CN115850456A - 猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体以及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体以及制备方法与应用，将筛选出的猫传染性鼻结膜炎病毒CC3株、CC246株制成灭活疫苗免疫蛋鸡制备高免疫鸡蛋，分离卵黄提取抗体得到猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，可以提高对猫的保护性，且效价高、稳定性好、见效快、不会产生耐药性。本发明的制备方法，采用酸稀释法对蛋黄进行抗体粗提，然后采用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，最后超滤浓缩除盐后，经冷冻真空干燥制成二价冻干卵黄抗体，卵黄抗体制备工艺方法简单、消耗成本低、产量较高、性质稳定易储存，安全高效且无公害，可用于猫传染性鼻结膜炎病毒的紧急预防，提高保护率。

Description

猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体以及制备方法与 应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体以及制备方法与应用。

背景技术

猫传染性鼻结膜炎病毒又叫猫杯状病毒(feline coronvirus，FCV)，引起的主要症状为上呼吸道症状，即咳嗽、鼻炎、结膜炎、口腔溃疡，严重表现为肺炎和胃肠炎。该病具有高度传染性，主要感染1岁以内幼猫。其在猫群中高度流行的主要原因之一是猫常处于带毒状态，许多临床康复或无症状的猫仍会持续排毒多年，成为重要传染源，其唾液、眼鼻分泌物和排泄物是病毒的主要载体。猫传染性鼻结膜炎单独感染不会致死，但是感染后患猫免疫力下降，极易发生其他猫科上呼吸道病毒混合感染，会导致死亡率增高。

目前该病主要采用注射疫苗进行预防，但是疫苗成分为抗原，其免疫方式为主动免疫，需要刺激机体产生抗体才能起到保护作用，所需要时间较长。对于未免疫群居猫，如果其中一只猫发病，通过注射疫苗产生抗体已来不及对猫提供保护。而且疫苗的普及率很低，一旦感染国内外尚无特异性疗法。

目前猫患病后主要应用广谱抗生素防止继发感染和对症治疗，但是抗生素会通过破坏细胞壁干扰蛋白质合成，长时间使用会引起菌群失调，且不具备高度特异性，易产生耐药性，疗效并不显著。因此，开发一种针对猫传染性鼻结膜炎病毒的特异性药物，降低发病率和死亡率，具有重要的现实意义。

FCV包含大量的病毒株，在病毒株之间有大量的抗原变异，这种高水平的抗原性变异使得难以获得在猫中针对FCV的广泛保护。一些研究显示 FCV不同病毒株在衣壳变异区存在20％～40％的差异，由于FCV基因组不同，FCV抗原也呈现出多样性，抗原的多样性意味着没有疫苗能中和所有的病毒分离株。有研究发现，大多数疫苗株F9或255就存在广泛的交叉保护。另外，由于FCV的进化和相关致死性疾病的发生，现有的疫苗选用的毒株很多都不能达到足够的效力，导致免疫失败的案例频繁出现。尽管用同源毒株接种非常有效，但一种毒株针对另一种毒株的交叉保护水平是相当有限的，这对于筛选制备疫苗的抗原带来困难。

目前，由于卵黄抗体制备相对简单、成本低、产量较高，具有很好的应用前景。然而，由于FCV高水平抗原性变异性，单株卵黄抗体很难对流行的猫传染性鼻结膜炎病毒进行全部预防，且国内、外尚无商品化的猫传染性鼻结膜炎病毒二价卵黄抗体。鉴于此，本发明通过血清中和试验表明，猫传染性鼻结膜炎病毒CC3株和CC246株之间缺乏交叉保护作用，且同源性较低为78.6％，进而我们研制了猫传染性鼻结膜炎病毒二价卵黄抗体。

发明内容

第一方面，本发明提供了猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，所述抗体由FCV CC3株和FCV CC246株制备的灭活疫苗分别免疫蛋鸡后分离高免疫鸡蛋的卵黄并提取抗体混合得到，FCV CC246株和FCV CC3 株中和抗体效价均≥1:2048，FCV CC3株的基因序列如SEQ ID No.1所示， FCV CC246株的基因序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，FCV CC3株于2022年07月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.45218，分类命名为猫传染性鼻结膜炎病毒。

进一步地，FCV CC246株于2022年07月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.45217，分类命名为猫传染性鼻结膜炎病毒。

进一步地，所述抗体通过以下步骤制备得到：取FCV CC246株、FCV CC3株病毒液分别经BEI灭活后，与ISA 78佐剂混合，得到相应疫苗；选用150～200日龄海兰白蛋鸡，分别用步骤S1得到的疫苗六次免疫FCV CC246株和FCV CC3株各自组的蛋鸡；六次免疫后14天，开始分别检测鸡蛋蛋黄中抗体中和效价，当中和抗体效价≥1:256时，收集鸡蛋进行硫酸铵纯化IgY；超滤除盐，浓缩至FCV CC246株、FCV CC3株中和抗体效价均不低于1:2048，灭活，冻干。

进一步地，蛋鸡免疫程序为：免疫6次，每次免疫剂量为1.0ml/只，每次免疫间隔14天，腿部或胸部肌肉注射。

第二方面，本发明提供了上述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1、疫苗的制备：

取FCV CC246株、FCV CC3株病毒液分别经BEI灭活后，与ISA 78 佐剂1:1(V：V)混合后乳化。

S2、蛋鸡的免疫：

选用150～200日龄海兰白蛋鸡，分别用步骤S1得到的疫苗六次免疫 FCV CC246株和FCV CC3株各自组的蛋鸡；蛋鸡免疫程序为：免疫6次，每次免疫剂量为1.0ml/只，每次免疫间隔14天，腿部或胸部肌肉注射。

S3、高免鸡蛋收集：

六次免疫后14天，开始分别检测鸡蛋蛋黄中抗体中和效价，将蛋黄用乙酸-乙酸钠缓冲液进行10倍稀释，离心取上清，检测上清中猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价，当中和抗体效价≥1:256时，开始分别收集鸡蛋；

S4、卵黄抗体的纯化：

将收集鸡蛋的蛋黄分离出来，用乙酸-乙酸钠缓冲液将蛋黄进行7～10 倍稀释，搅拌至完全溶解，2～8℃静置12～24小时；12000r/min～14000r/min 离心10～15min，取上清，去沉淀；硫酸铵纯化IgY，将上清中加入终浓度 33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置 2～24小时，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀，将沉淀溶解至原体积的1/4体积的生理盐水中，加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，重复沉淀两次；将第三次硫酸铵沉淀溶解于第三次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用30KD膜包超滤除盐，当浓缩液体积为原体积的1/10时，用生理盐水补充至原体积，反复至少5次，直至用2％BaCl₂溶液检测膜下液无白色沉淀产生；体积浓缩至FCV CC246 株、FCV CC3株中和抗体效价均不低于1:2048；

S5、灭活：

猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体浓缩液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC3株卵黄抗体浓缩液分别经0.22μm过滤除菌后，按1:4000(V：V)加入β-丙内酯，在2～8℃条件下灭活48～50小时，37℃条件下水解2小时，得到猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体原液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC3株卵黄抗体原液；

S6、冻干：

取猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体原液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC3株卵黄抗体原液混合，并用生理盐水稀释使混合液中猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价均不低于1:2048。并按比例加入右旋糖酐40和甘露醇，使其终浓度分别为4％和2.5％，混合均匀，0.22μm滤器除菌过滤，无菌定量分装，悬盖冻干丁基胶塞，迅速进行冷冻真空干燥，冻干后压盖密封，2～8℃保存。

第三方面，本发明提供了上述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体在猫传染性鼻结膜炎紧急预防药物中的应用。

第四方面，本发明还提供了一种抗猫传染性鼻结膜炎病毒的药物组合物，包括上述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体和药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明将筛选出的猫传染性鼻结膜炎病毒CC3株、CC246株，缺乏交叉保护作用、且同源性较低，分别接种于F81细胞得到高含量病毒液，病毒液灭活后和佐剂混合，通过灭活疫苗免疫蛋鸡制备高免疫鸡蛋，分离卵黄提取抗体得到猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，可以提高对猫的保护性，且效价高，可达1:2048，稳定性好、见效快、不会产生耐药性。同时，用鸡生产抗哺乳动物组织成分的抗体时，可以用较少的抗原产生较多的抗体，且免疫蛋鸡卵黄中的IgY滴度能长时间维持较高水平。此外，卵黄抗体是从鸡蛋中提取，只需收集免疫蛋鸡产下的蛋即可获得抗体，对蛋鸡本身无损伤，符合动物福利和现代动物保护规则。

本发明猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体的制备方法，采用酸稀释法对蛋黄进行抗体粗提，然后采用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，最后超滤浓缩除盐后，经冷冻真空干燥制成二价冻干卵黄抗体，卵黄抗体制备工艺方法简单、消耗成本低、产量较高、性质稳定易储存，耐热、耐酸、巴氏灭菌温度下不失活，安全高效且无公害。

本发明猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，交叉保护作用好，对猫传染性鼻结膜炎病毒感染的猫能够提供有效的、更广泛的免疫保护，可用于猫传染性鼻结膜炎病毒的紧急预防，提高保护率。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3提供的FCV CC246株、FCV CC3株卵黄抗体中和抗体检测结果，其中，A：FCV CC246感染后病变的F81细胞；B：FCV CC246 株卵黄抗体中和病毒后的F81细胞。

图2为本发明实施例3提供的FCV CC3株卵黄抗体中和抗体检测结果，其中，A：FCVCC3感染病变的F81细胞；B：FCV CC246株卵黄抗体中和病毒后的F81细胞。

图3为本发明实施例3提供的FCV CC246株卵黄抗体纯度检测结果。

图4为本发明实施例3提供的FCV CC3株卵黄抗体纯度检测结果。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1毒株的筛选

本发明将由我公司从长春、沈阳、哈尔滨、张家口、北京、杭州、扬州、郑州等地的患病猫病料分离鉴定得到的13株猫传染性鼻结膜炎病毒 FCV CCSN-1、FCV CC3、FCV CC9、FCVCC10、FCV CC85、FCV CC246、 FCV CC247、FCV CC256、FCV CC272、FCV CC295、FCV CC313、FCV CC316、FCV CC320制备的兔多抗血清，另外制备免疫猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、泛白细胞减少症三联灭活疫苗(妙三多)后得到的兔多抗血清作为对照，与现有的猫传染性鼻结膜炎病毒进行交叉保护试验，和猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价测定，进而在13株猫传染性鼻结膜炎病毒毒株中筛选两株交叉保护好且抗体效价高的毒株：FCV CC3株和CC246株。妙三多抗血清可以中和6株不同株的猫传染性鼻结膜炎病毒毒株(46.2％) FCV CC3株、CC246株抗血清可以中和12株不同株的猫传染性鼻结膜炎病毒毒株(92.3％)，且FCV CC3株和FCV CC246株毒株相互之间缺乏有效的交叉保护，FCV CC246和FCV CC3抗血清中和抗体效价均不低于 1:2048。结果如表1～表3。序列比对分析发现，FCV CC3(基因序列如SEQ IDNo.1所示)株和FCV CC246株(基因序列如SEQ ID No.2所示)之间的序列同源性较低(78.6％)。

表1毒株筛选结果(1)

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表2毒株筛选结果(2)

表3毒株筛选结果(3)

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FCV CC246株由本公司分离鉴定，属于杯状病毒科，杯状病毒属，属于无囊膜的单股正链RNA病毒，已于2022年07月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45217。FCV CC3株由本公司分离鉴定，属于杯状病毒科，杯状病毒属，属于无囊膜的单股正链RNA病毒，已于2022年07月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45218。病毒TCID₅₀均不小于10^9.5/ml。

实施例2疫苗的制备

分别制备FCV CC246株、FCV CC3株疫苗。

取实施例1筛选的猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株、FCV CC3 株按MOI为0.01～0.1分别接种于F81细胞，培养24～48小时，每日观察病变情况，当细胞完全脱落后收获细胞培养物，收获病毒液，得到病毒液含量均不小于10^9.5TCID₅₀/ml；将病毒液分别经终浓度0.001mol/L的BEI 30℃灭活20小时后，加入BEI使用量的10％1mol/L的硫代硫酸钠中和BEI，将2种灭活的病毒液分别与ISA 78佐剂1:1(V：V)混合后乳化，得到相应疫苗。

BEI的制备方法为：称取BEA溶于0.2mol/L NaOH中，BEA与0.2mol/L NaOH重量体积比为2.05g：100ml，37℃水浴1小时，即成0.1mol/L BEI，该过程伴随着pH值的变化，pH值从12.5降至8.5。

实施例3二价卵黄抗体的制备

1、蛋鸡的免疫：

选用150～200日龄海兰白蛋鸡，分别用实施例2得到的疫苗六次免疫 FCV CC246株和FCV CC3株各自组的蛋鸡；为获得抗体稳定且高效价的卵黄抗体，蛋鸡免疫程序为：免疫6次，每次免疫剂量为1.0ml/只，每次免疫间隔14天，腿部或胸部肌肉注射。

2、高免鸡蛋收集：

六次免疫后14天，开始分别检测鸡蛋蛋黄中抗体中和效价，将蛋黄用乙酸-乙酸钠缓冲液进行10倍稀释，离心取上清(WSF)，检测上清中猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价，当中和抗体效价≥1:256时，开始分别收集鸡蛋。如表4的结果显示，两种抗体水平均不低于1:256。

表4蛋鸡免疫后抗体效价结果

3、卵黄抗体的纯化：

将收集鸡蛋的蛋黄分离出来，用乙酸-乙酸钠缓冲液将蛋黄进行7～10 倍稀释，搅拌至完全溶解，2～8℃静置12～24小时；12000r/min～14000r/min 离心10～15min，取上清，去沉淀；硫酸铵纯化IgY，将上清中加入终浓度 33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置 2～24小时，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀，将沉淀溶解至原体积的1/4体积的生理盐水中，加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，重复沉淀两次；将第三次硫酸铵沉淀溶解于第三次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用30KD膜包超滤除盐，当浓缩液体积为原体积的1/10时，用生理盐水补充至原体积，反复至少5次，直至用2％BaCl₂溶液检测膜下液无白色沉淀产生；体积浓缩至FCV CC246 株、FCV CC3株卵黄抗体中和抗体效价均不低于1:2048(如图1和2所示)，纯度均不小于95.0％(如图3、图4、表5、表6所示)。

表5 FCV(CC246)卵黄抗体纯度及检测结果

表6 FCV(CC3)卵黄抗体纯度及检测结果

4、灭活：

猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体浓缩液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC3株卵黄抗体浓缩液分别经0.22μm过滤除菌后，按 1:4000(V：V)加入β-丙内酯，在2～8℃条件下灭活48～50小时，37℃条件下水解2小时，得到猫传染性鼻结膜炎病毒FCVCC246株卵黄抗体原液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC3株卵黄抗体原液。

5、冻干：

取猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体原液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC3株卵黄抗体原液混合，并用生理盐水稀释使混合液中猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价均不低于1:2048。并按比例加入右旋糖酐40和甘露醇，使其终浓度分别为4％和2.5％，混合均匀，0.22μm滤器除菌过滤，无菌定量分装，悬盖冻干丁基胶塞，迅速进行冷冻真空干燥，冻干后压盖密封，2～8℃保存。

6、抗体质量标准

性状白色海绵状疏松团块。

无菌检验按现行《中国兽药典》三部附录无菌检验或纯粹检验法检测，应无菌生长。

效价测定采用中和抗体检测方法，猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价均不低于1:2048。

细菌内毒素按现行《中国兽药典》一部附录细菌内毒素检查法进行检测，应小于10EU/ml。

纯度按现行《中国兽药典》一部附录电泳法—醋酸纤维素薄膜电泳法进行检测，应不低于蛋白质总量的95.0％。

实施例4猫传染性鼻结膜炎病毒的紧急预防试验

1、方法

选取2～3月龄幼猫25只(FCV中和抗体效价不高于1：4)，随机分成7组，每组5只猫。分别为Ⅰ组(攻毒对照组1)、Ⅱ组(攻毒对照组2)、Ⅲ组(攻毒对照组3)、Ⅳ组(卵黄抗体组1)、Ⅴ组(卵黄抗体组2)、Ⅵ组(卵黄抗体组3)和Ⅶ组(空白对照组)。

Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅶ组猫皮下注射生理盐水，剂量为1.5ml/kg；Ⅳ组、Ⅴ组和Ⅵ组猫皮下注射制备的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，剂量为1.5ml/kg。24小时后，Ⅰ组和Ⅳ组采用滴鼻方式感染FCV病毒(CC3 株分离株，病毒含量为10^8.50TCID₅₀/ml)，剂量为0.25ml/鼻孔；Ⅱ组和Ⅴ组采用滴鼻方式感染FCV病毒(CC246分离株，来自西诺生物科技有限公司)，剂量为0.25ml/鼻孔；Ⅲ组和Ⅵ组采用滴鼻方式感染FCV病毒(CC295分离株，来自西诺生物科技有限公司，因其序列与FCV CC246株、FCV CC3 株同源性较低，分别为76.6％、79.7％，接种细胞后病毒液含量较高为 10^8.70TCID₅₀/ml)，剂量为0.25ml/鼻孔；Ⅶ组采用滴鼻方式感染MEM培养基，剂量为0.25ml/鼻孔。7组试验猫分别隔离饲养，每日观察记录猫的状态，连续观察14天。采集鼻咽拭子作PCR检测。发病猫判定标准为 RT-PCR检测结果为阳性且有典型的FCV感染症状(高热、口腔溃疡、呼吸系统症状)。

2、结果

2.1临床症状

Ⅰ组猫于攻毒后2～3日陆续出现精神沉郁、眼分泌物、鼻分泌物、溃疡、体温升高等；Ⅱ组、Ⅲ组猫攻毒后在接种后2日陆续出现精神沉郁、眼分泌物、鼻分泌物、溃疡、体温升高等；Ⅳ组、Ⅵ组猫1只猫出现口腔少量溃疡，打喷嚏，眼鼻有少量分泌物；Ⅴ组猫未出现明显异常症状；Ⅶ组猫未见异常表现。攻毒后14天，部分发病猫临床症状均有所好转。

2.2体温变化

Ⅰ组猫体温在攻毒后第3天体温开始升高，第6天到达峰值，为40.8℃，感染后9天体温恢复正常；Ⅱ组内在攻毒后第2天体温开始升高，第5天到达峰值，最高体温为40.5℃，感染后8天体温恢复正常；Ⅲ组其中有3只猫在第2天体温开始升高第4天到达峰值，最高体温为40.2℃，感染后9 天体温均恢复正常；Ⅳ组其中有1只猫在第5天、第6天出现体温升高，后恢复正常；Ⅵ组猫其中有1只猫在第3天体温升高，在第6天均恢复正常；Ⅴ组、Ⅶ组猫体温变化波动不太大。对照组与卵黄抗体组评分比较差异极显著(P＜0.01)，结果见下表7、表8。

表7猫传染性鼻结膜炎病毒紧急预防试验体温情况(Ⅰ组～Ⅲ组)

表8猫传染性鼻结膜炎病毒紧急预防试验体温情况(Ⅳ组～Ⅶ组)

2.3FCV PCR检测结果

Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组猫攻毒后第2～3日眼鼻拭子可检出猫传染性鼻结膜炎病毒阳性，排毒持续时间大于7日，攻毒后第10日试验猫开始出现死亡；Ⅳ组、Ⅵ组第2～3日眼鼻拭子可检出为阳性；排毒持续时间不大于4日；Ⅴ组、Ⅶ组猫检测均为阴性。结果见表9、表10。

表9猫传染性鼻结膜炎病毒紧急预防试验病毒检测情况(Ⅰ组～Ⅲ组)

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“*”代表试验猫死亡。

表10猫传染性鼻结膜炎病毒紧急预防试验病毒检测情况(Ⅳ组～Ⅶ组)

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“*”代表试验猫死亡。

3结论

在紧急预防试验中，注射本发明的猫传染性鼻结膜炎二价冻干卵黄后，试验猫可获得不低于80％的保护，且无死亡情况。

抗体Ⅰ组(攻毒对照组1)、Ⅱ组(攻毒对照组2)、Ⅲ组(攻毒对照组 3)的发病率均为100％，保护率为0，死亡率分别为60％、40％、60％；Ⅳ组(卵黄抗体组1)、Ⅴ组(卵黄抗体组2)、Ⅵ组(卵黄抗体组3)的发病率均为20％、20％、0，保护率为80％、100％、80％，死亡率均为0；Ⅶ组(空白对照组)未发病。结果见表11。

表11各组试验猫发病率、保护率和死亡率结果

通过以上试验可知，本发明的猫传染性鼻结膜炎二价冻干卵黄抗体，交叉保护作用好，对猫传染性鼻结膜炎病毒感染的猫能够提供有效的、更广泛的免疫保护，可用于猫传染性鼻结膜炎病毒的紧急预防，具有广泛的应用前景。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (8)

1.猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，其特征在于，所述抗体由FCV CC3株和FCV CC246株制备的灭活疫苗分别免疫蛋鸡后分离高免疫鸡蛋的卵黄并提取抗体混合得到，FCV CC246株和FCV CC3株中和抗体效价均≥1:2048，FCV CC3株的基因序列如SEQ IDNo.1所示，FCV CC246株的基因序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，其特征在于，FCVCC3株于2022年07月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45218，分类命名为猫传染性鼻结膜炎病毒。

3.如权利要求1所述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，其特征在于，FCVCC246株于2022年07月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45217，分类命名为猫传染性鼻结膜炎病毒。

4.如权利要求1所述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，其特征在于，所述抗体通过以下步骤制备得到：取FCV CC246株、FCV CC3株病毒液分别经BEI灭活后，与ISA 78佐剂混合，得到相应疫苗；选用150～200日龄海兰白蛋鸡，分别用步骤S1得到的疫苗六次免疫FCV CC246株和FCV CC3株各自组的蛋鸡；六次免疫后14天，开始分别检测鸡蛋蛋黄中抗体中和效价，当中和抗体效价≥1:256时，收集鸡蛋进行硫酸铵纯化IgY；超滤除盐，浓缩至FCV CC246株、FCV CC3株中和抗体效价均不低于1:2048，灭活，冻干。

5.如权利要求4所述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体，其特征在于，蛋鸡免疫程序为：免疫6次，每次免疫剂量为1.0ml/只，免疫间隔14天，腿部或胸部肌肉注射。

6.如权利要求1所述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、疫苗的制备：

取FCV CC246株、FCV CC3株病毒液分别经BEI灭活后，与ISA 78佐剂1:1(V：V)混合后乳化；

S2、蛋鸡的免疫：

选用150～200日龄海兰白蛋鸡，分别用步骤S1得到的疫苗免疫FCV CC246株和FCV CC3株各自组的蛋鸡；蛋鸡免疫程序为：每次免疫剂量为1.0ml/只，每次免疫间隔14天，免疫6次，腿部或胸部肌肉注射；

S3、高免鸡蛋收集：

六次免疫后14天，开始分别检测鸡蛋蛋黄中抗体中和效价，将蛋黄用乙酸-乙酸钠缓冲液进行10倍稀释，离心取上清，检测上清中猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价，当中和抗体效价≥1:256时，开始分别收集各自组鸡蛋；

S4、卵黄抗体的纯化：

将收集鸡蛋的蛋黄分离出来，用乙酸-乙酸钠缓冲液将蛋黄进行7～10倍稀释，搅拌至完全溶解，2～8℃静置12～24小时；12000r/min～14000r/min离心10～15min，取上清，去沉淀；硫酸铵纯化IgY，将上清中加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置2～24小时，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀，将沉淀溶解至原体积的1/4体积的生理盐水中，加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，重复沉淀两次；将第三次硫酸铵沉淀溶解于第三次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用30KD膜包超滤除盐，当浓缩液体积为原体积的1/10时，用生理盐水补充至原体积，反复至少5次，直至用2％BaCl₂溶液检测膜下液无白色沉淀产生；体积浓缩至FCV CC246株、FCV CC3株中和抗体效价均不低于1:2048；

S5、灭活：

猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体浓缩液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCVCC3株卵黄抗体浓缩液分别经0.22μm过滤除菌后，按1:4000(V：V)加入β-丙内酯，在2～8℃条件下灭活48～50小时，37℃条件下水解2小时，得到猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体原液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC3株卵黄抗体原液；

S6、冻干：

取猫传染性鼻结膜炎病毒FCV CC246株卵黄抗体原液和猫传染性鼻结膜炎病毒FCVCC3株卵黄抗体原液混合，并用生理盐水稀释使混合液中猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价均不低于1:2048。并按比例加入右旋糖酐40和甘露醇，使其终浓度分别为4％和2.5％，混合均匀，0.22μm滤器除菌过滤，无菌定量分装，悬盖冻干丁基胶塞，迅速进行冷冻真空干燥，冻干后压盖密封，2～8℃保存。

7.如权利要求1所述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体在猫传染性鼻结膜炎紧急预防药物中的应用。

8.一种抗猫传染性鼻结膜炎病毒的药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-6任一项所述的猫传染性鼻结膜炎病毒二价冻干卵黄抗体和药学上可接受的载体。

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