WO2005054451A1 - 高度安全性痘瘡ワクチンウイルスおよびワクシニアウイルスベクター - Google Patents

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WO2005054451A1
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virus
vaccinia virus
strain
promoter
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Hisatoshi Shida
Minoru Kidokoro
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Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd.
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    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to novel vaccinia viruses and viral vectors. Specifically, reversion (reverted mutation or ancestral return) is caused. Attenuated pressure ulcer vaccinia virus LC 16m8 strain, and its parental LC 1 6mO strain is removed. Thus, the present invention relates to a genetically stable and safer Vaccinia virus / vaccinia virus vector that is less susceptible to reversion. Background art
  • LC16 LC16m0 strain (hereinafter sometimes referred to as the m0 strain) that formed a smaller box was selected.
  • the mO strain was inoculated to about 1000 people. However, the mO strain still had a strong reaction on the skin.
  • the LC 16m8 strain (hereinafter sometimes referred to as the m8 strain) was established as a small box size strain (Hiroshi Hashizume, Clinical and Virus Vo. 3 No. 3, July 1, 1975).
  • the m8 strain was inoculated to 100,000 children from 1974 to 1975, but no serious adverse reactions were reported, which proved to be highly safe compared to conventional vaccine strains. It was approved by the Ministry of Health and Welfare as an official vaccine strain.
  • the m8 strain had a weak skin growth ability, the antibody induction ability was almost the same as that of the parent Lister strain, and the safety was clearly superior.
  • This strain was also greatly improved in that it could be produced by aseptic tissue culture using primary cultured cells of the rabbit kidney.
  • vaccinia virus has been used as a vector by introducing other foreign genes because it has a wide host range and high expression efficiency (Japanese Patent Publication No. 1-509091).
  • Japanese Patent Publication No. 1-509091 Japanese Patent Publication No. 1-509091.
  • the aforementioned LC 16m0 and LC 16m8 strains were also considered for use as vectors because of their high safety.
  • the LC 16m0 strain has a problem in terms of skin growth
  • the LC 16m8 strain has a problem of the appearance of revertants, so it is safer as a pressure ulcer vaccine strain or vector virus. It was necessary to create a virus strain with a high level. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to produce a vaccine strain that is unlikely to cause reversion (an ancestor return), and to provide a safer pressure ulcer vaccine. Further It is another object of the present invention to provide a vector virus for safely expressing a foreign gene using the virus.
  • the gene involved in reversion is a B5R gene that resembles the virus host castle and plaque size.
  • the B5R gene inactivated due to the loss of most of the orf due to a frame shift due to a single base deletion in or f, but in the repartant, a base is newly inserted at another location.
  • Figures 1 and 2 The base sequence of the B5R gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the B5R gene product is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the ori of the B5R gene is complete.
  • the B5R gene of the mO strain was first cloned and introduced into the m8 strain by homologous recombination to produce a recombinant virus (RVV) with the complete B5R gene (m8B5R).
  • RVV recombinant virus
  • This RVV screening was performed by selecting large plaques and then sequencing the B5R gene.
  • constructs were constructed that completely deleted the entire B5R gene, including the promo and overnight regions (AB5R, Fig. 6). By homologous recombination, the B5R gene was deleted in the m8B5R and mO strains.
  • RVV m8AB5R (hereinafter also referred to as ⁇ 8 ⁇ ) and mOAB5R (hereinafter also referred to as ⁇ ⁇ )) were introduced. Furthermore, the transmembrane region of the B5R gene was removed, and a construct linked to the high expression promoter PSFJ 1-10 was created (proB5RdTM, Fig. 6). M0proB5 dTM (hereinafter sometimes referred to as mOdTM))). RVV screening was done by selecting small plaques and confirming the genomic sequence.
  • ni8AB5R, mOAB5R, m8proB5RdTM and m0proB5RdTM have higher genetic stability than the m8 strain.
  • the present invention is as follows.
  • Vaccinia virus strain Vaccinia virus strain that consists of vaccinia virus that does not produce B5R gene product with normal function, lacking part or all of B5R gene of LC16 strain, LC16m8 strain or LC16m0 strain Pressure ulcer vaccine virus that is less prone to back mutations that cause the production of B5R gene products with normal function,
  • a promoter is linked upstream of the B5R gene, and a part of the B5R gene is expressed, but the expression product has lost the normal function of the B5R gene expression product, [8]
  • a pressure ulcer vaccine pharmaceutical composition comprising the pressure ulcer vaccine virus according to any one of [1] to [1 0],
  • a vaccinia virus vector that lacks part or all of the B5R gene of the vaccinia virus strain LC16, LC16m8 or LC16mO and does not produce a normal B5R gene product.
  • Vaccinia virus vector according to any one of [1 2] to [1 4], in which plaque size when infected with rabbit kidney cells and subcutaneous growth when administered to rabbits is equivalent to LC16m8 strain ,
  • a part of the B5R gene is deleted, a promoter is linked upstream of the B5R gene, and a part of the B5R gene is expressed.
  • [1 7] A vaccinia virus vector according to any one of [1 2] to [1 6], wherein the transmembrane domain of the B5R gene is deleted,
  • a promoter is linked upstream of the B5R gene, and a part of the B5R gene is expressed, but the expression product loses the normal function of the B5R gene expression product, [1 9] vaccinia virus vector,
  • [2 1] The vaccinia virus vector of [1 9] or [2 0], wherein the promoter is PSFn-10, PSFJ2-16 or other box virus high expression promoter,
  • [2 2] A vaccinia virus vector according to any one of [1 2] Kas et al. [2 1] containing a foreign gene,
  • a virus virus, bacterial, protozoan or cancer vaccine virus pharmaceutical composition comprising the vaccinia virus vector according to [2 3].
  • FIG. 1 is a diagram showing the base sequences of the B5R gene of the liver of the LC16mO strain, the LC16m8 strain and the LC16m8 strain.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amino acid sequences of the B5R gene products of Lipper Yun of LC16mO, LC16m8 and LC16m8 strains.
  • FIG. 3 shows the passage from Lister strain to LC16m8.
  • FIG. 4 shows the characteristics of the Lister strain, LC16mO strain and LC16m8 strain.
  • Figure 5 shows LPC (Large Plaque), the LC16m8 and LC16m8 strain revertants.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram of a method for constructing a virus lacking the B5R gene.
  • FIG. 7 is a photograph showing the results of confirming the expression of B5R protein in the RK13 cell fraction infected with the improved virus using a Western plot.
  • FIG. 8 is a graph showing the frequency of appearance of ribartan silkworms by subculture of the improved virus.
  • FIG. 9 is a diagram showing the skin growth of the improved virus in rabbits.
  • FIG. 1 OA shows the weight loss of SCID mice administered with virus.
  • FIG. 10B is a graph showing weight loss of SCID mice administered with virus.
  • FIG. 11 shows changes in RED50 over time in SCID mice administered with virus.
  • Figure 12 shows the weight loss of BALB / c mice challenged with virulent vaccinia virus.
  • the vaccinia virus of the present invention can be produced by deleting all or part of the B5R gene of vaccinia virus, for example, LC16 strain, LC16niO strain or LC16m8 strain.
  • the B5R gene encodes a protein present in the envelope, and the B5R gene product is involved in viral infection.
  • the presence of the B5R gene has a problem in that it has a high skin proliferative potential and causes side effects such as self-inoculation when administered to humans.
  • the LC16m8 strain did not produce the B5R gene product due to a single-base frameshift mutation in the B5R gene, and the skin growth was weak, but the reverse mutation produced a normal B5R gene product. (Reversion), there was a risk that pathogenicity could be restored.
  • the vaccinia virus of the present invention lacks all or part of the B5R gene.
  • the pathogenicity originally possessed by the parent LC16mO strain is reduced, and in the m8AB5R, revertants are not generated by the sudden reversion of the parent LC16in8 strain.
  • the deletion of the B5R gene in the present invention is such that the B5R gene is not expressed or is expressed but the expressed protein does not maintain the normal function of the B5R gene product.
  • This deletion is not such that the trait is restored by a point mutation of the virus, but the normal function of the B5R gene product once lost is not restored.
  • one of the bases of the B5R gene was deleted due to a mutation, resulting in a frameshift, the 0RF of the B5R gene was shifted, and normal B5R was not expressed.
  • 0RF of the B5R gene is restored, and B5R with normal function is expressed, causing an ancestral return.
  • Deletions of the present invention do not include deletions that can cause ancestral return by such i3 ⁇ 4 mutations.
  • the B5R gene consists of a short consensus region from SCR1 to SCR4 and a transmembrane domain (TM), and the transmembrane domain plays an important role in the function of the B5R gene product.
  • the deletion of the B5R gene may be a deletion of the transmembrane domain.
  • a part of SCR1 to SCR4 may be deleted.
  • the deletion may be all deletions of ⁇ A encoding each region, or a part of the DNA encoding each region may be deleted to produce a B5R gene product with normal function.
  • the deletion of the B5R gene is a deletion of all B5R genes or a deletion of all transmembrane domains. It is also desirable to delete the B5R gene promoter. Such deletion can be performed by a known homologous recombination method.
  • Homologous recombination is a phenomenon in which two DNA molecules have the same base sequence in a cell and cause recombination with each other. This method is often used for recombination of viruses with large genomic DNA such as vaccinia virus. .
  • target A plasmid which is called a transfer vector
  • a transfer vector linking a gene and a foreign gene is constructed in such a way that the sequence of the vaccinia virus gene site is divided at the center, and this is applied to cells infected with vaccinia virus.
  • replacement occurs between the viral DNA that became naked during the viral replication process and the same sequence on the transfer vector, and the sandwiched promoter and foreign gene are integrated into the viral genome.
  • a vaccinia virus B4R gene to B6R gene region was cloned into a plasmid, and the entire B5R gene region located between the B4R gene and the B6R gene was deleted.
  • a plasmid in which a part of the B5R gene is deleted is prepared and introduced into vaccinia virus-infected cells.
  • the cells include BSC-1 cells, HTK-143 cells, Hep2 cells, MDCK cells, Vero cells, HeLa cells, CV1 cells, COS cells, RK13 cells, BHK-21 cells, primary rabbit heron kidney cells Cells that can be infected by an isozyme virus can be used.
  • the vector may be introduced into the cells by a known method such as a calcium phosphate method, a cationic ribosome method, or an electroporation method.
  • genes that can be selected markers eg, B5R gene, HA gene, TK gene, etc.
  • a transfer vector can be designed based on the nucleotide sequence information of the vaccinia virus gene, and then the gene to be disrupted can be homologously recombined using the transfer vector.
  • the transfer vector can be prepared according to the method described in DM Globe et al., Edited by Tomoyuki Kato, DNA Cloning 4 Mammal System 1 (2nd edition) TaKaRa et al.
  • plaque size in the case of B 5R gene
  • HA gene presence or absence of plaque erythrocyte adsorption
  • TK BudR drug resistance
  • a selection method such as gene
  • the B5R gene product is present on the infected cell surface and on the viral envelope, and acts to increase the efficiency of infection when the virus infects and spreads to neighboring cells or other parts of the host, and increases the virus plaque size and It is also involved in the host range.
  • the plaque size is reduced when animal cells such as RK 13 cells are infected, and the box size on the chorioallantoic membrane of embryonated chicken eggs is also reduced.
  • virus growth in Vero cells is significantly reduced.
  • the ability of the skin to proliferate when administered intradermally to Usagi is reduced and skin pathogenicity is reduced.
  • the lack of B5R protein function depends on the size of plaque formed when RK13 cells are infected, box size, virus propagation in Vero cells, skin pathogenicity in rabbits, etc. It can be judged as an indicator.
  • the gene sequence of vaccinia virus may be examined.
  • the silkworm virus of the present invention has a smaller plaque size when infected with animal cells, a smaller pock size, and a virus in Vero cells. Proliferation, dermatopathogenicity, etc. have also decreased, compared to the LC 16m8 strain, the black size and box size when animal cells are infected are the same.
  • Virus growth in cells and subcutaneous pathogenicity are equivalent.
  • Fig. 5 shows the plaque size when the LC 16mO and LC 16m8 strains were infected with rabbit kidney cells
  • Fig. 9 shows the skin growth in the rabbits of the LC 16mO and LC 16m8 strains (the recloned LC 16m8 strain).
  • deletion of the B5R gene also reduces virulence when inoculated into animals. For example, when the virus is inoculated intraperitoneally into a SC ID mouse and the body weight is measured over time, a virus strain that produces a B5R gene product with normal function is inoculated with 10 5 PFU virus for 2 weeks.
  • the B5R gene product having a normal function in the present invention is a gene product having the same function as that of the gene product encoded by the wild-type B5R gene, and has the above properties.
  • the infection defense was comparable to the virus strain with the B5R gene (Fig. 12), but the B5R gene product is Because it has been reported that it is important as an anti-infection protective antigen, it may be desirable that a part of the B5R gene product is produced when used as a pressure ulcer vaccine. Therefore, in the vaccinia virus of the present invention, the B5R gene should be expressed in a form in which normal function is lost while maintaining the antigenicity of the actual product. For this purpose, the virus should be designed so that only a part of the B5R gene, for example, a part or all of SCR1 to 4 is expressed.
  • a high-expression promoter may be linked to the upstream of the partially deleted B5R gene so as to function.
  • psFn-10, PSFJ2-16, p7.5K promoter, P11K promoter, T7.10 promoter, CPX promoter, HF promoter, H6 promoter, T7 hybrid promoter, etc. A high expression promoter for Pokpox virus.
  • the LC16mO strain and the LC16m8 strain that have completely deleted the B5R gene are referred to as m0AB5R and m8AB5R, respectively, and are sometimes referred to as ⁇ and ⁇ 8 ⁇ , respectively, and the transmembrane domain in the B5R gene is deleted.
  • the LC16mO and LC16m8 strains, which are highly expressed by linking promo overnight, are called mOproBSRdTM and m8proB5RdTM, respectively, and are called m0dTM and m8dTM, respectively. There is.
  • the LC16mO strain was produced from the Lister strain via the LC16 strain, and the LC16m8 strain was further produced from the LC16mO strain (Protein Nucleic Acid Enzyme Vol.48 No.12 (2003), p.1693- 1700). Isolation of the LC 16m8 strain from the Lister strain is carried out by the process shown in FIG. 2, and the LC16m0 strain and the LC16m8 strain can be obtained from Chiba Prefectural Institute of Public Health.
  • the LC16m0 and LC16m8 strains lacking the B5R gene of the present invention can be used as safe pressure ulcer virus vaccines without causing reversion.
  • the present invention also includes a vaccinia virus vector comprising the LC16 strain, the LC16m0 strain, and the LC16m8 strain that lack the B5R gene.
  • a desired foreign gene can be introduced into the vector.
  • Homologous recombination may be performed by the method described above. For example, a plasmid (transfer vector) in which a foreign gene to be introduced is linked into the DNA sequence of the site to be introduced is prepared, and this is introduced into a cell infected with vaccinia virus.
  • pSFJl-10, pSFJ2-16, P ⁇ 4, pGS20, pSClK pMJ60K p200K pBCB01-3, 06, pTKgpt-F 1-3s, pTMK pTM3, pPR34, 35, pgpt-ATA18_2, pHESl-3 Etc. can be used.
  • the introduction region of the exogenous gene is a gene that is not essential for the life cycle of ⁇ cinnavirus, and examples include hemagglutinin (HA) gene, thymidine kinase (TIO gene, F fragment, etc.).
  • the gene to be introduced changes to a viral trait due to its deletion, facilitating selection of recombinants
  • the HA gene in the case of a recombinant in which a foreign gene is introduced into the HA gene, it is disrupted by the foreign gene into which the HA gene has been introduced and loses its function. Recombinants can be easily selected because they no longer adsorb avian red blood cells and appear white.
  • the vaccinia virus-infected cells include: Velo cells, HeLa cells, CV 1 cells, COS cells, RK 13 cells, BHK-2 1 cells, primary rabbit kidney cells, B SC-1 cells, HTK-143 cells, Hep2 Cells capable of infecting vaccinia virus, such as cells and MDCK cells, can be used.
  • the promoters include, but are not limited to, PSF JH-10, PSFJ 2-16, p7.5K promoter, pl lK promoter motor, T7.10 promoter, CPX promoter, HF promoter, H6 promoter, T7 hybrid.
  • the foreign gene can be produced using a vaccinia virus vector into which the foreign gene has been introduced.
  • the host cell may be cultured by infecting a suitable host cell with a vaccinia virus vector introduced with a foreign gene.
  • the various animal cells described above can be used as the host cell.
  • the culture may be performed according to known culture conditions for animal cells.
  • by introducing genes encoding antigens such as viruses, bacteria, protozoa, and cancer as foreign genes it is possible to use silkworm virus vectors introduced with foreign genes as vaccines against various viruses, bacteria, protozoa, and cancer. it can.
  • human immunodeficiency virus hepatitis virus, herpes virus, mycobacteria, malaria parasite, serious acute respiratory syndrome (SARS virus) virus and other protective antigens (neutralizing antigens) or cancer antigens are encoded.
  • a gene may be introduced.
  • the present invention also includes a vaccinia virus vector into which these antigens have been introduced.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for a pressure ulcer vaccine comprising a vaccinia virus deleted of the B5R gene of the present invention, the use of the vaccinia virus deleted of the B5R gene of the present invention as a pressure ulcer vaccine, and a vaccinia virus as a subject. And a method of protecting against smallpox infection.
  • the administration method, dosage and the like of the vaccine pharmaceutical composition of the present invention are the same as those of the known vaccinia virus vaccine already used as a vaccine.
  • the vaccine pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutically effective amount of the present invention.
  • vaccinia virus vaccine as an active ingredient, and may be in the form of a sterile aqueous or non-aqueous solution, suspension, or emulsion. Further, it may contain a pharmaceutically acceptable diluent such as salt, buffer, adjuvant, etc., an auxiliary agent, a carrier and the like.
  • Administration of the vaccine pharmaceutical composition of the present invention may be performed by various parenteral routes, for example, subcutaneous route, intravenous route, intradermal route, intramuscular route, intraperitoneal route, intranasal route, and transdermal route. Of these, intradermal administration is preferred.
  • a pharmaceutically effective dose is an amount that is sufficient to obtain at least one of the desired biological effects, in this case a cellular or humoral immune response to a viral antigen.
  • the effective dose can be appropriately determined according to the age, sex, health, weight, etc. of the subject. For example, but not limited to adult humans, approximately 10 2 to 10 1 G box forming units (PFU) or plaque forming units (PFU), preferably 10 5 to 10 6 box forming units (PFU) per dose.
  • the present invention provides a vaccinia virus vaccine drug that is a vaccinia virus vector in which a B5R gene is deleted and a foreign gene is introduced, wherein the introduced foreign gene encodes a virus, bacteria, protozoa, or cancer antigen.
  • the administration method and dosage of the vaccine pharmaceutical composition may be in accordance with the above-described pressure ulcer vaccine pharmaceutical composition.
  • the purified genomic DNA of the m8 strain is used as a saddle type, and the B4R gene is amplified by two primers (GATGCTGTTGTGCTGTGTTTGC (SEQ ID NO: 3) and GTTAACACTGTCGAGCACTAAAAGG (SEQ ID NO: 4)).
  • An Hpal site was introduced on the side. This was cloned into a TA vector (pCR II) (pB4R + HpaI).
  • the B4R gene entire region and the TA vector multi-region were converted into two types of primers (GATGCTGTTGTGCTGTGTTTGC (SEQ ID NO: 5) and TTGTGTGGAATTGTGAGCGGA (SEQ ID NO: 6)).
  • the cloning site was amplified. After purification of this PCR product, both ends were blunted with T4 DNA polymerase (B4R + HpaI fragment).
  • the purified genomic DNA of the m8 strain is used as a saddle, and the B6R gene is amplified by two primers (GTTAACGTTCCATAAATTGCTACCG (SEQ ID NO: 7) and GTGTGACCTCTGCGTTGAATAG (SEQ ID NO: 8)). Introduced the Hpal site. This was cloned into the TA vector (pB6R + HpaI). Concatenation of B4R and B6R
  • PB6R + Hpal After confirming the base sequence of PB6R + Hpal, it was digested with Hpal and dephosphorylated with BAP. Next, it was mixed with the B4R + HpaI fragment and ligated. This mixture was made into a saddle shape, and one of the B4R and B6R genes ligated with primers ps / hr-si (TCGGAAGCAGTCGCAA CAAC (SEQ ID NO: 9)) and ps / hr-asl (ATACCATCGTCGTTAAAAGCGC (SEQ ID NO: 10)). The partial region was amplified. This PCR product was cloned into the TA vector and the nucleotide sequence was confirmed (PB4R + B6R). Construction of transfer vector (PB4R + B6R proB5RdTM) for partially deleted B5R highly expressing recombinant
  • Vaccinia virus (m8 strain for m8B 5R, m8B5R for m8 ⁇ and m8p roB 5RdTM, mO strain for ⁇ and m0proB5RdTM) is cultured in RK13 cells or PK cells cultured in 80% confluent in 35 mm dishes.
  • Transfer vector plasmid DNA (pB5R, m8 in the case of m8B5R), mixed with LipoiectAMINE PLUS (Invitrogen) after 1 hour of incubation at room temperature
  • pB4R + B6R and in the case of m8proB5RdTM and m0proB5RdTM, PB4R + B6R proB5RdTM were added to the cells according to the manual and incorporated, and cultured at 34 for 2 days.
  • the base sequence of the PCR product ⁇ ⁇ was confirmed by a direct sequence.
  • a clone with no problem in the nucleotide sequence was selected and further black-purified 2 to 3 times in RK13 cells. All viruses were cultivated in large quantities in RK13 cells, purified and concentrated by ultracentrifugation using 35 (W / V)% sucrose cushion, and virus titers were measured in RK13 cells for use in experiments. .
  • Figure 6 shows the construction of the virus lacking the B5R gene.
  • B5R protein with the same molecular weight was confirmed in m8B5R (m8 strain with wild-type B5R gene introduced) and mO strain, and a short B5R product in the high expression type improved virus (m8proB5RdTM, m0proB5RdTM) ) ⁇ ) Confirmed. No B5R gene product was detected in m8rc (recloned m8 strain), ⁇ 8 ⁇ and ⁇ (Fig. 7a).
  • the m8proB5RdTM, m0proB5RdTM, m8B5R, m0, LC16, and Wyeth strains were infected under the same culture conditions as described above, and the cultured supernatant was treated with 12.5% TCA. Concentrated with, and confirmed by Western blot (Fig. 7b). Anti-B5R Usagi polyclonal antibody was used as the primary antibody, which was detected by ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences K. K.). The cell fraction was ablated 1/40 of the total, and the culture supernatant was abbreviated 1/10.
  • vero cells the cells were subcultured for 2 passages, and the presence or absence of the liver was confirmed by measuring the RV content.
  • the revertant content was calculated as the ratio of virus titer by vero cells to virus titer in RK13 cells.
  • the recloned m8 strain (m8rc) was used as a control.
  • Figure 8 shows the frequency of occurrence of revertan cocoons.
  • ErD50 Eryt hema Do se 50, the amount of virus that can cause redness of 1 cm or more in 50% of the inoculated site
  • m8B5R in which a wild type B5R gene was introduced into mO strain, m8 rc and m8 strain was used.
  • Viruses with B5R gene activity have strong growth potential in skin and low ErD50 values (1.00, 2.25), whereas viruses lacking B5R gene (m8 rc, m8) ( ⁇ , mO ⁇ ) shows that the skin growth ability decreases and the ErD50 value increases (5.83, 5.50, 6.00), and that the B5R gene is directly related to skin growth.
  • Recombinants expressing B5R lacking the TM region (m8proB 5RdTM, m0proB 5RdTM) also have a higher ErD50 value (4.75,5O) than the control virus (m8B 5R, mO) expressing wild-type B5R. 5.00), indicating that the skin growth was greatly reduced to the same extent as m8 rc, ⁇ 8 ⁇ , and mO ⁇ .
  • mice Male were inoculated intraperitoneally with 10 7 to 10 9 PFU / (3ose, respectively, with m8 ⁇ , ⁇ , m8dTM, and mOdTM strains. decreased was observed the presence or absence of onset.
  • Figure 1 OA and Figure 10B show weight loss in mice.
  • 10 8 PFU / dose inoculation group showed some weight loss, but 10 7 PFU / dose inoculation group was similar to PBS inoculation group and MVA inoculation group There was no weight loss and no onset.
  • mO, m8B5R, and Wyeth strains with B5R gene activity also started to wilch in the 10 5 PFU / dose group after 2 weeks of vaccination and started to lose weight.
  • the mO-inoculated group most individuals died by 4 weeks after inoculation at any dose.
  • RashEpression Dose 50 was set as the amount of virus that could cause half-individual pupae as an indicator of the pathogenicity of the virus strain to SCID mice.
  • Figure 11 shows the changes over time.
  • all 5 strains ⁇ 8 ⁇ , mO ⁇ , m8dTM, m0dTM, m8rc
  • B5R gene function showed almost the same value, which is 21 og higher than 3 strains (m0, m8B5 Wyeth) with B5R activity. The value is shown. There was also a gap of several days at the beginning of the discovery.
  • vaccinia virus is being used as a live recombinant vaccine or expression vector system in addition to its use as a pressure ulcer vaccine. It is also important for the development of acupuncture and diagnostic agents for emerging re-emerging infectious diseases. Since it can be a tool, the improvement of the m8 strain is also significant from an application perspective. All publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Further, it will be readily understood by those skilled in the art that various modifications and variations of the present invention are possible without departing from the spirit and scope of the invention described in the appended claims. The present invention is intended to encompass such variations and modifications.

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Abstract

リバージョン（先祖帰り）を起こしにくいワクチン株を作出し、より安全性の高い痘瘡ワクチンを提供することを目的とする。本ワクチンウイルスは、ワクシニアウイルス株LC16m8株またはLC16mO株のB5R遺伝子の一部または全部を欠失しており、正常な機能を有するB5R遺伝子産物を産生しない。本ワクチンウイルスは、痘瘡ワクチンとして、また外来遺伝子を発現し得るベクターとして使用可能である。そして、復帰突然変異により正常機能を有するB5R遺伝子産物を産生しない痘瘡ワクチンおよびワクシニアウイルスベクターを提供する。

Description

明細書 高度安全性痘瘡ヮクチンウィルスおよびワクシニアウィルスべクタ一 技術分野
本発明は、 新規なワクシニアウィルスおよびウィルスベクターに関す るものである。 具体的には、 リバ一ジョ ン （復帰突然変異または先祖帰 り） を起こ しゃすい弱毒痘瘡ヮクシニアウィルス LC 16m8株おょぴその親 株 LC 1 6mO株から、 リバージョ ンに関わる遺伝子を除去することによ り リ バージョ ンを起こ しにく く した、 遺伝的に安定でよ り安全なヮクシニア ウイ/レスおよびワクシニアウィルスベクターに関するものである。 背景技術
痘瘡ヮクチンはかって全世界で使用され、 天然痘の撲滅に貢献した。 しかし、 当時のワクチン株はいずれも、 1 ) 種痘後脳炎のような重篤な 副作用を引き起こすこと、 2 ) ワクチンの生産はウィルスを牛の皮膚に 接種し、 できた膿瘍から取り 出すという原始的な手法によってお,り、 無 菌性を保証することが容易ではない、 という問題点を持っていた。 千葉 県血清研究所の橋爪らはこのよ うな問題点を解決するために、 当時世界 中で用いられていた痘苗株の中で比較的副作用が少ないと されていた Li st er株を初代ゥサギ腎臓細胞 （PRK) に 30°Cで継代培養し、 その中か ら、 40. 8°C以上では増殖しない温度感受性株と して LC16株を樹立した。 LC16 株はサルの中枢神経系に対する病原性が、 親株の Li ster 株や当時 ワクチンに使用されていた他の株に比べ大き く減弱していたが、 ゥサギ の皮膚での増殖性はむしろ亢進していることが判明した。 そこでさ らに PRK での継代を重ね、 よ り小さなボックを形成する LC16m0 株 （以下 m0 株と称すること もある） を選択した。 mO 株は約 1000 人に接種された。 しかし mO 株でも皮膚での反応がまだ強かったために、 mO 株からさらに ボックサイズが小さい株として LC 16m8株 （以下 m8株と称することもあ る） が樹立された （橋爪 壮、 臨床とウィルス Vo. 3 No. 3 昭和 50 年 7 月 1 日）。 m8株は、 1974年から 1975年にかけて 10万人の子供に接種さ れたが、 重篤な副反応は報告されなかったことから、 従来のワクチン株 に比較して高い安全性が証明され、 正式なワクチン株として厚生省から 認可された。 mO株と比較すると、 m8株は皮膚増殖能が弱いにもかかわら ず抗体誘導能は親株の L i s t e r株とほぼ同程度であり、 また安全性では明 らかに優れていた。 この株はゥサギ腎臓の初代培養細胞を用いた無菌的 な組織培養によって製造できる点も大きな改善点であった。 しかし、 m8 株を用いた応用研究と平成 13 年度の千葉県血精研究所における実製造 の経験から、 m8株の培養過程でラージプラークを形成するリバータント (復帰突然変異体） が出現することが明らかになった。 リバ一タントは プラーク純化した m8からも出現することから、 リバ一タントウィルスの 出現は m8株の避けがたい性質であり、 リバータン卜の性状は mO株に酷 似し、 皮膚での増殖能が昂進していることから、 リパータン卜の混入は ワクチンの安全性に懸念を生じかねないことが判明した。
また、 ワクシニアウィルスは、 広い宿主域と高い発現効率を有してい るという理由で、 他の外来遺伝子を導入し、 ベクターとして用いられて いた （特表平 1卜 509091 )。 前述の LC 16m0株や LC 16m8株もその高い安全性 から、 ベクタ一としての使用について検討されていた。
しかし、上述のように LC 16m0株は皮膚増殖性の面で問題があり、LC 16m8 株はリバ一タントの出現という問題があつたので、 痘瘡ワクチン株ある いはべクタ一ウィルスとしてより安全性の高いウィルス株を作出する必 要性があった。 発明の開示
本発明は、 リバ一ジョン （先祖帰り） を起こしにくいワクチン株を作 出し、 より安全性の高い痘瘡ワクチンを提供することを目的とする。 更 にそのウィルスを利用して外来遺伝子を安全に発現するためのベクター ウィルスを提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、 リバ一ジョン に関わる遺伝子がウィルスの宿主城やプラークサイズに鬨わる B5R遺伝 子であることを突き止めた。 つまり、 BI8株では B5R遺伝子が or f 内での 1 塩基欠失によるフレームシフトで orf の大部分が失われることにより 失活しているが、 リパータントでは新たに別の箇所に塩基の挿入が起こ ることによって or f が復元されていることを明らかにした （図 1および 2 )。 の B5R遺伝子の塩基配列を配列番号 1に、 B5R遺伝子産物のアミ ノ酸配列を配列番号 2に示す。m0株では B5R遺伝子の oriは完全である。 そこで、 まず mO株の B5R遺伝子をクローニングし、 m8 株に相同組換え によって導入し、 完全な B5R遺伝子を持つ組換えウィルス （RVV) を作製 した （m8B5R)。 この RVVのスクリーニングはラージプラークを選択し、 さらに B5R遺伝子をシーケンスすることによって行った。 次に、 プロモ 一夕一領域を含む B5R遺伝子全体を完全に欠失させたコンス トラク トと を作製し （A B5R、 図 6 )、 相同組換えによって m8B5Rと mO株に B5R遺伝 子の欠失を導入した RVV (それぞれ m8AB5R (以下 ηι8 Δと称することもあ る）、 mOAB5R (以下 πιΟ Δと称することもある）） を作出した。 さらに、 B5R 遺伝子の膜貫通領域を取り除き、 高発現プロモーター PSFJ 1-10につない だコンストラク トを作成し （proB5RdTM、 図 6 )、 同様に m8 B5Rと mO株に 導入した （それぞれ m8proB5RdTM (以下 m8dTM と称することもある）、 m0proB5 dTM (以下 mOdTM と称することもある）） を作出した。 RVV のス クリーニングは小さなプラークを選択し、 さらにゲノムのシーケンスを 確認することによつた。
B5R遺伝子の欠失を導入した 2種類の RVV (m8AB5R、 mOAB 5R) と、 B5R 遺伝子の機能を欠失させて高発現させた 2 種類の RVV (m8proB5RdTM、 m0proB5RdTM) の遺伝的安定性を m8株と比較するため、 製造と同じ培養 温度 （30°C ) 及び 34°Cでこれらのウィルスを初代ゥサギ腎細胞に 7代継 代し、 更にリバ一タントを選択的に増幅して検出を容易にするため Vero 細胞に 34°Cで 2代継代してラージプラークの比率を測定した。 対照とし て再クロ一ニングした m8株 （m8rc) を用いた （図 8 )。 その結果、 m8rc では 30°C継代で 8. Ί%、 34 継代では 60.3%のウィルスが、ラージブラー クを形成したのに対し、 これら 4種類の RVVではいずれの温度において もラージプラークが検出されなかった。 m8rcから出現したラージブラ一 クを形成するクローンの B5R遺伝子を調べたところ全てで挿入変異によ る oriの回復が認められた。
以上の結果から、 ni8AB5R、 mOAB5R, m8proB5RdTMおよび m0proB5RdTM は m8株に比べ遺伝的な安定性が高いことが証明された。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
[1 ]ワクシニアウィルス株 LC16株、 LC16m8株または LC16m0株の B5R遺 伝子の一部または全部が欠失しており、 正常な機能を有する B5R遺伝子 産物を産生しないワクシニアウィルスからなる痘瘡ワクチンであって、 正常な機能を有する B5R遺伝子産物の産生を引き起こす復帰突然変異を 起こしにくい痘瘡ワクチンウィルス、
[2] B5R遺伝子を完全に欠失している、 [1 ]の痘瘡ワクチンウィルス、 [3] B5R遺伝子の一部が欠失し、 正常な機能を有する B5R遺伝子発現産 物が産生されない、 [1 ]または [2 ]の痘瘡ワクチンウィルス、
[4] RK13細胞に感染させたときのプラークサイズおよびゥサギに投与 したときの皮下増殖性が LC 16m8株と同等である [ 1 ]から [ 3 ]のいずれか の痘瘡ワクチンウィルス、
[5] B5R遺伝子の一部が欠失し、 該 B5R遺伝子の上流にプロモーターを 連結させ、 B5R遺伝子の一部が発現するが、 該発現産物は B5R遺伝子発現 産物の正常な機能を失っている、 [1 ]から [4]のいずれかの痘瘡ワクチ ンウィルス、
[6 ] B5R遺伝子の膜貫通ドメインが欠失している、 [3 ]から [5 ]のいず れかの痘瘡ワクチンウィルス、 [7 ] プロモーターが PSF - 10、 PSFJ2- 16または他のボックスウィルス 用高発現プロモーターである、 [5]または [6]の痘瘡ワクチンウィルス
[8 ] B5R遺伝子のうち膜貫通ドメインの全部または一部が欠失してい るワクシニアウィルスよりなる痘瘡ワクチンウイ レス、
[9 ] B5R遺伝子の上流にプロモーターが連結し、 B5R遺伝子の一部が発 現するが、該発現産物は B5R遺伝子発現産物の正常な機能を失っている、 [8 ]の痘瘡ワクチンウィルス、
[1 0] プロモーターが PSFJ1_10、 PSFJ2-16または他のボックスウィル ス用高発現プロモーターである、 [8]または [9]の痘瘡ワクチンウィル ス、
[1 1] [1]から [1 0]のいずれかの痘瘡ワクチンウィルスを含む痘瘡 ワクチン医薬組成物、
[1 2] ワクシニアウィルス株 LC16株、 LC16m8株または LC16mO株の B5R 遺伝子の一部または全部が欠失しており、正常な機能を有する B5R遺伝子 産物を産生しないワクシニアウィルスベクターであって、 正常な機能を 有する B5R遺伝子産物の産生を引き起こす復帰突然変異を起こしにくい ワクシニアウィルスベクター、
[1 3] B5R遺伝子を完全に欠失している、 [1 2]のワクシニアウィルス ベ々々一
[1 4] B5R遺伝子の一部が欠失し、 正常な機能を有する B5R遺伝子発現 産物が産生されない、 [1 2]または [1 3]に記載のワクシニアウィルス ベ /7タ■ _
[1 5 ] ゥサギ腎臓細胞に感染させたときのプラークサイズおよびゥサ ギに投与したときの皮下増殖性が LC16m8株と同等である [1 2]から [1 4]のいずれかのワクシニアウィルスベクター、
[1 6] B5R遺伝子の一部が欠失し、 該 B5R遺伝子の上流にプロモーター を連結させ、 B5R遺伝子の一部が発現するが、 該発現産物は B5R遺伝子発 現産物の正常な機能を失っている、 [1 2 ]から [1 5 ] のいずれかのワク シニアウィルスベクター、
[1 7 ] B5R遺伝子の膜貫通ドメインが欠失している、 [1 2 ]から [1 6 ] のいずれかのワクシニアウィルスベクタ一、
[1 8] プロモーターが PSFH- 10、 PSFJ2- 16または他のボックスウィル ス用高発現プロモーターである、 [1 6 ]または [1 7 ] のワクシニアウイ ルスベクター、
[ 1 9 ] B5R遺伝子のうち膜貫通ドメインの全部または一部が欠失して いるワクシニアウィルスベクター、
[2 0 ] B5R遺伝子の上流にプロモーターが連結し、 B5R遺伝子の一部が 発現するが、 該発現産物は B5R遺伝子発現産物の正常な機能を失ってい る、 [ 1 9 ]のワクシニアウィルスベクター、
[2 1 ] プロモーターが PSFn- 10、 PSFJ2- 16または他のボックスウィル ス用高発現プロモーターである、 [1 9 ]または [2 0 ] のワクシニアウイ ルスベクター、
[2 2 ] 外来遺伝子を含む [ 1 2 ]カゝら [2 1 ]のいずれかのワクシニアゥ ィルスベクター、
[2 3 ] 外来遺伝子がウィルス、 細菌、 原虫または癌の抗原である [2 2 ]のワクシニアウィルスベクター、 ならびに
[2 4] [2 3]のワクシニアウィルスベクターを含む、ウィルス、細菌、 原虫または癌用ワクチンウィルス医薬組成物。 図面の簡単な説明
図 1は、 LC16mO株、 LC16m8株および LC16m8株のリバ一タントの B5R遺伝子 の塩基配列を示す図である。
図 2は、 LC16mO株、 LC16m8株および LC16m8株のリパー夕ン卜の B5R遺伝子 産物のアミノ酸配列を示す図である。
図 3は、 Lister株から LC16m8への継代を示す図である。 図 4は、 Lister株、 LC16mO株および LC16m8株の特徴を示す図である。 図 5は、 LC16m8株、 LC16m8株のリバ一タントである LPC (Large Plaque
Clone) および LCI 6m0株のプラークサイズを示す図である。
図 6は、 B5R遺伝子を欠失したウィルスの構築方法の概念図である。
図 7は、改良型ウィルスを感染させた RK13細胞画分の B5Rタンパク質発現 をウェスタンプロッ トで確認した結果を示す写真である。
図 8は、 改良型ウィルスの細胞継代培養によるリバータン卜の出現頻度 を示す図である。
図 9は、 改良型ウィルスのゥサギにおける皮膚増殖性を示す図である。 図 1 O Aは、 ウィルスを投与した SCIDマウスの体重減少を示す図である。 図 1 0Bは、ウィルスを投与した SCIDマウスの体重減少を示す図である。 図 1 1は、ウィルスを投与した SCIDマウスにおける RED50の経時的変化 を示す図である。
図 1 2は、強毒ワクシニアウィルスで攻撃した BALB/cマウスの体重減少 を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のワクシニアウィルスは、 ワクシニアウィルス、 例えば、 LC16 株、 LC16niO株または LC16m8株の B5R遺伝子の総てまたは一部を欠失さ せることにより作出することができる。 B5R 遺伝子は、 エンベロープに 存在するタンパク質をコードしており、 B5R 遺伝子産物は、 ウィルスの 感染に関与している。 B5R 遺伝子が存在すると、 皮膚増殖性が大きく、 ヒ トに投与した場合、 自己接種等の副作用を引き起こすという問題があ つた。 LC16m8株は、 B5R遺伝子中の一塩基のフレームシフト変異により、 B5R 遺伝子産物が産生されず、 皮膚増殖性は弱くなつていたが、 復帰突 然変異により正常な機能を有する B5R遺伝子産物が産生されるようにな り （リバ一ジョン）、 病原性が復活するおそれがあった。
本発明のワクシニアウィルスでは、 B5R 遺伝子の総てまたは一部が欠 失しているため、 mOAB5R株においては、 親株の LC16mO株の元来有して いた病原性が低下し、 m8AB5Rにおいては、 親株の LC16in8株の復帰突然 変異により リバ一タントが生じることがない。
本発明における B5R遺伝子の欠失は、 B5R遺伝子が発現しないかある いは発現してもその発現タンパク質が B5R遺伝子産物の正常な機能を保 持していないような欠失である。 本欠失は、 ウィルスの点突然変異によ り形質が復帰するようなものではなく、 一旦失われた B5R遺ィ云子産物の 正常な機能が復帰することのない欠失である。 例えば、 LC16in8株は、 突 然変異により B5R遺伝子の塩基の一つが欠失しフレームシフ トを起こし, B5R遺伝子の 0RFがずれ、正常な B5Rが発現しなくなっている 。 しかし、 一塩基欠失部分の近傍の点突然変異により塩基一つが挿入されることに より B5R遺伝子の 0RFが元に戻り、 正常な機能を有する B5R 発現する ようになり、 先祖帰りを起こす。 本発明の欠失はこのような i¾突然変異 により先祖帰りを起こしうる欠失を含まない。 B5R遺伝子は、 SCR1 から SCR4までの短コンセンサス領域 （Short consensus region) よび膜貫 通ドメイン （TM:Transmembrane Domain) からなり、 膜貫通 ドメインが B5R遺伝子産物の機能に重要な働きをする。従って、 B5R遺伝チの欠失は、 膜貫通ドメインの欠失でもよい。 また、 膜貫通ドメインだけではなく、 SCR1から SCR4の一部が欠失していてもよい。 この場合、 欠失は各領域 をコードする 丽 Aの総ての欠失でも、 あるいは各領域をコー ドする DNA の一部が欠失することにより、 正常な機能を有する B5R遺伝子産物が産 生されなくなるような欠失でもよい。 好適には、 B5R 遺伝子の欠失は、 B5R 遺伝子総ての欠失または膜貫通ドメイン総ての欠失である。 また、 B5R 遺伝子のプロモーターをも欠失させるのが望ましい。 このような欠 失は、 公知の相同組換え法により行うことができる。
相同組換えとは、 細胞内で 2つの DNA分子が同じ塩基配列 して相互 に組換えを起こす現象で、ワクシニアウィルスのような巨大なゲノム DNA を持つウィルスの組換えにしばしば用いられる方法である。 まず、 標的 とするワクシニアウィルス遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、 プ 口モーターと外来遺伝子を連結したプラスミ ド （これをトランスファ一 ベクターという） を構築し、 これを、 ワクシニアウィルスを感染させた 細胞に導入してやると、 ウィルス複製の過程で裸になったウィルス DNA とトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、 挟み込まれたプロモーターと外来遺伝子がウィルスゲノム中に組み込ま れる。例えばトランスファーベクターとして、 ワクシニアウィルスの B4R 遺伝子から B6R遺伝子の領域をプラスミ ドにクローニングし、 B4R遺伝 子と B 6R遺伝子の間に位置する B 5R遺伝子の全領域を欠失させたプラス ミ ド） または B 5R遺伝子の一部を欠失させたプラスミ ドを作製して、 こ れをワクシニアウィルス感染細胞に導入する。 細胞としては、 BSC- 1 細 胞、 HTK- 143細胞、 Hep2細胞、 MDCK細胞、 Ve ro細胞、 HeLa細胞、 CV 1細 胞、 COS細胞、 RK 13細胞、 BHK-2 1細胞、 初代ゥサギ腎臓細胞等ヮクシ二 ァウィルスが感染しうる細胞を用い得る。 また、 ベクターの細胞への導 入は、 リン酸カルシウム法、 カチォニックリボゾーム法、 エレク トロポ レーション法等の公知の方法で行えばよい。 組換え体を同定しやすくす るため、 相同組換えにより分断され機能を失う導入部位の遺伝子には選 択マ一カーとなり得る遺伝子 （例えば B5R遺伝子、 HA 遺伝子および TK 遺伝子等） を用いる場合が多い。 ワクシニアウィルス遺伝子の塩基配列 情報を基にトランスファーベクターを設計 ' 作製し、 該トランスファー ベクターを用いて破壊しょうとする遺伝子を相同組換えすればよい。 ト ランスファーベクターは、 D. M. Gl ove r他編、 加藤郁之進 監訳 DNA ク ローニング 4一哺乳類のシステム一 （第 2版） TaKaRa等に記載の方法に 従って作製することができる。 相同組換えを起こした相同組換え体の選 別方法としては、 選択した標的遺伝子によって、 プラークサイズ （B 5R 遺伝子の場合）、 プラークの赤血球吸着の有無 （HA遺伝子）、 BudR薬剤耐 性 （TK遺伝子） 等の選択方法を用いればよい。 あるいは、 PCR法でもサ ザンブロッテイング法のいずれの方法をも用いること力 sできる。 B5R 遺伝子産物は感染細胞表面およびウィルスのエンベロープに存在 し、 隣接の細胞、 あるいは宿主体内の他の部位にウィルスが感染 · 伝播 するときに、 感染効率を高める働きをし、 ウィルスのプラークサイズお よび宿主域にも関与している。 例えば、 B5R遺伝子を欠失させると、 RK 13 細胞等の動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、 孵 化鶏卵の漿尿膜上におけるボックサイズも小さくなる。 また、 Vero細胞 中でのウィルス増殖性は著しく低下する。 さらに、 ゥサギに皮内投与し たときの皮膚増殖能は低下し、 皮膚病原性が低下する。 従って、 B5R 夕 ンパク質の機能が欠失しているかどうかは、 RK13細胞に感染させたとき に形成されるプラークサイズ、 ボックサイズ、 Vero細胞でのウィルス増 殖性、 ゥサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。 ま た、 ワクシニアウィルスの遺伝子配列を調べてもよい。 本発明のヮクシ ニァウィルスは、 B5R遺伝子機能を有する L i s t e r株や LC 16mO株に比較 して、 動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、 ポッ クサイズが小さくなり、 Ve ro細胞でのウィルス増殖性、 皮膚病原性等も 低下しており、 LC 16m8株と比較して、 動物細胞に感染させた場合のブラ ークサイズ、 ボックサイズが同等であり、 ゥサギ腎臓細胞でのウィルス 増殖性、 Ve ro 細胞でのウィルス増殖性、 皮下病原性等も同等である。 LC 16mO 株と LC 16m8 株をゥサギ腎細胞に感染させた場合のプラークサイ ズを図 5に、 LC 16mO株と LC 16m8株 （リクローニングされた LC 16m8株） のゥサギにおける皮膚増殖性を図 9に示す。 さらに、 B5R 遺伝子を欠失 させると、 動物に接種した場合の病原性も低下する。 例えば、 SC IDマウ スにウィルスを腹腔内接種し、 経時的に体重を測定した場合、 正常な機 能を有する B5R遺伝子産物を産生するウィルス株では、 105PFUのウィル スを接種後 2週間程度で発痘が認められ、 体重が減少し始めるが、 正常 な機能を有する B5R遺伝子産物を産生しないウィルス株では、 107PFUの ウィルスを接種しても発痘は認められず、 体重の減少も認められない。 また、 動物に接種した場合の病原性を RED50 (半数の個体に発痘を起こ し得るウィルス量） を指標に調べた場合、 正常な機能を有する B5R遺伝 子産物を産生するウィルス株では正常な機能を有する B5R遺伝子産物を 產生しないウィルス株に対して 2 log以上高い値を示す。 図 1 0 A、 図 1 0 Bおよび図 1 1に SCIDマウスに対する病原性を示す。 本発明における 正常な機能を有する B5R遺伝子産物とは、 野生型 B5R遺伝子がコ ードす る遺伝子産物が有する機能と同一の機能を有する遺伝子産物で ¾り、 上 記の性質を有する。
また、 B5R遺伝子を完全に欠失したウィルス株でも、 感染防御倉 は B5R 遺伝子を有するウィルス株に比べ遜色ないという結果は得られているが (図 1 2 )、 B5R遺伝子産物は、 対痘瘡ワクチンの感染防御抗原として重 要であるという報告もあるため、 痘瘡ワクチンとして用いる場合は B5R 遺伝子産物の一部が産生されていたほうが望ましい可能性もある。 従つ て、 本発明のワクシニアウィルスにおいて、 B5R 遺伝子がその 現産物 の抗原性を維持したまま正常な機能が失われた形で発現されてちょい。 このためには、 B5R遺伝子のうちの一部、 例えば SCR1から 4の一部また は全部のみが発現されるようにウィルスを設計すればよい。 ま こ、 より ワクチンの抗原性を高めるためにこれらの領域がより多量に発現される ように設計してもよい。 このためには、 一部欠失させた B5R遺伝子の上 流に高発現プロモーターを機能し得る形で連結させればよい。 用いるプ 口モーターとして、 例えば psFn- 10、 PSFJ2- 16や p7.5Kプロモーター、 P11Kプロモーター、 T7.10プロモーター、 CPXプロモ一夕一、 HF プロモ 一夕一、 H6プロモータ一、 T7ハイブリ ツ ドプロモーターなどの（也のポッ クスウィルス用高発現プロモーター等が挙げられる。
本発明において、 B5R遺伝子を完全に欠失した LC16mO株、 LC16m8株を それぞれ、 m0AB5R、 m8AB5Rと称し、 それぞれ、 ιηΟΔ、 ϋΐ8Δと称するこ とがあり、 B5R 遺伝子のなかの膜貫通ドメインを欠失し、 上流にプロモ 一夕一を連結させ高発現性とした LC16mO 株、 LC16m8 株をそれぞれ、 mOproBSRdTM, m8proB5RdTM と称し、 それぞれ m0dTM、 m8dTM と称するこ とがある。
LC16mO株は、 Lister株から LC16株を経て作出された株であり、LC16m8 株は、 さらに LC16mO 株から作出された株である （蛋白質 核酸 酵素 Vol.48 No.12 (2003), p.1693 - 1700)。 L is ter株から LC 16m8株の単離は、 図 2に示すような工程で行われ、 LC16m0 株および LC16m8 株は、 千葉県 衛生研究所、 から入手することができる。
本発明の B5R遺伝子を欠失した LC16m0株および LC16m8株は、 リバー ジョンを起こすことなく安全な痘瘡ウィルスワクチンとして用いること ができる。
また、 本発明は、 上記の B5R遺伝子を欠失した LC16株、 LC16m0株お よび LC16m8株からなるワクシニアウィルスベクタ一を包含する。
該ベクターには、 所望の外来遺伝子を導入することができる。 上記の 相同組換えの手法を用いることにより、 理論的にはワクシニアウィルス ゲノムのどの部位にも外来遺伝子を導入することができる。 相同組換え は上述の方法で行えばよい。 例えば、 導入したい部位の DNA配列中に導 入すべき外来遺伝子を連結したプラスミ ド （トランスファーベクター） を作製し、 これを、 ワクシニアウィルスを感染させた細胞の中に導入す ればよい。 トランスファ一ベクターとして、例えば pSFJl-10、 pSFJ2 - 16、 P匪 4、 pGS20, pSClK pMJ60K p200K pBCB01-3, 06、 pTKgpt- F 1- 3s、 pTMK pTM3、 pPR34, 35、 pgpt- ATA18_2、 pHESl-3 等を用いることができる。 外 来遺伝子の導入領域は、 ヮクシニアウィルスの生活環に必須でない遺伝 子中であり、 例えば赤血球凝集素（HA)遺伝子、 チミジンキナーゼ （TIO 遺伝子、 F フラグメント等が挙げられる。 また、 上記の B5R 遺伝子領域 中 （B4R遺伝子と B6R遺伝子の間） に導入してもよい。 導入する部分の 遺伝子は、 それが欠失することによりウィルスの形質に変化し組換え体 の選択が容易になるものが望ましい。 例えば、 HA 遺伝子の場合では HA 遺伝子中に外来遺伝子が導入された組換え体では、 HA遺伝子が導入され た外来遺伝子によって分断され、 機能を失う。 そのためプラークはニヮ トリの赤血球を吸着しなくなるため白く見えるようになるので、 組換え 体を容易に選別することができる。 また、 TK遺伝子中に外来遺伝子 導 入された組換え体では、 TK遺伝子の機能が失われ、 5 -プロモデォキシゥ リジン（BudR)が致死的に作用しないので、 BudRにより選別することがで きる。 また、 B 5R 遺伝子中に外来遺伝子を導入した場合は、 組換え体の プラークが小さくなるのでプラークのサイズで選別することができる 。 ワクシニアウィルスを感染させる細胞としては、 Ve ro細胞、 HeLa細胞、 CV 1細胞、 COS細胞、 RK 13細胞、 BHK- 2 1細胞、 初代ゥサギ腎細胞、 B SC - 1 細胞、 HTK- 143細胞、 Hep2細胞、 MDCK細胞等、 ワクシニアウィルスが感 染しうる細胞を用い得る。
また、 外来遺伝子を導入する際、 外来遺伝子の上流に適当なプロモー ターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。 プロモータ一は、 限定 はないが、 上述の PSF JH- 10や、 PSFJ 2- 16、 p7. 5Kプロモーター、 p l lK プ 口モーター、 T7. 10プロモーター、 CPXプロモーター、 HFプロモーター、 H6プロモーター、 T7ハイブリツ ドプロモーター等を用いることができ る c 本発明のヮクシニアウィルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、 組換えヮクシニアウィルスベクターを構築する公知の方法により行う こ とができ、 例えば別冊 実験医学 ザ ' プロ トコールシリーズ 遺伝子 導入 &発現解析実験法 斎藤泉他編集、羊土社（ 1997年 9月 1 日発行）、 あるいは、 D. M. Gl ove r他編、 加藤郁之進 監訳 DNAクローニング 4ー哺 乳類のシステム一 （第 2 版） TaKaRa、 EMBO Journa l ( 1987 年 6 卷 P. 3379- 3384等の記載に従えばよい。
このようにして、 外来遺伝子を導入したワクシニアウィルスベクタ一 を用いて該外来遺伝子を製造することができる。 この際、 外来遺伝子を 導入したワクシニアウィルスベクターを適当な宿主細胞に感染させて該 宿主細胞を培養すればよい。 宿主細胞としては、 上述の種々の動物細胞 を用いることができる。 培養は、 動物細胞の公知の培養条件に従えばよ い。 さらに、 外来遺伝子としてウィルス、 細菌、 原虫および癌等の抗原を コードする遺伝子を導入することにより、 外来遺伝子を導入したヮクシ ニァウィルスベクターを種々のウィルス、 細菌、 原虫および癌に対する ワクチンとして用いることができる。 例えば、 ヒト免疫不全ウィルス、 肝炎ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ミコバクテリア、 マラリア原虫、 重 症急性呼吸器症候群（SARS サーズ）ウィルス等の感染防御抗原 （中和抗 原）、 あるいは癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。 本発明は、 これらの抗原を導入したワクシニアウィルスベクタ一も包含する。
さらに、 本発明は、 本発明の B5R遺伝子が欠失したワクシニアウィル スを含む痘瘡ワクチン医薬組成物、 本発明の B5R遺伝子が欠失したワク シニアウィルスの痘瘡ワクチンとしての使用およびワクシニアウィルス を被験体に投与し、 天然痘の感染を防御する方法を包含する。
本発明のワクチン医薬組成物の投与方法、 投与量等は、 既にワクチン として用いられている公知のワクシニアウィルスワクチンと同様である- 本発明のワクチン医薬組成物は、 医薬的に有効量の本発明のワクシニア ウィルスワクチンを有効成分として含んでおり、 無菌の水性又は非水性 の溶液、 懸濁液、 又はエマルションの形態であってもよい。 さらに、 塩、 緩衝剤、 アジュパント等の医薬的に許容できる希釈剤、 助剤、 担体等を 含んでいてもよい。 本発明のワクチン医薬組成物の投与は種々の非経口 経路、 例えば、 皮下経路、 静脈内経路、 皮内経路、 筋肉内経路、 腹腔内 経路、 鼻内経路、 経皮経路によればよいが、 この中でも皮内投与が好ま しい。 医薬的な有効投与量は、 所望の生物学的効果、 この場合にはウイ ルス抗原に対する細胞性免疫応答又は体液性免疫応答の少なく とも一つ を得るのに充分である量である。 有効投与量は被験体の年齢、 性別、 健 康、 及び体重等により適宜決定することができる。 例えば、 限定されな いが、 ヒ ト成人に対して、 投与当たり約 102〜101 Gボック形成単位（PFU) 又はプラーク形成単位（PFU)、 好ましくは 105〜106ボック形成単位（PFU) 又はプラーク形成単位（PFU)である。 さらに、 本発明は、 B5R 遺伝子が欠失しており外来遺伝子を導入した ワクシニアウィルスベクターであって、導入した外来遺伝子がウイルス、 細菌、 原虫および癌の抗原をコードする、 ワクシニアウィルスのヮクチ ン医薬組成物、 および該ヮクチンの使用および該べク夕一を被験体に投 与し、 ウィルス、 細菌、 原虫および癌等の感染を防御あるいは治療する 方法を包含する。 該ワクチン医薬組成物の投与方法、 投与量とは上述の 痘瘡ワクチン医薬組成物に準ずればよい。
次に、 本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例 1 B5R遺伝子欠失ミユータントおよび一部欠失 B5R高発現組換 え体の構築
B5R遺伝子欠失用 トランスファーベクター（PB4R+B6R)の構築
B4Rの TAクローニング
m8 株の精製ゲ ノ ム DNA を铸型 と して、 2 つ の プ ラ イ マー (GATGCTGTTGTGCTGTGTTTGC (配列番号 3 ) と GTTAACACTGTCGAGCACTAAAAGG (配列番号 4)) によって B4R遺伝子を増幅し、併せて oriの 3，側に Hpal 部位を導入した。 これを TA ベクター （pCR II) にクローニングした (pB4R+HpaI)。 pB4R+HpaIの塩基配列を確認した後、 これを铸型に 2つの プ ラ イ マ ー （ GATGCTGTTGTGCTGTGTTTGC ( 配 列 番 号 5 ) と TTGTGTGGAATTGTGAGCGGA (配列番号 6 )) によって B4R遺伝子全領域と TA ベクターのマルチクローニング部位を増幅した。 この PCR産物を精製後、 T4DNAポリメラ一ゼで両端を平滑化した（B4R+HpaI フラグメント）。
B6Rの TAクロ一ニング
m8 株の精製ゲ ノ ム DNA を踌型 と して、 2 つ の プラ イ マー (GTTAACGTTCCATAAATTGCTACCG (配列番号 7 ) と GTGTGACCTCTGCGTTGAATAG (配列番号 8 )) によって B6R遺伝子を増幅し、併せて oriの 5'側に Hpal 部位を導入した。 これを TAベクタ一にクローニングした（pB6R+HpaI)。 B4Rと B6Rの連結
PB6R+Hpal の塩基配列を確認した後、 Hpal で消化し、 BAPで脱リ ン酸 化した。 次に、 B4R+HpaIフラグメントと混合しライゲーシヨンした。 こ の混合物を铸型にして、 プライマー ps/hr- si (TCGGAAGCAGTCGCAA CAAC (配列番号 9 ))と ps/hr- asl (ATACCATCGTCGTTAAAAGCGC (配列番号 1 0)) によって、 連結した B4R遺伝子と B6R遺伝子の一部領域を増幅した。 こ の PCR 産物を TA ベクタ一にクローニングし、 塩基配列を確認 した (PB4R+B6R)。 一部欠失 B5R 高発現組換え体用 トランスファーベクター （PB4R+B6R proB5RdTM)の構築
mO 株の精製ゲ ノ ム DNA を鍀型 と し て、 2 つ の プラ イ マー ( ATGAAAACGATTTCCGTTGTTACG ( 配 列 番 号 1 1 ) と TCAATGATAAGTTGCTTCTAACGA (配列番号 1 2 )) によって B5R 遺伝子の ectodomain領域 （SCR1から SCR4までの領域） のみを増幅し、 これを TA ベクターにクローニングした（pB5RdTM)。 pB5RdTMの塩基配列を確認した 後、 制限酵素 Pstlで切断した後、 T4DNAポリメラーゼで平滑化し、 さら に Sad で切断して B5RdTMフラグメントを切り出した。 これを Sma I と Sad で消化したトランスファーベクター pSFn- 10 に連結した（pSFJdTM)。 次に pSFJdTMを Hpal と Saclで消化して、 プロモーター + B5RdTMのフラ グメント （proB5RdTM)を切り出した。 これを、 Hpal と Sacl で消化した PB4R+B6Rに連結した (pB4R+B6R proB5RdTM)。
組換えウィルスの作成
35mmディ ッシュに 80%コンフルェントに培養された RK13 細胞または P K細胞にワクシニアウィルス（m8B 5Rの場合は m8株、 m8 Δと m8p roB 5RdTM の場合は m8B5R、 ιηΟΔと m0proB5RdTMの場合は mO株） を moi = 0.02で感 染させ、 室温で 1時間吸着後、 LipoiectAMINE PLUS (Invitrogen)と混合 したトランスファーベクタープラスミ ド DNA (m8B5Rの場合は pB5R、 m8 Δと πιΟΔの場合は pB4R+B6R、 m8proB5RdTM と m0proB5RdTM の場合は PB4R+B6R proB5RdTM) をマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、 3 4でにて 2 日間培養した。 細胞を凍結融解後、 ソニケ一シヨンし、 ほ ぼコンフルェントになった RK13細胞に適当に希釈して接種し、 0.8%メチ ルセルロースを含む Eagle MEM, 5%FCS培地を加え、 34°Cで 2から 3 日間 培養した。ニュートラルレツ ドを最終濃度 0.01%になるように加え、 34 で 3 時間細胞を染色した後、 培地を除き、 フエノ一ルレッ ドを含まない Eagle MEM培地で 2度細胞面を洗い、 m8B5Rの場合はラージプラークを、 πι8Δ、 m8proB5RdTM, m0△および ] n0proB5RdTMの場合はスモールプラーク をチップの先で搔き取り、 Eagle MEM 培地に浮遊させた。 採取したプラ —クの浮遊液をソニケーション後、 その 200 Lを 15, OOOrpm, 30分間遠 心し、 沈査に 50 L の滅菌蒸留水または lOmMTris- HC1 (pH7.5)を添加し た。 30秒間ソニケーション後、 95°Cで 10分間加熱してゲノム DNA を抽 出し、 PCRによるスクリ一二ングに供した。ηι8Δと πιΟΔの場合は ps/hr - si と ps/hr-asl によって、 m8proB5RdTMと m0proB5RdTMの場合は ps/hr- si と B5R793as (GATCCGAAGAATGATATCCC) (配列番号 1 3 )によって PCRを行い、 所定の大きさの PCR プロダク トが検出されたクロ一ンについて、 PCR プ ロダク 卜の塩基配列をダイレク トシーケンスにより確認した。 塩基配列 に問題が無いクローンを選択し、 RK13細胞にてさらに 2から 3回ブラ一 ク純化した。 全てのウィルスは RK13細胞にて大量培養した後、 35 (W/V) % シユークロースクッションを用いた超遠心によって精製濃縮し、 RK13細 胞にてウィルス力価を測定し、 実験に供した。
図 6に B5R遺伝子を欠失したウィルスの構築図を示す。
実施例 2 B5 遺伝子欠失ミユータントおよび一部欠失 B5R高発現組換 え体における B5Rタンパク質の発現の確認
4種類の改良型ウィルス （πι8Δ、 mOA , m8proB5RdTM、 m0proB5RdTM) を、 RK13 細胞に moi = 10 で感染させ、 感染後 1 日の感染細胞画分の B5R タンパク質発現をウエスタンプロッ トで確認した （図 7 a)。 ウエスタン ブロッ 卜の一次抗体には抗 B5Rラッ トモノク口一ナル抗体 （SCR2領域を 認識） を用 い、 ECL Western Blotting Detect ion System (Amers am Biosciences K. K. )で特異的なバンドを検出した。
m8B5R (m8株に野生型 B5R遺伝子を導入したもの） と mO株では同じ分 子量の B5R夕ンパク質のバンドが確認され、 高発現タイプの改良型ウイ ルス （m8proB5RdTM、 m0proB5RdTMでは、 短い B5R産物の発現)^確認され た。 m8rc (リクローニングした m8株）、 πι8Δおよび ιηΟΔでは、 B5R遺伝 子産物は検出されなかった （図 7a)。
さらに、 培養上清中に分泌された B5R蛋白質を検出するため、 上記と 同じ培養条件で， m8proB5RdTM, m0proB5RdTM, m8B5R, m0， LC16, Wyeth株を感 染させ、 培養した培養上清を 12.5%TCAで濃縮し、 ウェスタンブロッ トで 確認した （図 7b)。 1次抗体には抗 B5Rゥサギポリクローナ レ抗体を用 い、 ECL Plus Western Blot t ing Detect ion System (Amersham Biosciences K. K. )で検出した。 細胞画分は全体の 1/40量、 培養上清は 1/10 量をアブ ライした。
TM ドメインを欠く B5R蛋白質を発現する m8proB5RdTMと m0proB5RdTM では細胞画分に比して大量の B5R蛋白質が培養上清画分に検 されたの に対し、 他のウィルス株では分子量の小さい（約 35Kd)B5R蛋白質が細胞 画分と同程度の量検出された。
実施例 3 リバータント出現頻度の確認
4種類の改良型ウィルス （ηι8Δ、 πιΟΔ、 m8proB5RdTM、 m0proB5RdTM) を製造用細胞である PRKに mo i = 0で 7代まで、それぞれ 30°C と 34°Cで 継代培養した後、 34°Cで vero細胞に 2代継代培養し、 リバ一夕 ン トの出 現の有無を、 RV含有量を測定して確認した。 リバータント含有量は、 RK13 細胞でのウィルス力価に対する vero 細胞によるウィルス力価の比とし て計算した。 対照としてリクローニングした m8株（m8rc)を用 た。 図 8 にリバータン卜の出現頻度を示す。
4種類の改良型ウィルスでは PRK細胞に 7代継代してもさら にその後 に ve ro 細胞でリバ一タントを選択的に増幅させてもリパータントは出 現せず、 リバージョンが起こりにくいウィルスであることが証明された。 一方、 リクローニングされた m8株（m8rc)からはリバ一タントが検出さ れ、 ve ro細胞でリバ一タントを選択的に増幅すると、 m8 rcでは PM細胞 1代培養ですでにリバータン卜が出現しており、 m8株では容易にリバー ジョンが起こることが判明した。 実施例 4 改良型ウィルスのゥサギにおける皮膚増殖性
改良型ウィルス （ηι8 Δ、 πιΟ Δ、 m8p roB5RdTM, m0p roB5RdTM) について、 ゥサギ皮膚接種試験で、 ErD50 (Eryt hema Do s e 50, 接種部位の 50%に 1 cm 以上の発赤を起しうるウィルス量） を測定し、 皮膚での増殖性を評価し た。 対照として、 mO株、 m8 rcおよび m8株に野生型 B5R遺伝子を導入し た m8B5Rを用いた。
3. 5kg 以上の日本白色種の背中の毛を刈り、 硫化バリウムで完全に除 毛した翌日、 10倍階段希釈したウィルスを 0. lmLずつ皮内接種した。 1 羽当り 2系列、 うち 1系列は肩から尻へ、 もう 1系列は逆方向に、 高ド ーズから低ドーズへと接種した。 1サンプル当り 2羽 （4箇所/ドーズ） 用いた。 接種後毎日、 7 日間、 接種部位の発赤径を計測し、 10mmを超え る発赤を陽性として極期の反応を基に ErD50 を t he Reed and Muench me thodによって算出した。 図 9にゥサギにおける皮膚増殖性を示す。
B5R遺伝子が活性を持つウィルス （m8B 5R、 mO株） は皮膚での増殖力が 強く ErD50値が低い（1. 00, 2. 25)のに対し、 B5R遺伝子を欠いたウィルス (m8 rc, m8 Δ , mO△ )では皮膚増殖能が低下して ErD50 値が高く なる (5. 83, 5. 50, 6. 00)ことが示され、 B5R 遺伝子が皮膚増殖性に直接拘わつ ていることが裏付けられた。 TM領域を欠失した B 5Rを発現する組換え体 (m8proB 5RdTM, m0proB 5RdTM)においても、野生型 B5Rを発現する対照ウイ ルス (m8B 5R, mO)に比べて高い ErD50値（4. 75, 5. 00)を示し、 m8 rc, ηι8 Δ , mO Δと同程度に皮膚増殖性が大きく減弱していることが示された。 実施例 5 SCIDマウスにおける感染実験
1群 4匹の 6週令 BALB/cSCIDマウス （雌） に、 m8△、 ιηΟΔ、 m8dTM、 および mOdTM株をそれぞれ 107から 109PFU/(3oseで腹腔内接種し、接種後 5週まで体重減少と発症の有無を観察した。 対照として、 PBS換種群とほ 乳類細胞では一段増殖しかできない MVA株を 107から 109PFU/dose 、 リ クローニングした m8株（m8rc)を 107から 109PFU/dose 、 mO株および m8 株に mO株の B5R遺伝子を組み込んだ ] I18B5Rを 104から 106PFU/dose、 現 在アメリカで使用されているワクチン株 Wyeth株を 103から 105PFU/dose， を接種して同様の観察を行った （図 1 0A、 図 1 0Bおよび図 1 1 )。
図 1 OA および図 1 0B はマウスの体重減少を示している。 πι8Δ、 mO Δ、 m8dTM、 および ] nOdTM株接種群のうち 108PFU/dose接種群では若干の 体重減少を示しているが、 107PFU/dose接種群では PBS接種群、 MVA接種 群と同様に全く体重減少を認めず、 発症もしなかった。 一方、 B5R 遺伝 子の活性を持つ mO株、 m8B5R株、 Wyeth株接種群では 105PFU/dose接種 群でも接種後 2週間で発痘が始まり、 それに伴い体重が減少始まった。 特に mO株接種群では、 いずれの doseにおいても接種後 4週までにほと んどの個体が死亡した。
体重減少以外に、ウィルス株の SCIDマウスに対する病原性の指標とし て、 半数の個体に発痘を起こしうるウィルス量として、 RashE pression Dose 50 (RED50)という値を設定した。 図 1 1は、 その経時的変化を表し たものである。 その結果、 B5R 遺伝子の機能を欠損した 5株 （ηι8Δ、 mO △、 m8dTM, m0dTM、 m8rc) はいずれもほぼ同じ値を示し、 B5R 活性を持 つ 3株 （m0、 m8B5 Wyeth) より 21og以上高い値を示した。 また発痘が 始まる時期にも数日間の開きがあった。 これらの 5株では、 通常人体に 投与される接種量の 1 0倍から 1 0 0倍に当たる 107PFU/dose を接種し た群では、 全く発症を認めず、 体重減少も見られず、 これらの株の高い 安全性が証明された。 実施例 6 BALB/cマウスにおける感染防御実験
πι8Δ、 ιηΟΔ株について、 天然痘ワクチンとしての効果を評価するため に、 BALB/cマウスでの感染防御実験を行った。 1群 8匹の 6週令 BALB/c マウス （雌） の筋肉内にそれぞれのウィルスを 104から 106PFU/dose接種 し、 接種後 4週目に致死量 （106 PFU/dose) のワクシニアウィルス強毒 株 Western Reserve (WR)株を経鼻感染させ、 攻撃後の体重減少を測定し た （図 1 2 )。 対照として、 アメリカの現行ワクチン株 Wye th と m8rc、 MVAを用いた。
πι8Δ、 πιΟΔ株ではいずれの doseにおいても Wyetli株同様、 攻撃後 4 日 目に一過性の体重減少を認めたものの、 完全に耐過し、 死亡する個体も いなかった。 一方 MVA株接種群では 104、 105PFU接種群では顕著な体重 減少が見られ、 106PFU 接種群でも若干の体重減少が認められた。 104PFU 接種群では 2匹が死亡した。 これらの結果から πι8Δ株、 πιΟΔ株はいずれ も現行の天然痘ワクチンと遜色ない免疫原性を備えることが確認された c 産業上の利用可能性
本発明により、 皮膚増殖性のような病原性が減じられ、 かつリバージ ヨンを起こしにくい、 より安全性の高い痘瘡ワクチンウイルスを提供す ることが可能となった。 これにより痘瘡ワクチンの製造 Ί1程管理をより 確実に行うことが可能となり、 ワクチン製造において大きなメリ ッ トが ある。 また、 品質の安定した安全な痘瘡ワクチンの供給は国の危機管理 においても重要である。 さらに、 ワクシニアウィルスは痙瘡ワクチンと しての用途以外に、 組み換え生ワクチンや発現ベクター系としての利用 法が実用化されつつあり、 新興再興感染症に対するヮクチンや診断薬等 の開発にも重要なツールになりうることから、 応用面から も m8株の改良 は意義が大きい。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書 に取り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想 および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更 が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこ のような変形および変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1. ワクシニアウィルス株 LC16株、 LC16m8株または LC16mO株の B5R 遺伝子の一部または全部が欠失しており、 正常な機能を有する B5R遺伝 子産物を産生しないワクシニアウィルスからなる痘瘡ワクチンであって、 正常な機能を有する B5R遺伝子産物の産生を引き起こす復帰突然変異を 起こしにくい痘瘡ワクチンウィルス。
2. B5R遺伝子を完全に欠失している、 請求項 1 に記載の痘瘡ワクチン ウィルス。
3. B5R遺伝子の一部が欠失し、 正常な機能を有する B5R遺伝子発現産 物が産生されない、 請求項 1 または 2に記載の痘瘡ワクチンウィルス。
4. RK13細胞に感染させたときのプラークサイズおよびゥサギに投与 したときの皮下増殖性が LC16m8株と同等である請求項 1から： 3のいずれ か 1項に記載の痘瘡ワクチンウィルス。
5. B5R遺伝子の一部が欠失し、 該 B5R遺伝子の上流にプロモーターが 連結され、 B5R遺伝子の一部が発現するが、 該発現産物は B5R遺伝子発現 産物の正常な機能を失っている、 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載 の痘瘡ワクチンウィルス。
6. B5R遺伝子の膜貫通ドメインが欠失している、 請求項 3 ら 5のい ずれか 1項に記載の痘瘡ワクチンウィルス。
7. プロモーターが PSFn_10、 PSFJ2- 16または他のボックスウィルス 用高発現プロモーターである、 請求項 5または 6に記載の痘瘡ワクチン ウィルス。
8. B5R 遺伝子のうち膜貫通ドメインの全部または一部が欠失してい るワクシニアウィルスよりなる痘瘡ワクチンウィルス。
9. B5R遺伝子の上流にプロモーターが連結し、 B5R遺伝子の一部が発 現するが、該発現産物は B5R遺伝子発現産物の正常な機能を失つている、 請求項 8記載の痘瘡ワクチンウィルス。
1 0. プロモーターが PSFJ1_10、 PSFJ2-16または他のボックスウィル ス用高発現プロモーターである、 請求項 8または 9 に記載の痘瘡ワクチ ンウィルス。
1 1. 請求項 1から 1 0のいずれか 1項に記載の痘瘡ワクチンウィル スを含む痘瘡ワクチン医薬組成物。
1 2. ワクシニアウィルス株 LC16株、 LC16m8株または LC16mO株の B5R 遺伝子の一部または全部が欠失しており、正常な機能を有する B5R遺伝子 産物を産生しないワクシニアウィルスベクターであって、 正常な機能を 有する B5R遺伝子産物の産生を引き起こす復帰突然変異を起こしにくい ワクシニアウィルスベクター。
1 3. B5R遺伝子を完全に欠失している、 請求項 1 2に記載のワクシニ ァウィルスベクター。
1 4. B5R遺伝子の一部が欠失し、 正常な機能を有する B5R遺伝子発現 産物が産生されない、 請求項 1 2または 1 3に記載のワクシニアウィル スベクター。
1 5. ゥサギ腎臓細胞に感染させたときのプラークサイズおよびゥサ ギに投与したときの皮下増殖性が LC16ni8株と同等である請求項 1 2から 1 4のいずれか 1項に記載のワクシニアウィルスベクター。
1 6. B5R遺伝子の一部が欠失し、 該 B5R遺伝子の上流にプロモーター が連結され、 B5R遺伝子の一部が発現するが、 該発現産物は B5R遺伝子発 現産物の正常な機能を失っている、 請求項 1 2から 1 5のいずれか 1項 に記載のワクシニアウィルスベクター。
1 7. B5R遺伝子の膜貫通ドメインが欠失している、 請求項 1 2から 1 6のいずれか 1項に記載のワクシニアウィルスベクター。
1 8. プロモータ一が PSFn- 10、 PSFJ2- 16または他のボックスウィル ス用高発現プロモータ一である、 請求項 1 6または 1 7のワクシニアゥ ィルスベクター。
1 9. B5R遺伝子のうち膜貫通ドメインの全部または一部が欠失してい るワクシニアウィルスベクター。
2 0. B5R遺伝子の上流にプロモーターが連結し、 B5R遺伝子の一部が 発現するが、 該発現産物は B5R遺伝子発現産物の正常な機能を失ってい る、 請求項 1 9記載のワクシニアウィルスベクター。
2 1. プロモーターが PSFn- 10、 PSFJ2- 16または他のボックスウィル ス用高発現プロモーターである、 請求項 1 9または 2 0 に記載のヮクシ ニァウィルスベクター。
2 2. 外来遺伝子を含む請求項 1 2から 2 1のいずれか 1項に記載の ワクシニアウィルスベクタ一。
2 3. 外来遺伝子がウィルス、 細菌、 原虫または癌の抗原である請求 項 2 2記載のワクシニアウィルスベクター。
2 4. 請求項 2 3記載のワクシニアウィルスベクターを含む、 ウィル ス、 細菌、 原虫または癌用ワクチンウィルス医薬組成物。
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