MXPA06012120A - Inhibidores de colinesterasa en liposomas asi como su produccion y uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica a base de un ingrediente activo incorporado en liposomas para la aplicacion topica transdermal, en donde los liposomas presentan en su interior un medio acido acuoso y contienen ahi cuando menos un inhibidor de colinesterasa, de preferencia del grupo integrado por donepezil, rivastigmina, galantamina, fisostigmina, heptilfisostigmina, feneserina, tolserina, cimserina, tiatolserina, tiacimserina, neostigmina, huperzina, tacrina, metrifonato y diclorovos, o un enantiomero o derivado de cuando menos uno de estos compuestos. La invencion tambien se refiere a un procedimiento para la produccion de este compuesto, eventualmente en forma esteril, asi como al uso de los liposomas cargados con ingrediente activo en diversas formulaciones galenicas para la aplicacion topica transdermal con efecto de deposito en la epidermis, para la profilaxis y/o la terapia del dolor neuropatico dermal o de la perdida por neuropatia de la funcion sensorial dermal. Figura 8.

Description

INHIBIDORES DE COLINESTERASA EN LIPOSOMAS ASI COMO SU PRODUCCIÓN Y USO La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas a base de inhibidores de colinesterasa en liposomas, a la producción de dichas composiciones y a sus posibilidades de aplicación terapéutica. Los inhibidores centrales de colinesterasa se utilizan para la farmacoterapia de la enfermedad de Alzheimer ligera hasta .medianamente grave con el fin de restablecer parcialmente en el cerebro la función patológicamente reducida con este síndrome del sistema de transmisión de excitaciones. Las investigaciones más recientes han arrojado que muchos inhibidores de colinesterasa no sólo bloquean la acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa mediante distintos mecanismos, sino que también ejercen una acción directa sobre los receptores nicotínicos neuronales. Dichos receptores, cuyo ligando natural es acetilcolina, no sólo se encuentran en nervios colinérgicos, sino también en el sistema nervioso serotonérgico y glutamatérgico y controlan ahí la liberación del respectivo neurotransmisor. Este efecto ocurre a concentraciones muy distintas del agente en cuestión, tiene lugar en diferentes puntos de enlace del receptor y puede producir (en parte también en función de la concentración del inhibidor de colinesterasa mismo y/o de la concentración de acetilcolina que se tenga simultáneamente) un bloqueo o una amplificación del efecto de acetilcolina sobre el receptor. En este aspecto, la galantamina estudiada de manera particularmente detallada juega un papel prototípico, ya que a concentraciones que producen una inhibición de colinesterasa de efecto terapéutico, es un ligando de modulación aloestérica en un punto de enlace distinto al punto de enlace de acetilcolina (Samochocki y colaboradores, Acta Neurol Scand Suppl. 2000; 176: 68-73; Dalas-Bailador y colaboradores, Mol Pharmacol. 2003; 64 (5): 1217-26). De este modo se potencializa adicionalmente el efecto de la concentración elevada de acetilcolina debido a la inhibición de colinesterasa de la galantamina. Por lo visto, en este y en otro punto de enlace del receptor se encuentra (Svensson y Nordberg, Neuroreport 1996; 7(13): 2201-5). Existen indicios comparables también para fisostigmina (Onkojo y colaboradores, Eur J Biochem 1991; 200(3): 671-7) y para donepezil . También de la galantamina se reportó un efecto antiapoptótico no colinérgico (Arroyo y colaboradores, Rev Neurol. 2002; 34(11): 1057-65), al igual que un efecto comparable con el Nerve Growth Factor (NGF) (Capsoni y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U.S.A. 2002; 99(19): 12432-7) .

A pesar de que estos estudios se llevaron a cabo en relación al tratamiento de la demencia de Alzheimer con su déficit colinérgico específico y la neurodegeneración vinculada a ello, también son de gran relevancia para enfermedades degenerativas y dolorosas del sistema nervioso periférico, en particular de los nervios sensoriales. Por un lado, desde hace tiempo se conoce la acción antinocicéptica de la nicotina y otras sustancias de efecto agonístico en receptores nicotínicos. Por el otro lado, en los estados tempranos de la neuropatía sensorial diabética al igual que en lesiones nerviosas agudas, la concentración del NGF en las secciones afectadas de la piel se encuentra fuertemente reducida. El NGF o una actividad neurotrófica equivalente que se transmite directamente o a través del sistema colinérgico estrechamente ligado al NGF, podría restablecer aquí la función sensorial. Sin embargo, los estudios a este respecto tuvieron poco éxito presumiblemente debido a que no se pudieron lograr concentraciones de NGF locales suficientemente elevadas sin efectos secundarios sistémicos (Anand, Prog Brain Res. 2004; 146 :477-92) . También los agonistas nicotínicos se vieron afectados en su aplicabilidad terapéutica a este respecto debido a efectos secundarios tales como alta presión arterial y parálisis 'neuromuscular. Esencialmente debido a su problemática de efectos secundarios, los inhibidores de colinesterasa de acción periférica se consideran inadecuados para la terapia analgésica en el ser humano (Ghelardini y colaboradores, Presynaptic Auto- and Heteroreceptors in the Cholinergic Regulation of Pain. In: Trends in Receptor Research, Elsevier Science Publishers B.V., 1992). Las formulaciones transdermales de los inhibidores de colinesterasa a base de parches que contienen el ingrediente activo disuelto o distribuido en un amplificador de penetración dermal, son conocidas. Como relación a manera de ejemplo de dichos sistemas transdermales pasivos se citan: las Patentes Europeas EP-0376067, EP-0377147, EP-0667774, EP- 0599952 y EP0517840 para fisostigmina; la Publicación Internacional WO-9934782 para pivastigmina; la Patente Europea EP-0680325 para galantamina así como la Publicación Internacional WO- 0132115 para Huperzina. Moriearty y colaboradores (Methods Find Exp Clin Pharmacol 1993; 15(6): 407-12) describen sistemas así para metrifonato o su producto de hidrólisis activo como inhibidor de colinesterasa diclorovos y para heptilfisostigmina. Otros dos descendientes sintéticos de la fisostigmina, tiacimserina y tiatolserina, son descritos por sus desarrolladores expresamente como particularmente adecuados para el uso transdermal. Los sistemas transdermales están diseñados todos para aplicaciones que requieren una administración sistémica del respectivo ingrediente activo. En estos casos, la elección de la ruta transdermal está dada por el deseo de entregar el ingrediente activo lenta y uniformemente al torrente sanguíneo y/o evitar la descomposición "First Pass" en el hígado que tiene lugar con la administración peroral, de modo que los niveles de plasma terapéuticamente óptimos se mantienen por largo tiempo. En lo anterior, la acción sistémica se logra gracias a que el ingrediente activo atraviesa la piel mediante difusión pasiva y es incorporado al torrente sanguíneo por los vasos capilares subdermales . El ingrediente activo también se puede depositar o enlazar provisionalmente en el tejido graso subdermal, para ser lavado de ahí lentamente hacia la circulación sanguínea. En la piel misma y como se tiene planeado, ocurre únicamente una retención reducida del ingrediente activo. Por ello, los sistemas mencionados son inadecuados para la terapia del dolor neuropático o la afectación de la función sensorial dermal debido a la neurodegeneración. Los liposomas son conocidos como medios para la liberación controlada de ingredientes activos farmacéuticos (por ejemplo, véase la relación en Ulrich, Biosci Rep. 2002; 22(2) : 129-50), en particular también por su uso en sistemas de "parches" transdermales especiales (por ejemplo, revelados en la Publicación Internacional WO-8701938 y en la Patente Norteamericana US-5718914) y en geles (Patente Norteamericana US 5064655) . El experto en la materia también conoce las formulaciones de anestésicos locales en liposomas de aplicación tópica; por ejemplo, la Patente Norteamericana US- 4937078 describe liposomas que contienen bloqueadores del canal de sodio habituales tales como tetracaína, lidocaína, etc . Una formulación liposomal del inhibidor de colinesterasa neostigmina para utilizarse como analgésico se ha descrito (Grant y colaboradores, Acta Anaesthesiol Scand. 2002; 46(1): 90-4), pero fue administrada por vía intratecal (es decir, en el tejido conjuntivo) , de modo que el efecto analgésico observado fue central . De este modo existe el objetivo de conformidad con la invención de encontrar la manera de administrar de tal modo los inhibidores de colinesterasa de acción conocida sobre los receptores nicotínicos neuronales y/o la actividad neurotrófica similar al NGF, que se puedan reducir o evitar tanto las desventajas conocidas de las aplicaciones con parche (por ejemplo, la necesidad de una superficie lo más plana posible para la aplicación del parche; posibles irritaciones cutáneas; la concentración de ingrediente activo en el parche debe ser muy elevada; los amplificadores de penetración pueden producir daños en la piel) , como también las desventajas de los procedimientos de aplicación invasivos y otros tipos de aplicación sistémica, en especial los efectos secundarios sistémicos indeseados y relacionadas con la elevada dosis necesaria. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica con inhibidores de colinesterasa que permita una dosificación de estos ' ingredientes activos reducida en su totalidad, pero a su vez suficientemente elevada en el aspecto local en la zona de las terminaciones nerviosas sensoriales de la piel, evitando simultáneamente en gran medida su sistemización. Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición que se pueda aplicar en cualquier parte del cuerpo, en particular también en zonas "irregulares" e inadecuadas para una aplicación de parches, por ejemplo, en pies para la neuropatía diabética y en la cara para la neuralgia del trigémino . Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición que no produzca manifestaciones de maceración en la piel, lo cual es esencial en el caso de piel predañada y/o frágil, por ejemplo, en diabéticos. Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición que se pueda elaborar como producto estéril y así se pueda aplicar como agente terapéutico, por ejemplo, en herpes zóster ya desde el estado e ampollas o en la fase de curación. Finalmente, también es objetivo de la invención proporcionar una composición que produzca en la piel un depósito de ingrediente activo desde el cual se suministre sustancia de manera continua, con lo cual se logra además una mejor biodisponibilidad y un mayor tiempo de descomposición en comparación con la aplicación sistémica. De conformidad con la invención, dichos objetivos se logran proporcionando un sistema liposomal para la administración tópica de inhibidores de colinesterasa. Sorpresivamente se encontró que al incluir los inhibidores de colinesterasa en liposomas de determinada composición y determinado tamaño y la subsiguiente formulación de los mismos en sistemas galénicos adecuados para la aplicación transdermal, se pueden lograr los objetivos antes mencionados. En lo anterior, para la producción y la carga de los liposomas con el ingrediente activo se ha acreditado como particularmente ventajoso gracias a su elevada eficiencia y a sus simultáneas condiciones de procedimiento benignas, el procedimiento escalable revelado en la Publicación Internacional WO-0236257 para el encapsulamiento de ingredientes activos. Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos conocidos en la técnica anterior para la producción y carga de liposomas. La carga de los liposomas con ingredientes activos se puede subdividir en dos categorías principales : carga de la membrana y carga de la fase acuosa intraliposomal . Después de que la base de galantamina fuera soluble en etanol, se intentó por primera vez incorporar las moléculas de ingrediente activo en la membrana liposomal, lo cual, sin embargo, no se logró. Mientras más galantamina ni se incorpore en la membrana y, en lugar de ello, se elimine por filtración, más fue suministrado también por la membrana. La porción de galantamina ligada a la membrana y no ligada fue aproximadamente igual de grande. Por esta razón, después se intentó cargar con galantamina la fase acuosa intraliposomal . Este proceso se puede llevar a cabo de dos maneras: mediante carga activa y pasiva. Partiendo de ensayos con carga pasiva de liposomas con galantamina-HBr/base en solución de PBS, pronto se observó que de este modo no se pueden producir suspensiones de galantamina-liposomas estables. Al igual que en los anteriores ensayos de membrana, el ingrediente activo también se difundía del medio acuoso de los liposomas en cuanto se retiraba del medio de entorno el ingrediente activo no incorporado . Por lo tanto, era necesario analizar el ingrediente activo galantamina más de cerca. Con ello se encontró que la galantamina presenta propiedades químicas similares a la doxorrubicina y mediante la carga controlada por gradientes de pH, se puede incorporar en liposomas. Para este tipo de carga activa, la característica más importante es el coeficiente de distribución de membrana/medio de liposoma. Se encontró que el coeficiente de distribución de amortiguador de octanol proporciona una buena indicación de la difusión de transmembrana de una sustancia y, por lo tanto, es relevante para la carga con ingrediente activo y para el perfil de liberación. Además, el ingrediente activo debe contener grupos amino protonizables, de modo que a un pH reducido el ingrediente activo es hidrofílico y a pH neutral o alcalino, es lipofílico. Partiendo de este modelo teórico, se produjeron liposomas con distinta composición de lípido, de preferencia con fosfolípidos de cadena larga y baja concentración de colesterol, en un amortiguador de carga adecuado, de preferencia en un amortiguador de ácido cítrico/carbonato de sodio. Después de producir los liposomas a pH reducido, se alcalinizó el medio de entorno y, de este modo, se generó un gradiente de pH. Después de agregar galantamina al medio alcalinizado, el ingrediente activo migra gracias a este gradiente de pH hacia adentro de los liposomas, en donde se protonizó y permaneció estable en los mismos. Al utilizar esta técnica, la medida de la carga, o bien, de la capacidad de carga es determinada en primer lugar por la proporción de los valores de pH dentro y fuera de los liposomas. En los ensayos realizados, con proporciones de ingrediente activo/lípido en el intervalo de 200-400 nmoles de ingrediente activo por µmol de lípido, se pudieron lograr valores similares como los conocidos por la literatura especializada a través de liposomas cargados de manera activa. Un incremento de la concentración del ingrediente activo en el medio de carga no produjo ningún incremento de la capacidad de carga. La carga activa antes descrita es un proceso de tres etapas que consta de formación de vesículas, adición del ingrediente activo y alcalinización. Por lo tanto, otro objeto de la invención era establecer un procedimiento de producción de una etapa que se pudiera realizar utilizando el módulo de corriente cruzada revelado en la Publicación Internacional WO-0236257. Con este fin se disolvió galahtamina en solución de ácido cítrico, se incorporó en liposomas mediante la técnica de inyección de corriente cruzada e inmediatamente después se alcalinizó el resto de la solución de ácido cítrico con un amortiguador de dilución (ácido cítrico/carbonato de sodio pH 9.0-9.5). En los siguientes ejemplos se muestra, entre otras cosas, que la calidad de los liposomas cargados con ingrediente activo se puede mejorar simplemente mediante la variación, en particular la reducción, del contenido de colesterol en la membrana de las vesículas, sobre todo en cuanto a su capacidad de penetración en la piel. Asimismo, las pruebas de estabilidad en los productos de los procedimientos de tres y una etapas demuestran que en ambos productos la estabilidad y calidad de los mismos se mantuvo sin modificaciones incluso después de más de seis meses de almacenamiento . En donde sea necesario o deseado, aumentando el tamaño promedio de los liposomas de aproximadamente 150-200 nm (como se utiliza por lo general en los experimentos aquí descritos) a 300-500 nm, la capacidad de carga se puede incrementar aún más. Adicionalmente, la eficiencia del procedimiento, es decir, la cantidad de ingrediente activo incorporado de forma liposomal por ml de suspensión, también se puede incrementar más aumentando la concentración de lípido ya sea durante la producción o en la subsiguiente filtración de las vesículas. La Figura 1 muestra una reproducción esquemática de un dispositivo para la producción de liposomas. La Figura 2 muestra los resultados de la CLAR de los ensayos de inclusión de galantamina en liposomas. Las barras oscuras indican galantamina en el retentato (es decir, galantamina liposomal) , en cambio, las barras claras indican galantamina en el filtrato (galantamina no incorporada) y la barra vacía indica la cantidad total de galantamina; ordenada-: galantamina en µg/ml . La Figura 3 muestra los resultados de la CLAR de los ensayos de inclusión de galantamina en liposomas. Las barras oscuras indican galantamina en el retentato (es decir, galantamina liposomal) , en cambio, las barras claras indican galantamina en el filtrato (galantamina no incorporada) y las barras vacías indican la cantidad total de galantamina; primeras tres barras : liposomas cargados positivamente con estearilamina; últimas tres barras: liposomas cargados negativamente con E-PG; 3A: galantamina-HBr; 3B: galantamina- base. La Figura 4 muestras los resultados de la CLAR de los ensayos de incorporación de galantamina en liposomas . Las barras oscuras indican galantamina en el retentato (es decir, galantamina liposomal) , en cambio, las barras claras indican galantamina en el filtrato (galantamina no incorporada) y las barras vacías indican la cantidad total de galantamina. La Figura 5 muestra los resultados de una prueba de estabilidad con liposomas de galantamina cargados activamente a distinto pH de la fase acuosa. Ordenada: concentración de ingrediente activo en nmoles de ingrediente activo por µmoles de lípido; abscisa: tiempo en semanas desde la producción de los preparados . La Figura 6 muestra los datos de la CLAR de la carga de liposomas preformados con galantamina en función de la temperatura y la duración de la carga. Información en por ciento de la concentración de galantamina dispuesta. La Figura 7 muestra los datos de la CLAR de liposomas cargados activamente en presencia de un exceso de galantamina de dos ensayos de producción. Las barras oscuras indican la cantidad de galantamina no incorporada, las barras claras aquélla de galantamina incorporada de forma liposomal . La línea clara entre los símbolos triangulares (valores correspondientes: ordenada derecha) indica la proporción estable de lípido/ingrediente activo. La Figura 8 muestra datos de estabilidad de un preparado de liposomas en donde éstos se cargaron activamente con galantamina en un procedimiento de una etapa. Ordenada: concentración de ingrediente activo en nmoles por ingrediente activo por µmoles de lípido; abscisa; tiempo en semanas desde la producción de los preparados . La Figura 9 muestra datos de estabilidad de liposomas de galantamina cargados activamente: A) producidos con el procedimiento de tres etapas; B) producidos con el procedimiento de .una etapa. La Figura 10 muestra los índices de inclusión de galantamina y la estabilidad de los liposomas de DMPC cargados activamente . La Figura 11 muestra la incorporación de galantamina en los liposomas de DPPC en función del contenido de colesterol . La Figura 12 muestra una prueba de estabilidad de liposomas de galantamina producidos conforme al método de gradientes de sulfato de amonio. Fl, F2 y F3 indican muestras de filtrato, R indica retentato.

La Figura 13 muestra la estabilidad de los liposomas de galantamina con lípidos de distinta longitud de cadena (A: C16 y B: C14) en formulaciones de hidrogel. La Figura 14 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de galantamina liposomales de distinta composición de lípido. Ordenada: ng de galantamina absoluta en la muestra en cuestión; abscisa: variaciones de la composición de lípido. • La Figura 15 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de galantamina liposomales después de una aplicación reiterada. La Figura 16 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de galantamina liposomales en función de la cantidad de muestra y la duración de la penetración. La Figura 17 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de galantamina liposomales en función de la concentración de hidrogel . La Figura 18 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de galantamina en forma de microemulsiones. La Figura 19 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de hidrogel a base de galantamina libre en comparación con galantamina incorporada de manera liposomal.

La Figura 20 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de galantamina liposomales en forma de una suspensión y como gel. La Figura 21 muestra el resultado de estudios in vitro de penetración en la piel con preparados de galantamina liposomales en distintas muestras de piel. Para una mejor ilustración, la invención se presenta más detalladamente con base en los siguientes ejemplos. Los ensayos se realizaron con galantamina como ingrediente activo, ya sea en forma de base libre o como sal HBr. Sin embargo, para el experto en la materia es claro que en el marco de la presente invención la galantamina también se puede utilizar en forma de sus enantiómeros y todas sus sales f rmacológicamente aceptables. De igual manera, en el marco de la presente invención están incluidos los derivados químicos de la galantamina y sus enantiómeros, como las moléculas reclamadas en las Publicaciones Internacionales WO-9612692, WO-9740049 y WO-0174820, si son inhibidores de colinesterasa y/o moduladores de receptores nicotínicos y/o desarrollan efectos neurotróficos tipo NGF, pudiéndose ajustar la composición y el tamaño de los liposomas a las propiedades fisicoquímicas de dichas moléculas. En el mismo sentido, para el experto en la materia es evidente que en el marco de esta invención también entran otras sustancias que galantamina y sus sales y derivados, siempre y cuando sean inhibidores de colinesterasa y/o moduladores de receptores nicotínicos y/o desarrollen efectos neurotróficos tipo NGF. A ellas pertenecen además de todas las sustancias indicadas en la descripción introductoria de la técnica anterior, en particular también las moléculas citadas en la Publicación Internacional WO 02059074, al igual que los descendientes de donepezil mencionados en las Publicaciones Internacionales WO 0178728 y WO 0198271, en especial también su derivado de fluoro ER-127528. Ejemplo 1: Producción y prueba de estabilidad de los liposomas de galantamina Para la producción de vesículas se utilizaron dipalmitoilfosfatidilcolina sintética (DPPC, Genzyme, Suiza) y colesterol (Solvay, Países Bajos) . Algunos experimentos se realizaron ya sea con fosfatidilglicerol de huevos de gallina (E-PG; empresa Lipoid, Alemania) o con estearilamina (Sigma, EUA) , con el fin de introducir en la membrana liposomal cargas positivas o negativas. La galantamina (Sanochemia AG, Austria) se utilizó como base libre o como sal HBr para los ensayos de inclusión. Como soluciones amortiguadoras se emplearon- PBS (phosphate buffered saline) o ácido cítrico en combinación con carbonato de sodio. Los liposomas se produjeron de preferencia mediante la técnica de inyección de corriente cruzada libre de fuerza de cizallamiento de conformidad con la Publicación Internacional WO- 0236257. Esta técnica se puede reproducir muy bien y permite la incorporación de cualquier ingrediente activo en los liposomas. Este método de una etapa que se puede realizar en continuo permite mediante la variación de las condiciones del procedimiento, en particular de la presión de inyección de la fase de lípido, producir de manera estable liposomas unilamelares con una membrana de capa doble de lípido ("bilayer") con tamaño y distribución de tamaño medios definidos y predeterminables . También se puede llevar a cabo bajo condiciones de procedimiento particularmente suaves y permite prescindir del uso de solventes posiblemente dañinos así como, en especial, del uso de fuerzas de cizallamiento para la formación de vesículas. Otras ventajas de este método se describen detalladamente en la Publicación Internacional WO-0236257. Asimismo, con este método es posible preparar todos los reactivos de forma estéril o libre de gérmenes y realizar la producción y carga de los liposomas bajo condiciones asépticas, de modo que al final resulte un producto estéril o libre de gérmenes en forma de liposomas cargados con ingrediente activo. La comprobación de la galantamina incorporada se realizó por ultrafiltración y/o diafiltración en una célula de agitación (A icon, EUA) o por filtración en gel mediante columnas Sephadex G25 (Pharmacia, Alemania) , mediante CLAR en fase invertida. La técnica de CLAR en fase invertida propia de la casa permite la determinación cuantitativa del componente de membrana colesterol y del ingrediente activo galantamina dentro de un sólo paso. El tamaño y la distribución de los liposomas se determinaron mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS) . Producción de los liposomas : Los liposomas se producen de preferencia mediante la técnica de corriente cruzada. Como se muestra en la Figura 1, el dispositivo para la producción de liposomas consta de un módulo de inyección de corriente cruzada 1, recipientes para la fase polar (amortiguador de inyección 2 y amortiguador de dilución 3) , un recipiente para la solución de etanol/lípido 4 y una compresora de nitrógeno 5. La abertura de inyección en el módulo de corriente cruzada tiene un diámetro de aproximadamente 250 µm. La mezcla de lípidos se disuelve bajo agitación de preferencia en etanol al 96% a una temperatura en el intervalo de 25 a 60 °C (dependiendo de la selección o composición de lípidos) , por ejemplo, en el caso de liposomas de DPPC, a una temperatura de 50 a 55 °C. También las soluciones amortiguadoras se templan de preferencia a la misma temperatura, por ejemplo, 55 °C. Mientras que la fase polar se bombea por el módulo de corriente cruzada mediante una bomba 6, por ejemplo, una bomba peristáltica, la solución de etanol/lípido se inyecta simultáneamente a la fase polar bajo cualquier presión predeterminable . Variante I : DPPC, colesterol y estearilamina (proporción molar 7:2:1) se disuelven junto con galantamina en etanol al 96% y se inyectan en amortiguador de PBS. Después .de la formación espontánea de los liposomas, éstos se filtran y tanto el retentato como el filtrato se analizan por CLAR en fase invertida. Como se observa en la Figura 2, de esta manera la galantamina no se puede integrar de forma estable en los liposomas. El filtrato (galantamina no incorporada) y el retentato (gala.nta.mina incorporada. de forma liposomal) presentan concentraciones de ingrediente activo idénticas . En la Figura 2 significan: la Ia barra: la cantidad total de galantamina dispuesta; la 2a y 3a barra: la distribución de ingrediente activo en el filtrato y el retentato después de una primera diafiltración (2a barra) y una diafiltración adicional (3a barra) . Variante II: Una vez más los lípidos se disolvieron en etanol.

Para los ensayos con liposomas cargados negativamente se utilizó estearilamina mediante fosfatidilglicerol de huevo de gallina (E-PG) . La solución de etanol/lípido se inyecta ya sea en una solución de PBS/base de galantamina o en una solución de PBS/galantamina HBr. Como • se observa en las Figuras 3A y 3B, tampoco con este procedimiento se pudo incorporar galantamina de manera satisfactoria. Después de la filtración, en el filtrato y en el retentato se encontraron las mismas cantidades de galantamina . En las Figuras 3A y 3B significan: la Ia y 4a barra: la cantidad total de galantamina dispuesta en cada caso; la 2a y 3a, o bien, 5a y 6a barra: la distribución de ingrediente activo en el filtrato y el retentato después de una primera diafiltración (2a y 5a barra) y una diafiltración adicional (3a y 6a barra) . Variante III : Carga externa de liposomas con galantamina mediante gradiente de pH. Los lípidos (proporción molar DPPC: colesterol = 55:45) se disolvieron en etanol y esta solución se inyectó a 300 mM de ácido cítrico de pH 3.5-4.5. Después de la formación espontánea de vesículas, se agrega galantamina-HBr y la solución se alcaliniza con 500 mM de carbonato de sodio. De este modo se genera un gradiente de pH entre el interior y el exterior de la vesícula de lípido (liposomas) . Debido a los incipientes problemas de hidrólisis, los valores de pH menores a 2.5 son menos adecuados al igual que los valores de pH mayores a 5.5 no se prefieren debido al gradiente de pH cada vez más plano. Como se observa en la Figura 4, la porción de galantamina en el filtrato es considerablemente menor que en el retentato, lo cual confirma que una gran parte de la galantamina evidentemente migra a los liposomas a lo largo de este gradiente de pH, se protoniza y permanece en el medio ácido dentro de los liposomas . En la Figura 4 significan: la Ia barra : el contenido total de galantamina dispuesta: la 2a y 3a barra: la distribución de ingrediente activo en el filtrato y el retentato después de una primera diafiltración (2a barra) y una diafiltración adicional (3a barra) . Este producto se dividió en varias alícuotas y se sometió a una prueba de estabilidad. En la Figura 5 se muestra la estabilidad del producto en un período de 8 semanas . Para determinar la cinética de la carga activa de los liposomas con galantamina, se estudió la duración del proceso de carga y se determinó la temperatura de carga ideal . En la Figura 6 se puede observar que dentro de alrededor de 15 minutos la cantidad total de galantamina migra a los liposomas y que tanto para la inclusión de ingrediente activo como también para la retención del mismo dentro de los liposomas, resulta favorable una temperatura de incubación en el intervalo de la temperatura ambiente (18- 22 °C) . Sin embargo, las diferencias observadas en un intervalo de 22-40°C son reducidas y en cualquier caso no desempeñan un papel significativo. La influencia negativa de mayores temperaturas de incubación parece repercutir en primer lugar en la estabilidad de los liposomas cargados, ubicándose la pérdida de ingrediente activo después de tres horas de incubación a una temperatura de 60 °C en un intervalo de aproximadamente 20-25% (Figura 6) . Con el fin de lograr un incremento de la cantidad de galantamina incorporada de manera liposomal, se preparó una solución con 8-10 mg de galantamina por ml de solución. Sin embargo, como se observa en la Figura 7, un exceso de galantamina (barra oscura; ordenada izquierda) no puede mejorar la proporción ingrediente activo/lípido, la cual en este ensayo se mantiene constante en alrededor de 200-300 nmoles de galantamina por µmol de lípido (línea clara entre los símbolos triangulares; ordenada derecha) . Por lo tanto, la cantidad de carga efectiva en una carga externa activa mediante un gradiente de pH parece depender en primer lugar del gradiente y menos de la concentración de ingrediente activo dispuesta.

Variante IV: Después de evaluar los resultados anteriores, se estableció un procedimiento de producción de una etapa. Los lípidos (DPPC: colesterol = 55:45% en moles) se disolvieron en etanol y la solución se inyectó en una solución de galantamina-HBr/ácido cítrico (pH 3.5-4.5), después de lo cual inmediatamente después de la formación espontánea de vesículas se agregó una solución amortiguadora de carbonato de sodio/ácido cítrico (pH 9.0-9.5) con el fin de diluir y alcalinizar la mezcla de reacción, es decir, de la suspensión de liposomas obtenida. Mediante la generación de este gradiente de pH inmediatamente después de la formación de vesículas, la galantamina no sólo se incorpora en los liposomas en una etapa, sino que también es retenida ahí de manera estable. Dependiendo del pH y del gradiente de pH, la cantidad de galantamina incorporada de forma liposomal de este modo se ubicó en un intervalo de cuando menos 100 nmoles de galantamina por µmol de lípido, de preferencia en un intervalo de cuando menos 150-400, por ejemplo, a un pH de 3.5 a menudo en el intervalo de 250 a 350 (Figuras 8-11). La estabilidad de este producto se mantuvo totalmente durante un período de observación de 6 semanas (véase la Figura 8) . Ejemplo 2: Producción y comparación de preparados de galantamina en forma de liposomas o microemulsiones con composición de lípido variable En este ejemplo se utilizaron como lípidos dipalmitoil-fosfatidinil-colina sintética (DPPC, Genzyme, Suiza) , dimiristoilfosfatidinilcolina (DMPC, Genzyme, Suiza) y colesterol (Solvay, Países Bajos) . La galantamina (Sanochemia AG, Austria) se utilizó como sal HBr para los estudios de inclusión liposomal . Como solución amortiguadora se empleó ácido cítrico/carbonato de sodio. Como segunda posibilidad de la carga activa se aplicó el método de gradiente de sulfato de amonio. Como fases acuosas para la producción de vesículas se utilizó una solución de sulfato de amonio y una solución de glucosa. En lo anterior nuevamente se aplicó la técnica de corriente cruzada. Después de retirar la galantamina no incorporada por filtración en gel, se determinaron por CLAR en fase invertida tanto los contenidos de ingrediente activo como los contenidos de lípidos. El tamaño y la distribución de los liposomas se determinaron nuevamente mediante espectroscopia de correlación de protones (PCS) . Además de los liposomas se elaboraron también preparados en forma de microemulsiones mediante el mezclado intenso con calentamiento escalonado con varios ciclos de calentamiento (calentamiento hasta 80 °C) . Como fase oleosa se empleó miristato de isopropilo (IPM) . Como emulsionante y coemulsionante se utilizaron Tween y Span 20. Diseño de liposomas y estabilidad: La producción de los liposomas, la carga y el análisis se llevaron a cabo como en el Ejemplo 1. Se continuaron las pruebas de estabilidad de muestras de liposomas con una proporción de lípido molar DPPC: colesterol de 55:45. Los resultados se muestran en las Figuras 9A y 9B. La Figura 9A muestra datos de estabilidad de la primera muestra de liposoma cargada con éxito con galantamina conforme al método activo (procedimiento de tres etapas) . Los liposomas de produjeron en presencia de 0.3 moles de ácido cítrico (pH 3.5-4.5) . Después de la formación de vesículas se agregó galantamina y simultáneamente se incrementó el pH de la solución fuera de los liposomas a 7.5. El gradiente de pH generado de este modo entre el interior y el exterior de los liposomas produjo la incorporación de galantamina en los mismos, en función de la concentración de iones de H+ dentro de los liposomas. La Figura 9B presenta los datos de estabilidad de muestras de liposomas de composición similar, realizándose, sin embargo, la formación de vesículas y la carga de galantamina utilizando la técnica de corriente- cruzada en un procedimiento de una etapa. Los datos muestran claramente que el gradiente de pH y, con ello, el contenido de galantamina incorporada de manera liposomal se mantuvo- constante por un período de más de medio año . Para determinar la mejor formulación de liposoma en cuanto a la flexibilidad de membrana y las propiedades de penetración de la piel vinculadas a lo anterior, se prepararon y probaron diversas suspensiones de liposomas con distinta composición de lípido. En lo anterior se utilizaron en primer lugar fosfolípidos eventualmente en combinación con colesterol . Sin embargo se encuentra en el marco de la invención el reemplazar o complementar los fosfolípidos con otros lipidos, por ejemplo, con glicolípidos, cerebrósidos, sulfátidos o galactósidos . Los ejemplos típicos de los lípidos que se pueden utilizar son fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosf tidilglicerol, cardiolipina, esfingomelina, plasmalogenos, gliceroglicolípidos, ceramida, glicoesfingolípidos, glicoesfingolípidos neutrales. Una posibilidad para mejorar la fluidez de las membranas relevante para las aplicaciones transdermales consiste en reducir las transición de fases de la membrana liposomal de doble capa, la cual es determinada principalmente por la longitud de las cadenas de acilo de los fosfolípidos, la cantidad de colesterol y la saturación de los fosfolípidos. Por esta razón, el DPPC, un fosfolípido con una longitud de cadena de acilo de 16 átomos de carbono, se reemplazó por DMPC (longitud de cadena de 14 átomos de carbono) , el cual reduce la temperatura de fusión TM de aproximadamente 45°C a 31°C.

La Figura 10 muestra los índices de inclusión de estas suspensiones de liposomas producidas mediante gradientes de pH de 3.5-7.5 y de 4.0-7.5. Después de lograr índices de inclusión satisfactorios (comparables a aquéllos logrados utilizando DPPC) , se tomaron muestras y se estudiaron en cuanto a su estabilidad (Figura 10) . Una segunda posibilidad para reducir la rigidez de la membrana e incrementar la fluidez consiste en reducir la porción de colesterol en la membrana. Partiendo de una proporción DPPC: colesterol de 55:45% en moles (como se describe en la literatura especializada para la carga de liposomas) , la cantidad de colesterol se redujo sucesivamente a 38 y 30%, referido al contenido total de lípido. En la Figura 11 se puede observar una ligera reducción de la carga de galantamina en comparación con los datos anteriores con grandes contenidos de colesterol. Sin embargo, estos liposomas mostraron mejores propiedades de penetración de la piel, como se describirá aún más adelante. La Figura 11 también muestra que los liposomas cargados se mantienen estables en el ensayo de largo plazo y no pierden galantamina. Contrario a los conocimientos de trabajos anteriores, también se pudieron producir liposomas libres de colesterol y cargar con éxito con ingrediente activo, de modo que de conformidad con la invención el contenido de colesterol se ubica en un intervalo de 0-50% en moles referido al contenido total de lípido. Una tercera posibilidad de hacer más flexibles las membranas liposomales consiste en reemplazar los lípidos de DPPC o DMPC totalmente saturados por fosfatidilcolina de huevo de gallina (E-PC) , una mezcla de lípidos natural con fosfolípidos insaturados . Además de los problemas de estabilidad al utilizar estos lípidos naturales, se necesitaba producirlos bajo atmósfera de nitrógeno. A pesar de ello, estas vesículas no produjeron buenos resultados en cuanto al tamaño y la homogeneidad de las mismas, ni una mejora en las propiedades de penetración de la piel, como se describe en los Ejemplos 3-10. Además de la técnica de ácido cítrico/carbonato de sodio para generar un gradiente de pH, también se utiliza a menudo el método de gradiente de sulfato de amonio. Con este método se forman liposomas en presencia de un amortiguador de sulfato de amonio (125 mmoles) . Después de la formación de vesículas, la solución de sulfato de amonio se reemplaza fuera de los liposomas mediante diafiltración por una solución de glucosa al 5%, con lo cual se pueden cargar pequeñas moléculas anfífilas en los liposomas y ahí se protonizan, mientras que en contraparte de los liposomas se escapa NH3. Este proceso constituye como es sabido el procedimiento más suave en comparación con el procedimiento de ácido cítrico/carbonato de sodio. Aun así, estos ensayos no produjeron resultados satisfactorios, en cualquier caso utilizando galantamina como ingrediente activo para la carga de los liposomas . Los datos en la Figura 12 muestran que falló la inclusión de galantamina, ya que en el retentato y en el filtrato se pudieron encontrar las mismas cantidades de ingrediente activo. Por esta razón, para la inclusión de galantamina en liposomas se debe dar preferencia al método de ácido cítrico/carbonato de sodio para la carga activa externa, estando, sin embargo, dentro del marco de la presente invención utilizar también sistemas ácido/base alternativos, conocidos por el experto en la materia, funcionalmente equivalentes para la generación del gradiente de pH deseado. Así, el ácido cítrico se podría reemplazar con otro ácido adecuado, farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un ácido mineral tal como ácido fosfórico, o, de preferencia, por un ácido orgánico, en particular del grupo de los ácidos orgánicos comestibles, tales como ácido málico, ácido fumárico, ácido tartárico, eventualmente también ácido ascórbico. De igual manera, el carbonato de sodio también podría reemplazarse por otro carbonato o bicarbonato alcalino o alcalinotérreo. Por "funcionalmente equivalentes" se debe entender en este contexto la capacidad de poder generar un gradiente de pH más allá de la membrana de capa doble de lípido de los liposomas y no destruir con ello la integridad de la membrana, de modo que el ingrediente activo incorporado, en particular protonizado, permanece de forma estable (en el sentido de los criterios de estabilidad aquí revelados) en los liposomas. Producción y prueba de estabilidad de un gel de liposoma de galantamina: Para utilizar una composición de galantamina liposomal como agente terapéutico de uso tópico, los liposomas se mezclan de preferencia en un hidrogel que se aplica más fácilmente sobre la piel que una suspensión pura. Sin embargo se encuentra dentro del marco de la invención producir también otras formulaciones galénicas para los ' liposomas de galantamina y aplicar tópicamente, en particular formulaciones en forma de soluciones, lociones, emulsiones, tinturas, esprays, ungüentos, cremas o eventualmente también en forma de tejidos textiles impregnados o materiales de vendaje. El experto en la materia está familiarizado con otras posibilidades, al igual que con vehículos y aditivos necesarios y farmacéuticamente compatibles para la producción de diversas formulaciones galénicas. . ' En experimentos tempranos se acreditó, por ejemplo, carbopol 981NF, un hidrogel que se puede utilizar en concentraciones muy reducidas . Está aprobado para su uso farmacéutico, es relativamente económico y está disponible en grandes cantidades . Los siguientes geles de liposoma se produjeron para los estudios de penetración con la celad de difusión de Franz : DPPC: colesterol = 55:45/pH 3.5 DPPC: colesterol = 62:38/pH 3.5 DPPC: colesterol = 70:30/pH 3.5 DMPC: colesterol = 55:45/pH 3.5 E-PC: colesterol = 63:38/pH 3.5 E-PC: colesterol = 70:30/pH 3.5 Con este fin, las suspensiones de vesículas se concentraron por ultrafiltración y a continuación se mezclaron bajo agitación con una base de gel estéril elaborada previamente. En este- método, las concentraciones de galantamina liposomal pueden variar ya sea mediante la ultrafiltración o mediante la concentración inicial de la base de gel que con la suspensión de vesículas se diluye a una concentración de carbopol de 0.5%. Por estándar se examinó una eventual pérdida de ingrediente activo que podría provenir de daños en la membrana durante el proceso de producción galénico y/o del almacenamiento a largo plazo. Para este fin, el gel se diluyó con amortiguador y se filtró. En el caso de daños en la membrana, en el filtrato se detectarían grandes cantidades de galantamina liberada. Como se observa en las Figuras 13A y 13B, ni durante la formulación galénica ni durante el subsiguiente almacenamiento por 19 semanas a 4°C se liberó una porción significativa de ingrediente activo. Más bien, el ingrediente activo permanece en los liposomas incluso después de la formulación galénica con hidrogel de carbopol y muestra un perfil de penetración que se mantiene igual en la prueba de piel, lo cual demuestra que tanto los liposomas como el gradiente de pH se mantuvieron intactos en la matriz de gel. Para una comparación en cuanto a las características de penetración de la piel, también la galantamina libre se mezcló con hidrogel y se examinó de la misma manera. Los resultados se presentan en los Ejemplos 3 a 10. Conceptos alternativos: En los últimos años, además de los liposomas también las microemulsiones han atraído cada vez más la atención para aplicaciones tópicas de determinados ingredientes activos . Las microemulsiones son dispersiones de dos componentes no miscibles entre sí, estabilizados mediante un tercer componente anfotérico. Sin embargo, debido a la presencia de sustancias tensoactivas tales como emulsionantes y co-emulsionantes, las microemulsiones pueden dañar la piel de forma similar que los parches transdermales . Conforme a estudios anteriores, se produjeron varias microemulsiones (Tabla 1) con galantamina como ingrediente activo y se sometieron a subsiguientes pruebas de penetración con la celda de difusión de Franz (resultados, véanse los Ejemplos 3 a 10) .

Tabla 1 : Microemulsiones 1E Lecitina ME A/AC 1E AC/A 10 ml de lPM 7.2 ml de IPM 5:5 g de H2O 1.9 g de SPC 0.2 g de Col 2.5 g de IPM 135 µl de H2O 0.5 g de H2O 2 g de Tween/Span20 10 mg de Gal 2 g de Tween/Span20 11 mg de Gal-HBr 10 mg de Gal 5 mg de Gal ME = microemulsión; A/A.C = agua en aceite; AC/A = aceite en agua En todos los ensayos aquí descritos se observó que únicamente una reducción del contenido de colesterol en la membrana de liposoma produce una mejora de las propiedades de penetración transdermal . Las suspensiones de liposomas y los preparados de gel liposomales ya son estables desde hace más de medio año y no muestran modificaciones en las propiedades del producto. Ejemplos 3-10: Prueba de penetración de la piel de diversos preparados de galantamina a base de lípidos Celda de difusión de Franz : La celda de difusión proviene de PermGear, EUA. El equipamiento incluyó tres celdas de difusión, cada una con una camisa doble llena de agua montada sobre una consola de agitación y unida al control de temperatura con un baño de agua. Las celdas mismas tienen una capacidad de respectivamente 8 ml, un sujetador de piel con una superficie de 0.78 cm2 y una cámara de descarga con 2 ml de capacidad. Prueba de integridad de piel : Para las pruebas en la celda de difusión de Franz se utilizó piel de cerdo. Con el fin de garantizar una superficie de piel intacta, cada pieza de piel se inspeccionó antes y después del experimento. Después de afianzar la piel en el sujetador de piel de la celda de difusión, se aplicaron 2 ml de amortiguador sobre la piel y se templó a 32 °C ± 1. Después de 30 minutos se midió la conductibilidad eléctrica, una medida de la resistencia y la calidad de la piel . El valor medido depende del origen de la piel, su espesor, el sistema de amortiguadores utilizados y el equipo empleado para la medición. Con base en varios experimentos básicos, se estableció un valor límite para la conductibilidad eléctrica de la piel intacta _< 1 mS/cm2 antes de la aplicación de una muestra. Las muestras de piel que no satisfacían este requisitos no eran aprobadas para los experimentos de penetración. Amortiguador de penetración: Después de preparar los liposomas de conformidad con la invención en amortiguador de ácido cítrico 0.3 M, y ajusfarlos a pH 7.5 con solución de carbonato de sodio 1 M, se utilizó el mismo amortiguador también para todos los ensayos de penetración. Tratamiento de las muestras después del ensayo de penetración: Después de cada experimento terminado se retiró el exceso de muestra de galantamina lavando la superficie con amortiguador. Posteriormente se volvió a medir la conductibilidad eléctrica y se retiró la muestra de piel del sujetador. Para separar la epidermis (piel superior) de la dermis (cuero) , la muestra de piel se colocó sobre una placa de calentamiento eléctrica y se calentó 30 segundos a 60 °C. Después de este tratamiento térmico, la epidermis se puede levantar simplemente mediante pinzas. Inmediatamente después, la epidermis y la dermis se dispusieron por separado en tubos de plástico y se congelaron a -20 °C. Para la extracción de galantamina, a la muestra congelada se agregaron 300 µl de amortiguador en presencia de nitrógeno líquido y, a continuación, la muestra congelada se pulverizó en un crio-molino. De inmediato el polvo se pasó a un tubo de centrifugación y se centrifugó a 4°C después de lo cual el sobrenadante claro se transfirió a un tubo limpio y se volvió a congelar a -20 °C hasta el inicio del análisis. Cuantificación del sobrenadante de galantamina: Para determinar pequeñas cantidades de galantamina se estableció un método CLAR en fase invertida modificado, más sensible y rápido: CLAR: Agilent 1100 Columna : Thermo Hypersil Keystone 150 x 4.6 mm, 5 µm, 190A Gradiente : Gradiente lineal Solvente A: H20/0.1%TFA Solvente B: ACN/0.1%TFA Detección: DAD, 230 nm Intervalo de cuantificación: 30-1000 ng/ml Volumen de inyección: 100 µl Material de ensayo: Se examinaron varias muestras con distintas formulaciones de galantamina. Se realizaron modificaciones en el volumen de descarga y en el diseño de penetración y se resumen en los resultados . Material : Suspensiones de galantamina liposomales : C16/3.5/(55/45) C14/3.5/(55/45) Geles de galantamina liposomales : C16/3.5/(55/45) C16/3.5/ (62/38) C16/3.5/(70/30) C14/3.5/(55/45) E-PC/3.5/(62/38) E-PC/3.5/(70/30) Geles de galantamina libres : 2-20 mg/g de gel Microemulsiones de galantamína ME de lecitina (1 mg/ml) ME agua/aceite (a/ac) (1 mg/ml) ME aceite/agua (ac/a) (1.6 mg/ml) Las diversas formulaciones de galantamina liposomales se elaboraron con la ayuda de la técnica de inyección de corriente cruzada. El material se ensayó tanto en suspensión como en una matriz de gel de carbopol (981NF) . Se obtuvieron variaciones en la composición de los liposomas utilizando diversos lípidos y distintos contenidos de colesterol (véanse los Ejemplos 1 y 2) . Los siguientes estudios de penetración se realizaron con diversos volúmenes de muestras, alimentación de muestras sencilla o múltiple, tomándose muestras a intervalos para la determinación de galantamina. Los resultados mostrados en las Figuras 14 a 21 tienen fundamento en cada caso en un experimento de penetración triple. Los diagramas muestran los resultados en ng de galantamina absoluta por muestra analizada. Los resultados se dividen en valores determinados del líquido del receptor REZ (= líquido que penetró por la piel acumulado en el recipiente recolector) y aquéllos determinados de la epidermis (EP) o dermis (DER) . Ejemplo 3 : En el Ejemplo 3 se comparan los resultados de distintos liposomas DPPC (C16) con diversos contenidos de colesterol con aquéllos de los liposomas DMPC (C16) y liposomas E-PC. Se aplicó una vez un volumen de muestra de 50 µl y se dejó penetrar por un lapso de 4 horas. Todos los preparados ensayados presentaron cantidades comparables de galantamina incorporada y estaban suspendidos en carbopol 981NF al 0.5%. La formulación más efectiva en este ensayo fue la muestra con la composición C16/70/30 (longitud de cadena del acilo/% en moles de fosfolípido/% en moles de colesterol) . En este gel, la concentración de colesterol en los liposomas fue de 30% en moles. Los otros dos preparados tenían porciones de colesterol considerablemente mayores (38 y 45% en moles) y, por lo tanto, también eran considerablemente más rígidos . Los datos determinados con este ensayo confirman la teoría de que los liposomas más fluidos, es decir, las membranas menos rígidas, penetran más eficientemente (Figura 14) . En la Figura 14 significan: 1 = C16/55/45; 2 = C16/62/38; 3 = C16/70/30; 4 = C14/55/45; 5 = E-PC/62/38: 6 = E-PC/70/30.

Ej emplo 4 : En el Ejemplo 4 se examinaron las propiedades de penetración de las muestras de gel después de la aplicación reiterada en la piel . Se compararon dos geles distintos con diversa composición de lípido y el mismo contenido de colesterol. Las muestras se aplicaron tres veces 50 µl, a saber, a una distancia de 4 horas. El material excesivo se retiró en cada caso antes de la aplicación de la siguiente muestra . Como se observa en el diagrama (Figura 15) , al final se pudo lograr un incremento de la concentración de galantamina, sin embargo la penetración en la epidermis al aplicar tres veces el material parece estar de alguna forma impedida o frenada. Posiblemente se trate de un tipo de saturación producida por la pequeña área de superficie de la pieza de piel tensada en combinación con las elevadas dosis de aplicación. Para ambas muestras se obtuvieron resultados comparables, de modo que no se pudo detectar evidentemente una influencia de la composición del lípido (Figura 15) . En la Figura 15 significan: 1 = C16/55/45/50µl; 2 = C16/55/45/l00µl ; 3 = C16/55/45/150µl; 4 = C14/55/45/50µl; 5 = C14/55/45/l00µl : 6 = C14/55/45/l50µl . Ej emplo 5 : En el Ejemplo 5 se compararon entre sí geles con liposomas C16 con elevados y reducidos contenidos de colesterol después de una aplicación única. Los volúmenes de muestra de 150 µl y 50 µl se dejaron penetrar durante 4 y 10 horas respectivamente . Las mayores concentraciones de galantamina se volvieron a encontrar al utilizar' liposomas con reducido contenido de colesterol . También en este caso parecen ventajosas las dosificaciones pequeñas. Después de 4 y 10 horas se encontraron en la epidermis altas cantidades de galantamina cuando se utilizaron 50 µl . Estos resultados confirman los valores alcanzados en los Ejemplos 3 y 4, es decir, la administración de liposomas con bajos contenidos de colesterol con la simultánea aplicación de cantidades reducidas, puede ser una estrategia favorable en la aplicación tópica de los preparados de conformidad con la invención en el uso profiláctico o terapéutico (Figura 16) . En lo anterior, en la Figura 16 significan: (longitud de cadena/fosfolípido/colesterol/cantidad de muestra/duración de la penetración) 1 = C16/55/45/l50µl/4h; 2 = C16/70/30/l50µl/4h; 3 C16/55/45/50µl/4h; 4 = C16/70/30/50µl/4h; 5 C16/55/45/l50µl/10h; 6 = C16/70/30/l50µl/l0h; 7 C16/55/45/l50µl/l0h; 8 = C16/70/30/50µl/l0h; Ejemplo 6: En el Ejemplo 6 se estudió la influencia de la concentración del gel en la relación con tres distintas concentraciones de galantamina libre suspendida en el gel. 50 µl de cada formulación se aplicaron una vez y se realizó el experimento de penetración por 4 y 10 horas respectivamente (Figura 17) . Las primeras tres barras en la Figura 17 representan los resultados con carbopol 98INF al 1% después de 4 horas, las siguientes tres, aquéllos con carbopol 981NF al 0.5% después de 10 horas. Los resultados después de- 4 horas muestran que la galantamina libre se difunde con relativa rapidez en el tejido de la piel. Sin embargo, como se puede observar en los resultados de 10 horas, el ingrediente libre también se encontró en concentración elevada en el líquido receptor, de modo que únicamente es de esperarse un efecto de depósito ligero (Figura 17) . Ej emplo 7 : En el Ejemplo 7 se probaron distintas estrategias de aplicación. Por la literatura especializada se conoce que las microemulsiones pueden ser herramientas útiles como sistemas portadores para la administración de pequeñas moléculas anfífilas. Para revisar este concepto se prepararon diversas microemulsiones (lecitina; agua en aceite; aceite en agua) con respectivamente 1 mg de galantamina por ml (véanse los Ejemplos 1 y 2) . Se aplicaron volúmenes de prueba de 50 µl en cada caso una vez y la penetración se realizó por un lapso de 4 horas. Como se observa en el diagrama (Figura 18), las cantidades absolutas de galantamina en la piel fueron menores que utilizando el hidrogel con liposomas. Asimismo, el ingrediente activo se distribuyó uniformemente en la dermis (cuero) y en el líquido receptor, lo cual permite suponer que tuvo lugar una penetración rápida con un almacenamiento en el mejor de los casos marginal en el tejido de la piel (Figura 18) . Estos conocimientos coinciden con aquellos otros autores e indican un mecanismo de penetración similar que utilizando parches de galantamina transdermales . Ej emplo 8 : En el Ejemplo 8 se compararon los resultados con galantamina libre en hidrogel y microemulsiones con aquéllos de la composición de liposomas preferida (fosfolípidos C16 con reducida porción de colesterol) . En todos los ensayos se estudiaron concentraciones de galantamina comparables bajo condiciones similares . Como se observa en el diagrama (Figura 19) , al utilizar la formulación de hidrogel con galantamina libre se encontraron en la piel cantidades considerables de galantamina. También se lograron valores aceptables con la formulación de liposomas y, en cambio, valores menos buenos con las microemulsiones. Sin embargo, como ya se ilustró en ejemplos anteriores, el objetivo de una nueva formulación tópica de ingrediente activo no es en primer lugar una rápida penetración en la piel, sino más bien la capacidad de conformar en la piel un depósito de ingrediente activo a partir del cual se pueda liberar éste con retardo. Un depósito como el anterior podría, por un lado, reducir la frecuencia de la aplicación, y por el otro, producir una emisión uniforme y controlada del ingrediente activo, lo cual incrementaría el efecto terapéutico. Lo anterior se logra cuando el ingrediente activo (como en el caso de las formulaciones liposomales de conformidad con la invención) se almacena en las capas de piel superiores y no en las zonas más profundas . En la Figura 19 significan: 1 = liposomas (C16/70/30) ; 2 = 1.8 mg de galantamina libre en hidrogel; 3 = 1.8 mg libres en microemulsión de lecitina; 4 = 1.8 mg libres en microemulsión agua/aceite; y 5 = 1.8 mg libres en microemulsión aceite/agua Ejemplo 9: En el Ejemplo 9 se compararon entre sí las formulaciones liposomales en suspensión y en hidrogel . La administración de un exceso de 1 ml de suspensión liposomal por un lapso de cuando menos 24 horas produjo únicamente una reducida eficacia de penetración (Figura 20) . Por lo tanto, parece confirmarse que una matriz de gel adecuada no sólo estabiliza los liposomas y hace más agradable y cómoda la aplicación, sino que también acerca más los liposomas a la piel y de este modo incrementa el efecto de penetración. En la Figura 20 significan: (longitud de cadena / fosfolípido / colesterol / cantidad de muestra / duración de la penetración / tipo) 1 = C16/55/45/lml/24h/suspensión; 2 = C14/55/45/lml/24h/ suspensión; 3 = C16/55/45/100µl/8h/gel; 4 = C14/55/45/l00µl/ 8h/gel . Ejemplo 10: En general, la prueba in vitro mediante la celda de difusión de Franz parece un método útil para estudios de penetración con diversas formulaciones liposomales a pesar de observarse determinados límites de aplicación del método, en especial al utilizar formulaciones liposomales de gel. Partiendo de experiencias anteriores con distintos geles de liposoma in vivo, también para la prueba de penetración in vitro aquí descrita era de esperarse que cada gel pudiera penetrar en su totalidad y sin exceso restante en la superficie de la piel. Sin embargo, no se logró administrar con el mismo éxito el gel en los experimentos con la celda de difusión de Franz. En todos los ensayos quedó un exceso considerable en el material de muestra en la superficie de la piel. Presumiblemente, esta desventaja afectó la eficiencia de penetración. Por lo tanto, es de esperar que in vivo penetren en la piel cantidades mayores de galantamina liposomal . Aun así, incluso en los experimentos in vitro aquí descritos, con las diversas formulaciones de liposomas se transportaron, ya convertidos, hasta 1.8 x 1016 moléculas de ingrediente activo por 0.75 cm2 de superficie de piel en la epidermis . Para revisar si eventualmente la toma de piel con el Dermaton o el pretratamiento de la misma pudiera ser responsable de los problemas de aplicación observados, se estudiaron diversas muestras de piel (Figura 21) . Sin embargo, con base en los resultados no se pudo determinar una influencia clara. Por lo tanto, es de suponer que la piel misma no influyó negativamente de forma considerable en los resultados obtenidos . En lo anterior, en la Figura 21 significan: 1 = piel sin tratar; liposomas: 70/30 (fosfolípido/colesterol) ; 2 = piel limpiada con etanol; liposomas: 70/30; 3 = piel tratada con gasa engrasada; liposomas: 55/45; 4 = piel limpiada con etanol y tratada con gasa engrasada; liposomas: 55/45. En cualquier caso se puede decir en resumen que las formulaciones de galantamina liposomales en gel hidrofílico constituyen una forma de administración ventajosa cuando el lugar de tratamiento se encuentra en el tejido dermal (cuero) , incluso cuando el ingrediente activo se aplique sobre la piel únicamente dos veces al día . Mediante el uso de conformidad con la invención, suave, no invasivo y no irritante para la piel, del ingrediente activo incorporado de manera liposomal, se puede lograr un considerable efecto de depósito en la epidermis y una liberación del ingrediente activo lenta y uniforme en el tejido dermal que se encuentra debajo .

Abreviaturas ACN Acetonitrilo DAD Detector por arreglo de diodos DER Dermis (cuero) DMPC Dimiristoilfosfatidilcolina DPPC Dipalmitoilfosfatidilcolina E-PC Fosfatidilcolina natural de huevos E-PG Fosfatidilglicerina natural de huevos EP Epidermis (piel superior) IPM Miristato de isopropilo NGF Nerve Growth Factor PBS Phosphate Buffered Saline REZ Recipiente de receptor (recipiente recolector) rp-HPLC reversed phase High Performance Liquid Chromatography TFA Ácido trifluoracético

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica a base de un ingrediente activo incorporado en liposomas para la aplicación tópica transdermal, caracterizada porque los liposomas presentan en su interior un medio ácido acuoso y contienen ahí cuando menos un inhibidor de colinesterasa, de preferencia del grupo integrado por donepezil, rivastigmina, galantamina, fisostigmina, heptilfisostigmina, feneserina, tolserina, cimserina, tiatolserina, tiacimserina, neostigmina, huperzina, tacrina, metrifonato y diclorovos, o un enantiómero o derivado de cuando menos uno de estos compuestos .

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el pH del medio acuoso dentro de los liposomas se ubica en un intervalo de 2.5-5.5, en particular en un intervalo de 3.5-4.5.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el medio acuoso dentro de los liposomas contiene un ácido orgánico, en particular ácido cítrico.

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque fuera de los liposomas se tiene un medio con pH neutral o alcalino, de preferencia con un pH de 7 a 8 , en particular con un pH de 7.

5. 5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque los liposomas son unilamelares y presentan una membrana de capa doble de lípido.

6. La composición de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque los liposomas contienen fosfolípidos con una longitud de cadena de acilo de cuando menos 14 átomos de carbono, de preferencia de cuando menos 16 átomos de carbono.

7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque los liposomas contienen colesterol en una cantidad de 0-50% en moles, de preferencia de 30-45% en moles de los lípidos totales .

8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque los liposomas presentan un tamaño promedio en el intervalo de 150 a 500 nm.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque los liposomas contienen el ingrediente activo en una concentración de cuando menos 100, en particular de 150-400 nmoles por µmol de lípido .

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque se presenta en forma de una suspensión, loción, emulsión, tintura, o espray, gel, crema o ungüento, de preferencia en forma estéril.

11. Un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica a base de un ingrediente activo incorporado en liposomas, caracterizado porque mediante la inyección de una fase de lípido etanólica en una fase acida acuosa se generan espontáneamente liposomas con un medio ácido acuoso en su interior, después de lo cual se neutraliza o alcaliniza la fase acuosa, de modo que entre el interior y el exterior de los liposomas se genera un gradiente de pH y en donde el ingrediente activo ya sea: a) se dispone en la fase acida acuosa y se incorpora en los liposomas en el transcurso de la generación espontánea de liposomas, o bien b) se agrega a la fase acuosa sólo después de la formación de vesículas y migra a los liposomas a lo largo del gradiente de pH.

12. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la neutralización o alcalinización se realiza directamente después de la formación de liposomas .

13. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la fase acuosa presenta antes de la neutralización o alcalinización un pH de 2.5-5.5, de preferencia de 3.5-4.5 y después un pH de 7-8, de preferencia de 7.5.

14. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la fase acida acuosa contiene un ácido orgánico, en particular ácido cítrico, y la neutralización o alcalinización se lleva a cabo por dilución de la fase acuosa con un amortiguador alcalino, en especial carbonato de sodio .

15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la fase de lípido contiene fosfolípidos con una longitud de cadena de acilo de cuando menos 14 átomos de carbono, de preferencia de cuando menos 16 átomos de carbono.

16. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la fase de lípido contiene colesterol en una cantidad de 0-50% en moles, de preferencia de 30-45% en moles de los lípidos totales .

17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque como ingrediente activo se dispone en la fase acuosa cuando menos un inhibidor de colinesterasa, de preferencia del grupo integrado por donepezil, rivastigmina, galantamina, fisostigmina, heptilfisostigmina, feneserina, tolserina, cimserina, tiatolserina, tiacimserina, neostigmina, huperzina, tacrina, metrifonato y diclorovos, o un enantiómero o derivado de cuando menos uno de estos compuestos, o se agrega a la fase acuosa después de la formación de liposomas .

18. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque la composición farmacéutica con los liposomas cargados con ingrediente activo se elabora en forma de una suspensión, loción, emulsión, tintura, o espray, gel, crema o ungüento, de preferencia en forma estéril .

19. El uso de una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como medicamento para la aplicación tópica sobre la piel .

20. El uso de una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la producción de un medicamento con efecto de depósito en la piel, para la profilaxis y/o la terapia del dolor neuropático dermal o de la pérdida por neuropatía de la función sensorial dermal .

21. El uso de cuando menos un inhibidor de colinesterasa, de preferencia del grupo integrado por donepezil, rivastigmina, galantamina, fisostigmina, heptilfisostigmina, feneserina, tolserina, cimserina, tiatolserina, tiacimserina, neostigmina, huperzina, tacrina, metrifonato y diclorovos, o un enantiómero o derivado de cuando menos uno de estos compuestos, para la producción de una composición farmacéutica para la aplicación tópica con efecto de depósito en la piel, para la profilaxis y/o la terapia del dolor neuropático dermal o de la pérdida por neuropatía de la función sensorial dermal .

22. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para reducir o evitar efectos secundarios sistémicos no deseados.