WO2005007838A1 - 細胞分化抑制剤、これを用いた細胞培養方法、培養液及び培養された細胞株 - Google Patents

細胞分化抑制剤、これを用いた細胞培養方法、培養液及び培養された細胞株

Info

Publication number
WO2005007838A1
WO2005007838A1 PCT/JP2004/009379 JP2004009379W WO2005007838A1 WO 2005007838 A1 WO2005007838 A1 WO 2005007838A1 JP 2004009379 W JP2004009379 W JP 2004009379W WO 2005007838 A1 WO2005007838 A1 WO 2005007838A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
hydrogen atom
compound
lower alkyl
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/009379
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tomoyuki Miyabayashi
Masashi Yamamoto
Original Assignee
Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Kabushiki Kaisha filed Critical Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
Priority to JP2005511810A priority Critical patent/JP4667241B2/ja
Priority to KR1020057024980A priority patent/KR101160698B1/ko
Priority to AU2004257966A priority patent/AU2004257966B2/en
Priority to EP04746848A priority patent/EP1640449A4/en
Publication of WO2005007838A1 publication Critical patent/WO2005007838A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/12—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with radicals, substituted by hetero atoms, attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/14—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with radicals, substituted by hetero atoms, attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring other than aralkyl radicals
    • C07D217/16—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with radicals, substituted by hetero atoms, attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring other than aralkyl radicals substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/655—Azo (—N=N—), diazo (=N2), azoxy (>N—O—N< or N(=O)—N<), azido (—N3) or diazoamino (—N=N—N<) compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a stem cell differentiation inhibitor comprising a low molecular compound, particularly a tetrahydroisoquinoline derivative as an active ingredient, a stem cell culture method using the same, a culture solution, and a stem cell line prepared using the same.
  • the present invention further relates to a novel bicyclic compound having an effect of maintaining undifferentiation of stem cells.
  • Organs and tissues damaged by trauma, illness, or even aging need to promote regeneration and restore their functions.
  • real organs such as the heart, liver, kidney, and spleen are indispensable for life support, and their functions are impaired.Abolition is directly linked to death, so transplant medical treatments that seek to save lives by organ transplantation are being actively conducted. .
  • the constant shortage of donors requires a new approach to address them.
  • stem cells which are present in embryos or adults, and are thought to have the ability to divide indefinitely and differentiate in one or more directions, to produce tissues and organs, and to supplement defective tissues.
  • Regenerative medicine is gaining attention as a treatment that surpasses the shortcomings of conventional organ transplantation.
  • stem cells after stem cells are proliferated, they are differentiated and used for cell transplantation, or artificial tissues are constructed in conjunction with the use of artificial support tissues, and then transplanted into a living body or used as an artificial organ. Things are considered. If stem cells can be used for cell transplantation therapy and tissue engineering, it is expected that problems associated with conventional transplantation treatments, including autologous transplantation, such as tissue loss and donor shortage after transplantation of donors will be solved.
  • Stem cells have been identified in many fields, such as blood vessels, nerves, blood, cartilage, bone, liver, and pancreas, and among them, totipotent stem cells, which have the ability to differentiate into all cell types, In addition to the regenerative medicine field mentioned above, cells for drug discovery and gene therapy In addition, the cells are particularly attracting attention as cells that can easily provide tissues.
  • ES cells embryonic stem (Embryonic Stem, hereinafter ES) cells and embryonic germ (Embryonic Germ, hereafter EG) cells are known.
  • ES cells are a cell line isolated from the inner cell mass (ICM) of the mouse blastocyst stage (Evans et al., Nature, 292, pl54, 1981).
  • the cells that make up an individual are derived from the inner cell mass (ICM) at the blastocyst stage or the primary ectoderm derived from the epiblast of the gastrulation (epiblast).
  • Epiblast is a totipotent stem cell group.
  • ES cells retain their ability to differentiate into various tissue-forming tissues and have the ability to differentiate into all mature adult cells by forming normal and chimeric embryos. It also has the ability to generate various cells, such as blood cells, cardiomyocytes, vascular endothelial cells, nerve cells, pigment cells, and endocrine cells, depending on the conditions of in vitro differentiation induction. Medicine, p 81-89, 2000).
  • EG cells are cells established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF (leukemia inhibitory factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor) (Matsui et al., Cell, 7). 0, p841, 1992, Resnic et al., Nature, 359, p550, 1992), has the ability to differentiate into various tissues like ES cells ing.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • ES cell lines other than mice have pluripotency similarly to mouse ES cells
  • Porcine ES cells Strojek et al., Theriogenology, 33: p901, 1990
  • Sheep ES cells Handyside, Roux's Arch. Dev. Biol., 196: pl85, 1987
  • Hamster ES cells Doetschman et al., Dev. Biol., 127, p224, 1988
  • germ monkey ES cells Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • marmoset ES cells Thomson et al., Biology of Production, 55, p254, 1996
  • human ES cells Thomson et al., Science, 282, pll45, 1998
  • Reubinoff et al. (Nature Biotech, 18, p399, 2000
  • R. cynomolgus monkey ES cells Suemori et al., Dev. Dyn. 222, P273, 2001).
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • PD 98059 (manufactured by Cell Signaling Technology) has been reported as a low-molecular compound that amplifies LIF-induced undifferentiation of embryonic stem cells, but the effect of PD 98059 is LIF-dependent. There is no effect by itself (Burdon et al., Dev. Biol., 210, p30, 1999), so the above-mentioned problems cannot be solved.
  • the differentiation inhibitor of the present invention contains a low-molecular compound as an active ingredient, but it has not been known that the low-molecular compound maintains an undifferentiated state of totipotent stem cells. Therefore, the low molecular weight compounds represented by the general formulas (1) to (10) described in the present specification did not have any known effects of maintaining the undifferentiation of totipotent stem cells.
  • the present invention has been made in order to achieve the above object, and is a differentiation inhibitor capable of culturing stem cells and embryonic stem cells in an undifferentiated state.
  • the present invention relates to a method, a cell culture solution containing such a differentiation inhibitor, and a cell line produced by culturing using such a differentiation inhibitor.
  • the present invention has the following configuration.
  • a stem cell differentiation inhibitor comprising a low molecular compound or a salt thereof as an active ingredient.
  • RRR 3 and R 4 may be the same or different and each represents an electron-withdrawing group, an electron-donating group, or a hydrogen atom.
  • Ring A represents a 5- to 8-membered ring containing at least one heteroatom in the ring.
  • X represents an alkylene group having 0 to 10 main chain atoms.
  • An alkylene group having 0 atoms represents a single bond.
  • the bond bonded to ring A may be a group that forms a double bond.
  • the alkylene group has an electron absorbing property as a substituent.
  • G represents an electron withdrawing group, an electron donating group or an aromatic group which may have a hydrogen atom.
  • the ring A may have one or more electron-withdrawing groups and / or electron-donating groups as substituents other than the XG group.
  • the stem cell differentiation inhibitor according to the above (1) which is a compound represented by the formula:
  • a ring is a 5- or 6-membered ring containing at least one heteroatom selected from the group consisting of a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom. Agent.
  • the alkylene group represented by X is an alkyl group, an acyl group, an alkoxy group, a nitro group, a hydroxycarbonyl group, an alkoxycarbonyl group, an aminocarbonyl group, a nitrile group and a halogen atom
  • R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 may be the same or different, and represent an electron-withdrawing group, an electron-donating group, or a hydrogen atom.
  • the stem cell differentiation inhibitor according to the above (2) which is a compound represented by the formula:
  • the low molecular weight compound is represented by the general formula (3)
  • R 5 and R 6 may be the same or different and each represents an electron-withdrawing group, an electron-donating group, or a hydrogen atom.
  • the stem cell differentiation inhibitor according to the above (2) which is a compound represented by the formula:
  • R 1 R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 are the same as defined in the above (6).
  • R 1Q , R 11 R 12 and R 13 may be the same or different and each represents an electron withdrawing group, an electron donating group or a hydrogen atom.
  • a double-sided broken line represents a single bond or a double bond. If the double dashed line represents a double bond, geometric isomers exist for the wavy line. The arrangement of these geometric isomers is not particularly limited, and may be independently E-form or Z-form. ]
  • the agent for suppressing stem cell differentiation according to the above (6) which is a compound represented by the formula:
  • R ⁇ R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R ", R 12 , and R 13 are each independently A group or atom selected from the group consisting of an alkyl group, an acyl group, an alkoxy group, a nitro group, a hydroxycarbonyl group, a nitrile group, an alkoxycarbonyl group, an aminocarbonyl group, a halogen atom and a hydrogen atom.
  • the agent for suppressing stem cell differentiation according to (8).
  • the low molecular weight compound has the general formula (5)
  • R 1Q , 1 and R 12 may be the same or different and each represents an electron withdrawing group, an electron donating group or a hydrogen atom.
  • the stem cell differentiation inhibitor according to the above (6) which is a compound represented by the formula:
  • R ⁇ R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 and R 12 are each independently an alkyl group, an acyl group
  • the above (10) which is a group or atom selected from the group consisting of a group, an alkoxy group, a nitro group, a hydroxycarbonyl group, a nitrile group, an alkoxycarbonyl group, an aminocarbonyl group, a halogen atom and a hydrogen atom.
  • Stem cell differentiation inhibitor is a group or atom selected from the group consisting of a group, an alkoxy group, a nitro group, a hydroxycarbonyl group, a nitrile group, an alkoxycarbonyl group, an aminocarbonyl group, a halogen atom and a hydrogen atom.
  • the low molecular weight compound is represented by the general formula (6)
  • RR 2 , R 3 , R 4 , R 5 , and R 6 are the same as defined in the above (7).
  • R 7 , R 8 and R 9 may be the same or different and each represents an electron withdrawing group, an electron donating group or a hydrogen atom.
  • the stem cell differentiation inhibitor according to the above (7) which is a compound represented by the formula:
  • R ⁇ R 2 S R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 each independently represent an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxy group, a nitro group, a nitrile.
  • RR 2 , R ⁇ R 4 , R 8 , R 9 and R 1 are hydrogen atoms
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group or a lower alkyl group
  • R 6 and R 7 is a lower alkyl group which may be the same or different
  • R 11 is a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group or a lower alkoxy group
  • R 12 is a hydrogen atom, a lower alkyl group
  • R 13 is a hydroxycarbonyl group, a nitryl group, an aminocarbonyl group, or a lower alkoxycarbonyl group, wherein R 13 is a lower acyl group or a lower alkoxy group;
  • the agent for suppressing stem cell differentiation according to (8).
  • R ⁇ R 2 , R 3 , RR 8 , and R 9 are hydrogen atoms
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group, or a lower alkyl group
  • d is a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkoxy group, or a lower alkoxycarbonyl group
  • R 12 is a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower acyl group, or Is a lower alkoxy group
  • R 1 and R 2 are hydrogen atoms
  • R 3 is a hydroxyl group or an acetyloxy group
  • R 4 is an acetyloxyalkyl group, a cyclic alkylaminoalkyl group which may contain an oxygen atom
  • R 5 is a lower alkyl group or an arylaminovinyl group
  • R 6 is a nitro group
  • R 7 , R 8 , and R 9 are a hydroxyalkylaminoalkyl group or a hydrogen atom
  • RR ⁇ R and R 4 may be the same or different and each is a hydrogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, or a halogen atom, and R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group.
  • R 6 ⁇ Pi R 7 may each be the same or different, a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group which may form a cyclic structure
  • R 8 And R 9 are hydrogen atoms
  • R 1 G , R 11 and R 12 may be the same or different, and each may be a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower acyl group or A lower alkoxy group, wherein R 13 represents a hydroxycarbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a secondary aminocarbonyl group or a tertiary aminocarbonyl group;
  • Geometrical isomers exist in the wavy line portion, and the arrangement of these geometrical isomers is not particularly limited, and each may be independently an E-form or a Z-form.
  • R 1 R 2 , R ⁇ and R 4 may be the same or different; An atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, or a halogen atom; R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group, or a lower alkyl group; R 6 and R 7 are the same or different; A hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group which may form a cyclic structure, R 8 and R 9 are hydrogen atoms, and R 1 G and R 12 are a hydrogen atom, a halogen atom, A nitro group, a lower alkyl group, a lower acyl group or a lower alkoxy group, R 11 is a lower acyl group, and R 13 is a hydroxycarbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group, or an aminocarbonyl group .
  • R 13 is a hydroxycarbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group, or
  • RR 2 , and R 4 may be the same or different and each is a hydrogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, or a halogen atom
  • R 5 is a lower acryl group
  • R 6 and R 7 may be the same or different, and each may be a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group which may form a cyclic structure
  • R 8 and R 9 is a hydrogen atom
  • R 1 G, R 1 1 and R 1 2 are each may be the same or different, a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower Ashiru group or a lower alkoxy group
  • R 13 represents a hydroxycarbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group or an aminocarbonyl group.
  • Geometric isomers exist in the wavy line portion, and the arrangement of these geometric isomers is not particularly limited, and
  • R 2 , R 3 , and R 4 may be the same or different, and each is a hydrogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, or a halogen atom, and R 5 is a hydrogen atom.
  • R 6 and R 7, which may be the same or different, may be a lower alkyl group or a lower alkyl group which may form a cyclic structure
  • R 8 and R 9 is a hydrogen atom
  • R 1 G , R 1 ⁇ and R 12 may be the same or different, and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower acyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 13 represents a nitrile group.
  • geometrical isomers with respect to the wavy portion and the arrangement of these geometrical isomers is not particularly limited, and each may be independently the E-form or the Z-form. ]
  • RR ⁇ R and R 4 may be the same or different and each is a hydrogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, or a halogen atom, and R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group.
  • R 6 and R 7 may be the same or different and may form a hydrogen atom, a lower alkyl group or a cyclic structure, a lower alkyl group, 8 and R 9 are hydrogen atoms, and R 10 , R 11 , and R 12 may be the same or different, and each may be a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower acyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 13 represents a hydroxycarbyl group, a lower alkoxycarbonyl group, an aminocarbonyl group, or a nitrile group.
  • R ⁇ R 2 , R 'and R 4 are hydrogen atoms
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group or a lower alkyl group
  • R 6 and R 7 are the same or different.
  • R 8 , R 9 and R 1 G are hydrogen atoms. ?
  • RRR 3 and R 4 are hydrogen atoms
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group or a lower alkyl group
  • R 6 and R 7 may be the same or different and may be lower.
  • An alkyl group, R 8 , R 9 and R 1 D are hydrogen atoms
  • R 11 is a lower acetyl group
  • R 12 is a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower acryl group, or A lower alkoxy group
  • R 13 is a hydroxycarbyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a carbamoyl group, a mono-lower alkylaminocarbonyl group, a di-lower alkylaminocarbonyl group, or a phenylaminocarbonyl group
  • R ⁇ R 2 , R 3 , and R 4 are hydrogen atoms
  • R 5 is a lower acyl group or a lower alkyl group
  • R 6 and R 7 are the same but different
  • R 8 , R 9 and R 1 Q are hydrogen atoms; ? Thank you!
  • ⁇ May be the same or different, and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower acyl group or a lower alkoxy group, and R 13 is a hydroxycarbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group,
  • R ⁇ RR and R 4 are hydrogen atoms
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group or a lower alkyl group
  • R 6 and R 7 may be the same or different It is a lower alkyl group
  • R 8 , R 9 and R 1 D are hydrogen atoms.
  • ⁇ may be the same or different, and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower acyl group or a lower alkoxy group
  • R 13 is a nitrile group
  • R ⁇ RR and R 4 are hydrogen atoms
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group or a lower alkyl group
  • R 6 and R 7 may be the same or different
  • R 8 , R 9 and R 1 Q are hydrogen atoms; ? as well as! ? ⁇ May be the same or different, and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkyl group, a lower acyl group or a lower alkoxy group
  • R 13 is a hydroxycarbonyl group or a lower alkoxycarbonyl group.
  • (21) The compound according to (21) or a salt thereof, which is a canolebamoyl group, a mono-lower alkylaminocarbonyl group, a di-lower alkylaminocarbonyl group, a phenylaminocarbonyl group, or a nitrile group.
  • An agent for inhibiting stem cell differentiation comprising the compound according to any one of (17) to (31) or a salt thereof as an active ingredient.
  • Stem cells characterized by culturing stem cells in an undifferentiated state using the stem cell differentiation inhibitor according to any one of (1) to (16) and (32) to (38). Culture method.
  • a pharmaceutical composition comprising the compound according to any of (17) to (31) or a salt thereof or a prodrug thereof.
  • FIG. 1 shows the structure of Compound A of the present invention.
  • Compound A is a compound in which R 1 to R 12 in formula (5) in FIG. 1 are represented by the groups or elements shown in the following table.
  • FIG. 2 shows the structures of compounds BF of the present invention.
  • Compounds B to F are compounds in which R 1 to R 13 in formula (4) in FIG. 2 are represented by groups or elements shown in the following table.
  • FIG. 3 shows the results of alkaline phosphatase quantification 1.
  • FIG. 4 shows the results of alkaline phosphatase staining 1.
  • FIG. 5 shows the results of STAT3 activation case 1.
  • FIG. 6 shows the expression level of the Oct_3Z4 gene.
  • FIG. 7 shows the expression level of nanog gene.
  • FIG. 8 shows the results of the average fluorescence intensity in the evaluation of the expression level 1 of the SSEA-1 antigen.
  • FIG. 9 shows the structures of compounds ao of the present invention. Compounds a to o are compounds of formula (6) in FIG. ⁇ ⁇ ! ⁇ 9 is represented by the groups or elements shown in the table below.
  • FIG. 10 shows the results of alkaline phosphatase assay 2 using the differentiation inhibitor of the present invention.
  • FIG. 11 shows the results of the average fluorescence intensity in the evaluation of the expression level 2 of the SSEA-1 antigen.
  • FIG. 12 shows the results of STAT3 activation case 2.
  • FIG. 13 shows the result 1 of the ES cell subculture.
  • FIG. 14 shows the result 2 of the ES cell subculture.
  • FIG. 15 shows the effect of the differentiation inhibitor of the present invention on the maintenance of undifferentiated embryonic stem cells.
  • FIG. 16 shows the effect of the differentiation inhibitor of the present invention on the maintenance of undifferentiated embryonic stem cells (stained diagram).
  • FIG. 17 shows the structure of Compound II of the present invention. In the compound ⁇ , ⁇ to ⁇ 3 in the formula (10) in FIG. 17 are represented by groups or elements shown in the following table.
  • FIG. 18 shows the structures of compounds 2 to 10 of the present invention.
  • Compounds 2 to 10 are represented by the formula (9) in FIG. ⁇ 1 to!? 13 are represented by the groups or elements shown in the table below.
  • FIG. 19 shows a staining diagram of alkaline phosphatase staining.
  • a stem cell refers to another cell type that has a specialized function, that is, a cell that has finally differentiated or can be differentiated into another stem cell type that can be differentiated into a narrower range of cell types. .
  • Totipotent stem cells are divided into any type of cell, including pluripotent cells and fully differentiated cells (ie, cells that can no longer differentiate into various cells). A cell that can be transformed.
  • Pluripotent stem cells are cells that are not necessarily all types, but are capable of dividing into one of many different cell types.
  • One example of a pluripotent cell is a hematopoietic stem cell, which can differentiate into various blood cell types such as lymphocytes and red blood cells.
  • Embryonic stem cells are totipotent cells obtained from the morula or blastocyst stage of embryos, especially in the preimplantation stage, among stem cells, and are also called ES cells. Embryonic stem cells may also refer to pluripotent stem cells derived from primordial germ cells of an embryo or a fetus that have been determined to be sperm or ova. However, these cells are sometimes called embryonic germ (EG) cells and are sometimes distinguished from embryonic stem cells. As used herein, embryonic stem cells are of any animal species. Examples include embryonic stem cells such as primates, including humans, non-primate mammals, and birds.
  • Totipotent refers to a state capable of differentiating into any cell type, including pluripotent cells and fully differentiated cells (ie, cells that can no longer differentiate into various cells).
  • Pluripotency is a condition that does not necessarily come in all types, but can differentiate into one of many different cell types.
  • Undifferentiated Undifferentiated is a condition in which a cell or any population of cells has the ability to differentiate into one or more more differentiated cells. It refers to a state of a cell or a cell population containing the cell.
  • Feeder A feeder used for the purposes of describing the present invention refers to one on which totipotent stem cells are plated to provide an environment that assists in the growth of the plated totipotent stem cells.
  • a feeder cell used for the purpose of describing the present invention refers to a non-totipotent stem cell on which totipotent stem cells are plated, and a non-totipotent stem cell is a plated totipotent stem cell.
  • Provide an environment that helps the growth of Cell-derived components All components derived from cells, including components secreted from cells, contents, and cell membrane components.
  • the present invention relates to a differentiation inhibitor capable of maintaining stem cells, preferably embryonic stem cells in an undifferentiated state, and to maintain proliferation, a culture method using the same, a culture solution using the same, and a culture prepared using the same.
  • the differentiation inhibitor, the culture method, and the culture solution provided by the present invention can grow and maintain undifferentiated embryonic stem cells more easily and safely than ever before.
  • the cell culture method containing the differentiation inhibitor of the present invention can also be used to screen for a specific differentiation-inducing factor and a useful combination of differentiation-inducing factors.
  • the ability to grow undifferentiated embryonic stem cells using the differentiation inhibitor of the present invention and the culturing method can be used to identify embryonic stem cell lines having one or more genetic modifications having important therapeutic applications.
  • any compounds can be used as long as they are chemically stable low molecular weight compounds and have an activity of maintaining stem cells in an undifferentiated state.
  • the low molecular weight compound represented by (1) is mentioned.
  • RR 2 ,, and R 4 may be the same or different and each represents an electron-withdrawing group, an electron-donating group, or a hydrogen atom.
  • the electron donating group is a substituent capable of donating an electron to the benzene ring
  • the electron withdrawing group is a substituent having a property of attracting ⁇ electrons on the benzene ring. It is also possible to define ⁇ 0 as an electron donating group and ⁇ > 0 as an electron withdrawing group using Hammett's substituent constant ⁇ (Basic Organic Reaction Theory, Shizunobu Hashimoto et al., Sankyo Publishing, 1997). .
  • the ring represents a 5- to 8-membered ring containing at least one heteroatom in the ring.
  • An alkylene group having 0 atoms represents a single bond.
  • the pound that bonds to Ring A may be a group that forms a double bond.
  • the alkylene group may have one or more electron-withdrawing groups, electron-donating groups or hydrogen atoms as substituents.
  • G represents an electron withdrawing group, an electron donating group or an aromatic group which may have a hydrogen atom.
  • the ring A may have one or more electron-withdrawing groups, Z or electron-donating groups as substituents other than the XG group.
  • the ring A is a 5- or 6-membered ring containing at least one hetero atom in the ring selected from the group consisting of a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom. It is also desirable that ring A is a 5- or 6-membered ring containing one nitrogen atom in the ring. In this case, the five-membered ring is desirably unsaturated, and the six-membered ring is desirably saturated.
  • the alkylene group represented by X is an alkyl group, an acyl group, an alkoxy group, a nitro group, a hydroxycarbonyl group, an alkoxycarbonyl group, an aminocarbonyl group, a nitrile group and a halogen atom as a substituent. It is preferable that the compound has at least one selected group and Z or atom.
  • examples of the general formula (1) include a tetrahydroisoquinoline derivative represented by the formula (2) and an indole derivative represented by the general formula (3).
  • RR 2 , R 3 , R 4 , X and G are as defined above.
  • R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 may be the same or different, and represent an electron-withdrawing group, an electron-donating group, or a hydrogen atom.
  • R 1 R 2 , R 3 , RX and G are as defined above.
  • R 5 and R 6 may be the same or different and each represents an electron-withdrawing group, an electron-donating group, or a hydrogen atom.
  • tetrahydroisoquinoline derivative represented by the general formula (2) examples include: Examples include compounds and salts having a structure represented by the formula (4) or the formula (5).
  • ⁇ 1 to ⁇ 3 may be the same or different and each represents an electron withdrawing group, an electron donating group or a hydrogen atom.
  • alkyl group, Ashiru group, an alkoxy group, a nitro group, hydroxycarboxylic Poni group, nitrile group, an alkoxycarbonyl group, Aminoka Ruponiru group, a halogen atom ⁇ Pi group or nuclear S selected from the group consisting of hydrogen atom can give.
  • R 8 , R 9 and R 10 are hydrogen atoms
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group or a lower alkyl group.
  • R 6 and R 7 are lower alkyl groups which may be the same or different,
  • R 11 is a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group or a lower alkoxy group, and
  • R 12 is a hydrogen atom An atom, a lower alkyl group, a lower acyl group, or a lower alkoxy group, wherein R 13 is a hydroxycarbonyl group, a nitrile group, an aminocarbonyl group, or a lower alkoxycarbonyl group;
  • Examples of the lower alkyl group represented by R include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentinole, isopenpentole, neopentinole, 1-methylpropyl, Examples include n-hexyl, isohexyl, 1,1-dimethinolebutynole, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylinobutynole, 3,3-dimethylinopropyl, and 2-ethylbutyl. Preferably, it is methyl.
  • Examples of the lower alkoxy group represented by R include methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentoxy, hexyloxy, heptoxy and octyloxy. . Preferred is methoxy.
  • halogen atom represented by R examples include fluorine, chlorine, bromine, and iodine, and are preferably chlorine or bromine.
  • Examples of the lower acetyl group represented by R include formyl, acetyl, propionyl, butyryl and the like, with acetyl being preferred.
  • the lower alkyl group which may form a cyclic structure represented by R is cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclopentyl, cyclooctyl, etc., preferably cyclopentyl, cyclohexyl , Is the mouth of the mouth.
  • the lower alkoxycarbonyl represented by R includes methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl and the like, and is preferably methoxycanoleponyl or ethoxycarbonyl.
  • Examples of the aminocarbonyl represented by R include, for example, -C0NR 2 (R represents a hydrogen atom which may be the same or different, a lower alkyl group exemplified above, or a phenyl group which may have a substituent. ) And the like.
  • Examples of the secondary aminocarbonyl group represented by R include —C0 HR (representing a lower alkyl group and a phenyl group which may have a substituent) as exemplified above.
  • Examples of the tertiary aminocarbonyl group include, for example, -C0NR 2 (R represents a lower alkyl group which may be the same or different, and a fuynyl group which may have a substituent) Is mentioned.
  • Examples of the aminoalkyl group represented by R include, for example, one (CH 2 ) n -NR 2 (n represents 1 to 8, but preferably 1. Further, R is a hydrogen atom which may be the same or different, Lower alkyl group, lower alkyl group that may form a cyclic structure (cyclic structure may contain 1 to 3 heteroatoms such as nitrogen and oxygen), substituent that may have a substituent Represents a phenyl group).
  • the double-sided broken line in the formula (4) represents a single bond or a double bond.
  • geometric isomers exist in the wavy portion (two places).
  • the configuration of these geometric isomers is not particularly limited, and may be each independently E-form or Z-form.
  • the compound of the present invention is a compound of the geometrical isomer in a pure form based on these geometric isomers. It can be any mixture.
  • R 8 and R 9 are hydrogen atoms
  • R 1 Q is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • R 5 is a hydrogen atom, a lower acyl group, or a lower alkyl group
  • 6 and R 7 is a lower alkyl group which may be the same or different
  • R 1 1 is a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a lower alkoxy shea group or a lower alkoxycarbonyl group
  • R 1 2 is a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower acyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 1 3 is ⁇ amino carbonyl group, the compound represented by the general formula (7) below .
  • examples of the more specific compound included in the general formula (4), which is a tetrahydroisone quinoline derivative are as follows.
  • ⁇ 1 to!? 4 and R 6 to R 12 include the same or different electron-withdrawing groups, or groups or atoms selected from electron-donating groups or hydrogen atoms.
  • R 6 to R 12 include the same or different electron-withdrawing groups, or groups or atoms selected from electron-donating groups or hydrogen atoms.
  • R 1 to R 4 and R 6 to Ri 2 are the same or different and are an alkyl group, an alkenyl group, an alkyl group, a phenyl group, a naphthyl group, a furyl group, a chenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkylcarbonyl Group, benzoyl group, naphthoyl group, furoyl group, tenyl group, dialkylcarbamoyl group, acetyl group, butanol group, methoxycarbonyl group, cycloalkyl group, benzyloxy group, adamantyloxy group, nitro group A group selected from the group, or a halogen atom or a hydrogen atom Is mentioned.
  • R 6 ⁇ R 1 2 alkyl group, Asechiru group, an alkoxycarbonyl group, a nitro group, it Motoma other selected from the group consisting of a halogen atom or a hydrogen atom is the atomic desirable .
  • Examples of the compound included in the general formula (5) include the following.
  • a pharmaceutically acceptable salt is desirable.
  • hydrochloride, sulfate, phosphate, hydrobromide, acetate, maleate, fumarate, succinate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, citrate, tartaric acid A salt or the like may be formed.
  • ester compounds of the compounds represented by the general formulas (4) and (5) are also included in the scope of the present invention, and include, for example, carboxylic acid esters, sulfonic acid esters, and inorganic acid esters.
  • Examples of the indole derivative represented by the general formula (3) include a compound represented by the following formula (6).
  • ? 1 to! ⁇ 9 represent the same or different electron withdrawing groups, electron donating groups or hydrogen atoms.
  • preferably! ? 1 to!? 9 represent a group or atom selected from the group consisting of an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, a nitro group, an acetyloxy group, an aminoalkyl group, an acetyloxyalkyl group, an aminobutyl group and a hydrogen atom.
  • R and R 2 are hydrogen atoms
  • R 3 is an acetooxy group or a hydroxyl group
  • R 4 is a hydrogen atom, a dialkylaminoalkyl group, a cyclic alkylaminoalkyl group, or a hydroxyalkylaminoalkyl.
  • R 5 is a lower alkyl group or an arylaminobutyl group
  • R 6 is a dinitro group
  • R 7 to R 9 may be the same or different. Desirably, it is an alkyl group, a lower alkoxy group, or a hydrogen atom.
  • Examples of the compound included in the general formula (6) include the following. 2-Methyl-3- 2-nitro-1-phenyl-1H-indole-6-ol
  • the compound of the present invention can be produced by the methods described below, methods analogous thereto, or known methods.
  • the method for producing the compound represented by the formula (9) is shown below.
  • thioether derivative (I) and the phenylazoacetamide derivative (II) are converted to a suitable solvent that does not adversely affect the reaction (for example, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide, ethers such as tetrahydrofuran, , Toluene and other aromatic hydrocarbons) and refluxing until the raw materials are exhausted.
  • a suitable solvent for example, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide, ethers such as tetrahydrofuran, , Toluene and other aromatic hydrocarbons
  • the derivative (I) can be prepared by a known method (for example, described in Khim. Geterotsikl. Soedin., No. 7, ⁇ 995 (1990)), or It can be purchased from commercial products. Specifically, it is as shown in Table 1 below. table 1
  • the fenylazoacetoamide derivative (II) can be obtained by a known method (Materialy Ural 'sk. Soveshch. Po Spektroskopii, 4th, Sverdlovsk 1963, p205 (1965), Bulletin detreu Polonaise des Sciences, Serie des Sciences Chimiques, 14). (1), p29 (1966), Am. Chem. Soc., Div. Org. Coatings, Plastics Chem. Preprints, 23 (2), p486 (1963), Zhurnal Obshchei Khimii, 35 (3), p559 (1965) , Zhurnal Obshchei Khimii, 32, p526 (1962)).
  • the compound represented by the formula (9) can also be synthesized by the following scheme.
  • the compound (IV) obtained by reacting a benzylcarbinol derivative with a 2-cyanoacetamide derivative in the presence of sulfuric acid is combined with a diazonium salt (V) in an aqueous alcohol solution that does not adversely affect the reaction. It is obtained by reacting in the presence.
  • a diazonium salt (V) in an aqueous alcohol solution that does not adversely affect the reaction. It is obtained by reacting in the presence.
  • Various derivatives of the benzylcarbinol derivative can be purchased from commercial products, and can be obtained by a known method (for example, J. Gen. Chem. USSR, No. 6, pl263 (1936).
  • the salt can be derived from a commercially available aminobenzene derivative by an aqueous solution of hydrochloric acid or sodium nitrite by a known method.
  • R 5 is a methyl group in the compound represented by the formula (9) is described below.
  • a suitable solvent that does not adversely affect the reaction for example, nitriles of acetonitrile, ethers such as tetrahydrofuran, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene
  • sodium carbonate to dissolve and dissolve methyl iodide in a suitable solvent that does not adversely affect the reaction
  • a suitable solvent that does not adversely affect the reaction for example, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide, and ethers such as tetrahydrofuran.
  • Benzene, toluene and other aromatic hydrocarbons can be produced by slowly dropping and refluxing.
  • R 5 is an acetyl group in the compound represented by the formula (9)
  • the compound represented by the formula (9) is dissolved in an appropriate solvent that does not adversely affect the reaction (for example, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide), and thionyl chloride is appropriately dissolved without affecting the reaction. It can be produced by adding a solution dissolved in a suitable solvent (for example, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide) dropwise in an ice bath. '
  • the compound can be produced by adding a hydroxylation sphere and a compound represented by the formula (9) to ethanol and refluxing the mixture.
  • the compound represented by the formula (12), the corresponding primary or secondary amine, HOBt (Advanced ChemTech, USA) and triethylamine are converted into a suitable solvent (for example, dimethylformamide, dimethylacetate) which does not adversely affect the reaction.
  • a suitable solvent for example, dimethylformamide, dimethylacetate
  • Dissolve in amides such as amides and add HBTU (Advanced ChemTech, USA) to a suitable solvent that does not adversely affect the reaction for example, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide, and halogens such as dichloromethane) (E.g., a system solvent). It can be produced by stirring at room temperature.
  • the compound represented by the general formula (4) exists in a solvent capable of dissolving in an appropriate solvent, as it is, or in a reduced form represented by the following formula (15), or as a mixture thereof. You can.
  • the compound of the present invention or a salt thereof obtained by force can be isolated and purified by ordinary separation means such as, for example, recrystallization, distillation, and mouth chromatography.
  • ordinary separation means such as, for example, recrystallization, distillation, and mouth chromatography.
  • the compound of the present invention when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto.
  • salt when obtained with salt, It can be converted into a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the compound or its salt may have an asymmetric carbon in some cases, but when it is obtained as an optically active mixture (racemate), it can be separated into its optical activities by ordinary optical resolution means.
  • the concentration of the differentiation inhibitor of the present invention in the range of 0.1 ng / m1 to 1 mg Zm1, preferably 10 ng Zm1 to 100 ⁇ g / m1, and more preferably More preferably, it is used in the range of 100 ng / m 1 to 10 ⁇ g / m 1.
  • the differentiation inhibitor of the present invention contains a low-molecular compound that maintains undifferentiation of embryonic stem cells without activating STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), particularly a tetrahydroisoquinoline derivative.
  • Embryonic stem cells of a specific mouse strain remain undifferentiated by LIF regardless of the presence or absence of feeder cells consisting of fibroblasts derived from mouse embryos. LIF is known to transmit downstream signals through activation of STAT3 (Matsuda et al., EMB0 Journal, 18, 15, P 4261, 1999).
  • the differentiation inhibitor of the present invention includes low molecular weight compounds that maintain undifferentiated embryonic stem cells without activating STAT3. In other words, it includes low molecular weight compounds having an activity to maintain undifferentiated embryonic stem cells by an action different from that of LIF.
  • the Nanog gene was identified as one of the molecules that regulates undifferentiation of embryonic stem cells without LIF and STAT3 (Mitsui et al., Cell, 113, p631, 2003, Chambers et al., Cell, 113, p643, 2003).
  • the presence of the N anog gene has been confirmed in mice and humans.If expression is suppressed by gene disruption, the totipotency of embryonic stem cells is lost, and conversely, the expression of the N anog gene is increased by overexpressing the N anog gene
  • a substance capable of increasing the expression level of the Nanog gene for example, a low-molecular compound, can be used for maintaining the undifferentiated state of embryonic stem cells, that is, for culturing totipotent embryonic stem cells.
  • the Nanog gene since the strong expression of the Nanog gene does not activate STAT3, the Nanog gene maintains undifferentiated embryonic stem cells independently of LIF and STAT3. That is, it is suggested that a substance capable of increasing the expression level of the Nanog gene, for example, a low-molecular compound, can be used for culturing even rat embryonic stem cells in which the effect of maintaining undifferentiation by LIF has not been observed. Is done.
  • the differentiation inhibitor of the present invention includes a low-molecular compound that increases the expression level of the Nanog gene. That is, the differentiation inhibitor of the present invention includes a low-molecular compound that exerts the ability to maintain undifferentiation of embryonic stem cells through an increase in the expression level of the Nanog gene.
  • the differentiation inhibitor of the present invention includes a low molecular compound having an activity of maintaining an undifferentiated state of a cell without using STAT3.
  • the differentiation inhibitor of the present invention can be used by being added to any mammalian cell culture basal medium which is a basal medium for animal cell culture.
  • animal cell basic medium include, but are not limited to, Dalbecco's modified single medium: DMEM, knockout DMEM, Glasgow MEM: GMEM, RPMI1640, IMDM (all manufactured by Invitrogenlnvitrogen, USA) Not done.
  • the cell culture medium is Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • these basal media can be used by adding proteins related to cell growth and differentiation control, such as serum or serum substitutes, various growth factors, and cytokines. Further, any compound may be added.
  • the serum can be any serum that provides nutrients that are effective in maintaining the growth and viability of embryonic stem cells if they are stem cells, or serum-based solutions.
  • examples of such sera include fetal calf serum (FCS), bovine serum (CS), and horse serum (HS).
  • Serum substitutes are well known to those skilled in the art, such as protein, Amino acids, lipids, vitamins and the like can be used alone or in combination. Proteins include insulin, transferrin, albumin, peptone, FGF (Fibroblast Growth Factor), EGF (Epitherial Growth Factor), etc.
  • the serum is fetal calf serum.
  • the fetal calf serum is provided at a concentration between about 25% and about 1%.
  • the concentration of fetal calf serum in the cell culture medium is 15%.
  • the serum replacement is Knockup Serum Replacement: KSR (Invitrogen, USA).
  • Cell growth factors that can be added include hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor (IGF), nerve growth factor (NGF ), Platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor (TGF), bone morphogenetic factor (BMP), stem cell factor (SCF), Wnt, etc. Not limited.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • PDGF Platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • BMP bone morphogenetic factor
  • SCF stem cell factor
  • Wnt Wnt, etc.
  • cytokines include, but are not limited to, interleukin (IL) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • the compound to be added is not particularly limited, but may be an agonist or an antagonist to an arbitrary protein, or may be an arbitrary phosphorylation inhibitor.
  • PD 98059 from Cell Signaling Technology
  • 6-bromoindirubin-3 oxime is provided.
  • the cell culture medium also contains antioxidants (reducing agents) (eg,] 3-mercaptoethanol).
  • antioxidants reducing agents
  • 3-mercaptoethanol has a concentration of about 0. ImM.
  • Other antioxidants such as monothioglycerol or dithiothreitol (DTT), alone or in combination, can be used for similar effects.
  • Still other equivalent materials are well known to those skilled in the art of cell culture.
  • the active ingredient thereof can be used together with an arbitrary culture medium or fixed to the culture medium.
  • a porous material can be used as a culture substrate.
  • the porous body refers to a substrate having a large number of fine pores, and its material, thickness, shape, dimensions, and the like are not particularly limited.
  • the material of the porous body may be an organic material, an inorganic material, or a composite material composed of an organic material and an inorganic material.
  • the shape of the porous body may be any of a flat plate, a sphere, a rod, a fiber, and a hollow.
  • a film, a sheet, a membrane, a plate, a nonwoven fabric, a filter paper, a sponge, a woven fabric, a knit, a lump, Yarns, hollow yarns, particles and the like In culturing cells, nonwoven fabrics are more preferable in view of the fact that the size of the pores supporting the cells can be easily controlled so that the cells can be cultured three-dimensionally, and the ease and cost of preparing a base material.
  • the average pore size is preferably not less than 0.1 lm and not more than ⁇ . , 1 m or more and 50 / m or less are more preferable.
  • the fiber diameter is not particularly limited, but is preferably 0.03 denier or less.
  • the above porous body may be subjected to a surface coating treatment with a polymer compound in order to improve cell adhesion, differentiation maintenance function, and proliferation ability.
  • a macromolecular substance is a monomer in which one or more types of repeating structural units are connected in one, two, or three dimensions. Refers to a substance having a molecular weight of several hundred or more.
  • Polymer substances can be broadly classified into three groups: natural polymer substances, semi-synthetic polymer substances, and synthetic polymer substances, and any of the polymer substances can be used in the present invention.
  • natural polymer substances include sugars and gelatins such as myriki (mica), asbestos (asbestos), dara fight (graphite), diamond, starch, cellulose, alginic acid, etc., fibronectin, and fibrinogen. , Laminin, collagen, etc.
  • Semi-synthetic polymer substances include glass, cellulose nitrate, cellulose acetate, rubber hydrochloride, carboxymethyl cellulose, etc.
  • Synthetic polymer substances examples include polyphosphonitrile chloride, polyethylene, polychlorinated vinyl, polyamide, polyethylene terephthalate, polysulfone, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polymethyl methacrylate, polyhydroxyethyl methacrylate, and polydimethyl amide.
  • the culture substrate is gelatin. In another embodiment, it is a matrix (BD Biosciencs ⁇ ).
  • a method and apparatus for separating and culturing stem cells or embryonic stem cells from a population of a plurality of different cells by using a culture substrate on which the differentiation inhibitor of the present invention is fixed as a cell capturing material can be provided. That is, a cell-containing solution containing stem cells or embryonic stem cells and cells to be removed is introduced into a container filled with a cell-capturing material comprising a culture substrate such as a porous body in which the differentiation inhibitor of the present invention is fixed. A stem cell or embryonic stem cell is captured by a cell capturing material, and a cell to be removed is derived from the outside of the container and then cultured together with the container.
  • the container can be used for cell culture.
  • the cells to be removed refer to all cells other than stem cells or embryonic stem cells. Also, cells that have differentiated from stem cells or embryonic stem cells and have lost pluripotency are included in this.
  • the cell-containing liquid to be introduced into the cell trapping material may be any cell liquid containing stem cells or embryonic stem cells. For example, blood, bone marrow, fragment tissue fluid, or culture of stem cells or embryonic stem cells Liquid and the like.
  • the present invention relates to a method for growing embryonic stem cells as well as stem cells.
  • a stem cell grown using the differentiation inhibitor of the present invention can also provide a culture of embryonic stem cells.
  • the cells cultured using the differentiation inhibitor of the present invention include all stem cells and embryonic stem cells that can be obtained using known methods and materials.
  • the stem cells include stem cells that can be obtained by the following known methods. Bone marrow cells ("Bone marrow transplantation guide” by HJ Dieg, HG Talingemann, GL Phillips / Shinpei Kasakura), bone marrow stem cells (Osawa et al., Science, 273, p242-245, 1996, Goodell et al., JE Med.
  • embryonic stem cells to be cultured can be obtained using the following known methods and materials.
  • Mouse embryonic stem cells Evans et al., Nature, 292, pl54, 1981.
  • Pesticide ES cells Schellander et al., Theriogenology, 31, pl5-17, 1989, swine ES cells: Strojek et al., Theriogenology, 33: p901, 1990, sheep ES cells: Handyside, Roux, s Arch. Dev. Biol., 196: pl85, 1987, Hamster ES cells: Doetschman Biol., 127, p224, 1988, Monkey ES cells: Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Powered cynomolgus ES cells Suemori et al., Dev. Dyn. 222, P273, 2001
  • human ES cells Thomson et al., Science, 282, pll45, 1998, Reubinoff et al., NatureBiotech, 18, p399, 2000
  • human EG cells Gearhart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, pl3726, 1998.
  • Mouse embryonic stem cells (129SV and C57 / BL6) can be purchased from Dainippon Pharmaceutical.
  • the differentiation inhibitor provided by the present invention can be used for all stem cells and embryonic stem cells, but is preferably used for mammalian stem cells and embryonic stem cells, and is preferably used for primate stem cells and embryonic stem cells. Is preferred.
  • cells and embryonic stem cells can be cultured in an undifferentiated state using the differentiation inhibitor of the present invention.
  • the degree of undifferentiation of stem cells, preferably embryonic stem cells, cultured using the differentiation inhibitory lj of the present invention can be confirmed by measuring the activity of alkaline phosphatase (ALP) present on the cell membrane of the stem cells.
  • ALP activity is known to be maintained in undifferentiated embryonic stem cells and decreased upon differentiation (Williams et al., Nature, 336, p684, 1988; Thomson et al., Science, 282, pll45, 1998) .). Examples of such methods include staining using an insoluble substrate, and spectrophotometric measurement using a water-soluble substrate to detect the activity of ALPHA phosphatase (ALP).
  • ALP activity can be quantified by spectrophotometry.
  • pNPP paranitrophenyl phosphate
  • ALP present on the cell membrane hydrolyzes pNPP to produce paranitrophenol.
  • the alkaline phosphatase activity can be quantified.
  • the ALP activity of embryonic stem cells cultured with the addition of the differentiation inhibitor of the present invention was significantly higher than that of control embryonic stem cells cultured in a medium containing no differentiation inhibitor. Shows that it has high ALP activity. That is, it is confirmed that the differentiation inhibitor of the present invention can proliferate while maintaining the undifferentiated state of embryonic stem cells. Recognized.
  • ALP activity can be detected by ALP staining.
  • To the cells on the culture dish add a reaction solution containing phosphate and diazoum salts as substrates. Phosphoric acid ester salts are hydrolyzed by allelic phosphatase present in the form of cell membrane, followed by coupling reaction with diazonium salts to form azo dyes, which precipitate in the ALP active site.
  • the ALP activity of the cells can be quantified, that is, the undifferentiated degree of the cells can be quantified.
  • ALP staining of embryonic stem cells cultured with the differentiation inhibitor of the present invention by the method described in Example 1 (6) showed that ALP activity was significantly higher than that of control cells without the differentiation inhibitor. That is, it is confirmed that the differentiation inhibitor of the present invention can proliferate while maintaining the undifferentiated state of embryonic stem cells.
  • the degree of undifferentiation of embryonic stem cells can be confirmed by measuring the expression level of Oct-3 / 4 gene.
  • the Oct-3 / 4 gene is a transcription factor belonging to the P0U family and is specifically expressed in undifferentiated states in embryonic stem cells and embryonic cancer cells (EC cells) (Okamoto et al., Cell, 60, p461, 1990). In embryonic development, it is expressed only in the undifferentiated cell lineage (Scholer, Trends Genet, 7, p323, 1991). Furthermore, homozygous mice of the Oct-3 / 4 gene disrupted mouse stop development at the blastocyst stage.
  • a real-time PCR method has a wide dynamic range, and enables simple and reliable quantitative measurement.
  • Taq Man probe using ABIPRISM7700TM (Applied Biosystems) for real-time PCR technology And the method using LightCyclerTM (Roche Diagnostics).
  • changes in the amount of DNA synthesized in each cycle can be detected in real time under a rapid reaction cycle in which the temperature cycle of PCR is completed in tens of minutes.
  • Four types of DNA detection methods for real-time PCR use DNA binding dyes (interactors), hybridization probes (kissing probes), TaqMan probes, and Sunrise Uniprimers (molecular beacons). There is a method.
  • the expression level of the Oct-3 / 4 gene can be analyzed using a DNA binding dye, for example, SYBR Greenl.
  • SYBR Greenl is a dye that binds specifically to the duplex of DNA, and the intrinsic fluorescence intensity is enhanced by binding to the duplex. By adding SYBR Greenl during the PCR reaction and measuring the fluorescence intensity at the end of each cycle of the extension reaction, an increase in the PCR product can be detected.
  • primers are designed based on the sequence of the Oct-3 / 4 gene using commercial gene analysis software, etc., as in normal PCR. Since SYBR Greenl also detects non-specific products, optimal primer settings are required.
  • the goal of quantitative PCR is to determine the amount of DNA of interest per sample. For this, it is necessary to evaluate the amount of sample initially added to the reaction system.
  • another DNA that serves as an internal standard that reflects the sample volume can be measured separately from the target DNA, and the sample volume initially added to the reaction system can be corrected.
  • the internal standard used for the purpose of correcting the sample amount may be a housekeeping gene which is generally considered to have no difference in expression level between tissues.
  • genes such as glyceraldehyde aldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH), a major glycolytic enzyme, actin or actin, a component of the cytoskeleton, and S26, a liposome constituent protein.
  • GPDH glyceraldehyde aldehyde phosphate dehydrogenase
  • actin or actin a major glycolytic enzyme
  • S26 a liposome constituent protein
  • the expression level of the Oct-3 / 4 gene can be determined for cells exposed to the differentiation inhibitor of the present invention. Not exposed to the differentiation inhibitor, that is, significantly different from the Oct-3 / 4 gene expression level in control cells induced to differentiate from embryonic stem cells A compound having an activity capable of maintaining the expression level of the Oct-3 / 4 gene is considered to be a differentiation inhibitor that maintains undifferentiation of embryonic stem cells.
  • SSEA Stage Specific Embryonic Antigen
  • a surface antigen such as SSEA-1
  • a specific antibody that recognizes the antigen
  • a second antibody second antibody conjugated to a reporter such as a fluorescent label.
  • Incubation with allows labeling.
  • cells expressing the target antigen become fluorescent.
  • the labeled cells can then be counted and sorted using standard methods, for example using a flow cytometer. The numbers of labeled and unlabeled cells can then be compared to determine the effect of the culture medium of interest.
  • the cells after exposure to an unlabeled cell surface marker antibody, the cells, in an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) format, are specific for an anti-cell surface antigen antibody (eg, an anti-SSEA-1 antibody).
  • an anti-cell surface antigen antibody eg, an anti-SSEA-1 antibody
  • a second antibody can be exposed from which the number of cells expressing the desired surface antigen can be quantified colorimetrically or by measuring fluorescence. Still other methods for quantifying cells expressing surface antigens are well known to those skilled in cell culture.
  • the improved differentiation inhibitor, culture method and culture solution for the growth of stem cells or embryonic stem cells provided by the present invention can be applied to all techniques in which stem cells or embryonic stem cells are useful. It is expected that.
  • the cells produced using the differentiation inhibitor of the present invention, the culture method and the culture solution can be differentiated, used for cell transplantation, or used for constructing an artificial tissue in combination with the use of an artificial support tissue. It can be transplanted to or used as an artificial organ.
  • the use of stem cells for cell transplantation therapy and tissue engineering can solve the problems of conventional transplantation therapy, including autologous transplantation, such as tissue deficiency after transplantation of a donor and insufficient donor.
  • the cultured cells or tissues may be returned to the same person as the collected person or transplanted to another person for treatment.
  • the cells and the like of the present invention can be used for any of them.
  • the differentiation inhibitor of the present invention a culture method using the same, a culture of unmodified and modified stem cells, preferably embryonic stem cells, obtained by a culture solution containing the same, is a stem cell, preferably an embryonic stem cell.
  • a putative stem cell or embryonic stem cell differentiation inducer can be added to a cell culture grown using the methods described above.
  • Substances capable of inducing differentiation into three germ layer lineages as compared to control cell cultures deficient in putative stem cell or embryonic stem cell differentiation-inducing substances are identified as embryonic stem cell differentiation-inducing factors.
  • the differentiation inhibitor Z or compound or a salt thereof according to the present invention has excellent stem cell undifferentiated maintenance and proliferation ability, and is therefore used as a therapeutic agent for tissues or organs damaged by disease or trauma.
  • Target diseases include, for example, burns, intractable skin ulcers, pimples, hypertrophic scars, nevus, and tattoos in the skin-related field, fractures and osteoporosis in the bone field, and osteoporosis in the cartilage field.
  • Parkinson's disease Huntington's disease
  • Alzheimer's disease trauma to the limb due to trauma, head and neck surgery, damage associated with thoracic surgery, and facial nerve Paralysis, diaphragmatic nerve injury, pelvic nerve injury, etc., periodontal disease in teeth, alveolar bone damage due to alveolar pyorrhea, odontosis, male pattern baldness in hair, congenital abnormalities in cornea, endothelial cell compensation Insufficiency, cloudiness due to corneal infection, corneal degeneration, corneal malformation, etc.Vascular-related hypertension, chronic arterial occlusion, ischemic heart disease, etc.
  • Examples include, but are not limited to, diabetes in the gut and hepatitis, cirrhosis, and liver failure in the liver.
  • the differentiation inhibitor and Z or the compound of the present invention prevent and prevent the above diseases.
  • Oral or parenteral administration is possible as a therapeutic agent.Does it mix with a pharmaceutically acceptable carrier and is usually administered orally as a solid preparation such as tablets, capsules, granules, and powders? Injection, suppository, intravenous, subcutaneous, intramuscular etc. Is administered parenterally as a sublingual tablet or the like. It may also be administered sublingually, subcutaneously or intramuscularly as a sustained release formulation such as sublingual tablets and microcapsules.
  • the daily dose varies depending on the severity of the symptoms; age, sex, weight, and sensitivity difference of the subject; timing of administration, interval, properties of pharmaceutical preparations, preparation, type; type of active ingredient, and is particularly limited.
  • the dosage for use in the livestock or fisheries field is the same as described above, but about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 10 mg per kg body weight of the organism to be administered, usually 1 to 3 times a day. It is divided and administered.
  • the content of the compound of the present invention in the pharmaceutical composition is about 0.01 to 100% by weight of the whole composition.
  • various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations; solvents in liquid preparations, Formulated as solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers, soothing agents, etc.
  • pharmaceutical additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners can be used.
  • Preferable examples of the above-mentioned excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, microcrystalline cellulose, light caffeic anhydride and the like.
  • Preferable examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • Preferable examples of the binder include crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and polypyrrolidone.
  • Preferable examples of the above disintegrant include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethylcellulose canolesum, cross force / remelose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like.
  • Preferred examples of the above-mentioned solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, and corn oil.
  • Preferred examples of the solubilizer include: Examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate;
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate
  • hydrophilic polymers such as polyvinylinolea / recol, polyvinylinolepyrrolidone, sodium / reoxymethylcellulose sodium, methylcellulose, hydroxymethinolecellulose, hydroxyshethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • Preferable examples of the tonicity agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • Preferable examples of the buffer include, for example, buffers such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • Preferred examples of the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • Suitable examples of the above preservatives include, for example, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Preferable examples of the antioxidant include sulfite, ascorbic acid and the like.
  • a suspension agent, a solubilizing agent, a stabilizing agent, a tonicity agent, a preservative, and the like are added to the differentiation inhibitor and / or the compound of the present invention, and a vein, subcutaneous, or intramuscular injection is prepared by a known method. can do. At that time, if necessary, it can be lyophilized by a known method.
  • the compound of the present invention is administered, for example, to humans, the compound itself is mixed with an appropriate pharmacologically acceptable carrier, excipient, or diluent, and is orally or parenterally administered as a pharmaceutical composition. Can be safely administered.
  • Examples of the pharmaceutical composition include oral preparations (eg, powders, granules, capsules, tablets), parenteral preparations (eg, injections, 10 drops, external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, etc.) ), Suppositories (eg, rectal suppositories, vaginal suppositories, etc.)].
  • oral preparations eg, powders, granules, capsules, tablets
  • parenteral preparations eg, injections, 10 drops, external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, etc.)
  • Suppositories eg, rectal suppositories, vaginal suppositories, etc.
  • the differentiation inhibitor and / or the compound of the present invention may be a dispersant (eg, Tween 80 (manufactured by Atlas Powder Co., USA), HCO 60 (manufactured by Nikko Chemicals) Polyethylene Lendacol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), Aqueous injections with preservatives (eg, methylparaben, propylparaben, benzyl alcohol, etc.), tonicity agents (eg, sodium chloride, mannitol, sorbitol, dextrose, etc.), or olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, etc.
  • a dispersant eg, Tween 80 (manufactured by Atlas Powder Co., USA), HCO 60 (manufactured by Nikko Chemicals) Polyethylene Lendacol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.
  • preservatives eg, methylparaben, propylparaben, benz
  • Inhibitor Z or compound can be added to excipients (eg, lactose, sucrose, starch) Disintegrant (eg, starch, calcium carbonate, etc.), binder (eg, starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.) or lubricant (eg, talc , Magnesium stearate, polyethylene dalicol 600, etc.) and compression molding, and then, if necessary, coating by a method known per se for taste masking, enteric or sustained purposes.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch
  • Disintegrant eg, starch, calcium carbonate, etc.
  • binder eg, starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.
  • lubricant eg, talc , Magnesium stearate, polyethylene d
  • the coating agent examples include hydroxypropyl methylcellulose, ethinoresenorelose, hydroxymethinolese / rerose, hydroxypropinoresenorelose, polyoxyethylene glycolone, and the like. Tween 80, Punoleronic F 6 8.
  • eudragit manufactured by Rohm, Germany, methacrylic acid / acrylic acid copolymer
  • dyes eg, Bengala , Titanium dioxide, etc.
  • an intermediate phase may be provided between the enteric phase and the drug-containing phase by a method known per se for the purpose of separating both phases.
  • the dehydration inhibitor and Z or the compound of the present invention can be made into a solid, semi-solid or liquid external administration preparation.
  • the compound of the present invention can be used as it is or as an excipient (eg, glycol, mannitol, starch, microcrystalline cellulose, etc.), a thickener (eg, natural gums, cellulose derivatives, acrylic acid polymer) Etc.) and mixed to form a powdery composition.
  • the liquid form should be an oily or aqueous suspension almost as in the case of injections.
  • an aqueous or oily gel or ointment is preferred.
  • pH regulators eg, carbonate, phosphoric acid, citric acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc.
  • preservatives eg, esters of paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzalkonium chloride, etc.
  • oily base used in the above composition examples include glycerides of higher fatty acids (eg, cocoa butter, witepsol (manufactured by Dynamite Nobel, Germany), etc.), and intermediate fatty acids [eg, migliols (manufactured by Dynamite Nobel Or vegetable oil (eg, sesame oil, soybean oil, cottonseed oil, etc.).
  • aqueous base examples include polyethylene glycols and propylene glycol
  • examples of the aqueous gel base include natural gums, cellulose derivatives, vinyl polymers, and acrylic acid polymers.
  • the prodrugs of the compounds (9) and (10) refer to compounds which are converted into compounds (9) and (10) having a stem cell proliferating action in vivo by a metabolic reaction with an enzyme, gastric acid or the like.
  • prodrugs of compounds (9) and (10) when compounds (9) and (10) have an amino group, compounds in which the amino group is acylated, alkylated or phosphorylated (E.g., when the amino group of compound (9) or (10) is dicosanoylated, alanylated, pentylaminocarbonylated, (5-methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl) ) Methoxycarbonylation, tetrahydrofuranylation, pyrrolidylmethylation, bivaloyloxymethylation, tert-butylated compound, etc.); and when compounds (9) and (10) have carboxyl, Are esterified or amidated (e.g., compounds (9) and (1 0) is carb
  • the prodrugs of Compounds (9) and (10) can be prepared under physiological conditions as described in Hirokawa Shoten, 1990, “Development of Pharmaceuticals,” Vol. 7, Molecular Design, pp. 163 to 198. ) It may change to (10).
  • the prodrugs of compounds (9) and (10) may be themselves or pharmacologically acceptable salts.
  • salts include inorganic bases (eg, alkali metals such as sodium and potassium, calcium, magnesium, etc.) when the prodrugs of compounds (9) and (10) have an acidic group such as lipoxyl.
  • organic amines such as N, N, -dibenzylethylenediamine, and basic amino acids such as arginine, lysine, and ordinine.
  • the prodrug of the compound (9) or (10) has a basic group such as an amino group, an inorganic acid or an organic acid (eg, hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, carbonic acid, bicarbonate, formic acid, acetic acid, Propionic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc.), aspartic acid, glutamic acid, etc. And a salt with an acidic amino acid.
  • an inorganic acid or an organic acid eg, hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, carbonic acid, bicarbonate, formic acid, acetic acid, Propionic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, ox
  • the prodrugs of the compounds (9) and (10) may be either hydrates or non-hydrates.
  • Compounds (9) and (10) may have one or two geometric isomers (cis-trans isomers) in the molecule, but compounds having cis- and trans-isomers in any ratio are also described in the present invention. Is included.
  • Compound (10) has one or more Although the compound may have asymmetric carbon, both of the R configuration and the S configuration regarding these asymmetric carbons are included in the present invention.
  • Compounds (9) and (10) may be labeled with an isotope (eg, 3 H, 14 C).
  • polysaccharides eg, dextran, pullulan, manna, chitin, chitosan, etc.
  • amino, carboxyl, and hydroxyl groups of compounds (9) and (10) It may be combined as a point.
  • a complex in which the compounds (9) and (10) are included in cyclodextrin (these include a parabody, a / 3 body, and a ⁇ body, preferably a j3 body or a ⁇ ⁇ ⁇ body) may be used.
  • Dulbecco's Modif ied Eagle Medium (hereinafter referred to as Dulbecco's Modif ied Eagle Medium
  • DMEM fetal calf serum
  • knockout serum replacement KSR (manufactured by Invitrogen)
  • IraM J3 mercaptoethanol
  • IX Non-essential amino acid stock I nv itrogen 11140-050
  • 2raM L-Glutamine Invitrogen 25030-081
  • 103 unit / ml ESGR0 CHEMIC0N International Inc., manufactured.
  • ESGR0 contains mouse LIF as an active ingredient.
  • ES cell differentiation inhibitor As a medium for assay, an Atsey medium was prepared by removing ESGR0 from the above ES cell medium.
  • mice embryonic stem cell line D3 ES cells (Rolf Kemler, Max Planck Institut fur Immunbiologie Stuneweg5 D-79108Freiburg available from Germany lambda) was inoculated on one layer of a 6 cm diameter fibroblast feeder, and grown in 5 ml of ES medium by culturing for 2 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • the supernatant was removed, the cells were resuspended in 2 Om1 of fresh ES cell medium, seeded on a 15 cm diameter cell culture dish pre-coated with 0.1% gelatin solution and incubated at 37 ° C. Incubated for 20 minutes. Twenty minutes later, the medium containing the suspended cells is collected with a pit, and seeded again on a 15 cm diameter cell culture dish coated with a 0.1% aqueous gelatin solution, at 37 ° C for 20 minutes. Incubated.
  • the culture medium was transferred to a 50-ml sterile tube, centrifuged at 1,000 rpm for about 5 minutes using a tabletop centrifuge, the supernatant was removed, and the cells were re-suspended in 5 ml of ES cell medium to obtain ES cells.
  • D3 ES cells obtained in the above (3) Preparation of mouse ES cells were placed in a 96-well cell culture dish (FALCON Cat. No. 3072, USA) previously coated with a 0.1% gelatin solution. 3 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 3 cells per well were seeded so that the ES cell culture medium per well was 90 ⁇ 1.
  • Differentiation inhibitor (A, B, C, D, E, F) of the present invention dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS0) or water or a mixture thereof so that each well has 0.4 to 40 ⁇ ⁇ / ⁇ 1.
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • E to F is purchased from PHARMEKS Inc.
  • ESGR0 10 1 ⁇ Ka ⁇ , at 37, were cultured in 5% C0 2 incubator for 7 days. DMS0 was brought into the medium at a final concentration of 0.1% or less. Only DMS0 was added to the control wells to a final concentration of 0.1%.
  • the structure of compound A is shown in FIG. 1, and the structures of compounds BF are shown in FIG.
  • P-NITR0PHENYLPH0SPHATE SOLUTION produced by MOSS Inc., PRODUCTNO. NPPD-1000, USA, or SIGMA, A-3469, USA) (hereinafter, p-NPP) And quantified.
  • the medium is aspirated from each well of ES cells cultured for 7 days by the method described in the above (4) ES cell inhibitor, Atsusei 1, and the cells are washed with 100 / xl phosphate buffered saline. After washing once with (PBS), P- ⁇ l was added to each well and left at room temperature for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 12.5 ⁇ l of 8 ⁇ sodium hydroxide solution to each well. The absorbance at 405 nm (0. D. 405) and the absorbance at 690 nm (0. D. 690) of the solution were measured with an absorbance meter (Molecular Devices, model: SPECTRA MAX190). .690 The value calculated in step was defined as the alkaline phosphatase activity. Figure 3 shows the results of the quantification as a rough sketch.
  • the differentiation inhibitors of the present invention Compounds A to F, significantly amplified alkaline phosphatase activity as compared with the control DMS0 (0.1%). That is, it can be seen that the differentiation inhibitor of the present invention supported the culture of undifferentiated ES cells.
  • ES cells were stained using alkaline phosphatase kit (SIGMADiagnostic Cat. No. 86-R).
  • the medium is removed by suction from each cell of the ES cells cultured by the method described in (4) ES cell differentiation inhibition assay 1 above, and the cells are washed once with 2 ml of phosphate buffered saline (PBS). Thereafter, 2 ml of a cell fixing solution (25 ml of a formic acid solution (Cat. No. 91-5 manufactured by SIGMA), 65 ml of acetone, 8 ml of 37% formaldehyde) are added to each well, and the mixture is left to stand at room temperature for 30 seconds.
  • a cell fixing solution 25 ml of a formic acid solution (Cat. No. 91-5 manufactured by SIGMA)
  • 65 ml of acetone 8 ml of 37% formaldehyde
  • ES cells cultured in the absence of ESGR0 as a negative control ES cells cultured in the presence of ESGRO (1000 units / ml) as a positive control, and the differentiation inhibitor of the present invention.
  • ESGRO 1000 units / ml
  • the ES cells cultured in the presence of Compound B were stained significantly deeper than the ES cells cultured in the absence of ESGR0, indicating that they had high alkaline phosphatase activity. Furthermore, the differentiation inhibitor of the present invention was also able to form undifferentiated colonies equivalent to ES cells cultured in the presence of the positive control ESGR0. That is, it can be seen that the differentiation inhibitor of the present invention strongly supported the proliferation of ES cells in an undifferentiated state. Compounds A and CF were stained in the same manner as compound B.
  • LipofectAMINE 2000 manufactured by Invitrogen, USA
  • a differentiation inhibitor dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS0) or water or a mixture thereof to give a concentration of 0.4 to 40 ⁇ g / ml in each well, or 10 to: L000 units / ml
  • 50 1 of ESGR0 diluted with ES Atsushi medium was added thereto, and the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 6 to 24 hours.
  • the luminescence signal of each cell was measured by the luciferase 'reporter enzyme using Pitka Gene Dual Chip Pansy (Toyo Ink Mfg., Japan) according to the attached protocol.
  • ESGR0 enhanced the expression of the reporter enzyme by PSTAT3-TA-Luc in a dose-dependent manner, whereas the compound B of the present invention did not induce the expression of the reporter enzyme.
  • Example 2 (1) ES cell differentiation inhibition assay 2
  • D3 ES cells prepared according to the method described in (3) Preparation of mouse ES cells in Example 1 were transferred to a cell culture dish of 1 Ocm in diameter previously coated with a 0.1% aqueous gelatin solution to obtain 8 ⁇ 10 4 cells. Then, the cells were seeded so that the ES cell medium was 10 ml. To each dish, the differentiation inhibitor (A to F) of the present invention dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS0), a medium, or a mixture thereof, so as to have a concentration of 40 ⁇ g / ml, or 10 4 units / ml. the prepared ESGRO added 1 ml, and cultured for 7 days at 37 ° C, 5% C0 2 Inkyube one coater. DMS0 was brought into the medium at a final concentration of 0.1% or less.
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • the LightCycler First Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche's Diagnostics, Inc.) PCR was performed according to the attached protocol.
  • the expression levels of the Oct-3 / 4 gene and the glycemic aldehyde triphosphate dehydrogenase (GAPDH) gene as an internal standard were measured.
  • the sense primer 0CT3 up (SEQ ID NO: 1)
  • the antisense primer 0ct3 down SEQ ID NO: 2
  • the sense primer GAPDH was used.
  • up (SEQ ID NO: 3) and antisense primer GAPDH down (SEQ ID NO: 4) were used.
  • the composition of the PCR reaction solution and the reaction conditions are shown below.
  • D.3 ES cells prepared according to the method described in (3) Preparation of mouse ES cells in Example 1 were placed on a 10 cm diameter cell culture dish previously coated with a 0.1% aqueous gelatin solution, and 7.85 ⁇ 10 5 cells were placed in the dish. Then, the cells were seeded so that the ES cell medium was 10 ml.
  • the differentiation inhibiting agent B of the present invention at a final concentration of 4 [mu] g / ml, or in addition to the medium ESGR0 a final concentration lX10 3 unit / ml, 37 ° C, 5% C0 2 Inkyubeta one 1 Cultured for one day.
  • RNA solution After removing the supernatant, 1 ml of a 70% aqueous ethanol solution was added, shaken, and centrifuged at 10,000 rpm in a microcentrifuge at 4 ° C for about 5 minutes. After removing the supernatant and drying the precipitate, the precipitate was dissolved in 30 ⁇ l of distilled water to obtain a total RNA solution.
  • RNA obtained in this manner was converted into type ⁇ , Deoxyribobonucleasasel, AmplificcationGrade) (manufactured by Invitrogen), Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR.
  • cDNA was synthesized according to the attached protocol. That is, add 1 ⁇ l l O XDNa sel Reaction Buffer and 1 / zl l O XD Na sel Buffer (from Invitrogen) to 2 / Z g of total RNA, and add 10 ⁇ l of distilled water. A reaction mixture was prepared and incubated at room temperature for 10 minutes.
  • the cells were incubated at 85 ° C for 5 minutes and then placed on ice for 1 minute.
  • One ⁇ l of RNase H was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 20 minutes to obtain cDNA.
  • a part of the synthesized cDNA obtained in this way was diluted 5-fold with distilled water, and the 21 was used as type II, and LightCycler First Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics) PCR was performed according to the attached protocol. Na nog gene and glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase as internal standard
  • GAPDH The expression level of the gene was measured.
  • Lima ⁇ "Na nog— up (SEQ ID NO: 5) and antisense primer N anog— down (SEQ ID NO: 6) were used to amplify the GAPDH gene using the sense primer GAPDH up (SEQ ID NO: 3).
  • antisense primer GAPDH down SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing
  • the expression level of the Nanog gene of the ES cells cultured in the presence of the differentiation inhibitor B of the present invention was determined by the ES cells cultured in a medium containing no differentiation inhibitor and a medium containing 1,000 000 units of Zm1. (Fig. 7). That is, it was confirmed from the expression level of the Nanog gene that the differentiation inhibitor B of the present invention had an effect of maintaining undifferentiation of ES cells.
  • the expression level of the Nanog gene was increased. That is, it was revealed that the cells have an activity of maintaining undifferentiation of ES cells.
  • ES cell differentiation inhibition assay 2 The cells cultured in (1) ES cell differentiation inhibition assay 2 were washed twice with PBS, and the cells were detached from the dish with a cell scraper. 300 ⁇ l of Hanks balanced salt solution (HBSS, manufactured by Invitrogen) containing 2% FBS was added so that the number of cells became 6 ⁇ 10 5 . 30 ⁇ l of MX-SSEA-1 antibody (manufactured by Kyowa Medex) diluted 50-fold with HBSS was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 40 minutes.
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • MX-SSEA-1 antibody manufactured by Kyowa Medex
  • the flow cytometer used was a FACSCalibur (BECT0N DICKINSON) and the measurement condition data collection and analysis software was CELLQuest (BECT0N DICKINSON).
  • the results are shown in FIG.
  • the average fluorescence intensity per cell of cells cultured with the addition of each differentiation inhibitor, that is, the intensity of SSEA-1 antigen expression per cell, is higher than that of cells cultured in a medium without differentiation inhibitors. It was significantly increased. Similar experiments with Compounds A, C, and E also showed significantly higher levels of SSEA-1 expression. That is, the differentiation inhibitor of the present invention is an undifferentiated ES Example 3 shows that cells are maintained
  • a D3 ES cell prepared according to the method described in (3) Preparation of mouse ES cell in Example 1 was coated with a 96-well cell culture dish (FALCON Cat. No. 3072, USA), 3200 cells per well were seeded at 100 1 ES cell Atsell medium per well.
  • the differentiation inhibitor of the present invention (a to o: a, j to 10) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS0) or water or a mixture thereof so as to have a concentration of 0.4 to 40 ⁇ g / ml in each well.
  • m is IF LAB Ltd., Ukraine, b, c, f, n is PHARMEKS, Russia, d, e, o is SPECS, Netherlands, g-i is CH EMB RIDGE, purchased from the United States), or ESGRO was added and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 4 days.
  • DMS0 was brought into the medium at a final concentration of 0.1% or less. Only DMS0 was added to the control wells to a final concentration of 0.1%.
  • Fig. 9 shows the structures of the differentiation inhibitors a to o.
  • the al cell phosphatase activity of ES cells was measured using p-NITR0PHENYLPH0SPHATE SOLUTION (MOSS Inc., PRODUCTNO. NPPD-1000, USA, or SIGMA, A-3469, USA) (hereinafter, p-PP). And quantified.
  • the medium is aspirated off from each well of ES cells cultured for 4 days by the method described in (1) ES cell differentiation inhibition assay 4 above, and the cells are washed with 100 ⁇ l of phosphate buffered saline (PBS). After washing once, ⁇ - ⁇ 1 was added to each well, and the plate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 10 shows a graph of the quantification result.
  • the differentiation inhibitors of the present invention compounds a to o, significantly amplified the activity of lipophilic phosphatase as compared with DMSO (0.1%) as a control. That is, the differentiation inhibitor of the present invention supported the culture of undifferentiated ES cells.
  • the D 3 ES cells prepared according to the method described in (3) Preparation of mouse ES cells in Example 1 were previously purified by 0.1 ° /. 8 ⁇ 10 4 cells were seeded on a cell culture dish of 1 Ocm in diameter coated with a gelatin aqueous solution of the above so that the ES cell Atssay medium was 10 ml.
  • To each dish add 1 ml of ESGR0 to 40 ⁇ / ⁇ 1 in dimethyl sulfoxide (DMS0) or a differentiation inhibitor of the present invention (a to o) dissolved in a medium or a mixture thereof. ° and cultured for 4 days at C, 5% C0 2 incubator. DMS0 was brought into the medium at a final concentration of 0.1% or less.
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • the cells cultured in the above (3) ES cell differentiation inhibition assay 5 were washed twice with PBS, and the cells were detached from the dish with a cell scraper.
  • 300 1 Hanks balanced salt solution (HBSS, manufactured by Invitrogen) containing 2% FBS was prepared so that the number of cells became 6 ⁇ 10 5 cells.
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • MX-SSEA-1 antibody manufactured by Kyowa Medex
  • Flow cytometer is FACSCalibur (BECT0N DICKINSON, US Country) and the measurement condition data collection and analysis software used was CELLQuest (BECTON DICKINSON, USA).
  • the results are shown in FIG.
  • a similar experiment was performed for compounds b to o, and it was also shown that the expression level of SSEA-1 was significantly higher. That is, it became clear that the differentiation inhibitor of the present invention maintains undifferentiated ES cells.
  • D3 ES cells prepared according to the method described in (3) Preparation of ES cells in Example 1 were coated with a 24-well cell culture dish (FALCON Cat. No. 3047, USA) previously coated with a 0.1% aqueous gelatin solution. ) in a 1 X 1 0 5 cells per Ueru, ES cell medium per Ueru is seeded so that the 500 1, 37, in 5% C0 2 incubator and cultured for 12 hours to 24 hours. Next, using LipofectAMINE 2000 (manufactured by Invitrogen, USA) according to the attached protocol, PSTAT3-TA-Luc or pTA-Luc vector (manufactured by C1ontech, USA) was added at 0.9 / well.
  • LipofectAMINE 2000 manufactured by Invitrogen, USA
  • PSTAT3-TA-Luc or pTA-Luc vector manufactured by C1ontech, USA
  • zg was transfected into ES cells.
  • pRL-TK vector Promega, USA
  • pRL-TK vector Promega, USA
  • the medium was aspirated, After washing twice with PBS, and added ES Atsusi medium by each Ueru 500 1.
  • a differentiation inhibitor dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS0) or water or a mixture thereof at a concentration of 0.4 to 40 ⁇ g / ml, or an ES at a concentration of 10 to 10,000 units / ml in each well. and cultured for 6 to 24 hours at ESGR0 diluted with Assi medium 50 ⁇ 1 ⁇ Ka ⁇ to 37 ° C, 5% C0 2 Inkyu activator.
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • Example 4 Subculture of ES cells
  • ES cells prepared according to the method described in (3) Preparation of mouse ES cells in Example 1 were placed in a cell culture dish of 6 cm in diameter previously coated with a 0.1% aqueous gelatin solution at 3 ⁇ 10 5 cells. Were seeded so that the ES cell medium was 4.5 ml. Jimechirusurufu Okishido so that 10 ⁇ 40 ⁇ g / m 1 to each dish (DMSO), or medium, or differentiation inhibiting agent of the present invention dissolved in the mixture (to F, to o), or 10 4 units / m 1 of ESGRO was added with 0.5 ml of mash. DMSO was brought into the medium at a final concentration of 0.1% or less.
  • a control containing only DMSO 0.5 ml of a 1% concentration solution diluted with a medium was added to a final concentration of 0.1%.
  • the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 7 to 30 days.
  • the medium was changed every day, and the culture medium was changed every 2 to 3 days so as to obtain 3 ⁇ 10 5 cells / dish.
  • Al cell phosphatase activity of ES cells cultured for 7 days or 30 days using the differentiation inhibitor of the present invention was quantified by colony assay. That is, ES cells subcultured by the above method were placed in a 96-well cell culture dish (FALCON Cat. No. 3072, USA) previously coated with a 0.1% aqueous gelatin solution at 1 ⁇ 10 3 cells / liter. Individual cells were inoculated so that the ES cell culture medium per cell was 90 ⁇ l per well. To each well, ESG RO diluted with a medium so as to have a concentration of 0 to 10 3 units / m 1 was added with 10 ⁇ l of mash, and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 4 days.
  • FIG. 13 shows the results of quantitative determination of the enzyme lipophosphatase of ES cells subcultured with compound B for 30 days and ES cells subcultured for 7 days in serum-free medium with compound f.
  • FIG. 14 shows the results of the quantitative determination of the lipophilic phosphatase.
  • ES cells subcultured with the differentiation inhibitor of the present invention Compounds B and ⁇ , significantly amplified the activity of lipophilic phosphatase as compared to ES cells cultured with DMS ⁇ (0.1%). That is, it can be seen that the differentiation inhibitor of the present invention supported the undifferentiated state of ES cells even in long-term culture.
  • DME / F-12, 1: 1 (SI GM AD6421) was added with factors at the following final concentrations to prepare a culture medium for cynomolgus monkey ES cells.
  • KSR 10828-028 manufactured by InVitrogen
  • IX non-essential amino acid SI GMA M 7145
  • 2 mM L—G 1 utamine SI GMA G7513
  • 1 mM sodium pyruvate SI GMA S 8636
  • IX penicillin / streptomycin solution SI GMA P 078 l
  • DMEM manufactured by Invitrogen 1 was used as a culture medium for one mouse feeder cell for cultivating monkey ES cells. In 1960-044), each factor was added at the final concentrations shown below to prepare.
  • Kuizaru ES cells manufactured by Tanabe pharmaceutical Co., Ltd.
  • the cells were grown for three days in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. in a quinary ES cell culture medium.
  • GFR Growth Factor Reduced
  • BD Matrigel Nippon Becton, Dateskinson, 354230, Japan
  • BD Matrigel Matrix Nippon Becton Thaton's Dickinson's 354234
  • the differentiation inhibitor of the present invention (A to F, a to o) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) or a medium or a mixture thereof so that each dish has a concentration of 8 to 40 ⁇ g / m 1.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a medium or a mixture thereof so that each dish has a concentration of 8 to 40 ⁇ g / m 1.
  • 0.5-ml of 6-bromoindirubin-3 oxime. C, and cultured in a 5% CO 2 incubator.
  • the cells were passaged every 2 to 4 days according to the method described in (2) Preparation of Power-Supplied Monkey ES Cells.
  • DM SO was brought into the medium at a final concentration of 0.1% or less.
  • the above cultured cells were evaluated by staining for alkaline phosphatase described in Example 1 above.
  • Fig. 15 shows the results of staining with alkaline phosphatase of cells cultured for 2 days after addition of compound B or compound f as the ratio of the number of stained colonies to the total number of colonies. Under or in the presence of compound f, the cells were cultured for 3 days and subcultured. The photograph of alkaline phosphatase staining after 3 days is shown in FIG.
  • Chinese cynomolgus monkey ES cells subcultured in the presence of compound f are the Chinese cynomolgus monkey ES cells subcultured in the presence of DMS0. Staining was significantly higher than that of.
  • m-Aminoacetophenone (Aldrich, USA) is dissolved in benzene, hydrochloric acid gas is passed through, the resulting precipitate is filtered off and recrystallized from isopropanol.
  • p-aminoacetophenone hydrochloride Dissolve the obtained P-aminoacetophenone hydrochloride in a 20% aqueous ethanol solution and acidify with concentrated hydrochloric acid in an ice bath. An aqueous solution of sodium nitrite is added dropwise and treated with urea to obtain a diazonium salt solution.
  • the D3 ES cells cultured using the method described in (2) Culture of mouse ES cells in Example 1 are washed twice with PBS. A 0.25% trypsin solution (manufactured by InV Itrogen) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 5 minutes to remove colonies of undifferentiated D3ES cells from the feeder. 5 ml of ES cell culture medium was added, cell colonies were dispersed using a small-diameter pipette, transferred to a 15-ml sterile tube, and pelletized by centrifugation at 800 rpm for about 5 minutes in a tabletop centrifuge (Tomy Seie). .
  • ES cells were stained with alkaline phosphatase kit (SIGMADiagnostic Cat. No. 86-R).
  • the medium is aspirated from each well of the ES cells cultured by the method described in the above “ES cell differentiation inhibition assay”, and the cells are washed once with 0.5 ml of phosphate buffered saline (PBS). Thereafter, 0.5 ml of a cell fixative (25 ml citric acid solution (SIGMA Cat. No. 91-5), 65 ml acetone, 8 ml 37% formaldehyde) is added to each well, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 30 seconds.
  • a cell fixative 25 ml citric acid solution (SIGMA Cat. No. 91-5)
  • 65 ml acetone, 8 ml 37% formaldehyde is added to each well, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 30 seconds.
  • ES cells cultured in the absence of the negative control, ESGR0, in the presence of the positive control, ESGR0 (1000 units / ml) In cultured ES cells, and it was compared stained images of the compound 4 (4 ⁇ ⁇ / ⁇ 1) ES cells cultured in the presence of the present invention (see FIG. 19).
  • the ES cells cultured in the presence of Compound II were stained significantly deeper than the ES cells cultured in the absence of ESGR0, indicating that they had high alkaline phosphatase activity.
  • the compound of the present invention was also able to form undifferentiated colonies equivalent to ES cells cultured in the presence of the positive control ESGR0. That is, it can be seen that the compound of the present invention strongly supported the proliferation of ES cells in an undifferentiated state.
  • stem cells preferably embryonic stem cells
  • the differentiation inhibitor provided by the present invention, a culture method using the same, and a culture solution can be applied to produce a stem cell, preferably an embryonic stem cell, as a cell source used for cell transplantation.
  • the differentiation inhibitor provided by the present invention, and the culture method using the same can be used to reduce one or many genetic modifications. It can be applied to produce embryonic stem cells. Examples of such applications include, but are not limited to, the development of cell-based models of the disease, as well as the development of tissues specific for transplantation to treat genetic diseases.
  • the dehydration inhibitor or bicyclic compound of the present invention can proliferate stem cells in an undivided state, and as a result, cultured cells and tissues can be suitably used in the field of regenerative medicine. Available.
  • the present invention can be applied to a pharmaceutical composition.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、幹細胞あるいは胚性幹細胞を、フィーダー細胞を用いずに未分化な状態で培養させ得る分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを用いた培養液およびこの分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞を提供することである。本発明によれば、低分子化合物、特にテトラヒドロイソキノリン誘導体を有効成分とする幹細胞分化抑制剤、テトラヒドロイソキノリン誘導体を用いて幹細胞を培養することによりフィーダー細胞非存在下で大量にかつ安全で未分化に幹細胞を培養する方法、テトラヒドロイソキノリン誘導体を含む幹細胞の培養液、テトラヒドロイソキノリン誘導体を分化抑制剤として用いて培養、作製された細胞が提供される。　

Description

明細書
細胞分化抑制剤、 これを用いた細胞培養方法、 培養液及び培養された細胞株 技術分野
本発明は、 低分子化合物、 特にテトラヒドロイソキノリン誘導体を有効成分と する幹細胞分化抑制剤、 それを用いる幹細胞培養方法、 培養液およびそれを用い て作製された幹細胞株に関する。 本発明はさらに、 幹細胞の未分化維持作用を有 する新規な 2環化合物にも関する。 背景技術
外傷や病気、 さらには加齢などによって傷害を受けた臓器 ·組織は、 再生を促 進し、 その機能を回復させる必要がある。 特に、 心臓'肝臓 ·腎臓 '瞎臓などの 実質臓器は生命維持に必須であるためその機能低下 ·廃絶は死に直結することか ら、 臓器移植により救命を図る移植医療が盛んに行われている。 しかし、 恒常的 なドナー不足からその解決には新たなァプローチが必要になっている。
最近になり、 胚、 或いは成体に存在し、 無制限に分裂して、 ひとつ或いは複数 の方向に分化する能力を有すると考えられる幹細胞を利用して組織 ·器官の作製 を行い、 欠損組織の補填を行う再生医療が、 従来の臓器移植の欠点を凌駕する治 療法として注目されている。
具体的には、 幹細胞を増殖させた後、 分化させ細胞移植に用いたり、 人工支持 組織の利用と併せ人工的な組織構築を行い、 それを生体内へ移植したり人工臓器 として利用したりすることなどが考えられている。 幹細胞を細胞移植治療や組織 工学に利用できれば、 ドナーにおける移植片摘出後の,袓織欠損やドナー不足など、 従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できると期待される。
幹細胞は、 血管、 神経、 血液、 軟骨、 骨、 肝臓、 藤臓など数々の分野で同定さ れているが、 そのなかでも特に全ての細胞型に分化する能力を有する全能性幹細 胞は、 上述の再生医療分野のほか、 創薬、 および遺伝子治療に用いるための細胞 ならびに組織を容易に提供し得る細胞として特に注目されている。
全能性幹細胞の一例として、胚性幹（Emb r y o n i c S t e m、以下 E S) 細胞や、 胚性生殖 (Emb r y o n i c G e r m, 以下 EG) 細胞が知られて いる。 E S細胞は、 マウスの胚盤胞期の内部細胞塊 （Inner Cell Mass, ICM) 力、 ら分離された細胞株である （Evans ら、 Nature, 292, pl54, 1981年）。 個体を構 成する細胞は胚盤胞期の内部細胞塊 （Inner Cell Mass，以下 ICM) あるいは原腸 胚上層（epiblast、以下ェピブラスト）から派生した一次外胚葉に由来しており、 ICMおよぴェピブラストは全能性を持つた幹細胞群であるといえる。 E S細胞は 各種個体形成組織への分化能を保持し、 正常な胚とキメラ胚を形成させることに より、 成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有している。 また、 試験管 内の分化誘導条件によっても、 血液細胞、 心筋細胞、 血管内皮細胞、 神経細胞、 色素細胞、腌内分泌細胞など様々な細胞を生成させる能力をもっている（仲野徹、 最新医学別冊—再生医学、 p 8 1— 8 9、 20 0 0)。
EG細胞は始原生殖細胞を L I F (L e u k e m i a I n h i b i t o r y F a c t o r) と b FGF (b a s i c F i b r o b l a s t G r o w t h F a c t o r ) 存在下で培養することにより樹立された細胞であり （Ma t s u i ら、 C e l l、 7 0、 p 8 4 1、 1 9 9 2年、 R e s n i cら、 N a t u r e、 3 5 9、 p 5 5 0、 1 9 9 2年）、 E S細胞と同様に各種組織への分化能を有し ている。
最近になって、 マウス以外でも E S細胞株の樹立が報告され、 マウス E S細胞 と同様多分化能を有していることが示されている （ゥシ E S細胞： Schellander ら、 Theriogenology, 31, pl5 - 17， 1989年、豚 E S細胞： Strojekら、 Theriogenology, 33:p901, 1990年、 羊 E S細胞： Handyside、 Roux' s Arch. De v. Biol. , 196 :pl85, 1987年、ハムスター E S細胞： Doetschmanら， Dev. Biol. , 127、 p224, 1988年、 ァ 力ゲザル E S細胞： Thomsonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 92、 p7844、 1995 年、 マーモセッ卜 E S細胞： Thomsonら、 Biology of Production, 55、 p254、1996 年、 ヒト E S細胞： Thomsonら、 Science, 282, pll45, 1998年、 Reubinoff ら、 Nature Biotech, 18， p399, 2000 年、 力二クイザル E S細胞： Suemori ら、 Dev. Dyn. 222、 P273, 2001年）。
E S細胞の未分化を維持するには、 通常胎仔由来の線維芽細胞をフィーダ一細 胞として用いて共培養することが必要である。 霊長類の E S細胞株の未分化維持 においても同様の方法が用いられている（Thomsonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995年、 Thomsonら、 Science, 282, pll45, 1998年、 Reubinoff ら、 Nature Biotech, 18, p399, 2000年）。
しかし、マウス初代線維芽細胞の調製は煩雑である。即ち、妊娠マウスから 13. 5 から 15. 5 日の胚を取り出し、 酵素処理によって胚体を分解し、 ディッシュ上に 得られた線維芽細胞を回収する。 初代細胞であるため、 品質管理は複雑で、 GMP 適応レベルの管理は困難であり、 ES細胞の未分ィヒ維持能も、用いる胚体により異 なる可能性が考えられる。 この煩雑な調製作業を経由しない ES細胞培養方法と して、 マウス胚線維芽細胞のセルラインである ST0細胞 （A T C C 5 6 - X) を用いる方法がある。 し力 し、 S T O細胞の E S細胞未分化維持能は変化しやす く、 E S細胞の安定的な培養にはマウス初代線維芽細胞の方が優れている。
また、 最近になって異種動物間での内在性ウィルスの感染例が報告されている (van der Laanら、 Nature, 407, p90, 2000年）。 医療用途でのヒト E S細胞の 利用を目的とした培養方法においては異種動物細胞間での接触をでき得る限り 回避した培養方法の開発が望まれている。 従って、 マウス由来細胞を用いる上記 の E S細胞未分化維持培養方法は、 医療用途を目的とした E S細胞の培養には適 していない。
マウス由来フィーダ一細胞を用いない霊長類 ES細胞の培養方法として、 マウ ス初代線維芽細胞の分泌成分を培養培地中に加える方法が報告されている （例え ば、 特開 2 0 0 1— 1 7 1 6 3号公報を参照）。 し力 し、 この場合においても 培養中の ES細胞がマウス細胞から分泌される未同定の因子に曝されることから、 このような環境で培養された ES細胞は医療用途の使用には適していないうえに、 内在性ウィルスの感染の危険性も残されている。 従って、 マウス初代線維芽細胞 との共培養による欠点が全く解消されていない。
マウス由来フィーダー細胞並びにマウスフィーダー細胞由来分泌成分を用い ないマウス E S細胞の未分化維持培養方法として、 ゼラチンをコートした培養皿 を用いる培養方法が既に知られているが、 この場合には、 白血病抑制因子
(leukemia inhibitory factor, LIF) の培地への添加が必須である （例えば、 Smithら、 Dev. Biol. , 121, pi, 1987年を参照）。 LIFはサイト力インであるこ とから高コスト、 保存性などの問題があり大量培養には適していない。 加えて、 LIFの効果は極めて特定のマウス系統 （129Zs V系や C 57 B LZ6系） 由 来の ES細胞に限定的であり、 他種動物において顕著な効果は見られない。 特に 霊長類の ES細胞においては、 培地中への LIFの添加のみでは未分化状態を維持 することができないことが明らかにされている （例えば、 Thomson ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, '92, p7844, 1995年；及ぴ、 Thomsonら、 Science, 282, pll45, 1998年を参照）。
また、 LIF による胚性幹細胞の未分化維持作用を増幅させる低分子化合物とし て PD 98059 (C e l l S i g n a l i n g T e c hn o l o g y社 製） が報告されているが、 PD 98059の作用は LIF依存的であり、 単独では 効果が認められない （Burdonら、 Dev. Biol. , 210， p30, 1999年）ため前述の問題点 を解決されない。
従って、 全能性幹細胞を、 低コストで安全かつ大量に培養することを可能にす る分化抑制剤はこれまでなく、 また、 全能性幹細胞を、 低コストで安全かつ大量 に培養する方法も知られていなかった。 本発明の分化抑制剤は、 低分子化合物を 有効成分として含有するが、 低分子化合物が全能性幹細胞の未分化状態を維持す ることはこれまで知られていなかった。 従って、 本明細書に記載の一般式（1)〜 (10) で示される低分子化合物が有する全能性幹細胞の未分化維持作用は全く 知られていなかった。 発明の開示 本発明の課題は、 幹細胞或いは胚性幹細胞を、 フィーダ一細胞或いはフィーダ 一細胞由来成分を用いずに、 未分化状態で培養させ得る分化抑制剤を提供するこ とにある。 また、 本発明の課題は、 このような分化抑制剤を用いて、 フィーダ一 細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに幹細胞或いは胚性幹細胞を未分 化の状態で培養する方法を提供すること、 このような分化抑制剤を含む細胞培養 液を提供すること、 およびこのような分ィヒ抑制剤を用いて培養して作製された細 胞株を提供することにある。 本発明のさらに別の課題は、 幹細胞或いは胚性幹細 胞を、 フィーダ一細胞或いはフィーダ一細胞由来成分を用いずに、 未分化状態で 培養させ得る新規な 2環化合物を提供することである。
本発明は、 上記課題を達成するためになされたものであって、 幹細胞ならびに 胚性幹細胞を未分化な状態で培養させ得る分化抑制剤、 それを用いた幹細胞なら ぴに胚性幹細胞の培褰方法、 このような分化抑制剤を含む細胞培養液、 およびこ のような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株に関する。
すなわち、 本発明は、 以下のような構成からなる。
( 1 ) 低分子化合物またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
( 2 ) 低分子化合物が、 一般式 （1 )
Figure imgf000006_0001
[式中、 R R R3、 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子 吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。 A環は、 少なくとも 1つのへテロ原 子を環内に含む 5〜 8員環を表す。 Xは、 主鎖の原子数が 0〜 1 0のアルキレン 基を表す。 原子数 0のアルキレン基とは、 単結合を表す。 該アルキレン基を構成 する 1つ以上のエチレンが、 一 C = C一基及び Z又は一 N = N—基及び/又は一 C O NH—基で置き換わっていてもよい。 また、 環 Aと結合するボンドが二重結 合となる基であってもよい。 さらに、 該アルキレン基は、 置換基として、 電子吸 引基、 電子供与基または水素原子を 1つ以上有してもよい。 Gは、 電子吸引基、 電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。 該 A環は、 一 XG基 以外の置換基として電子吸引基及び/又は電子供与基を 1つ以上有してもよ い。]
で表される化合物である、 上記 （1) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(3) A環が窒素原子、 酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なく とも 1つのへテロ原子を環内に含む 5もしくは 6員環である、 上記 （2) に記載 の幹細胞分化抑制剤。
(4) A環が、 1つの窒素原子を環内に含む 5または 6員環である、上記 （2) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(5) Xで表されるアルキレン基が、 置換基としてアルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ニトロ基、 ヒ ドロキシカルポニル基、 アルコキシカルボニル基、 ァ ミノカルボニル基、 二トリル基及ぴハロゲン原子からなる群から選ばれる基及ぴ /又は原子を 1つ以上有している、 上記 （2) 〜 （4) の何れかに記載の幹細胞 分化抑制剤。
(6) 低分子化合物が、 一般式 （2)
Figure imgf000007_0001
[式中、 I？1、 R2、 R3、 R4、 X及ぴ Gは、 前記 （2) 中の定義と同義である。 R5、 R 6、 R7、 R8、 及び R9は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。 ]
で表される化合物である、 上記 （2) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(7) 低分子化合物が、 一般式 （3)
Figure imgf000008_0001
[式中、 R R2、 R3、 R4、 X及び Gは、 前記 （2) 中の定義と同義である。 R5及 ぴ R6は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子吸引基、 電子供与基また は水素原子を表す。]
で表される化合物である、 上記 （2) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(8) 低分子化合物が、 一般式 （4)
Figure imgf000008_0002
[式中、 R1 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 及ぴ R9は、 前記 （6) 中の定義と 同義である。 R1Q、 R11 R12、 及ぴ R13は、 それぞれ同一または異なっていても よく、 電子吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。 二重片側破線は単結合ま たは二重結合を表す。 二重片側破線が二重結合を表す場合、 波線部に関して幾何 異性体が存在する。 これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独立 に、 E体又は Z体のいずれであってもよい。]
で表される化合物である、 上記（ 6 )に記載の幹細胞分化抑制剤。
(9) R\ R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 R9、 R10、 R"、 R12、 及ぴ R13が、 そ れぞれ独立に、 アルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ニトロ基、 ヒドロキシカ ルポニル基、 二トリル基、 アルコキシカルボニル基、 ァミノカルボニル基、 ハロ ゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、 上記 （8) に記載の幹細胞分化抑制剤。 低分子化合物が、 一般式 （5)
Figure imgf000009_0001
[式中、 R R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 及ぴ R9は、 前記 （6) 中の定義と 同義である。 R1Q、 1、 R12は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子 吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。]
で表される化合物で る、 上記 （6) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(1 1) R\ R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 R9、 R10、 R1 及び R12が、 それ ぞれ独立に、 アルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ニトロ基、 ヒドロキシカル ボニル基、 二トリル基、 アルコキシカルボニル基、 ァミノカルボニル基、 ハロゲ ン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、 上記 （10) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(12) 低分子化合物が、 一般式 （6)
Figure imgf000009_0002
[式中、 R R2、 R3、 R4、 R5、 及ぴ R6は前記 （7) 中の定義と同義である。 R7、 R8、及び R9は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子吸引基、 電子供与 基または水素原子を表す。] で表される化合物である、 上記 （7) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(13) R\ R2 S R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 及び R9がそれぞれ独立に、 アルキ ル基、 アルコキシ基、 ヒ ドロキシル基、 ニトロ基、 二トリル基、 ァセトキシ基、 ァセトキシアルキル基、 酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、 ジアルキルァミノアルキル基、 ジアルキルァミノビュル基、 ヒ ドロキシアルキル アミノアルキル基、 ァリールアミノビニル基、 及ぴ水素原子よりなる群から選ば れる基または原子である、 上記 （12) に記載の分化抑制剤。
(14) R R2、 R\ R4、 R8、 R9及ぴ R1()が水素原子であり、 R5が水素原子、 低 級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R7は、 同一であっても異なつ てもよい低級アルキル基であり、 R11が、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 または低級アルコキシ基であり、 R12が、 水素原子、 低級アルキル基、 低級ァシ ル基、 または低級アルコキシ基であり、 R13が、 ヒドロキシカルボ二ル基、 ニト リル基、 ァミノカルボニル基、 または低級アルコキシカルボニル基である、 上記
(8) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(15) R\ R2、 R3、 R R8、 及び R9が水素原子であり、 R5が水素原子、 低級ァ シル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び が、 同一であっても異なっても よい低級アルキル基であり、 R1。が水素原子又は低級アルキル基であり、 エが、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルコキシ基、 または低級アルコキシ カルボニル基であり、 R12が、 水素原子、 低級アルキル基、 低級ァシル基、 また は低級アルコキシ基である、 上記 （10) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(16) R1および R2が水素原子であり、 R3がヒドロキシル基またはァセトキシ 基であり、 R4がァセトキシアルキル基、 酸素原子を含んでも良い環状アルキルァ ミノアルキル基、 ジアルキルァミノアルキル基、 ヒ ドロキシアルキルァミノアル キル基、 又は水素原子であり、 R5が低級アルキル基、 またはァリールアミノビ二 ル基であり、 R6がニトロ基であり、 R7、 R8、 及ぴ R9が同一であっても異なって もよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、 または水素原子である、 上記 （1 2) に記載の幹細胞分化抑制剤。 ( 1 7 ) -般式 （9 )
Figure imgf000011_0001
[式中、 R R\ R 及ぴ R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基また は環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、R8及び R9は水素原子であり、 R1 G、 R1 1 及ぴ R1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハ ロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基 であり、 R1 3がヒドロキシカルボニル基、 低級アルコキシカルボニル基、 二級ァ ミノカルボニル基または三級ァミノカルボ二ル基を ¾す。 波線部に関して幾何異 性体が存在し、 これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであってもよレ、。 ]
で表される化合物またはその塩。
( 1 8 ) 一般式 （9 )
Figure imgf000011_0002
[式中、 R1 R2、 R\ 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基また は環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、R8及び R9は水素原子であり、 R1 G及び R1 2が水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシ ル基または低級アルコキシ基であり、 R1 1が低級ァシル基であり、 R1 3がヒ ドロキ シカルボニル基、 低級アルコキシカルボニル基、 ァミノカルボ二ル基を表す。 波 線部に関して幾何異性体が存在し、 これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであってもよい。]
で表される化合物またはその塩。
( 1 9 ) 一般式 （9 )
Figure imgf000012_0001
[式中、 R R2、 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒ ドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R7は、 それ ぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基または環状構造 を形成してもよい低級アルキル基であり、 R8及び R9は水素原子であり、 R1 G、 R1 1及び R1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原 子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3はヒ ドロキシカルボニル基、 低級アルコキシカルボニル基またはァミノカル ポニル基を表す。 波線部に関して幾何異性体が存在し、 これらの幾何異性体の配 置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであってもよい。] で表される化合物またはその塩,
( 2 0 ) 一般式 （9 )
Figure imgf000013_0001
[式中、 、 R2、 R3、 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 低級アルキル基または環状構造 を形成してもよい低級アルキル基であり、 R8及び R9は水素原子であり、 R1 G、 R1 \ 及び R1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン 原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3は二トリル基を表す。 波線部に関して幾何異性体が存在し、 これらの幾何異 性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであって もよい。]
で表される化合物またはその塩。
( 2 1 ) 一般式 （1 0 )
Figure imgf000013_0002
[式中、 R R\ R 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒ ドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基また は環状構造を形成してもょレ、低級アルキル基であり、 R8及び R9は水素原子であり、 R10, R11, 及ぴ R12は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ 基であり、 R13がヒ ドロキシカルボ-ル基、 低級アルコキシカルボニル基、 アミ ノカルボニル基、 又は二トリル基を表す。]
で表される化合物またはその塩。
(22) R\ R2, R '及び R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R7が同一であつても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及ぴ R1 Gが水素原子であり、 ェ及ぴ！？ が、 同一 であっても異なっていてもよい水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキ ル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R13がヒドロキシカルボ二 ル基、 低級アルコキシカルボニル基、 モノ低級アルキルアミノカルボ二ル基、 ジ 低級アルキルアミノカルボニル基、 又はフエニルァミノカルボ-ル基である、 前 記 （1 7) 記載の化合物またはその塩。
(23) R R R3、及び R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R7が同一であっても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及び R1 Dが水素原子であり、 R11が低級ァシル基で あり、 R12が水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル 基、 または低級アルコキシ基であり、 R13がヒ ドロキシカルボュル基、 低級アル コキシカルポニル基、 力ルバモイル基、 モノ低級アルキルアミノカルボニル基、 ジ低級アルキルアミノカルボニル基、 又はフエニルアミノカルボニル基である、 前記 （1 8) 記載の化合物またはその塩。 ( 2 4 ) R\ R2、 R3、 及ぴ R4が水素原子であり、 R5が低級ァシル基、 または低 級アルキル基であり、 R6及ぴ R7が同一であっても異なっていてもよい低級アルキ ル基であり、 R8、 R9及び R1 Qが水素原子であり、 ！？ 及ぴ！^ が、 それぞれ同一 または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル 基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3がヒ ドロキシカルボニル 基、 低級アルコキシカルボニル基、 カルパモイル基、 モノ低級アルキルアミノカ ルポニル基、 ジ低級アルキルァミノカルボニル基、 又はフエニルァミノカルボ二 ル基である、 前記 （1 9 ) 記載の化合物またはその塩。
( 2 5 ) R\ R R 及ぴ R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R7が同一であっても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及び R1 Dが水素原子であり、 ェ及ぴ！^^が、 それ ぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級 アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3が二トリル基で ある、 前記 （2 0 ) 記載の化合物またはその塩。
( 2 6 ) R\ R R 及ぴ R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R7が同一であっても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及ぴ R1 Qが水素原子であり、 ！？ 及び！？^が、 それ ぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級 アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R 1 3がヒ ドロキシカ ルポニル基、 低級アルコキシカルボニル基、 カノレバモイル基、 モノ低級アルキル ァミノカルボニル基、 ジ低級アルキルァミノカルボニル基、 フエニルァミノカル ボニル基、 又は二トリル基である、 前記 （2 1 ) 記載の化合物またはその塩。
( 2 7 ) (4 -ァセチル-フエニルァゾ） -（3， 3-ジメチル- 3， 4-ジヒドロ- 2H -イソキ ノリン- 1-ィリデン） -酢酸ェチルエステル、 （4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-（3， 3 -ジ メチル- 3, 4-ジヒドロ— 2H-イソキノリン十ィリデン） -酢酸、 2 - (4-ァセチル -フエ 二ルァゾ）-2- (3， 3-ジメチル- 3， 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン -トイリデン） - N -メ チル-ァセトアミ ド、 2 -（4-ァセチル -フエ二ルァゾ）-2_ (3, 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン- 1-ィリデン）- N，N-ジメチル-ァセトアミ ド、 2- (4-ァセチ ル-フエニルァゾ）- 2 -（3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ - 2H-ィソキノリン- 1 -ィリデ ン)- N-フエニル-ァセトアミ ドである、前記（1 7)記載の化合物またはその塩。 (28) 2- (3-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2- (3, 3-ジメチル- 3,4-ジヒドロ- 2H-ィ ソキノリン - 1 -イリデン) -ァセトアミ ドである、 前記 （1 8) 記載の化合物また はその塩。
(29) 2- (4 -ァセチル -フエ二ルァゾ）-2- (2,3, 3 -トリメチル -3， 4-ジヒ ドロ -2H-イソキノリン - 1-イリデン） -ァセトアミ ド、 2-(2 -ァセチル- 3，3-ジメチル - 3， 4-ジヒ ドロ- 2H -ィソキノリン -1-ィリデン） - 2 -（4 -ァセチル -フエニルァゾ） - ァセトアミ ド である、 前記 （19) 記載の化合物またはその塩。
(30) (4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-(3， 3 -ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキ ノリン- 1 -イリデン） -ァセトニトリルである前記 （20) 記載の化合物またはそ の塩。
(31) 2- (4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2- (3, 3 -ジメチル- 1， 2， 3, 4-テトラヒ ド ロ-イソキノリン- 1-ィル) -ァセトアミ ドである前記 （21) 記載の化合物または その塩。
(32) 前記 （1 7) 〜 （31) のいずれかに記載の化合物またはその塩を有 効成分とする幹細胞分化抑制剤。
(33) 低分子化合物がアルカリホスファターゼの活性を維持または上昇させ る作用を有する化合物である、 上記 （1) 〜 （16) 又は （32) のいずれかに 記載の幹細胞分化抑制剤。
( 3 4 ) 低分子ィ匕合物カ 、 STAT3 (signal transducer and activator of transcrption3)を活性化しない化合物である、 上記 （1) 〜 （16)、 （32) 又 は （33) のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
(35) 低分子化合物が、 S SEA— 1抗原発現量を増加させる作用を有する 化合物である、 上記 （1) 〜 （16) 又は （32) 〜 （34) のいずれかに記載 の幹細胞分化抑制剤。 (36) 低分子化合物が、 Na n o g遺伝子の発現量を増加させる作用を有す る化合物である上記 （1) 〜 （16) 又は （32) 〜 （35) .のいずれかに記載 の幹細胞分化抑制剤。
(37) 低分子化合物が、 Na n o g遺伝子の発現量を増加させる作用を有す る 2環化合物である、 上記 （36) に記載の幹細胞分化抑制剤。
(38) 低分子化合物が、 Na n o g遺伝子の発現量を増加させる作用を有す るァゾ基を含有する 2環化合物である、上記（37)に記載の幹細胞分化抑制剤。
(39) 上記 （1) 〜 （16) 及ぴ （32) 〜 （38) のいずれかに記載の幹 細胞分化抑制剤を用いて幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする幹細 胞培養方法。
(40) 上記 （1) 〜 （16) 及ぴ （32) 〜 （38) のいずれかに記載の幹 細胞分化抑制剤を用いて胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする 胚性幹細胞培養方法。
(41) 上記 （1) 〜 （16) 及び （32) 〜 （38) のいずれかに記載の幹 細胞分化抑制剤を有効成分として含有する培地。
(42) 上記 （17) 〜 （31) のいずれかに記載の化合物またはその塩を含 有する培地。
(43) 分化抑制剤、 化合物またはその塩の濃度が 10 n g/m 1〜100 μ gZmlであることを特徴とする上記 （41) または （42) に記載の培地。
(44) 上記 （1) 〜 （16) 及び （32) 〜 （38) のいずれかに記載の分 化抑制剤を用いて未分化状態で培養された幹細胞。
(45) 上記 （1) 〜 （16) 及ぴ （32) 〜 （38) のいずれかに記載の分 化抑制剤を用いて未分化状態で培養された幹細胞を分化させて得られる細胞ま たは組織。
(46) 細胞または糸且織が生体内へ移植するためのものである上記 （44) ま たは （45) に記載の細胞または組織。
(47) 上記 （44) 〜 （46) のいずれかに記載の細胞または/およひ且織 を生体内に移植する治療方法。
( 4 8 ) 上記 （1 7 ) 〜 （3 1 ) のいずれかに記載の化合物またはその塩のプ 口ドラッグ。
( 4 9 ) 上記 （1 7 ) 〜 （3 1 ) のいずれかに記載の化合物もしくはその塩ま たはそのプロドラッグを含有してなる医薬組成物。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の化合物 Aの構造を示す。 化合物 Aは、 図 1中の式（5 )の R1 〜R 1 2が下表に示す基または元素で表される化合物である。
図 2は、本発明の化合物 B〜 Fの構造を示す。化合物 B〜 Fは、図 2中の式（ 4 ) の R 1〜R 1 3が下表に示す基または元素で表される化合物である。
図 3は、 アルカリホスファターゼ定量 1の結果を表す。
図 4は、 アルカリホスファターゼ染色 1の結果を表す。
図 5は、 STAT3活性化ァッセィ 1の結果を示す。
図 6は、 O c t _ 3 Z 4遺伝子発現量を示す。
図 7は、 n a n o g遺伝子発現量を示す。
図 8は、 S S E A— 1抗原の発現量評価 1における平均蛍光強度の結果を示す。 図 9は、本発明の化合物 a〜 oの構造を示す。化合物 a〜 oは、図 9中の式（ 6 ) の！^〜!^ 9が下表に示す基または元素で表される。
図 1 0は、 本発明の分化抑制剤を用いた場合のアルカリホスファターゼ定量 2 の結果を表す。
図 1 1は、 SSEA- 1抗原の発現量評価 2における平均蛍光強度の結果を示す。 図 1 2は、 STAT3活性化ァッセィ 2の結果を示す。
図 1 3は、 E S細胞継代培養の結果 1を表す。
図 1 4は、 E S細胞継代培養の結果 2を表す。
図 1 5は、 本発明の分化抑制剤の胚性幹細胞未分化維持効果を示す。
図 1 6は、本発明の分化抑制剤の胚性幹細胞未分化維持効果（染色図）を示す。 図 1 7は、 本発明の化合物①の構造を示す。 化合物①は、 図 1 7中の式（1 0 ) の ^〜^ 3が下表に示す基または元素で表される。
図 1 8は、 本発明の化合物②〜⑩の構造を示す。 化合物②〜⑩は、 図 1 8中の 式（9 )の！^1〜!?1 3が下表に示す基または元素で表される。
図 1 9は、 アルカリホスファターゼ染色の染色図を表す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
以下の用語は他で述べない限り、 以下に提供されるように定義される。
本明細書で使用される他の全ての用語は、 他に述べない限り、 その用語に関す る特定の分野でのその語法に関して定義される。
幹細胞：幹細胞とは、 特異化された機能を有する他の細胞型、 即ち、 最終的に 分化した細胞、 もしくは、 より狭い範囲の細胞型に分化可能な他の幹細胞型に分 化し得る細胞を指す。
全能性幹細胞：全能性幹細胞とは、多能性の細胞およぴ完全に分化した細胞（す なわち、 種々の細胞へと、 もはや分化し得ない細胞） を含む任意の細胞型へと分 化し得る細胞のことを言う。
多能性幹細胞：多能性幹細胞とは、 必ずしも全ての型にならないけれども、 異 なる多数の細胞型のうちの 1つへと分ィ匕し得る細胞をいう。 多能性細胞の 1つの 例は、 造血幹細胞であり、 この細胞はリンパ球およぴ赤血球のような種々の血液 細胞型へと分化し得る。
胚性幹細胞：胚性幹細胞とは、 幹細胞の中でも特に前着床段階の胚の、 桑実胚 または胚盤胞段階から得られた全能性の細胞をいい、 E S細胞とも呼ばれる。 ま た、胚性幹細胞には、精子あるいは卵子になると決まっている、胚または胎児（胎 仔）の始原生殖細胞に由来する多能性の幹細胞のことをいう場合もある。ただし、 この細胞は胚性生殖 （Embryonic Germ, EG) 細胞と呼ばれて胚性幹細胞と区別さ れる場合もある。 本明細書中で用いる胚性幹細胞は、 いかなる動物種のものであ つてよく、 例えばヒトを含む霊長類、 霊長類以外の哺乳類、 鳥類などの胚性幹細 胞が挙げられる。
全能性：全能性とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々 の細胞へと、 もはや分化し得ない細胞） を含む任意の細胞型へと分化し得る状態 を言う。
多能性：多能性とは、 必ずしも全ての型にならないけれども、 異なる多数の細 胞型のうちの 1つへと分化し得る状態をいう。
未分化：未分化とは、 1つの細胞、 或いは複数の細胞からなる任意の細胞集団 が、 1つまたは複数の、 さらに分化が進んだ状態の細胞に分化し得る能力を有す る状態である細胞、 或いは該細胞を含む細胞集団である状態であることをいう。 フィーダ一：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダ一とは、 全 能性幹細胞がその上にプレートされ、 プレートされた全能性幹細胞の増殖の助け となる環境を提供するものをいう。
フィーダ一細胞：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダ一細胞と は、 全能性幹細胞がその上にプレートされる非全能性幹細胞をいい、 非全能性 幹細胞は、 プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供する。 細胞由来成分：細胞から分泌される成分、 内容物、 および細胞膜成分など、 細 胞に由来する全ての成分をいう。
本発明は、 幹細胞、 好ましくは胚性幹細胞を未分化の状態で、 増殖おょぴ維持 させ得る分化抑制剤、 それを用いた培養方法、 それを用いた培養液、 それを用い て培養し作製された細胞株を提供する。 本発明で提供する分化抑制剤、 培養方法 および培養液は、 従来より簡便に、 安全に、 未分化の胚性幹細胞を増殖しそして 維持する。本発明の分化抑制剤を含む細胞培養方法はまた、特定の分化誘導因子、 および分化誘導因子の有用な組み合わせについてスクリーニングするために使 用され得る。 本発明の分化抑制剤、 および培養方法を使用して、 未分化な胚性幹 細胞を増殖させる能力は、 重要な治療適用を有する単一もしくは複数の遺伝的改 変を有する胚性幹細胞系を産生する能力を含む重要な利益を提供する。 本発明の分化抑制剤は、 化学的に安定な低分子化合物で、 幹細胞を未分化な状 態で維持する活性を有するものであればいずれも用いることができるが、 好まし くは下記一般式 （1 ) で表される低分子化合物があげられる。
Figure imgf000021_0001
式中、 R R2、 、 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子 吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。 電子供与基とは、 ベンゼン環へ電子 を供与し得る置換基、 電子吸引基とはベンゼン環上の π電子を吸引する性質を有 する置換基をいう。また、 Hammettの置換基定数 σを用いてび < 0を電子供与基、 σ >0 を電子吸引基と定義することもできる （基礎有機反応論、 橋本静信ら著、 三共出版、 1997年)。
Α環は、 少なくとも 1つのへテロ原子を環内に含む 5〜8員環を表す。
は、 主鎖の原子数が 0〜 1 0のアルキレン基を表す。 原子数 0のアルキレン 基とは、 単結合を表す。 該アルキレン基を構成する 1つ以上のエチレンが、 _ C = C _基及ぴZ又は_ N = N—基及ぴ/又は—C O N H—基で置き換ゎってぃ てもよい。 また、 環 Aと結合するポンドが二重結合となる基であってもよい。 さ らに、 該アルキレン基は、 置換基として、 電子吸引基、 電子供与基または水素原 子を 1つ以上有してもよい。
Gは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。 該 A環は、 一 X G基以外の置換基として電子吸引基及ぴ Z又は電子供与基を 1つ 以上有してもよい。
このうち、 A環が窒素原子、 酸素原子及ぴ硫黄原子よりなる群から選ばれる少 なくとも 1つのへテロ原子を環内に含む 5もしくは 6員環であることが望まし レ、。 また、 A環が、 1つの窒素原子を環内に含む 5または 6員環である場合も同様 に望ましい。 この場合、 5員環は不飽和であることが望ましく、 6員環は飽和で あることが望ましい。
さらに、 Xで表されるアルキレン基は、 置換基としてアルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ニトロ基、 ヒドロキシカルポニル基、 アルコキシカルボニル基、 ァミノカルボ二ル基、 二トリル基及ぴハロゲン原子からなる群から選ばれる基及 ぴ Z又は原子を 1つ以上有している場合が望ましい。
たとえば一般式 （1 ) の例としては、 式 （2 ) で表されるようなテトラヒドロ イソキノリン誘導体おょぴ一般式 （3 ) で表されるようなインドール誘導体があ げられる。
Figure imgf000022_0001
式中、 R R2、 R3、 R4、 X及び Gは、 前記と同義である。 R5、 R6、 R7、 R8、 及 ぴ R9は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子吸引基、電子供与基また は水素原子を表す。
Figure imgf000022_0002
式中、 R1 R2、 R3、 R X及び Gは、 前記と同義である。 R5及び R6は、 それぞ れ同一または異なっていてもよく、 電子吸引基、 電子供与基または水素原子を表 す。
一般式 （2 ) で表されるテトラヒドロイソキノリン誘導体の具体例としては、 式 （4) 若しくは式 （5) で示される構造の化合物および塩があげられる。
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
式中、 ！^1〜^3は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子吸引基、 電子 供与基または水素原子を表す。
より好ましくは、 ！^〜1113は、 アルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ニトロ 基、 ヒドロキシカルポニル基、 二トリル基、 アルコキシカルボニル基、 アミノカ ルポニル基、 ハロゲン原子及ぴ水素原子よりなる群から選ばれる基または原子力 S あげられる。
また、 一般式 （4) の場合、 さらに好ましくは、 1^〜^、 R8、 R9及び R10が水 素原子であり、 R5が水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6 及ぴ R7が、 同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、 R11が、 水素 原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 または低級アルコキシ基であり、 R12が、 水素 原子、低級アルキル基、低級ァシル基、 または低級アルコキシ基であり、 R1 3が、 ヒドロキシカルポニル基、 二トリル基、 ァミノカルボ二ル基、 または低級アルコ キシカルポニル基があげられる。
Rで表される低級アルキル基としては、例えば、 メチル、ェチル、 n-プロピル、 イソプロピル、 n -ブチル、 イソブチル、 sec-ブチル、 tert-プチル、 n -ペンチノレ、 ィソペンチノレ、 ネオペンチノレ、 1 -メチルプロピル、 n -へキシル、 イソへキシル、 1, 1-ジメチノレブチノレ、 2, 2 -ジメチルブチル、 3， 3 -ジメチノレブチノレ、 3, 3 -ジメチノレ プロピル、 2 -ェチルブチルなどが挙げられる。 好ましくは、 メチルである。
R で表される低級アルコキシ基としては、 例えば、 メ トキシ、 エトキシ、 プロ ポキシ、 イソプロポキシ、 ブトキシ、 sec-ブトキシ、 tert-ブトキシ、 ペントキ シ、 へキシロキシ、 へプチ口キシ、 ォクチロキシなどが挙げられる。 好ましくは メ トキシである。
Rで表されるハロゲン原子としては、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素などが挙げ られるが、 好ましくは塩素または臭素である。
R で表される低級ァシル基として、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチ リルなどが挙げられるが、 好ましくはァセチルである。
R で表される環状構造を形成してもよい低級アルキル基としてシクロブチル、 シク口ペンチル、 シク口へキシル、 シク口へプチノレ、 シクロォクチルなどが挙げ られる力、好ましくはシク口ペンチル、シク口へキシル、シク口へプチルである。
R で表される低級アルコキシカルボニルとして、 メ トキシカルボニル、 ェトキ シカルボニル、 プロポオキシカルボニルなどが挙げられるが、 好ましくはメ トキ シカノレポニルもしくはェトキシカルボニルである。
Rで表されるァミノカルボニルとしては、 例えば、 - C0NR2 (Rは同一でも異な つてもよい水素原子、 先に例示した低級アルキル基、 置換基を有してもよいフエ -ル基を表す） などが挙げられる。
Rで表される二級アミノカルボニル基としては、 例えば、 - C0 HR (先に例示し た低級アルキル基、置換基を有してもよいフエ二ル基を表す）などが挙げられる。 また、 三級アミノカルポニル基としては、 例えば、 - C0NR2 (Rは同一でも異なつ てもよい先に例示した低級アルキル基、 置換基を有してもよいフユ二ル基を表 す） などが挙げられる。
Rで表されるアミノアルキル基としては、 例えば、 一 （CH2) n -NR2 ( nは 1 〜 8を示すが、好ましくは 1である。また Rは同一でも異なっても良い水素原子、 低級アルキル基、 環状構造を形成しても良い低級アルキル基 （環状構造中には窒 素や酸素などのへテロ原子を 1〜 3個含んでも良い）、 置換基を有しても良いフ 工ニル基を表す） などがあげられる。
Rで表されるァセトキシアルキルとしては、 一 （CH2) n -0Ac ( nは 1〜8を表 す） があげられるが、 好ましくは nは 1である。
また、式（4 )における二重片側破線は単結合または二重結合を表す。 さらに、 式 （4 ) で表されるィ 合物において、 二重片側破線が二重結合を表す場合、 波線 部 （2箇所） に関して幾何異性体が存在する。 これらの幾何異性体の配置は特に 限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであってもよく、 本発明の 化合物は、 これらの幾何異性に基づく純粋な形態の幾何異性体の任意の混合物で あってもよレヽ。
一般式 （5 ) の場合、 さらに好ましくは、 ！?1〜!^、 R8及ぴ R9が水素原子であ り、 R1 Qが水素原子または低級アルキル基であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R7が、同一であっても異なってもよい低級 アルキル基であり、 R1 1が、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルコキ シ基、 または低級アルコキシカルボニル基であり、 R1 2が、 水素原子、 低級アル キル基、 低級ァシル基、 または低級アルコキシ基があげられる。
一般式 （4 ) の具体例として式 （4 ) 中、 二重片側破線が二重結合であり、 R1 3がァミノカルボニル基である、 一般式 ( 7 ) で表される化合物があげられる。
Figure imgf000026_0001
また、 テトラヒ ドロイソンキノリン誘導体である前記一般式 （4 ) に含まれる さらに具体的な化合物には、 次のようなものが例示される。
2 -（4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2 -（3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリ ン- 1-イリデン) -ァセトアミ ド
2 -（3-ァセチル-フェニルァゾ） - 2- (3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリ ン- 1-イリデン) -ァセトアミ ド
2- (4-ブロモ-フエ二ルァゾ）-2- (3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン -1 -イリデン) -ァセトアミ ド
2- (3-ブロモ -フエニルァゾ） - 2 -（3， 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン - 1 -イリデン) -ァセトアミ ド
2- (4 -クロ口-フエニルァゾ） - 2-（3, 3 -ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン - 1-イリデン) -ァセトアミ ド
2- (3-クロ口-フエ二ルァゾ）-2 -（3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン - 1-イリデン) -ァセトアミ ド
2 -（3， 3-ジメチル- 3， 4-ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン- 1 -ィリデン）-2- m-トリルァゾ -ァセトアミ ド
2 -（3， 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ - 2H -ィソキノリン -卜ィリデン） - 2 - p -トリルァゾ -ァセトアミ ド
2- (3， 3 -ジメチル- 3， 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン- 1-ィリデン） - 2 -（4-メ トキシ- フエニルァゾ）-ァセトアミ ド 2- (3, 3 -ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン- 1-ィリデン）-2- (3-メ トキシ- フエニルァゾ） -ァセトアミ ド
2 -（3, 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン- 1 -ィリデン） - 2 - (4-二トロ-フ ェニルァゾ） -ァセトアミ ド
2- (3， 3 -ジメチル- 3, 4 -ジヒドロ- 2H -イソキノリン- 1-ィリデン） - 2 -（3 -二トロ-フ ェニルァゾ）-ァセトアミ ド
2 -（3， 3 -ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン- 1-ィリデン）-2- (4 -スルファ モイル-フエニルァゾ）-ァセトアミ ド
2- (3， 3 -ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン- 1 -ィリデン） - 2 -（3 -スルファ モイル-フエニルァゾ）-ァセトアミ ド
2 -（4 -ァセチルアミノ-フエニルァゾ） - 2 -（3, 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H-ィソ キノリン- 1 -イリデン：) -ァセトアミ ド
2- (3-ァセチルアミノ-フエニルァゾ） - 2 -（3， 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-ィソ キノリン- 1-イリデン) -ァセトアミ ド
2- (2 -ァセチル-フェニルァゾ） - 2- (3, 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H -イソキノリ ン -1-ィリデン）-ァセトアミ ド
2- (3, 3-ジメチル -3, 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン- 1 -ィリデン） - 2 -フエ二ルァゾ -ァセトアミ ド
(4 -ァセチル-フエ二ルァゾ）_ (3， 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン- 1 - ィリデン） -酢酸ェチルエステル
2- (4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2 -（3， 3-ジメチル -1， 2， 3, 4-テトラヒ ドロ-イソキ ノリン- 1-ィル）ーァセトアミ ド
2- (4 -ァセチル-フェニルァゾ） - 2- (3， 3-ジメチル- 3， 4-ジヒ ドロ- 2H -イソキノリ ン- 1 -ィリデン） - N -メチル -ァセトアミ ド
2 -（4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2- (3， 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリ ン- 1-ィリデン）- N-フエニル-ァセトアミ ド
2-（4-ァセチル -フエ二ルァゾ）-2 -（2, 3, 3 -トリメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -ィソキ ノリン- 1 -ィリデン) -ァセトアミド
(4 -ァセチル-フエ二ルァゾ）-（3, 3-ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン- 1- イリデン) -ァセトニトリル
2- (4 -ァセチル-フエ二ルァゾ）-2- (3， 3 -ジメチル- 3， 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリ ン- 1 -ィリデン) - N, N-ジメチル-ァセトアミ ド
(4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-（3, 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒドロ- 2H-イソキノリン- 1 - イリデン) -酢酸
2-（2 -ァセチル- 3, 3-ジメチル -3, 4-ジヒ ドロ- 2H -イソキノ リ ン - 1 -ィ リデ ン）- 2- (4-ァセチル-フエニルァゾ）- ァセトアミ ド また、 一般式 （5 ) の具体例として以下に示す一般式 （8 ) で表される化合物 があげられる。
Figure imgf000028_0001
式中、 ！^1〜!?4、 R6〜R1 2としては、 同一または異なった電子吸引基、 または電 子供与基または水素原子から選ばれる基または原子が挙げられる。 好ましくは、
Rl〜R4、 R6〜Ri 2は、 同一または異なった、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキ ュル基、 フエニル基、 ナフチル基、 フリル基、 チェニル基、 アルコキシ基、 アル キルァミノ基、 アルキルカルボニル基、 ベンゾィル基、 ナフトイル基、 フロイル 基、 テノィル基、 ジアルキルカルパモイル基、 ァセチル基、 ブタノィル基、 メ ト キシカルボ二ル基、 シクロアルキル基、 ベンジルォキシ基、 ァダマンチルォキシ 基、 ニトロ基よりなる群から選ばれる基、 あるいはハロゲン原子または水素原子 が挙げられる。 さらには、 1〜!?4、 R6〜R1 2はアルキル基、 ァセチル基、 アルコ キシ基、 ニトロ基、 ハロゲン原子もしくは水素原子よりなる群から選ばれる基ま たは原子であることが望ましい。
また一般式 （5 ) に含まれる化合物には次のようなものが例示される。
2 -シァノ -2 -（3, 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -ィソキノリン- 1 -ィリデン）- N - p- トリノレ-アセトアミ ド
2-シァノ -2- (3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ - 2H-ィソキノリン- 1 -ィリデン） - N- m- トリル -ァセトアミ ド
2-シァノ -2- (3, 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-ィソキノリン- 1 -ィリデン）- N- o - トリル -ァセトアミ ド
2-シァノ -2 -（3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ - 2H -ィソキノリン- 1-ィリデン） - N -（4- メ トキシ—フエ二ル）—ァセトアミ ド
2 -シァノ- 2 -（3， 3-ジメチル -3, 4-ジヒ ドロ- 2H-ィソキノリン十ィリデン） - N -（3 - メ トキシ-フエ二ル) -ァセトアミ ド
2 -シァノ- 2 -（3, 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン -1-ィリデン） - N -（4- 二トロ-フエ二ル）-ァセトアミ ド
2 -シァノ -2- (3, 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-ィソキノリン- 1 -ィリデン） - N -（3 - 二トロ—フエ二ル）-ァセトアミ ド
4- [2 -シァノ- 2 -（3， 3-ジメチル -3, 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン- 1-ィリデン） -ァ セチルァミノ] -安息香酸ェチルエステル
3- [2-シァノ -2 -（3, 3-ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン -トイリデン） -ァ セチルァミノ] -安息香酸ェチルエステル
2 -シァノ- 2 -（3, 3-ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン -1 -ィリデン） - N -フ ェニル-ァセトアミ ド
2 -シァノ - 2 -（3， 3 -ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ -2H-イ ソキノ リ ン- 1-ィ リデ ン） - N -（2, 4 -ジメチル-フエニル) -ァセトアミ ド
2 -シァノ- 2- (3, 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ -2H-イソキノリン- 1 -ィリデン）-ァセ トアミ ド
—般式（2 )および （3 ) であらわされる化合物の塩としては、 薬学的に許容し うる塩が望ましい。例えば、塩酸塩、硫酸塩、 リン酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、 マレイン酸塩、 フマル酸塩、 コハク酸塩、 メタンスルホン酸塩、 p—トルエンス ルホン酸塩、 クェン酸塩、 酒石酸塩などを形成してもよい。
また、 一般式 （4 ) および （5 ) であらわされる化合物のエステル化合物も本 発明の範囲であり、 例えば、 カルボン酸エステル、 スルホン酸エステル、 無機酸 エステルなどがあげられる。
一般式 （3 ) に表されるようなインドール誘導体としては、 以下の式 （6 ) で 表される化合物があげられる。
Figure imgf000030_0001
式中、！?1〜!^9は同一または異なった電子吸引基、 電子供与基または水素原子を表 す。 このうち、 好ましくは、 ！?1〜!?9はアルキル基、 アルコキシ基、 ヒドロキシル 基、 ニトロ基、 ァセトキシ基、 アミノアルキル基、 ァセトキシアルキル基、 アミ ノビュル基、 及ぴ水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。 さらには、 R 及ぴ R2が水素原子であり、 R3がァセトキシ基またはヒドロキシ ル基であり、 R4が水素原子、 ジアルキルァミノアルキル基、 環状アルキルァミノ アルキル基、 ヒ ドロキシアルキルァミノアルキル基、 またはァセトキシアルキル 基であり、 R5が低級アルキル基、ァリールァミノビュル基であり、 R6が二トロ基、 R7〜R9が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、 ま たは水素原子であることが望ましい。
また、 一般式 （6 ) に含まれる化合物には次のようなものが例示される。 2 -メチル- 3 -二ト口- 1 -フエ二ル- 1H -ィンドール- 6 -オール
1- (4 -メトキシ-フエ二ル）- 2 -メチル- 3 -二ト口- 1H-ィンドール- 6 -オール
2 -メチル— 3 -二ト口— l—p—トリノレ一 1H—ィンドール— 6—オール
2- [2 -（4 -メ トキシ-フエニルァミノ） -ビュル] - 3 -二トロ- 1 - p -トリル - 1H -ィンド ■ ~ル— 6 -ォ1 ~ノレ
1- (2-メ トキシ-フエニル） - 2 -メチル- 3 -二ト口- 1H -ィンドール- 6-オール
7 -ジメチルァミノメチル- 2 -（2 -ジメチルァミノ -ビュル） - 3 -二トロ- 1 - p -トリル 一 1H—ィンドーノレ— 6—才ー/レ
1 -（4 -メ トキシ-フエ二ル）- 2-メチル -3 -二トロ- 7-ピペリジン -1 -ィルメチル- 1H- ィンドール- 6-オール塩酸塩
2 -（2 -ジメチルァミノ -ビュル） - 1 -（4 -メ トキシ-フエ二ル）- 7 -モルフォリン- 4 -ィ ルメチル- 3-二ト口- 1H-ィンドール- 6-オール
7- [ (3 -ヒ ドロキシ-プロピルァミノ） -メチル] - 1 - (4-メ トキシ-フエ二ル) - 2 -メチ ル- 3-二ト口- 1H-ィンドール- 6-オール塩酸塩
7 -ジメチルアミノメチル- 2- (2 -ジメチルアミノ -ビュル） - 1 -（4 -メ トキシ-フエ二 ル）— 3 -二ト口— 1H—ィンドール— 6—ォーノレ
7-ジェチルァミノメチル- 1- (4-メ トキシ-フエニル） - 2 -メチル- 3 -二ト口- 1H-ィ ンドーノレ- 6—ォーノレ
7 -ジメチルァミノメチル- 2 -メチル- 3-二ト口- 1 - p-トリル- 1H-ィンドール- 6-ォ ール
1- (4 -メ トキシ -フエニル） - 2 -メチル -3 -二トロ- 7-ピペリジン- 1-ィルメチル- 1H - ィンドール- 6 -オール
酢酸 7-ァセトキシメチル- 2-メチル- 3 -二ト口- 1- p-トリル- 1H-ィンドール- 6-ィ ルェステル
2- (2 -ジメチルァミノ -ビュル）- 1- (4-メ トキシ-フエ二ル）- 3-二トロ- 7-ピペリジ ン- 1-ィルメチル- 1H -ィンドール - 6_オール
7-ジメチルァミノメチル- 2 -メチル- 3-二トロ- 1 -フエ二ル- 1H-ィンドール - 6-ォ ール
7 -ジメチルァミノメチル -卜 （4 -メ トキシ-フエニル） -2-メチル- 3 -二トロ- 1H -ィ ンドール- 6-オール
本発明の化合物は以下に述べる方法及びそれらに準ずる方法、 または公知の方 法を行うことにより製造することができる。 式（ 9 )で表される化合物の製造法を 以下に示す。
Figure imgf000032_0001
等量のチォエーテル誘導体（ I )とフエ二ルァゾァセトアミ ド誘導体（I I )を 反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒 （例えば、 ジメチルホルムアミド、 ジメチ ルァセトアミ ドなどのアミ ド類、 テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ベンゼ ン、 トルエンなどの芳香族炭化水素類） に溶解し、 原料がなくなるまで還流する ことにより製造することができる。 該誘導体（ I )は公知の方法 （例えば、 Khim. Geterotsikl. Soedin. , No. 7, ρ995 (1990)などに記載） により、 もしくは、 市販品から購入することができる。 具体的には、 下表 1に示すとおりである。 表 1
サプライャ R l R 2 R 3 R 4 R 6 R 7
Asinex -H -OMe -OMe - H - Me -Me
Asinex -H - H - H -H ーシク口へキシノレ
Asinex -H -H -H - H -シクロペンチル
Asinex - OMe - H - H -OMe -Me - Me
Asinex -H -OMe -OMe - H -シク口ペンチノレ
Asinex - H - H - H - H —シク口へプチ 7レ
PHARMEKS - H - H -H - H -Me - Me
LABOTEST - H -H - H -H -Me - Et
LABOTEST -H - H - H -H -Et -Et
MCL - H -Me -Me -H -Me -Me
MCL - H - H - H -Me - Me -Me
MCL - H -0CH2Ph -OMe - H -Me -Me
CBI -H - OH -OMe - H -Me -Me
CBI -H - H -Br -OMe -Me - Me
フエ二ルァゾァセトアミド誘導体（I I )は、 公知の手法 （Materialy Ural' sk. Soveshch. po Spektroskopii, 4th, Sverdlovsk 1963, p205 (1965) , Bulletin de Academie Polonaise des Sciences, Serie des Sciences Chimiques , 14 (1) , p29 (1966) , Am. Chem. Soc. , Div. Org. Coatings, Plastics Chem. Preprints , 23 (2) , p486 (1963) , Zhurnal Obshchei Khimii , 35 (3) , p559 (1965)、 Zhurnal Obshchei Khimii, 32, p526 (1962)など） により製造することができる。
式（9 )で表される化合物は以下のスキームでも合成可能である。
Figure imgf000034_0001
ベンジルカルビノール誘導体と 2 -シァノアセトアミ ド誘導体とを硫酸存在下 で反応することにより得られる化合物（IV)とジァゾ二ゥム塩 (V)とを反応に悪影 響を及ぼさないアルコール水溶液中、 塩酸存在下で反応させることにより得られ る。 ベンジルカルビノール誘導体は様々な誘導体が市販品から購入でき、 さらに 公知の方法 (例えば、 J. Gen. Chem. USSR, No. 6, pl263 (1936)により得る事が出来 る。 また、 ジァゾ二ゥム塩は市販のァミノベンゼン誘導体を塩酸、 亜硝酸ナトリ ゥム水溶液により公知の方法で誘導できる。
式（9 )で表される化合物のうち、 2- (4-ァセチル-フエニルァゾ) -2 - (3, 3 -ジメ チル- 3， 4-ジヒドロ- 2H -ィソキノリン- 1-ィリデン） -ァセトアミ ド （Asinex, 口シ ァ）、 2 -（3 -クロ口-フエ二ルァゾ）-2-（3， 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソキノ リン - 1-イリデン） -ァセトアミ ド （Asinex, ロシア）、 2- (3， 3 -ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン- 1-ィリデン） - 2 -（3 -メ トキシ-フエニルァゾ）-ァセトアミ ド （Asinex, ロシア）、 2 -（3, 3 -ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H-ィソキノリン- 1-ィリ デン） -2- (3-ニトロ-フエニルァゾ）-ァセトアミ ド （PHA腿 KS, ロシア）、 2- (3，3- ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン- 1 -ィリデン） -2- (4 -メ トキシ-フエ二 ルァゾ） -ァセトアミ ド（PHARMEKS, 口シァ）、 2 -（3， 3 -ジメチル -3， 4-ジヒドロ- 2H - イソキノリン- 1 -イリデン） -2- m-トリルァゾ-ァセトアミ ド （IBS, ロシア） は巿 販品であり、 サプライヤーから入手することが出来る。
式（9 )で表される化合物の中で、 R5がメチル基である場合の製造法を以下に示 す。 反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒 （例えば、 ァセトニトリルの二トリル 類、 テトラヒ ドロフランなどのエーテル類、 ベンゼン、 トルエンなどの芳香族炭 化水素類） に式 (4)で表される化合物 （R 5 =-H) 及び炭酸ナトリウムを加えて溶 解し、 ヨウ化メチルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒 （例えば、 ジメチル ホルムアミ ド、 ジメチルァセトアミ ドなどのアミ ド類、 テトラヒドロフランなど のエーテル類、 ベンゼン、 トルエンなどの芳香族炭化水素類） に溶解したものを ゆっくり滴下し、 還流することにより製造することができる。
式（9 )で表される化合物の中で、 R5がァセチル基である場合の製造法を以下に 示す。 氷浴下、 式（9 )で表される化合物 (R5=-H) 及びジメチルァミノピリジン をピリジンに溶解し、 無水酢酸を加え、 攪拌することにより製造することができ る。
式（1 1 )で表される化合物の製造法を以下に示す。
Figure imgf000036_0001
式（9 )で表される化合物を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒 （例えば、 ジ メチルホルムアミド、 ジメチルァセトアミドなどのアミド類） に溶解し、 塩化チ ォニルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセトアミドなどのァミド類） に溶解したものを氷浴下で滴下すること により製造できる。 '
式（1 2 )で表される化合物の製造法を以下に示す。
Figure imgf000036_0002
エタノールに水酸化力リゥム及び式（9 )で表される化合物を加え、 還流するこ とにより製造することができる。
式（1 3 )で表される化合物の製造法を以下に示す。
Figure imgf000037_0001
式（1 2 )で表される化合物をエタノールに懸濁し、 冷却しながら塩化チォ をゆつくり滴下し、 室温で攪拌することにより製造することができる。
式（1 4 )で表される化合物の製造法を以下に示す。
Figure imgf000037_0002
式（1 2 )で表される化合物、 該当する 1級または 2級ァミン、 HOBt (Advanced ChemTech社、米国）及びトリェチルァミンを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶 媒 (例えば、ジメチルホルムアミド、 ジメチルァセトアミドなどのアミド類など) に溶解し、 これに HBTU (Advanced ChemTech社、 米国） を反応に悪影響を及ぼさ ない適当な溶媒 （例えば、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルァセトアミドなどの アミド類、ジクロロメタンなどのハロゲン系溶媒など）に溶解したものを加えた。 室温で攪拌することにより製造することができる。
式（1 0 )で表される化合物の製造法を以下に示す。
Figure imgf000038_0001
反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒 （例えば、 ァセトニトリルの二トリル類 など） に式（9 )及び（1 1 )〜（1 4 )で表される化合物を溶解し、 トリフエニルす ず水素化物 （Aldrich、米国） を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、 ベンゼン、 トルエン、 キシレンなどの芳香族炭化水素類） に溶解したものを前記 溶媒に加え、 還流することにより製造することができる。
一般式 （4 ) で示される化合物は、 適当な溶媒に溶解させることができる力 溶媒中においてはそのままで、 或いは下記式 （1 5 ) で表される還元型で、 ある いはその混合物として存在してもよレ、。
Figure imgf000038_0002
力べして得られる本発明の化合物またはその塩は、 例えば、 再結晶、 蒸留、 ク 口マトグラフィーなどの通常の分離手段により単離、 精製することができる。 か くして本発明の化合物が遊離体で得られた場合には、 公知の方法あるいはそれに 準じた方法によって塩に変換することができる。 逆に塩で得られた場合には、 公 知の方法あるいはそれに準じた方法により、 遊離体または他の塩に変換すること ができる。 化合物またはその塩が不斉炭素を有する場合もあるが、 光学活性の混 合物 （ラセミ体） として得られた場合には、 通常の光学分割手段によりそれぞれ の光学活性に分離することができる。
本発明の分化抑制剤の濃度としては、 0 . 1 n g /m 1〜l m g Zm 1の範囲 で使用することが望ましく、 好ましくは 1 0 n g Zm 1〜 1 0 0 μ g /m 1、 さ らに好ましくは l O O n g /m 1〜 1 0 μ g /m 1の範囲で使用することであ る。
また、 本発明の分化抑制剤は STAT3 (signaltransducer and activator of transcription 3)の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合 物、 特にテトラヒドロイソキノリン誘導体を含む。 特定のマウス系統の胚性幹細 胞は、 マウス胎仔由来の線維芽細胞からなるフィーダ一細胞の存在、 非存在にか かわらず、 LIFによって未分化が維持される。 LIFは STAT3の活性化を介して下 流にシグナルを伝えることが知られている（Matsudaら、 EMB0 Journal, 18、 15、 P4261、1999年)。 し力 し、 最近になって STAT3を活性化せずに胚性幹細胞の未分 化を維持する分化抑制因子が存在することが報告されたことから （Dani ら、 Developmental Biology, 203、 pl49、 1998年） 、STAT3 を介さない胚性幹細胞の 未分化維持機構が存在すると考えられている。 さらに、 LIF力 霊長類胚性幹細 胞の未分化維持に効果を示さないことから （Thomsonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995年、 Thomsonら、 Science, 282, pll45, 1998年、 Reubinoff ら、 Nature Biotech, 18, p399, 2000年）、 霊長類胚性幹細胞には、 LIFおよび STAT3 とは異なるシグナルによつて未分化状態を維持する機構が存在することが 示唆される。 本発明の分化抑制剤には STAT3の活性化を介さずに胚性幹細胞の未 分化を維持する低分子化合物が含まれる。 いいかえれば、 LIF とは異なる作用に より胚性幹細胞の未分化を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
最近、 LIFおよび STAT3を介さずに胚性幹細胞の未分化を制御する分子のひと つとして N a n o g遺伝子が同定された（Mitsuiら、 Cell、 113、 p631、 2003年、 Chambers ら、 Cell、 113、 p643、 2003年）。 N a n o g遺伝子は、 マウス、 ヒト でその存在が確認され、 遺伝子破壌により発現を抑制すると、 胚性幹細胞の全能 性は失われ、逆に、 N a n o g遺伝子を強発現させて発現量を増加させると、 LIF 非存在下でも胚性幹細胞の未分化を維持することができる。 従って、 N a n o g 遺伝子の発現量を増加させ得る物質、 例えば低分子化合物は、 胚性幹細胞の未分 化維持、 即ち、 全能性の胚性幹細胞の培養に利用することができる。
また、 N a n o g遺伝子の強発現が STAT3を活性化しないことから、 N a n o g遺伝子は LIFおよび STAT3非依存的に胚性幹細胞の未分化を維持する。 即ち、 N a n o g遺伝子の発現量を増加させ得る物質、 例えば低分子化合物は、 LIFに よる未分化維持の効果が認められなレヽ胚性幹細胞においても、 その培養に用レ、得 ることが示唆される。
本発明の分化抑制剤には N a n o g遺伝子の発現量を増加させる低分子化合 物が含まれる。 即ち、 本発明の分化抑制剤には N a n o g遺伝子の発現量の増加 を介して胚性幹細胞の未分化維持能を発揮する低分子化合物が含まれる。
また、 最近の報告によれば、 ある種の骨髄由来間葉系幹細胞においても胚性幹 細胞と同様に、 マウス由来の幹細胞の培養は LIF依存的であるが、 ヒト由来の幹 細胞は LIF非依存的であることが示されている（Verfaillieら、 Nature, 418, p41, 2002年)。 これは、 多分化能を示す幹細胞は、 胚性幹細胞と同様の未分化維持機 構を有していることを示唆し、 従って、 霊長類幹細胞においても、 胚性幹細胞と 同様に、 LIF - STAT3経路とは異なるシグナルによって未分化が維持されている可 能性が示唆される。 本発明の分化抑制剤には、 STAT3 を介さずに細胞の未分化状 態を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
本発明の分化抑制剤は、 動物細胞培養用基礎培地である任意の哺乳類細胞培養 基本培地に添加して使用することができる。 動物細胞基本培地の例としては、 ダ ルべッコ改変ィ一グル培地： DMEM、 ノックアウト DMEM、 グラスゴー MEM： GMEM、 RPMI1640、 IMDM (以上 I n v i t r o g e n l n v i t r o g e n社製、米国） などが挙げられるがこれらに限定されない。 1つの実施態様としての細胞培地は ダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM) である。 さらにこれらの基礎培地に血清ま たは血清代替物、 各種増殖因子、 サイトカインなど、 細胞増殖や分化制御に関わ る蛋白質を添加して用いることもできる。また、任意の化合物を添カ卩しても良い。 血清は、 幹細胞ならぴに胚性幹細胞の増殖および生存性の維持に効果的である栄 養素を供給する任意の血清、 または、 血清ベースの溶液であり得る。 ごのような 血清の例には、 ゥシ胎仔血清 （FCS)、 ゥシ血清 （CS)、 馬血清 （HS) などがあり、 また、 血清代替物としては当業者に周知のもの、 蛋白質、 アミノ酸、 脂質、 ビタ ミンなどを単独で、 或いは組み合わせて用いることができる。 蛋白質としてはィ ンスリン、 トランスフェリン、 アルブミン、 ぺプトン、 FGF (Fibroblast Growth Factor) , EGF (EpitherialGrowth Factor) などが、 アミノ酸としてはアルギニ ン、 システィン、 グルタミン、 グリシン、 ヒスチジン、イソロイシン、 ロイシン、 リジン、メチォニン、 フエ二ルァラニン、セリン、スレオニン、 トリプトファン、 チロシン、 バリンなどが、 ビタミンとしては、 パントテン酸、 コリン、 葉酸、 ィ ノシトール、 ニコチン酸アミ ド、 リボフラビン、 チアミン、 ピリ ドキシンなどが 例示されるがこれらに限定されない。 1つの実施態様において、 血清はゥシ胎仔 血清である。 より特定の実施態様において、 ゥシ胎仔血清は約 25 %と約 1 %と の間の濃度で提供される。 さらにより特定の実施態様において、 細胞培地でのゥ シ胎仔血清濃度は 15%である。 また、 他の実施態様において、 血清代替物はノッ クァゥト血清リプレースメント ： KSR (I n v i t r o g e n社製、 米国） であ る。 添カ卩し得る細胞増殖因子としては、 肝細胞成長因子 （HGF)、 上皮細胞増 殖因子 （EGF)、 線維芽細胞増殖因子 （FGF)、 インスリン様増殖因子 （I G F)、 神経成長因子 （NGF)、 血小板由来増殖因子 （PDGF)、 血管内皮増殖 因子 （VEGF)、 トランスフォーミング増殖因子 （TGF)、 骨形成因子 （BM P)、 幹細胞因子 （SCF)、 Wn tなどが例示されるがこれらに限定されない。 添加し得るサイトカインとしてはインターロイキン （ I L)、 顆粒球一マクロフ ァージコロニー刺激因子 （GM— CSF) などが例示されるがこれらに限定され ない。 また、 L I F、 ノッチリガンドなどの分化制御因子を添加することもでき る。 また、 添加する化合物は特に限定されないが、 任意の蛋白質に対するァゴニ ストまたはアンタゴニストであってよく、 また、 任意のリン酸化阻害剤であって も良い。 1つの実施態様に於いて、 PD 98059 (C e l l S i g n a l i n g Te c n o l o g y社製） が提供される。 また、 他の実施態様に於いて 6 -ブロモインジルビン- 3ォキシムが提供される。
細胞培地は、 抗酸化剤 （還元剤） （例えば、 ]3—メルカプトエタノール） も含 む。 ある好適な実施態様において、 ]3—メルカプトエタノールは、 約 0. ImMの濃 度を有する。 他の抗酸化剤 （例えば、 モノチォグリセロール、 もしくは、 ジチ ォス レイトール （DTT) の単独もしくは組み合わせ） が同様の効果のために使用 され得る。 さらに他の等価な物質は、 細胞培養の分野の当業者に周知である。 本発明の分化抑制剤ならぴにその有効成分は、 任意の培養基材とともにあるい は培養基材に固定して使用することもできる。 培養基材には多孔質体を使用する ことがでる。多孔質体とは、微細な孔を多数有する基材のことをいい、その材質、 厚さ、 形状、 寸法などは特に限定はない。 多孔質体の材質は、 有機材料、 無機材 料及び有機材料と無機材料からなる複合材料であつても良い。 多孔質体の形状は 平板状、 球状、 棒状、 繊維状、 中空状のいずれの形態であっても良く、 例えば、 フィルム、 シート、 膜、 板、 不織布、 ろ紙、 スポンジ、 織物、 編物、 塊、 糸、 中 空糸、 粒子等が挙げられる。 細胞を培養するにあたって、 3次元的に培養できる ように細胞を支持する孔の大きさを簡単に制御できることや、 基材作製の容易さ 及びコストなどを考慮すると不織布がより好ましい。 多孔質体の孔の大きさにつ いては、 特に限定はないが、 細胞を 3次元的に支持できるようにすることを考慮 すると、 平均孔径が、 0. l m以上 ΙΟΟμιη以下であることが好ましく、 1 m以 上 50 / m以下がさらに好ましレ、。繊維径については特に限定はないが、 0.03デニ ール以下が好ましい。
上記の多孔質体は、細胞の接着性や分化維持機能、増殖能を向上させるために、 高分子化合物により表面コーティング処理を施されていてもよい。 高分子物質と は、 1種以上の繰り返し構成単位の単量体が 1次元、 2次元、 3次元的に連なつ た分子量数百以上の物質のことをいう。 高分子物質は、 大きく天然高分子物質、 半合成高分子物質、 合成高分子物質の 3つに分類することができ、 本発明におい ていずれの高分子物質も使用することができる。
例えば、 天然高分子物質としては、 マイ力 （雲母)、 アスベスト （石綿）、 ダラ ファイト （石墨）、 ダイアモンド、 でんぷん、 セルロ^"ス、 アルギン酸等に代表 される糖類及びゼラチン、 フイブロネクチン、 フイブリノ一ゲン、 ラミニン、 コ ラーゲン等に代表されるタンパク質等が挙げられる。 半合成高分子物質としては、 ガラス、 硝酸セルロース、 酢酸セルロース、 塩酸ゴム、 カルボキシメチルセル口 ース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリホスホニトリルクロライド、 ポリエチレン、 ポリ塩化ビュル、 ポリアミ ド、 ポリエチレンテレフタレート、 ポ リスルホン、 ポリアクリロニトリル、 ポリビエルアルコール、 ポリメチルメタク リレート、 ポリヒドロキシェチルメタタリレート、 ポリジメチルアミノエチルメ タクリレート及ぴヒ ドロキシェチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメ タクリレートの共重合体に代表されるような 2種類以上の合成単量体からなる 共重合体等が挙げられる。
コーティング処理のし易さを考慮すると、 有機高分子物質が好ましく、 タンパ ク質やべプチド並びに有機合成高分子物質がさらに好ましい。 一つの実施態様に 於いて、 培養基材はゼラチンである。 また、 他の実施態様においては、 マトリゲ ノレ （B D B i o s c i e n c e s ±) である。
本発明の分化抑制剤を固定した培養基材を細胞捕捉材として用いることによ り、 複数の異なる細胞からなる集団から、 幹細胞或いは胚性幹細胞を分離し、 か つ、 培養を行える方法及び装置が提供され得る。 即ち、 幹細胞或いは胚性幹細胞 と、 除去対象細胞を含む細胞含有液を本発明の分化抑制剤を固定した、 多孔質体 などの培養基材からなる細胞捕捉材が充填されている容器に導入し、 細胞捕捉材 に幹細胞或いは胚性幹細胞を捕捉させ、 除去対象細胞を容器外に導出した後に容 器ごと培養することを特徴とする幹細胞或いは胚性幹細胞培養方法であり、 また 本発明の分化抑制剤を固定化した培養基材からなる細胞捕捉材を容器に充填し た細胞培養装置であって、 前記細胞捕捉材は細胞培養用担体として使用し得るも のであり、 前記容器は細胞培養に使用し得るものであることを特徴とする細胞培 養装置である。 除去対象細胞とは、 幹細胞或いは胚性幹細胞以外の全ての細胞を いう。 また、 幹細胞或いは胚性幹細胞から分化して、 多分化能を失った細胞もこ れに含まれる。 細胞捕捉材に導入する細胞含有液としては、 幹細胞或いは胚性幹 細胞を含有する細胞液であればいかなるものでもよく、一例として、血液、骨髄、 碎片組織液、 或いは、 幹細胞、 胚性幹細胞の培養液などがあげられる。
本発明は幹細胞ならぴに胚性幹細胞を増殖するための方法に関する。 本発明の 分化抑制剤を用いて増殖させた幹細胞ならぴに胚性幹細胞の培養物を提供する ことができる。
本発明の分化抑制剤を用いて培養される細胞には、 公知の方法おょぴ材料を使 用して入手し得る全ての幹細胞およぴ胚性幹細胞が含まれる。 幹細胞には以下の 公知の方法によって入手し得る幹細胞が一例として挙げられる。 骨髄細胞 （「骨 髄移植ガイド」 H. J.ディーグ、 H. G.タリンゲマン、 G. L.フイリップス著/笠倉新 平訳）、 骨髄幹細胞 (Osawa ら、 Science, 273、 p242- 245、 1996年、 Goodell ら、 J. E. Med. 183、 pl797 - 1806、 1996年、 Verfaillieら、 Nature, 418, p41, 2002年）、 神経幹細胞 (Reynoldsら、 Science, pl707- 1710、 1992年）、組織幹細胞 (Goodell ら、 J. E. Med. 183、 pl797 - 1806、 1996年、 松崎ら、 実験医学、 19、p345- 349、 2001 年、 Blau ら、 Cell、 105、 p829 - 841、 2001 年）、 間葉系幹細胞 （Liechty ら、 NatureMedicine, 6、 1282-1286、2000年。 Pittengerら、 Science, 284、pl43 - 147、 1999年） 。皮膚幹細胞 ·表皮幹細胞 （室田誠逸編、 「再生医学 ·再生治療」 現代化 学増刊 4 1、 東京化学同人)。
また、 培養されるべき胚性幹細胞としては、 以下に示す、 公知の方法おょぴ 材料を使用して入手し得る。マウス胚性幹細胞： Evansら、 Nature, 292, pl54, 1981 年、 ゥシ E S細胞： Schellanderら、 Theriogenology, 31, pl5 - 17， 1989年、豚 ES細 胞： Strojekら、 Theriogenology, 33 :p901， 1990年、羊 ES細胞： Handyside、Roux， s Arch. Dev. Biol. , 196： pl85, 1987 年 、 ハ ム ス タ ー ES 細 胞 ： Doetschman ら， Dev. Biol. , 127、 p224, 1988年、 サル E S細胞： Thomsonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995年、力二クイザル E S細胞： Suemoriら、 Dev. Dyn. 222、 P273, 2001年、ヒト E S細胞： Thomsonら、 Science, 282, pll45, 1998年、 Reubinoff ら、 NatureBiotech, 18， p399, 2000 年、 ヒ ト EG 細胞 ： Gearhart ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, pl3726, 1998年。 また、 マウス胚性幹細胞 (129SV および C57/BL6) は、 大日本製薬より購入できる。
本発明により提供される分化抑制剤は、 全ての幹細胞および胚性幹細胞に用い ることができるが、 哺乳類の幹細胞および胚性幹細胞に用いることが望ましく、 霊長類の幹細胞および Βί性幹細胞に用いることが好ましい。
細胞ならびに胚性幹細胞は、 一旦単離されると、 本発明の分化抑制剤を使用し て未分化な状態で培養され得る。
本発明の分化抑制斉 ljを用いて培養した幹細胞、 好ましくは胚性幹細胞の未分化 程度は幹細胞の細胞膜上に存在するアルカリホスファターゼ （ALP) 活性を測定 することにより確認することができる。 未分化な胚性幹細胞では ALPの活性が維 持され、 分化すると減少することが知られている (Williams ら、 Nature, 336、 p684、 1988年。 Thomsonら、 Science, 282、 pll45,、 1998年。）。 不溶性基質を 用いた染色法、 あるいは水溶性基質を用いた分光学的測定法などによりアル力リ ホスファターゼ （ALP) 活性を検出する方法が挙げられる。
一つの実施態様において、 分光学的測定法により ALP活性を定量することがで きる。 培養ディッシュ上の細胞にパラニトロフエニルホスフェイト （pNPP) のァ ルカリ性溶液を添加する。 細胞膜上に存在する ALPによって pNPPが加水分解さ れ、 パラニトロフエノールが生じる。 生成した溶液の 405nmの吸光度を測定する ことによって、 アルカリホスファターゼ活性を定量することができる。 実施例 1
( 5 ) に記載の方法により、 本発明の分化抑制剤を添加して培養した胚性幹細胞 の ALP活性を測定すると、 分化抑制剤を含まない培地にて培養したコントロール の胚性幹細胞にくらべ有意に高い ALP活性を有していることが示される。 即ち本 発明の分化抑制剤が、 胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確 認される。
他の実施態様において、 ALP染色法により ALP活性を検出することもできる。 培養ディッシュ上の細胞に、 基質としてリン酸エステル塩とジァゾユウム塩を含 む反応溶液を添加する。 細胞膜状に存在するアル力リホスファターゼによりリン 酸エステル塩が加水分解され、 次いでジァゾニゥム塩とカツプリング反応するこ とによりァゾ色素が生じ、 ALP活性部位に色素が沈殿する。 染色されたコロニー 数を計測することにより細胞の ALP活性を定量化することが可能となり、 即ち細 胞の未分化度合いを定量することができる。実施例 1 ( 6 )に記載の方法により、 本発明の分化抑制剤を用いて培養した胚性幹細胞を ALP染色すると、 分化抑制剤 を用いないコントロール細胞に比べ有意に ALP活性が高いことが示され、 即ち本 発明の分化抑制剤が、 胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確 認される。
また、 胚性幹細胞の未分化程度は Oct- 3/4遺伝子の発現量を測定することによ つて確認することができる。 Oct- 3/4遺伝子は P0Uフアミリーに属する転写因子 で、胚性幹細胞、胚性癌細胞（E C細胞）で、未分化状態特異的に発現し（Okamoto ら、 Cell、 60、 p461、1990年）、 胚発生においても未分化細胞系譜においてのみ発 現し （Scholer、 Trends Genet、 7、 p323、 1991年）、 さらに、 Oct - 3/4遺伝子破壊 マウスのホモ個体は胚盤胞期で発生を停止することから未分化状態維持に重要 な機能を有していることが明らかにされている （Nichols ら、 Cell、 95、 p379、 1998年)。 また、 一方、 Oct- 3/4遺伝子の過剰発現は胚性幹細胞の分化を促進す ることが最近明らかにされ （Mwa ら、 Nat . Genet. 24、 p372、2000年）、 Oct- 3/4 の発現量をある一定の範囲に保つことが.未分化状態の維持に重要である。 Oct-3/4遺伝子の発現量を測定する一つの実施態様としては定量的 PCR (ポリメ ラーゼ連鎖反応） 法を用いることができる。
一つの実施態様においてはリアルタイム PCR法が用いられ、 幅広いダイナミッ クレンジをもち、 簡便で信頼性のある定量測定が可能である。 リアルタイム PCR 技術には、 ABIPRISM7700TM (Applied Biosystems)を使用した Taq Manプローブ を用いる方法や、 LightCyclerTM (ロシュ .ダイァグノスティック） を用いた方 法がある。 特に後者の場合は PCRの温度サイクルが数十分で終了する高速反応サ ィクルのもとで、 サイクルごとに合成される DNAの増幅量変化をリアルタイムに 検出できる。 リアルタイム PCR法の DNA検出法としては、 DNA結合色素 （インタ 一力レーター）、 ハイブリダィゼーシヨン♦プローブ （キッシングプローブ）、 TaqManプローブおよぴ Sunriseュニプライマー （モレキュラー ·ビーコン） を利 用する 4種類の方法がある。 また、 DNA結合色素、 例えば SYBR Greenlを利用し て Oct- 3/4遺伝子の発現量を解析することができる。 SYBR Greenlは DNAの二本 鎖特異的に結合色素であり、 二本鎖に結合することで本来の蛍光強度が増強され る。 PCR反応時に SYBR Greenlを加え、 伸張反応の各サイクルの終わりに蛍光強 度を測定すれば、 PCR産物の増加が検出できる。 Oct- 3/4遺伝子を検出するには 通常の PCRと同様に Oct - 3/4遺伝子の配列をもとに、 市販の遺伝子解析ソフトゥ エアなどを用いてプライマーを設計する。 SYBR Greenl は非特異的産物も検出し てしまうため最適なプライマーの設定が必要となる。 設計基準としては、 オリゴ マーの長さ、 配列の塩基組成、 GC含量、 および T m値などに留意が必要である。 多くの場合、 定量 PCRにおいて明らかにすることを目的とするのは、 サンプル 一定量当たりの目的 DNA量である。 このためには最初に反応系に加えたサンプル 量の評価が必要である。 この場合サンプル量を反映するような内部標準となる別 の DNAを目的 DNAとは別に測定し、 最初に反応系に加えたサンプル量を補正する ことができる。 サンプル量を捕正する目的で用いる内部標準には、 通常、 組織に よって発現量に差がないと考えられているハウスキーピング遺伝子を用いるこ とができる。 例えば、 解糖系の主要酵素であるグリセ口アルデヒドリン酸脱水素 酵素（GAPDH)、 細胞骨格の構成成分である ァクチンまたは ァクチン、 リポゾ ームの構成蛋白質である S26などの遺伝子が挙げられる。
Oct- 3/4遺伝子の発現レベルは、 本発明の分化抑制剤に暴露された細胞につい て決定することができる。 分化抑制剤に暴露されていない、 即ち、 胚性幹細胞か ら分化誘導されたコントロール細胞の Oct- 3/4遺伝子発現量にくらべ、 有意に Oct - 3/4遺伝子の発現量を維持させることができる活性を有する化合物が、 胚性 幹細胞の未分化を維持する分化抑制剤であるとみなされる。
最適化された胚性幹細胞の未分化維持培養基材をスタリ一二ングするさらに 他の方法として、 ステージ特異的胚抗原（Stage Specific Embryonic Antigen) (以 後 SSEAと記載)- 1、 SSEA-3、 SSEA-4などの未分化な細胞に特異的に発現する抗原 を検出方法が挙げられる（Smithら、 Nature, 336、 p688、 1988年、 Solterら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A、75、P5565、 1978年、 Kannagiら、 EMBO J. 2、p2355、 1983年）。 一つの実施態様において、 SSEA- 1などの表面抗原は、 同抗原を認識する特異的 抗体 （一次抗体） とインキュベートし、 さらに蛍光標識のようなレポーターと結 合した第二の抗体 （二次抗体） とインキュベートことにより、 標識することがで きる。 この操作により目的の抗原を発現する細胞が、 蛍光性になる。 次いで、 標 識された細胞を標準的な方法、 例えばフローサイトメーターを用いて、 計数、 さ らには分取され得る。 次いで、 標識および非標識細胞の数は、 目的とする培養基 材の効果を決定するために比較され得る。 あるいは、 非標識細胞表面マーカー抗 体に曝露された後、 ELISA (酵素結合免疫吸着アツセィ） 形式において、 その細 胞は、 抗細胞表面抗原抗体 （例えば抗 SSEA-1抗体） に対して特異的な第二の抗 体に曝露され得、 そこから、 所望の表面抗原を発現する細胞の数が、 比色定量的 に、 または蛍光を測定することにより定量され得る。 表面抗原を発現する細胞を 定量するさらに他の方法も、 細胞培養の当業者に周知である。
本発明によって提供される、 幹細胞、 または胚性幹細胞の増殖に対する改善さ れた分化抑制剤、 培養方法および培養液は、 幹細胞または胚性幹細胞が有用であ るすべての技術に対して適用されることが予想される。
本発明の分化抑制剤、 培養方法おょぴ培養液を用いて産生される細胞は、 分化 させ、 細胞移植に用いたり、 人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築に使用 され、 生体内へ移植したり人工臓器として利用されうる。 幹細胞の細胞移植治療 や組織工学への利用は、 ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足な ど、 従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できる。 移植のために 培養された細胞や組織は、 治療のため、 採取した人と同一人に戻す場合と他人に 移植する場合があるが、 本発明の細胞等はいずれにも用いることができる。
本発明の分化抑制剤、 それを用いた培養方法、 それを含む培養液により得られ た、非改変および改変された幹細胞、好ましくは胚性幹細胞の培養物は、幹細胞、 好ましくは胚性幹細胞のモニタリングまたは幹細胞収集を改良する物質につい てスクリーニングするために使用される。 例えば、 推定の幹細胞或いは胚性幹細 胞分化誘導物質は、 上記の方法を用いて増殖させた細胞培養物へ添加され得る。 推定の幹細胞或いは胚性幹細胞分化誘導物質を欠損した対照細胞培養物と比較 して、 三胚葉系列への分化を誘導し得る物質は、 胚性幹細胞分化誘導因子として 同定される。
本発明の分化抑制剤おょぴ Zまたは化合物、 またはその塩は、 優れた幹細胞未 分化維持ならびに増殖能を有することから、 病気または外傷などにより傷害を受 けた組織または器官の治療剤として用いることができる。 対象となる疾患として は、 例えば皮膚関連では、 熱傷、 難治性皮膚潰瘍、 じょくそう、 肥厚性瘢痕、 母 斑、 刺青など、 骨関連では、 骨折、 骨粗しょう症など、 軟骨関連では、 変形性関 節症、 慢性リウマチ、 椎間板ヘルニア、 骨端症、 スポーツ障害など、 神経関連で は、 パーキンソン病、 ハンチントン病、 アルツハイマー病、 外傷による四肢の神 経切断、 頭頸部外科 ·胸部外科に伴う損傷、 顔面神経麻痺、 横隔膜神経損傷、 骨 盤内神経損傷など、 歯関連では歯周病 ·歯槽膿漏による歯槽骨損傷、 無歯症が、 毛髪では男性型脱毛症が、 角膜では先天性異常、 内皮細胞代償不全、 角膜感染に よる混濁、 角膜変性症、 角膜形状異常など、 血管関連では高血圧、 慢性動脈閉塞 症、虚血性心疾患など、心筋では心筋梗塞、膝臓では糖尿病など、肝臓では肝炎、 肝硬変、 肝不全などが挙げられるが、 これらに限定されない。
本発明の分化抑制剤および Zまたは化合物は、 上記の疾患に対して予防および
/または治療剤として、 経口投与または非経口投与のいずれも可能であり、 薬学 的に許容される担体と混合し、 通常、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤など固形 製剤として経口投与されるか、 静脈内、 皮下、 筋肉内などに注射剤、 坐薬若しく は舌下錠などとして非経口投与される。 また、 舌下錠、 マイクロカプセルなどの 徐放製剤として、 舌下、 皮下および筋肉内などに投与してもよい。 一日の投与量 は、 症状の程度；投与対象の年齢、 性別、 体重、 感受性差；投与の時期、 間隔、 医薬製剤の性質、 調剤、 種類；有効成分の種類などによって異なり、 特に限定さ れないが、 通常、 哺乳動物 1 k g体重あたり約 0.01— 100mg、 好ましく は約 0.02〜 20 m g、 更に好ましくは 0. 1〜： L 0mg、 最も好ましくは 0. 5〜10mgを、 通常 1日 1〜4回に分けて投与する。 畜産または水産分野で使 用する場合の投与量も上記に準ずるが、 投与対象生物 1 k g体重あたり約 0. 0 l〜30mg、 好ましくは約 0. l〜10mgを、 通常一日 1〜 3回に分けて投 与する。 本発明の化合物の医薬組成物中の含有量は、 組成物全体の約 0. 01な いし 100重量％である。
上記薬学的に許容される担体としては、 製剤素材として慣用の各種有機あるい は無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤； 液状製剤における溶剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張化剤、 緩衝剤、 無痛化剤な どとして配合される。 また必要に応じて、 防腐剤、 抗酸化剤、 着色剤、 甘味剤な どの製剤添加物を用いることもできる。 上記賦形剤の好適な例としては、 例えば 乳糖、 白糖、 D-マンニトール、 デンプン、 結晶セルロース、 軽質無水ケィ酸な どが挙げられる。 上記滑沢剤の好適な例としては、 例えばステアリン酸マグネシ ゥム、 ステアリン酸カルシウム、 タルク、 コロイドシリカなどが挙げられる。 上 記結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、 白糖、 D-マンニトール、 デキストリン、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセル ロース、 ポリビュルピロリ ドンなどが挙げられる。
上記崩壌剤の好適な例としては、 例えばデンプン、 カルボキシメチルセルロー ス、 カルボキシメチルセルロースカノレシゥム、 クロス力/レメロ一スナトリウム、 カルボキシメチルスターチナトリゥムなどが挙げられる。 上記溶剤の好適な例と しては、 例えば注射用水、 アルコール、 プロピレングリコール、 マクロゴール、 ゴマ油、 トゥモロコシ油などが挙げられる。上記溶解補助剤の好適な例としては、 例えばポリエチレングリコール、 プロピレングリコール、 D-マンニトール、 安 息香酸ベンジル、 エタノール、 トリスァミノメタン、 コレステロール、 トリエタ ノールァミン、 炭酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウムなどが挙げられる。 上記懸 濁化剤の好適な例としては、 例えばステアリルトリエタノールァミン、 ラウリル 硫酸ナトリウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化べンザルコニゥ ム、 塩化べンゼトニゥム、 モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例え ばポリビニノレア/レコール、 ポリビニノレピロリ ドン、 力/レポキシメチルセルロース ナトリウム、 メチルセルロース、 ヒ ドロキシメチノレセルロース、 ヒ ドロキシェチ ルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げら れる。
上記等張化剤の好適な例としては、 例えば塩化ナトリウム、 グリセリン、 D - マンニトールなどが挙げられる。 上記緩衝剤の好適な例としては、 例えばリン酸 塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。 無痛化剤の好 適な例としては、 例えばべンジルアルコールなどが挙げられる。 上記防腐剤の好 適な例としては、 例えばパラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブタノール、 ベ ンジルアルコール、 フヱネチルアルコール、 デヒ ドロ酢酸、 ソルビン酸などが挙 げられる。 上記抗酸化剤の好適な例としては、 例えば亜硫酸塩、 ァスコルビン酸 などが挙げられる。
本発明の分化抑制剤および/または化合物に、 懸濁化剤、 溶解補助剤、 安定化 剤、 等脹化剤、 保存剤などを添加し、 公知の方法により静脈、 皮下、 筋肉内注射 剤とすることができる。 その際必要により公知の方法により凍結乾燥物とするこ とも可能である。 本発明化合物を例えばヒ トに投与する場合は、 それ自体あるい は適宜の薬理学的に許容される担体、 賦形剤、 希釈剤と混合し、 医薬組成物とし て経口的または非経口的に安全に投与することができる。 上記医薬組成物として は、 経口剤 （例、 散剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 錠剤）、 非経口剤 〔例、 注射剤、 点滴 10剤、 外用剤 （例、 経鼻投与製剤、 経皮製剤など）、 坐剤 （例、 直腸坐剤、 膣坐剤など） など〕 が挙げられる。 これらの製剤は、 製剤工程において通常一般 に用いられる自体公知の方法により製造することができる。
本発明の分化抑制剤および/または化合物は分散剤 （例、 ツイーン （Tween) 8 0 (アトラスパウダー社製、 米国、 H C O 6 0 (日光ケミカルズ製） ポリェチ レンダリコール、 カルボキシメチルセルロース、 アルギン酸ナトリウムなど）、 保存剤 （例、 メチルパラベン、 プロピルパラベン、 ベンジルアルコールなど）、 等張化剤 （例、 塩化ナトリウム、 マンニトール、 ソルビトール、 ブドウ糖など） などと共に水性注射剤に、 あるいはォリーブ油、 ゴマ油、 綿実油、 コーン油など の植物油、 プロピレングリコールなどに溶解、 懸濁あるいは乳化して油性注射剤 に成形し、 注射剤とすることができる。 経口剤とするには、 自体公知の方法に従 レ、、本発明の分化抑制剤おょぴ Zまたは化合物を例えば賦形剤（例、乳糖、白糖、 デンプンなど）、 崩壌剤 （例、 デンプン、 炭酸カルシウムなど）、 結合剤 （例、 デ ンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリ ドン、 ヒ ドロキシプロピルセルロースなど） または滑沢剤 （例、 タルク、 ステアリン酸 マグネシウム、 ポリエチレンダリコール 6 0 0 0など) などを添加して圧縮成形 し、 次いで必要により、 味のマスキング、 腸溶性あるいは持続性の目的のため自 体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。 そのコーティング剤としては、 例えばヒ ドロキシプロピルメチルセルロース、 ェ チノレセノレロース、 ヒ ドロキシメチノレセ/レロース、 ヒ ドロキシプロピノレセノレロース、 ポリオキシエチレングリコーノレ、 ツイーン 8 0、 プノレロニック F 6 8、 セノレロー スアセテートフタレート、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、 ヒ ドロキシメチノレセ^/ロースァセテ一トサクシネート、 オイ ドラギッ ト (ローム社 製、 ドイツ， メタアクリル酸 ·アクリル酸共重合） および色素 （例、 ベンガラ、 二酸化チタンなど） などが用いられる。 腸溶性製剤とする場合、 腸溶相と薬剤含 有相との間に両相の分離を目的として、 自体公知の方法により中間相を設けるこ ともできる。
外用剤とするには、 公知の方法に従い、 本発明の分ィヒ抑制剤および Zまたは化 合物を固状、 半固状または液状の外用投与剤とすることができる。 例えば、 上記 固状のものとしては、 本発明化合物をそのまま、 あるいは賦形剤 （例、 グリコー ル、 マンニトール、 デンプン、 微結晶セルロースなど）、 増粘剤 （例、 天然ガム 類、 セルロース誘導体、 アクリル酸重合体など） などを添加、 混合して粉状の組 成物とする。 上記液状のものとしては、 注射剤の場合とほとんど同様に油性また は水性懸濁剤とする。 半固状の場合は、 水性または油性のゲル剤、 あるいは軟膏 状のものがよい。 また、 これらはいずれも、 pH調節剤 （例、 炭酸、 リン酸、 ク ェン酸、 塩酸、 水酸化ナトリウムなど）、 防腐剤 （例、 パラォキシ安息香酸エス テル類、 クロロブタノール、 塩化ベンザルコニゥムなど） などを加えてもよレ、。 例えば坐剤とするには、 自体公知の方法に従い、 本発明化合物を油性または水性 の固状、 半固状あるいは液状の坐剤とすることができる。 上記組成物に用いる油 性基剤としては、 例えば高級脂肪酸のグリセリ ド 〔例、 カカオ脂、 ウイテプゾル 類 （ダイナマイトノーベル社製， ドイツ） など〕、 中級脂肪酸 〔例、 ミグリオ一 ル類 （ダイナマイトノーベル社製， ドイツ） など〕、 あるいは植物油 （例、 ゴマ 油、 大豆油、 綿実油など） などが挙げられる。 また、 水性基剤としては、 例えば ポリエチレングリコール類、 プロピレングリコール、 水性ゲル基剤としては、 例 えば天然ガム類、 セルロース誘導体、 ビニール重合体、 アクリル酸重合体などが 挙げられる。
化合物 （9) 及び （1 0) のプロドラッグとは、 生体内において酵素や胃酸等 による代謝反応により、 幹細胞増殖作用を有する化合物 （9) 及び （1 0) に変 換される化合物をいう。 化合物 （9) 及ぴ （1 0) のプロドラッグとしては、 化 合物 (9) 及び (1 0) がアミノ基を有する場合、 該ァミノ基がァシル化、 アル キル化、 りん酸化された化合物 （例、 化合物 （9) 及ぴ （1 0) のァミノ基がェ ィコサノィル化、 ァラニル化、 ペンチルァミノカルボニル化、 (5-メチル- 2 -ォ キソ- 1， 3-ジォキソレン -4-ィル） メ トキシカルボ二ル化、 テトラヒドロフラ ニル化、 ピロリジルメチル化、 ビバロイルォキシメチル化、 t e r t-ブチル化 された化合物など） ；化合物 （9) 及び （1 0) がカルボキシルを有する場合該 カルボキシルがエステル化、 アミド化された化合物 (例、 化合物 (9) 及び (1 0) のカルボキシルがェチルエステル化、 フエニルエステル化、 カルボキシメチ ルエステル化、 ジメチルァミノメチルエステル化、 ビバロイルォキシメチルエス テル化、 ェトキシカルボニルォキシェチルエステル化、 フタリジルエステル化、
(5—メチル -2—ォキソ -1， 3—ジォキソレン— 4—ィル） メチルエステル化、 シ ク口へキシルォキシカルボニルェチルエステル化、 メチルアミ ド化された化合物 など） ；等が挙げられる。 これらの化合物は公知の方法によって製造することが できる。 また、 化合物 （9) 及び （10) のプロドラッグは、 広川書店 1990 年刊 「医薬品の開発」 第 7巻分子設計 163頁から 1 98頁に記載されているよ うな、 生理的条件で化合物 （9) 及ぴ （10) に変化するものであってもよレ、。 化合物 （9) 及び （10) のプロドラッグはそれ自身であっても、 薬理学的に 許容される塩であってもよい。 このような塩としては、 化合物 （9) 及ぴ（10) のプロドラッグが力ルポキシル等の酸性基を有する場合、 無機塩基 （例、 ナトリ ゥム、 力リゥム等のアルカリ金属、 カルシウム、 マグネシウム等のアルカリ土類 金属、 亜鉛、 鉄、 銅等の遷移金属等） や有機塩基 （例、 トリメチルァミン、 トリ ェチルアミン、 ピリジン、 ピコリン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノー/レアミン、 ジシク口へキシルァミン、 N, N， -ジベンジルェチレ ンジァミンなどの有機アミン類、 アルギニン、 リジン、 オル二チンなどの塩基性 アミノ酸類等） などとの塩が挙げられる。 化合物 （9) 及ぴ （10) のプロドラ ッグがァミノ基等の塩基性基を有する場合、 無機酸や有機酸 （例、 塩酸、 硝酸、 硫酸、 燐酸、 炭酸、 重炭酸、 ギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 トリフルォロ酢酸、 フ マール酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メ タンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 p-トルエンスルホン酸等）、 ァスパラギ ン酸、グルタミン酸などの酸性ァミノ酸等との塩が挙げられる。また、化合物（ 9 ) 及び （10) のプロドラッグは水和物およぴ非水和物のいずれであってもよレ、。 化合物 （9) 及ぴ （10) は分子内に 1もしくは 2箇所幾何異性体 （シス-トラ ンス異性体） を生じる場合があるが、 任意の比率でシス体、 トランス体を有する 化合物も本発明に包含される。 化合物（10)は分子内に 1ないしそれより多い不 斉炭素を有する場合があるが、 これら不斉炭素に関し R配置、 S配置のいずれも 本発明に包含される。 化合物 （9) 及び （10) は同位元素 （例、 3 H、 14 C) などで標識されていてもよレ、。
化合物（9)及び（10) のプロドラッグとしては、多糖（例：デキストラン、 プルラン、 マンナシ、 キチン、 キトサンなど） に化合物 （9) 及び （10) がァ ミノ基、 カルボキシル基、 水酸基などを反応点として結合したものでも良い。 ま た、 化合物 （9) 及ぴ （10) がシクロデキストリン （ひ体、 /3体、 γ体などが あるが、 好ましくは j3体または Υ体） などに包摂された複合体でもよい。 実施例
次に本発明を具体化した実施例を示す。 この実施例は、 本発明を実施する当業 者を補助するために提供される。 これらの実施例は、 いかなる様式においても、 決して本発明の範囲を制限するものではない。 また、 本発明の範囲を逸脱しない 範囲で変化させてもよい。以下の実施例に記載の「室温」は 0ないし 30°Cを示す。 「％」 は特記しない限り重量パーセントを意味する。 実施例 1
(1) マウス ES細胞培地の作製
E S細胞を増殖させる目的で、 Dulbecco' sModif ied Eagle Medium (以下
DMEM) (I n v i t r o g e n社製 11995)に、 以下に示す最終濃度で因子を添加 して E S細胞培地を調製した。 15% ゥシ胎仔血清（ I n V i t r o g e n社製） もしくは 15%ノックァゥト血清リプレースメント ： KSR (I n v i t r o g e n 社製） 、 0. IraM J3—メルカプトエタノール (SIGMA社製）、 I X非必須アミノ酸ス トツク（I nv i t r o g e n社製 11140- 050)、2raM L-Glutamine ( I n v i t r o g e n社製 25030-081)、 103unit/ml ESGR0(CHEMIC0N International Inc. ,社 製)。
ただし、 ESGR0はマウス LIFを有効成分として含有する。 ES細胞分化抑制ァ ッセィ用の培地として、 上記の E S細胞培地から ESGR0を除いたアツセィ培地を 作製した。
(2) マウス ES細胞の培養
直径 6cmの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に 0.1%の濃度で Gelatin (SIGMA社 製 TypeA:from porcinESkin、G2500)を溶解し、 滅菌した 0.1%ゼラチン水溶液 5ml を添加し、 37°Cで 30分以上静置した。 ゼラチン水溶液を除いて、 マイトマイシ ン C (協和発酵社製） 処理したマウス胚性初代培養細胞 （ I n V i t r o g e n 社製 YE 9284400) 2X106個を播種し、 10%ゥシ胎仔血清（ I n v i t r o g e n社製）を含む DMEM5mlで、 37。 (：、 5%C02インキュベーター （タパイエスぺ ック社製）で 5時間以上培養した。マウス胚性幹細胞株 D3 E S細胞（Rolf Kemler, Max Planck Institut fur Immunbiologie Stuneweg5 D-79108Freiburg Germany Λ より入手可能） を、 直径 6cm繊維芽細胞フィーダ一層上に播種し、 5mlの ES培 地で、 37°C、 5% C02インキュベーターで 2日間培養して増殖させた。
(3) マウス ES細胞の調製
前記の （2) £3細胞の培養の方法に従って培養した03£3細胞を？83で 2回洗浄後、 0. 25¾トリプシン溶液（ I n V i t r o g e n社製 15090 —046)を加え、 3 7 °Cで 5分間インキュベートし、 未分化の D3ES細胞の コロニーをフィーダ一から脱離させた。 5m 1の E S細胞培地を添カ卩し、 小径ピ ペットを使用して細胞コロニーを分散させ、 50m 1の滅菌チューブに移し、 卓 上遠心機 （トミー精ェ） で 1000 r pm、 約 5分間遠心してペレツト化した。 上清を除き、 細胞を 2 Om 1の新鮮な ES細胞培地に再懸濁し、 0. 1%のゼラ チン水溶液で予めコートした直径 15 c mの細胞培養用デイツシュに播種し、 3 7°Cで 20分間ィンキュベートした。 20分後、 浮遊細胞を含む培地をピぺット で回収し、 再度、 0. 1 %のゼラチン水溶液でコートした直径 1 5 c mの細胞培 養用ディッシュに播種し、 37°Cで 20分間ィンキュベートした。 浮遊細胞を含 む培地を 50mlの滅菌チューブに移し、 卓上遠心機で 1000 r p m、 約 5分 間遠心後、 上清を除き、 5mlの ES細胞アツセィ培地に再懸濁して ES細胞を 得た。
(4) ES細胞分化抑制剤ァッセィ 1
前記の （3) マウス E S細胞の調製で得た D 3 E S細胞を、予め 0.1%のゼラチ ン水溶液でコートした 96穴細胞培養用デイツシュ （FALCON社製 Cat. No.3072、 米国） に、 1ゥエルあたり 3X102〜1 X103個の細胞を、 1 ゥエル当たりの ES 細胞アツセィ培地が 90^1になるように播種した。 各ゥエルに 0.4〜40^§/ιη1と なるようにジメチルスルフォキシド （DMS0)、 または水、 或いはその混合物に溶 解した本発明の分化抑制剤 （A, B, C, D, E, F： A〜Dは ASINEX社 （ロシア）、 E〜 F は PHARMEKS社 （ロシア） から購入）、 あるいは ESGR0を 10 1添カ卩し、 37で、 5% C02インキュベーターで 7 日間培養した。 DMS0 の培地中への持ち込は最終濃度 0.1%以下となるようにした。 またコントロールゥエルには、 DMS0のみを最終濃 度で 0.1%となるように加えた。 化合物 Aの構造を図 1に、 化合物 B〜Fの構造 を図 2に示した。
(5) アルカリホスファターゼ定量 1
E S細胞のアル力リホスファターゼ活性を、 p- NITR0PHENYLPH0SPHATE SOLUTION (MOSS Inc.社製、 PRODUCTNO. NPPD- 1000、米国、または SIGMA社製、 A- 3469、 米国製）（以下、 p - NPP)を用いて定量した。
前記の （4) ES細胞分ィヒ抑制剤アツセィ 1に記載の方法で 7日間培養した E S細胞の各ゥエルから培地を吸引除去し、 その細胞を 100/xl のリン酸緩衝化生 理食塩水 （PBS) で 1回洗浄後、 P- ΝΡΡΙΟΟμ 1を各ゥエルに加え、室温で 10分間静 置した。各ゥエルに 12.5μ1 の 8 Μ水酸化ナトリウム溶液を添加し、 反応を停止 させた。 溶液の 405nmの吸光度（0. D.405)と 690nmの吸光度（0. D.690)を吸光度計 (Molecular Devices社製、型式： SPECTRA MAX190)により測定し、 0. D.405-0. D.690 で算出される値をアル力リホスファターゼ活性とした。 定量結果をダラフ化した ものを図 3に示した。
本発明の分化抑制剤、化合物 A〜Fはコント口ールである DMS0 (0. 1%)に比べて 有意にアルカリホスファターゼ活性を増幅させた。 即ち、 本発明の分化抑制剤は 未分化な E S細胞の培養を支持したことがわかる。
( 6 ) アルカリホスファターゼ染色 1
E S細胞をアルカ リ ホスファタ一ゼキッ ト （SIGMADiagnostic 社製 Cat. No. 86- R)を用いて染色した。 前記の （4 ) E S細胞分化抑制アツセィ 1に記 載の方法で培養した E S細胞の各ゥヱルから培地を吸引除去し、 その細胞を 2ml のリン酸緩衝化生理食塩水 （PBS) で 1回洗浄後、 2ml の細胞固定液 (25ml タエ ン酸溶液（SIGMA社製 Cat. No. 91-5)、 65mlアセトン、 8ml 37%ホルムアルデヒ ド） を各穴に加え、 室温で 30秒静置する。
固定液を吸引除去し、 2mlの脱イオン水を各穴に加えて 45秒室温で静置する。 脱イオン水を吸引除去し、 ついでアルカリホスファターゼ染色液 （1ml亜硝酸 ナトリゥム溶液、 lml ファーストレツドバイオレツト LBソルト溶液、 lmlナフト ール AS- BIアル力リ溶液、 45ml蒸留水） を 1ゥヱルあたり 2ml加え 15分間室温 で静置後、 染色液を吸引除去し、 脱イオン水 2mlで洗浄した。 ネガティブコント 口ールである ESGR0非存在下で培養した E S細胞、 ポジテイブコント口ールであ る、 ESGRO (1000ュニット /ml)存在下で培養した E S細胞、 そして、 本発明の分化 抑制剤である化合物 B (4 g/ml) 存在下で培養した E S細胞の染色像を比較した
(図 4参照）。 化合物 B存在下で培養した E S細胞は、 ESGR0非存在下で培養した E S細胞に比べ、 有意に濃く染色されており、 高いアルカリホスファターゼ活性 を有していることが示された。 さらに、 本発明の分化抑制剤は、 ポジティブコン トロールである ESGR0存在下で培養した E S細胞と同等の未分化コロニーを形成 させることもできた。 すなわち、 本発明の分化抑制剤は、 E S細胞の未分化状態 での増殖を強く支持したことがわかる。 なお、 化合物 A、 C〜Fについても、 化合物 Bと同様に染色された。
( 7 ) STAT3活性化アツセィ 1
実施例 1の （3 ) マウス E S細胞の調製に記載の方法に従って調製した D 3 E S細胞を、予め 0. 1%のゼラチン水溶液でコートした 24穴細胞培養用ディッシュ (FALCON Cat. No. 3047、米国）に、 1ゥエルあたり 1 X 105個の細胞を、 1 ゥエル当 たりの E S細胞培地が 500 μ 1 になるように播種し、 37°C、 5% C02ィンキュベー ターで 12時間〜 24時間培養した。 次に、 LipofectAMINE 2000 ( I n v i t r o g e n社製、 米国）を用いて、 添付のプロトコールに従って、 PSTAT3- TA- Luc、 ま たは pTA- Lucベクター （C 1 o n t e c h社製、 米国） を 1ゥエルあたり 0. 9 /x g を E S細胞にトランスフエクションした。また、内部コントロールとして、 pRL - TK ベクター （P r o m e g a社製、 米国） を各ゥエル 0. l /z g、 同時にトランスフエ クシヨンした。 37°C、 5 % C02インキュベーターで 4時間培養後、培地を吸引し、 PBSで 2回洗浄したのち、 E Sアツセィ培地を各ゥエル 500 μ 1ずつ加えた。 次い で、 各ゥエルに 0. 4〜40 μ g/mlとなるようにジメチルスルフォキシド (DMS0) ま たは水或いはその混合物に溶解した分化抑制剤、 あるいは 10〜： L0，000unit/mlと なるように ESアツセィ培地で希釈した ESGR0を 50 1添加し 37°C、 5% CO 2イン キュベータ一で 6〜24時間培養した。 続いて、 ピツカジーンデュアル ·シ一パン ジー （東洋インキ製造社製、 日本） を用いて、 添付のプロトコールに従って、 各 細胞のルシフェラーゼ 'レポーター酵素による発光シグナルを測定した。 図 5に 示すように、 ESGR0が容量依存的に PSTAT3- TA- Lucによるレポーター酵素の発現 を亢進させたのに対し、 本発明の化合物 Bは、 レポーター酵素の発現を誘導しな かった。
また、 化合物 A、 C〜Fについても同様の実験を行うことにより、 レポーター酵 素の発現の有無を確認することができる。 実施例 2 ( 1 ) ES細胞分化抑制ァッセィ 2
実施例 1の （3) マウス ES細胞の調製に記載の方法に従って調製した D 3 E S細胞を、 予め 0.1%のゼラチン水溶液でコートした直径 1 Ocm の細胞培養用デ ィッシュに 8X104個の細胞を、 E S細胞アツセィ培地が 10mlになるように播種 した。 各ディッシュに 40 μ g/ml となるようにジメチルスルフォキシド （DMS0)、 または培地、 或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤 （A〜F)、 あるい は 104 u n i t s /mlに調製した ESGROを 1ml添加し、 37°C、 5% C02ィンキュベ 一ターで 7日間培養した。 DMS0の培地中への持ち込は最終濃度 0.1%以下となる よつにした。
(2) RNAの単離 1
前記の （1) ES 細胞分化抑制アツセィ 2に示す方法で培養した ES 細胞から IS0GEN (株式会社二ツボンジーン社製、 日本） を用い、 添付の方法に従ってトー タル RNAを抽出した。 即ち、 培養後のディッシュから培地を除去し、 PBSlOmlで 二回洗浄し、 ISOGENE lml に溶解した。 室温で 5分間静置した後、 1.5ml のエツ ペンドルフチューブに回収した。 クロ口ホルム （和光純薬） を 0.2ml加え、 15秒 間振とうし、 2〜3分間室温で静置した。微量遠心機（トミー精ェ）で 4°C、 10000 r 111で15分間遠心した。 上清 400μ 1を新しい 1.5mlのエツペンドルフチュ ーブに移し、 500μ 1のイソプロパノール （和光純薬） を加え、 室温で 10分間静 置後、微量遠心機にて 4°C、 10000 r p mで 10分間遠心した。 上清を除去後、 70% エタノール水溶液を lml加え、振とうした後、微量遠心機にて 4°C、 10000 r p m、 約 5分間遠心した。 上澄みを除去して沈殿を乾燥させた後、 30μ1の蒸留水に溶 解させ、 トータル RNA溶液を得た。
このようにして得られたトータル RNAの 2 μ g を铸型に、 D e o X y r i b o nu c l e a s e l (Amp l i f i c a t i o n Gr a d e) I n v ι t r o g e n社製）、 Oligo(dT) 12-18 プライマー（I n v i t r o g e n社製 18418 - 012)、 ォムニスクリプトリバーストランスクリプターゼ （Q I AGEN社 製） を用い添付のプロトコールに従って cDNAを合成した。 即ち、 トータル RN A2 ju gに Ι μ ΐの l O XDN a s e l R e a c t i o n B u f f eRl ju l の 1 0 XDN a s e I (以上 I n v i t r o g e n社製） と蒸留水を加えて 1 0 μ 1となるようにした反応液を作製し、 室温で 1 0分間インキュベートした。 2 5mM EDTA溶液を 1 μ 1加えて、 6 5°Cで 1 0分間加熱した。 室温に戻し た後、 2 μ 1の 1 0 X B u f f e r RT、 2 μ 1の 5 mM d NT P M i x, 2 μ 1の 01igo(dT)12- 18 プライマー、 0. 2 5 μ 1の RN a s e OUT ( I n v i t r o g e n社製、 1 0 7 7 7— 0 1 9)、 Ι μ ΐの Omn i s c r i p t R e v e r s e T r a n s c r i p t a s eを加え、 RN a s eフリ一精製水 で全量 20 μ 1に合わせ、 3 7°Cで 6 0分間インキュベートして、 c DNA溶液 を得た。 このようにして得た合成 c DNAの一部を蒸留水で 5倍に希釈し、 その 2 μΐを铸型として、ライトサイクラ一ファーストスタート DNA マスター SYBRグ リーン I キット （ロシュ 'ダイァグノスティック社製） を用い添付のプロトコ一 ルに従って PCR を行った。 Oct- 3/4遺伝子、並びに内部標準としてグリセ口アル デヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ （GAPDH) 遺伝子の発現量を測定した。 Oct - 3/4 遺伝子の増幅には、 センスプライマー 0CT3 up (配列表配列番号 1)、 およびアン チセンスプライマー 0ct3 down (配列表配列番号 2)を用い、 GAPDH遺伝子の増幅 には、 センスプライマー GAPDH up (配列表配列番号 3)、 およびアンチセンスプ ライマー GAPDH down (配列表配列番号 4) を用いた。 PCR反応液の組成と反応条 件を以下にそれぞれ示す。
Oct- 3/4遺伝子定量 PCR反応液組成
25mM MgCl2 Ι.βμ ΐ
5 μΜ センスプライマー Ι.ΟμΙ
5 Μ アンチセンスプライマー 1.0 μ ΐ
c DNA (5倍希釈） 2.0μ1
LightCycler-FastStartDNAMaster 2.0 μ ΐ
ϋ。Ο 12.4
計
ο
Oct- 3/4遺伝子定量 PCR反応条件 ο プログラム サイクル数 区分 温度 時間 温度変化速度
CO (sec) (。し/ sec. 変 性 1 1 95 600 20 増 幅 45 1 95 15 20
2 55 10 20
3 72 20 20
融解曲線解析 1 1 95 0 20
2 65 10 1
3 96 0 0.1 本発明の分化抑制剤 （B， D, F) 存在下で培養した ES細胞の O c t— SZ 4遺伝子の発現は、 分化抑制剤を含まない培地にて培養した ES細胞に比べ有意 に亢進しており、 ESGR01, 000ュニット/ m 1と同等の O c t— 3Z4遺伝子 発現維持効果が認められた （図 6)。 即ち、 本発明の分化抑制剤 （B， D, F) は、 ES細胞の未分化を維持することが O c t— 3/4遺伝子の発現量から確認 された。 以上の結果から、 本発明の分化抑制剤、 化合物 B， D， Fが ES細胞の 未分化状態を維持することが O c t— 3/4遺伝子の発現量からも示された。 また、 分化抑制剤 A， C, Eについても同様の検討を行ったところ、 分化抑制 剤 （B, D, F) と同様に O c t— 3/4遺伝子の発現を維持した。 即ち、 ES細 胞の未分化を維持した。
(3) ES細胞分化抑制アツセィ 3
実施例 1の （3) マウス ES細胞の調製に記載の方法に従って調製した D 3 E S細胞を、 予め 0.1%のゼラチン水溶液でコートした直径 10cmの細胞培養用ディ ッシュに 7.85X105個の細胞を、 ES細胞アツセィ培地が 10mlになるように播種 した。各ディッシュには、本発明の分化抑制剤 Bを最終濃度 4μ g/mlで、或いは、 ESGR0を最終濃度 lX103unit/mlで培地に添加し、 37°C、 5%C02ィンキュベータ一 で 1日培養した。
(4) R Aの単離 2
前記（ 3 ) ES細胞分化抑制アツセィ 3に示す方法で培養した ES細胞から IS0GEN (株式会社二ツボンジーン社製、 日本)を用い、添付の方法に従ってトータル RNA を抽出した。 即ち、 細胞を 15ml の滅菌チューブに回収し、 卓上遠心機 （トミー 精ェ） で l,000rpm、 約 5分間遠心してペレット化した。 上清を除き、 PBS 10ml で 2回洗浄後、 1.5ml のエツペンドルフチューブに移した。 ISOGENE lml に溶解 し、 室温で 5分間静置した後、 クロ口ホルム （和光純薬） を 0.2ml加え、 15秒間 振とうし、 2〜3分間室温で静置した。微量遠心機 （トミー精ェ） で 4° ( 、 10, 000 r pmで 1 5分間遠心した。 上清 400μ 1を新しい 1.5mlのエツペンドルフチュ ーブに移し、 500μ 1のイソプロパノール （和光純薬） を加え、 室温で 10分間静 置後、 微量遠心機にて 4°C、 10, 000 r pmで 10分間遠心した。 上清を除去後、 70%エタノール水溶液を 1ml加え、 振とうした後、 微量遠心機にて 4°C、 10, 000 r pm、 約 5分間遠心した。 上澄みを除去して沈殿を乾燥させた後、 30μ1の蒸 留水に溶解させ、 トータル RNA溶液を得た。
このようにして得られたトータル RNAの 2 μ gを铸型に、 D e o x y r i b o nu c l e a s e l 、 Amp l i f i c a t i o n G r a d e) ( I n v i t r o g e n社製)、 Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR
( I n v i t r o g e n社製， 18080-051) を用い添付のプロトコールに従って cDNAを合成した。 即ち、 2 /Z gのトータル RNAに 1 μ ΐの l O XDNa s e l R e a c t i o n B u f f e r、 1 /z lの l O XDNa s e l (以上 I n v i t r o g e n社） を加え、 蒸留水で 1 0 μ 1となるようにした反応液を作製し、 室温で 1 0分間インキュベートした。 1 1の251111^ EDTA溶液を加えて、 6 5でで 1 0分間加熱し、 室温に戻した後、 反応液を 8 μ 1とり、 1 μ 1の 50mM Oligo (dT) 20プライマー、 l；^ lの1 0mM dNTP M i xを加え、 65^で 5分間インキュベートした。氷中に 1分間置いた後、 2 μ 1の 1 0 XRT B u f f e r s 4 μ 1の 25mM Mg C 12、 2 μ 1の 0. 1M DTT、 1 μ 1の RN a s e OUT ( I n v i t r o g e n社製）、 そして、 1 μ 1の Superscript III RTを加えて 50°Cで 50分間インキュベートした。 続いて 8 5 °Cで 5分間イン キュペートした後、 氷中に 1分間置いた。 1 μ 1の RNa s e Hを加え、 3 7 °C で 20分間ィンキュベートして c DNAを得た。 このようにして得た合成 c DN Aの一部を蒸留水で 5倍に希釈し、 その 2 1 を铸型として、 ライトサイクラ一 ファーストスタート DNA マスター SYBRグリーン I キット （ロシュ ·ダイァグノ スティック社製） を用い添付のプロトコールに従って PCR を行った。 Na n o g 遺伝子、 並びに内部標準としてグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ
(GAPDH) 遺伝子の発現量を測定した。 N a n o g遺伝子の増幅には、 センスプ ライマ^" Na n o g— up (配列表配列番号 5)、 およびアンチセンスプライマー N a n o g— down (配列表配列番号 6)を用い、 GAPDH遺伝子の増幅には、 センスプ ライマー GAPDH up (配列表配列番号 3)、 およびアンチセンスプライマー GAPDH down (配列表配列番号 4) を用いた。 PCR反応液の組成、 及ぴ反応条件を以下に 示す。
_N a n o g_遺伝チ定量上 CR反応液組成
25mM MgCl2 2Λμ1
5 μΜ センスプライマー Ι.ΟμΙ
5 μΜアンチセンスプライマー Ι.ΟμΙ
c DNA (5倍希釈） 2.0μ1
LightCycler-FastStartDNAMasteR 2.0 μ 1
Η.Ο 11.6^1
計 20.0 1
Na n o g遺伝子定量 PCR反応条件 ステップ プログラム サイクル数 区分 温度 時間 温度変化速度
(°C) (sec) (。し/ sec)
1 変 性 1 1 95 600 20
2 増 幅 45 1 95 15 20
2 58 10 20
3 72 20 20
3 融解曲線解析 1 1 95 0 20
2 65 10 1
3 96 0 0.1 本発明の分化抑制剤 B存在下で培養した E S細胞の N a n o g遺伝子の発現 量は、 分化抑制剤を含まない培地、 ならびに、 ESGRO 1， 000ュニット Z m 1を含む培地にて培養した ES細胞に比べ有意に増加していた （図 7)。 即ち、 本発明の分化抑制剤 Bは、 E S細胞の未分化を維持する効果を有することが N a n o g遺伝子の発現量から確認された。
また、 分化抑制剤 A, C, D, E, Fについても同様の検討を行ったところ、 分化抑制剤 Bと同様に N a n o g遺伝子の発現量を増加させた。 即ち、 ES細胞の 未分化を維持する活性を有することが明らかになった。
(5) SSEA- 1抗原の発現量評価 1
前記の （ 1 ) ES細胞分化抑制ァッセィ 2で培養した細胞を PBSで 2回洗浄し、 セルスクレイパーで細胞をディッシュから脱離した。細胞数が 6X105個になるよ うに 2%FBSを含む Hanks balanced salt solution (HBSS, I n v i t r o g e n 社製）を 300 μ 1加えた。 HBSSで 50倍希釈した MX- SSEA- 1抗体 （Kyowa Medex社 製） を 30 μ 1加え 40分間、 氷上で静置した。 HBSS (lml)で 2回洗浄後、 HBSS (300 μ 1)に再分散し、 HBSSで 20倍に希釈した FITC- Goat anti Mouse IgM抗体 （ZYMED 社製）を 30 1加え 30分間、遮光して氷上で静置した。 HBSS (lml)で 2回洗浄後、 HBSS (lml)に再分散し、 20/ g/ml PI溶液 (Dojindo社製）を 100μ 1加え、 フロー サイトメーター測定に用いるサンプルを得た。 またフローサイトメーター測定に 用いるサンプルは、 凝集塊を除く目的で孔径 100 μιηのナイロン ·メッシュに通 した後に測定を行った。 フローサイトメータ一は FACSCalibur(BECT0N DICKINSON 社製）を用い、 測定条件データ収集解析ソフトウェアは CELLQuest (BECT0N DICKINSON社製）を用いた。結果を図 8に示した。各分化抑制剤を添加して培養し た細胞の、 1細胞あたりの平均蛍光強度、 即ち、 1細胞あたりの SSEA- 1抗原発現 強度は、分化抑制剤を含まない培地で培養した細胞に比べ、有意に亢進していた。 また、 化合物 A， C, Eについて同様の実験をしたところ、 同様に SSEA - 1 の発 現レベルが有意に高いことを示した。 即ち、本発明の分化抑制剤は、未分化な ES 細胞を維持することが明らかになった 実施例 3
インドール誘導体 a〜oについても同様の実験をし、 以下の結果を得た。
( 1 ) E S細胞分化抑制アツセィ 4
実施例 1の （3 ) マウス E S細胞の調製に記載の方法に従って調製した D 3 E S細胞を、 予め 0. 1%のゼラチン水溶液でコートした 96穴細胞培養用デイツシュ (FALCON社製 Cat. No. 3072、 米国） に、 1ゥヱルあたり 3200個の細胞を、 1ゥ エル当たりの E S細胞アツセィ培地が 100 1 になるように播種した。 各ゥエル に 0. 4〜40 μ g/ml となるようにジメチルスルフォキシド （DMS0)、 または水、 或 いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（ a〜 o： a、 j〜mは IF LAB Ltd. 社、 ウクライナ、 b、 c、 f 、 nは PHARMEKS社、 ロシア、 d、 e、 oは SPECS 社、オランダ、 g〜 iは C H EMB R I D G E社、米国から購入）、あるいは ESGRO を 10 μ 1添加し、 37°C、 5% CO 2インキュベーターで 4日間培養した。 DMS0の培地 中への持ち込は最終濃度 0. 1%以下となるようにした。 またコントロールゥエル には、 DMS0のみを最終濃度で 0. 1%となるように加えた。 分化抑制剤 a〜 oの構 造を図 9に示した。
( 2 ) アル力リホスファターゼ定量 2
E S細胞のアル力リホスファターゼ活性を、 p- NITR0PHENYLPH0SPHATE SOLUTION (MOSS Inc.社製、 PRODUCTNO. NPPD- 1000、米国、または SIGMA社製、 A - 3469、 米国製）（以下、 p- PP)を用いて定量した。 前記の （1 ) E S細胞分化抑制アツセ ィ 4に記載の方法で 4 日間培養した E S細胞の各ゥエルから培地を吸引除去し、 その細胞を 100 μ 1のリン酸緩衝化生理食塩水 （PBS) で 1回洗浄後、 Ρ- ΡΡΙΟΟ μ 1を各ゥヱルに加え、室温で 10分間静置した。各ゥエルに 12. 5 μ 1の 8 Μ水酸化ナ トリウム溶液を添カ卩し、 反応を停止させた。 溶液の 405nmの吸光度 (0. D. 405)と 690nm の吸光度（0. D. 690)を吸光度計（MolecularDevices 社製、 型式： SPECTRA MAX190)により測定し、 O.D.405-0. D.690で算出される値をアル力リホスファタ一 ゼ活性とした。 定量結果をグラフしたものを図 10に示した。 本発明の分化抑制 剤、化合物 a〜 oはコントロールである DMSO(0.1%)に比べて有意にアル力リホス ファターゼ活性を増幅させた。 即ち、 本発明の分化抑制剤は未分化な ES細胞の 培養を支持した。
(3) ES細胞分化抑制アツセィ 5
実施例 1の （3) マウス ES細胞の調製に記載の方法に従って調製した D 3 E S細胞を、 予め 0.1°/。のゼラチン水溶液でコートした直径 1 Ocmの細胞培養用デ イツシュに 8X104個の細胞を、 ES細胞アツセィ培地が 10mlになるように播種 した。 各ディッシュに 40 ^/πι1 となるようにジメチルスルフォキシド （DMS0)、 または培地、 或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤 （a〜o)、 ある レヽは ESGR0を 1ml添加し、 37°C、 5% C02インキュベーターで 4日間培養した。 DMS0 の培地中への持ち込は最終濃度 0.1%以下となるようにした。
(4) SSEA- 1抗原の発現量評価 2
前記の（ 3 ) E S細胞分化抑制ァッセィ 5で培養した細胞を PBSで 2回洗浄し、 セルスクレイパーで細胞をディッシュから脱離した。細胞数が 6X105個になるよ うに 2%FBSを含む Hanks balanced salt solution (HBSS、 I n v i t r o g e n 社製）を 300 1カ卩えた。 HBSSで 50倍希釈した MX- SSEA- 1抗体 （Kyowa Medex社 製） を 30μ1加え 40分間、 氷上で静置した。 HBSS (lml)で二回洗浄後、 HBSS (300 /il)に再分散し、 HBSSで 20倍 FITC-Goat anti Mouse IgM抗体 （ZYMED社製） を 30 μ 1加え 30分間、遮光して氷上で静置した。 HBSS (lml)で二回洗浄後、 HBSS (lml) に再分散し、 20//g/ml PI溶液（Dojindo社製）を ΙΟΟμΙ加え、 フローサイトメ一 ター測定に用いるサンプルを得た。 またフローサイトメーター測定に用いるサン プルは、 凝集塊を除く目的で孔径 100 μπιのナイロン ·メッシュに通した後に測 定を行った。 フローサイトメータ一は FACSCalibur(BECT0N DICKINSON社製、 米 国）を用い、測定条件データ収集解析ソフトウェアは CELLQuest (BECTON DICKINSON 社製、 米国）を用いた。 結果を図 1 1に示した。 各分化抑制剤を添加して培養し た細胞の、 1細胞あたりの平均蛍光強度、即ち、 1細胞あたりの SSEA- 1抗原発現 強度は、分化抑制剤を含まない培地で培養した細胞に比べ、有意に亢進していた。 また、 化合物 b〜oについて同様の実験をしたところ、 同様に SSEA- 1 の発現レ ベルが有意に高いことを示した。 即ち、 本発明の分化抑制剤は、 未分化な ES細 胞を維持することが明らかになつた。
( 5 ) STAT3活性化ァッセィ 2
実施例 1の （3 ) E S細胞の調製に記載の方法に従って調製した D 3 E S細胞 を、予め 0. 1 %のゼラチン水溶液でコートした 24穴細胞培養用デイツシュ（FALCON Cat. No. 3047、米国）に、 1ゥエルあたり 1 X 1 0 5個の細胞を、 1 ゥエル当たりの E S細胞培地が 500 1 になるように播種し、 37 、 5% C02インキュベーターで 12 時間〜 24時間培養した。 次ぎに、 LipofectAMINE 2000 ( I n v i t r o g e n社製、 米国）を用いて、 添付のプロトコールに従って、 PSTAT3-TA- Luc、 または pTA- Lucベクター （C 1 o n t e c h社製、 米国） を 1ゥエルあたり 0. 9 /z gを E S細胞にトランスフエクシヨンした。 また、 内部コントロールとして、 pRL - TKベ クタ一 （P r o m e g a社製、 米国） を各ゥエル 0. l /i g、 同時にトランスフエク シヨンした。 37°C、 5 %C02インキュベーターで 4時間培養後、培地を吸引し、 PBS で 2回洗浄したのち、 E Sアツセィ培地を各ゥエル 500 1ずつ加えた。次いで、 各ゥエルに 0. 4〜40 μ g/mlとなるようにジメチルスルフォキシド (DMS0) または 水或いはその混合物に溶解した分化抑制剤、 あるいは 10〜10，000unit/mlとなる ように ESァッセィ培地で希釈した ESGR0を 50 ^ 1添カ卩し 37°C、 5% C02ィンキュ ベーターで 6〜24時間培養した。 続いて、 ピツカジーンデュアル ·シーパンジー
(東洋インキ製造社製、 日本） を用いて、 添付のプロトコールに従って、 各細胞 のルシフェラーゼ 'レポーター酵素による発光シグナルを測定した。 図 1 2に示 すように、 ESGR0が PSTAT3- TA- Lucによるレポーター酵素の発現を亢進させたの に対し、 本発明の化合物 bは、 レポーター酵素の発現を誘導しなかった。
また、 化合物 a、 c〜oについても同様の実験を行うことにより、 レポーター 酵素の発現の有無を確認することができる。 実施例 4 ： ES細胞の継代培養
実施例 1の （3) マウス ES細胞の調製に記載の方法に従って調製した E S細 胞を、 予め 0. 1 %のゼラチン水溶液でコートした直径 6 c mの細胞培養用ディ ッシュに 3 X 105個の細胞を、 E S細胞アツセィ培地が 4. 5m lになるよう に播種した。 各ディッシュに 10〜40 μ g/m 1となるようにジメチルスルフ ォキシド （DMSO)、 または培地、 或いはその混合物に溶解した本発明の分化 抑制剤 （A〜F、 a〜o)、 あるいは 104u n i t s /m 1の ESGROを 0. 5ml添カ卩した。 DM SOの培地中への持ち込は最終濃度 0. 1%以下となるよ うにした。 DM SOのみのコントロールは培地で希釈した 1%濃度液を 0. 5 m 1加えて最終濃度 0. 1%とした。 37°C、 5% CO2インキュベーターで 7日 〜30日培養した。 培地は毎日交換し、 2〜3日毎に 3 X 105個/ディッシュ となるように ϋ代した。
本発明の分化抑制剤を用いて 7日、 或いは 30日間培養した ES細胞のアル力 リホスファターゼ活性をコロニーアツセィにより定量した。 即ち、 前記の方法で 継代培養した E S細胞を、 予め 0.1%のゼラチン水溶液でコートした 96穴細胞培 養用ディッシュ （FALCON社製 Cat. No.3072、 米国） に、 1ゥエルあたり 1 X10 3個の細胞を、 1ゥヱル当たりの E S細胞アツセィ培地が 90μ1になるように播種 した。 各ゥエルに 0〜103u n i t s/m 1となるよう培地で希釈した E S G ROを 10 μ 1添カ卩し、 37°C、 5% C02インキュベーターで 4日間培養した。 各ゥエルから培地を吸引除去し、細胞を 100 μΐのリン酸緩衝化生理食塩水（P B S) で 1回洗浄後、 ρ— ΝΡ Ρ 100 μ 1を各ゥエルに加え、室温で 10分間 静置した。各ゥエルに 12. 5 μ 1の 8Μ水酸化ナトリウム溶液を添加し、 反応 を停止させた。 溶液の 405 nmの吸光度 （O. D. 405) と 690 nmの吸 光度（O. D. 690)を吸光度計 (Molecular Devices社製、型式： SPECTRA MAX190) により測定し、 O.D.405-0. D.690 で算出される値をアル力リホスファターゼ活性 とした。 化合物 Bを添カ卩して 30日間継代培養した E S細胞のアル力リホスファ ターゼ定量結果を図 13に、 化合物 f を添カ卩して無血清培地で 7日間継代培養し た E S細胞のアル力リホスファターゼ定量結果を図 14に示した。
本発明の分化抑制剤、 化合物 Bおよび ίで継代培養した E S細胞は、 DMS Ο (0.1%)で培養した E S細胞に比べて有意にアル力リホスファターゼ活性を増幅 させた。 即ち、 本発明の分化抑制剤は ES細胞の未分化状態を長期培養において も支持したことがわかる。
また、 分化抑制剤 A， C〜E、 a〜oについても同様の検討を行ったところ、 分化抑制剤（B， f ) と同様にアルカリホスファターゼの活性を維持した。即ち、 ES細胞の未分化を維持した。 実施例 5
(1) 力二クイザル E S細胞の培養
力二クイザル E S細胞培養培地として、 DME/F— 12， 1 ： 1 (S I GM A D 6421) に、 以下に示す最終濃度で因子を添加して力二クイザル E S細 胞培地を調製した。 20%ノックアウト血清リプレースメント ： KSR ( I n V i t r o g e n社製 10828— 028)、 I X非必須ァミノ酸 （S I GMA M 7145 ) , 2 mM L— G 1 u t a m i n e (S I GMA G7513)、 1 mMピルビン酸ナトリウム （S I GMA S 8636)、 I Xペニシリン/ス ト レプトマイシン溶液 （S I GMA P 078 l)o また、 力二クイザル ES細胞 培養用のマウスフィーダ一細胞用の培地として、 DMEM (I n V i t r o g e n 社製 1 1960— 044) に、 以下に示す最終濃度で各因子を添加して調 製した。 10%ゥシ胎仔血清 （ I n V i t r o g e n社製）、 2 mM L— G 1 u t am i n e (S I GMA G75 1 3)、 1 Xペニシリン/ストレプトマイシ ン溶液 （S I GMA P 0781)。 直径 6 c mの細胞培養用ディッシュに、 蒸留水に 0. 1 %の濃度で G e 1 a t
1 n (S I GMA社製 TypeA:from porcinESkin、G2500) を溶解し、 滅菌して作 製した 0. 1%ゼラチン水溶液 5m 1を添加し、 37 °Cで 30分以上静置した。 ゼラチン水溶液を除いて、 マイトマイシン C (協和発酵社製） 処理したマウス胚 性初代培養細胞 （ I n V i t r o g e n社製 YE 9284400) 2X106個を 播種し、 前記のフィーダ一細胞用培地を用いて 37° (、 5%C02インキュベー ター（タバイエスペック社製）で 5時間以上培養した。力二クイザル ES細胞（田 辺製薬株式会社製） を、 マウス胚性初代培養細胞に播種し、 5m lの力二クイザ ル ES細胞培養培地で、 37°C、 5%CO2インキュベーターで 3日間培養して 増殖させた。
(2) 力二クイザル ES細胞の調製
前記の （1) 力二クイザル E S細胞の培養に記載の方法に従って培養した力二 クイザル E S細胞を P B Sで洗浄後、 DMEM ( I n v i t r o g e n社製 1 1 960— 044) に溶解した 0. 1 %コラゲナーゼ溶液（Wa k o社製 03
2— 10534)もしくは、 トリプシン溶液 （2.5%トリプシン溶液 （Invitrogen 社製 15090-046) を 10ml、 Knockout Serum Replacement (Invitrogen 社製 10828-028)を 20ml、 lOOmM CaCl2水溶液を lml、 PBSを 69ml混合することにより 調製） を加え、 37。Cで 5分間インキュベートした。 5mlの力二クイザル ES 細胞培養培地を添加し、 小径ピペットを使用して細胞コロニーを脱離後、 分散さ せ、 15m 1の滅菌チューブに移し、 卓上遠心機 （トミー精ェ） で l O O O r p m、 約 5分間遠心してペレッ ト化した。 上清を除き、 細胞を 5m 1の新鮮な E S 細胞培地に再懸濁し、 力二クイザル E S細胞を得た。
(3) マトリゲルコートディッシュの作製
グロースファクターリデュースド (GFR)BDマトリゲル (日本べクトン 'デイツ キンソン社製、 354230、 日本） 及び BDマトリゲル基底膜マトリックス （日本べ タ トン 'ディッキンソン社製、 354234) を 2〜8°Cの冷蔵庫でー晚解凍し、 冷や したピぺットを用いてゆつくりと混合した。 冷却した DMEMZF12 1 : 1 (S i g m a社製、 D 6421、 米国）でマトリゲルを 20倍希釈し、 培養ディッシュに加 え、 室温で 1時間ィンキュベートした。 溶液を除去し、 DMEM/F12 1： 1で洗浄 し、 マトリゲルコートディッシュを得た。
(4) ES細胞分化抑制剤ァッセィ 6
前記の （2) 力二クイザル ES細胞の調製に記載の方法に従って調製した力二 クィザル E S細胞を 3〜 5倍に培地で希釈し、 予めマトリゲル （日本べクトン · ディツキンソン社製） でコートした直径 6 c mの細胞培養用ディッシュ 1枚当た り 4. 5mlを播種した。 次いで、 各ディッシュに 8〜40 μ g/m 1となるよ うにジメチルスルフォキシド (DMSO)、 または培地、 或いはその混合物に溶 解した本発明の分化抑制剤 （A〜F、 a〜o) 及び 6-ブロモインジルビン- 3ォキ シムを 0. 5m l添加し、 37。C、 5 %C O 2インキュベーターで培養した。 2 〜 4日毎に前記 （2) 力二クイザル ES細胞の調製に記載の方法に従って継代し た。 DM SOの培地中への持ち込は最終濃度 0. 1%以下となるようにした。 以 上の培養細胞を前記実施例 1に記載のアル力リフォスファターゼ染色により評 価を行った。
化合物 Bもしくは化合物 f を添加後、 2 日間培養した細胞のアル力リフォスフ ァターゼ染色の結果を総コロニー数に対する染色されたコロニー数の割合とし て図 15に、 6-プロモインジルビン - 3ォキシム非存在下もしくは存在下、化合物 f を添加し、 3日間培養後継代し、 3日後のアルカリフォスファターゼ染色写真を 図 16に示した。
本発明の分化抑制剤、 化合物 B及び f で培養した力二クイザル ES細胞は、 DMS0 (0.1%)で培養した力二クイザル ES細胞に比べて有意にアルカリフォスファ ターゼ染色されたコロニーの割合が多かった。 また、 化合物 f存在下で継代培養 した力二クイザル ES細胞は、 DMS0存在下で継代培養した力二クイザル E S細胞 に比べ、 有意に染色されていた。 さらに、 6 -ブロモインジルビン- 3ォキシム存在 下では、 化合物 f の効果は増強された。 即ち、 本発明の分化抑制剤は、 力二クイ ザル E S細胞の未分化状態を支持したことがわかる。 なお、 化合物ん C〜E、 a〜 e、 g〜。についても同様の検討を行ったところ、 分化抑制剤 （B, f) と同様にァ ルカリフォスファターゼの活性を維持した。 即ち、 力二クイザル ES細胞の未分 化を維持した。 実施例 6 ：化合物の製造方法
[ 1 ] 3, 3-ジメチル- 1, 2, 3， 4 -テトラヒ ドロイソキノリ二デン- 1 -ァセトアミ ド の合成
Figure imgf000074_0001
ベンゼンに 2-シァノアセトアミド （Aldrich社、 米国） を加え攪拌しながら、 10°Cに上がらないようにゆっくりと濃硫酸を滴下する。 室温に戻した後、 ジメチ ルベンジルカルビノール （Lancaster社、 英国） を加える。 約 30分間還流し、 室 温に放冷後、 反応混合液を氷水に注ぐ。 抽出した水相を中和し、 生じた沈殿を濾 別する。 乾燥後、 イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。 MS (m/z) =217 (M+l)
[ 2 ] 2- (4-ァセチル-フエ-ルァゾ） -2- (3， 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソ キノリン- 1 -イリデン） -ァセトアミ ドの合成
Figure imgf000075_0001
p -アミノアセトフエノン （Aldrich社、 米国） をベンゼンに溶解し、 塩酸ガス を通気し、 得られた沈殿を濾別し、 イソプロパノールにより再結晶することによ り p -アミノアセトフエノン塩酸塩を得る。 得られた p-アミノアセトフエノン塩 酸塩を 20%エタノール水溶液に溶解し、 氷浴下、 濃塩酸で酸性にする。 亜硝酸ナ トリゥム水溶液を滴下し、 尿素で処理することにより、 ジァゾ二ゥム塩溶液を得 る。
3， 3-ジメチル- 1, 2, 3, 4 -テトラヒドロイソキノリ二デン- 1ーァセトアミ ドを 20% エタノール水溶液に溶解し、 濃塩酸を加える。 10°Cを越えないように温度を調整 し、 先のジァゾ二ゥム塩溶液を加える。 反応液が変化し、 攪拌しながら飽和酢酸 ナトリウム水溶液を加える。 得られた沈殿を濾別後、 イソプロパノールで再結晶 することにより標題化合物を得る。
MS (m/z) =363 (M+l)
[ 3 ] 2 -（3-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2 -（3, 3 ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソ キノリンートイリデン）-ァセトアミ ドの合成
Figure imgf000075_0002
m -アミノアセトフヱノン （Aldrich社、 米国） をベンゼンに溶解し、 塩酸ガス を通気し、 得られた沈殿を濾別し、 イソプロパノールにより再結晶することによ り p-アミノアセトフエノン塩酸塩を得る。 得られた P-アミノアセトフヱノン塩 酸塩を 20%エタノール水溶液に溶解し、 氷浴下、 濃塩酸で酸性にする。 亜硝酸ナ トリウム水溶液を滴下し、 尿素で処理することにより、 ジァゾ二ゥム塩溶液を得 る。
3, 3 -ジメチル- 1, 2， 3, 4-テトラヒ ドロイソキノリニデン- 1-ァセトアミ ドを 20% エタノール水溶液に溶解し、 濃塩酸を加える。 10°Cを越えないように温度を調整 し、 先のジァゾ二ゥム塩溶液を加える。 反応液が変化し、 攪拌しながら飽和酢酸 ナトリウム水溶液を加える。 得られた沈殿を濾別後、 イソプロパノールで再結晶 することにより標題化合物を得る。
MS (m/z) =363 (M+l)
[ 4 ] 2 -（4-ァセチル-フヱニルァゾ） -2- (2, 3， 3-トリメチル -3， 4 -ジヒ ドロ- 2H- イソキノリン—トイリデン)-ァセトアミ ドの合成
Figure imgf000076_0001
ァセトニトリルに 2 -（4 -ァセチル-フエニルァゾ） - 2- (3， 3-ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノリン- 1-イリデン） -ァセトアミ ド (Asinex社， ロシア） 及び炭 酸ナトリウムを加え、 ヨウ化メチルのァセトニトリル溶液をゆっくり滴下し、 還 流する。 還流物を室温まで放冷後、 溶媒を減圧留去し、 残渣をジクロロメタンに 溶解し、 蒸留水で洗浄する。 その後無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 これを濾別し た後、 溶媒を減圧留去する。 反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィー で精製し、 標題化合物を得る。
MS (m/z) =377 (M+l) [ 5 ] 2- (2 -ァセチル- 3， 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -ィソキノリン- 1 -ィリデ ン）- 2- (4-ァセチル-フエニルァゾ）-ァセトアミドの合成
Figure imgf000077_0001
氷浴下、 2 -（4-ァセチル-フエ-ルァゾ）-2- (3， 3-ジメチル- 3, 4-ジヒドロ- 2H-ィ ソキノリン- 1 -ィリデン） -ァセトアミド （Asinex社， 口シァ） 及びジメチルァミ ノビリジンをピリジンに溶解し、 無水酢酸を加える。 停止後、 前記反応後の溶媒 を氷水に注ぎ、 ジクロロメタンにより反応生成物を抽出する。 反応生成物を無水 硫酸ナトリウムで乾燥し、 これを濾別した後、 溶媒を減圧留去する。 反応生成物 を含む残渣をカラムクロマトグラフィ一で精製し、 標題化合物を得る。
MS (m/z) =405 (M+l)
[ 6 ] (4 -ァセチル-フエ二ルァゾ）-（3, 3 -ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ -2H-イソキノ リン- 1-イリデン） -ァセトニトリルの合成
Figure imgf000077_0002
氷浴下、 2- (4-ァセチル-フエニルァゾ） - 2- (3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒドロ- 2H -ィ ソキノリン- 1 -ィリデン）-ァセトアミド (Asinex社， ロシア）、塩化チォニル及ぴ DMFを混合し、 ゆつくり攪拌する。 混合溶媒から過剰の塩化チォニルを減圧留去 し、 反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、 標題化合物を 得る。 MS (m/z) =345 (M+l)
[ 7 ] (4 -ァセチル-フエニルァゾ） -（3， 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキノ リン- 1-ィリデン) -酢酸の合成
Figure imgf000078_0001
エタノールに水酸化力リゥム及ぴ 2- (4 -ァセチル-フエ二ルァゾ）- 2-（3， 3-ジメ チル -3, 4-ジヒ ドロ - 2H-ィソキノリン- 1-ィリデン） -ァセトアミ ド（Asinex社， 口 シァ） を加え、 加熱還流する。 還流物を室温まで放冷後、 これに蒸留水を加え、 さらに塩酸を加えて中性にした後、 エーテルで反応生成物を抽出する。 反応生成 物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 これを濾別した後、 溶媒を減圧留去する。 反 応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、 標題化合物を得る。 MS (m/z) =364 (M+l)
[ 8 ] (4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-（3, 3 -ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H-イソキノ リン- 1-ィリデン） -酢酸ェチルエステルの合成
Figure imgf000078_0002
(4 -ァセチル -フエ二ルァゾ）-（3, 3 -ジメチル- 3， 4-ジヒ ドロ- 2H -ィソキノリン - 1-イリデン) -酢酸をエタノールに懸濁し、 攪拌する。 冷却しながら塩化チォニ ルをゆつくり滴下し、 その後、 室温で攪拌する。 攪拌混合溶媒から溶媒を減圧留 去し、 水で洗浄する。 反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 これを濾別し た後、 溶媒を減圧留去する。 反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィー で精製し、 標題化合物を得る。
MS (m/z)=392 (M+l)
[ 9 ] 2 -（4-ァセチル-フエニルァゾ） - 2 -（3， 3-ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソ キノリン- 1 -ィリデン） - N -メチル-ァセトアミ ドの合成
Figure imgf000079_0001
(4-ァセチル -フエ二ルァゾ）-（3， 3-ジメチル- 3， 4-ジヒ ドロ- 2H-ィソキノリン -1 -イリデン） -酢酸、 メチルァミン、 HOBt (Advanced ChemTech社、 米国） 及ぴト リエチルァミンを DMFに溶解し、 HBTU (Advanced ChemTech社、 米国） のジクロ ロメタン溶液を加え、 その後、 室温で攪拌する。 攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリ ゥム水溶液、 5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。 反応生成物を無水硫酸ナ トリウムで乾燥し、 これを濾別した後、 溶媒を減圧留去する。 反応生成物を含む 残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、 標題化合物を得る。
MS (m/z)=377 (M+l)
[ 1 0 ] 2- (4 -ァセチル -フエ二ルァゾ）-2- (3, 3-ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H -ィ ソキノリン- 1-イリデン） - N，N-ジメチ /レ-アセトアミ ドの合成
Figure imgf000080_0001
(4-ァセチル-フエニルァゾ） -（3, 3-ジメチル- 3, 4-ジヒ ドロ- 2H -ィソキノリン - 1 -イリデン） -酢酸、 ジメチルァミン、 HOBt (Advanced ChemTech社、 米国） 及ぴ トリェチルァミンを DMFに溶解し、 HBTU (Advanced ChemTech社、 米国） のジク ロロメタン溶液を加え、 その後、 室温で攪拌する。 攪拌混合溶媒を飽和塩化ナト リウム水溶液、 5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。 反応生成物を無水硫酸 ナトリウムで乾燥し、 これを濾別した後、 溶媒を減圧留去する。 反応生成物を含 む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、 標題化合物を得る。
MS (m/z) =391 (M+l)
[ 1 1 ] 2- (4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2 -（3, 3-ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -ィ ソキノリン- 1 -ィリデン）- N-フエニル-ァセトアミ ドの合成
Figure imgf000080_0002
(4 -ァセチル-フエ二ルァゾ）-（3， 3 -ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H-イソキノリン - 1-イリデン） -酢酸、 フエニルァミン、 HOBt (Advanced ChemTech社、 米国） 及ぴ トリェチルァミンを DMFに溶解し、 HBTU (Advanced ChemTech社、 米国） のジク ロロメタン溶液を加え、 その後、 室温で攪拌する。 攪拌混合溶媒を飽和塩化ナト リゥム水溶液、 5%炭酸水素ナトリゥム水溶液で洗浄する'。 反応生成物を無水硫酸 ナトリウムで乾燥し、 これを濾別した後、 溶媒を減圧留去する。 反応生成物を含 む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、 標題化合物を得る。
MS (m/z) =439 (M+l)
[ 1 2 ] 2 -（4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-2-（3， 3 -ジメチル- 1, 2， 3， 4-テトラヒ ド 口-イソキノリン- 1 -ィル) -ァセトアミ ドの合成
Figure imgf000081_0001
窒素気流下、 ァセトニトリルに 2- (4 -ァセチル-フェニルァゾ） - 2 -（3， 3 -ジメチ ル- 3, 4-ジヒドロ- 2H -ィソキノリン- 1-ィリデン） -ァセトアミ ド（Asinex社， 口シ ァ） を溶解したものに、 トリフエニルすず水素化物 （Aldrich、 米国） を溶解し たキシレンを加え、 還流する。 還流物を室温まで放冷し、 不溶物を濾別する。 濾 液から溶媒を減圧留去し、 反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで 精製し、 標題化合物を得る。
MS (m/z) =365 (M+l) 実施例 7
( 1 ) E S細胞分化抑制アツセィ 7
実施例 1の ( 2 ) マウス E S細胞の培養に記載の方法を用いて培養した D3 E S 細胞を PBSで 2回洗浄する。 0. 25%トリプシン溶液（ I n V i t r o g e n社製） を加え、 37°Cで 5分間インキュベートし、未分化の D3E S細胞のコロニーをフィ ーダ一から脱離させた。 5ml の E S細胞培地を添加し、 小径ピペットを使用して 細胞コロニーを分散させ、 15mlの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精ェ） で 8 0 0 r p m、 約 5分間遠心してペレツト化した。 上清を除き、 細胞を 5mlの 新鮮な E S細胞培地に再懸濁し、 0. 1%のゼラチン水溶液で予めコートした直径 10cmの細胞培養用ディッシュに播種し、 37°Cで 20分間ィンキュベートした。 20 分後、 浮遊細胞を含む培地をピぺットで回収し、 15mlの滅菌チューブに移し、卓 上遠心機で 1000 r p m、 約 5分間遠心してペレツト化した後、 上清を除き、 5ml の E S細胞アツセィ培地に再懸濁する。予め 0. 1%のゼラチン水溶液でコートした 24穴細胞培養用ディッシュ （FALCON社製 Cat. No. 3047、 米国） に、 1ゥエルあ たり 3 X 102〜 1 X 103個の細胞を、 1ゥエル当たりの E S細胞アツセィ培地が 500 μ ΐになるように播種した。各ゥエルに 0. 4〜40 i g/mlとなるようにジメチル スルフォキシド （DMS0)、 または水、 或いはその混合物に溶解した実施例 6に記 載の方法を用いて製造した化合物①〜⑩、あるいは ESGR0を 50 /i l添加し、 37°C、 5%∞2ィンキュベータ一で 7日間培養した。 DMS0の培地中への持ち込は最終濃度 0, 1%以下となるようにした。 またコントロールゥエルには、 DMS0のみを最終濃 度で 0. 1 %となるように加えた。 化合物①の構造を図 1 7に、 化合物②〜⑩の構 造を図 1 8に示した。
( 2 ) アル力リホスファターゼ染色
E S細胞をアルカ リ ホスファタ一ゼキ ッ ト （SIGMADiagnostic 社製 Cat. No. 86- R)を用いて染色した。 前記 「E S細胞分化抑制アツセィ」 に記載の方 法で培養した E S細胞の各ゥエルから培地を吸引除去し、 その細胞を 0. 5mlのリ ン酸緩衝化生理食塩水 （PBS) で 1回洗浄後、 0. 5ml の細胞固定液 (25ml クェン 酸溶液（SIGMA社製 Cat. No. 91 - 5)、 65ml アセトン、 8ml 37%ホルムアルデヒド） を各穴に加え、 室温で 30秒静置する。 固定液を吸引除去し、 0. 5mlの脱イオン水 を各穴に加えて 45秒室温で静置する。 脱イオン水を吸引除去し、 ついでアル力 リホスファターゼ染色液 （1ml亜硝酸ナトリゥム溶液、 1ml ファーストレツ ドバ ィォレッ ト LB ソルト溶液、 1mlナフトール AS- BI アルカリ溶液、 45ml蒸留水） を 1 ゥエルあたり 0. 5ml加え 15分間室温で静置後、 染色液を吸引除去し、 脱ィ ォン水 0. 5mlで洗浄した。 ネガテイブコント口ールである ESGR0非存在下で培養 した E S細胞、 ポジティブコント口ールである、 ESGR0 (1000ユニット /ml)存在下 で培養した ES細胞、 そして、 本発明の化合物④ (4μβ/ιη1)存在下で培養した E S細胞の染色像を比較した （図 19参照）。 化合物④存在下で培養した ES細胞 は、 ESGR0非存在下で培養した E S細胞に比べ、 有意に濃く染色されており、 高 いアルカリホスファターゼ活性を有していることが示された。 さらに、 本発明の 化合物は、 ポジテイブコント口ールである ESGR0存在下で培養した E S細胞と同 等の未分化コロニーを形成させることもできた。 すなわち、 本発明の化合物は、 ES細胞の未分化状態での増殖を強く支持したことがわかる。
なお、 化合物①〜③、 ⑤〜⑩についても、 化合物④と同様に染色された。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 幹細胞、 好ましくは胚性幹細胞を、 未分化なまま、 期間を延 長してまたは無期限に、 大量にかつ安全に増殖させることができる。 本発明によ つて提供される分化抑制剤、 それを用いた培養方法、 培養液は、 細胞移植用途で 用いる細胞ソースとしての幹細胞、 好ましくは胚性幹細胞を産生するために適用 され得る。 幹細胞、 好ましくは胚性幹細胞を利用することにより得られる多くの 恩恵に加え、 本発明によって提供される分化抑制剤おょぴそれを用いた培養方法 は、 1つもしくは多数の遺伝的な改変を有する胚性幹細胞を産生するために適用 され得る。 このような適用の例は、 疾患について細胞ベースでのモデルの開発、 ならびに遺伝病を処置するために移植について特異化された組織の開発を含む が、 これに限定されない。
上記の通り、 本発明の分ィヒ抑制剤おょぴ Ζまたは 2環化合物は、 幹細胞を未分 化状態で増殖させることができ、 その結果培養された細胞や組織を再生医療分野 で好適に利用できる。 また、 本ィ匕合物を医薬組成物に応用することができる。 本出願が主張する優先権の基礎となる 2003年 6月 27日付の日本特許出願 (特願 2003— 185398) 及ぴ 2003年 10月 14日付の日本特許出願 (特願 2003-353870 )の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細 書中に参照として取り込まれる。

Claims

請求の範囲 低分子化合物またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。 低分子化合物が、 一般式 （1 )
Figure imgf000084_0001
[式中、 R R2、 R3、 及ぴ R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子 吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。 A環は、 少なくとも 1つのへテロ原 子を環内に含む 5〜 8員環を表す。 Xは、 主鎖の原子数が 0〜1 0のアルキレン 基を表す。 原子数 0のアルキレン基とは、 単結合を表す。 該アルキレン基を構成 する 1つ以上のエチレンが、 _ C = C一基及び Z又は一 N = N—基及び/又は一 C O NH—基で置き換わっていてもよい。 また、 環 Aと結合するポンドが二重結 合となる基であってもよい。 さらに、 該アルキレン基は、 置換基として、 電子吸 引基、 電子供与基または水素原子を 1つ以上有してもよい。 Gは、 電子吸引基、 電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。 該 A環は、 一 X G基 以外の置換基として電子吸引基及び/又は電子供与基を 1つ以上有してもよ い。]
で表される化合物である、 請求項 1に記載の幹細胞分化抑制剤。
3 . A環が窒素原子、 酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なく とも 1つのへテロ原子を環内に含む 5もしくは 6員環である、 請求項 2に記載の 幹細胞分化抑制剤。
4 . A環が、 1つの窒素原子を環内に含む 5または 6員環である、 請求項 2 に記載の幹細胞分化抑制剤。
5 . Xで表されるアルキレン基が、 置換基としてアルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ニトロ基、 ヒ ドロキシカルボニル基、 アルコキシカルボ二ル基、 ァ ミノカルボ二ル基、 二トリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及ぴ
Z又は原子を 1つ以上有している、 請求項 2〜 4の何れかに記載の幹細胞分化抑 制剤。
6 . 低分子化合物が、 一般式 ( 2 )
Figure imgf000085_0001
[式中、 R1 R2、 R R4、 X及ぴ Gは、前記請求項 2中の定義と同義である。 R5、 R6、 R7、 R8、及び R9は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。 ]
で表される化合物である、 請求項 2に記載の幹細胞分化抑制剤。
7 . 低分子化合物が、 一般式 （3 )
Figure imgf000085_0002
[式中、 R R2、 R3、 R4、 X及ぴ Gは、 前記請求項 2中の定義と同義である。 R5 及び R6は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基ま たは水素原子を表す。]
で表される化合物である、 請求項 2に記載の幹細胞分化抑制剤。
8 . 低分子化合物が、 一般式 （4 )
Figure imgf000086_0001
[式中、 R R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 及ぴ R9は、 前記請求項 6中の定義 と同義である。 R1 Q、 1、 R1 2、 及び R1 3は、 それぞれ同一または異なっていて もよく、 電子吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。 二重片側破線は単結合 または二重結合を表す。 二重片側破線が二重結合を表す場合、 波線部に関して幾 何異性体が存在する。 これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独 立に、 E体又は Z体のいずれであってもよい。]
で表される化合物である、 請求項 6に記載の幹細胞分化抑制剤。
9 . R R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 R9、 R1 0、 R"、 R1 2、 及ぴ R1 3が、 それぞれ独立に、 アルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ニトロ基、 ヒ ドロキシ カルボ二ル基、 二トリル基、 アルコキシカルボニル基、 ァミノカルボニル基、 ハ ロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、 請求項 8 に記載の幹細胞分化抑制剤。
1 0 . 低分子化合物が、 一般式 ( 5 )
Figure imgf000086_0002
[式中、 R R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 及び R9は、 前記請求項 6中の定義 と同義である。 R1 ()、 R1 1 R1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電 子吸引基、 電子供与基または水素原子を表す。]
で表される化合物である、 請求項 6に記載の幹細胞分化抑制剤。
1 1 . R\ R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 R9、 R1 0、 R1 1 , 及ぴ R1 2が、 そ れぞれ独立に、 アルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ニトロ基、 ヒドロキシカ ルポニル基、 二トリル基、 アルコキシカルボ二ル基、 ァミノカルボニル基、 ハロ ゲン原子及ぴ水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、 請求項 1 0 に記載の幹細胞分ィヒ抑制剤。
1 2 . 低分子化合物が、 一般式 ( 6 )
Figure imgf000087_0001
L式中、 R R2、 R3、 R4、 R5、 及ぴ R6は前記請求項 7中の定義と同義である。 R 7、 R8、 及び R9は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 電子吸引基、 電子 供与基または水素原子を表す。 ]
で表される化合物である、 請求項 7に記載の幹細胞分化抑制剤。
1 3 . R\ R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 及ぴ R9がそれぞれ独立に、 アル キル基、アルコキシ基、 ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、ァセトキシ基、 ァセトキシアルキル基、 酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、 ジアルキルァミノアルキル基、 ジアルキルァミノビュル基、 ヒ ドロキシアルキル アミノアルキル基、 ァリールアミノビニル基、 及び水素原子よりなる群から選ば れる基または原子である、 請求項 1 2に記載の分化抑制剤。
1 4 . R R2、 R3、 R4、 R8、 R9及び R 1 (3が水素原子であり、 R5が水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R7は、 同一であっても異な つてもよい低級アルキル基であり、 R1 1が、水素原子、ハロゲン原子、 ニトロ基、 または低級アルコキシ基であり、 R1 2が、 水素原子、 低級アルキル基、 低級ァシ ル基、 または低級アルコキシ基であり、 R1 3が、 ヒ ドロキシカルボ二ル基、 ニト リル基、 ァミノカルボ二ル基、 または低級アルコキシカルボニル基である、 請求 項 8に記載の幹細胞分化抑制剤。
1 5 . R\ R\ R3、 R4、 R8、 及び R9が水素原子であり、 R5が水素原子、 低級 ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R7が、 同一であっても異なって もよい低級アルキル基であり、 R1 Gが水素原子又は低級アルキル基であり、 R1 1 が、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルコキシ基、 または低級アルコ キシカルボニル基であり、 R1 2が、 水素原子、 低級アルキル基、 低級ァシル基、 または低級アルコキシ基である、 請求項 1 0に記載の幹細胞分化抑制剤。
1 6 . R1および R2が水素原子であり、 R3がヒ ドロキシル基またはァセトキ シ基であり、 R4がァセトキシアルキル基、 酸素原子を含んでも良い環状アルキル ァミノアルキル基、 ジアルキルァミノアルキル基、 ヒ ドロキシアルキルァミノア ルキル基、 又は水素原子であり、 R5が低級アルキル基、 またはァリールァミノビ ニル基であり、 R6がニトロ基であり、 R7、 R8、 及ぴ R9が同一であっても異なつ てもよい低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 または水素原子である、 請求項 1 2に記載の幹細胞分化抑制剤。
1 7 . 一般式 （ 9 )
Figure imgf000088_0001
[式中、 R R R3、 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒ ドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基また は環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、R8及び R9は水素原子であり、 R1 Q、 R1 1 及び R1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハ ロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基 であり、 R1 3がヒ ドロキシカルボニル基、 低級アルコキシカルボ二ル基、 二級ァ ミノカルボニル基または三級ァミノカルボ二ル基を表す。 波線部に関して幾何異 性体が存在し、 これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであってもよい。]
で表される化合物またはその塩。
1 8 . 一般式 （9 )
Figure imgf000089_0001
[式中、 R R2、 R3、 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒ ドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基また は環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、R8及び R9は水素原子であり、 R1 Q及び R1 2が水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシ ル基または低級アルコキシ基であり、 R1 1が低級ァシル基であり、 R1 3がヒドロキ シカルボニル基、 低級アルコキシカルボニル基、 ァミノカルボ二ル基を表す。 波 線部に関して幾何異性体が存在し、 これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであってもよい。] で表される化合物またはその塩。
1 9 . 一般式 （ 9 )
Figure imgf000090_0001
[式中、 R1 R2、 R\ 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R7は、 それ ぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基または環状構造 を形成してもよい低級アルキル基であり、 R8及ぴ R9は水素原子であり、 R1 G、 R1 1及ぴ R1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原 子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3はヒ ドロキシカルボニル基、 低級アルコキシカルボニル基またはァミノカル ボニル基を表す。 波線部に関して幾何異性体が存在し、 これらの幾何異性体の配 置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであってもよい。] で表される化合物またはその塩。
2 0 . 一般式 （ 9 )
Figure imgf000090_0002
[式中、 R R2、 R 及び R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 低級アルキル基または環状構造 を形成してもよい低級アルキル基であり、 R8及び R9は水素原子であり、 R1 C1、 R1 \ 及ぴ R 1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン 原子、二ト口基、低級アルキル基、低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3は二トリル基を表す。 波線部に関して幾何異性体が存在し、 これらの幾何異 性体の配置は特に限定されず、 それぞれ独立に、 E体又は Z体のいずれであって もよい。]
で表される化合物またはその塩。
2 1 . 一般式 （1 0 )
Figure imgf000091_0001
[式中、 R R2、 、 及ぴ R4は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素 原子、 低級アルキル基、 ヒドロキシル基、 低級アルコキシ基、 又はハロゲン原子 であり、 R5は水素原子、 低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R 7は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 低級アルキル基また は環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、R8及び R9は水素原子であり、 R1 Q、 R 1 1 及び R1 2は、 それぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ 基であり、 R 1 3がヒドロキシカルボニル基、 低級アルコキシカルボニル基、 アミ ノカルボニル基、 又は二トリル基を表す。]
で表される化合物またはその塩。
2 2 . R R2、 R3、及び R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R 7が同一であっても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及び R1 Gが水素原子であり、 ェ及ぴ！^^が、 同一 であっても異なっていてもよい水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキ ル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3がヒ ドロキシカルボ二 ル基、 低級アルコキシカルボニル基、 モノ低級アルキルアミノカルボニル基、 ジ 低級アルキルァミノカルボ二ル基、 又はフエニルァミノカルポニル基である、 請 求項 1 7記載の化合物またはその塩。
2 3 . R\ R R3、及び R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及び R7が同一であっても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及ぴ R1 Gが水素原子であり、 R1 1が低級ァシル基で あり、 R1 2が水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル基、 低級ァシル 基、 または低級アルコキシ基であり、 R1 3がヒドロキシカルボニル基、 低級アル コキシカルボニル基、 力ルバモイル基、 モノ低級アルキルアミノカルポニル基、 ジ低級アルキルァミノカルボニル基、 又はフエニルァミノカルボ-ル基である、 請求項 1 8記載の化合物またはその塩。
2 4 . \ R2、 R 及ぴ R4が水素原子であり、 R5が低級ァシル基、 または低 級アルキル基であり、 R6及ぴ R7が同一であっても異なっていてもよい低級アルキ ル基であり、 R8、 R9及ぴ R1 Gが水素原子であり、 ェ及ぴ ^が、 それぞれ同一 または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級アルキル 基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3がヒ ドロキシカルボニル 基、 低級アルコキシカルポニル基、 力ルバモイル基、 モノ低級アルキルアミノカ ルポニル基、 ジ低級アルキルァミノカルボエル基、 又はフヱ-ルァミノカルボ二 ル基である、 請求項 1 9記載の化合物またはその塩。
2 5 . R R R 及び R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低被ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R6及ぴ R7が同一であっても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及び R1 Gが水素原子であり、 ！？ 及ぴ！^^が、 それ ぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級 アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3が二トリル基で ある、 請求項 2 0記載の化合物またはその塩。
2 6 . R\ R2, R3、及び R4が水素原子であり、 R5が水素原子、低級ァシル基、 または低級アルキル基であり、 R 6及び R 7が同一であっても異なっていてもよい低 級アルキル基であり、 R8、 R9及び R1 ()が水素原子であり、 ！^ 及び！^^が、 それ ぞれ同一または異なっていてもよく、 水素原子、 ハロゲン原子、 ニトロ基、 低級 アルキル基、 低級ァシル基または低級アルコキシ基であり、 R1 3がヒ ドロキシカ ルボニル基、 低級アルコキシカルボニル基、 力ルバモイル基、 モノ低級アルキル ァミノカルボニル基、 ジ低級アルキルァミノカルボニル基、 フエニルァミノカル ポニル基、 又は二トリル基である、 請求項 2 1記載の化合物またはその塩。
2 7 . (4 -ァセチル-フエニルァゾ） -（3, 3-ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2H -イソキ ノリン十ィリデン） -酢酸ェチルェステル、 (4-ァセチル-フエ二ルァゾ）-（3, 3 -ジ メチル- 3, 4 -ジヒドロ- 2H -ィソキノリン- 1 -ィリデン） -酢酸、 2- (4 -ァセチル-フエ -ルァゾ） - 2- (3， 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ド口 - 2H-ィソキノリン- 1 -ィリデン） - N -メ チル-ァセトアミ ド、 2 -（4 -ァセチル-フエニルァゾ） - 2 -（3, 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒ ドロ- 2H-ィソキノリン- 1 -ィリデン） - Ν, Ν-ジメチル-ァセトアミ ド、 2 -（4 -ァセチ ル-フヱ二ルァゾ）-2- (3, 3 -ジメチル- 3, 4 -ジヒ ドロ- 2Η-イソキノリン- 1 -ィリデ ン) - Ν-フエニル-ァセトアミ ドである、 請求項 1 7記載の化合物またはその塩。
2 8 . 2 -（3 -ァセチル -フエニルァゾ） - 2 -（3， 3 -ジメチル- 3， 4 -ジヒドロ- 2Η -ィ ソキノリン- 1 -イリデン) -ァセトアミ ドである、 請求項 1 8記載の化合物または その塩。
2 9 . 2- (4-ァセチル -フエ二ルァゾ）-2 -（2, 3，3 -トリメチル -3, 4-ジヒ ドロ - 2Η -イソキノリン- 1 -ィリデン） -ァセトアミ ド、 2 -（2 -ァセチル -3, 3-ジメチル -3, 4-ジヒ ドロ- 2Η -イソキノリン- 1 -ィリデン） - 2- (4 -ァセチル-フェニルァゾ） - ァセトアミド である、 請求項 1 9記載の化合物またはその塩。
3 0 . (4-ァセチル-フエニルァゾ） -（3， 3 -ジメチル- 3, 4 -ジヒドロ- 2H-イソキ ノリン- 1-イリデン) -ァセト-トリルである請求項 2 0記載の化合物またはその 塩。
3 1 . 2- (4-ァセチル-フエニルァゾ） - 2 -（3， 3 -ジメチル- 1, 2, 3, 4 -テトラヒ ド ロ-イソキノリン- 1-ィル） -ァセトアミ ドである請求項 2 1記載の化合物または その塩。
3 2 . 請求項 1 7〜 3 1のいずれかに記載の化合物またはその塩を有効成分 とする幹細胞分化抑制剤。
3 3 . 低分子化合物がアル力リホスファターゼの活性を維持または上昇させ る作用を有する化合物である、 請求項 1〜1 6又は 3 2のいずれかに記載の幹細 胞分化抑制剤。
3 4 . 低分子ィ匕合物力 S、 STAT3 (signal transducer and activator of transcrption3)を活性化しない化合物である、 請求項 1〜 1 6、 3 2又は 3 3の いずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
3 5 . 低分子化合物が、 S S E A— 1抗原発現量を増加させる作用を有する 化合物である、 請求項 1〜1 6又は3 2〜3 4のいずれかに記載の幹細胞分化抑 制剤。
3 6 . 低分子化合物が、 N a n o g遺伝子の発現量を増加させる作用を有す る化合物である請求項 1〜 1 6又は 3 2〜3 5のいずれかに記載の幹細胞分化 抑制剤。
3 7 . 低分子化合物が、 N a n o g遺伝子の発現量を増加させる作用を有す る 2環化合物である、 請求項 3 6に記載の幹細胞分化抑制剤。
3 8 . 低分子化合物が、 N a n o g遺伝子の発現量を増加させる作用を有す るァゾ基を含有する 2環化合物である、 請求項 3 7に記載の幹細胞分化抑制剤。
3 9 . 請求項 1〜1 6及ぴ3 2〜3 8のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤 を用いて幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする幹細胞培養方法。
40. 請求項 1〜 1 6及び 32〜 3 8のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤 を用.いて胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする胚性幹細胞培養 方法。
41. 請求項 1〜 1 6及ぴ 32〜 38のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤 を有効成分として含有する培地。
42. 請求項 1 7〜 3 1のいずれかに記載の化合物またはその塩を含有する 培地。
43. 分化抑制剤、 化合物またはその塩の濃度が 1 0 η §Ζιη 1〜1 00 μ g/m 1であることを特徴とする請求項 4 1または 42に記載の培地。
44. 請求項 1〜 1 6及び 3 2〜 38のいずれかに記載の分化抑制剤を用い て未分化状態で培養された幹細胞。
45. 請求項 1〜 1 6及び 3 2〜 38のいずれかに記載の分化抑制剤を用い て未分化状態で培養された幹細胞を分化させて得られる細胞または組織。
46. 細胞または,祖織が生体内へ移植するためのものである請求項 44また は 45に記載の細胞または組織。
47. 請求項 44〜 46のいずれかに記載の細胞または Zおよび組織を生体 内に移植する治療方法。
48. 請求項 1 7〜3 1のいずれかに記載の化合物またはその塩のプロドラ ッグ。
49. 請求項 1 7〜3 1のいずれかに記載の化合物もしくはその塩またはそ のプロドラッグを含有してなる医薬組成物。
PCT/JP2004/009379 2003-06-27 2004-06-25 細胞分化抑制剤、これを用いた細胞培養方法、培養液及び培養された細胞株 WO2005007838A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005511810A JP4667241B2 (ja) 2003-06-27 2004-06-25 細胞分化抑制剤、これを用いた細胞培養方法、培養液及び培養された細胞株
KR1020057024980A KR101160698B1 (ko) 2003-06-27 2004-06-25 세포 분화 억제제, 이것을 이용하는 세포 배양 방법, 배양 배지 및 배양된 세포주
AU2004257966A AU2004257966B2 (en) 2003-06-27 2004-06-25 Cell diffrentiation inhibitor, cell culture method using the same, liquid culture medium and cultured cell line
EP04746848A EP1640449A4 (en) 2003-06-27 2004-06-25 CELL DIFFERENTIATION INHIBITOR AGENT, CELL CULTURE METHOD USING THE SAME, CULTURE MEDIUM AND CULTIVATED CELL LINE

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-185398 2003-06-27
JP2003185398 2003-06-27
JP2003-353870 2003-10-14
JP2003353870 2003-10-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005007838A1 true WO2005007838A1 (ja) 2005-01-27

Family

ID=34082299

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/009379 WO2005007838A1 (ja) 2003-06-27 2004-06-25 細胞分化抑制剤、これを用いた細胞培養方法、培養液及び培養された細胞株

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20050153941A1 (ja)
EP (1) EP1640449A4 (ja)
JP (1) JP4667241B2 (ja)
KR (1) KR101160698B1 (ja)
AU (1) AU2004257966B2 (ja)
WO (1) WO2005007838A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006204292A (ja) * 2004-12-27 2006-08-10 Asahi Kasei Corp ヒト胚性幹細胞分化抑制剤
JP2008195642A (ja) * 2007-02-13 2008-08-28 Asahi Kasei Corp インドール誘導体
US9435493B2 (en) 2009-10-27 2016-09-06 Cree, Inc. Hybrid reflector system for lighting device

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080023680A (ko) 2005-05-10 2008-03-14 인터뮨, 인크. 스트레스-활성화 단백질 키나제 시스템을 조절하기 위한피리돈 유도체
KR20080073774A (ko) * 2005-11-28 2008-08-11 주식회사 중외제약 배양에서 세포의 무혈청 증식
GB0704407D0 (en) * 2007-03-07 2007-04-18 Glaxo Group Ltd Compounds
MX2010012848A (es) 2008-06-03 2011-03-01 Intermune Inc Compuestos y metodos para tratar trastornos inflamatorios y fibroticos.
WO2011085225A1 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Wake Forest University Health Sciences Delivery system
EP2683328B1 (en) 2011-03-07 2017-11-08 Wake Forest University Health Sciences Delivery system
AR092742A1 (es) 2012-10-02 2015-04-29 Intermune Inc Piridinonas antifibroticas
CN106459042B (zh) 2014-04-02 2019-06-28 英特穆恩公司 抗纤维化吡啶酮类
WO2015194710A1 (ko) * 2014-06-17 2015-12-23 가톨릭대학교 산학협력단 Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101705412B1 (ko) * 2014-06-17 2017-02-09 가톨릭대학교 산학협력단 Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
US10006005B2 (en) * 2014-06-27 2018-06-26 National University Corporation Chiba University Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells to hepatoblasts
CA3058695A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Basilea Pharmaceutica International AG Processes for the preparation of furazanobenzimidazoles and crystalline forms thereof
CN116600801A (zh) * 2020-09-30 2023-08-15 Fl2022-001公司 Hsd17b13抑制剂和其用途

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000834A1 (en) * 1985-08-02 1987-02-12 Leo Pharmaceutical Products Ltd. A/S Novel vitamin d analogues
US4667083A (en) * 1986-02-14 1987-05-19 Westinghouse Electric Corp. Torch for preheating a continuously fed welding wire
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US6667176B1 (en) * 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
EP1349614A2 (en) * 2001-01-03 2003-10-08 President And Fellows Of Harvard College Compounds regulating cell proliferation and differentiation
AU2002235728A1 (en) * 2001-02-26 2002-10-03 Novo Nordisk A/S Method for generating insulin-secreting cells suitable for transplantation
GB2394958B (en) * 2001-07-24 2006-03-01 Es Cell Int Pte Ltd Methods of inducing differentiation of stem cells
AU2002318927B2 (en) * 2001-07-31 2007-01-04 Genzyme Corporation Methods to mobilize progenitor/stem cells
WO2003038070A1 (fr) 2001-10-31 2003-05-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Materiau de base pour culture de cellules souches embryonnaires et procede de culture
AUPS209402A0 (en) 2002-05-02 2002-06-06 Victor Chang Cardiac Research Institute, The Cell differentiation and self renewal
WO2003102151A2 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Celgene Corporation Modulating cell differentiation and treating myeloprolifertive disorders with jnk/mkk inhibitors
EP1511838A4 (en) 2002-06-07 2007-01-10 Es Cell Int Pte Ltd METHOD FOR CONTROLLING DIFFERENTIATION IN STEM CELLS
WO2005038010A2 (en) * 2003-10-16 2005-04-28 The University Court Of The University Of Edinburgh Control of es cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor
US20050260748A1 (en) * 2004-02-27 2005-11-24 Michigan State University Adult stem cells and uses thereof
US7662941B2 (en) * 2005-01-18 2010-02-16 The Trustees of the University of Princeton - Princeton University Embryonic stem cell self maintenance and renewal reporter
US7892830B2 (en) * 2007-01-17 2011-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Clonal culture of human pluripotent stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATANES N. ET AL: "The reaction of 1-Alkyldihydroisoquinolines with benzyne. An unexpected entry to dibenzindolizines", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 28, no. 7, 1987, pages 817 - 820, XP002981846 *
See also references of EP1640449A4 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006204292A (ja) * 2004-12-27 2006-08-10 Asahi Kasei Corp ヒト胚性幹細胞分化抑制剤
JP2008195642A (ja) * 2007-02-13 2008-08-28 Asahi Kasei Corp インドール誘導体
US9435493B2 (en) 2009-10-27 2016-09-06 Cree, Inc. Hybrid reflector system for lighting device

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004257966B2 (en) 2008-10-02
KR20060056901A (ko) 2006-05-25
US20090155906A1 (en) 2009-06-18
AU2004257966A1 (en) 2005-01-27
US20050153941A1 (en) 2005-07-14
JP4667241B2 (ja) 2011-04-06
EP1640449A1 (en) 2006-03-29
JPWO2005007838A1 (ja) 2006-08-31
US8883504B2 (en) 2014-11-11
KR101160698B1 (ko) 2012-06-28
EP1640449A4 (en) 2009-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8883504B2 (en) Cell differentiation suppressing agent, method of culturing cells using the same, culture solution, and cultured cell line
CN104508121B (zh) 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法
US7452718B2 (en) Direct differentiation method for making cardiomyocytes from human embryonic stem cells
JP7029144B2 (ja) 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法
EP2268795B1 (en) Method for generating primate cardiovascular progenitor cells for clinical use from primate embryonic stem cells or embryonic-like state cells, and their applications
JP6864670B2 (ja) 網膜色素上皮細胞の調製法
US20080254003A1 (en) Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Cardiomyocytes and Cardiomyocyte Progenitors Derived Therefrom
JP5764598B2 (ja) 幹細胞を培養するための方法及びキット
IL190016A (en) Cardiomyocyte production
WO2009116893A1 (ru) Способ получения эндотелиальных клеток (варианты)
JP5107589B2 (ja) インドール誘導体
JP2006204292A (ja) ヒト胚性幹細胞分化抑制剤
H Parsons et al. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells
KR20090090586A (ko) 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법
Klimanskaya Retinal pigment epithelium
WO2012157612A1 (ja) 細胞分化誘導剤および分化誘導方法
JP2005013152A (ja) 細胞分化抑制剤及びこれを用いた細胞培養方法、培養液、培養された細胞
US20200308548A1 (en) Amplifying Beta Cell Differentiation with Small Molecules BET (Bromodomain And Extraterminal Family Of Bromodomain-Containing Proteins) Inhibitors
JP4406601B2 (ja) 組織幹細胞増殖剤
JP2011152111A (ja) 多能性幹細胞培養用培地
IL178006A (en) Method for making high purity cardiomyocyte preparations suitable for regenerative medicine
Zhu et al. DA neurons derived from hES cells that express HLA-G1 are capable of immunosuppression
KR20090059339A (ko) 줄기세포에서 심장근육세포로의 분화를 촉진하는 화합물및 그 유도체
JP2005000034A (ja) 全能性幹細胞培養用フィーダー
AU2005318931A1 (en) Differentiation of human embryonic stem cells and cardiomyocytes and cardiomyocyte progenitors derived therefrom

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005511810

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020057024980

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004746848

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004257966

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2004257966

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20040625

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004746848

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020057024980

Country of ref document: KR