KR20090059339A

KR20090059339A - 줄기세포에서 심장근육세포로의 분화를 촉진하는 화합물및 그 유도체

Info

Publication number: KR20090059339A
Application number: KR1020070126151A
Authority: KR
Inventors: 남기환; 강용국; 김장환; 이창희; 김은경; 손미영; 김형진; 오구택; 김환묵; 원영석; 문옥성; 이철호
Original assignee: 한국생명공학연구원; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2007-12-06
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2009-06-11
Also published as: KR100943985B1

Abstract

본 발명은 포유류의 배아 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도 또는 심장기능 향상시키기 위하여 사용되는 화합물 및 그 유도체에 관한 것으로서, 상기 화합물 또는 그 유도체의 존재 하에 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는 방법, 상기 화합물 또는 그 유도체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 배지조성물, 상기 분화 유도 방법에 의하여 제조된 심장근육세포, 상기 심장근육세포를 유효성분으로 포함하는 심장 질환 치료용 약제학적 조성물, 상기 심장근육세포를 이용하여 심장근육세포의 발생 유도, 분화 유도, 재생 또는 생존을 촉진하는 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

배아줄기세포, 심장근육세포, 분화촉진제, 증식촉진제, 세포치료제, 심장재생치료제

Description

줄기세포에서 심장근육세포로의 분화를 촉진하는 화합물 및 그 유도체 {Compound and its derivatives which have cardiomyocyte differentiating effect from stem cells}

본 발명은 포유류의 배아 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도 또는 심장기능 향상시키기 위하여 사용되는 화합물 및 그 유도체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 상기 화합물 또는 그 유도체의 존재 하에 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는 방법, 상기 화합물 또는 그 유도체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 배지조성물, 상기 분화 유도 방법에 의하여 제조된 심장근육세포, 상기 심장근육세포를 유효성분으로 포함하는 심장 질환 치료용 약제학적 조성물, 상기 심장근육세포를 이용하여 심장근육세포의 발생 유도, 분화 유도, 재생 또는 생존을 촉진하는 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가증식 능력을 갖추고 있는 세포로서, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포), 배아기의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell. EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체줄기세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC 세포)의 3종이 가장 잘 알려져 있다. 줄기세포는 각종 장기에 대한 기능회복을 위한 세포자원으로서 연구의 대상이 되고 있다. 줄기세포에서 원하는 세포로 분화를 유도하는 과정은 다양할 수 있으며, 그 과정에서 특정의 세포로 분화되도록 유도하기 위하여 사이토카인, 생리활성단백 및 단순화합물 등이 나타내는 효과를 알아내고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다.

한편, 심장근육세포(cardiomyocyte)는 출생 전에는 자율 박동하면서 활발하게 세포 분열을 하지만, 출생 직후부터 분열 기능을 상실하게 되며, 또한 미분화된 전구 세포를 가지지 않기 때문에, 심근경색이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 심장근육세포가 사멸하더라고 소실된 심장근육세포는 보충되지 않는다. 그 결과, 남아있는 심장근육세포는 대상성 비대에 의해 심장 기능을 유지하려고 하지만, 각종 스트레스가 지속되어 그 허용범위를 넘어서게 되면 새로운 심장근육세포의 쇠퇴 및 사멸을 유발하여 심근 기능이 저하되는 심부전이 유발된다.

심부전의 치료제로는, 종래에는 심근의 수축력을 증가시키는 디기탈리스 제제나 크산틴 제제 등의 강심제가 사용되어 왔으나, 이들 약제를 장기간 투여하는 경우 심근 에너지의 과잉 소비로 인해 병의 용태를 악화시키는 것으로 알려져 있 다. 또한, 최근에는 교감 신경계나 레닌-안지오텐신계의 항진에 의한 과잉 심부하를 경감시키는 베타-차단제나 ACE(angiotensin converting enzyme) 저해제에 의한 치료가 주를 이루고 있지만, 이는 대증적 치료법에 불과하며, 상해를 입은 심조직 자체를 회복시키는 방법이 아니다. 이러한 방법들에 비해 심장 이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 제공자의 부족, 의료 윤리, 환자의 육체적 및 경제적 부담 등의 문제가 있어, 심장이식 방법을 일반적인 치료법으로 자주 사용하기 어려운 실정이다.

따라서, 심근경색 등 다양한 원인에 의하여 심장기능의 저하에 대하여 심장기능을 향상 또는 회복시키고자 하는 연구에 있어서 줄기세포는 세포치료용 심장근육세포의 공급원으로서 매우 큰 주목을 받고 있다. 특히, 이전부터 배아줄기세포가 시험관내 배양에 의해 심장근육세포로 분화를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 배아줄기세포 유래의 심장근육세포를 성체 심장 조직에 이식한 동물 실험에서는, 배아 심근을 이식한 경우와 거의 동일하게, 매우 유효성이 높은 것으로 확인되었다 (미국특허 제 6,015,671호; Klug et al., J.Clin.Invest., 98:216, 1996). 또한, 인간 배아줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도할 수 있다는 것이 알려져 있으며(Kehat et al., J.Clin.Invest., 108:407, 2001; Chunhui et al., Circ.Res., 91:508, 2002; 국제공개특허 제03/06950호), 이들 연구에 따르면 인간 배아줄기세포로부터 분화가 유도된 심장근육세포는 자립 박동 기능을 가질 뿐만 아니라, 미오신 중쇄/경쇄, α-액티닌, 트로포닌 및 심방성 이뇨 펩티드(artial natriuretic peptide; ANP) 등의 심근 특이 단백질과, GATA-4, Nkx2.5 및 MEF-2c 등의 심근 특이적 전사인자를 발현 및 생산하며, 또한 미세 해부학적 관찰 및 전기 생리학적 해석상 태생기의 미성숙한 심장근육세포의 형질을 유지하고 있는 것으로 확인되어, 이의 재생 의료로의 이용이 기대되고 있다.

그러나 종래 방법에 의해 배아 줄기세포 또는 배아 생식세포로부터 형성된 배아체(embryoid body, EB)는 심장근육세포 이외에도 혈구계 세포나, 혈관계 세포, 신경계 세포, 장관계 세포, 뼈·연골 세포 등의 다른 종류의 세포가 혼재된 형태로 발생되는 문제점이 있다. 줄기세포로부터 심장근육세포를 분화시키는 효율은 매우 낮은 상황이며, 이들 분화된 세포에서 심장근육세포가 차지하는 비율은 전체의 5 내지 20 % 정도에 지나지 않는다. 따라서, 심장근육세포로 분화시키는 효율을 높이는 것은 심장기능향상을 위한 세포치료법의 개발에 있어서 매우 중요한 전기가 될 것이라고 생각되고 있다.

본 발명의 화합물 및 그 유도체는 포르피린 합성의 핵심 전구 물질로 포르피린의 합성에 사용되는 물질이다. 하기 화학식 1의 화합물은 Bull. Korean Chem. Soc.(W.S. Cho et al., 1998, 19, 314), Tetrahedron(C. Lee and J. Lindsey, 1994, 50, 11427) 및 미국 공개특허 제2005/038262호에 개시되어 있는 화합물로서, 세포 분화에 대한 생리학적 기능은 전혀 알려진 바가 없다. 그 유도체인 화학식 2의 화합물은 포르피린 합성의 중간체로서 알려져 있을 뿐이다 (J.-W. Ka, Tetrahedron Lett. 2000, 41, 4609).

본 발명자들은 심장기능향상을 위한 세포치료법을 개발하고자 노력한 결과, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체들이 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는데 탁월한 효과가 있다는 새로운 용도를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체의 존재 하에 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 화합물 또는 그 유도체를 포함하는, 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하기 위한 배지조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 분화 유도 방법에 의하여 제조된 심장근육세포을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 심장근육세포를 유효성분으로 포함하는 심잘 질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 심장근육세포를 포함하는, 심장근육세포의 발생 유도, 분화 유도, 재생 또는 생존을 촉진하는 후보물질을 검정하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 심장근육세포를 이용하여 심장근육세포의 발생 유도, 분화 유도, 재생 또는 생존을 촉진하는 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학 식 2로 표시되는 그 유도체의 존재 하에 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다:

상기 화학식에서, R₁ 은 수소, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 할라이드, 니트로, 시아노기, 알콕시카르보닐, 아미노기, 아세트아미도기 및 치환되거나 치환되지 않은 아릴기 또는 헤테로아릴기로 구성되는 군으로부터 선택되며, R2, R3 및 R4는 서로 같거나 다른 것으로 수소, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 할라이드, 니트로, 시아노기 및 알콕시카르보닐기로 구성되는 군에서 선택되며, X는 C, N, O 또는 S 이다.

본 발명에서 사용된 용어, "줄기세포"는 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며 자가증식 능력을 갖추고 있는 세포를 말하며, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포), 배아기의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell. EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체줄기세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC 세포)의 3종이 가장 잘 알려져 있다. 마우스 유래 배아 줄기세포의 구체적인 예로는, EB3 세포, E14 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129SV 세포 및 J1 세포 등을 들 수 있다. 또한, 배아 줄기세포, 배아 생식세포 및 다능성 성체줄기세포의 제조, 계대 및 보존에 대해서는 이미 확립되어 있는 표준적인 프로토콜(Matsui et al., Cell, 70: 841, 1992; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13726, 1998; 미국특허 제 6,090,622호; Jiang et al., Nature, 418: 41, 2002; 국제공개특허 01/11011)을 참조하여 이들 줄기세포를 용이하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용가능한 세포는, 상기 3종으로 한정되지 않으며, 포유동물의 배아나 태아, 제대혈, 또는 성체 장기나 골수 등의 성체 조직, 또는 혈액 등으로부터 유래된 모든 다능성 줄기세포를 포함하며, 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 줄기세포를 포함한다. 이 경우 용어, "배아 줄기세포와 유사한 형질"이란, 배아 줄기세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나, 배아 줄기세포 특이적인 유전자를 발현하거나, 또는 테라토마(teratoma) 형성 기능을 가지거나, 또는 키메라 마우스 형성능이 있는 등의 배아 줄기세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로 정의할 수 있다.

또한, 배아 줄기세포와 유사한 형질을 갖지 않는 세포 또는 다능성 줄기세포가 아니라도, 적어도 시험관내 배양에서 심장근육 세포형의 형질을 가지는 세포로 분화할 수 있는 성질을 가진 세포라면 본 발명에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 이와 같은 세포의 예로는, 골수 세포에 유래하는 골수중간엽계 줄기세포(Bruder et al., 미국특허 제 5,736,396호; pittenger et al., Science 284: 143, 1999)나 CMG 세포(Makino et al., J. Clin. Invest., 103: 697, 1999; 국제 공개특허 제01/048151호) 또는 근조직에 유래하는 Spoc 세포(국제공개특허 제03/035382호)를 들 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "심장근육세포"는 "심근세포"와 같은 의미로 사용되며, 장래에 기능적인 심장근육세포가 될 수 있는 능력을 가진 심장근육 전구 세포, 또는 태아형 심장근육세포, 성체 심장근육세포의 모든 분화 단계의 세포를 포함한다. 즉, 본 발명에서 용어, "줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화 유도"라 함은 줄기세포에서 심장근육세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 심장근육세포로 완전히 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 심장근육전구세포로의 분화도 포함하는 것으로서, 본 발명의 화합물은 줄기세포가 심장근육세포로 완전히 분화되는 것을 효과적으로 달성되도록 할 뿐만 아니라 줄기세포에서 심장근육전구세포로 분화하는 데에도 매우 큰 효율성을 나타낸다.

줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 확인하기 위하여, 심장근육 전구 세포 또는 심장근육세포에 특이적인 마커의 검출을 이용할 수 있다. 심장근육 전구 세포 또는 심장근육세포에 특이적인 마커의 예로는 미오신 중쇄/경쇄, α-엑티닌, 트로포닌, ANP, GATA-4, Nkx2.5 및 MEF-2c 등을 들 수 있다. 이러한 심장근육세포에 특이적인 각종 마커의 발현을 검출하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 혼성화 분석으로서 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물 학적 방법으로 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심장근육세포에 특이적인 마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행(GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 이용가능하며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 면역조직 화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은 면역화학적 방법을 사용할 수 있다. 면역화학적 방법에서, 심장근육 전구 세포 또는 심장근육세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있으며, 시판되고 있는 항체를 사용할 수 있다.

또한, 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 확인하기 위하여, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다. 즉, 줄기세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도 유용한 지표가 될 수 있다.

본 발명에서, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체는, 구체적으로 화학식 3 내지 화학식 14로 표시되는 다음과 같은 화합물들을 포함한다. 또한, 이들 유도체는 약제학적으로 허용가능한 각종 무기염 또는 유기염을 포함한다.

본 발명은 줄기세포를 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체의 자극 하에 배양하는 것을 특징으로 하며, 상기 자극 방법은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 상기 화합물을 배지 중에 첨가하는 방법을 들 수 있다. 그 밖에도, 상기 화합물을 배지에 첨가하는 방법과 동일한 효과를 나타내는 모든 방법을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 줄기세포 분화 유도방법은 크게 3 단계로 실시될 수 있다: (a) 줄기세포를 준비하는 단계; (b) 줄기세포로부터 배아체(embryoid body)를 얻는 단계; 및 (c) 본 발명의 화합물을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 배지 조성물을 포함하는 배지에서 배아체를 배양하여 배아체로부터 분화된 세포를 분리하는 단계이다.

상기 단계 (b)에서 이용되는 배양 디쉬는 배아체의 효율적인 형성을 위하여 세포가 부착(adhesion)될 수 있는 작용기가 없는 박테리얼 그레이드 배양 디쉬가 적합하다. 단계 (b)는 배아체가 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 2일 내지 5일이다.

상기 단계 (c)에서는 본 발명의 화합물과 다른 줄기세포 분화유도제를 함께 처리할 수 있으며, 처리에 있어서 서로 시간적으로 제한이 없다. 즉, 본 발명의 화합물을 다른 분화유도제보다 먼저, 동시에 또는 후에 처리할 수 있다. 세포 덩어리(cell aggregates)인 배아체로부터 개별적인 세포를 분리하는 것은, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 기계적인 방법 및 효소적 방 법으로 실시될 수 있으며, 트립신과 같은 효소를 이용하는 효소적 분리 방법이 바람직하다. 단계 (c)는 분화 세포가 형성될 수 있는 충분한 시간 동안 실시하는 것이 일반적이며, 바람직하게는 3일 내지 15일이다. 한편, 단계 (c)에서는, 동물세포 배양에서 통상적으로 이용되며 동물세포의 부착이 가능한 조직 배양 디쉬, 멀티 웰 플레이트 또는 폴리-L-라이신 코팅-유리 커버슬립이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어 혈청, 완충액 및 항산화제 등을 포함하는 α-MEM 배지를 이용할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 그 유도체의 줄기세포 분화 유도 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 화합물에 속하는 12 가지 화합물(화학식 3 내지 화학식 14의 화합물)을 마우스 배아줄기세포주인 KH2세포에 처리하여 α-미오신 중쇄에 의한 EGFP의 형광발현을 확인하였고, 심장근육세포 특이적 마커 유전자인 Nkx2.5 및 GATA4, MLC-2V 및 α-MHC 의 발현을 전기 영동으로 확인하였다 (도 1 및 도 2). 또한, 면역조직화학염색에 의하여 EGFP를 발현하는 세포(녹색 형광)가 곧 심장근육세포임을 확인하였다 (도 4). 또한, 본 발명의 화합물에 농도 의존적으로 줄기세포의 분화가 유도됨을 확인하였다 (도 5).

또한, 본 발명의 실시예에서는 박동하는 심장근육세포의 생성율 및 심근세포 표지자들의 발현을 나타내는 형광면역염색을 통하여, 본 발명의 화합물 및 그 유도체가 마우스 배아 줄기세포뿐만 아니라 인간 배아 줄기세포에서도 탁월한 분화 유 도 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (도 7 및 도 8).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체를 포함하는, 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하기 위한 배지조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 줄기세포 분화유도제로서 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체를 단독으로 포함할 수도 있고, 또는 다른 분화유도제를 추가적으로 포함하여 이들 분화유도제 사이에 상승적인(synergic) 효과가 발생되도록 할 수 있다. 본 발명의 조성물에 추가적으로 사용할 수 있는 분화유도제는 줄기세포의 분화유도제로 알려진 어떠한 것도 가능하며, 바람직하게는 레티노산(retinoic acid) 및 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 등을 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 배지 조성물 내에 0.1 μM 내지 100 μM의 농도로 포함되는 것이 좋다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도 방법에 의하여 제조된 심장근육세포에 관한 것이다.

상기 분화 유도 방법에 의해 배아 줄기세포를 포함하는 줄기세포로부터 분화 유도된 심장근육세포는, 공지 방법에 따라 계속적으로 세포 회수, 분리 및 정제함으로써 고순도의 심장근육세포를 효율적이면서도 다량으로 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 심장근육세포를 이하에서는 본 발명에 의해 제조된 심장근육세포라고 한다.

심장근육세포의 정제는 공지된 세포 분리 및 정제 방법을 모두 적용할 수 있으며, 그 구체적 예로는 유세포 측정기나 자석비드 또는 패닝법 등의 항원-항체 반응에 준한 방법(Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition (Acad. Press, 1993); Antibody Engineering: A Practical Approach(IRL Pressat Oxford University Press, 1996)), 수크로스 또는 페르콜(Percoll) 등의 담체를 이용한 밀도 구배 원심에 의한 세포 분화법을 들 수 있다. 또한, 심장근육세포의 선별법으로서, 근본이 되는 배아 줄기세포 등의 다능성 줄기세포의 유전자에 미리 인위적인 수정을 가하여 약제 내성 또는 이소성 단백질의 발현능을 부여함으로써 심장근육세포로서의 형질을 가지는 세포를 회수하는 방법을 들 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 심장근육세포를 유효성분으로 포함하는 심잘 질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 질환은 심장근육세포의 손상에 의해 유발되는 모든 심장 질환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 심장 질환은 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염 및 만성 심부전 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로서, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카싱아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세하게 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은, 본 발명에 의해 제조된 심장근육세포를 높은 순도로 포함하는 것이면, 세포를 배지 등의 수성 담체에 부유시킨 것, 세포를 생체 분해성 기질 등의 지지체에 내포시킨 것, 또는 단층 또는 다층의 심장근육세포 시트(Shimizu et al., Circ. Res. 90: e40, 2002)로 가공한 것 등의 어떤 형상이든 사용할 수 있다. 또한, 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사 등에 의해 투여될 수 있고, 국소 주입이 가장 바람직한 투여방법이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 개흉한 뒤 주사기를 이용하여 직접 심장에 주입하는 방법, 심장의 일부를 외과적으로 절개하여 이식하는 방법, 또는 카테터를 이용한 경혈관적 방법에 의해 이식하는 방법 등(Murry et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 67: 519, 2002; Menasche, Ann. Thorac. Surg., 75: S20, 2003; Dowell et al., Cardiovasc. Res., 58: 336, 2003)으로 장해 부위에 수송할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 방법으로 태아 심장으로부터 회수한 심장근육세포를 심장 상해 동물의 심장에 이식하면, 상당히 양호한 치료 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Menasche, Ann. Thorac. Surg. 75: S20, 2003; Reffelmann et al., Heart Fail. Rev. 8: 201, 2003). 배아 줄기세포 유래의 심장근육세포는 태아 심장 유래의 심장근육세포와 상당히 유사한 형질을 나타낸다(Maltsev et al., Mech. Dev. 44: 41, 1993; Circ. Res. 75: 233, 1994). 또한, 실제로 배아 줄기세포 유래의 심장근육세포를 성체 심장에 이식한 동물 실험예에서, 태아 심근을 이식한 예와 거의 동일하게 매우 높은 생착성을 나타낸다는 것도 확인되었다(Klug et al., J. Clin. Invest. 98: 216, 1996). 따라서, 심장근육세포의 쇠퇴 및 소실로 인한 상기의 심질환에 있어서, 본 발명에 기재된 방법에 의해 제조한 심장근육세포를 질환성 심장 조직에 보충적으로 이식함으로써, 심기능 개선의 촉진을 기대할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 심장근육세포를 포함하는, 심장근육세포의 발생 유도, 분화 유도, 재생 또는 생존을 촉진하는 후보물질을 검정하기 위한 키트, 및 그러한 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 제조된 심장근육세포는, 각종 생리 활성물질(예, 약물)이나 기능이 알려지지 않은 신규 유전자 산물 등의 약리 평가 및 활성 평가에 유용하다. 예를 들면, 배아 줄기세포 등의 다능성 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화 제어에 관여하는 물질이나 약제, 또는 심장근육세포의 기능 조절과 관련된 물질이나 약제, 또는 심장근육세포에 독성이나 장애성을 나타내는 물질이나 약제의 스크리닝에 이용할 수 있다. 특히, 현재 인간 심장근육세포를 이용한 스크리닝 방법은 거의 없으므로, 본 발명에 의해 제조된 심장근육세포는 이러한 스크리닝 방법을 실시하기 위한 유용한 세포 재료가 된다. 다른 예로, 본 발명에 의해 제조된 심장근육세포를 포함하는 검정 키트는, 상기 스크리닝에 유용하다.

스크리닝에 제공되는 피시험 물질은, 배양 시스템에 첨가가능한 임의의 종류의 것일 수 있으며, 예를 들면, 저분자 화합물, 고분자 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩티드, 유전자, 바이러스, 세포, 세포 배양액 및 미생물 배양액 등이 있다. 유전자를 효율적으로 배양 시스템에 도입하는 방법으로는, RNA 종양 바이러스, 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터를 이용한 배양 시스템에 첨가하는 방법, 또는 리포솜 등의 인공적 구조물에 밀봉하여 배양 시스템에 첨가하는 방법 등이 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에서 줄기세로부터 심장근육세포로의 분화를 억제 또는 유도하는 후보물질을 스크리닝하는 방법은, (ⅰ) 본 발명의 화합물을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 배지 조성물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 상기 배지에 피시험 물질을 처리하는 단계; 및 (ⅲ) 피시험 물질을 처 리하기 전과 처리한 후에 줄기세로부터 심장근육세포로의 분화 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

피시험 물질의 심장근육 분화 유도 효율은, 본 발명에 기재된 방법을 이용하여 배양 중인 줄기세포를, 배양 개시 후 5 내지 15 일째, 바람직하게는 7 내지 12 일째에 심장근육세포 특이적인 각종 마커의 발현을 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출함으로써 측정할 수 있다. 생화학적 또는 면역화학적 방법은 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 면역조직 화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은 면역화학적 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 심장근육세포의 심기능을 억제 또는 향상시키는 후보물질을 스크리닝하는 방법은, (ⅰ) 제 1항의 방법에 의하여 심장근육세포를 얻는 단계; (ⅱ) 상기 심장근육세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (ⅲ) 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후에 심장근육세포의 심기능을 측정하는 단계를 포함한다.

피시험 물질을 검정하는 지표인 심장근육세포의 심기능은 일예로 심장근육세포의 생존성을 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 기재된 방법에 의해 제조된 심장근육세포를 적절한 세포 밀도로 배양 플레이트에 접종하고, 혈청 무첨가 배지에서 배양하면, 세포자살(apoptosis)이 유도될 수 있지만, 이 때, 적당량의 피시험 물질을 배지에 첨가하여 심장근육세포의 생존률 또는 사망률을 측정하면 된다. 심장근육세포의 생존률 또는 사망률은, 트리팬블루 등의 색소의 취입을 지표로 하는 육안 관찰에 의해 측정할 수 있으며, 탈수소 산소의 활성(환원 활성)을 지표로 하는 방법, 또는 세포자살 세포에 특이적인 카스파제 활성이나 아넥신 V의 발현을 지 표로 하는 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 기작을 이용하는 키트들이, Sigma 사나 Clonetech 사, Promega 사 등의 많은 브랜드에서 시판되고 있으므로, 용이하게 사용할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 의해 수득된 물질 또는 약제는, 심장근육세포의 분화 유도 작용이나 기능 조절 작용을 가지므로, 예를 들면, 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염 및 만성 심부전 등의 심질환의 예방제 또는 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명에서 제시하는 화합물과 그 유도체들은 다양한 원인에 의한 심장기능저하가 진행되는 것을 방지하거나 회복시키기 위하여 사용될 수 있으며, 세포치료제로서 사용하거나 연구하는 데 있어서 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1. 시료화합물에 의한 마우스 배아 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화 유도 효과 확인

1-1. 면역형광법에 의한 확인

본 발명의 구체적인 실험에서는 마우스 배아 줄기세포주인 KH2를 이용하였다. KH2 세포는 마우스 배아줄기세포로서 심장근육세포에 특이적으로 발현하는 마커인 α-미오신 중쇄(α-MHC) 유전자의 프로모터에 의하여 증강된 녹색 형광성 단백질(enhanced green fluorescence protein, EGFP)이 발현되도록 유전적으로 조작된 배아 줄기세포로서, 미분화상태에서는 EGFP를 발현하지 않으나, 분화되어 심장근육세포로 분화되는 경우에만 EGFP를 발현하는 세포이다.

KH2 세포를 이용하여 다음과 같이 배아체(embryoid body, EB)를 만들었다. 우선, 배아체는 분화 배지 25 ㎕속에 800 개의 세포가 포함되도록 세포부유액을 만들어 배양접시의 뚜껑에 25 ㎕의 방울을 만들어 매달린 상태로 3일간 배양하여 만들었다. 만들어진 배아체 3 개를 분화 배지 225 ㎕와 함께 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣었다. 실험하고자 하는 각각의 화합물은 10 mM이 되도록 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 스톡(stock) 용액으로 만들었다. 스톡 용액을 이용하여 시험하고자 하는 농도의 10 배 농도가 되도록 분화 배지로 희석하였다. 이렇게 준비한 10 배액을 상기에서 준비한 96 웰 플레이트의 각 웰에 25 ㎕씩 넣고 잘 혼합하였다. 12 일 간 배양하면서 배양액을 교환해 주었는데, 배양액의 교환은 처음 4 일간은 2 일마다 실시하고, 그 이후부터는 매일 교환해 주었다. 배지교환 방법은, 먼저 각 웰에서 200 ㎕씩 배지를 덜어내고, 180 ㎕의 분화 배지를 넣어주고, 상기에서 준비한 것과 같은 방법으로 3일 이내에 준비한 10 배농도의 화합물 배지를 20 ㎕씩 넣어주고 잘 혼합하는 방법으로 하였다. 배양 마지막날에는 96 웰 플레이트의 각 웰에서 모든 배지를 제거하고, 200 ㎕의 PBS로 3 회 세척하였다. 각 웰에 0.05% 의 트립신 용액을 50 ㎕씩 넣고 3 분간 36 ℃ 배양기에서 배양한 후, 마이크로피펫을 이용하여 개별세포로 분리하였다. 분리한 세포에 1 %의 포르말린-PBS 용액을 200 ㎕씩 각 웰에 분주하고 10 분간 실온에서 방치하였다. 분리한 세포를 FACS칼리버를 이용하여 EGFP 형광발현을 분석하였다.

그 결과, 표 1 및 도 1에서 보는 바와 같이 12 가지 실험물질 모두 유의한 심근분화 촉진효과를 나타내었다.

12 가지 화합물의 심근분화 촉진 효과

No	Id	(1차실험시) Purity(%)	1차실험결과 (5μM)	2차실험결과 (실험농도,μM)	3차실험결과
No	Id	(1차실험시) Purity(%)	1차실험결과 (5μM)	2차실험결과 (실험농도,μM)	1.0 μM	10.0 μM
1	30986	100		37.4 (10)	1.7	15.9
2	30980	90	31.8	41.4 (10)	21.4	24.1
3	30981	100	80	35.5 (1)	16.1	19.6
4	30983	90	57	45.5 (10)	15.6	30.4
5	30984	80	95.4	40.5 (1)	22.0	50.3
6	30985	100	80.6	28.8 (1)	15.3	23.4
7	30987	100	79.1	42.3 (10)	5.1	17.1
8	31002	95	97	43.0 (1)	20.0	51.0
9	117928	85	14.9	41.7 (10)	20.9	27.7
10	117933		79.1	38.3 (1)	12.6	21.8
11	117947		92.3	36.5 (1)	3.2	12.7
12	117970	95	85.2	37.4 (1)	6.5	24.3

1-2. 전기 영동법에 의한 확인

배아줄기세포인 KH2 세포로부터 심장근육세포로 분화를 유도하는 과정에서 화학식 3의 화합물(30986)을 첨가하였을 때 나타나는 심장근육세포 분화 관련 유전자들의 발현을 분석하였다. 유전자발현 분석은 총 RNA를 세포에서 분리한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하여 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase-chain reaction)법으로 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 초기 심장근육세포 분화에 관련된 것으로 알려진 Nkx2.5 및 GATA4는 대조군에 비하여 화학식 3의 화합물을 처리한 세포에서 높은 수준의 발현상태를 유지하는 것을 알 수 있었다. 한편, 심장근육세포의 마커로 사용되는 심장근육세포를 구성하는 성분인 MLC-2V 및 α-MHC는 분화가 진행됨에 따라 대조군에 비하여 높은 수준의 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 배아줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 결정짓는 과정에서 지속적으로 본 발명의 시료화합물을 유지시켜주면, 심장근육세포로의 분화가 촉진된다는 것을 알 수 있다.

실시예 2. 시료화합물의 처리 시기에 따른 마우스 배아 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화 유도

시료화합물의 처리시기에 따른 실험성적을 알아보기 위하여, 분화유도 당일에서 15일까지 시기별로 화학식 3의 화합물(30986)을 각각 10.0 μM씩 처리하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 3일에서 15일까지 화합물을 처리한 실험군과 5일에서 15일까지 화합물을 처리한 실험군 및 8일에서 15일까지 화합물을 처리한 실험군에서 유사한 정도의 분화유도 성적을 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 이 본 발명의 화합물이 분화유도의 후기에 주로 작용할 가능성을 나타내는 것이며, 분화된 세포의 증식을 촉진할 가능성을 나타내는 것이다.

실시예 3. 시료화합물을 처리한 마우스 배아 줄기세포에서 EGFP 발현 세포가 심장근육세포임을 확인

분화배지에 화학식 10의 화합물(31002) 10 uM을 분화유도 3일에서 15일까지 처리하여 얻은 KH2 세포에서, 심장근육세포 마커인 α-엑티닌, α-미오신 중쇄(α-MHC) 및 트로포닌 T 에 대한 면역조직화학염색(red color)을 실시하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 녹색형광을 나타내는 세포 (EGFP 양성세포)는 모두 심장근육세포 마커들을 발현하고 있음을 확인하였다. 따라서 마우스 배아 줄기세포에서 EGFP를 발현하는 세포가 심장근육세포임을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 시료화합물의 농도에 따른 마우스 배아 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화 유도 효과

시료화합물이 나타내는 배아줄기세포에서 심장근육세포로 분화를 촉진하는 효과가 농도의존적인지를 알아보기 위하여, 화학식 3의 화합물(30986)을 이용하여 실험하였다. 즉, 배아 줄기세포인 KH2 세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는 과정(3 내지 15 일 동안)에서 0 uM, 0.2 uM, 1.0 uM, 5.0 uM 및 25.0 uM 의 농도로 각각 화학식 3의 화합물을 첨가하여 분화를 유도하고, 15 일째에 분화되어 나타나는 심장근육세포를 EGFP 발현으로 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 농도의존적으로 심장근육세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 인간 배아 줄기세포에서 시료화합물(31002 및 30986)이 나타내는 심장근육세포 분화 촉진 효과

인간 배아 줄기세포를 심장근육세포로 분화시키면서 화학식 3의 화합물(30986) 및 화학식 10의 화합물(31002)의 심장근육세포 분화 촉진 효과를 분석하였다. 인간배아줄기세포에서 배아체를 만들어 배양접시에 부착시키고 시료화합물 31002 또는 30986을 10 uM이 되도록 배지에 첨가하여 2 일간 배양하였다. 배양 후에, 심장근육세포의 특징인 박동하는 세포가 나타나는 배아체의 숫자를 계산하였다. 이와 같은 실험 과정이 도 6에 나타나 있다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 화학식 3의 화합물(30986) 또는 화학식 10의 화합물(31002)를 처리한 배아체에서, 시료를 처리하지 않은 배아체에 비하여 박동소를 나타내는 배아체의 비율이 유의하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 시료화합물을 처리한 후에 나타나는 박동소에서 심장근육세포의 특성을 가지는 세포가 존재하는지를 알아보기 위하여, 심장근육세포의 마커 유전자들의 발현을 면역세포형광염색법으로 분석하였다. 위에서와 같이 2 일간 화학식 3의 화합물(30986) 및 화학식 10의 화합물(31002)을 처리한 세포를 고정하고, 박동하는 세포괴와 박동하지 않는 세포괴에서 심장근육세포의 마커유전자인 ANP 및 트로포닌 T의 발현을 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 박동소를 가지는 세포괴에서 ANP 및 트로포닌 T 모두 뚜렷하게 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 화학식 3의 화합물(30986) 및 화학식 10의 화합물(31002)이 심장근육세포의 분화를 촉진한다는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 화합물에 속하는 12 가지 화합물에 의한, 마우스 배아줄기세포주인 KH2세포로부터 심장근육세포로의 분화 유발 효과를 면역형광법에 의하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 화학식 3의 화합물(30986) 에 의한, 마우스 배아줄기세포주인 KH2세포로부터 심장근육세포로의 분화 유발 효과를 확인하기 위하여, 심장근육세포 특이적 발현 유전자인 Nkx2.5 및 GATA4, MLC-2V 및 α-MHC 의 발현 여부를 전기 영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 화학식 3의 화합물(30986) 에 처리 시기에 따른, 마우스 배아줄기세포주인 KH2세포로부터 심장근육세포로의 분화 유발 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 화학식 10의 화합물(31002)을 처리한 마우스 배아 줄기세포에서 EGFP 발현 세포(녹색 형광)에서 심장근육세포 특이적 마커(α-엑티닌, α-미오신 중쇄 및 트로포닌 T)가 동시에 발현(적색 형광)됨을 보여주는 면역조직화학염색 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 마우스 배아 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화 유도 효과가 시료 화합물에 대하여 농도의존적임을 보여주는 실험결과이다.

도 6은 인간 배아 줄기세포에서 배아체(EB) 형성을 통한 심근분화 유도 과정을 나타낸 것이다.

도 7은 화학식 3의 화합물(30986) 또는 화학식 10의 화합물(31002)을 처리한 인간 배아줄기세포에서, 박동하는 심장근육세포의 비율을 나타낸 것이다.

도 8은 화학식 3의 화합물(30986) 또는 화학식 10의 화합물(31002)을 처리한 인간 배아줄기세포에서, 박동하는 심장근육세포에서 심장근육세포 특이적인 마커유전자인 ANP 및 트로포닌 T가 발현됨을 확인한 면역세포형광염색 결과를 나타낸 것이다.

에서 심장근육세포로 분화시키는 과정에서 compound의 촉진적 효과를 나타내고 있다

Claims

화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체의 존재 하에 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하는 방법:

상기 화학식에서, R₁ 은 수소, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 할라이드, 니트로, 시아노기, 알콕시카르보닐, 아미노기, 아세트아미도기 및 치환되거나 치환되지 않은 아릴기 또는 헤테로아릴기로 구성되는 군으로부터 선택되며, R2, R3 및 R4는 서로 같거나 다른 것으로 수소, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 할라이드, 니트로, 시아노기 및 알콕시카르보닐기로 구성되는 군에서 선택되며, X는 C, N, O 또는 S 이다.
제 1항에 있어서, 상기 화합물 또는 그 유도체는 화학식 3 내지 화학식 14로 표시되는 하기의 화합물 중 하나인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 심장근육세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포인 방법.
화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 그 유도체를 포함하는, 줄기세포로부터 심장근육세포로의 분화를 유도하기 위한 조성물:

상기 화학식에서, R₁ 은 수소, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 할라이드, 니트로, 시아노기, 알콕시카르보닐, 아미노기, 아세트아미도기 및 치환되거나 치환되지 않은 아릴기 또는 헤테로아릴기로 구성되는 군으로부터 선택되며, R2, R3 및 R4는 서로 같거나 다른 것으로 수소, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 할라이드, 니트로, 시아 노기 및 알콕시카르보닐기로 구성되는 군에서 선택되며, X는 C, N, O 또는 S 이다.
제 5항에 있어서, 상기 화합물 또는 유도체는 화학식 3 내지 화학식 14로 표시되는 하기의 화합물 중 하나인 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 줄기세포는 심장근육세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포인 것인 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포인 조성물.
제 1항의 방법에 의하여 제조된 심장근육세포.
제 9항의 심장근육세포를 유효성분으로 포함하는 심장 질환 치료용 약제학적 조성물.
(ⅰ) 본 발명의 화합물을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 배지 조성물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 상기 배지에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (ⅲ) 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후에 줄기세로부터 심장근육세포로의 분화 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 줄기세로부터 심장근육세포로의 분화를 억제 또는 유도하는 후보물질을 스크리닝하는 방법.
(ⅰ) 제 1항의 방법에 의하여 심장근육세포를 얻는 단계; (ⅱ) 상기 심장근육세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (ⅲ) 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후에 심장근육세포의 심기능을 측정하는 단계를 포함하는, 심장근육세포의 심기능을 억제 또는 향상시키는 후보물질을 스크리닝하는 방법.