WO2005064016A1

WO2005064016A1 - 微生物の多重検出方法

Info

Publication number: WO2005064016A1
Application number: PCT/JP2004/019340
Authority: WO
Inventors: Naoko Horikoshi; Susumu Kawasaki; Yukio Okada; Kazuko Takeshita; Takashi Sameshima; Shinichi Kawamoto; Kenji Isshiki
Original assignee: Prima Meat Packers, Ltd.; National Food Research Institute
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2005-07-14
Also published as: EP1707638A4; US20080014578A1; JP4621919B2; EP1707638B1; JPWO2005064016A1; US8298758B2; EP1707638A1

Abstract

　食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法を提供するものである。　（Ａ）少なくとも、アクロモペプチダーゼ、リゾチーム等の溶菌酵素及び／又はエンテロリシン等の溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤で処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程を順次行う。また、上記（Ａ）の検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が１８～４８時間培養後に１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下、例えば培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養する工程を設けることが好ましい。

Description

明細書

微生物の多重検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、食品に存在する病原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法に関する。

背景技術

[0002] 従来、マルチプレックス PCRを利用する微生物の多重検出方法は、よく知られている。例えば、野菜'果実を対象として病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリァモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文献 1参照）、食品中の病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文献 2参照）、牛乳を対象として病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネス、カンピロバクタ一属菌の各菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文献 3参照）、食品中のサルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを多重検出する方法 (例えば、非特許文献 4参照）、食品中の病原性大腸菌 0157等の大腸菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文献 5参照）、牛乳を対象として病原性大腸菌 0157 、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文献 6参照）などが報告されている。また、マルチプレックス PCR用のプライマ一として、大腸菌の検出用プライマー (例えば、特許文献 1参照）、病原性大腸菌 Ol 57の O抗原検出用プライマー（例えば、特許文献 2参照)も知られている。

[0003] 他方、微生物の DNAを抽出する方法として、結核菌等のマイコバクテリゥムに溶菌酵素ァクロモぺプチダーゼ等を用いる方法 (例えば、特許文献 3参照）、グラム陰性、陽性菌に溶菌酵素ァクロモぺプチダーゼ等を用いる方法 (例えば、特許文献 4参照）、レジオネラ菌にプロテアーゼ Kゃァクロモぺプチダーゼ等を用いる方法 (例えば、特許文献 5参照)、大腸菌などにタンパク変性剤、還元剤、界面活性剤、キレート剤等を用いる方法 (例えば、特許文献 6参照)などが知られてヽる。 [0004] 特許文献 1 :特開 2001— 95576号公報

特許文献 2：特開平 11-332599号公報

特許文献 3：特開平 6—165676号公報

特許文献 4：特表平 9— 500793号公報

特許文献 5 :特開平 5— 317033号公報

特許文献 6：特開平 6— 289016号公報

非特許文献 1 : Japanese Journal of Food Microbiology, Vol.19, No2, 47-55, 2002 非特許文献 2 : Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 21, 92-98, 1998 非特許文献 3 : Milchwissenschaft, 55 (9), 500-503, 2000

非特許文献 4 Journal of Food Protection, Vol.64, Nol l, 1744-1750, 2001 非特許文献 5 : Molecular and Cellular Probes, 13, 291-302, 1999

非特許文献 6 : Food Microbiology, 20, 345-350, 2003

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 1種類の微生物を PCR法によって検出する方法は既に確立されている力複数の微生物を PCR法で同時に検出する方法は、食品分野で検討されつつあるものの、未だ十分に信頼できる方法は確立されて、な、と、うのが現状である。本発明の課題は、食品に存在する病原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法を提供することにある。すなわち、複数の対合プライマ一を組み合わせて行う PCR法として知られて!/、るマルチプレックス PCRを用いて、病原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を簡便に、かつ高い感度で再現性よく検出することができる微生物の多重検出方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0006] (培養）

危害の高い病原菌は、食品中で「陰性」（25g中に含まれていないこと)であることが定められており、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。食品 25g中 1CFUレベルの微量に汚染した微生物を検出するためには、増菌培養が不可欠である。増菌培養する場合、通常、対象の病原菌ごとに個別に選択性のある培地を使用して培養する力同時に数種の微生物を検出するために、増菌についても、 1種の培地で複数の微生物を同時に増殖させるための検討を行った。なるべく短時間（例えば、 24時間以内）で検出できる培養条件を設定するが好ましぐそのためには、特に培地の選択が重要となる。同時に増菌することは、対象微生物同士が同科あるいは同属菌種、または発育特性が似ていれば比較的容易であるが、異種で発育特性が異なる微生物の場合は難しい。例えば、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを検出対象とした場合、これら病原菌 3菌種中で、サルモネラ、 0157に比べて、低温発育性であるリステリアは増殖が遅いという問題があった。

[0007] そこで、他の細菌が混在した中でも、特にリステリアが十分に増殖できるように、リステリアにとって好ましい栄養源を持つ培地で、炭水化物が少なぐ緩衝能が高い培地について検討したところ、培地 No. 17 (トリプトース 10g、肉エキス 5g、酵母エキス 5g 、塩化ナトリウム 5g、グルコース 0. 5g、リン酸-ナトリウム 7g、リン酸一カリウム 15g/ 1L中）は、トリプトソーャブイヨンや BHI (ブレインハートインフュージョン）、 BPW( Buffered peptone Water)よりも 3種混在中でリステリアの増殖が最も良ぐサルモネラと 0157もリステリアより増殖が早力つた。このことから、 3種同時に検出するためには培地 No. 17が良いと考えられた。

[0008] (DNA)

PCR反応を行う際、 DNAの抽出を行うが、 DNAの抽出では溶菌操作が必要となる。グラム陽性細菌の溶解は、より厚くより高密度なペプチドダリカン層が主要細菌細胞壁成分であるため、グラム陰性細菌よりもかなり困難である。今回の技術ではサルモネラ、 0157などのグラム陰性菌に加え、リステリアというグラム陽性菌も同時に検出する、という点で困難であった。また、食品からの抽出という点では、食品残渣は多様性なものであり、溶菌法を 1種類に特定するのは困難である。特に畜肉などに代表される検体では高タンパク、高脂肪、かつ個体差があるので、溶菌が一定の効率で行われないという、 DNA抽出の上での困難性が存在した。さらに検討したところ、トリプトソーャブイヨン、ミューラーヒントンブロスなど、培養する培地の違いによって、リゾチームだけでは細胞が壊れない（ = DNAが抽出できない）リステリアがあった。培養条件は、たとえ同じ培地を使用しても食品の種類が異なったり、損傷程度が異なることで変わってくると考えられる。また、場合によっては、より回復の良い培地を用いる必要性があるため、どのような場合でも細胞が壊れる抽出方法が必要であった。

[0009] 一般的な DNA抽出法として、ボイル法やアルカリ— SDS法が知られている力ボイル法ではリステリアが高感度に抽出できないことを確認した。 SDSは、 DNA抽出にぉ、て使用しやす、界面活性剤として知られて、るが、強力な PCR阻害剤であるため、抽出に用いた後には、完全に除去しなければならない。未習熟な実験者においても熟練者と同様の効果と結果が得られるようにするためには、 SDSのように低濃度の混入でも反応に影響を与える物質は好ましくなぐ SDSは熟練者との抽出効率差が現われる原因になりうる危害要因と判断した。また、フエノール、クロ口ホルムは、危険で人体に有害な有機溶媒であり、この処理を行うことによって DNAの精製度は良くなるが、抽出効率に技術的な個人差が現われることが容易に想像でき、一定の感度が保障できない。また、特別な廃液処理が必要となることから、食品製造現場での検査法には適合しない抽出法であるということもできる。そこで、未習熟'熟練者においても操作が容易であり、かつ DNAの抽出効率 (言い換えれば検出感度）が一定であることが期待でき、さらに、食品製造現場で実行できる簡便さ'安全さを備えており、畜肉に代表される高タンパクな食品からも DNA抽出が可能な方法を開発する必要性があった。

[0010] 培養液を 5 μ mのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除き、その後溶菌酵素液 (ァクロモぺプチターゼとリゾチームの混合液)を混合し、 37°Cで 1時間処理後、界面活性剤 [ツイーン 20 (Tween20) ]とタンパク質変性剤（グァ二ジンイソチオシァネート）の混合液をカ卩えて完全に菌体を溶解できることがわ力つた。また、ァクロモぺプチダーゼの代わりにェンテロリシンのような溶菌活性を持つバクテリオシンを利用しても完全に菌体を溶解できることがわ力つた。遠心分離により不溶画分を取り除き、ァルコール沈殿を行ヽ DNAを抽出した。処理の順番はァクロモぺプチターゼがリゾチームより先、もしくは一緒に行い、あるいはェンテロリシンがリゾチームより先、もしくは一緒に行い、その後ツイーン 20処理後、グァ-ジンイソチオシァネート処理、もしくはツイーン 20とグァ-ジンイソチオシァネート処理を一緒に行うことが極めて好ましいことがわかった。ツイーン 20は粘性が高ぐ単独で加えることが難しいため混合添加することが望ま U、こともわ力つた。

[0011] また、フエノール、クロ口ホルム処理を行わなくても、アルコール沈殿や DN A抽出液添カ卩量 (PCR反応液 50 1に対し 2 1)によって、 PCRで問題なく検出できる程度に可溶ィ匕したタンパク質を除くことができた。ツイーン 20は PCR反応液にも使われるもので、 SDSに比べ阻害が少なぐ未習熟な実験者でも扱いが容易であると考えられた。また、もちろん、この抽出法はおのおの単独菌種での抽出においても可能である。さらに、（1)ァクロモぺプチターゼ単独、（2)リゾチーム単独、（3)ェンテロリシン単独、（4)ァクロモぺプチターゼ処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、（5)リゾチーム処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、（6)ェンテロリシン処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、（7)プロティナ一ゼ、 (8)プロティナーゼ K処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、 (9)グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、（10)グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理 +加熱処理、の各方法についても試みた力これらいずれの方法も、ァクロモぺプチターゼとリゾチームで併用処理し、あるいはェンテロリシンとリゾチームで併用処理し、その後ツイーン 20とグァ-ジンイソチオシァネートで処理する前記方法の方が、リステリアの高感度の抽出にぉ、て優れて!/、た。

[0012] (PCR反応）

数種の菌を同時に検出する方法としてマルチプレックス PCRを採用した。複数の対合プライマーを組み合わせて行う PCR法であるマルチプレックス PCR法には、互!ヽにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがなぐ融解温度の近い対合プライマーを選定して用いた。プライマーの選択や混合割合により、反応のしゃすさ、検出限界に差が出てくることもわ力つた。マルチプレックス PCRを行う場合には、その後の判定に用いる電気泳動像に 3菌種のバンドが同じような濃さで検出するようにプライマーの混合割合を調整する必要がある。 3菌種が同じ DNA濃度（20pg)のとき、 3種菌のバンドが同様の濃さで検出できるよう、調整した。例えば、プライマーとして、配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを使用した場合、 6種のプライマーの混合割合は、サルモネラ用プライマー各 120nM 、リステリア用プライマー各 100nM、 0157用プライマー各 80nM力配列番号 5— 1 0で示される塩基配列カゝらなる DNAを使用した場合、サルモネラ用プライマー各 60 nM、リステリア用プライマー各 60nM、 0157用プライマー各 240nMが最も理想的な配合量であった。さらに低濃度の混合割合である、サルモネラ用プライマー各 30η Μ、リステリア用プライマー各 25ηΜ、 0157用プライマー各 20ηΜ (配列番号 1一 6 で示される塩基配列力もなる DNA使用時）、あるいは、サルモネラ用プライマー各 1 5ηΜ、リステリア用プライマー各 15ηΜ、 0157用プライマー各 60ηΜ (配列番号 5— 10で示される塩基配列からなる DNA使用時）においても検討した力電気泳動による目視での検出が可能ではあるが困難であったことから、上記濃度が好ましいことがわかった。

また、 PCR反応では、最終産生量が 10— ⁸Μ程度まで標的遺伝子を増幅できることが知られて、る。 PCR反応では通常 1菌種にっき 200ηΜ程度のプライマーをカ卩えて行う力多重検出の場合、各菌種についてこのプライマー量をカ卩えることは明らかに過剰であることがわかった。特にマルチプレックス反応の場合、その過剰なプライマ一による生成産物 (これは非標的産物を含む）により優位な反応のみが結果として得られる可能性が高い。このため、 PCR反応においてプライマー量を制限することで最終産物量を制限することとマルチプレックス反応との関係を考慮した。もちろん、 PCR 反応にはプライマーダイマーなどを代表とする非増幅産物もプライマーを消費するため、下限の濃度は存在するが、検出器の感度最低限のプライマー濃度を設定することにより、より複数のマルチプレックス反応を成功させる可能性が期待できることもわかった。言い換えれば、プライマーの下限の濃度を検出器の感度に合わせることで、より複数の検出が期待できる。電気泳動や蛍光プローブ法、キヤビラリ一電気泳動法などによる検出器の限界を考慮した上で、 50ηΜ程度以上での反応を行わざるを得ず、 3種類の病原菌の検出を確認したが、検出器の感度上昇によってこの濃度を低く設定することができ、より多くの標的を一度に検出できると考えられる。より高感度な増幅産物検出法が実現した際には上記の考えを踏まえた上で最終産物量を制御することにより、より多数のマルチプレックス PCRによる多重同時検出を実現できることもわかった。

[0014] すなわち本発明は、（1)食品中の 2種以上の異なる特性の微生物を、 1本の PCR 反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行ヽ、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、

(A)少なくとも、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物の DNAを抽出する工程と、

(B)検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックス PCRを行うェ程と

を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法や、（2)検出対象微生物の DNAを抽出する工程の前に、 1CFUZ lOOgの微生物が 24時間培養後に 10³CFUZml以上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の微生物の多重検出方法や、（3) 2種以上の異なる特性の微生物が、リステリアモノサイトゲネスを含むことを特徴とする上記（1)又は（2)記載の微生物の多重検出方法や、（4)特異的なプライマーカ、配列番号 5及び 6に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする上記（3)記載の微生物の多重検出方法や、 (5) 2種以上の異なる特性の微生物が、病原性大腸菌 0157を含むことを特徴とする上記（1)又は（2)記載の微生物の多重検出方法や、（6)特異的なプライマーが、配列番号 1及び 2、又は配列番号 7及び 8に示される塩基配列力なるプライマーであることを特徴とする請求項 5記載の微生物の多重検出方法や、（7) 2種以上の異なる特性の微生物力サルモネラ属菌を含むことを特徴とする上記（1)又は（2)記載の微生物の多重検出方法や、（8)特異的なプライマーが、配列番号 3及び 4、又は配列番号 9及び 10に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする上記（7)記載の微生物の多重検出方法に関する。

[0015] また本発明は、（9)培養後の pHが 5. 1以上となる培養条件下で培養することを特徴とする上記（1)一（8)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（10)ダルコース濃度が 0. 15%以下の培地、及び Z又は、リン酸緩衝液の濃度が 50mM以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする上記（1)一 (9 )の、ずれか記載の微生物の多重検出方法や、（11)溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿により DNAを析出して抽出することを特徴とする上記（1)一（10)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（ 12)溶菌酵素力ァクロモぺプチダーゼ及び Z又はリゾチームであることを特徴とする上記（1)一（11)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（13)溶菌活性を持つバクテリオシン力ェンテロリシンであることを特徴とする上記（1)一（12)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（14)界面活性剤が、ソルビタンモノラウラートのエチレンォキシド縮合物であることを特徴とする上記（ 1)一（ 13)のヽずれか記載の微生物の多重検出方法や、（15)タンパク質変性剤力グァ-ジンイソチオシァネートであることを特徴とする上記（1)一（14)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（16)プライマーとして、配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを合計 750nM以下の濃度で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする上記（ 1)一（ 15)の、ずれか記載の微生物の多重検出方法や、（ 17)プライマーとして、配列番号 5— 10で示される塩基配列力もなる DNAを合計 750nM以下の濃度で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする上記（1)一（15)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（18)食品が、食肉又は食肉加工品であることを特徴とする上記（1)一（17)のいずれか記載の微生物の多重検出方法に関する発明の効果

[0016] 本発明によると、食品に存在する病原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等又はそれ以上の高い感度で簡便に検出することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明の微生物の多重検出方法としては、食肉、食肉加工品、牛乳、野菜等の食品中の 2種以上の異なる特性の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、（A)少なくとも、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つノクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物の DNAを抽出する工程と、（B)検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックス PCRを行う工程とを含む方法であれば特に制限されないが、上記 (A)の検出対象微生物の DNAを抽出する工程の前に、 lCFUZlOOgの微生物が 24時間培養後に 10³CFU/ml以上となる培養条件下で培養する工程を含むことが好ましい。また、検出対象の微生物としては、食品の汚染微生物であればどのようなものでもよく、リステリアモノサイトゲネス、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、カンピロバクタ一属菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、エルシニア属菌、大腸菌群、セレウス菌、コレラ菌、赤痢菌、ボツリヌス菌などを具体的に例示することができる。また、公定法としては、「食品衛生検査指針」（1990年社団法人日本食品衛生協会 )に説明されている方法をいい、具体例が実施例 9において説明されている。

[0018] 本発明の微生物の多重検出方法によると、食品 25g中 1CFUレベルの微量に汚染した微生物を検出することが可能となるが、本発明の微生物の多重検出方法においては、食品汚染微生物の培養工程が極めて重要である。食品汚染微生物の増菌培養における培養条件としては、 lCFUZlOOgの微生物が 48時間培養後、好ましくは 30時間培養後、特に好ましくは 24時間培養後、中でも 18時間培養後に 10³CFU Zml以上となる培養条件を挙げることができるが、さらに緩衝能を有する培地を用いて培養後の pHが 5. 1以上となる培養条件下で培養することや、グルコース濃度が 0 . 15%以下の培地、及び Z又は、リン酸緩衝液の濃度が 50mM以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養するのが好ましヽ。リン酸緩衝液以外の緩衝液としては、クェン酸緩衝液、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、トリス緩衝液、 MOPS緩衝液、 MES緩衝液を挙げることができる。

[0019] 本発明の微生物の多重検出方法においては、培養増殖させた食品汚染微生物からの DNA抽出工程が必須とされる。カゝかる DNA抽出工程としては、少なくとも、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物の DNAを抽出する工程であれば特に制限されないが、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿により DNAを析出して抽出する方法を好適に例示することができる。上記溶菌酵素としては、ァクロモぺプチダーゼ、リゾチーム、プロテア一ゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、 13— 1 , 3—ダルカナーゼ、ザィモリアーゼ、セルラーゼ等を挙げることができ、溶菌活性を持つバクテリオシンとしては、ェンテロリシン、ヘルべティシンを挙げることができる。これらは 1種又は 2種以上用いることができるが、中でもァクロモぺプチダーゼ、リゾチーム、ェンテロリシンやこれらの組合せ、例えば、ァクロモぺプチダーゼとリゾチームとの併用、ェンテロリシンとリゾチームとの併用を好適に例示することができる。上記界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤を挙げることができ、中でも非イオン界面活性剤であるソルビタンモノラウラートのエチレンォキシド縮合物、より具体的には、ッィーン 20を好適に挙げることができる。上記タンパク質変性剤としては、グァ-ジンィソチオシァネート、尿素、塩酸グァ-ジン、トリクロ口酢酸、 SDS、 Triton X— 100、デォキシコール酸等を挙げることができ、これらは 1種又は 2種以上用いることができるが、中でも溶菌効果や取扱、易さの点でグァニジンイソチオシァネートが好ましヽ。溶菌物力の DNAの抽出 ·析出は、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿を行うなど、公知の方法により行うことができる。

本発明の微生物の多重検出方法においては、前記抽出した DNAと、検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックス PCRを行う工程が必須とされる。使用するプライマーとしては、検出対象微生物特異的なプライマーであって、互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがなく、融解温度の近い対合プライマーを選択することが好ましい。また、その後の判定に用いられる電気泳動像に出現するバンドが同じような濃さで検出しうるようにプライマーの混合割合を調整することが好ましい。例えば、病原性大腸菌 0157 に特異的なプライマーセットとしては、配列番号 1及び 2、配列番号 7及び 8、配列番号 11及び 12、配列番号 13及び 14などに示される塩基配列からなる DNA力サルモネラ属菌に特異的なプライマーセットとしては、配列番号 3及び 4、配列番号 9及び 10、配列番号 15及び 16などに示される塩基配列からなる DNA力リステリアモノサイトゲネスに特異的なプライマーセットとしては、配列番号 5及び 6、配列番号 17及び 18、配列番号 19及び 20などに示される塩基配列からなる DNAを挙げることができ、これらを組み合わせて用いることができる力中でも配列番号 1一 6又は配列番号 5 一 10で示される塩基配列力もなる DNAの組み合わせが最も好ましぐこの場合、合計 750nM以下の濃度でプライマーを混合することが好ましぐまた配列番号 1一 6を用いた場合、 6種のプライマーの混合割合はサルモネラ用プライマー各 120nM、リステリア用プライマー各 100nM、 0157用プライマー各 80nM力配列番号 5— 10 を用いた場合、サルモネラ用プライマー各 60nM、リステリア用プライマー各 60nM、 0157用プライマー各 240nMが最も好まし!/、。

[0021] PCR後の検出法としては、電気泳動法、蛍光プローブ法、キヤビラリ一電気泳動法、定量 PCR法などにより行うこともできる。特に、定量 PCRの場合は、プライマーとして配列番号 5— 10で示される塩基配列からなる DNAを用い、蛍光プローブに配列番号 21— 23で示される塩基配列からなる DNAを用いることにより検出することができる。

[0022] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

実施例 1

[0023] (既存培地での同時培養）

病原性大腸菌 0157は Escherichia coli 0157 : H7 ATCC43894、サルモネラ属菌は Salmonella enteritidis IF03313、リステリアモノサイトゲネスは Listeria monocytogenes ATCC49594を用いた。また、肉由来菌には、シユードモナス（ Pseudomonas fragi)、ントロノ、クタ¹ ~~ (Citrobacter freundn)、フクトノ、チノレス、

Lactobacillus viriaescens)、ロイコノストック (Leuconostoc mesenteroidesノの 4株を用いた。試験培地にはトリブトソーャブイヨン (TSB ;日水製薬社製）、及び、 Buffered Peptone Water (BPW;ペプトン 10g、塩ィ匕ナ卜リウム 5g、リン酸一水素ナトリウム 3. 5g 、リン酸-水素カリウム 1. 5gZlL)の 2つの培地を用いた。

[0024] 病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各 1CFUZ10 Oml、肉由来菌を各 10⁴CFUZl00mlになるように試験培地に接種した。 35°Cで培養し、経時的に一般生菌数、 0157数、サルモネラ数、リステリア数を計測した。一般生菌数は標準寒天培地（日水製薬社製)を用い、 35°Cで 48時間培養後の総コ口- 一数、 0157数はデソキシコレート寒天培地（日水製薬社製)を用い、 35°Cで 24時間培養後の大腸菌様のコロニー数、サルモネラ数は MLCB寒天培地（日水製薬社製）を用い、 35°Cで 24時間培養後のサルモネラ様のコロニー数、リステリア数は PA LCAM寒天培地（Merck社製）を用い、 35°Cで 48時間培養後のリステリア様のコ口- 一数をそれぞれ測定した。結果を図 1に示す。その結果、いずれの培地でも特にリステリアモノサイトゲネスの増殖が弱力つた。培養液の pHを測定したところ、 pHの低下が認められた。

実施例 2

[0025] (培地の緩衝能および糖濃度の影響）

実施例 1でリステリアモノサイトゲネスの増殖が弱力つたのは培養後の培地の pHが低下したことが原因と考えられたため、各菌の増殖に及ぼす培地の緩衝能および糖濃度の影響を調査した。基本培地（トリプトース 10g、肉エキス 5g、酵母エキス 5g、塩化ナトリウム 5gZlL中）に、リン酸-ナトリウムおよびリン酸一カリウムをカ卩えてリン酸濃度を 15mMから 200mMまで調整し（pH6. 3)、グルコースの濃度を 0%力も 0. 2 5%まで変化させて加えて、試験培地を作製した。実施例 1で使用した、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各 lCFUZl00ml、肉由来菌を各 10⁴CFUZmlになるように各試験培地に接種した。 35°Cで培養し、 18、 24、 30、 48時間後の一般生菌数、 0157数、サルモネラ数、リステリア数、 pHを計測した。結果を表 1に示す。

[0026] その結果、グルコース濃度 0. 15%以下の培地、またはリン酸濃度 50mM以上の培地、または培養後の pHを 5. 1以上に保持する培地を用いることによって病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスとも 18時間以上培養することで 10³CFUZml以上 (PCRでの検出に必要な菌数）に増殖した。以降の試験には表 1の No. 17の培地（トリプトース 10g、肉エキス 5g、酵母エキス 5g、塩化ナトリウム 5 g、グルコース 0. _5g、リン酸-ナトリウム 7g、リン酸一カリウム 15g/lL中）を選定した。培地成分については、検出の目的とする細菌の存在環境や損傷程度に応じて、トリプトース、肉エキス、酵母エキス以外の窒素源、グノレコース以外の炭素源、リン酸以外の緩衝能を持つ物質も有効であり、また、増殖を促進する物質として無機塩類ゃピルビン酸もしくはピルビン酸塩、ツイーンなどの界面活性剤を添加した方がより好ましかった。

[0027] [表 1]

実施例 3

[0028] (DNA抽出方法 1)

病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を No. 17 培地 10mlに接種し、 35°Cで 18時間培養した。各培養液をそれぞれ lmlチューブに取り、 15, OOOr. p. mで 5分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その菌体回収物に溶菌酵素液 {20m_g//mlのァクロモぺプチダーゼ 10 μ 1と 20mgZmlのリゾチーム 10 1と TEバッファー [ImM EDTAを含む lOmMトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン-塩酸緩衝液、 ρΗ8] 180 /ζ 1の混合液 }をカ卩え、 37°Cで 1時間処理後、溶菌剤（ッィーン 20を 1一 2%添加した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液）を 300 μ 1加えて完全に菌体を溶解した。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、溶菌が十分に行われていることが確認できた。この溶液を 15, OOOr. p. mで 5分間遠心分離し、上澄み 400 μ 1を別のチューブに移し、溶液中の DNAをイソプロパノールで沈殿させた後、遠心分離して目的の DNAを得た。また、ァクロモぺプチダーゼの代わりに、ェンテ口リシンを用いても、同様に溶菌が十分に行われていることが確認できた。

実施例 4

(DNA抽出方法 2)

同様に、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を No. 17培地 10mlに接種し、 35°Cで 18時間培養した。各培養液をそれぞれ lml チューブに取り、 15, 000r. p. mで 5分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その菌体回収物に溶菌剤（ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液）を 500 1カ卩え、回収物を溶解した。 100°Cで 10分間加熱し、 5分間氷冷した。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、病原性大腸菌 0157やサルモネラ属菌は溶菌できていた力実施例 3の DNA抽出方法に比べるとリステリアモノサイトゲネスの溶菌の程度が少し劣っていた。また、リステリアモノサイトゲネスの溶菌を、 1)菌体回収物に 20mgZmlのァクロモぺプチダーゼ 10 μ 1と ΤΕバッファー 190 μ 1の混合液を加え、 37°Cで 1時間処理した液、 2)菌体回収物に 20mgZmlのリゾチーム 10 1 と TEバッファー 190 1の混合液をカ卩え、 37°Cで 1時間処理した液、 3)菌体回収物にェンテロリシン 10 1と TEバッファー 190 1の混合液を加え、 37°Cで 1時間処理した液、 4)上記 1)液に、溶菌剤（ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液)を 300 1加え混合した液、 5)上記 2)液に、溶菌剤（ツイーン 20を 1一 2 %添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液）を 300 μ 1加え混合した液、 6)上記 3)液に、溶菌剤（ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Μグァ-ジンイソチオシァネート溶液）を 300 1カ卩ぇ混合した液、 7)菌体回収物に 20mgZmlのプロティナーゼ K1 1と TEバッファー 200 1の混合液を加え、 37°Cで 1時間処理した液、 8)上記 7)液に、溶菌剤（ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液）を 300 1加え混合した液、 9)菌体回収物に溶菌剤（ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4M グァ-ジンイソチオシァネート溶液） 500 μ 1をカロえ混合した液をそれぞれ用いて行!ヽ、光学顕微鏡で観察を行ったが、いずれもリステリアモノサイトゲネスの溶菌の程度が実施例 3の DNA抽出方法に比べると少し劣っていた。

実施例 5

[0030] (PCR反応の条件設定）

実施例 3で得た DNA抽出液を用いて PCR反応を行った。 PCRは、次のプライマーから、検出対象微生物毎に特異的なプライマーを 1セットずつ選択して用いた。配列番号 1 : GGC GGA TTA GAC TTC GGC TA

配列番号 2 : CGT TTT GGC ACT ATT TGC CC

配列番号 3： GGG AGT CCA GGT TGA CGG AAA ATT T

配列番号 4 : GTC ACG GAA GAA GAG AAA TCC GTA CG

配列番号 5 : CGG AGG TTC CGC AAA AGA TG

配列番号 6 : CCT CCA GAG TGA TCG ATG TT

配列番号 7 :ATC ATT GAC GAT TGT AGC ACC

配列番号 8 : ACA TGA GGA GCA TTA ACT TCG

配列番号 9 : GGG TCG TTC TAC ATT GAC AG

配列番号 10 : TTC CCT TTC CAG TAC GCT TC

配列番号 11 : GTA TTT GGA GAC ATG GGA GC

配列番号 12 : ACT AAT GAC ACG ATT CGT TCC

配列番号 13 : CGG ACA GTA GTT ATA CCA C

配列番号 14 : CTG CTG TCA CAG TGA CAA A

配列番号 15 : AGC TTT GGT CGT AAA ATA AGG

配列番号 16 : GAT GCC CAA AGC AGA GAG AT

配列番号 17 : CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT

配列番号 18 : GCA CTT GAA TTG CTG TTA TTG

配列番号 19 : ACC AAT GGG ATC CAC AAG A

配列番号 20 : GAG CTG AGC TAT GTG CGA T

[0031] PCR反応液は、 10 X Buffer5 μ 1、 dNTP溶液 4 μ 1、 UNGO. 5 1、 AmpliTaq G old 0. 25 μ 1、 MgCl lO ^ K 、ずれも、アプライドバイオシステムズジャパン社製）、プライマー、 DNA抽出液 2 /z lに滅菌水をカ卩えて合計 50 /z lとした。反応条件は 50°C で 2分保持後、 95°Cで 10分反応させた後、 95°C ' 20秒、 60°C ' 30秒、 72°C ' 30秒を 40回繰り返し、 72°Cで 7分保持後、 4°Cで保管した。 PCR産物は 2. 5%ァガロースゲル電気泳動で確認した。配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを組み合わせる場合、プライマーの混合割合は病原性大腸菌 0157用プライマー (配列番号 1、 2)各 80nM、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号 3、 4)各 120nM、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号 5、 6)各 ΙΟΟηΜが最も理想的な配合量であった。例えば、さらに低濃度の混合割合である、病原性大腸菌 0157用プライマー各 20nM、サルモネラ属菌用プライマー各 30nM、リステリアモノサイトゲネス用プライマー各 25nMにおいても検討した力ァガロース電気泳動による目視での検出は可能ではあるが多少困難であった。また、配列番号 5— 10で示される塩基配列カゝらなる DNAを用いた場合、プライマー混合割合は病原性大腸菌 0157用プライマ一（配列番号 7、 8)各 240nM、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号 9、 10)各 60 nM、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号 5、 6)各 60nMが最も理想的な配合量であった。その他の病原性大腸菌 0157用プライマー（配列番号 11、 12もしくは配列番号 13、 14)、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号 15、 16)、リステリァモノサイトゲネス用プライマー（配列番号 17、 18又は配列番号 19、 20)についてもそれぞれ混合割合を調整することにより利用できることがわ力つた。

[0032] また、配列番号 5— 10の組み合わせでは、それぞれの内部配列に特異的な配列番号 21— 23を蛍光色素で標識したプローブを用いることによって、定量 PCRもしくはハイブリダィゼーシヨン等による検出手法において検出できることがわ力つた。配列番号 21 : CGG ATG ATT TGT GGC ACG AGA AA

配列番号 22 :TCT GGC ATT ATC GAT CAG TAC CAG CC

配列番号 23 : AGT TCA AAT CAT CGA CGG CAA CCT CGG A

実施例 6

[0033] (反応特異性の確認）

表 2に示した病原性大腸菌 0157を 4株、サルモネラ属菌 4株、リステリアモノサイトゲネス 10株、病原性大腸菌 0157以外の Escherichia coli4株、リステリアモノサイトゲネス以外のリステリア属 4株を用いて特異性の確認を行った。各菌株をトリブトソーャブイヨン（日水製薬社製)で 35°C18時間培養し、方法 1として、実施例 3記載の DNA 抽出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプチダーゼとリゾチームを用、た抽出法を行!、、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 1一 6の組み合わせを用いた方法を行つた。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にヱンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 5— 10の組み合わせを用いた方法を行った。 PCR反応の結果を 2. 5%ァガロースゲル電気泳動で確認したところ、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスでは電気泳動像の所定の位置にバンドが検出し、陽性であることが示された。一方、病原性大腸菌 0157以外の Escherichia coli、リステリアモノサイトゲネス以外のリステリア属では、バンドが検出せず、陰性菌であることが示され、特異性に問題がないことを確認した。結果を表 2に示した。

[表 2]

実施例 7 [0035] (肉成分混在系での検出限界の確認）

実施例 1記載の病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを用いた。各菌を前記 No. 17培地 10mlに接種し、 35°Cで 18時間培養を行い、菌株培養液を得た。また、鶏もも挽肉 25gに No. 17培地 225mlをカ卩え、 30秒間ストマッカーで粉砕し、 35°Cで 18時間培養した。この時の培養液の一般生菌数は 3. 1 X 1 0⁸CFUZmlであった。鶏もも挽肉の培養液を 9mlずつ分注し、これに各菌株培養液の 10倍段階希釈液 lmlをそれぞれ添加し、各菌株培養液の各希釈系列の肉試料液を作製した。それぞれの試料液を 5 mのフィルターを通し大きな食品くずを取り除いた後、方法 1として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 1一 6の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にェンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 5— 10の組み合わせを用いた方法を行つた。それぞれ 2. 5%ァガロースゲル電気泳動により確認した結果、肉試料液での病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検出限界は、いずれも 10³CFUZmlであることを確認した。代表して方法 1の結果の電気泳動図を図 2 に示した。

実施例 8

[0036] (接種した食品からの病原菌の検出）

実施例 1記載の病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを用いた。豚挽肉に各菌株が 10²CFU/25g、 10CFUZ25g、 lCFU/25g、 10—

接種した豚挽肉 25gに No. 17培地を 22 5mlカ卩え、ストマッカ一で 30秒粉砕し、 35°Cで 24時間培養した。各培養液を 5 μ m のフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法 1として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 1一 6の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にェンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 5— 10の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、 2. 5%ァガロースゲル電気泳動により確認した。代表して方法 1の結果を図 3に示す。その結果、いずれの菌株も lCFUZ25g存在すればいずれの方法でも検出できることを確認した。病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスなどの危害の高い病原菌は、食品中で「陰性」（25g中に含まれていないこと)であることが定められており、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。本多重検出法は、公定法と同等以上の精度があることが確認された。

実施例 9

[0037] (公定法と多重検出法との比較試験;市販食品からの病原菌の検出）

鶏肉や鶏肝など、 20検体をスーパーから購入し、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検査を多重検出法により行うとともに公定法と比較した。また、公定法は、次の通りに行った。

[0038] 病原性大腸菌 0157については、検体 25gにノボピオシン加 mECブロス（極東製薬工業社製） 225mlを加え、ストマッカ一で 30秒粉砕した後、 42°Cで 18時間培養し、クロモアガー 0157培地（関東ィ匕学社製）およびマッコンキーソルビトール寒天培地 (日水製薬社製）に画線し、 35°Cで 18— 24時間培養した。クロモアガー 0157培地で藤色、マッコンキーソルビトール培地で半透明のピンク色を示したものを病原性大腸菌 0157擬陽性とし、 CLIG寒天培地 (極東製薬工業社製）に画線し、 35°Cで 18 一 24時間培養した。下層が黄色ぐ上層がピンクでかつ紫外放射により発光しないものを病原性大腸菌 0157擬陽性とし、インドール反応を行い、陽性 (赤)のものについて凝集反応を行った。凝集反応は大腸菌 0157検出キット「UNI」（Oxoid社製)を用いて行った。凝集反応で疑わしいコロニーをクロモアガー 0157培地、マッコンキ一ソルビトール寒天培地、 TSI寒天培地（日水製薬社製)、 LIM培地（日水製薬社製 )に画線し、 35°Cで 24時間培養した。クロモアガー 0157培地で藤色、マッコンキーソルビトール寒天培地で半透明のピンク色、 TSI寒天培地で黄色、 LIM培地で無変化のものについて PCR反応により病原性大腸菌 0157であることを確認した。

[0039] サルモネラ属菌については、検体 25gに EEMブイヨン（日水製薬社製） 225mlを加え、ストマッカ一で 30秒粉砕した。 35°Cで 18時間培養し、セレナイトシスチン基礎培地（日水製薬社製） 10mlに lmlカ卩え、 43°Cで 15— 18時間培養した。全体あるいは沈殿が赤色を呈したものにっ、て、 1白金耳を MLCB寒天培地（日水製薬社製）に画線し、 35°Cで 24時間培養後、黒色のコロニーを生じたものをサルモネラ属菌擬陽性とし、確認試験として、 TSI寒天培地、 LIM培地に画線した。 35°C、 24— 48時間培養し、 TSI培地で斜面が赤く高層が黒色で、 LIM培地で無変化のものをサルモネラ属菌陽性とした。

[0040] リステリアモノサイトゲネスについては、検体 25gに UVMリステリア選択増菌ブイョン（Merck社製） 225mlを加え、ストマッカ一で 30秒粉砕した。 30°Cで 48時間培養し、 PALCAMリステリア選択寒天培地 (Merck社製）に 1白金耳画線した。 35°Cで 48 時間培養し、リステリア属陽性と判定されたものについて、馬血液寒天培地（日水製薬社製)、標準寒天培地（日水製薬社製）に画線して、 35°C、 24— 48時間培養した。溶血性が陽性のものについてォキシダーゼ反応、カタラーゼ反応、グラム染色、顕微鏡観察、アビリステリア（日本ピオメリュー社製)を行い、リステリアモノサイトゲネスと同定されたものをリステリアモノサイトゲネス陽性とした。

[0041] 多重検出法については次のように行った。検体 25gに、 No. 17培地を 225ml加え、ストマッカ一で 30秒粉砕し、 35°Cで 24時間培養した。培養液を 5 μ mのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法 1として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 1一 6の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にェンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 5— 1 0の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、 2. 5%ァガロースゲル電気泳動により確認した。結果を表 3に示す。

[0042] その結果、病原菌が検出した検体は、公定法では病原性大腸菌 0157 0検体、サルモネラ属菌 3検体、リステリアモノサイトゲネス 6検体、多重検出法ではいずれの方法でも病原性大腸菌 Ol 57 0検体、サルモネラ属菌 3検体、リステリアモノサイトゲネス 8検体であり、公定法で陽性であった検体はいずれも多重検出法で陽性であった。また、公定法で陰性、多重検出法で陽性であったリステリアモノサイトゲネス 2検体（表 3、検体 No.5、 15)【こつ!/ヽて、 No.17での培養液を PALC AMリステリァ選択寒天培地 (Merck)に画線培養後、形成したコロニーの同定試験を行ったところ、リステリアモノサイトゲネスであることを確認した。このことから、本多重検出法では公定法に比べて同等以上の精度があることを確認した。

[0043] [表 3]

図面の簡単な説明

[0044] [図 1]トリプトソーャブイヨン（TSB)および Buffered Peptone Water (BPW)培地を用いた 35°C培養での病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスおよび一般生菌数の挙動を示す図である。

[図 2]病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を接種した肉試料液中（一般生菌数: 3.1 X 10⁸CFU/ml)での各菌株の多重検出法による検出限界を示す電気泳動像の図である。

[0045] M:分子量マーカー

レーン 1一 7は、病原性大腸菌 0157接種区 (一般生菌数 :3. lX10⁸CFU/ml) を示し、 0157接種量は次の通り。

1:1. lX10⁷CFU/ml、 2:1.1 X 10⁶CFU/ml、 3: 1.1 X 10⁵CFU/ml、 4: 1. 1 X 10⁴CFU/ml、 5:1. IX 10³CFU/ml、 6:1. IX 10²CFU/ml、 7: 11CFU /ml

レーン 8— 14は、サルモネラ属菌接種区（一般生菌数： 3. lX10⁸CFUZml)を示し、サルモネラ接種量は次の通り。

8:5.0X10⁶CFU/ml、 9:5.0X10⁵CFU/ml、 10:5.0X10⁴CFU/ml、 11: 5.0X10³CFU/ml、 12:5.0X10²CFU/mU 13:50CFU/mU 14:5CFU/ ml

レーン 15— 21は、リステリアモノサイトゲネス接種区（一般生菌数： 3.1 X 10⁸CFU Zml)を示し、リステリア接種量は次の通り。

15:1. lX10⁷CFU/ml、 16:1. lX10⁶CFU/ml、 17:1. lX10⁵CFU/ml、 1 8:1. lX10⁴CFU/ml、 19:1. lX10³CFU/ml、 20:1. 1 X 10²CFU/ml、 21 :HCFU/ml

圆 3]病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を接種した豚挽肉を用い、多重検出法により各菌株を検出した結果を示す電気泳動像の図である。

M:分子量マーカー

レーン 1一 4は、リステリアモノサイトゲネス接種区を示し、リステリア接種量は次の通り。

l:16CFU/25g, 2:1.6CFU/25g, 3:0.16CFU/25g, 4:0.02CFU/25 g

レーン 5— 8は、サルモネラ属菌接種区を示し、サルモネラ属菌接種量は次の通り。 5： 110CFU/25g, 6： 1 lCFU/25g, 7:1. lCFU/25g, 8:0. HCFU/25g レーン 9一 12は、病原性大腸菌 0157接種区を示し、 0157接種量は次の通り。 9:850CFU/25g, 10:8.5CFU/25g 、11:8.5CFU/25g 、12:0.85CF U/25g

Claims

請求の範囲

[1] 食品中の 2種以上の異なる特性の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、

を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法。

[2] 検出対象微生物の DNAを抽出する工程の前に、 lCFUZlOOgの微生物が 24時間培養後に 10³CFU/ml以上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の微生物の多重検出方法。

[3] 2種以上の異なる特性の微生物力リステリアモノサイトゲネスを含むことを特徴とする請求項 1又は 2記載の微生物の多重検出方法。

[4] 特異的なプライマーカ、配列番号 5及び 6に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項 3記載の微生物の多重検出方法。

[5] 2種以上の異なる特性の微生物が、病原性大腸菌 0157を含むことを特徴とする請求項 1又は 2記載の微生物の多重検出方法。

[6] 特異的なプライマーカ、配列番号 1及び 2、又は配列番号 7及び 8に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項 5記載の微生物の多重検出方法

[7] 2種以上の異なる特性の微生物が、サルモネラ属菌を含むことを特徴とする請求項 1 又は 2記載の微生物の多重検出方法。

[8] 特異的なプライマーカ、配列番号 3及び 4、又は配列番号 9及び 10に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項 7記載の微生物の多重検出方法。

[9] 培養後の pHが 5. 1以上となる培養条件下で培養することを特徴とする請求項 1一 8 の！、ずれか記載の微生物の多重検出方法。

[10] グルコース濃度が 0. 15%以下の培地、及び Z又は、リン酸緩衝液の濃度が 50mM 以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする請求項 1 一 9のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[11] 溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿により DNAを析出して抽出することを特徴とする請求項 1一 10のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[12] 溶菌酵素が、ァクロモぺプチダーゼ及び Z又はリゾチームであることを特徴とする請求項 1一 11のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[13] 溶菌活性を持つバクテリオシン力ェンテロリシンであることを特徴とする請求項 1一 1

2の、ずれか記載の微生物の多重検出方法。

[14] 界面活性剤力ソルビタンモノラウラートのエチレンォキシド縮合物であることを特徴とする請求項 1一 13のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[15] タンパク質変性剤力グァ-ジンイソチオシァネートであることを特徴とする請求項 1 一 14のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[16] プライマーとして、配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを合計 750nM 以下の濃度で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする請求項 1一

15のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[17] プライマーとして、配列番号 5— 10で示される塩基配列からなる DNAを合計 750η

Μ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする請求項 1 一 15のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[18] 食品が、食肉又は食肉加工品であることを特徴とする請求項 1一 17のいずれか記載の微生物の多重検出方法。