hours. All preparations tested had comparable amounts of entrapped galantamine and were suspended in 0.5% Carbopol 981NF.
  • the most effective formulation in this experiment was the sample with the C16 / 70/30 (acyl chain length / mol% phospholipid / mol% cholesterol) lipid composition. In this gel, the cholesterol concentration in the liposomes was 30 mol%.
  • the other two preparations had significantly higher cholesterol levels (38 and 45 mol%) and were therefore much more rigid.
  • Example 4 the penetration properties of gel samples after repeated application to the skin were examined. Two different gels with different lipid compositions and the same cholesterol content were compared. The samples were applied three times with 50 ⁇ l each and every 4 hours. Excess material was removed before the next sample was applied.
  • Example 5 gels with Cl6 liposomes with high and low cholesterol contents were compared after a single application. Sample volumes of 150 ul and 50 ul were allowed to penetrate for 4 and 10 hours, respectively. The highest levels of galantamine in the skin were found again when using liposomes with a low cholesterol content. Low doses seem to be more advantageous here too. After 4 and 10 hours, high amounts of galantamine were found in the epidermis when 50 ⁇ l was used. These results confirm the values that were achieved in Examples 3 and 4, ie the administration of liposomes with low cholesterol contents and at the same time a low application amount overall, could represent a favorable strategy for the topical application of the preparations according to the invention in prophylactic or therapeutic use ( Fig.16).
  • Example 6 the influence of the gel concentration in connection with three different concentrations of free galantamine suspended in the gel was investigated. 50 ⁇ l of each formulation was applied once and the penetration experiment was carried out over 4 or 10 hours (Fig.17). The first three bars in Fig.17 represent the results with 1% Carbopol 981NF after 4 h, the next three bars those with 0.5% Carbopol 981NF after 10 h. The results after 4 hours show that free galantamine diffuses into the skin tissue relatively quickly. However, as can be seen from the 10 h values, the free active ingredient was also found in high concentrations in the receptor fluid, so that only a slight depot effect can be expected (Fig. 17).
  • Example 7 various application strategies were tested. It is known from the literature that microemulsions can be useful tools as carrier systems for the administration of small amphiphilic molecules. In order to check this concept, various microemulsions (lecithin; water in oil; oil in water) with 1 mg galantamine per ml each were produced (see Examples 1 and 2).
  • the amount of galantamine in the skin is lower than when using the hydrogel with liposomes.
  • the active ingredient was equally distributed in the dermis (dermis) and receptor fluid, which suggests that rapid penetration with at best marginal storage in the skin tissue took place (Fig.18).
  • Example 8 the results with free galantamine in hydrogel and microemulsions were compared to those of the preferred liposome composition (C16 low cholesterol phospholipids). In all experiments, comparable concentrations of galantamine were examined under similar conditions.
  • Example 9 liposomal formulations in suspension and in hydrogel were compared with one another.
  • the administration of an excess of 1 ml of liposomal suspension over a period of at least 24 hours resulted in only a slight decrease Penetration effectiveness (Fig.20). So it seems to be confirmed that a suitable gel matrix not only stabilizes the liposomes and makes application more pleasant and convenient, but also brings the liposomes closer to the skin and thus increases the penetration effect.
  • Fig. 20 they mean: (chain length / phospholipid / cholesterol / sample amount / penetration time / type)
  • Liposomes: 70/30 phospholipid / cholesterol
  • 2 skin cleaned with ethanol
  • 3 skin treated with fatty gauze
  • 4 skin cleaned with ethanol and treated with grease
  • liposomal galantamine formulations in hydrophilic gel represent an advantageous dosage form if the place of treatment is in the dermal tissue (dermis), even if the active ingredient is only applied to the skin twice a day.
  • a mild depot effect in the epidermis and a slow, uniform release of the active ingredient into the underlying dermal tissue can be achieved by the inventive, mild, non-invasive and non-irritating use of the liposomally enclosed active ingredient.

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung auf der Basis eines in Liposomen eingeschlossenen Wirkstoffes zur topischen, transdermalen Applikation, wobei die Liposomen in ihrem Inneren ein saures, wässriges Milieu aufweisen und darin mindestens einen Cholinesterase-Hemmer, vorzugsweise aus der Gruppe Donepezil, Rivastigmin, Galantamin, Physostigmin, Heptylphysostigmin, Phenserin, Tolserin, Cymserin, Thiatolserin, Thiacymserin, Neostigmin, Huperzin, Tacrin, Metrifonat und Dichlorvos, oder ein Enantiomer oder Derivat zumindest einer dieser Verbindungen, enthalten. Die Erfindung bezieht sich weiters auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzung, gegebenenfalls in steriler Form, sowie auf die Verwendung der wirkstoffbeladenen Liposomen in verschiedenen galenischen Formulierungen zur topischen transdermalen Applikation mit Depoteffekt in der Epidermis, zur Prophylaxe und/oder Therapie des dermalen neuropathischen Schmerzes oder des neurophatiebedingten Verlustes der dermalen sensorischen Funktion.

Description

CHOLINESTERASE-INHIBITOREN IN LIPOSOMEN SOWIE DEREN HERSTELLUNG UND VERWENDUNG
TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische
Zusammensetzungen auf der Basis von Cholinesterase-Inhibitoren in Liposomen, auf die Herstellung solcher Zusammensetzungen und auf deren therapeutische Anwendungsmöglichkeiten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zentralgängige Inhibitoren der Cholinesterasen werden zur Pharmakotherapie der leichten und mittelschweren Alzheimer' sehen Krankheit eingesetzt, um die bei diesem Syndrom krankhaft verminderte Funktion des cholinergen Reizleitungssystems im Gehirn teilweise wiederherzustellen. Neuere Forschungen haben ergeben, dass viele Cholinesterase-Inhibitoren nicht nur durch unterschiedliche Mechanismen die Acetyl- und Butyrylcholinesterase blockieren, sondern auch direkte Wirkungen auf neuronale nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren ausüben. Diese Rezeptoren, deren natürlicher Ligand Acetylcholin ist, finden sich nicht nur auf cholinergen Nerven, sondern auch im serotonergen und gluta atergen Nervensystem und steuern dort die Freisetzung des jeweiligen Neurotransmitters .
Diese Wirkung tritt bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen des betreffenden Agens ein, erfolgt an unterschiedlichen Rezeptor- Bindungsstellen des Rezeptors, und kann - zum Teil auch in Abhängigkeit von der Konzentration des Cholinesterase-Inhibitors selbst und/oder von der gleichzeitig bestehenden Acetylcholin- Konzentration - in einer Blockade oder einer Verstärkung der Wirkung des Acetylcholins auf den Rezeptor resultieren.
Eine prototypische Rolle kommt dem in dieser Hinsicht besonders eingehend untersuchten Galantamin zu, da dieses bei Konzentrationen, die eine therapeutisch wirksame Cholinesterase- Hem ung bewirken, ein allosterisch modulierender Ligand an einer von der Acetylcholin-Bindungsstelle distinkten Bindungsstelle ist (Samochocki et al . , Acta Neurol Scand Suppl . 2000/ 176: 68- 73; Dalas-Bailador et al., Mol Pharmacol. 2003; 64(5): 1217-26). Dadurch wird die Wirkung der durch die Cholinesterase-Hemmung des Galantamins erhöhte Konzentration des Acetylcholins zusätzlich potenziert. Tacrin bindet offenbar ebenfalls an dieser und an einer weiteren Bindungsstelle des Rezeptors (Svensson und Nordberg, Neuroreport 1996; 7(13): 2201-5). Vergleichbare Hinweise existieren auch für Physostigmin (Onkojo et al., Eur J Biochem 1991; 200(3): 671-7) und für Donepezil. Auch für Galantamin wurde eine nicht-cholinerge anti- apoptotische Wirkung berichtet (Arroyo et al . , Rev Neurol. 2002; 34(11): 1057-65), ebenso wie eine dem Nerve Growth Factor (NGF) entsprechende Wirkung (Capsoni et al . , Proc Natl Acad Sei U S A. 2002; 99(19) : 12432-7) .
Obwohl diese Studien in Hinblick auf die Behandlung der Alzheimer' sehen Demenz mit ihrem spezifischen cholinergen Defizit und der damit verbundenen Neurodegeneration durchgeführt wurden, sind sie auch für degenerative und schmerzhafte Erkrankungen des peripheren Nervensystems, insbesondere der sensorischen Nerven, von hoher Bedeutung. Einerseits ist anti-nozizeptive Wirkung von Nikotin und anderen Substanzen, die an nikotinischen Rezeptoren agonistisch wirken, seit geraumer Zeit bekannt. Andererseits ist in den frühen Stadien der diabetischen sensorischen Neuropathie ebenso wie bei akuten Nervenläsionen die Konzentration von NGF in den betroffenen Abschnitten der Haut stark vermindert. NGF bzw. eine diesem entsprechende neurotrophe Aktivität, die direkt oder über das eng mit NGF verbundene cholinerge System vermittelt wird, könnte hier die sensorische Funktion wiederherstellen. Diesbezügliche Studien waren jedoch wenig erfolgreich, vermutlich weil keine ausreichend hohen lokalen NGF-Konzentrationen ohne systemische Nebeneffekte erzielbar waren (Anand, Prog Brain Res. 2004; 146 :477-92). Auch nikotinische Agonisten haben sich in ihrer diesbezüglichen therapeutischen Anwendbarkeit durch Nebenwirkungen wie Bluthochdruck und neuro uskuläre Paralyse beeinträchtigt gezeigt. Peripher wirkende Cholinesterase- Inhibitoren gelten, wesentlich auch aufgrund der Nebenwirkungsproblematik, als für die analgetische Therapie am Menschen ungeeignet (Ghelardini et al . , Presynaptic Auto- and Heteroreceptors in the Cholinergic Regulation of Pain. In: Trends in Receptor Research, Elsevier Science Publishers B.V., 1992). Transdermale Formulierungen von Cholinesterase-Inhibitoren auf der Basis von Pflastern, die den Wirkstoff in einem dermalen Penetrationsverstärker gelöst oder verteilt enthalten, sind bekannt. In beispielhafter Aufzählung solcher passiven transdermalen Systeme seien erwähnt: EP-0376067, EP-0377147, EP- 0667774, EP-0599952 und EP0517840 für Physostig in; WO-9934782 für Rivastigmin; EP-0680325 für Galantamin, sowie WO-0132115 für Huperzin. Moriearty et al . (Methods Find Exp Clin Pharmacol 1993; 15(6): 407-12) beschreiben solche Systeme für Metrifonat bzw. dessen als Cholinesterase-Inhibitor aktives Hydrolyseprodukt
Dichlorvos und für Heptylphysostigmin. Zwei weitere synthetische Abkömmlinge des Physostigmins, Thiacymserin und Thiatolserin, werden von ihrem Entwickler ausdrücklich als besonders geeignet zur transdermalen Verwendung beschrieben.
Diese transdermalen Systeme sind sämtlich für Anwendungen ausgelegt, die eine systemische Verabreichung des jeweiligen Wirkstoffes erfordern. Die Wahl der transdermalen Route ist in diesen Fällen durch den Wunsch gegeben, den Wirkstoff langsam und gleichmässig in die Blutbahn abzugeben und/oder den bei peroraler Aufnahme auftretenden „First Pass"-Abbau in der Leber zu vermeiden, sodass therapeutisch optimale Plasmaspiegel über längere Zeit bestehen bleiben. Die systemische Wirkung wird dabei dadurch erzielt, dass der Wirkstoff die Haut auf dem Wege passiver Diffusion durchdringt und von subdermalen Kapillargefässen in den Blutström aufgenommen wird. Der Wirkstoff kann sich auch im Unterhaut-Fettgewebe vorübergehend ablagern bzw. binden, um von dort langsam in den Blutkreislauf ausgewaschen zu werden. In der Haut selbst tritt beabsichtigterweise nur eine geringe Retention des Wirkstoffes auf. Die genannten Systeme sind daher für die Therapie des neuropathischen Schmerzes bzw. der Beeinträchtigung der dermalen sensorischen Funktion durch Neurodegeneration ungeeignet . Liposomen sind als Mittel zur kontrollierten Freisetzung pharmazeutischer Wirkstoffe bekannt (z.B. siehe Übersicht bei Ulrich, Biosci Rep. 2002; 22(2): 129-50), insbesondere auch zur Verwendung in speziellen transdermalen „Pflaster"-Systemen (z.B. geoffenbart in WO-8701938 und US-5718914) und in Gelen (US- 5064655) . Auch die Formulierung von Lokalanästhetika in topisch applizierten Liposomen ist dem Fachmann bekannt; z.B. beschreibt US-4937078 Liposomen, die übliche Natriumkanal-Blocker wie Tetracain, Lidocain usw. enthalten.
Eine liposomale Formulierung des Cholinesterase-Inhibitors Neostigmin zur Verwendung als Analgetikum ist zwar beschrieben (Grant et al . , Acta Anaesthesiol Scand. 2002; 46(1): 90-4), wurde aber intrathecal (d.h. in das Bindegewebe) verabreicht, sodass die beobachtete analgetische Wirkung eine zentrale war.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es stellte sich somit die erfindungsgemässe Aufgabe, einen Weg zu finden, Cholinesterase-Inhibitoren mit bekannter Wirkung auf neuronale nikotinische Rezeptoren und/oder NGF-ähnlicher neurotropher Aktivität so zu verabreichen, dass sowohl die bekannten Nachteile von Pflasteranwendungen (z.B. Erfordernis einer möglichst planen Oberfläche für die Aufbringung des Pflasters; mögliche Hautirritationen; Wirkstoffkonzentration im Pflaster muss sehr hoch sein; Penetrationsverstärker können Hautschädigung bewirken) , als auch die Nachteile von invasiven Applikationsverfahren und anderen systemischen Anwendungsarten, insbesondere die mit der erforderlichen hohen Dosierung verbundenen, unerwünschten systemischen Nebenwirkungen, vermindert oder vermieden werden können.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung mit Cholinesterase-Inhibitoren bereit zu stellen, welche eine insgesamt niedrige, gleichzeitig jedoch ausreichend hohe lokale Dosierung dieser Wirkstoffe im Bereich der sensorischen Nervenendigungen der Haut unter gleich- zeitig weitgehender Vermeidung ihrer Systemisierung erlaubt.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu stellen, welche überall am Körper, insbesondere auch an "unebenen" Stellen, welche sich für eine Pflasteranwendung nicht eignen, z.B. an Füssen bei diabetischer Neuropathie, im Gesicht bei Trigeminusneuralgie, aufgebracht werden kann.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu stellen, welche zu keinen Mazerationserscheinungen an der Haut führt, was insbesondere bei bereits vorgeschädigter und/oder fragiler Haut, beispielsweise bei Diabetikern, essentiell ist.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu stellen, welche als steriles Produkt hergestellt und dadurch z.B. bei Herpes Zoster bereits im Bläschen-Stadium oder in der Abheilungsphase als Therapeutikum aufgebracht werden kann.
Es ist schließlich auch ein Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung bereit zu stellen, welche in der Haut ein Wirkstoff-Depot produziert, aus dem kontinuierlich Substanz abgegeben wird, wodurch außerdem eine bessere Bioverfügbarkeit und längere Halbwertszeit im Vergleich zur systemischen Anwendung erzielt wird.
Erfindungsgemäss werden diese Ziele durch die Bereitstellung eines liposomalen Systems zur topischen Verabreichung von Cholinesterase-Inhibitoren erreicht .
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass durch Einschluss von Cholinesterase-Inhibitoren in Liposomen bestimmter Zusammensetzung und Grosse und anschliessende Formulierung dieser Liposomen in geeigneten galenischen Systemen zur transdermalen Verabreichung, die zuvor erwähnten Ziele verwirklicht werden können. Dabei hat sich zur Herstellung und Beladung der Liposomen mit Wirkstoff das in der WO-0236257 geoffenbarte, skalierbare Verfahren zur Wirkstoff-Verkapselung aufgrund seiner hohen Effizienz bei gleichzeitig äusserst schonenden Verfahrensbedingungen als besonders vorteilhaft erwiesen. Andere im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Herstellung und Beladung von Liposomen können aber ebenfalls angewandt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Beladung von Liposomen mit Wirkstoffen kann in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: Beladung der Membran und Beladung der intraliposomalen wässrigen Phase. Nachdem Galantamin-Base in Ethanol löslich ist, wurde zuerst versucht, die Wirkstoffmoleküle in die liposomale Membran zu inkorporieren, was allerdings nicht gelang. Je mehr Galantamin in die Membran nicht eingeschlossen und statt dessen durch Filtration entfernt wurde, desto mehr wurde auch von der Membran wieder abgegeben. Der Anteil an membrangebundenem und nicht gebundenem Galantamin war etwa gleich gross. Aus diesem Grunde wurde anschliessend versucht, die intraliposomale wässrige Phase mit
Galantamin zu beladen. Dieser Vorgang kann auf zweierlei Arten bewerkstelligt werden: durch aktives und passives Beladen. Ausgehend von Versuchen mit passiver Beladung von Liposomen mit Galantamin-HBr/Base in PBS-Lösung stellte sich bald heraus, dass sich damit keine stabilen Galantamin-Liposomen-Suspensionen herstellen lassen. Wie schon in den vorherigen Membran-Versuchen, diffundierte der Wirkstoff nun auch aus dem wässrigen Milieu der Liposomen heraus, sobald nicht-eingeschlossener Wirkstoff aus dem Umgebungsmedium entfernt wurde.
Es war daher erforderlich, sich den Wirkstoff Galantamin etwas näher anzusehen. Dabei wurde gefunden, dass Galantamin ähnliche chemische Eigenschaf en wie Doxorubicin aufweist und durch pH-Gradienten-gesteuerte Beladung in Liposomen eingeschlossen werden kann. Für diese Art der aktiven Beladung ist das wichtigste Merkmal der Liposomenmembran/Liposomenmedium- Verteilungskoeffizient . Es wurde gefunden, dass der Octanol/Buffer-Verteilungs koeffi zient einen guten
Hinweise für die Transmembran-Diffusion eines Stoffes liefert und daher für die Beladung mit Wirkstoff beziehungsweise für das Freisetzungsprofil relevant ist. Zudem muss der Wirkstoff protonierbare Aminogruppen enthalten, sodass bei niedrigem pH der Wirkstoff hydrophil und bei neutralem oder alkalischem pH lipophil ist .
Unter Zugrundelegung dieses theoretischen Modells wurden Liposomen mit unterschiedlicher Lipidzusammenset zung, vorzugsweise mit langkettigen Phospholipiden und geringen Cholesterol-Konzentrationen) , in einem geeigneten Beladungspuffer, vorzugsweise in einem Zitronensäure/Na- triumcarbonat-Puffer , hergestellt. Nachdem die Liposomen bei niedrigem pH hergestellt worden waren, wurde das umgebende Medium alkalisiert und dadurch ein pH-Gradient erzeugt. Nach Zusatz von Galantamin in das alkalisierte Medium migrierte der Wirkstoff dank dieses pH-Gradienten in die Liposomen hinein, wurde dort protoniert und verblieb stabil in den Liposomen.
Bei Anwendung dieser Technik wird das Ausmass der Beladung bzw. die Beladungskapazität in erster Linie vom Verhältnis der pH-Werte innerhalb und ausserhalb der Liposomen bestimmt. In den durchgeführten Versuchen konnten mit Wirkstoff/Lipid-Verhältnissen im Bereich von 200 - 400 nmol Wirkstoff je μmol Lipid ähnliche Werte erzielt werden, wie sie aus der Literatur über aktiv beladene Liposomen bekannt sind. Eine Erhöhung der Wirkstoffkon- zentration im Beladungsmedium führte zu keiner Steigerung der Beladungs kapazität .
Die zuvor beschriebene aktive Beladung ist ein dreistufiger Vorgang, bestehend aus Vesikelbildung, Wirkstoffzugäbe und Alkalisierung . Es war daher ein weiteres Ziel der Erfindung, ein einstufiges Herstellungsverfahren zu etablieren, welches unter Verwendung des in der WO-0236257 offenbarten Kreuzstrommoduls realisiert werden konnte. Zu diesem Zweck wurde Galantamin in Zitronensäurelösung gelöst, mittels
Kreuzstrom-Injektionstechnik in Liposomen eingeschlossen und unmittelbar anschliessend darauf die restliche Zitronensäurelösung mit einem Verdünnungspuffer ( Zitronensäure/Natriumcarbonat pH 9,0 - 9,5) alkalisiert.
In den nachfolgenden Beispielen wird unter anderem gezeigt, dass die Qualität der wirkstoffbeladenen Liposomen allein schon durch Variation, insbesondere durch Verringerung, des Cholesterolgehaltes in der Vesikelmembran verbessert werden kann, vor allem in Bezug auf deren Hautpenetrationsfähgkeit . Darüber hinaus belegen Stabilitätstests für die Produkte aus dem dreistufigen und dem einstufigen Verfahren, dass bei beiden Produkten selbst nach mehr als sechs Monaten Lagerung, die Produktstabilität und -qualität unverändert geblieben ist.
Wo erforderlich oder gewünscht, kann durch Anhebung der mittleren Liposomengrösse von ca. 150 - 200 nm (wie in den hierin beschriebenen Experimenten zumeist verwendet) auf 300 bis 500 nm, die Beladungskapazität weiter erhöht werden. Zusätzlich lässt sich auch die Effizienz des Verfahrens, d.h. die Menge an liposomal eingeschlossenem Wirkstoff je ml Suspension, durch Erhöhung der
Lipidkonzentration entweder während der Herstellung oder bei der anschliessenden Filtration der Vesikel noch weiter steigern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Abb.l zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Herstellung der Liposomen. Abb.2 zeigt HPLC-Resultate von Galantamin-Einschlussversuchen in Liposomen. Dunkle Balken stellen Galantamin im Retentat (d.h. liposomales Galantamin), helle Balken hingegen im Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und der leere Balken die Gesamtmenge an Galantamin dar; Ordinate: Galantamin in μg/ml . Abb.3 zeigt HPLC-Resultate von Galantamin-Einschlussversuchen in Liposomen. Dunkle Balken stellen Galantamin im Retentat (d.h. liposomales Galantamin) , helle Balken hingegen im Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und die leeren Balken die Gesamtmenge an Galantamin dar; erste drei Balken: positiv geladene Liposomen mit Stearylamin; letzte drei Balken: negativ geladene Liposomen mit E-PG; 3A: Galantamin-HBr; 3B: Galantamin-Base.
Abb.4 zeigt HPLC-Resultate von Galantamin-Einschlussversuchen in Liposomen. Dunkle Balken stellen Galantamin im Retentat (d.h. liposomales Galantamin), helle Balken hingegen im Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und der leere Balken die Gesamtmenge an Galantamin dar. Abb.5 zeigt die Ergebnisse eines Stabilitätstests mit aktiv beladenen Galantamin-Liposomen bei unterschiedlichem pH der wässrigen Phase; Ordinate: Wirkstoffkonzentration in nmol Wirkstoff pro μmol Lipid; Abszisse: Zeitraum in Wochen seit Herstellung der Präparate. Abb.6 zeigt HPLC-Daten der Beladung vorgeformter Liposomen mit Galantamin in Abhängigkeit von Temperatur und Beladungsdauer. Angaben in Prozent der vorgelegten Galantaminkonzentration. Abb.7 zeigt HPLC-Daten aktiv beladener Liposomen in Gegenwart eines Galantaminüberschusses aus zwei Herstellungsversuchen. Dunkle Balken stellen die Menge an nicht-eingeschlossenem, helle Balken jene an liposomal eingeschlossenem Galantamin dar. Die helle Linie zwischen den Dreieckssymbolen (zugehörige Werte: rechte Ordinate) weist auf das stabile Lipid/Wirkstoff-Verhältnis hin.
Abb.8 zeigt Stabilitätsdaten eines Liposomen-Präparates, worin die Liposomen in einem einstufigen Verfahren aktiv mit Galantamin beladen wurden. Ordinate: Wirkstoffkonzentration in nmol Wirkstoff pro μmol Lipid; Abszisse: Zeitraum in Wochen seit Herstellung der Präparate. Abb.9 zeigt Stabilitätsdaten von aktiv beladenen Galantamin- Liposomen: A) hergestellt im dreistufigen Verfahren; B) hergestellt im einstufigen Verfahren.
Abb.10 zeigt Galantamin-Einschlussraten und Stabilität von aktiv beladenen DMPC-Liposomen. Abb.11 zeigt die Galantaminaufname in DPPC-Liposomen in Abhängigkeit des Cholesterolgehaltes. Abb.12 zeigt einen Stabilitätstest von Galantamin-Liposomen, hergestellt nach der Ammoniumsulfat-Gradientenmethode. Fl, F2, F3 bezeichnen Filtratproben, R steht für Retentat. Abb.13 zeigt die Stabilität von Galantaminliposomen mit Lipiden verschiedener Kettenlänge (A: C16 und B: C14) in Hydrogelformulierungen.
Abb.14 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposomalen Galantamin-Präparaten unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. Ordinate: ng Galantamin absolut in der jeweiligen Probe; Abszisse: Variationen der Lipidzusammensetzung. Abb.15 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposomalen Galantamin-Präparaten nach wiederholter Applikation. Abb.16 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposomalen Galantamin-Präparaten in Abhängigkeit der Probenmenge und der Penetrationsdauer . Abb.17 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposomalen Galantamin-Präparaten in Abhängigkeit der Hydrogel-Konzentration. Abb.18 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit Galantamin-Präparaten in Form von Mikroemulsionen. Abb.19 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit Hydrogel-Präparaten auf der Basis von frei vorliegendem Galantamin im Vergleich zu liposomal ein- geschlossenem Galantamin.
Abb.20 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposomalen Galantamin-Präparaten in Form einer Suspension bzw. als Gel. Abb.21 zeigt das Ergebnis von in vitro Haut-Penetrationsstudien mit liposomalen Galantamin-Präparaten bei verschiedenen Hautproben.
Zur besseren Illustration wird die Erfindung anhand der nachfolgenden Beispiele weiter erläutert. Die Versuche wurden anhand von Galantamin als Wirkstoff, entweder in Form der freien Base oder als HBr-Salz, durchgeführt. Es ist dem Fachmann aber einsichtig, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung Galantamin auch in Form seiner Enantiomere und seiner sämtlichen pharmakologisch akzeptablen Salze verwendet werden kann. Ebenso sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung chemische Derivate des Galantamins und deren Enantiomere, so etwa die in WO-9612692, WO- 9740049 und WO-0174820 beanspruchten Moleküle, soweit diese Cholinesterase-Hemmstoffe und/oder nikotinische Rezeptor- Modulatoren sind und/oder neurotrophe, NGF-artige Wirkungen entfalten, mitumfasst, wobei Zusammensetzung und Grosse der
Liposomen an die physikochemischen Eigenschaften dieser Moleküle angepasst werden können.
Im gleichen Sinne ist es dem Fachkundigen offensichtlich, dass auch andere Substanzen als Galantamin und dessen Salze und Derivate, soweit diese Cholinesterase-Hemmstoffe und/oder nikotinische Rezeptor-Modulatoren sind und/oder neurotrophe, NGF- artige Wirkungen entfalten, ebenso in den Rahmen dieser Erfindung fallen. Hierzu zählen neben allen in der einführenden Beschreibung des Standes der Technik angeführten Substanzen, insbesondere auch die in WO 02059074 genannten Moleküle, ebenso wie die in WO 0178728 und WO 0198271 genannten Abkömmlinge des Donepezils, insbesondere auch dessen Fluoro-Derivat ER-127528.
Beispiel 1: Herstellung und Stabilitätsprüfung der Galantamin- Liposomen
Zur Vesikelherstellung wurden synthetisches Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC, Genzyme, Schweiz) und Cholesterol (Solvay, Niederlande) eingesetzt.
Einige Experimente wurden entweder mit Hühnerei- Phosphatidylglycerol (E-PG; Fa. Lipoid, Deutschland) oder mit Stearylamin (Sigma, USA) durchgeführt, um positive oder negative Ladungen in die liposomale Membran einzubringen. Galantamin (Sanochemia AG, Austria) wurde als freie Base oder als HBr-Salz für die Einschlussversuche eingesetzt. Als Pufferlösungen wurden PBS (phosphate buffered saline) oder Zitronensäure in Kombination mit Natriumcarbonat verwendet.
Die Liposomen wurden bevorzugt mittels der scherkraftfreien
Kreuzstrom-Injektionstechnik gemäss WO-0236257 hergestellt. Diese Technik ist sehr gut reproduzierbar und erlaubt das Einschliessen beliebiger Wirkstoffe in Liposomen. Diese kontinuierlich durchführbare, einstufige Methode gestattet es, durch Variation der Verfahrensbedingungen, insbesondere des Injektionsdruckes der Lipidphase, unilamellare Liposomen mit einer Lipid-Doppelschicht- membran ("Bilayer") mit definierter, vorwählbarer mittlerer Grosse und Grössenverteilung stabil herzustellen. Sie ist außerdem unter ausgesprochen milden Verfahrensbedingungen ausführbar und erlaubt es, auf den Einsatz möglicherweise schädigender Lösungsmittel sowie insbesondere auf die Anwendung von Scherkräften zur Vesikelbildung vollständig zu verzichten. Weitere Vorteile dieser Methode sind in WO-0236257 ausführlich beschrieben. Darüber hinaus ist es mit dieser Methode möglich, sämtliche Reagenzien in steriler oder keimfreier Form bereitzustellen und die Liposomenherstellung und -beladung unter aseptischen Bedingungen durchzuführen, sodass schlussendlich ein steriles oder keimfreies Produkt in Form wirkstoffbeladener Liposomen resultiert.
Der Nachweis für eingeschlossenes Galantamin wurde, nach Ultrafiltration und/oder Diafiltration in einer Rührzelle (Amicon, USA) oder nach einer Gelfiltration über Sephadex G25 Säulen (Pharmacia, Deutschland) , mittels rp-HPLC (reversed phase high Performance liquid chromatography) geführt. Die hauseigene rp- HPLC-Technik gestattet die quantitative Bestimmung des Membranbestandteiles Cholesterol und des Wirkstoffes Galantamin innerhalb eines einzigen Durchlaufes. Die Liposomengrösse und - Verteilung wurde mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) bestimmt .
Liposomenherstellung: Die Liposomen werden bevorzugt mittels Kreuzstromtechnik hergestellt. Wie in Abb.l dargestellt, besteht die Vorrichtung zur Liposomenherstellung aus einem Kreuzstrom-Injektionsmodul 1, Behältern für die polare Phase (Injektionspuffer 2 und Verdünnungspuffer 3) , einem Behälter für die Ethanol/Lipid-Lösung 4 und einem Stickstoffkompressor 5. Die Injektionsöffnung im Kreuzstrommodul hat einen Durchmesser von ca. 250 μm. Die Lipidmischung wird bevorzugt in 96% Ethanol bei einer Temperatur im Bereich von - je nach Lipidauswahl bzw. Lipidzusammensetzung - 25 bis 60°C, beispielsweise im Falle von DPPC-Liposomen bei einer Temperatur von 50 bis 55 °C, unter Rühren gelöst. Auch die Pufferlösungen werden vorzugsweise auf dieselbe Temperatur, beispielsweise 55 °C, temperiert. Während die polare Phase durch das Kreuzstrommodul mittels einer Pumpe 6, z.B. einer Peristaltikpumpe, gepumpt wird, wird gleichzeitig die Ethanol/Lipid-Lösung unter beliebig vorwählbarem Druck in die polare Phase injiziert.
Variante I:
DPPC, Cholesterol und Stearylamin (molares Verhältnis 7:2:1) werden zusammen mit Galantamin in 96% Ethanol gelöst und in PBS- Puffer injiziert. Nach spontan erfolgter Ausbildung der Liposomen werden diese filtriert und sowohl das Retentat als auch das Filtrat mittels rp-HPLC analysiert. Wie aus Abb.2 ersichtlich, kann Galantamin auf diese Weise nicht stabil in die Liposomen integriert werden. Filtrat (nicht eingeschlossenes Galantamin) und Retentat (liposomal eingeschlossenes Galantamin) zeigen identische Wirkstoffkonzentrationen. Es bedeuten in Abb.2: der 1. Balken: die Gesamtmenge an vorgelegtem Galantamin; der 2. und 3. Balken: die Wirkstoff-Verteilung in Filtrat und Retentat nach der ersten (2. Balken) und nach einer weiteren Diafiltration (3. Balken).
Variante II: Abermals wurden die Lipide in Ethanol gelöst. Für Versuche mit negativ geladenen Liposomen wurde Stearylamin durch Hühnerei- Phosphatidylglycerol (E-PG) ersetzt. Die Ethanol/Lipid-Lösung wird entweder in eine Lösung von PBS/Galantaminbase oder in eine PBS/Galantamin-HBr-Lösung injiziert.
Wie aus den Abbildungen Abb.3A und Abb.3B ersichtlich, liess sich Galantamin auch nach diesem Verfahren nicht zufriedenstellend in Liposomen einschliessen. Nach Filtration wurden in Filtrat und Retentat gleiche Mengen an Galantamin gefunden. Es bedeuten in Abb.3A und Abb.3B: der l.und 4. Balken: die Gesamtmenge an jeweils vorgelegtem
Galantamin; der 2. und 3. bzw. 5. und 6. Balken: die Wirkstoff-Verteilung in
Filtrat und Retentat nach der ersten (2. und 5. Balken) bzw. nach einer weiteren Diafiltration (3. und 6. Balken).
Variante III:
Externe Beladung von Liposomen mit Galantamin mittels pH-Gradient.
Die Lipide (molares Verhältnis DPPC : Cholesterol = 55 : 45) wurden in Ethanol gelöst und diese Lösung in 300 mM Zitronensäure pH 3,5 - 4,5 injiziert. Nach spontaner Vesikelbildung wird Galantamin-HBr zugesetzt und die Lösung mit 500 mM Natriumcarbonat alkalisiert. Auf diese Weise bildet sich ein pH-Gradient zwischen Innen- und Aussenseite der Lipidvesikel (Liposomen) aus. pH-Werte unter 2,5 sind aufgrund einsetzender Hydrolyseprobleme weniger geeignet, ebenso sind pH-Werte grösser 5,5 aufgrund des immer flacher werdenden pH-Gradienten nicht bevorzugt.
Wie aus Abb. ersichtlich, ist der Anteil an Galantamin im Filtrat wesentlich geringer als im Retentat, was bestätigt, dass ein Grossteil des Galantamins offensichtlich entlang dieses pH- Gradienten in die Liposomen migriert, dabei protoniert wird und im sauren Milieu innerhalb der Liposomen verbleibt. Es bedeuten in Abb.4: der 1. Balken: die Gesamtmenge an vorgelegtem Galantamin; der 2. und 3. Balken: die Wirkstoff-Verteilung in Filtrat und Retentat nach der ersten (2. Balken) bzw. nach einer weiteren Diafiltration (3. Balken).
Dieses Produkt wurde in mehrere Aliquote aufgeteilt und einem Stabilitätstest unterzogen. In Abb.5 wird die Produktstabilität über einen Zeitraum von 9 Wochen dargestellt.
Zur Bestimmung der Kinetik der aktiven Beladung von Liposomen mit Galantamin wurde die Dauer des Beladungsvorganges untersucht und die optimale Beladungstemperatur ermittelt. Aus Abb.6 ist ersichtlich, dass innerhalb von rund 15 Minuten die gesamte Galantaminmenge in die Liposomen migriert und dass sowohl für die Wirkstoffaufnahme als auch für die Wirkstoffrückhaltung innerhalb der Liposomen eine Inkubationstemperatur im Bereich der Raumtemperatur (18 - 22 °C) günstig ist. Die für einen Bereich von 22 - 40 °C ermittelten Unterschiede sind aber gering und spielen jedenfalls keine signifikante Rolle. Der negative Einfluss höherer Inkubationstemperaturen scheint sich in erster Linie auf die Stabilität der beladenen Liposomen auszuwirken, wobei bei einer Temperatur von 60°C der WirkstoffVerlust nach 3 h Inkubation bereits in einem Bereich von ca. 20 - 25% liegt (Abb.6) .
Um eine Erhöhung der Menge an liposomal eingeschlossenem Galantamin zu erreichen, wurde eine Lösung mit 8 - 10 mg
Galantamin pro ml Lösung vorbereitet. Wie aus Abb.7 ersichtlich, kann jedoch ein Überschuss an Galantamin (dunkle Balken; linke Ordinate) das Verhältnis Wirkstoff/Lipid nicht verbessern, welches in diesem Versuch bei etwa 200 - 300 nmol Galantamin je μmol Lipid konstant bleibt (helle Linie zwischen den Dreieckssymbolen; rechte Ordinate) . Die effektive Beladungsmenge bei aktiver externer Beladung über einen pH-Gradienten scheint also in erster Linie vom Gradienten und weniger von der vorgelegten Wirkstoffkonzentration abhängig zu sein.
Variante IV:
Nach erster Auswertung der vorangegangenen Resultate wurde ein einstufiges Herstellungsverfahren etabliert. Die Lipide (DPPC : Cholesterol = 55 : 45 Mol%) wurden in Ethanol gelöst und die Lösung in eine Galantamin-HBr/Zitronensäurelösung (pH 3,5 - 4,5) injiziert, worauf unmittelbar nach spontan erfolgter Vesikelbildung eine Natriumcarbonat/Zitronensäure-Pufferlösung (pH 9,0 - 9,5) zwecks Verdünnung und Alkalisierung der Reaktionsmischung, d.h. der entstandenen Liposomensuspension, zugesetzt wurde. Durch die Herstellung dieses pH-Gradienten unmittelbar nach der Vesikelbildung wird Galantamin nicht nur in einem Schritt in die Liposomen aufgenommen, sondern dort auch stabil zurückgehalten. Die Menge an solcherart liposomal aufgenommenem Galantamin lag - abhängig vom pH-Wert bzw. pH-Gradienten - in einem Bereich von mindestens 100 nmol Galantamin pro μmol Lipid, vorzugsweise in einem Bereich von mindestens 150 - 400, beispielsweise bei einem pH-Wert von 3,5 häufig im Bereich von 250 bis 350 (Abbildungen 8 -11) . Die Stabilität dieses Produkts blieb über einen Beobachtungszeitraum von 6 Wochen vollständig erhalten (siehe Abb.8) .
Beispiel 2: Herstellung und Vergleich von Galantamin- Präparaten in Form von Liposomen oder Mikroemulsionen mit variabler Lipidzusammensetzung
In diesem Beispiel wurden als Lipide synthetisches Dipalmitoylphosphatidyl-cholin (DPPC, Genzyme, Schweiz) , Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC, Genzyme, Schweiz) und Cholesterol (Solvay, Niederlande) verwendet. Galantamin (Sanochemia AG, Austria) wurde als HBr-Salz für die liposomalen Einschlussstudien verwendet. Als Pufferlösung wurde Zitronensäure/Natriumcarbonat eingesetzt .
Als zweite Möglichkeit der aktiven Beladung wurde die Ammoniumsulfat-Gradienten-Methode angewandt. Als wässrige Phasen für die Vesikelherstellung wurden eine Ammoniumsulfatlösung und eine Glucoselösung eingesetzt. Dabei wurde abermals die Kreuzstromtechnik verwendet. Nach Entfernung von nicht- eingeschlossenem Galantamin mittels Gelfiltration, wurden sowohl die Wirkstoff- als auch die Lipidgehalte mittels rp-HPLC bestimmt. Liposomengrösse und -Verteilung wurden wiederum mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) bestimmt.
Neben Liposomen wurden auch Präparate in Form von Mikroemulsionen durch kräftiges Mischen bei stufenweiser Erhitzung mit mehreren Heizzyklen (Erhitzung bis 80°C) hergestellt. Als Ölphase wurde Isopropylmyristat (IPM) eingesetzt. Tween und Span 20 kamen als Emulgator und Co-Emulgator zum Einsatz.
Liposo endesign und Stabilität :
Liposomenherstellung, Beladung und Analyse wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Stabilitätstests von Liposomenproben mit einem molaren Lipidverhältnis DPPC : Cholesterol = 55 : 45 wurden fortgeführt. Ergebnisse sind in den Abbildungen 9A und 9B dargestellt.
Abb.9A zeigt Stabilitätsdaten der ersten erfolgreich nach der aktiven Methode mit Galantamin beladenen Liposomenprobe (dreistufiges Verfahren) . Die Liposomen wurden in Gegenwart von 0,3 mol Zitronensäure (pH 3,5 - 4,5) hergestellt. Nach erfolgter Vesikelbildung wurde Galantamin zugesetzt und gleichzeitig der pH-Wert der Lösung ausserhalb der Liposomen auf 7,5 angehoben. Der dadurch entstandene pH-Gradient zwischen der Innen- und Aussenseite der Liposomen führte zur Aufnahme von Galantamin in die Liposomen, in Abhängigkeit von der H+-Ionenkonzentration innerhalb der Liposomen.
Abb.9B zeigt Stabilitätsdaten von Liposomenproben ähnlicher Zusammensetzung, wobei jedoch die Vesikelbildung und Galantaminbeladung unter Anwendung der Kreuzstromtechnik in einem einstufigen Verfahren erfolgten. Die Daten zeigen deutlich, dass der pH- Gradient und damit der Gehalt an liposomal eingeschlossenem Galantamin über einen Zeitraum von mehr als einem halben Jahr konstant geblieben ist. Zur Ermittlung der besten Liposomenformulierung in Bezug auf Membranflexibilität und die damit verbundenen Hautpenetrationseigenschaften wurden verschiedene Liposomensuspensionen mit unterschiedlicher Lipidzusammensetzung vorbereitet und getestet. Dabei wurden in erster Linie
Phospholipide, gegebenenfalls in Kombination mit Cholesterol, eingesetzt. Es liegt jedoch im Rahmen der Erfindung, Phospholipide durch andere Lipide zu ersetzen oder zu ergänzen, beispielsweise durch Glykolipide, Cerebroside, Sulfatide oder Galactoside. Typische Vertreter der einsetzbaren Lipide sind z.B. Phosphatidyl- ethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin, Sphingomyeline, Plasmalogene, Glyceroglykolipide, Ceramid, Glykosphingolipide, neutrale Glykosphingolipide .
Eine Möglichkeit, die für transdermale Applikationen bedeutsame Membranfluidität zu verbessern, besteht darin, den Phasenübergang der liposomalen Doppelschichtmembran zu reduzieren, welcher vornehmlich durch die Länge der Acylketten der Phospholipide, die Menge an Cholesterol und die Sättigung der Phospholipide bestimmt wird. Aus diesem Grunde wurde DPPC, ein Phospholipid mit einer Acylkettenlänge von 16 Kohlenstoffatomen, durch DMPC (Kettenlänge von 14 Kohlenstoffatomen) ersetzt, welches die Schmelztemperatur TM von ca. 45°C auf 31°C erniedrigt.
Abb.10 zeigt Einschlussraten solcher Liposomensuspensionen, die mittels pH-Gradienten von 3,5 - 7,5 und von 4,0 - 7,5 hergestellt wurden. Nachdem zufriedenstellende Einschlussraten (vergleichbar mit jenen bei Verwendung von DPPC) erzielt wurden, wurden Proben genommen und auf ihre Stabilität hin geprüft (Abb.10).
Eine zweite Möglichkeit, die Membranrigidität zu senken und die Fluidität zu erhöhen besteht darin, den Cholesterol-Anteil in der Membran zu vermindern. Ausgehend von einem Verhältnis DPPC : Cholesterol von 55 : 45 Mol% (wie in der Literatur für Liposomenbeladung beschrieben) , wurde die Cholesterolmenge sukzessive auf 38 bzw. 30 %, bezogen auf den Gesamtlipidgehalt, reduziert. In Abb.11 kann eine leichte Abnahme der Galantaminbeladung festgestellt werden, im Vergleich zu früheren Daten mit höheren Cholesterol-Gehalten. Diese Liposomen zeigten jedoch verbesserte Hautpenetrationseigenschaften, wie weiter unten noch beschrieben wird. Abb.11 zeigt außerdem, dass die beladenen Liposomen im Langzeitversuch stabil blieben und kein Galantamin verloren.
Entgegen Erkenntnissen aus früheren Arbeiten konnten auch cholesterolfreie Liposomen stabil hergestellt und erfolgreich mit Wirkstoff beladen werden, sodass erfindungsgemäss der Cholesterolgehalt in einem Bereich von 0 - 50 Mol%, bezogen auf den Gesamtlipidgehalt, liegt.
Eine dritte Möglichkeit, liposomale Membranen flexibler zu machen, besteht darin, die voll gesättigten DPPC- oder DMPC-Lipide durch Hühnerei-Phosphatidylcholin (E-PC) , eine natürliche Lipidmischung mit ungesättigten Phospholipiden, zu ersetzen. Neben
Stabilitätsproblemen bei Verwendung dieser natürlichen Lipide war es außerdem erforderlich, die Liposomen unter Stickstoffatmosphäre herzustellen. Trotzdem ergaben diese Vesikel weder gute Resultate in Bezug auf die Vesikelgrösse und -homogenität, noch Verbesserungen in den Hautpenetrationseigenschaften, wie in den Beispielen 3 - 10 beschrieben.
Neben der Zitronensäure/Natriumcarbonat-Technik zur Erzeugung eines pH-Gradienten wird auch die Ammoniumsulfat-Gradientenmethode häufig angewandt. Mit dieser Methode werden Liposomen in Gegenwart eines Ammoniumsulfatpuffers (125 mmol) gebildet. Nach der Vesikelbildung wird die Ammoniumsulfatlösung ausserhalb der Liposomen mittels Diafiltration durch eine 5% Glucoselösung ersetzt, wodurch kleine amphiphile Moleküle in die Liposomen geladen werden können und dort protoniert werden, während im Gegenzug NH3 aus den Liposomen entweicht. Dieser Vorgang stellt bekanntlich das mildere Verfahren gegenüber dem Zitronensäure/Natriumcarbonat-Verfahren dar .
Dennoch ergaben diese Versuche, jedenfalls bei Verwendung von Galantamin als Wirkstoff zur Beladung der Liposomen, keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Die Daten in Abb.12 zeigen, dass der Galantamineinschluss fehlgeschlagen ist, da im Retentat und im Filtrat gleiche Mengen an Wirkstoff aufgefunden werden konnten. Daher ist für den Einschluss von Galantamin in Liposomen die Zitronensäure/Natriumcarbonat-Methode für die externe, aktive Beladung vorzuziehen, wobei es allerdings im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt, auch alternative, dem Fachmann bekannte, funktioneil äquivalente Säure/Base-Systeme zur Ausbildung des gewünschten pH-Gradienten einzusetzen. So könnte Zitronensäure durch eine andere geeignete, pharmazeutisch zulässige Säure, beispielsweise eine Mineralsäure wie Phosphorsäure, oder vorzugsweise durch eine organische Säure, insbesondere aus der Gruppe der essbaren organischen Säuren, wie z.B. Äpfelsäure, Fumarsäure, Weinsäure, gegebenenfalls auch
Ascorbinsäure, ersetzt werden. Gleichermassen könnte auch Natriumcarbonat durch eine andere Base, insbesondere durch ein anderes Alkali- oder Erdalkalicarbonat oder -bicarbonat ersetzt werden.
Unter "funktioneil äquivalent" ist in diesem Zusammenhang die Fähigkeit zu verstehen, über die Lipiddoppelschichtmembran der Liposomen hinweg einen pH-Gradienten ausbilden zu können und dabei die Membranintegrität nicht zu zerstören, sodass eingeschlossener, insbesondere protonierter, Wirkstoff stabil - im Sinne der hierin offenbarten Stabilitätskriterien - in den Liposomen verbleibt.
Herstellung und Stabilitätsprüfung eines Galantamin-Liposomengels: Zur Anwendung einer liposomalen Galantaminzusammensetzung als topisch einzusetzendes Therapeutikum werden die Liposomen bevorzugt in ein Hydrogel eingemischt, welches leichter auf die Haut aufzutragen ist, als eine reine Suspension. Es liegt jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, auch andere galenische Formulierungen für die Galantamin-Liposomen herzustellen und topisch anzuwenden, insbesondere Formulierungen in Form von Lösungen, Lotions, Emulsionen, Tinkturen, Sprays, Salben, Cremes oder gegebenenfalls auch in Form imprägnierter textiler Gewebe oder Verbandsmaterialien. Dem Fachmann auf dem Gebiet sind weitere Möglichkeiten vertraut, ebenso wie die dazu erforderlichen, pharmazeutisch zulässigen Begleit- und Zusatzstoffe zur Herstellung der verschiedenen galenischen Formulierungen.
In früheren Experimenten bewährt hat sich beispielsweise Carbopol 981NF, ein Hydrogel, welches in sehr geringen Konzentrationen eingesetzt werden kann. Es ist für den pharmazeutischen Einsatz zugelassen, relativ billig zu erwerben und in grossen Mengen verfügbar.
Folgende Liposomengele wurden für die Penetrationsstudien mit der Franz-Diffusionszelle hergestellt: DPPC : Cholesterol=55 : 45/pH3, 5 DPPC: Cholesterol =62:38/pH3,5 DPPC: Cholesterol =70:30/pH3,5 DMPC: Cholesterol =55:45/pH3,5 E-PC: Cholesterol =63:38/pH3,5 E-PC: Cholesterol =70:30/pH3,5 Zu diesem Zweck wurden die Vesikelsuspensionen durch Ultrafiltration konzentriert und nachfolgend unter Rühren mit einer vorgefertigten, sterilen Gelbasis vermischt. Bei dieser Methode können die liposomalen Galantaminkonzentrationen entweder über die Ultrafiltration oder über die Anfangskonzentration der Gelbasis, die mit der Vesikelsuspension auf eine Carbopol- konzentration von 0,5 % verdünnt wird, variiert werden.
Standardmässig wurde auf allfälligen Wirkstoffverlust, der von Membranschädigungen während des galenischen Produktionsverfahrens und/oder von der Langzeitlagerung herrühren könnte, getestet. Für diesen Zweck wurde das Gel mit Puffer verdünnt und filtriert. Im Falle von Membranbeschädigungen wären grössere Mengen an freigesetztem Galantamin im Filtrat nachweisbar. Wie aus den Abbildungen Abb.l3A und Abb.l3B ersichtlich, wird weder während der galenischen Formulierung noch während der nachfolgenden Lagerung über 19 Wochen bei 4°C ein signifikanter Anteil an Wirkstoff freigesetzt. Vielmehr verbleibt der Wirkstoff in den Liposomen auch nach der galenischen Formulierung mit Carbopol- Hydrogel und er zeigt ein gleichbleibendes Penetrationsprofil im Hauttest, was beweist, dass sowohl die Liposomen als auch der pH- Gradient in der Gelmatrix intakt geblieben sind.
Für einen Vergleich bezüglich der Hautpenetrationseigenschaften wurde auch freies Galantamin auf die gleiche Art und Weise mit Hydrogel vermischt und getestet. Ergebnisse werden in den Beispielen 3 bis 10 präsentiert.
Alternative Konzepte: Neben Liposomen haben auch Mikroemulsionen in den letzten Jahren verstärkt Aufmerksamkeit für topische Anwendungen bestimmter Wirkstoffe auf sich gezogen. Mikroemulsionen sind Dispersionen zweier miteinander nicht mischbarer Komponenten, die durch eine dritte, amphoterische Komponente stabilisiert werden. Aufgrund der Anwesenheit oberflächenaktiver Substanzen wie Emulgatoren und Co- Emulgatoren können Mikroemulsionen die Haut jedoch auf ähnliche Art und Weise schädigen wie transdermale Pflaster.
Nach vorausgegangenen Literaturstudien wurden mehrere
Mikroemulsionen (Tab.l) mit Galantamin als Wirkstoff hergestellt und anschliessenden Penetrationstests mit der Franz- Diffusionszelle unterzogen (Resultate siehe Beispiele 3 bis 10) .
Tabelle 1: Mikroemulsionen Lecithin ME W/O ME O/W ME 10 ml IPM 7,2 ml IPM 5,5 g H20 1,9 g SPC 0,2 g Chol 2,5 g IPM 135 μl H20 0,5 g H20 2 g Tween/Span20 10 mg Gal 2g Tween/Span20 11 mg Gal-HBr 10 mg Gal 5 mg Gal
ME=Mikroemulsion; W/O = Wasser in Öl; O/W = Öl in Wasser In allen hierin beschriebenen Versuchen zeigte sich, dass lediglich eine Verminderung des Cholesterolgehalts in der Liposomenmembran eine Verbesserung der transdermalen Pentrationseigenschaften mit sich brachte. Die angefertigten Liposomensuspensionen und liposomalen Gelpräparate sind bereits seit mehr als einem halben Jahr stabil und zeigen keine Veränderungen in den Produkteigenschaften.
Beispiele 3 -10 : Hautpenetrationstests unterschiedlicher lipid- basierter Galantaminpräparate
Franz-Diffusionszelle :
Die Diffusionszelle stammte von PermGear, USA. Die Ausrüstung umfasste drei Diffusionszellen, jede mit einem wassergefüllten Doppelmantel auf einer Rührerkonsole montiert und mit einem Wasserbad zur Temperatursteuerung verbunden. Die Zellen selbst haben ein Fassungsvolumen von je 8 ml, einen Hauthalter mit einer Oberfläche von 0,78 cm2 und eine Aufgabekammer mit 2 ml Fassungsvolumen.
Hautintegritätstest :
Für die Tests in der Franz-Diffusionszelle kam Schweinehaut zum Einsatz. Um eine intakte Hautoberfläche sicherzustellen wurde jedes Hautstück vor und nach dem Experiment getestet. Nach Befestigung der Haut auf dem Hauthalter der Diffusionszelle wurden 2 ml Puffer auf die Haut aufgebracht und auf 32 °C + 1 temperiert. Nach 30 Minuten wurde die elektrische Leitfähigkeit, ein Mass für den Hautwiderstand und die Hautqualität, gemessen. Der Messwert hängt ab vom Ursprung der Haut, ihrer Dicke, dem verwendeten Puffersystem und der für die Messung verwendeten Ausrüstung. Auf der Basis mehrerer Grundexperimente wurde ein Grenzwert für die elektrische Leitfähigkeit der intakten Haut von < 1 mS/cm2 vor dem Auftragen einer Probe festgelegt. Hautproben, die diese Anforderung nicht erfüllten, wurden für die Penetrationsexperimente nicht zugelassen.
Penetrationspuffer: Nachdem die erfindungsgemässen Liposomen in 0,3 M Zitronensäurepuffer, eingestellt auf pH 7,5 mit 1 M Natriumcarbonatlösung, hergestellt wurden, wurde derselbe Puffer auch für alle Penetrationsversuche eingesetzt.
Probenbehandlung nach dem Pentrationsversuch:
Nach jedem beendeten Experiment wurde der Überschuss an Galantamin-Probe durch Waschen der Oberfläche mit Puffer entfernt. Danach wurde nochmals die elektrische Leitfähigkeit gemessen und die Hautprobe vom Halter entfernt. Zum Zwecke der Trennung der Epidermis (Oberhaut) von der Dermis (Lederhaut) wurde die
Hautprobe auf eine elektrische Heizplatte gelegt und 30 Sekunden lang bei 60°C erwärmt. Nach dieser Wärmebehandlung kann die Epidermis ganz einfach mittels einer Pinzette abgehoben werden. Unmittelbar danach wurden Epidermis und Dermis jeweils getrennt voneinander in Plastikröhrchen überführt und bei -20 °C eingefroren. Zur Galantaminextraktion wurden 300 μl Puffer zur gefrorenen Probe in Gegenwart von flüssigem Stickstoff hinzugefügt und die tiefgefrorene Probe anschliessend in einer Kryo-Mühle pulverisiert. Das Pulver wurde sogleich in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei 4°C zentrifugiert, worauf der klare Überstand in ein sauberes Röhrchen transferiert und erneut bei -20°C bis zum Beginn der Analyse eingefroren wurde.
Quantifizierung des Galantamin-Überstandes: Zur Bestimmung kleiner Mengen an Galantamin wurde eine modifizierte, empfindlichere und schnellere rp-HPLC-Methode etabliert:
HPLC: Agilent 1100
Säule: Thermo Hypersil Keystone 150 x 4,6 mm, 5μm, 190A
Gradient: linearer Gradient Lösungsmittel A: H20/0,1%TFA Lösungsmittel B: ACN/0,1%TFA Detektion: DAD, 230nm Quantifikationsbereich: 30 - 1000 ng/ml Injektionsvolumen: lOOμl
Testmaterial :
Mehrere Proben mit unterschiedlichen Galantaminformulierungen wurden getestet. Änderungen im Aufgabevolumen und
Penetrationsdesign wurden vorgenommen und sind in den Ergebnissen zusammengefasst .
Material : - liposomale Galantaminsuspensionen: C16/3, 5/(55/45) C14/3, 5/(55/45) liposomale Galantamingele : C16/3, 5/(55/45) C16/3, 5/(62/38) C16/3, 5/(70/30) C14/3, 5/(55/45) E-PC/3, 5/(62/38) E-PC/3, 5/(70/30) - freie Galantamingele: 2 - 20 mg/g Gel Galantamin-Microemulsionen: Lecithin-ME (1 mg/ml) Wasser/Öl (W/O) - ME (1 mg/ml) Öl/Wasser (O/W) - ME (1,6 mg/ml) Die verschiedenen liposomalen Galantaminformulierungen wurden unter Zuhilfenahme der Kreuzstrominjektionstechnik hergestellt. Das Material wurde sowohl in Suspension als auch in einer Carbopol (981NF) -Gelmatrix getestet. Variationen in der
Membranzusammensetzung der Liposomen wurden durch den Einsatz verschiedener Lipide und unterschiedlicher Cholesterol-Gehalte (siehe Beispiele 1 und 2) erhalten. Die nachfolgenden Penetrationsstudien wurden mit verschiedenen Probenvolumina, einfachen und mehrfachen Probenaufgaben durchgeführt, wobei in zeitlichen Abständen Proben zur Galantaminbestimmung genommen wurden. Die in den Abbildungen 14 bis 21 dargestellten Resultate basieren jeweils auf einem dreifachen Penetrationsexperiment. Die Diagramme zeigen die Resultate in ng Galantamin absolut je analysierte Probe. Die Ergebnisse werden unterteilt in Werte, die aus der Rezeptorflüssigkeit REZ (=im Auffangbehälter gesammelte, durch die Haut penetrierte Flüssigkeit) und jene, die aus der Epidermis (EP) bzw. Dermis (DER) heraus bestimmt wurden.
Beispiel 3:
In Beispiel 3 werden die Ergebnisse verschiedener DPPC (C16)- Liposomen mit unterschiedlichen Cholesterolgehalten jenen von DMPC (C14) -Liposomen und E-PC-Liposomen gegenüber gestellt. Es wurde ein Probenvolumen von 50 μl einmal aufgetragen und über einen Zeitraum von 4 Stunden penetrieren gelassen. Alle getesteten Präparate wiesen vergleichbare Mengen an eingeschlossenem Galantamin auf und waren in 0,5% Carbopol 981NF suspendiert. Die effektivste Formulierung in diesem Versuch war die Probe mit der C16/70/30 (Acylkettenlänge / Mol% Phospholipid / Mol% Cholesterol) Lipidzusammensetzung. In diesem Gel betrug die Cholesterolkonzentration in den Liposomen 30 Mol%. Die beiden anderen Präparate hatten wesentlich höhere Cholesterolanteile (38 bzw. 45 Mol%) und waren daher auch wesentlich rigider. Die aus diesem Versuch ermittelten Daten bestätigen die Theorie, dass stärker fluide Liposomen, d.h. weniger rigide Membranen, effizienter penetrieren (Abb.14). In Abb.14 bedeuten: 1= C16/55/45; 2= C16/62/38; 3= C16/70/30; 4= C14/55/45; 5= E-PC/62/38; 6= E-PC/70/30. Bei spiel 4 :
In Beispiel 4 wurden die Penetrationseigenschaften von Gelproben nach wiederholter Aufbringung auf die Haut untersucht. Verglichen wurden zwei verschiedene Gele mit unterschiedlicher Lipidzusammensetzung bei gleichem Cholesterolgehalt . Die Proben wurden je dreimal ä 50 μl aufgetragen und zwar im Abstand von 4 Stunden. Überschüssiges Material wurde jeweils vor Aufbringung der nächsten Probe entfernt.
Wie aus dem Diagramm (Abb.15) ersichtlich, konnte zwar zum
Schluss eine Erhöhung der Galantaminkonzentration erreicht werden, doch scheint die Penetration in die Epidermis bei dreimaligem Auftragen des Materials irgendwie behindert oder gebremst zu werden. Möglicherweise handelt es sich dabei um eine Art Sättigung, hervorgerufen durch das kleine Oberflächenareal des eingespannten Hautstücks in Kombination mit den hohen Anwendungsdosen. Es wurden für beide Proben vergleichbare Resultate erzielt, sodass ein Einfluss der Lipidzusammensetzung nicht offensichtlich erkennbar war (Abb.15). In Abb.15 bedeuten:
(Kettenlänge/Phospholipid/Cholesterol/Probenmenge gesamt) 1= C16/55/45/50μl; 2= C16/55/45/100μl; 3= C16/55/45/150μl; 4= C14/55/45/50μl; 5= C14/55/45/100μl; 6= Cl4/55/45/150μl;
Beispiel 5:
In Beispiel 5 wurden Gele mit Cl6-Liposomen mit hohen und niedrigen Cholesterolgehalten nach einmaligem Auftragen miteinander verglichen. Probenvolumina von 150 μl und 50 μl wurden 4 bzw. 10 Stunden lang penetrieren gelassen. Die höchsten Galantaminmengen in der Haut wurden erneut bei Anwendung von Liposomen mit niedrigem Cholesterolgehalt gefunden. Auch hier scheinen niedrige Dosierungen vorteilhafter zu sein. Nach 4 und 10 Stunden wurden in der Epidermis dann hohe Galantaminmengen gefunden, wenn 50 μl eingesetzt wurden. Diese Resultate bestätigen die Werte, die in den Beispielen 3 und 4 erzielt wurden, d.h. die Verabreichung von Liposomen mit niedrigen Cholesterolgehalten bei gleichzeitig geringer Applikationsmenge insgesamt, könnte eine günstige Strategie bei der topischen Anwendung der erfindungs- gemässen Präparate im prophylaktischen oder therapeutischen Einsatz darstellen (Abb.16). Dabei bedeuten in Abb.16: (Kettenlänge/Phospholipid/Cholesterol/Probenmenge/Penetrationsdaue r) l=C16/55/45/150μl/4h; 2=Cl6/70/30/150μl/4h 3=C16/55/45/50μl/4h; 4=C16/70/30/50μl/4h; 5=C16/55/45/150μl/10h 6=C16/70/30/150μl/10h;
7=C16/55/45/50μl/10h; 8=C16/70/30/50μl/10h
Beispiel 6:
In Beispiel 6 wurde der Einfluss der Gelkonzentration im Zusammenhang mit drei verschiedenen Konzentrationen an freiem, in dem Gel suspendierten, Galantamin untersucht. 50 μl jeder Formulierung wurden einmal aufgetragen und das Penetrationsexperiment über 4 bzw. 10 Stunden durchgeführt (Abb.17). Die ersten drei Balken in Abb.17 repräsentieren die Ergebnisse mit 1% Carbopol 981NF nach 4 h, die nächsten drei Balken jene mit 0,5 % Carbopol 981NF nach 10 h. Die Ergebnisse nach 4 h zeigen, dass freies Galantamin relativ schnell in das Hautgewebe diffundiert. Allerdings, wie an den 10 h-Werten erkennbar, wurde der freie Wirkstoff auch in hoher Konzentration in der Rezeptorflüssigkeit gefunden, sodass nur ein geringfügiger Depoteffekt zu erwarten ist (Abb.17).
Beispiel 7:
In Beispiel 7 wurden verschiedene Applikationsstrategien getestet. Aus der Literatur ist bekannt, dass Mikroemulsionen als Trägersysteme für die Verabreichung von kleinen amphiphilen Molekülen nützliche Werkzeuge sein können. Um dieses Konzept zu überprüfen, wurden verschiedene Mikroemulsionen (Lecithin; Wasser in Öl; Öl in Wasser) mit jeweils 1 mg Galantamin je ml hergestellt (siehe Beispiele 1 und 2) .
Probenvolumina von 50 μl wurden je einmal aufgetragen und die Penetration wurde über eine Zeitraum von 4 h durchgeführt. Wie aus dem Diagramm (Abb.18) ersichtlich, waren die absoluten
Galantaminmengen in der Haut niedriger als bei Verwendung des Hydrogels mit Liposomen. Außerdem wurde der Wirkstoff gleichermassen in Dermis (Lederhaut) und Rezeptorflüssigkeit verteilt, was darauf schliessen lässt, dass eine rasche Penetration bei bestenfalls marginaler Speicherung im Hautgewebe stattgefunden hat (Abb.18). Diese Erkenntnisse stehen in Einklang mit jenen anderer Autoren und deuten auf einen ähnlichen Penetrationsmechanismus wie bei Verwendung von transdermalen Galantaminpflästern hin.
Beispiel 8:
In Beispiel 8 wurden die Ergebnisse mit freiem Galantamin in Hydrogel und Mikroemulsionen mit jenen der bevorzugten Liposomenzusammensetzung (C16-Phospholipide mit geringem Cholesterolanteil) verglichen. In allen Versuchen wurden vergleichbare Galantaminkonzentrationen unter ähnlichen Bedingungen untersucht.
Wie aus dem Diagramm (Abb.19) ersichtlich, wurden bei Verwendung der Hydrogelformulierung mit freiem Galantamin beträchtliche Galantaminmengen in der Haut gefunden. Akzeptable Werte wurden auch mit der Liposomenformulierung erhalten, weniger hingegen mit den Mikroemulsionen. Jedoch ist - wie schon in vorangegangenen Beispielen erläutert - das Ziel einer neuen topischen Wirkstoffformulierung nicht in erster Linie eine schnelle
Hautpenetration sondern vielmehr die Fähigkeit, ein Wirkstoffdepot in der Haut aufzubauen, aus welchem der Wirkstoff verzögert freigesetzt werden kann. Ein solches Depot könnte einerseits die Häufigkeit der Anwendung reduzieren und andererseits eine gleichmässigere, kontrollierte Abgabe des Wirkstoffes bewirken, was den therapeutischen Effekt steigern würde. Dies wird dann erreicht, wenn der Wirkstoff - wie im Fall der erfindungsgemässen liposomalen Formulierungen - in den oberen Hautschichten und nicht in tieferen Bereichen gespeichert wird.
Es bedeuten in Abb.19:
1= Liposomen (C16/70/30) ; 2= 1,8 mg Galantamin frei in Hydrogel; 3= 1,8 mg frei in Lecithin-Mikroemulsion; 4= 1,8 mg frei in W/O- ME; und 5= 1,8 mg frei in O/W-ME
Beispiel 9:
In Beispiel 9 wurden liposomale Formulierungen in Suspension und in Hydrogel mit einander verglichen. Die Verabreichung eines Überschusses von 1 ml liposomaler Suspension über einen Zeitraum von mindestens 24 h führte lediglich zu geringer Penetrationswirksamkeit (Abb.20). Es scheint sich also zu bestätigen, dass eine geeignete Gelmatrix nicht nur die Liposomen stabilisiert und das Aufbringen angenehmer und bequemer macht, sondern auch die Liposomen näher an die Haut heran bringt und so die Penetrationswirkung erhöht. Es bedeuten in Abb.20: (Kettenlänge/Phospholipid/Cholesterol/Probenmenge/Penetrationsdaue r/Art)
1= C16/55/45/lml/24h/Suspension; 2= C14/55/45/lml/24h/Suspension; 3= Cl6/55/45/100μl/8h/Gel; 4= C14/55/45/100μl/8h/Gel;
Beispiel 10:
Im allgemeinen scheint das in-vitro-Testen mittels der Franz- Diffusionszelle eine nützliche Methode für Penetrationsstudien mit verschiedenen liposomalen Formulierungen zu sein, auch wenn bestimmte Grenzen der Anwendbarkeit der Methode, speziell bei Einsatz liposomaler Gelformulierungen, zu Tage traten. Ausgehend von früheren Erfahrungen mit verschiedenen Liposomengels in vivo war auch für die hierin beschriebenen in vitro- Penetrationstests zu erwarten, dass jedes Gel vollständig und ohne verbleibenden Uberschuss an der Hautoberfläche in die Haut penetrieren kann. Dennoch ist es nicht gelungen, das Gel in den Experimenten mit der Franz-Diffusionszelle mit gleichem Erfolg zu verabreichen. In allen Versuchen blieb ein beträchtlicher Uberschuss an Probenmaterial an der Hautoberfläche zurück. Dieser Nachteil hat vermutlich die Penetrationseffizienz negativ beeinflusst. Es ist daher zu erwarten, dass in vivo höhere Mengen an liposomalem Galantamin in die Haut penetrieren.
Immerhin wurden aber selbst in den hierin beschriebenen in vitro- Experimenten mit den diversen Liposomenformulierungen umgerechnet bis zu 1,8 xlOlδ Wirkstoffmoleküle je 0,78 cm2 Hautoberfläche in die Oberhaut (Epidermis) transportiert.
Um nachzuprüfen, ob eventuell die Hautentnahme mit dem Dermatom oder die Vorbehandlung der Haut für die beobachteten Applikationsprobleme verantwortlich sein könnte, wurden verschiedene Hautproben getestet (Abb.21). Anhand der Ergebnisse liess sich allerdings kein klarer Einfluss feststellen. Es ist daher zu vermuten, dass die Haut selbst die erzielten Ergebnisse nicht wesentlich negativ beeinflusst hat. Dabei bedeuten in Abb.21:
1= Haut unbehandelt; Liposomen: 70/30 (Phospholipid/Cholesterol) ; 2= Haut mit Ethanol gereinigt; Liposomen: 70/30; 3= Haut mit Fettgaze behandelt; Liposomen: 55/45; 4= Haut mit Ethanol gereingt und mit Fettgaze behandelt; Liposomen: 55/45.
Jedenfalls lässt sich zusammenfassend sagen, dass liposomale Galantamin-Formulierungen in hydrophilem Gel eine vorteilhafte Darreichungsform darstellen, wenn der Ort der Behandlung im dermalen Gewebe (Lederhaut) liegt, selbst wenn der Wirkstoff nur zweimal pro Tag auf die Haut aufgetragen wird. Durch die erfindungsgemässe, milde, nicht invasive und nicht hautreizende Anwendung des liposomal eingeschlossenen Wirkstoffes lässt sich ein beachtlicher Depoteffekt in der Epidermis und eine langsame, gleichmässige Freisetzung des Wirkstoffes in das darunter liegende dermale Gewebe erzielen.
Abkürzungen:
ACN Acetonitril
DAD Diodenarraydetektor DER Dermis (Lederhaut)
DMPC Dimyristoylphosphatidylcholin
DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin
E-PC natürliches Phosphatidylcholin aus Eiern
E-PG natürliches Phosphatidylglycerin aus Eiern EP Epidermis (Oberhaut)
IPM Isopropylmyristat
NGF Nerve Growth Factor
PBS Phosphate Buffered Saline
REZ Rezeptorgefäss (Auffangbehälter) rp-HPLC reversed phase High Performance Liquid
Chromatography
TFA Trifluoressigsaure

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Pharmazeutische Zusammensetzung auf der Basis eines in Liposomen eingeschlossenen Wirkstoffes zur topischen, transdermalen Applikation, dadurch gekennzeichnet, dass die
Liposomen in ihrem Inneren ein saures, wässriges Milieu aufweisen und darin mindestens einen Cholinesterase-Hemmer, vorzugsweise aus der Gruppe Donepezil, Rivastigmin, Galantamin, Physostigmin, Heptylphysostigmin, Phenserin, Tolserin, Cymserin, Thiatolserin, Thiacymserin, Neostigmin, Huperzin, Tacrin, Metrifonat und Dichlorvos, oder ein Enantiomer oder Derivat zumindest einer dieser Verbindungen, enthalten.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des wässrigen Milieus innerhalb der Liposomen in einem
Bereich von 2,5 - 5,5, insbesondere in einem Bereich von 3,5 - 4,5 liegt.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Milieu innerhalb der Liposomen eine organische Säure, insbesondere Zitronensäure, enthält.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ausserhalb der Liposomen ein Milieu mit neutralem oder alkalischem pH-Wert, vorzugsweise einem pH-Wert von 7 bis 8, insbesondere einem pH-Wert von 7,5 vorliegt.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen unilamellar sind und eine Lipid-Doppelschichtmembran aufweisen.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen Phospholipide mit einer Acylkettenlänge von mindestens 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von mindestens 16 Kohlenstoffatomen, enthalten.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen Cholesterol in einer Menge von 0 - 50 Mol%, vorzugsweise von 30 - 45 Mol%, der Gesamtlipide enthalten.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen eine mittlere Grosse im Bereich von 150 bis 500 nm aufweisen.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen den Wirkstoff in einer Konzentration von mindestens 100, insbesondere von 150 - 400 nmol je μmol Lipid enthalten.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Suspension, Lotion, Emulsion, Tinktur, oder eines Sprays, Gels, einer Creme oder einer Salbe, vorzugsweise in steriler Form, vorliegt.
11. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung auf der Basis eines in Liposomen eingeschlossenen Wirkstoffes, dadurch gekennzeichnet, dass durch Injektion einer ethanolischen Lipidphase in eine saure wässrige Phase spontan Liposomen mit einem sauren, wässrigen Milieu in ihrem Inneren erzeugt werden, worauf die wässrige Phase neutralisiert oder alkalisiert wird, sodass sich zwischen der Innen- und Aussenseite der Liposomen ein pH-Gradient ausbildet und wobei der Wirkstoff entweder a) in der sauren wässrigen Phase vorgelegt und im Zuge der spontan erfolgenden Liposomenbildung in die Liposomen aufgenommen, oder b) erst nach erfolgter Vesikelbildung der wässrigen Phase zugesetzt wird und entlang des pH-Gradienten in die Liposomen migriert.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Neutralisation oder Alkalisierung unmittelbar nach erfolgter Liposomenbildung vorgenommen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Phase vor der Neutralisation oder Alkalisierung einen pH- Wert von 2,5 - 5,5, vorzugsweise von 3,5 - 4,5 und danach einen pH-Wert von 7 - 8, vorzugsweise von 7,5, aufweist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die saure wässrige Phase eine organische Säure, insbesondere Zitronensäure, enthält und die Neutralisation oder Alkalisierung durch Verdünnen der wässrigen Phase mit einem alkalischen Puffer, insbesondere mit Natriumcarbonat, vorgenommen wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidphase Phospholipide mit einer Acylkettenlänge von mindestens 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von mindestens 16 Kohlenstoffatomen, enthält.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidphase Cholesterol in einer Menge von 0 - 50 Mol%, vorzugsweise von 30 - 45 Mol%, der Gesamtlipide enthält.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkstoff mindestens ein Cholinesterase- Hemmer, vorzugsweise aus der Gruppe Donepezil, Rivastigmin,
Galantamin, Physostigmin, Heptylphysostigmin, Phenserin, Tolserin, Cymserin, Thiatolserin, Thiacymserin, Neostigmin, Huperzin, Tacrin, Metrifonat und Dichlorvos, oder ein Enantiomer oder Derivat zumindest einer dieser Verbindungen, in der wässrigen Phase vorgelegt oder der wässrigen Phase nach erfolgter Liposomenbildung zugesetzt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung mit den mit Wirkstoff beladenen Liposomen in Form einer Suspension,
Lotion, Emulsion, Tinktur, oder eines Sprays, Gels, einer Creme oder einer Salbe, vorzugsweise in steriler Form, hergestellt wird.
19. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Medikament zur topischen Anwendung auf der Haut.
20. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Medikamentes mit Depotwirkung in der Haut, zur Prophylaxe und/oder Therapie des dermalen neuropathischen Schmerzes oder des neurophatiebedingten Verlustes der dermalen sensori-schen Funktion.
21. Verwendung wenigstens eines Cholinesterase-Hemmers, 5 vorzugsweise aus der Gruppe Donepezil, Rivastigmin, Galantamin, Physostigmin, Heptylphysostigmin, Phenserin, Tolserin, Cymserin, Thiatolserin, Thiacymserin, Neostigmin, Huperzin, Tacrin, Metrifonat und Dichlorvos, oder eines Enantiomers oder Derivates zumindest einer dieser Verbindungen, zur Herstellung einer 10 pharmazeutischen Zusammensetzung zur topischen Applikation mit Depotwirkung in der Haut, zur Prophylaxe und/oder Therapie des dermalen neuropathischen Schmerzes oder des neurophatiebedingten Verlustes der dermalen sensorischen Funktion.
15 22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, zur Verminderung oder Vermeidung unerwünschter systemischer Nebenwirkungen.
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