WO2005063968A1 - Ｅｓ細胞培養用基礎培地 - Google Patents

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WO2005063968A1
WO2005063968A1 PCT/JP2004/019818 JP2004019818W WO2005063968A1 WO 2005063968 A1 WO2005063968 A1 WO 2005063968A1 JP 2004019818 W JP2004019818 W JP 2004019818W WO 2005063968 A1 WO2005063968 A1 WO 2005063968A1
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cells
medium
concentration
cell
culture
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PCT/JP2004/019818
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Miho Furue
Tetsuji Okamoto
Makoto Asashima
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Gs Platz Co Ltd
Miho Furue
Tetsuji Okamoto
Makoto Asashima
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components

Definitions

  • the present invention relates to a basal medium for preparing a medium for culturing mammalian ES cells.
  • Embryonic stem (ES) cells are undifferentiated and have the ability to generate all types of differentiated cells in vitro during the development of an organism. It is known that the self-renewal ability and undifferentiation of ES cells can be maintained in the presence of feeder cells or LIF using a culture medium supplemented with fetal bovine serum (Zandstra, PW, et al.). al., Biotechnol Bioen 69, 607-17 (2000)). However, under such culture conditions, which are now widely used, it is difficult to reliably remove feeder cells when analyzing the differentiation of ES cells. Cannot be analyzed. An ES cell line that can be cultured without a single feeder cell is also known. For example, one mouse ES cell line, ES-D3, spontaneously differentiates under culture conditions without a single feeder. Tend to.
  • serum contains vari- able components of activin and fibroblast growth factor and unknown differentiation inducing factors. These components may affect the analysis results when analyzing the cell growth and differentiation of ES cells by adding various substances from the outside.
  • the use of serum has a risk of infection such as viruses, prions, and unknown factors, and carries risks when applied to regenerative medicine.
  • serum-free culturing conditions for ES cells However, when cells are passaged for several generations, they may be separated into nerves, etc., and undifferentiated cells may not be maintained. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a serum-free culture medium that allows long-term cultivation of ES cells while maintaining undivided properties without a feeder cell, and a basic medium for producing such a medium.
  • the purpose is to provide land.
  • the present inventors have found that by using a medium having a specific composition, ES cells can be cultured while maintaining undifferentiation without feeder cells and serum. That is, the present invention provides the following Table I:
  • a basal medium for preparing an ES cell culture medium which has the composition shown in (1).
  • the present invention provides a compound of the following Table II:
  • a basal medium for preparing an ES cell culture medium which has the composition shown in (1).
  • the present invention provides a compound of the following Table III:
  • a basal medium for preparing an ES cell culture medium which has the composition shown in (1).
  • the basal medium of the present invention 2.5 to 4.58 / / Bruno ⁇ [? £ S, and the amount of N a HC_ ⁇ 3 required to adjust the desired [rho Eta further Including.
  • the present invention provides a method for culturing ES cells, which comprises using the medium for culturing ES cells of the present invention.
  • Figure 1 shows the flow of Oct 3Z4 expression in ES-D3 cells cultured in various media.
  • Figure 2 shows the effect of LIF concentration on ES-D3 cell growth.
  • FIG. 3 shows the growth of ES-D3 cells cultured in ESF7 and CEM media. Detailed description of the invention
  • a basal medium for preparing a serum-free synthetic medium for growing undifferentiated mouse ES cells in the absence of feeder cells is provided.
  • the basal medium of the present invention (hereinafter referred to as ESF medium) is prepared by adding each of the components shown in the above table to water at a specified concentration, and further adding 2.5 to 4.5 g / L of HEPES. and after adding the amount of N a HC_ ⁇ 3 required to adjust the desired p H, by sterilization using methods well known in the art, it can be easily manufactured.
  • Basic components such as basic amino acids may be added in the form of a free base or in the form of a salt such as HC1 salt.
  • the basal medium of the present invention contains 6 factors (6F; insulin, transferrin, 2-ME, 2-ethanolamine, sodium selenite, oleic acid complexed with fatty acid-free serum albumin) and LIF (leukemia suppression). )
  • ESF7 medium ES cell culture medium of the present invention
  • these six factors and LIF are commercially available.
  • ESF 7 medium ES cells can be maintained in a type I collagen-coated flask under serum-free conditions.
  • the medium for culturing ES cells of the present invention may be produced by appropriately mixing a commercially available medium.
  • Rukoto be conveniently prepared by prepared by adding pyruvic acid, selenious acid Natoriumu L-histidine HC 1 ⁇ ⁇ 2 ⁇ instead of L-histidine Is preferably used after adding 23.16.5 g ZL in total.
  • ES cells when mouse ES cells are cultured in ESF7 medium according to the present invention, ES cells are expressed by the expression of transcription factor ⁇ ct 3 Z4, stem cell marker SSE A-1, and alkaline phosphatase.
  • transcription factor ⁇ ct 3 Z4 stem cell marker SSE A-1
  • alkaline phosphatase To maintain the phenotype of Undivided.
  • BMP4 bone morphogenetic factor 4
  • activin A also promoted the differentiation of ES cells into fibroblast-like cells and spinous cells. That is, ES cells cultured in the ES F7 medium according to the present invention maintained their ability to divide into specific cells by stimulation of differentiation inducers.
  • the concentration of L-alanine is 1.78 mg / L to 2.67 mg / L, preferably 2.0025 mg / L to 2.4475 mg L, more preferably 2.11375 mg / L to 2.33625 mg / L. .
  • the concentration of L-arginine is 40 mg / L to 60 mg / L, preferably 45 mg / L to 55 mg / L, more preferably 47.5 mg / L to 52.5 mg L.
  • the concentration of L-arginine HC1 is 75.8 mg / L to 113.7 mg / L, preferably 85.275 mg / L to 104.225 mg / L, more preferably 90.0125 mg / L to 99.4875 mg / L.
  • the concentration of L-asparagine H 2 ⁇ is 13.002 mg / L to 19.503 mg / L, preferably 14.62725 mg / L to 17.87775 mg / L, more preferably 15.43988 mg / L to 17.06513 mg / L.
  • L- concentration of Asuparagin acid is 6.66 m g /L ⁇ 9.99 mg / L, preferably from 7.4925 mg / L ⁇ 9.1575 mg / L, more preferably 7.90875 mg / L ⁇ 8.74125 mg / L.
  • the concentration of L-cysteine HC 1 ⁇ H 20 is 7.024 mg / L to 10.536 mg / L, preferably 7.902 mg / L to 9.658 mg / L, more preferably 8.341 mg / L to 9.219 mg / L.
  • the concentration of L-cystine 2 HC1 is 38.058 mg / L to 57.087 mg / L, preferably 42.81525 mg / L to 52.32975 mg / L, more preferably 45.19388 mg / L to 49.95113 mg / L.
  • the concentration of L-glutamic acid is 6.94 mg / L to 10.41 mg / L, preferably 7.8075 mg / L to 9.5425 mg / L, more preferably 8.24125 mg / L to
  • the concentration of L-glutamine is 439.72 mg / L to 659.58 mg / L, preferably 494.685 mg / L to 604.615 mg / L, more preferably 522.1675 mg / L to 577.1325 mg / L.
  • the concentration of glycine should be 15.5 mg / L to 23.25 mg / L, preferably 17.4375 mg / L to 21.3125 mg / L, more preferably 18.40625 mg / L to 20.34375 mg / L.
  • the concentration of L-histidine should be between 3 mg / L and 30 mg / L, preferably
  • L-hydroxyproline is 4 mg / L to 6 mg / L, preferably 4.5 mg / L to 5.5 mg / L, more preferably 4.75 mg / L to 5.25 mg / L.
  • concentration of L-isoleucine is 52.748 mg / L to 79.122 mg / L, preferably 59.3415 mg / L to 72.5285 mg / L, more preferably 62.63825 mg / L to 69.23r75 mg / L.
  • the concentration of L bite isine is 54.58 mg / L to 81.87 mg / L, preferably 61.4025 mg / L to 75.0475 mg / L, more preferably 64.81375 mg / L to 71.63625 mg / L.
  • the concentration of L-lysine HC1 is 73.74 mg / L to 110.61 mg / L, preferably 82.9575 mg / L to -101.3925 mg / L, more preferably 87.56625 mg / L to 96.78375 mg / L.
  • the concentration of L-methionine is 15.896 mg / L to 23.844 mg / L, preferably 17.883 mg / L to 21.857 mg / L, more preferably 18.8765 mg / L to 20.8635 mg / L.
  • the concentration of L-phenylalanine is 30.392 mg / L to 45.588 mg / L, preferably 34.191 mg / L to 41.789 mg / L, more preferably 36.0905 mg / L to 39.8895 mg / L.
  • the concentration of L-proline is 10.9 mg / L to 16.35 mg L, preferably 12.2625 mg / L to 14.9875 mg / L, more preferably 12.94375 mg / L to 14.30625 mg / L.
  • the concentration of L-serine is 24.9 mg / L to 37.35 mg / L, preferably 28.0125 mg / L to 34.2375 mg / L, more preferably 29.56875 mg / L to 32.68125 mg / L.
  • the concentration of L-threonine is 44.42 mg / L to 66.63 mg / L, preferably 49.9725 mg / L to 61.0775 mg / L, more preferably 52.74875 mg / L to 58.30125 mg / L.
  • the concentration of L-tryptophan is 7.808 mg / L to 11.712 mg / L, preferably 8.784 mg / L to 10.736 mg / L, more preferably 9.272 mg / L to: 10.248 mg / L.
  • the concentration of L-tyrosine is 33.888 mg / L to 50.832 mg / L, preferably 38.124 mg / L to 46.596 mg / L, more preferably 40.242 mg / L to 44.478 mg / L.
  • the concentration of L-valine is 43.86 mg / L to 65.79 mg / L, preferably 49.3425 mg / L to 60.3075 mg / L, more preferably 52.08375 mg / L to 57.56625 mg / L.
  • the concentration of glucanthion is 0.2 mg / L to 0.3 mg / L, preferably 0.225 mg / L to 0.275 mg / L, more preferably 0.2375 mg / L to 0.2625 mg / L.
  • the concentration of paraaminobenzoic acid should be between 0.2 mg / L and 0.3 mg / L, preferably between 0.225 mg / L and 0.275 mg / L. Preferably it is 0.2375 mg / L to 0.2625 mg / L.
  • the concentration of pyotin is 0.04148 mg / L to 0.06222 mg / L, preferably 0.046665 mg / L to 0.057035 mg L, more preferably 0.049258 mg / L to 0.054443 mg / L.
  • the concentration of calcium pantothenate is 1.746 mg / L to 2.619 mg / L, preferably 1.96425 mg / L to 2.40075 mg / L, more preferably 2.073375 mg / L to 2.291625 mg / L.
  • the concentration of salicycholine is 4.992 mg / L to 7.488 mg / L, preferably 5.616 mg / L to 6.864 mg / L, more preferably 5.928 mg / L to 6.552 mg / L.
  • the concentration of folate is 2.06 mg / L to 3.09 mg / L, preferably 2.3175 mg / L to 2.8325 mg / L, more preferably 2.44625 mg / L to 2.70375 mg / L.
  • the concentration of inositol is 13.48 mg / L to 20.22 mg / L, preferably 15.165 mg / L to 18.535 mg / L, more preferably 16.0075 mg / L; 17.6925 mg / L.
  • the concentration of nicotinamide is 1.8074 mg / L to 2.7111 mg / L, preferably 2.033325 mg / L to 2.485175 mg / L, more preferably 2.146288 mg / L to 2.372213 mg / L.
  • the concentration of pyridoxal HC1 is 1.6 mg /] to 2.4 mg / L, preferably 1.8 mg / L to 2.2 mg / L, more preferably 1.9 mg / L to 2.1 mg / L.
  • the concentration of pyridoxine HC1 is 0.2124 mg / L to 0.3186 mg / L, preferably 0.23895 mg / L to 0.29205 mg / L, more preferably 0.252225 mg / L to 0.278775 mg / L.
  • the concentration of lipoflavin is from 0.2076 mg / L to 0.3114 mg / L, preferably from 0.23355 mg / L to 0.28545 mg / L, more preferably from 0.246525 mg / L to 0.272475 mg / L.
  • the concentration of thiamine HC1 is 1.868 mg / L to 2.802 mg / L, preferably 2.1015 mg / L
  • the concentration of vitamin B12 is 0.273 mg / L to 0.4095 mg / L, preferably 0.307125 mg / L
  • hypoxanthine It is 0.375375 mg / L, more preferably 0.324188 mg / L to 0.358313 mg / L.
  • concentration of hypoxanthine should be between 0.816 mg / L and 1.224 mg / L, preferably between 0.918 mg / L and
  • the concentration of linoleic acid is 0.0168 mg / L to 0.0252 mg / L, preferably 0.0189 mg / L to 0.0231 mg / L, more preferably 0.01995 mg / L to 0.02205 mg / L.
  • the concentration of lipoic acid (thioctic acid) is 0.042 mg / L to 0.063 mg L, preferably 0.04725 mg / L to 0.05775 mg / L, more preferably 0.049875 mg / L to 0.055125 mg / L.
  • the concentration of prolethesin dihydrochloride is 0.0322 mg / L to 0.0483 mg L, preferably 0.036225 mg / L 0.044275 mg / L, more preferably 0.038238 mg / L to 0.042263 mg / L.
  • the concentration of thymidine is 0.146 mg / L to 0.219 mg / L, preferably 0.16425 mg / L to 0.20075 mg / L, more preferably 0.173375 mg / L to 0.191625 mg / L.
  • the concentration of sodium chloride is 5279.8 mg / L to 7919.7 mg / L, preferably 5939.775 mg / L to 7259.725 mg / L, more preferably 6269.763 mg / L to 6929.738 mg / L.
  • the concentration of potassium salt is 284.72 mg / L to 427.08 mg / L, preferably 320.31 mg / L to 391.49 mg / L, and more preferably 338.105 mg / L to 373.695 mg / L.
  • the concentration of calcium chloride is 86.644 mg / L to 129.966 mg / L, preferably 97.4745 mg / L to 119.1355 mg / L, more preferably 102.8898 mg / L to: 113.7203 mg / L.
  • the concentration of calcium nitrate 4 H 2 0 is, 20 mg / L ⁇ 30 mg / L , preferably 22.5 mg / L ⁇ 27.5 mg / L, more preferably 23.75 mg / L ⁇ 26.25 mg / L.
  • the concentration of magnesium chloride is 11.444 mg / L to 17.166 mg / L, preferably 12.8745 mg / L to: 15.7355 mg / L, more preferably 13.58975 mg / L to: 15.02025 mg / L.
  • the concentration of magnesium sulfate (anhydrous) are, 48.844 mg / L ⁇ 73.266 mg / L , preferably 54.9495 mg / L ⁇ 67.1605 mg / L, more preferably 58.00225 m g /L ⁇ 64.10775 mg / L.
  • the concentration of sodium dihydrogen phosphate is 43.48 mg / L to 65.22 mg / L, preferably 48.915 mg / L to 59.785 mg / L, more preferably 51.6325 mg / L to 57.0675 mg / L .
  • the concentration of disodium monohydrogen phosphate (water-free) should be 188.408 mg / L to 282.612 mg / L, preferably 211.959 mg / L.
  • the concentration of sucrose (anhydrous) is 1860.4 mg / L to 2790.6 mg / L, preferably 2092.95 mg / L to 2558.05 mg / L, and more preferably 2209.225 mg / L to 2441.775 mg / L.
  • the concentration of sodium pyruvate is 0.001 mg / L to 220 mg / L, preferably 50 mg / L to 170 mg / L, more preferably 100 mg / L to 120 mg L.
  • Sodium pyruvate may not be included in the basal medium but may be added later.
  • the concentration of ferric nitrate 9 H 2 0 is, 0.04 mg / L ⁇ 0.06 mg / L, and preferably from 0.045 mg / L ⁇ 0.055 mg / L, more preferably 0.0475 mg / L ⁇ 0.0525 mg / L.
  • the concentration of copper sulfate 5 H 2 0.00 is 0.0005 mg / L to 0.00075 mg / L, preferably 0.000563 mg / L to 0.000688 mg / L, more preferably 0.000594 mg / L to 0.000656 mg / L.
  • the concentration of zinc sulfate 7 H 2 0 is, 0.1728 mg / L ⁇ 0.2592 mg / L , preferably from 0.1944 mg / L ⁇ 0.2376 mg / L, more preferably 0.2052 mg / L ⁇ 0.2268 mg / L.
  • the concentration of sodium selenite is from 0.000692 mg / L to 0.00348 mg / L, preferably from 0.000779 mg / L to 0.00291 mg / L, more preferably from 0.000822 mg / L to 0.00263 mg / L.
  • Sodium selenite may not be included in the basic medium but may be added later.
  • the concentration of phenol red is 5.248 mg / L to 7.872 mg / L, preferably 5.904 mg / L to 7.216 mg L, more preferably 6.232 mg / L to 6.888 mg / L.
  • the concentration of HEPES added to the basal medium of the present invention is 2859.6 mg / L to 4289.4 mg / L, preferably 3217.05 mg / L to 3939.95 mg / L, more preferably 3395.775 mg / L to 3753.225 mg / L.
  • the concentration of N a HC 0 3 is, 1600 mg / L ⁇ 2400 mg / L , the preferred properly 1800 mg / L ⁇ 2200 mg / L, more preferably Ru 1900 mg / L ⁇ 2100 mg / L der.
  • ES cells By using the ES cell culture medium of the present invention, ES cells can be grown while maintaining undifferentiation without using a single feeder cell. Therefore, the effects of various factors on ES cell sorting can be examined with reproducibility. In addition, it becomes easier to establish conditions for dividing ES cells into specific cells and organs, and ES cells can be differentiated in a test tube (or in vitro) along a predetermined route. Can be induced. Therefore, the medium for culturing ES cells of the present invention is useful for studying ES cells for application to regenerative medicine.
  • a basal medium (referred to as ESF medium) having the composition shown in the following table was prepared and sterilized according to a standard method.
  • Component concentration (mg / L) Component concentration (mg / L)
  • ES-D3 (ATCC, USA) was used as the ES cell line. These cells can be cultured without a single feeder cell, in which case it is said that they tend to divide. ES-D 3 cells are initially plated on 0.1% gelatin
  • CEM Complete ES medium
  • CEM Cell & Molecular Tbchnologies, Inc., Phillipburg, NJ
  • the composition of the CEM medium is shown below.
  • wash cells with Dulbecco's phosphate buffer treat cells with 0.001% trypsin ⁇ 0.01% EDTA for 10 to 30 seconds, and disperse cells by pipetting.
  • trypsin with 0.1% trypsin inhibitor dissolved in MCDB 153 solution, collect cells in ESF medium, centrifuge, disperse cells in ESF medium, centrifuge again, ESF 7 medium The cells were dispersed.
  • the collagen-coated flask, the ES- D 3 cells in ESF 7 medium were seeded at a cell density of 5_7 xl 0 3 Zml, were cultured for several days, unclear boundary weak adhesiveness small Al force Rifosufata first active Positive cell groups formed colonies and proliferated.
  • the determination of the undifferentiated phenotype was performed as follows. Fix cells for 5 min with 4.5 mM citrate, 225 mM sodium citrate, 3 mM sodium chloride, 65% methanol and 4% paraformaldehyde to detect cell phosphatase activity. After washing, the cells were visualized using a Fast Red substrate kit (Nichirei Co., Tokyo, Japan) according to the manufacturer's instructions.
  • ES cells were plated in 90 mm plastic plates coated with collagen type I in ESF7, and in RD + 2ME + FBS, and in gelatin-coated plastic plates. C 3x105 cells were seeded in EM. On the sixth day of culture, cells were trypsinized with trypsin ZEDTA in PBS and then fixed with 1% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) for 1 hour.
  • ES-D3 cells in Thailand In a 24-well plate coated with collagen I in ESF6 (ESF + factor 6) and in RD + 6F, and in a 24-well plate coated with gelatin in DMEM + 15% FBS + 2_mercaptoethanol , 5x103 cell wells. LIF was added to each well at 0, 1, 10, 100, 500, and 1000 units Zml. After culturing for 6 days, the cells were counted using a Coulter counter.
  • LIF maintains the self-renewal ability and undifferentiation of ES cells, but does not affect cell proliferation.
  • ESF6 medium filled circles
  • LIF clearly stimulated ES cell proliferation in a concentration-dependent manner.
  • DMEM solid triangles
  • FBS FBS
  • 2-mercaptoethanol LIF had little effect on cell proliferation. That is, by using the chemically synthesized serum-free ESF6 medium of the present invention, it was possible to identify the previously unknown activity of LIF on mouse ES cells.
  • ES-D3 cells were seeded in a 24-well plate coated with type I collagen (Falcon) in ESF 7 and a 24-well plate coated with gelatin in CEM with 1 ⁇ 10 4 cell nowells. Then, cell proliferation was compared (Fig. 3).
  • ES-D3 cells were inoculated into laminin-coated plastic plates in ESF7 and cultured for 2 days. Next, the medium was changed to RD + 5F medium (RD supplemented with 5 factors).
  • RD medium is a basic medium for serum-free synthetic medium commonly used for non-ES cell types.
  • BMP 4 fatty acid free-BSA was supplemented to RD + 5F medium.
  • ES-D3 cells are inoculated on a laminin-coated plastic plate using ESF5 as a medium, and FGF-2 and heparin, or FGF-2 and heparin and NGF, or FGF-2 Heparin and PDGF-AA were added, and after culturing for 1 day, only the insult factor was added, and on the second day of culturing, the medium was replaced with ESF5, and the cells were cultured. The medium was changed every two days.
  • ESF 5 Addition of activin A to ESF 5 induced differentiation of ES-D3 cells into fibroblast-like cells.
  • BMP4 was added to ESF5 supplemented with fatty acid free-BSA (fatty acid free serum albumin)
  • ES cells differentiated into epithelial-like cells.
  • FGF-2 and heparin, or NGF or PDGF-AA were added to ESF5, they differentiated into neuron-like cells.
  • C57ZBL6 JES cells The effect of ESF7 medium on the culture of C57ZBL6 JES cells was examined. Fifteen passaged frozen C57 / BL6 J ES cells (Cell & Molecular Technologies, Inc., Phillipburg, NJ) were purchased and maintained in CME on feeder cells. C57ZBL6 J ES cells were pipetted in PBS alone or in PBS containing type I collagenase and inoculated into collagen-coated flasks in ESF 7 medium (3000 units of LIF / ml) without feeder cells. C57 / BL6J ES cells formed undifferentiated colonies and grew slowly. That is, it was shown that by using the culture medium for ES cell culture of the present invention, ES cells that normally grow on one feeder cell also grow without feeder cells. Industrial applicability
  • ES cells can be cultured for a long period of time in serum-free culture while maintaining undifferentiation without using a single feeder cell, which is useful for inducing ES cell growth and differentiation.

Description

明細書
E S細胞培養用基礎培地 技術分野
本発明は哺乳動物の E S細胞を培養するための培地を調製するための基礎培地 に関する。 背景技術
胚性幹 （E S ) 細胞は未分化性を示し， 生物の発生過程においてインピトロで あらゆるタイプの分ィヒした細胞を発生させる能力を有する。 E S細胞の自己複製 能および未分化性は， ゥシ胎児血清を補充した培養用培地を用いて， フィーダ一 細胞または L I Fの存在下で維持しうることが知られている （Zandstra, P.W., et al., Biotechnol Bioen 69, 607-17 (2000)) 。 しかし， 現在広く用いられてい るこのような培養条件においては， E S細胞の分化を解析する際にフィーダ一細 胞を確実に除去することが困難であり， 分化誘導因子の添加による影響を正確に 解析することができない。 また， フィーダ一細胞なしで培養しうる E S細胞株も 知られているが， 例えば， マウス E S細胞株の 1つである E S—D 3は， フィー ダ一層なしの培養条件下では自発的に分化する傾向にある。
さらに， 血清は， ァクチビンおよび線維芽細胞成長因子や未知の分化誘導因子 の， その量が変動する成分を含む。 これらの成分は， 種々の物質を外から加えて E S細胞の細胞成長および分化を解析する際に， 分析結果に影響を与える可能性 がある。 また， 血清の使用はウィルス， プリオンや未知の因子などの感染の危険 性があり， 再生医療への応用の際にはリスクを伴う。 また， E S細胞の無血清培 養条件についての報告もあるが， 数代継代すると神経などに分ィヒし， 未分化性が 維持できない場合がある。 発明の開示
本発明は， フィーダ一細胞なしで， 未分ィ匕性を維持したまま E S細胞を長期に 培養しうる無血清培養用の培地， およびこのような培地を製造するための基礎培 地を提供することを目的とする。
本発明者らは， 特定の組成を有する培地を用いることにより， フィーダ 細胞 および血清なしで， 未分化性を維持したまま E S細胞を培養しうることを見いだ した。 すなわち， 本発明は， 以下の表 I ：
表 I
Figure imgf000004_0001
に示される組成を有することを特徴とする， E S細胞培養用培地を調製するため の基礎培地を提供する。
別の態様においては， 本発明は， 以下の表 I I ：
表 H
Figure imgf000005_0001
に示される組成を有することを特徴とする， E S細胞培養用培地を調製するため の基礎培地を提供する。 また別の態様においては， 本発明は， 以下の表 I I I ：
表 m
Figure imgf000006_0001
に示される組成を有することを特徴とする， ES細胞培養用培地を調製するため の基礎培地を提供する。
別の態様においては， 本発明の基礎培地は， 2. 5〜4. 58// の^[ ?£ S , および所望の ρ Ηに調節するために必要な量の N a H C〇3をさらに含む。 さらに別の態様においては， 本発明は， 本発明の ES細胞培養用培地を用いる ことを特徴とする ES細胞の培養方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は， 各種培地で培養した ES— D 3細胞における Oc t 3Z4発現のフロ
—サイトメトリ分析を示す。
図 2は， ES— D3細胞の成長に及ぼす L I F濃度の影響を示す。
図 3は， E S F 7培地および C EM培地で培養した E S— D 3細胞の増殖を示 す。 発明の詳細な説明
本発明においては， フィーダ一細胞の非存在下で未分化マウス ES細胞を成長 させるための無血清合成培地を調製するための基礎培地が提供される。 本発明の 基礎培地 （以下， ESF培地と称する） は， 水に， 上の表に示される各成分を所 定の濃度となるように加え， さらに 2. 5〜4. 5 g/Lの HEPES, および 所望の p Hに調節するために必要な量の N a H C〇3を加えた後， 当該技術分野 においてよく知られる方法を用いて滅菌することにより， 容易に製造することが できる。 塩基性アミノ酸等の塩基性成分は， 遊離塩基の形で加えても， HC 1塩 等の塩の形で加えてもよい。 本発明の基礎培地に， 6因子 （6F；インスリン， トランスフェリン， 2— ME， 2—エタノールァミン， 亜セレン酸ナトリウム， 無脂肪酸ゥシ血清アルブミンと複合体化したォレイン酸） および L I F (白血病 抑制因子） を補充して， 本発明の ES細胞培養用培地 （以下， ESF7培地と称 する） を製造する。 これらの 6因子および L I Fは市販されている。 この ESF 7培地を用いることにより， ES細胞をタイプ Iコラーゲン被覆フラスコで無血 清条件下で維持することができる。 あるいは， 本発明の ES細胞培養用培地は， 市販の培地を適宜混合することにより製造してもよい。 例えば， 市販の RPMI, DMEMおよび F 12を 1 ： 2 ： 1の割合で混合し， HE PES, NaHC〇3， ピルビン酸， 亜セレン酸ナトリゥムを添加して作成することにより簡便に製造す ることができるが， L—ヒスチジン HC 1 · Η2〇の代わりに， L—ヒスチジン を計 2 3 . 1 6 5 gZL添加して使用する方が好ましい。
後述の実施例に示されるように， 本発明にしたがって E S F 7培地でマウス E S細胞を培養すると， E S細胞は， 転写因子〇c t 3 Z4， 幹細胞マーカー S S E A- 1 , およびアルカリホスファターゼの発現により表されるように， 未分ィ匕 の表現型を維持した。 また， このようにして維持した未分化細胞に， 骨形成因子 4 (B MP 4) を加えると上皮様細胞への分化が誘導された。 また， ァクチビン Aを加えると， E S細胞の線維芽細胞様細胞および棘状細胞への分化が促進され た。 すなわち， 本発明にしたがって E S F 7培地で培養した E S細胞は， 分化誘 導因子の刺激により特定の細胞に分ィヒする能力を維持していた。
本発明の基礎培地においては， L—ァラニンの濃度は， 1.78 mg/L〜2.67 mg/L, 好ましくは 2.0025 mg/L〜2.4475 mg L, より好ましくは 2.11375 mg/L 〜2.33625 mg/Lである。 L—アルギニンの濃度は， 40 mg/L〜60 mg/L， 好ま しくは 45 mg/L〜55 mg/L, より好ましくは 47.5 mg/L〜52.5 mg Lである。 L —アルギニン H C 1の濃度は， 75.8 mg/L〜113.7 mg/L， 好ましくは 85.275 mg/L〜 104.225 mg/L， より好ましくは 90.0125 mg/L〜99.4875 mg/Lである。 Lーァスパラギン H2〇の濃度は， 13.002 mg/L〜 19.503 mg/L， 好ましくは 14.62725 mg/L〜17.87775 mg/L, より好ましくは 15.43988 mg/L〜17.06513 mg/Lである。 L—ァスパラギン酸の濃度は， 6.66 mg/L〜9.99 mg/L, 好ましく は 7.4925 mg/L〜9.1575 mg/L, より好ましくは 7.90875 mg/L〜8.74125 mg/L である。 L—システィン H C 1 · H20の濃度は， 7.024 mg/L〜10.536 mg/L， 好ましくは 7.902 mg/L〜9.658 mg/L, より好ましくは 8.341 mg/L〜9.219 mg/Lである。 L—シスチン 2 H C 1の濃度は， 38.058 mg/L〜57.087 mg/L, 好ましくは 42.81525 mg/L~52.32975 mg/L, より好ましくは 45.19388 mg/L〜 49.95113 mg/Lである。 L一グルタミン酸の濃度は， 6.94 mg/L〜 10.41 mg/L， 好ましくは 7.8075 mg/L〜9.5425 mg/L, より好ましくは 8.24125 mg/L〜
9.10875 mg/Lである。 L—グルタミンの濃度は， 439.72 mg/L〜659.58 mg/L, 好ましくは 494.685 mg/L〜604.615 mg/L, より好ましくは 522.1675 mg/L〜 577.1325 mg/Lである。 グリシンの濃度は， 15.5 mg/L〜23.25 mg/L， 好ましく は 17.4375 mg/L〜21.3125 mg/L, より好ましくは 18.40625 mg/L〜20.34375 mg/Lである。 L一ヒスチジンの濃度は， 3 mg/L〜30 mg/L, 好ましくは
20.8485 mg/L~25.4815 mg/L, より好ましくは 22.00675 mg/L〜24.32325 mg/Lである。 Lーヒドロキシプロリンの濃度は， 4 mg/L〜6 mg/L， 好ましく は 4.5 mg/L〜5.5 mg/L， より好ましくは 4.75 mg/L〜5.25 mg/Lである。 L— イソロイシンの濃度は， 52.748 mg/L〜79.122 mg/L, 好ましくは 59.3415 mg/L 〜72.5285 mg/L, より好ましくは 62.63825 mg/L〜69.23r75 mg/Lである。 L 一口イシンの濃度は， 54.58 mg/L〜81.87 mg/L, 好ましくは 61.4025 mg/L〜 75.0475 mg/L, より好ましくは 64.81375 mg/L〜71.63625 mg/Lである。 L— リジン H C 1の濃度は， 73.74 mg/L〜110.61 mg/L, 好ましくは 82.9575 mg/L -101.3925 mg/L, より好ましくは 87.56625 mg/L〜96.78375 mg/Lである。 L ―メチォニンの濃度は， 15.896 mg/L〜23.844 mg/L, 好ましくは 17.883 mg/L 〜21.857 mg/L， より好ましくは 18.8765 mg/L〜20.8635 mg/Lである。 L—フ ェニルァラニンの濃度は， 30.392 mg/L〜45.588 mg/L， 好ましくは 34.191 mg/L〜41.789 mg/L, より好ましくは 36.0905 mg/L〜39.8895 mg/Lである。 L—プロリンの濃度は， 10.9 mg/L〜 16.35 mg L, 好ましくは 12.2625 mg/L〜 14.9875 mg/L, より好ましくは 12.94375 mg/L〜 14.30625 mg/Lである。 L一 セリンの濃度は， 24.9 mg/L〜37.35 mg/L， 好ましくは 28.0125 mg/L〜34.2375 mg/L, より好ましくは 29.56875 mg/L〜 32.68125 mg/Lである。 L—スレオニ ンの濃度は， 44.42 mg/L~66.63 mg/L, 好ましくは 49.9725 mg/L~61.0775 mg/L, より好ましくは 52.74875 mg/L〜58.30125 mg/Lである。 L—トリプト ファンの濃度は， 7.808 mg/L〜 11.712 mg/L， 好ましくは 8.784 mg/L〜 10.736 mg/L, より好ましくは 9.272 mg/L〜： 10.248 mg/Lである。 L—チロシンの濃度 は， 33.888 mg/L〜50.832 mg/L， 好ましくは 38.124 mg/L〜46.596 mg/L, よ り好ましくは 40.242 mg/L〜44.478 mg/Lである。 Lーバリンの濃度は， 43.86 mg/L〜65.79 mg/L， 好ましくは 49.3425 mg/L〜60.3075 mg/L, より好ましく は 52.08375 mg/L〜57.56625 mg/Lである。
グル夕チオンの濃度は， 0.2 mg/L〜0.3 mg/L, 好ましくは 0.225 mg/L〜0.275 mg/L, より好ましくは 0.2375 mg/L〜0.2625 mg/Lである。 パラアミノ安息香 酸の濃度は， 0.2 mg/L〜0.3 mg/L， 好ましくは 0.225 mg/L〜0.275 mg/L， より 好ましくは 0.2375 mg/L〜0.2625 mg/Lである。 ピオチンの濃度は， 0.04148 mg/L〜0.06222 mg/L， 好ましくは 0.046665 mg/L〜0.057035 mg L， より好ま しくは 0.049258 mg/L~0.054443 mg/Lである。 パントテン酸カルシウムの濃 度は， 1.746 mg/L〜2.619 mg/L, 好ましくは 1.96425 mg/L〜2.40075 mg/L, より好ましくは 2.073375 mg/L〜2.291625 mg/Lである。 塩ィヒコリンの濃度は， 4.992 mg/L〜7.488 mg/L, 好ましくは 5.616 mg/L〜6.864 mg/L, より好ましく は 5.928 mg/L〜6.552 mg/Lである。 葉酸の濃度は， 2.06 mg/L〜3.09 mg/L, 好 ましくは 2.3175 mg/L〜2.8325 mg/L, より好ましくは 2.44625 mg/L〜2.70375 mg/Lである。 イノシトールの濃度は， 13.48 mg/L〜20.22 mg/L， 好ましくは 15.165 mg/L〜18.535 mg/L, より好ましくは 16.0075 mg/L〜； 17.6925 mg/Lで ある。 ニコチン酸アミドの濃度は， 1.8074 mg/L〜2.7111 mg/L， 好ましくは 2.033325 mg/L〜2.485175 mg/L, より好ましくは 2.146288 mg/L〜2.372213 mg/Lである。 ピリドキサール H C 1の濃度は， 1.6 mg/]し〜 2.4 mg/L， 好ましく は 1.8 mg/L〜2.2 mg/L, より好ましくは 1.9 mg/L〜2.1 mg/Lである。 ピリドキ シン H C 1の濃度は， 0.2124 mg/L〜0.3186 mg/L， 好ましくは 0.23895 mg/L〜 0.29205 mg/L, より好ましくは 0.252225 mg/L〜0.278775 mg/Lである。 リポ フラビンの濃度は， 0.2076 mg/L〜0.3114 mg/L, 好ましくは 0.23355 mg/L〜 0.28545 mg/L, より好ましくは 0.246525 mg/L〜0.272475 mg/Lである。 チア ミン H C 1の濃度は， 1.868 mg/L〜2.802 mg/L, 好ましくは 2.1015 mg/L〜
2.5685 mg/L, より好ましくは 2.21825 mg/L〜2.45175 mg/Lである。 ビタミン B 1 2の濃度は， 0.273 mg/L〜0.4095 mg/L, 好ましくは 0.307125 mg/L〜
0.375375 mg/L, より好ましくは 0.324188 mg/L〜0.358313 mg/Lである。 ヒポ キサンチンの濃度は， 0.816 mg/L〜1.224 mg/L， 好ましくは 0.918 mg/L〜
1.122 mg/L, より好ましくは 0.969 mg/L〜1.071 mg/Lである。 リノール酸の濃 度は， 0.0168 mg/L〜0.0252 mg/L, 好ましくは 0.0189 mg/L〜0.0231 mg/L, より好ましくは 0.01995 mg/L~0.02205 mg/Lである。 リポ酸 （チォクト酸） の濃度は， 0.042 mg/L〜0.063 mg L, 好ましくは 0.04725 mg/L〜0.05775 mg/L, より好ましくは 0.049875 mg/L〜0.055125 mg/Lである。 プロレツシン 二塩酸塩の濃度は， 0.0322 mg/L〜0.0483 mg L, 好ましくは 0.036225 mg/L〜 0.044275 mg/L, より好ましくは 0.038238 mg/L〜0.042263 mg/Lである。 チミ ジンの濃度は， 0.146 mg/L〜0.219 mg/L， 好ましくは 0.16425 mg/L〜0.20075 mg/L, より好ましくは 0.173375 mg/L〜0.191625 mg/Lである。
塩化ナトリウムの濃度は， 5279.8 mg/L〜7919.7 mg/L， 好ましくは 5939.775 mg/L〜7259.725 mg/L, より好ましくは 6269.763 mg/L〜6929.738 mg/Lであ る。 塩ィ匕カリウムの濃度は， 284.72 mg/L〜427.08 mg/L， 好ましくは 320.31 mg/L~391.49 mg/L, より好ましくは 338.105 mg/L〜373.695 mg/Lである。 塩化カルシウム （無水） の濃度は， 86.644 mg/L〜129.966 mg/L， 好ましくは 97.4745 mg/L〜 119.1355 mg/L, より好ましくは 102.8898 mg/L〜： 113.7203 mg/Lである。 硝酸カルシウム 4 H20の濃度は， 20 mg/L〜30 mg/L, 好ましく は 22.5 mg/L〜27.5 mg/L, より好ましくは 23.75 mg/L〜26.25 mg/Lである。 塩化マグネシウム （無水） の濃度は， 11.444 mg/L〜17.166 mg/L, 好ましくは 12.8745 mg/L〜： 15.7355 mg/L, より好ましくは 13.58975 mg/L〜： 15.02025 mg/Lである。 硫酸マグネシウム （無水） の濃度は， 48.844 mg/L〜73.266 mg/L, 好ましくは 54.9495 mg/L〜67.1605 mg/L, より好ましくは 58.00225 mg/L〜64.10775 mg/Lである。 リン酸二水素ナトリウム （無水） の濃度は， 43.48 mg/L〜65.22 mg/L, 好ましくは 48.915 mg/L〜59.785 mg/L, より好まし くは 51.6325 mg/L〜57.0675 mg/Lである。 リン酸一水素ニナトリウム （無 水） の濃度は， 188.408 mg/L〜282.612 mg/L， 好ましくは 211.959 mg/L〜
259.061 mg/L, より好ましくは 223.7345 mg/L〜247.2855 mg/Lである。 ブド ゥ糖 （無水） の濃度は， 1860.4 mg/L〜2790.6 mg/L， 好ましくは 2092.95 mg/L 〜2558.05 mg/L, より好ましくは 2209.225 mg/L〜2441.775 mg/Lである。 ピ ルビン酸ナトリウムの濃度は， 0.001 mg/L~220 mg/L, 好ましくは 50 mg/L〜 170 mg/L, より好ましくは 100 mg/L〜 120 mg Lである。 ピルビン酸ナトリウ ムは， 基本培地中に含めず， 後に添加してもよい。 硝酸第二鉄 9 H20の濃度は， 0.04 mg/L~0.06 mg/L, 好ましくは 0.045 mg/L〜0.055 mg/L， より好ましくは 0.0475 mg/L〜0.0525 mg/Lである。 硫酸銅 5 H2〇の濃度は， 0.0005 mg/L〜 0.00075 mg/L, 好ましくは 0.000563 mg/L〜0.000688 mg/L, より好ましくは 0.000594 mg/L〜0.000656 mg/Lである。 硫酸第一鉄 7 H20の濃度は， 0.1668 mg/L〜0.2502 mg/L, 好ましくは 0.18765 mg/L〜0.22935 mg/L, より好ましく は 0.198075 mg/L〜0.218925 mg/Lである。 硫酸亜鉛 7 H20の濃度は， 0.1728 mg/L〜0.2592 mg/L, 好ましくは 0.1944 mg/L〜0.2376 mg/L, より好ましくは 0.2052 mg/L〜0.2268 mg/Lである。 亜セレン酸ナトリゥムの濃度は， 0.000692 mg/L〜0.00348 mg/L， 好ましくは 0.000779 mg/L〜0.00291 mg/L, より好まし くは 0.000822 mg/L〜0.00263 mg/Lである。 亜セレン酸ナトリゥムは， 基本培 地中に含めず， 後に添カロしてもよい。 フエノールレッドの濃度は， 5.248 mg/L 〜7.872 mg/L, 好ましくは 5.904 mg/L〜7.216 mg L, より好ましくは 6.232 mg/L〜6.888 mg/Lである。
本発明の基礎培地に加える H E P E Sの濃度は， 2859.6 mg/L〜4289.4 mg/L, 好ましくは 3217.05 mg/L〜3931.95 mg/L, より好ましくは 3395.775 mg/L〜 3753.225 mg/Lである。 N a H C 03の濃度は， 1600 mg/L〜2400 mg/L, 好ま しくは 1800 mg/L〜2200 mg/L, より好ましくは 1900 mg/L〜2100 mg/Lであ る。
本発明の E S細胞培養用培地を用いることにより， フィーダ一細胞を用いるこ となく， E S細胞を未分化性を維持したまま成長させることができる。 このため, 種々の因子が E S細胞の分ィ匕に及ぼす影響を再現性をもって調べることができる。 また， E S細胞からの特定の細胞や臓器への分ィ匕条件を確立することがより容易 になり， 予め規定された経路に沿って試験菅内 （あるいは生体外で） で分化させ るよう E S細胞を誘導することが可能となる。 したがって， 本発明の E S細胞培 養用培地は， 再生医療への応用に向けた E S細胞の研究に有用である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 また， 本出願が有する優先権主張の基礎 となる出願である日本特許出願 2 0 0 3 - 4 3 4 0 3 5号の明細書および図面に 記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。 実施例
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが， これらの実施例は本発明 の範囲を制限するものではない。 実施例 1
基礎培地の調製
以下の表に示される組成の基礎培地 （E S F培地と称する） を作成し， 定法に したがって滅菌した。 成分 濃度 (mg/L) 成分 濃度 (mg/L)
Lーァラニン 2.225 ニコチン酸アミド 2.25925
L—アルギニン 50 ピリドキール HCI 2
L—アルギニン HCI 94.75 ピリドキシン HCI 0.2655
Lーァスパラギン H20 16.2525 リボフラビン 0.2595
L-ァスパラギン酸 8.325 チアミン HCI 2.335
L—システィン HCI' H20 8.78 ビタミン Β·) 2 0.34125
L一シスチン 2HCI 47.5725 ヒポキサンチン 1.02
L—グルタミン酸 8.675 リノール酸 0.021
L—グルタミン 549.65 リポ酸 (チォクト酸） 0.0525 グリシン 19.375 プロレツシン二塩酸塩 0.04025
L一ヒスチジン 23.165 チミジン 0.1825 し一ヒド、ロキシプロリン 5 塩化ナトリウム 6599.75
L一イソロイシン 65.935 塩化カリウム 355.9
L—ロイシン 68.225 塩化カルシウム (無水） 108.305
L一リジン HCI 92.175 硝酸カルシウム 4H20 25
L—メチ才ニン 19.87 塩化マグネシウム (無水） 14.305
L—フエ二ルァラニン 37.99 硫酸マグネシウム (無水） 61.055
13.625 リン酸二水素ナトリウム 54.35
L—プロリン
(無水)
31.125 リン酸一水素ニナトリウム 235.51
L—セリン
(無水）
ヒースレオニン 55.525 ブドゥ糖 (無水） 2325.5
L—卜リブトフアン 9.76 ピルビン酸ナ卜リウム 110
Lーチロシン 42.36 硝酸第二鉄 9H20 0.05
L—パリン 54.825 硫酸銅 5H20 0.000625 グルタチオン 0.25 硫酸第一鉄 7H20 0.2085 パラアミノ安息香酸 0.25 硫酸亜鉛 7H20 0.216 ビォチン 0.05185 亜セレン酸ナトリウム 0.000865 パントテン酸カルシウム 2.1825 フエノールレッド 6.56 塩化コリン 6.24 HEPES 3574.5 葉酸 2.575 NaHC03 2000 イノシトール 16.85 実施例 2
ES細胞の培養および成長
ES細胞株としては， ES—D3 (ATCC, USA) を用いた。 この細胞は， フィーダ一細胞なしで培養することができるが， その場合には分ィ匕傾向を示すと 言われている。 ES—D 3細胞は， 最初は， 0. 1 %ゼラチン被覆プレート
(Cell & Molecular Technologies, Inc., PhiUipburg, NJ) で， 15 %ゥシ胎児 血清， L—グルタミン， 0. ImM 2—メルカプトエタノール， ヌクレオシド， 非必須アミノ酸， および L I Fを補充したダルベッコ改変イーグル培地
( Complete E S medium ； 以下 C EMと称する， Cell & Molecular Tbchnologies, Inc., Phillipburg, NJ) で維持した。 C EM培地の組成を以下に示 す。
ES-101-B
Complete ES Cell Culture Media
Pari
Number Component
SLM-220 DME ES cell qualified, 400 ml
TMS-002 L-Glutamine 8mt400 mf media
ES-008 4 mi nudeostdes400 ml media
ES-007 4 ml beta-mercaptoethanol/400 ml media
TMS-001 mfNEAA/4Q0mlmedia
ES-C09 60 ml FBS400 m) media
UF A mteUF/400 ml media
ΤΜ&ΛΒ2 4 ml PenStrep«00 ml media
[Base Catalog # [SLW220l IWorkin range 17.0 -7.4 {Base Catalog lES-008
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000015_0001
75 cm2コ一二ング社プラスチックフラスコに o. 1 Smg/mlのコラ一 ゲンタイプ I溶液を 10ml入れ， 乾燥させないように 12時間処理し， 細胞播 種直前に溶液を吸引除去した。 ESF培地に 6因子 （1 O gZmlゥシインス リン， 5 gZm 1ヒトトランスフェリン， 10 M 2—メルカプトエタノー ル， 1 0 M 2—アミノエタノ一ル， 10 nM亜セレン酸ナトリウム， 4 LL g /m 1無脂肪酸ゥシ血清アルブミンと複合体化したォレイン酸） ならびに 300 ユニット Zmlの L I F (ESGRO (登録商標） ， Chemicon International Inc.) を添加した無血清培地 （ESF7培地） を調製した。 継代時は， ダルべッ コ氏リン酸緩衝液にて洗浄後， 0. 001%トリプシン · 0. 01%EDTAに て細胞を 10秒から 30秒処理後， ピペッティングにて細胞を分散後， MCDB 153溶液に溶解した 0. 1%トリプシンインヒビ夕一にてトリプシンを中和し, ESF培地で細胞を集めて， 遠心後， 細胞を ESF培地で分散， 再度， 遠心後， ESF 7培地に細胞を分散させた。 コラーゲン被覆フラスコに， ESF 7培地中 で ES— D 3細胞を 5_7 x l 03Zmlの細胞密度で播種し， 数日間培養した ところ， 接着性の弱い小型で境界が不明瞭でアル力リフォスファタ一活性陽性の 細胞群がコロニーを形成して増殖した。
未分化表現型の判定は以下のようにして行つた。 細胞のアル力リホスファタ一 ゼ活性を検出するために， 細胞を 4. 5mMクェン酸， 2. 25mMクェン酸ナ トリウム， 3 mM塩ィ匕ナトリウム， 65%メタノールおよび 4%パラホルムアル デヒドで 5分間固定し， 洗浄し， 次に F a s t Re d基質キット （Nichirei Co., I kyo, Japan) を用いて製造元の指針にしたがつて， アル力リホスファターゼ を可視化した。
OCT 3 Z4蛋白質発現を検出するためには， 細胞を PBS中 4%パラホルム アルデヒド （PFA) で 4 で 16時間固定した。 抗体とのインキュベートの前 に， 0. 002 %トリプシンを室温にて 5分処理して細胞の透過性を増加させ, 切片をメタノール中 3 % H202で 30分間ィンキュペートすることにより内在性 ペルォキシダーゼ活性をブロックした。 切片をマウス抗 Oc t 3/4
(Transduction Laboratories, Lexington, KY) で免投染色し， ペリレオ十シダ一 ゼコンジュゲート化 S imp 1 e S t a i n MAXPO (登録商標） ャギ抗マ ウス I g G (NICHIREI Corporation, Tbkyo, Japan) および 3—ァミノ一 9一 ェチルカルパゾールで可視化した。
Oc t 3Z4発現のフローサイトメトリ分析を行うためには， ES細胞を， コ ラーゲンタイプ Iで被覆した 90mmプラスチックプレートで ESF 7中で， お よび RD+ 2ME + FBS中で， およびゼラチン被覆プラスチックプレートで C EM中で， 3x 105細胞を播種した。 培養第 6日に， 細胞を PBS中トリプシ ン ZEDTAでトリプシン処理し， 次に 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 4) 中 1%パラホルムアルデヒドで 1時間固定した。 細胞を PBS中 1%サポニン （S i gma) 中で室温で 10分間処理して透過性を増加させた後， 細胞を lmlの 10%ャギ血清 （Nichirei) 中に 30分間懸濁し， 遠心分離し， 次に抗 O c t 3 ノ 4マウス抗体 (Transduction Labolartories, Lexington, KY) とともに 1時間 インキュベートした。 細胞を 1%ャギ血清を含有する PBSで 3回洗浄し， 次に フルォレセイン （F I TC) —コンジュゲート化ャギ抗マウス I gG抗体
(Immunotech, France) と 30分間反応させた。 細胞を 1 %ャギ血清を含有す る P B Sで 3回洗浄した。 再懸濁した細胞を E p i c s A 1 t r a (Beckman Coulter Co., Miami, FL) で分析した。
コラーゲン被覆フラスコで E S F 7培地中で 5日間培養した E S— D 3細胞と, 0. 1%ゼラチン被覆フラスコで CEM中で 5日間培養した ES— D 3細胞につ いて， その細胞の形態を観察することにより表現型を比較した。 ESF7培地中 で成長したほとんどの ES細胞は未分化のままであった。 しかし， CEM中の培 養物は， 未分化細胞， 線維芽細胞様細胞， 上皮細胞様細胞および神経様細胞の混 合物を含んでいた。 ES細胞の未分化の性質は， 通常は， 幹細胞マーカー Oc t 3 Z4に対する抗体で染色された細胞の比率を決定することにより確認される。 免疫組織化学的染色により， E S F 7培地中のほとんどの E S—D 3細胞は O c t 3 4蛋白質を発現していたが， CEM中ではより少ない細胞が Oc t 3/4 を発現していた。 フローサイトメトリを用いて調べたところ， ESF7培地中の 95%以上の細胞が Oc t 3 Z4蛋白質を発現していたが， CEM中では 85% 未満の細胞が Oc t 3/4を発現していた （図 1) 。 15%FBSおよび 2—メ ルカプトエタノールを添加した RD栄養培地中では， Oc t 3 4ポジティブ細 胞のパーセンテージは 60%未満であった。 実施例 3
L I F濃度の影響
L I Fが ES— D 3細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。 ES— D3細胞をタイ プ Iコラーゲンで被覆した 24—ゥエルプレートで ESF6 (ESF + 6因子） で， および RD+6F中で， およびゼラチンで被覆した 24—ゥエルプレートで DMEM+ 15%FBS + 2_メルカプトエタノール中で， 5 x 103細胞 ウ エルで播種した。 L I Fを各ゥエルに 0， 1， 10， 100， 500， 1000 ユニット Zmlで加えた。 6日間培養した後に細胞をコールターカウンターで計 数した。
L I Fは ES細胞の自己複製能および未分化性を維持するが， 細胞の増殖には 影響を及ぼさないことが知られている。 しかしながら， 図 2に示されるように， ESF6培地 （黒丸） においては， L I Fは明らかに濃度依存的様式で ES細胞 増殖を刺激した。 一方， 15%FBSおよび 2—メルカプトエタノールを補充し た DMEM (黒三角） 中では， L I Fは細胞増殖にはほとんど影響を及ぼさなか つた。 すなわち， 本発明の化学合成無血清 ESF6培地を用いることにより， L I Fのマウス E S細胞に対するこれまでに知られていない活性を識別することが 可能となった。
ESF 7培地から L I Fを除いた場合にも， ES— D 3細胞の自発的分ィ匕は認 められなかった。 L I Fの非存在下で FBSを培地に加えると， ES— D3細胞 は線維芽細胞様細胞， 上皮様細胞， および神経様細胞に分化した。 このことは， E S— D 3細胞が E S F 6培地中で未分化性を維持していたことを示す。 実施例 4
ES細胞の細胞増殖
ES— D 3細胞を， タイプ Iコラーゲンで被覆した 24—ゥエルプレート (Falcon) に E S F 7中で， およびゼラチンで被覆した 24ゥエルプレートに CEM中で， 1 X 104細胞ノウエルで播種し， 細胞増殖を比較した （図 3) 。
ES— D3細胞は CEM中でよく増殖した （黒三角； Td = 9時間） 。 ES—D 3細胞は E SF7培地中では C EM中よりゆっくりと増殖したが （黒丸； T d = 11. 8時間） , 第 6曰における細胞密度はいずれの培地についてもほとんど同 じであった。 ES—D3細胞を ESF 7培地中で 1年以上継続して培養しても， 細胞はその形態を変ィ匕させず， アルカリホスファターゼ活性， Oc t 3/4およ び S S E A— 1を発現し続けた。 実施例 5
ES 129SV細胞の培養
ESF7培地が E S 129 S v細胞の培養に及ぼす影響を調べた。 10代継 代目の凍結 129ZSVES細胞 （Cell & Molecular I chnologies, Inc.,
Phillipburg, NJ) を購入し， これをフィーダ一細胞上で CME中で維持した。 129/S VES細胞をタイプ Iコラゲナーゼを含む PBS中でピベッティング し， ESF7培地 （2000ユニットの L I Fノ m 1) でフィーダ一細胞なしで コラーゲン被覆フラスコに接種した。 ES 129 Sv細胞はゆっくり増殖し， 神経様細胞も出現した。 しかし， アルカリホスファターゼ活性および〇c t 3Z 4抗体を用いる免疫組織学的発現の測定から E S 129 S v細胞が E S F 7培 地中で分化することなく増殖したことがわかった。 すなわち， 本発明の ES細胞 培養用培地を用いることにより， 通常はフィーダ一細胞上で増殖する E S細胞も フィーダ一細胞なしで増殖することが示された。 ただし， 継代時は， トリプシン EDTAではなく， 0. 3ユニット/ m 1のコラゲナーゼタイプ I A— Sを用い て， 細胞を分散させた。 実施例 6
BMP4, ァクチビン Aならびに FGF— 2による分化誘導
ES-D 3細胞を， E S F 7中でラミニン被覆プラスチックプレートに接種し， 2日間培養した。 次に， 培地を RD+5F培地 （5因子を補充した RD) に交換 した。 RD培地は非 ES細胞タイプについて一般に用いられている無血清合成培 地用の基本培地である。 BMP 4の添加のためには， RD+ 5 F培地に fatty acid free-BSAを補充した。
ァクチビン Aを RD+ 5 Fに加えると， E S— D 3細胞の線維芽細胞様細胞へ の分化が誘導された。 B M P 4を fatty acid free-BSA (無脂肪酸ゥシ血清アル ブミン） を補充した RD+5Fに加えると， ES細胞は上皮様細胞に分ィ匕した。 これらの結果は， ES— D 3細胞が成長因子に応答して， 特定の経路に沿って分 化するよう誘導されうることを示す。 ES— D3細胞を， ESF7中でラミニン 被覆プラスチックプレートに接種し， 2日間培養した。 次に， 培地を ESF5に 交換した。 B M P 4の添加のためには， E S F 5に fatty acid free-BSA (無脂 肪酸ゥシ血清アルブミン） を補充した。 あるいは， £3—03細胞を， 培地を E SF5を用いて， ラミニン被覆プラスチックプレ一トに接種し， BMP 4ならび に fatty acid free-BSAを添加して培養を行う。 培地は 2日毎に交換した。 ある いは， ES— D3細胞を， 培地を ESF 5を用いて， ラミニン被覆プラスチック プレートに接種し， FGF— 2ならびにへパリン， あるいは， FGF— 2とへパ リンと NGF, あるいは， FGF— 2とへパリンと PDGF— AAを添加し， 1 日培養後， それぞれ漕辱因子のみ添加し， さらに培養 2日目に培地を ESF 5に 培地交換し， 培養を行った。 培地は 2日毎に交換した。
ァクチビン Aを ESF 5に加えると， ES—D 3細胞の線維芽細胞様細胞への 分化が誘導された。 B M P 4を fatty acid free-BSA (無脂肪酸ゥシ血清アルブ ミン） を補充した ESF 5に加えると， ES細胞は上皮様細胞に分化した。 FG F— 2とへパリン， あるいはさらに NGF， あるいは PDGF— AAを ESF 5 に加えると， 神経様細胞に分化した。 これらの結果は， ES— D3細胞が成長因 子に応答して， 特定の経路に沿って分化するよう誘導されうることを示す。 実施例 7
ES C 57/BL 6 J ES細胞の培養
ESF7培地が C57ZBL6 J E S細胞の培養に及ぼす影響を調べた。 10代継代の凍結 C57/BL6 J ES細胞 （Cell & Molecular Technologies, Inc., Phillipburg, NJ) を購入し， これをフィーダー細胞上で C M E中で維持し た。 C57ZBL6 J ES細胞を PBSのみにて， あるいはタイプ Iコラゲ ナーゼを含む PBS中でピペッティングし， ESF 7培地 （3000ユニットの L I F/ml) でフィーダ一細胞なしでコラーゲン被覆フラスコに接種した。 C 57/BL 6 J ES細胞は未分化なコロニーを作り， ゆっくり増殖した。 すな わち， 本発明の ES細胞培養用培地を用いることにより， 通常はフィーダ一細胞 上で増殖する E S細胞もフィーダー細胞なしで増殖することが示された。 産業上の利用性
本発明にしたがう培地を用いることにより， フィーダ一細胞なしで， 未分化性 を維持したまま E S細胞を長期に無血清培養することができるため， E S細胞の 成長および分化誘導に有用である。

Claims

請求の範囲 以下の表 I ：
表 I
Figure imgf000022_0001
に示される組成を有することを特徴とする， E S細胞培養用培地を調製するため の基礎培地。.
2. 以下の表 I I ：
表 II
Figure imgf000023_0001
に示される組成を有することを特徴とする， ES細胞培養用培地を調製するため の基礎培地。
3. 以下の表 I I I ：
表 in
Figure imgf000024_0001
に示される組成を有することを特徴とする， ES細胞培養用培地を調製するため の基礎培地。
4. 2. 5〜4. 5gZLの HEPES, および所望の pHに調節するために 必要な量の N a H C〇3をさらに含む， 請求項 1一 3のいずれかに記載の基礎培 地。
5. 請求項 4記載の基礎培地， インスリン， トランスフェリン， 2—メルカプ トエタノール， 2—エタノールァミン， 亜セレン酸ナトリウム， 無脂肪酸ゥシ血 清アルブミンと複合体化したォレイン酸， および L I F (白血病抑制因子） を含 む， ES細胞培養用培地。
6. 請求項 5記載の ES細胞培養用培地を用いることを特徴とする， ES細胞 の培養方法。
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