CN108473539B - 猫杯状病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的猫衣壳蛋白，包含该衣壳蛋白的活减毒猫杯状病毒，包含该衣壳蛋白的活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，包含此类活减毒猫杯状病毒的疫苗，活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，以及用于制备此类病毒的方法。

Description

猫杯状病毒疫苗
本发明涉及新的猫杯状病毒衣壳蛋白，包含该衣壳蛋白的活减毒猫杯状病毒，包含该衣壳蛋白的活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，包含此类活减毒猫杯状病毒的疫苗，活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，以及用于制备此类病毒的方法。
猫杯状病毒(FCV)是属于杯状病毒科中的水疱疹病毒属的单链正义RNA病毒。该病毒是高度感染性的，并且引起猫的上呼吸道疾病(URD)和口腔溃疡。该病毒还与慢性牙龈炎和口腔炎相关。更近来，出现了通常称为VS-FCV的毒性全身性猫杯状病毒，其引起高死亡率、水肿和溃疡性皮肤损害和黄疸。
FCV的传播主要通过与鼻腔或口腔分泌物接触(Scherk, M. A.等人, Journal of Feline Medicine and Surgery (2013) 15, 补充文件)。
杯状病毒科的基因组和基因组组织是本领域中众所周知的。总体概述尤其由Clarke, J.等人(Inf.Diseases 181 (Suppl. 2):S309-316 (2000))公开。猫杯状病毒的第一个完整基因组序列已经于1992年公开(Carter, M. J.等人, Virology 190:443-448(1992))，并且在后来的年代中，多得多猫杯状病毒的完整基因组序列已经公开(尤其通过Oka, T.等人, GenomeA, May/June 2013, vol. 1, issue 3, e00349-13,Genomea.asm.org)，并且可尤其通过Genbank得到。
FCV的基因组仅包含三个开放阅读框；ORF 1、2和3。ORF1编码大非结构性多蛋白。ORF3，短3’-末端ORF，编码被认为参与基因组RNA的衣壳化的小蛋白。
ORF 2是编码FCV衣壳蛋白的开放阅读框。已知衣壳蛋白是触发宿主中的保护性免疫应答的蛋白。因此，衣壳蛋白是用于开发用于针对FCV感染保护猫的疫苗的靶蛋白。
FCV毒株在全世界仅包含一种血清型，并且主要包含一种血清群。然而，在毒株之间存在相当大的遗传性变异，且因此存在抗原性变异。这种高水平的抗原性变异使得难以获得在猫中针对FCV的广泛保护：尽管用同源毒株接种非常有效，但一种毒株针对另一种毒株的交叉保护水平是相当可变的。(Coyne C.P.等人, J. Virol. 86: 11356-11367(2012))。
目前，修饰的活疫苗和灭活疫苗是可得的，并且它们通常全身施用。最初，疫苗曾经是单一疫苗，其主要基于毒株FCV F9或FCV 255。然而，它们都受困于上面鉴定的问题：缺乏广泛的交叉保护。
目前，至少部分地通过施用包含两种不同的FCV毒株(诸如FCV 431和FCV G1)的二价疫苗来在一定程度上绕开该问题。
此类(灭活的)二价疫苗目前在美国和欧洲均商业可得。(Poulet H, 等人, Vaccine 26: 3647–3654 (2008), Chengjin Huang等人, Journal of Feline Medicineand Surgery February 12: 129-137 (2010))。
McCabe V. J.等人开发了活减毒和灭活疫苗的替代方案，其构建了一种活减毒重组载体病毒(LARCV)，在该情况下是粘液瘤病毒，其表达FCV衣壳蛋白，并且成功地将该重组粘液瘤病毒作为LARCV疫苗施用于猫。
此类基于重组粘液瘤-载体的疫苗具有这样的优点：载体是减毒的，不在猫中复制并且仅携带编码FCV衣壳蛋白的FCV ORF。因此，接种后没有FCV或载体病毒脱落至环境中。
表达FCV衣壳蛋白的活减毒重组载体病毒的另一个实例是如由Yokoyama, N.等人(J. Vet. Med. Sci. 60:717-723 (1998))所述的猫疱疹病毒载体。该载体还用于针对FCV接种猫。
然而，还没有开发既安全又显示广泛水平的交叉保护的活减毒FCV疫苗或基于重组载体的疫苗。
本发明的一个目标是提供安全且仍显示广泛水平的交叉保护的FCV疫苗。
令人惊讶地发现，存在迄今未知的FCV毒株，其中衣壳蛋白显示针对许多FCV野外毒株的显著广谱的交叉保护。该毒株的代表的衣壳蛋白的实例描绘于SEQ ID NO:34中。其衣壳蛋白序列显示于SEQ ID NO:34中的该新型FCV毒株的代表进一步被称为FCV毒株KalemCrouch。
表1显示针对本发明的新型FCV毒株产生的抗血清与31种其他FCV毒株的交叉中和特性。显示病毒滴度的log10降低。>1.5 log10的滴度降低被认为是显著的。
如下表所示，针对新型FCV毒株Kalem Crouch产生的抗血清令人惊讶地中和了测试的31种FCV毒株中的26种。与常用的F9毒株进行比较。如表1中可见，看到针对F9产生的抗血清仅显示对于测试的22种FCV毒株中的3种的滴度的显著降低。
已将该新FCV毒株的衣壳蛋白的氨基酸序列与24种其他FCV衣壳蛋白的已知氨基酸序列进行比较，并且可以得出结论，该序列与已知的FCV衣壳蛋白相当显著不同。如从图5可见，新毒株的衣壳蛋白和已知的FCV毒株的衣壳蛋白之间的总体序列同一性为约87％。此外，新衣壳蛋白的几个独特氨基酸被鉴定为K89、M90、M100、I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524、S545、S634、F635、P636。此外，氨基酸447-452的序列KLEYEN和氨基酸489-493的GVISD也是独特的。
应该理解的是，对于SEQ ID NO:34的氨基酸序列和编码蛋白的DNA，在该毒株的各个代表之间可以存在较小的天然变异。首先，在核苷酸水平上，存在所谓的“第二和第三碱基的摆动”，解释可以存在这样的核苷酸变化，其在其编码的氨基酸序列中仍然未被注意到：例如，三联体TTA、TTG、TCA、TCT、TCG和TCC都编码亮氨酸。此外，在FCV的代表之间可以存在核苷酸水平上的轻微变异，这可以导致氨基酸序列的微小变异。这些变异可以通过总体序列中的(一个或多个)氨基酸差异或通过所述序列中的(一个或多个)氨基酸的缺失、取代、插入、倒置或添加来反映。基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸取代已经例如由Neurath等人于"The Proteins" Academic Press New York (1979)中描述。相关氨基酸之间的氨基酸替代或进化中已频繁发生的替代尤其是Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val (参见Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat.Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3)。其他氨基酸取代包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于该信息，Lipman和Pearson开发了一种用于快速和灵敏的蛋白比较(Science, 227, 1435-1441, 1985)和确定相同蛋白之间的功能相似性的方法。本发明的示例性实施方案的此类氨基酸取代以及具有缺失和/或插入的变异在本发明的范围内，只要所得蛋白保留其免疫反应性。这解释了为什么根据本发明的FCV衣壳蛋白，当从不同的野外分离株分离时，可以具有约90％的同一性水平，同时仍然代表具有相当的免疫交叉反应性的蛋白。
因此，本发明的第一个实施方案涉及与如SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的猫杯状病毒衣壳蛋白。
任选地，所述衣壳蛋白与如SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100％的序列同一性，按优先顺序递增。
本发明和/或其实施方案的另一个实施方案涉及包含与如SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的衣壳蛋白的活减毒FCV。
本发明和/或其实施方案的另一个实施方案涉及包含根据本发明和/或其任何实施方案的衣壳蛋白的活减毒FCV。
任选地，所述FCV具有衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与如SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100％的序列同一性，按优先顺序递增。
此外，本发明涉及包含以下氨基酸中的至少一个的猫杯状病毒衣壳蛋白：K89、M90、M100、I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524、S545、S634、F635、P636。合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸中的至少一个或多个：K89、M90、M100、I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524、S545、S634、F635、P636。合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸中的至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个：K89、M90、M100、I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524、S545、S634、F635、P636。
此外，本发明涉及包含以下氨基酸中的至少一个的猫杯状病毒衣壳蛋白：I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524或S545。合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸中的至少一个或多个：I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524或S545。合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸中的至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个：I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524或S545。
此外，本发明涉及包含以下氨基酸中的至少一个的猫杯状病毒衣壳蛋白：L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518或I524。合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸中的至少一个或多个：L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518或I524。合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸中的至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个：L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518或I524。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：K89、M90和M100。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：I317。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：L390、A391、V392、Q396、S397、K398和N404。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451和N452。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：G484、G489和I491。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：N516、S517、E518和I524。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：S545。
合适地，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：S634、F635和P636。
明确设想根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含上述氨基酸组的组合。例如，根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白包含以下氨基酸：L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404和I317。另一个实例涉及根据本发明和/或其实施方案的猫杯状病毒衣壳蛋白，其包含以下氨基酸：N516、S517、E518、I524和S545。
此外，本发明涉及猫杯状病毒衣壳蛋白，其中氨基酸447-452是KLEYEN且/或其中氨基酸489-493是GVISD。合适地，本发明涉及猫杯状病毒衣壳蛋白，其中氨基酸447-452是KLEYEN且氨基酸489-493是GVISD。合适地，其中氨基酸447-452是KLEYEN且/或其中氨基酸489-493是GVISD的猫杯状病毒衣壳蛋白也包含以下氨基酸中的至少一个：K89、M90、M100、I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、G484、N516、S517、E518、I524、S545、S634、F635或P636。
本发明和/或其实施方案的另一个实施方案涉及包含衣壳蛋白的活减毒FCV，所述衣壳蛋白与如SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性且具有以下氨基酸中的至少一个：K89、M90、M100、I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524、S545、S634、F635、P636。
根据本发明的衣壳蛋白或编码衣壳蛋白的区域诸如ORF2或其片段可以几种方式用于制备用于针对FCV保护猫的疫苗。
包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域的DNA片段可以例如用于制备包含根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的非-FCV重组载体病毒。它也可以用于制备杂合FCV，如下所述。
因此，本发明的第三个实施方案涉及DNA片段，其特征在于其包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域。
在其中使用重组载体作为包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域的DNA片段的载体的情况下，衣壳蛋白的表达通常通过将包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域的DNA片段置于合适的异源启动子的控制下来获得。
合适的启动子是能够驱动位于宿主细胞(在该情况下，真核的，更具体地猫细胞)中启动子下游的编码区的转录的启动子。用于表达FCV衣壳蛋白的大量合适的启动子是本领域中已知的，其被公认用于它们的有效水平的表达。此类启动子包括经典启动子，诸如(人)巨细胞病毒立即早期启动子(Sun-Young Lee 等人, Journal of BiomedicalScience 6: 8-17 (1999), Seed, B. 等人, Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F.等人, PNAS 90, 11478-11482,1993; Ulmer, J.B. 等人, Science 259, 1745-1748,1993)，人巨细胞病毒增强子-启动子(Donofrio G., 等人, Clinical and VaccineImmunology 13: 1246-1254, (2006))，小鼠巨细胞病毒立即早期(MCMVie1)启动子，小鼠巨细胞病毒早期(MCMVe1)启动子，SV40立即早期启动子(Sprague J. 等人, J. Virology45, 773 ,1983)，SV-40启动子(Berman, P.W. 等人, Science, 222, 524-527, 1983)，金属硫蛋白启动子(Brinster, R.L. 等人, Nature 296, 39-42, 1982)，热休克启动子(Voellmy 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985)，Ad2的主要晚期启动子，β-肌动蛋白启动子(Tang 等人, Nature 356, 152-154, 1992)和CAG启动子(Miyazaki, J; Takaki, S; Araki, K; Tashiro, F; Tominaga, A; Takatsu, K;Yamamura, K., Gene 79 (2): 269–277 (1989)和Niwa, H; Yamamura, K; Miyazaki,J., Gene 108 (2): 193–199 (1991))。
合适地，将编码衣壳蛋白的区域置于合适启动子的控制下。
包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域的DNA片段可以例如是质粒。该质粒可以是环状或线性形式。
鉴于根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白提供的广泛保护，在活重组载体病毒中使用编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域是有吸引力的。
此类活减毒重组载体病毒(LARCV)是能够感染宿主动物(在该情况下，猫物种)并携带在合适启动子的控制下的外源基因(在该情况下，编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域)的重组病毒。
LARCV及其用途已经尤其由Souza, A.P.D.等人于Braz. J. Med. Biol. Res,38:509-522 (2005)中综述。此类活重组载体病毒的实例是：痘病毒(尤其痘苗病毒)、腺病毒、疱疹病毒、粘液瘤病毒和更近期甲病毒。
因此，本发明的第四个实施方案涉及包含在启动子的控制下的编码根据本发明的衣壳蛋白的区域的活减毒重组载体病毒(LARCV)。
McCabe等人提供了此类减毒活重组载体病毒的实例，McCabe等人描述了粘液瘤病毒作为FCV毒株F9的衣壳蛋白的LARCV的用途(参见上文)。
表达FCV衣壳蛋白的活减毒重组载体病毒的另一个实例是表达FCV衣壳蛋白的猫疱疹病毒载体(诸如由Yokoyama, N.等人描述)(参见上文)。
合适地，活减毒重组载体病毒是粘液瘤病毒或猫疱疹病毒。
本发明和/或其实施方案的另一个实施方案涉及根据本发明和/或其实施方案的活减毒重组载体病毒，其用于针对FCV感染保护猫。
衣壳蛋白及其编码区也可以允许用于针对FCV保护猫的另一种方法。该方法涉及杂合FCV。
本领域已知存在用于针对FCV感染保护猫的活减毒疫苗。这种活减毒FCV的一个实例是FCV毒株F9，已知其在全身施用时提供安全的活疫苗。然而，如上所提及，一般FCV毒株和还有F9毒株都不能针对其他FCV毒株感染猫提供广泛的交叉保护。
现在令人惊讶地发现，包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域和来自减毒FCV的ORF1的杂合FCV毒株提供了高水平的安全性和广泛的交叉保护。
另一个实施方案涉及活减毒杂合FCV，其特征在于所述FCV包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的区域，并且包含编码来自减毒FCV的开放阅读框1(ORF1)的减毒的区域。
合适地，本发明和/或其实施方案的活减毒杂合FCV包含编码根据本发明和/或其实施方案的衣壳蛋白的开放阅读框2(ORF2)，并且包含来自减毒FCV的开放阅读框1(ORF1)。
用于构建杂合杯状病毒的方法是本领域众所周知的。对于猫杯状病毒，Neill等人描述了不同FCV毒株之间的衣壳蛋白结构域交换(Neill, D. J.等人, J. Virol 74:1079-1084 (2000))。Thumfart J. O.和Meyers G. (J. Virol. 76:6398-6407 (2002))已经在2002年描述了用于在转染cRNA或cDNA构建体后从细胞中回收重组病毒的其他方法。Aubry,F.等人近期已经描述了使用亚基因组扩增子生成单链正义RNA病毒的甚至更快的方法(J.Gen. Virol 95:2462-2467 (2014))。
减毒病毒可以例如通过如下获得：使根据本发明和/或其实施方案的病毒在诱变剂存在的情况下生长，随后选择显示子代水平和/或复制速度降低的病毒。许多此类试剂是本领域已知的。
另一种频繁使用的减毒方法是系列体外传代。在该过程期间，病毒变得适应于用于系列传代的细胞系。作为结果，它们当随后作为疫苗再次施用于天然宿主时表现出减毒。
获得减毒病毒的又另一种方式是使它们在偏离其天然栖息地温度的温度下生长。温度敏感突变体(Ts-突变体)的选择方法是本领域中众所周知的。此类方法包括使病毒在诱变剂存在的情况下生长，随后在亚最佳温度和最佳温度下生长，在细胞层上滴定子代病毒，以及视觉选择在最佳温度下较慢生长的那些噬斑。此类小噬斑包含缓慢生长且因此期望的减毒活病毒。
用于生成减毒单链正义RNA病毒的更直接和可预测的方法例如由Weeks, S. A.等人于J. of Biol.Chem., 287:31618-31622 (2014)中描述。
任选地，技术人员将使用编码来自开放阅读框1(ORF1)的减毒的区域或来自已有的减毒FCV毒株的ORF1。这种活减毒病毒的众所周知的实例是FCV毒株F9。
Kalunda等人AJVR (1975) 36:353-356描述了作为疫苗的毒株FCV-F9的特性。还参见Bittle,等人, Ibid. (1976) 37:275-278。
合适地，本发明和/或其实施方案涉及根据本发明的活减毒杂合FCV，其包含编码来自开放阅读框1(ORF1)的减毒的区域或获得自FCV毒株F9的开放阅读框1(ORF1)。
在实施例部分中，详细描述了用于制备如上所述的根据本发明和/或其实施方案的杂合FCV的方法。
本发明的再另一个实施方案涉及根据本发明和/或其实施方案的活减毒杂合FCV，其用于针对FCV感染保护猫。
适合于培养活重组载体病毒的哺乳动物细胞是本领域已知的。此类细胞是支持已知LARCV(诸如痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、粘液瘤病毒和更近期甲病毒)的生长的细胞。
表达FCV衣壳蛋白的减毒重组的基于粘液瘤的载体病毒可以例如在RK13细胞上生长。表达FCV衣壳的减毒重组的基于猫疱疹病毒的载体病毒可以例如在Crandell-Rees猫肾(CRFK)细胞上生长。
同样地，适合于培养活减毒FCV和活减毒杂合FCV的细胞是本领域中已知的。用于使FCV生长的最常见的细胞是CRFK细胞。
因此，本发明的再另一个实施方案涉及包含根据本发明和/或其实施方案的活减毒FCV、根据本发明的LRCV或根据本发明的活减毒杂合FCV的细胞培养物。
如上所示，根据本发明和/或其实施方案的FCV衣壳蛋白针对各种不同FCV毒株提供广泛水平的交叉保护。
由于该原因，根据本发明和/或其实施方案的活减毒FCV，根据本发明和/或其实施方案的活重组载体病毒和根据本发明和/或其实施方案的活减毒杂合FCV为用于针对FCV保护猫的疫苗提供了非常合适的基础。
因此，本发明的又另一个实施方案涉及用于针对FCV保护猫的疫苗，其中此类疫苗包含根据本发明和/或其实施方案的活减毒FCV和药学上可接受的载体，和/或根据本发明和/或其实施方案的活减毒重组载体病毒和药学上可接受的载体，和/或根据本发明和/或其实施方案的活减毒杂合FCV和药学上可接受的载体。
保护在这方面应当在广义上解释：针对FCV保护猫被认为包含接种以预防疾病，接种以减少疾病的体征和在疾病被诊断后的治疗性接种。
适合于用于根据本发明使用的疫苗中的药学上可接受的载体的实例是无菌水、盐水、含水缓冲液诸如PBS等。此外，根据本发明的疫苗可以包含其他添加剂，诸如稳定剂和/或抗氧化剂。
如上所提及，从野外分离的FCV的毒力相对高：猫杯状病毒感染是上呼吸道感染的原因，并且当毒性FCV被口咽施用时，其引起发热、眼-鼻分泌物、龈口炎、舌炎、体重减轻和不佳身体状况。FCV的毒性全身形式引起发热、血管炎、水肿、四肢上的溃疡性病变、黄疸和死亡。(存在零星的信息：甚至FCV F9的疫苗毒株当口咽施用时确实引起龈口炎)。
如本文所定义的活减毒病毒是当与从野外分离的病毒相比具有降低水平的毒力的病毒。用根据本发明和/或其实施方案的活减毒病毒、活减毒杂合病毒或LRCV接种至少在发热持续时间、口腔溃疡、体重减轻和/或病毒分泌天数的方面当与用野生型FCV感染未接种的动物相比时降低感染的严重程度(临床体征和症状的减少)。
通常，可以在不添加佐剂的情况下使用基于活减毒FCV、LRCV和活减毒杂合FCV的疫苗。尽管如此，如果需要如此，疫苗中可以包括佐剂。
佐剂是以非特异性方式加强宿主的免疫应答的免疫刺激物质。所述佐剂可以是亲水性佐剂，例如氢氧化铝或磷酸铝，或疏水性佐剂，例如基于矿物油的佐剂。
根据本发明和/或其实施方案的基于活减毒FCV、LRCV和活减毒杂合FCV的疫苗可以包含稳定剂。可以将稳定剂添加至根据本发明和/或其实施方案的疫苗中，例如，以保护其免于降解、延长保质期或改善冷冻干燥效率。可用的稳定剂尤其是SPGA (Bovarnik等人,1950, J. Bacteriology, vol. 59, p. 509)，脱脂乳，明胶，牛血清白蛋白，碳水化合物，例如山梨醇，甘露醇，海藻糖，淀粉，蔗糖，葡聚糖或葡萄糖，乳糖，蛋白诸如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，和缓冲液，诸如碱金属磷酸盐。为了重构冷冻干燥的组合物，将其悬浮于生理上可接受的稀释剂中。这种稀释剂可以例如与无菌水或生理盐溶液一样简单。以更复杂的形式，冷冻干燥的疫苗可以悬浮于乳剂中，例如如EP 1,140,152中所述。
用于将根据本发明和/或其实施方案的疫苗应用于靶生物体的剂量方案可以是单剂量或多剂量的应用并且以如免疫有效的量应用。
何者构成基于根据本发明和/或其实施方案的病毒的根据本发明的疫苗的“免疫原性有效量”取决于期望的效果。如本文所用的术语“免疫原性有效量”涉及根据本发明的活减毒FCV、活减毒载体病毒或活减毒杂合FCV在与由野生型FCV在未免疫猫中的感染引起的病理效果相比时其减少由野生型FCV病毒感染引起的病理效果的程度上在猫中诱导免疫应答所必需的量。
确定治疗是否是“免疫学有效的”，例如通过将实验性攻击感染施用于接种的动物和接下来确定靶动物的疾病临床体征、血清学参数或通过测量病原体的重新分离，随后将这些发现与攻击未接种的猫后观察到的那些进行比较，完全在技术人员的能力之内。
施用的病毒量将取决于施用途径、可能佐剂的存在和施用的时刻。
包含根据本发明和/或其实施方案的活减毒FCV或活减毒杂合病毒的活疫苗的优选量例如表达为组织培养感染剂量(TCID50)。例如，对于这种活减毒病毒，可以有利地使用每个动物剂量102至108 TCID50的剂量范围；优选使用104至106 TCID50的范围。
疫苗中基于粘液瘤病毒的活重组载体病毒的优选量将在104 – 108噬斑形成单位(PFU)的范围内。
疫苗中基于猫疱疹病毒的活重组载体病毒的优选量也将在104 – 108噬斑形成单位(PFU)的范围内。
可以应用几种施用方式，其都是本领域中已知的。根据本发明的疫苗优选经由注射(优选肌内注射)施用于猫。用于施用的方案可以根据标准FCV或活重组载体病毒接种实践进行优化。
驯化的猫通常针对几种疾病接种。出于易于施用的原因和还有经济原因，期望同时施用几种疫苗，优选作为组合疫苗。此类组合疫苗然后将包含根据本发明和/或其实施方案的活减毒FCV和/或根据本发明和/或其实施方案的活减毒杂合FCV和/或根据本发明和/或其实施方案的活重组载体病毒，并且除了这以外，包含至少一种其他猫致病性微生物或猫致病性病毒和/或所述猫致病性微生物或猫致病性病毒的至少一种其他免疫原性组分和/或编码所述猫致病性微生物或猫致病性病毒的所述其他免疫原性组分的遗传物质。
因此，该实施方案的优选形式涉及用于针对FCV保护猫的疫苗，其中此类疫苗包含根据本发明的活减毒FCV和药学上可接受的载体，和/或根据本发明的活重组载体病毒和药学上可接受的载体和/或根据本发明的活减毒杂合FCV和药学上可接受的载体以及至少一种其他猫致病性微生物或猫致病性病毒和/或所述猫致病性微生物或猫致病性病毒的至少一种其他免疫原性组分和/或编码所述猫致病性微生物或猫致病性病毒的所述其他免疫原性组分的遗传物质。
在该实施方案的一个更优选形式中，至少一种其他猫致病性微生物或猫致病性病毒选自猫全白细胞减少症病毒、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猫细小病毒、狂犬病病毒和猫疱疹病毒。
在实施例部分中，提供了构建根据本发明的活减毒杂合FCV的详细实例。基本上，该方法包括优选使用重叠延伸组装第一和第二扩增子(所述第一和第二扩增子各自包含全长病毒基因组的一部分)、产生包含全长病毒基因组的扩增子的步骤。
合适地，第一FCV扩增子包含减毒FCV的完整ORF1区域和ORF2区域的相邻5’-部分，且第二FCV扩增子包含ORF1区域的3’-部分和完全相邻的ORF2//ORF3区域，其中ORF2是编码根据本发明和/或其实施方案的FCV衣壳蛋白的ORF2。
因此存在跨越两个扩增子中均存在的ORF1区域的5’-部分和ORF2区域的3’-部分的重叠区域。这将允许通过重叠延伸来组装第一和第二扩增子。
因此，又另一个实施方案涉及用于获得根据本发明的活减毒杂合FCV的方法，其包括以下步骤：
a. 制备包含减毒FCV的完整ORF1区域和ORF2区域的相邻5’-部分的第一FCV扩增子，
b. 制备包含ORF1区域的3’-部分和完全相邻的ORF2//ORF3区域的第二FCV扩增子，其中ORF2是根据本发明的ORF2，
c. 使用重叠延伸组装第一和第二扩增子，
d. 生成感染性FCV，
e. 用感染性FCV感染易感细胞，
f. 回收感染性子代FCV。
附图说明
图1：用PCR从FCV cDNA扩增覆盖FCV基因组的5’末端起的5349bp或FCV F9和KalemCrouch基因组分别的3’末端起的2422和2416bp的扩增子。
图2：生成FCV F9 (SEQ ID NO:60)、Kalem Crouch (SEQ ID NO:59)、FK (SEQ IDNO:62)和KF (SEQ ID NO:61)的全长重叠延伸组装体，并在1％琼脂糖凝胶上分辨。FCV F9和Kalem Crouch从它们各自的5’和3’扩增子制备作为对照，以证明正确的重叠设计。
图3：用PCR扩增全长重组FK和KF FCV DNA，并在1％琼脂糖凝胶上分辨。
图4：被FCV Kalem Crouch感染的CrFK细胞中FCV的典型CPE(细胞病变效应)的实例。
图5：FCV Kalem Crouch (SEQ ID NO:34)和F9 (SEQ ID NO:35)衣壳蛋白序列与公开的FCV序列(SEQ ID NO:36-58)的比对。氨基酸的编号在核苷酸水平上。
图6：FCV F9 (SEQ ID NO:59)和Kalem Crouch毒株(SEQ ID NO:60)与重组FCV FK(SEQ ID NO:61)和KF毒株(SEQ ID NO:62)的序列比对。
图7：FCV Kalem Crouch (SEQ ID NO:34)和F9 (SEQ ID NO:35)衣壳蛋白序列与公开的FCV序列(SEQ ID NO:36-58)的比对。氨基酸的编号在氨基酸水平上。
图8：在所示的MCS的NcoI位点中具有突变的p22m-GFP质粒的图谱。
图9：源自p22-GFP质粒的p22m-GFP和p22m-4a构建体的比较。
图10：具有突出的pMCPK插入物的整个MR24-Kalem Crouch克隆的基因组的图。
实施例：
实施例1：
使用在猫中产生的针对毒株FCV F9和Kalem Crouch的超免疫血清来测定几种FCV毒株的中和指数。该实验如下面部分8中所述进行。数据显示于表1中。从表中变得清楚的是，针对Kalem Crouch产生的血清针对许多其他FCV毒株具有广泛的交叉保护。对于针对Kalem Crouch的血清，针对31种FCV毒株中的16种看到显著的Log10降低(即> 1.5)。表1还显示通常使用的F9毒株的交叉保护低得多。对于22种FCV毒株中的3种，针对F9产生的血清显示显著的Log10降低(即>1.5)。应当注意的是，被F9血清中和或至少显著降低的2种FCV毒株3809，6420，CV-21是F9样病毒。因此，不仅为比F9多得多的FCV毒株提供了Kalem Crouch交叉保护，而且其为非F9毒株提供了交叉保护。
表 1：通过血清的Log10降低
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实施例2
杂合FCV-克隆的构建。
1. 细胞培养
所有细胞系都在37℃、5% CO2下维持在组织培养烧瓶中。
使Crandell-Rees猫肾(CrFK)细胞在补充有5％胎牛血清、0.15％碳酸氢钠、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、10μg/ml链霉素和2μg/ml两性霉素B的培养基M6B8中生长。
将BsRT7细胞维持在补充有5％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mg/ml遗传霉素(G418)的培养基DMEM中。转染前在细胞接种时移除遗传霉素。
2. 病毒分离
从猫收集口咽/鼻拭子并转运在培养基M6B8中。将拭子短暂涡旋并将病毒悬浮液接种至汇合的CrFK细胞上，并在37℃和5% CO2下孵育，直至观察到FCV特异性的CPE。将感染的烧瓶冻融以裂解细胞，澄清以移除细胞碎片并在-70℃下作为等分试样储存。
3. FCV的生长
吸附适当的病毒稀释液以感染汇合的CrFK单层。将细胞在37℃、5% CO2下孵育，直至观察到FCV特异性的CPE。将感染的烧瓶冻融以裂解细胞，澄清以移除细胞碎片并在-70℃下作为等分试样储存。
4. RNA分离
将澄清的病毒悬浮液在131500 x g、4℃下使用SW28转子离心近似16小时。使用RNeasy® Miniprep试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从所得沉淀中提取RNA。将RNA洗脱于50μl无RNA酶的水中，等分并在-70℃下储存，直至使用。
5. cDNA合成
FCV RNA用作cDNA合成的模板。使用INVITROGEN Superscript II®试剂盒(Carlsbad, CA)和引物Fr2F (SEQ ID NO:32)和Fr4R (SEQ ID NO:33)合成cDNA。
6. 病毒滴定
使用在生长培养基中病毒的系列十倍稀释液(100μl/孔，每个稀释度5个孔)来感染96孔板中的CrFK细胞的汇合单层。将感染的CrFK细胞在37℃、5% CO2下孵育最长达5天，并检查FCV特异性的CPE。记录存在CPE的孔的数目并使用Reed Muench方法计算滴度。滴度表示为TCID50/ml。
7. FCV抗体的制备
在猫中产生针对FCV毒株的抗体。每个处理组由分别圈养的3只猫组成。猫通过口咽途径或通过皮下注射感染。将猫通过口咽途径用第二剂量的病毒超免疫。在第二次接种后三周从猫收集血浆。
8. 病毒中和测定
将病毒的连续稀释液与等体积的恒定量的血浆稀释液或生长培养基混合，并在37℃下孵育1小时。将病毒或病毒血清混合物接种在96孔板中的汇合CrFK细胞上(每个稀释度5个孔)。将板在37℃、5% CO2下孵育5天。通过计算观察到的滴度的差异来测定中和指数。
9. 用于从FCV cDNA生成重叠DNA扩增子的引物的设计
使用Phusion聚合酶(NEB, Ipswich, MA)与寡核苷酸引物对FKP1F (SEQ ID NO:5)和FKP1R (SEQ ID NO:6)以及表4中所述的PCR条件进行PCR反应以生成覆盖从FCV基因组的5’起的5349bp的扩增子。类似地，还使用Phusion聚合酶(NEB, Ipswich, MA)与寡核苷酸引物对FKP2F (SEQ ID NO:7)和FKP2R (SEQ ID NO:8)使用Phusion聚合酶(NEB, Ipswich,MA)和表5中所述的PCR条件进行PCR反应以生成覆盖从FCV F9的3’末端起的2422bp以及从FCV Kalem Crouch的3’末端起的2416 bp的扩增子。
10. 从PCR反应纯化DNA
使用QIAquick® PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)使用两次柱洗涤纯化所有扩增的DNA。使用Nanodrop仪器(Thermo Scientific, Waltham, MA)测定洗脱的DNA的浓度和纯度。
11. 组合FCV扩增子以生成全长FCV
制备与0.1、0.25或0.5pmol的每种FCV扩增子的等摩尔混合物，所述FCV扩增子如方法部分9中所述生成并且如方法部分10中所述进行纯化。使用足量的这种混合物(通常5μL)作为模板用于使用Phusion聚合酶(NEB, Ipswich, MA)的表6中描述的重叠延伸PCR。
12. 生成全长感染性FCV DNA
使用足量的如上面部分5中所述制备的cDNA反应物或如部分11中所述制备的重叠延伸PCR反应物(通常在1和5μL之间)作为模板以生成全长感染性FCV DNA。分别使用ThPhusion聚合酶(NEB, Ipswich, MA)连同寡核苷酸引物对MBL 446 (SEQ ID NO:1)和MBL447 (SEQ ID NO:2)或FCVT7f (SEQ ID NO:3)和FCVpAr (SEQ ID NO:4)以及表7和8中描述的PCR条件。
13. 将全长感染性FCV DNA转染至BsRT7细胞中
用如部分12中所述生成的全长感染性FCV DNA使用INVITROGEN® Lipofectamine® 3000转染如部分1中所述在24孔板中培养至近似50-70%汇合度的BsRT7细胞。通常每个孔使用3μg DNA。将细胞与DNA-脂质体复合物孵育最长达72小时。
14. 用来自转染的BsRT7细胞的裂解物感染CrFK细胞
通过冻融裂解转染的BsRT7细胞。细胞裂解物用于感染汇合的CrFK细胞单层。
15. FCV的免疫荧光染色
用FCV感染的CrFK细胞用甲醇固定并用PBS洗涤。将固定的细胞依次与多克隆抗FCV血清和抗猫FITC抗体缀合物或小鼠单克隆抗体NCL-1G9 (Leica Microsystems, UK)和抗小鼠FITC抗体缀合物孵育。使用具有I3滤光片的DM1L显微镜(Leica Microsystems, UK)观察荧光。
16. FCV的序列分析
使用寡核苷酸引物MBL 446 (SEQ ID NO:1)和MBL 447 (SEQ ID NO:2)连同Phusion聚合酶(NEB, Ipswich, MA)以及表4中所述的PCR条件从cDNA制备全长FCV DNA。所得全长FCV DNA如方法部分11中所述纯化，并使用来自表3的寡核苷酸引物的任何组合进行测序。DNA样品通过GATC-biotech, UK进行测序。30-100 ng/µl的质粒或10-50 ng/µl的PCR产物与10 pmol/µl的测序引物一起发送。
表1用于生成全长感染性FCV DNA的PCR引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表2 用于生成FCV扩增子的PCR引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表3 用于测序重组FCV基因组的全长的PCR引物。
Figure 924999DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表4 用于生成FCV的覆盖从5’末端起5349 bp的扩增子的PCR条件。
Figure 45402DEST_PATH_IMAGE006
表5 用于生成FCV的覆盖从3’末端起最长达2422 bp的扩增子的PCR条件。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表6进行组合FCV扩增子以生成全长FCV DNA模板的重叠延伸PCR的PCR条件。
Figure 746511DEST_PATH_IMAGE008
表7 用于从cDNA扩增全长FCV DNA并添加5’ T7启动子和3’多聚A束的PCR条件。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
表8 用于从重叠延伸PCR模板材料扩增全长FCV DNA并添加5’ T7启动子和3’多聚A束的PCR条件。
Figure 813824DEST_PATH_IMAGE010
2. Myxo-Kalem Crouch构建体的制备
在p22m-GFP (p22-GFP的衍生物)质粒MCS (多克隆位点)上使用BamHI和XhoI位点克隆pMCPK (Kalem Crouch FCV分离株的主要衣壳蛋白的加工部分)。参见图8。
为了避免向pMCPK添加额外的C-端AA(氨基酸)，通过引入点突变(CCATGG->CCATCG，图1)移除p22-GFP中的MCS的NcoI位点中从起始密码子的翻译。定点诱变用于使用以下引物突变p22-GFP质粒：-
Figure DEST_PATH_IMAGE011
PCR程序：在98℃，30”，20x[在98℃，10”, 在58.3℃，10”，在72℃，2’], 在72℃，5’，在4℃，∞，和Phusion聚合酶(NEB，目录号：M0530L)。
在转化至XL10 gold大肠杆菌(目录号：200315)中前，用DpnI消化将模板p22-GFP质粒从反应中移除。挑取所得大肠杆菌菌落中的几个以建立小量制备培养物，其通过用NcoI消化提取的质粒DNA (QiaPrep Spin Miniprep试剂盒，目录号：27104)来筛选。在1％琼脂糖凝胶上，对应于线性化质粒的独特条带表明成功突变(因为p22m-GFP质粒中唯一剩余的NcoI位点存在于GFP基因的上游)。除了消化后的线性化质粒之外，342bp片段表明存在两个NcoI位点，且因此存在完整的p22-GFP质粒。随后使用测序来证实突变。
插入物pMCPK使用PCR制备，其用以下引物：-
Figure 159355DEST_PATH_IMAGE012
其在pMCPK的5’末端的Kozac序列中包括起始密码子。所用的PCR程序是：在98℃，30”，35x[在98℃，10”，在55℃，10”，在72℃，40”]，在72℃，5’，在4℃，∞，而模板是从分离自被Kalem Crouch FCV感染的CRFK细胞的总RNA制备的cDNA。在1％琼脂糖凝胶上证实正确的扩增子大小后，将PCR反应中的插入物DNA纯化(Qiagen PCR清洁试剂盒)并用BamHI和XhoI与p22m-GFP质粒平行消化。连接后，该程序导致用pMCPK替代GFP插入物和5’和3’ RHDV重复侧翼(图2)。将消化的插入物和质粒DNA上样至1％琼脂糖凝胶上，并切下1664bp(插入物)和4031bp(质粒骨架)的条带并使用StrataPrep DNA凝胶提取试剂盒(目录号：400766)纯化。将骨架和插入物在4℃下连接过夜，且随后将2uL该连接物转化至XL10 gold大肠杆菌(目录号：200315)中。建立小量制备培养物，并通过用BamHI和XhoI两者消化来筛选提取的DNA。通过使用与生成pMCPK插入物的相同PCR反应(参见上文)和随后测序证实插入物的身份。选择构建体p22m-4a用于随后的步骤中。
经5小时将1mL M6B8 + 5％FBS培养基中稀释的50μL MR24材料应用至具有~80%汇合的RK13细胞的6cm皿中，然后洗去所有未吸收的MR-24病毒，补充额外3mL相同的培养基，并用~4.5ug p22m-4a质粒使用Lipofectamine 3000转染。~17小时后，通过温和刮取收获部分细胞并与培养基一起保存。将板上剩余的一半细胞固定(100％ EtOH)，并用FCV-抗血清、随后用FITC-标记的抗猫抗体针对免疫荧光染色，以证实pMCPK的表达。染色的细胞表明pMCPK表达增强以及p22m-4a和MR-24之间可能重组以产生MR-24-Kalem Crouch，因为仅用p22m-4a转染或仅用MR-24感染的对照细胞没有染色(对于重组MR24-Kalem Crouch病毒的图表，参见图10)。
通过连续轮的滴定、表达的pMCPK的免疫荧光检测和富集样品的稀释来进行MR-24-Kalem Crouch重组粘液瘤病毒的富集。简而言之，以一定范围的稀释度用来自感染/转染的病毒感染一系列用RK-13细胞接种的96-孔组织培养皿。3天后，将所有96-孔皿都冷冻并保留为第一轮储备物。第二系列的RK-13接种的96-孔皿然后用来自第一轮储备物的材料(来自每个孔5-10μl)感染。2-3天后，将这些重复皿用冰冷的甲醇固定，并首先用猫抗FCV多克隆抗血清染色，且然后用山羊抗猫IgG FITC标记的第二抗体染色。鉴定含有荧光的感染灶的孔并取出第一轮储备物皿上相应的孔，然后稀释并用于感染第二系列的96-孔皿，其变为第二轮储备物。重复该程序，直至病毒储存物含有大部分重组病毒。通过三轮单灶分离实现最后的纯化。扩增三个最佳染色克隆(即B8、A9和A10)，并将克隆A9用于进一步实验以测定克隆纯度(即在背景中缺乏野生型MR24生长)和插入物(即pMCPK)序列稳定性。将MR24-Kalem Crouch通过每次以0.001 MOI接种而在RK13细胞中传代5次。
为了确定pMCPK插入物的稳定性，比较了来自第1代的MR24-Kalem Crouch DNA和来自第5代的MR24-Kalem Crouch DNA。在p22m-4a相比于MR24-Kalem Crouch-第1代或MR24-Kalem Crouch-第1代相比于MR-24-Kalem Crouch-第5代中未检测到突变，表明p22m-4a中的pMCPK与MR24成功重组并且经病毒的5代保持稳定。
总之，这些实验显示，FCV Kalem Crouch (pMCPK)的加工的主要衣壳蛋白已被插入MR24-Kalem Crouch克隆A9的MGF位点中并从其表达。
结果
1. FCV Kalem Crouch的分离和生长
猫杯状病毒(FCV)毒株Kalem Crouch分离自在2010年12月在Jersey的FCV爆发期间所取的拭子。该拭子源自一只阉割的雄性，2岁6个月，命名为Kalem Crouch，并且由NewEra Veterinary Surgery, St Saviour, Jersey收集。将拭子短暂涡旋并将病毒悬浮液接种至汇合的CrFK细胞上，并在37℃和5% CO2下孵育，直至观察到FCV特异性的CPE。将感染的烧瓶冻融以裂解细胞，澄清以移除细胞碎片并在-70℃下储存。病毒的滴度为106.91 TCID50/ml。
测定分离株的核苷酸序列。该序列在SEQ ID NO:60中注释。
衣壳蛋白的氨基酸序列与公共领域中可用的其他FCV序列进行比对。序列比对在图5和7中注释。
2. 生成重组FCV病毒
2.1. FCV扩增子的制备
如方法部分5中所述制备的FCV F9或Kalem Crouch cDNA用作PCR反应中的模板，所述PCR反应用Phusion聚合酶(NEB, Ipswich, MA)、寡核苷酸引物对FKP1F (SEQ ID NO:9)和FKP1R (SEQ ID NO:10)以及表4中描述的条件以生成覆盖FCV基因组的5’末端起的5349bp的扩增子。类似地，使用寡核苷酸引物对FKP2F (SEQ ID NO:11)和FKP2R (SEQ IDNO:12)以及表5中所述的PCR条件来生成覆盖FCV F9的3’末端起的2422 bp和FCV KalemCrouch的3’末端起的2416 bp的扩增子。通过经1小时以120V在1 x TBE缓冲液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中进行电泳来解析这些扩增子和5μL GeneRuler 1kb Plus DNA梯(Thermo Scientific, Waltham, MA)。预期大小的条带显示于图1中。
2.2.使用重叠延伸PCR来组装FCV扩增子
使用QIAquick® PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)纯化结果部分2中生成的FCV扩增子。这些扩增子用于制备杂合病毒：杂合病毒FK在F9背景中包含KalemCrouch衣壳，且杂合病毒KF在Kalem Crouch背景中包含F9衣壳。
为了制备FCV FK和KF模板DNA，用FCV F9 5’末端和FCV Kalem Crouch 3’末端扩增子或FCV Kalem Crouch 5’末端和FCV F9 3’末端扩增子制备含有0.1至0.5pmol每种扩增子的等摩尔混合物。这些混合物用作具有表6中所述的条件的重叠延伸PCR反应中的模板。组装的FK和KF DNA扩增子的预期大小分别为7685bp和7702bp。通过经1小时以120V在1x TBE缓冲液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中进行电泳来解析这些样品中组装的DNA和5μL GeneRuler 1kb Plus DNA梯(Thermo Scientific, Waltham, MA)。所得组装的F9、Kalem Crouch、FK和KF的DNA显示于图2中。
2.3. 感染性FCV病毒的生成
使用Phusion聚合酶(NEB, Ipswich, MA)和寡核苷酸引物对FCVT7f (SEQ ID NO:3)和FCVpAr (SEQ ID NO:4)用表8中描述的PCR条件制备感染性FCV FK或KF DNA。感染性FCV FK和KF DNA的预期大小分别为7728bp和7737bp。通过经1小时以120V在1 x TBE缓冲液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中进行电泳来解析这些样品中的感染性FCV DNA和5μLGeneRuler 1kb Plus DNA梯(Thermo Scientific, Waltham, MA)。FK和KF的全长感染性DNA分别显示于图3部分A和B中。
2.4. 感染性FCV病毒的回收
使用QIAquick® PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从全长PCR反应物纯化感染性FCV FK和KF DNA，并使用Invitrogen® Lipofectamine® 3000试剂(Carlsbad,CA)如方法部分13中所述转染至在24-孔板上生长的50-90％汇合的BsRT7细胞上。转染的BsRT7细胞在正常生长条件下与转染复合物一起孵育24-72小时，然后通过冻融裂解。然后将来自每个孔的BsRT7裂解物应用至良好生长至50和100％之间的汇合度的CrFK细胞。在正常生长条件下孵育在BsRT7细胞裂解物存在的情况下生长的CrFK细胞，如方法部分1中所述。通常通过在CrFK细胞的单层中形成噬斑来检测病毒的存在，其类似于图4中所示的那些。
2.5. FCV FK和KF病毒的序列。
将重组FCV病毒进行测序。
已经将这些序列与图6中的FCV F9和Kalem Crouch的序列进行比较。重组FK病毒被表示为SEQ ID NO:61并且包含Kalem Crouch衣壳。重组KF病毒被表示为SEQ ID NO:62并且包含F9衣壳。
Myxo-Kalem Crouch构建体在猫中的效力
实验设计：
将15只8-11周龄的短毛家猫分成两组。一组10只猫，其用上述重组Myxo-KalemCrouch构建体(第5代)(每个剂量106.23 TCID50)间隔三周皮下接种两次；和一组5只对照猫。第二次接种后四周，将猫取拭子并且对照未接种的猫中的两只用毒性FCV毒株KalemCrouch(每只猫104.0 TCID50)鼻内攻击并与剩余的猫混合用于接触攻击。从攻击后的第1天到攻击后的第17天，每天对所有猫取拭子。记录临床观察结果，包括体重和体温。临床发现如下评分，参见表8。(施用退热剂以缓解发热和痛苦。在先前的实验中，证明了退热剂的施用对病毒分泌没有影响)。
表 8：临床体征的评分的概述
临床体征 评分
轻度不适(MA+) 1
明显不适(Ma++) 2
存在溃疡(无论数量或大小) 1
跛/跛行(无论患肢的数量) 2
病毒脱落 1
发热(温度高于≥39.5℃) 1
施用退热剂以缓解发热和痛苦(当温度高于40℃时施用) 10 (每次施用)
与前一天相比体重减轻 1
结果：
猫在接种前没有抗体(第-1天)。在猫中在接种后(第48天)没有观察到强烈的血清-转化。在猫中在攻击后(第66天)观察到强烈的血清-转化。
表 9：抗体的滴度
Figure DEST_PATH_IMAGE013
在实验开始时或攻击前一天，不能从猫分离病毒。可以从第1组和第2组的所有猫分离病毒，在属于两组的猫中观察到与FCV相关的临床体征，表明实质性攻击。
表 10：临床评分
Figure 903189DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE015
表 11：每组的临床体征：
Figure 576747DEST_PATH_IMAGE016
对数据的Kruskal-Wallis非参数检验显示接种的猫和对照猫之间的总评分(P =0.037)和发热评分(P = 0.020)的统计学显著差异，表明Myxo-Kalem Crouch构建体能够针对FCV攻击感染诱导免疫(攻击后猫的临床评分的减少)。
实验设计
2.7 产生针对FCV的FK和KF杂合病毒的超免疫血清的研究。
该研究包括六只229至432日龄的短毛家猫。这些被分成两组，每组3只猫，其中组之间相对均匀分开雄性猫。每组分开圈养。适应后，用104.6 TCID50/剂量的FCV毒株FK皮下接种属于组1的猫。用104.6 TCID50/剂量的FCV毒株KF皮下接种属于组2的猫。
然后所有猫在两周后(第14天)以105 TCID50/剂量鼻内接受第二剂量的相同病毒。在第二次接种后三周收集血清。
将血清热灭活并进行病毒中和测试。通过病毒诱导的CrFK细胞上的细胞病变效应(CPE)的减少来评价病毒中和。将32-316 TCID50的病毒的5倍重复与等体积的血清的连续稀释液(从1:4开始)混合。然后将病毒/血清混合物在37℃下孵育至少60分钟。然后将100μl病毒-血清混合物添加至用100μl生长培养基中的CrFK细胞接种的96-孔组织培养皿中。连续孵育5天。VN滴度被表示为病毒诱导的CPE完全不存在时的最高血清稀释度的倒数。
结果
表 12：首次接种(s.c.)后的VN滴度
Figure DEST_PATH_IMAGE017
NT：未测试。
表 13：第二次接种(i.n.)后的VN滴度
Figure 572384DEST_PATH_IMAGE018
数据显示重组病毒FK和KF在猫中是免疫原性的。猫中发展的抗体是功能性的(中和的)。抗体的交叉反应性显示与FCV毒株F9和FCV毒株Kalem Crouch之间观察到的层次相似的层次，使得用杂合毒株KF (F9衣壳)接种猫诱导针对毒株F9、但不针对毒株KalemCrouch的病毒中和抗体，而用杂合毒株FK (Kalem Crouch衣壳)接种导致诱导针对毒株F9和Kalem Crouch的病毒中和抗体。
2.8中和指数
使用在猫中产生的针对毒株FCV F9和Kalem Crouch的超免疫血清来测定重组FCV毒株FK和KF的中和指数。数据显示于表7中。
从表中变得清楚的是，FCV毒株FK确实被抗FCV Kalem Crouch超免疫血清强烈中和，而FCV毒株KF确实被抗FCV F9超免疫血清强烈中和。
Figure DEST_PATH_IMAGE019
表14 FCV F9和Kalem Crouch抗血清针对重组FCV FK和KF的中和指数。
表14和获得自从FK和KF接种的猫生成的血清的数据(表13)表明存在病毒中和的单向层次。F9和KF (F9衣壳)抗血清没有有效地中和Kalem Crouch或FK (Kalem Crouch衣壳)病毒，而来自用Kalem Crouch和FK (Calem Crouch衣壳)接种的猫的血清中和自身并且也显著中和F9和KF (F9衣壳)病毒。
Figure IDA0001708418250000011
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Claims (15)

1.猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白，其由SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列组成。
2.包含衣壳蛋白的活减毒FCV，所述衣壳蛋白由SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列组成。
3.DNA片段，其特征在于其包含编码根据权利要求1所述的衣壳蛋白的区域。
4.根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于将编码衣壳蛋白的区域置于合适启动子的控制下。
5.活减毒重组载体病毒(LARCV)，其特征在于所述载体病毒包含在合适启动子控制下的编码根据权利要求1所述的猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白的区域。
6.根据权利要求5所述的活减毒重组载体病毒，其特征在于所述LARCV是粘液瘤病毒或猫疱疹病毒。
7.根据权利要求5或6所述的活减毒重组载体病毒在制备用于针对FCV保护猫的药物中的用途。
8.活减毒杂合FCV，其特征在于所述FCV包含编码根据权利要求1所述的衣壳蛋白的开放阅读框2(ORF2)或根据权利要求3所述的DNA片段，并且包含来自减毒FCV的开放阅读框1(ORF1)。
9.根据权利要求8所述的活减毒杂合FCV，其特征在于所述FCV包含来自FCV毒株F9的ORF1。
10.根据权利要求8或9所述的活减毒杂合FCV在制备用于针对FCV保护猫的药物中的用途。
11.细胞培养物，其包含根据权利要求2所述的活减毒FCV、根据权利要求5或6所述的LARCV或根据权利要求8或9所述的活减毒杂合FCV。
12.用于针对FCV保护猫的疫苗，其特征在于所述疫苗包含根据权利要求2所述的活减毒FCV和/或根据权利要求5或6所述的活减毒重组载体病毒和/或根据权利要求8或9所述的活减毒杂合FCV以及药学上可接受的载体。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于所述疫苗包含至少一种其他猫致病性微生物或猫致病性病毒和/或所述猫致病性微生物或猫致病性病毒的至少一种其他免疫原性组分和/或编码所述猫致病性微生物或猫致病性病毒的所述其他免疫原性组分的遗传物质。
14.根据权利要求13所述的疫苗，其特征在于所述至少一种其他猫致病性微生物或猫致病性病毒选自猫全白细胞减少症病毒、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猫细小病毒、狂犬病病毒和猫疱疹病毒。
15.用于获得根据权利要求8或9所述的活减毒杂合FCV的方法，其包括以下步骤：
a. 制备包含减毒FCV的完整ORF1区域和ORF2区域的相邻5'-部分的第一FCV扩增子，
b. 制备包含ORF1区域的3'-部分和完整的相邻ORF2//ORF3区域的第二FCV扩增子，其中ORF2是编码根据权利要求1所述的FCV衣壳蛋白的ORF2，
c. 使用重叠延伸组装第一和第二扩增子，
d. 生成感染性FCV，
e. 用感染性FCV感染易感细胞，
f. 回收感染性后代FCV。
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