WO2004094477A1 - Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliosido n-glicolil gm3 y su uso para diagnostico y tratamiento de tumores. - Google Patents

Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliosido n-glicolil gm3 y su uso para diagnostico y tratamiento de tumores. Download PDF

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Loudes Tatiana Roque Navarro
Cristina María Mateo De Acosta Del Rio
Mabel RODRÍGUEZ GONZALEZ
Gertrudis Rojas Dorantes
Ariel TALAVERA PÉREZ
Ernesto Moreno Frias
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Centro De Inmunologia Molecular
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Definitions

  • the present invention is fundamentally related to Immunology and in particular to obtaining less immunogenic immunoglobulins by means of genetic engineering for use in the treatment of cancer. More specifically, the present invention relates to peptide sequences encoding a recombinant monoclonal antibody or fragments derived therefrom that specifically recognize antigens containing the ganglioside N-glycolyl GM3 and not other gangliosides of the N-glycolyl or N-acetyl type, or a sulfated glycolipids.
  • Prior art is fundamentally related to Immunology and in particular to obtaining less immunogenic immunoglobulins by means of genetic engineering for use in the treatment of cancer. More specifically, the present invention relates to peptide sequences encoding a recombinant monoclonal antibody or fragments derived therefrom that specifically recognize antigens containing the ganglioside N-glycolyl GM3 and not other gangliosides of the N-glycolyl or N
  • Gangliosides are glyphosphingolipds that contain sialic acid and are present in vertebrate plasma membranes (Stults CLM and cois. Methods Enzymology 179: 167-214, 1989). Some of these molecules have been reported in the literature as antigens associated with tumors or tumor markers (Hakamori SH: Curr Opin Immunol 3: 646-653, 1991), so the use of anti-ganglioside antibodies has been described as useful in the diagnosis and therapeutics of cancer (Hougton AN et al. PNAS USA 82: 1242-1246, 1985; Zhang S et al. Int J Cancer 73: 42-49, 1997).
  • NGc N-acetyl
  • NGc N-glycolyl
  • Patent application EP 0972782 A1 describes the murine monoclonal antibody 14F7, produced by the hybridoma deposited according to the Budapest treaty under accession number ECACC 98101901.
  • This monoclonal antibody has isotype lgG1 and was generated from the immunization of Balb / mice.
  • VLDL low density lipoproteins
  • said antibody binds preferentially to the NGcGM3 ganglioside, and recognizes an antigen expressed in human breast and melanoma tumors (Carr A et al, Hybridoma 19: 3: 241-247, 2000).
  • non-human monoclonal antibodies such as murine 14F7
  • murine monoclonal antibodies have certain disadvantages for treating humans, particularly in a repetitive therapeutic scheme.
  • murine monoclonal antibodies have a relatively short half-life in blood, in addition to losing important immunological properties such as effector functions when used in humans.
  • murine monoclonal antibodies contain considerable amino acid sequences that are immunogenic when injected into humans. Numerous studies have shown that, after administration of a foreign antibody, the immune response produced in the patient can be considerably strong and substantially eliminate the therapeutic utility of the antibody after an initial treatment.
  • the construction of mini-libraries of antibody fragments exposed on filamentous phages from the ibridomas allows the selection of molecules with the capacity of specific recognition of the antigen within this repertoire.
  • the objective is the rapid obtaining of antibody fragments that combine the recognition of the original antibody with a smaller molecular size and the ability to be produced by a bacterial host.
  • This technique allows to discard the multiple variants of non-functional or impossible to produce antibody fragments in bacteria that are obtained during the isolation and manipulation of the genes of the variable regions of a hybridoma by conventional cloning techniques (Roovers, R. OY cois Br. J. Cancer. 78, 1407-1416, 1998).
  • the exchange of chains allows modifying the properties of the binding site and also combining sequences of immunoglobulins from different species, and selecting those variants that retain the specificity of recognition.
  • Steinberger, P. and cois. J. Biol. Chem. 275,36073-36078, 2000, Rader, C. and cois. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95,8910-8915, 1998, Beiboer, SWH et al. J. Mol. Biol. 296,833-849, 2000).
  • the present invention relates to a modified antibody derived from murine antibody 14F7, which recognizes the original antigen with equal affinity and is less immunogenic when administered to patients.
  • Another finding of the present invention has been the obtaining of fragments derived from said antibody that comprise variable light chain regions different from the original, but retain their properties as regards specificity, affinity, and recognition, and can be expressed by a Bacterial host both in the form of soluble molecules and presented on the surface of filamentous phages. Fragments derived from the 14F7 antibody are useful as therapeutic weapons. Additionally, the expression of scFv fragments of the 14F7 antibody on the surface of an M13 filamentous phage allows manipulating its binding site and obtaining higher affinity variants for therapeutic purposes. Another object of the present invention is the characterization of antibody fragments that only partially retain the 14F7 sequence, but retain their properties as regards specificity, affinity, and recognition.
  • Both the modified antibody and the fragments obtained specifically recognize tumor cells that express the NGcGM3 antigen, which allows it to be used in the diagnosis or therapy of said tumors and have the advantage over the murine antibody from which they originated, which are less immunogenic
  • Objects of the present invention are novel pharmaceutical compositions which comprise the modified 14F7 antibody or its single chain Fv fragments, wherein said antibody or fragment may be linked to a radioactive isotope useful in the location or treatment of tumors expressing the antigen.
  • the object of the present invention is also a method for radioimmunodiagnostic or radioimmunotherapy of tumors expressing the ganglioside NGcGM3, where pharmaceutical compositions comprising the modified antibody 14F7 or its fragments bound to a radioactive isotope are used.
  • Detailed description of the invention are described in accordance of the invention.
  • a chimeric antibody derived from the murine monoclonal antibody 14F7 produced by the hybridoma with deposit number ECACC 98101901 is described, characterized in that the sequences of the hypervariable regions (CDRs) of the heavy and light chains are: HEAVY CHAIN
  • said chimeric antibody is characterized in that the sequences of the framework regions (FRs) of the heavy and light chains are:
  • FR3 KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR FR4: WGQGTTVTVSS
  • FR2 WYQQRTHESPRLLIK
  • FR3 GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC
  • the chimeric antibody is characterized in that it contains the human heavy chain constant region lgG1 and the human light chain constant region Ck.
  • the present invention relates to a modified antibody derived from murine monoclonal antibody 14F7 produced by the hybridoma with ECACC deposit number 98101901, characterized in that the regions of the heavy and light chain frames contain any of the following mutations :
  • Position 12 A by R Position 18 M by V Position 19 K by R Position 20 M by V Position 38 K by R Position 40 R by A Position 42: D by G Position 48 I by V
  • said modified antibody is characterized in that it contains the human lgG1 heavy chain constant region and the human Ck light chain constant region.
  • the present invention refers to single chain Fv fragments derived from the 14F7 antibody that comprise the sequence of the heavy chain variable region obtained from the hybridoma (ECACC deposit 98101901), and retain the recognition specificity from 14F7.
  • said Fv fragments include variable light chain regions from non-immunized mice or humans, different from the light chain variable region produced by said hybridoma, which allow their production by a bacterial host in the form of antibody fragments presented on phage filamentous or soluble molecules.
  • the present invention also relates to the cell lines that express the chimeric and humanized antibodies, and the bacterial clones that produce the fragments derived from 14F7.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions for the treatment and / or location and identification of malignant breast tumors, melanomas, their metastases and recurrences, characterized in that they contain one of the recombinant monoclonal antibodies or their fragments described herein. invention, as well as an excipient suitable for its application. Said antibody or fragment could be bound to a radioactive isotope, useful in the location and / or therapy of malignant tumors.
  • the present invention relates to the use of the described recombinant antibodies, for use in the manufacture of a pharmaceutical composition useful in the treatment and / or localization and identification of malignant tumors The detailed description of how to carry out and use the present invention is given below:
  • Murine antibody 14 F7 was obtained by immunization of Balb / c mice with the GM3 ganglioside (euGc) hydrophobic conjugated with low density lipoproteins and in the presence of Freund's adjuvant (EP 0972782 A1, Carr A and cois. Hybridoma 19: 3: 241-247, 2000).
  • RNA is obtained from 10 6 cells of the hybridoma producing the 14F7 monoclonal antibody (murine AcM, lgG1, which recognizes the ganglioside NGcGM3, using the TRIZOL extraction method (GIBCO BRL, NY), according to the constructions of the maker.
  • the synthesis of the complementary DNA (cDNA) and the amplification of the VH and VL variable regions are performed using the Access RT-PCR reagent kit (Promega, USA) according to the manufacturer's recommendations. Briefly, the reaction is carried out from 5 ⁇ g of RNA in the presence of 25 pmoles of the dT oiigonucleotide designed to hybridize in the poIyA tail of the RNA, and of the oligonucleotides corresponding to the ends of each variable region, VH and VK.
  • VH and VK RCPs are digested with the restriction enzymes Eco RV-Nhe I, for VH, and Eco RV-Sa / I for VK, and cloned into the respective expression vectors (Coloma MJ and cois. J Immunol Methods 152: 89-104, 1992).
  • the VH region is cloned into the PAH4604 vector which has a human lgG1 constant region included and as a selection marker the L-histidinol resistance gene.
  • the VK region is cloned into the PAG4622 vector, which carries a mycophenolic acid resistance gene and a human kappa constant region.
  • the resulting genetic constructs are named 14F7VH-PAH4604 and 14F7VK-PAG4622, respectively.
  • NS0 cells are electroporated with 10 ⁇ g of 14F7VH-PAH4604 and 10 ⁇ g of 14F7VK-PAG4622 linearized with the enzyme Pv I.
  • the DNAs are precipitated with ethanol, mixed and dissolved in 50 ⁇ L of SSTF (phosphate buffered saline). Approximately 10 7 cells are grown to semiconfluence and collected by centrifugation, subsequently resuspended in 0.5 mL of SSTF together with the DNA in an electroporation cuvette. After 10 min on ice the cells are subjected to a pulse of 200 V and 960 F, and kept on ice for 10 min.
  • SSTF phosphate buffered saline
  • the cells are grown in 96-well plates in selective medium, Modified Dulbecco (DMEM-F12) with 10% fetal calf serum (SFT) and 10 mM L-histidinoI. Transfected clones become visible 10 days after the selection medium is added.
  • DMEM-F12 Modified Dulbecco
  • SFT fetal calf serum
  • chimeric immunoglobulin is determined by ELISA based on the supernatant of the clones.
  • polystyrene plates High binding, Costar
  • human anti-IgG goat serum Sigma
  • SSTF-t phosphate buffered saline, 0.5% Tween-20, pH 7.5
  • culture supernatant samples diluted in SSTF-t-SFT are added for one hour at 37 ° C.
  • the plates are washed again with SSTF-t and incubated with a goat serum anti-peroxidase-conjugated human kappa chain (Jackson), one hour at 37 ° C.
  • the plates are subsequently washed in the same manner and incubated with a citrate phosphate buffer solution pH 4.2 which contains the o-phenylenediamine substrate. After 15 min the absorbance is measured at 492 nm.
  • the ability of antigen recognition by the chimeric antibody is verified by a competitive ELISA using the gangliosides NGcGM3 and NAcGM3.
  • polystyrene plates (Polysorp, Nunc) are coated with 50 ⁇ L of a solution at 4 ⁇ g / mL of NGcGM3 or NAcGM3 in methanol and incubated for one hour at 37 ° C. They are blocked with 200 ⁇ L of a 1% bovine serum albumin (SAB) solution in Tris-HCI buffer, pH 7.8-8.0 for one hour at 37 ° C.
  • SAB bovine serum albumin
  • variable domains of 14F7 are analyzed with the AMPHI Program (Margalit H et al. J Immunol 138: 2213-2229, 1987), which allows the identification of segments of 7 or 1 1 amino acids with an unfriendly helix structure, which has been related to T immunogenicity.
  • AMPHI Program Margalit H et al. J Immunol 138: 2213-2229, 1987
  • These algorithms in this case predict fragments related to the presentation of T epitopes in the variable regions of the heavy and light chains of the murine monoclonal antibody 14F7.
  • variable domains of 14F7 are compared with the sequences of variable regions of human immunoglobulins reported, to identify the human immunoglobulin that has greater homology with the murine molecule under analysis.
  • SWISSPROT database available on the Internet can be used through the BLAST program (Altschul SF and cois. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402, 1997).
  • the essence of the method lies in achieving a reduction in immunogenicity by the rupture or humanization of the possible T epitopes, with a minimum of mutations in the FRs, specifically in those segments that have an unfriendly helix structure, excluding those positions involved with the three-dimensional structure of the antigen recognition site.
  • the sequences of the variable regions of VH and VL of the murine immunoglobulin are compared with the most homologous human and the residues that differ between the murine sequence and the human sequence are identified, only in the unfriendly segments remaining within the FR region (Kabat E, Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health, 1991). These "murine" residues will be susceptible to death due to the fact that they are in the same position in the human sequence.
  • the genetic constructs corresponding to the VH and VL regions of the 14F7hT antibody are obtained, by the method described above, they are cloned into the respective expression vectors, similar to that described above in the case of the construction of the chimeric Ac, obtaining the following genetic constructions: 14F7hTVK-PAG4622 and 14F7hTVH-PAH4604.
  • the transfection of these genes to cells NSO is exactly under the same conditions described for the chimeric antibody.
  • the clones that produce the humanized antibody are also detected by ELISA.
  • the specific recognition ability of the antigen by the humanized antibody is verified by a competitive ELISA using the gangliosides NGcGM3 and NAcGMS. The procedure is identical to that described for the chimeric antibody.
  • the messenger RNA is isolated from the 14F7 hybridoma cells, the complementary DNA is synthesized and the sequences corresponding to the heavy and light chain variable regions are amplified separately, using two sets of oligonucleotides designed to hybridize with a wide range of murine variable regions.
  • the amplified heavy chain variable regions are purified, digested with the appropriate enzymes and bound to the pHG-1 m fagomide vector (designed for the presentation of single chain antibodies on the surface of filamentous phage), previously digested with the same enzymes .
  • the products of the ligation reaction are purified and introduced by electroporation into bacteria of the TG1 strain of E.coli.
  • the transformed bacteria make up a semi-library of heavy chain variable regions of limited diversity (all from the 14F7 hybridoma).
  • the DNA corresponding to this semi-library is purified and ligated separately to collections of variable light chain regions (previously purified and digested with the appropriate enzymes).
  • the genetic constructions in bacteria of strain TG1 are introduced by electroporation, to form different types of independent libraries.
  • One of them is a mini-library of limited diversity built with the light chain variable regions also obtained from the 14F7 hybridoma cells.
  • Chain exchange libraries are also obtained, where the heavy chain variable regions from the hybridoma are combined with diverse collections of variable light chain regions obtained from murine and human lymphocytes.
  • Colonies are taken at random from each library to produce phages from them using the auxiliary phage M13 K07.
  • the recognition of N-glycolyl GM3 by phage carrying antibody fragments is directly analyzed through a solid phase immunoenzymatic assay (ELISA). Clones producing functional fragments are thus located.
  • ELISA solid phase immunoenzymatic assay
  • phage carrying antibody fragments are produced from the total mixture of transformed bacteria that each library forms.
  • the phage mixture obtained is contacted with the N-glycolyl GM3 antigen bound to a surface solid, the phage carrying antibody fragments with binding capacity are retained and the rest is removed by thorough washing.
  • the bound phages are eluted by a change in pH and multiplied to obtain a new phage mixture that serves as a starting material for a new cycle of selection on the antigen. After several cycles of selection, the recognition of antibody fragments presented on phages from colonies is analyzed. In this way, additional clones producing functional fragments are identified, which were diluted in the initial libraries.
  • the characterization of the antibody fragments produced by the Ions includes and analysis of their specificity by ELISA against a panel of related gangliosides, the study of tumor recognition by immunohistochemistry, the evaluation of their ability to be produced as antibody fragments. soluble functional, outside the context of its phage display, and the complete sequencing of its variable regions.
  • Example 1 Obtaining the Chimeric Monoclonal Antibody 14F7.
  • the cDNA synthesis and PCR amplification of the VH and VK murine variable regions was performed with the Vent Polymerase enzyme using specific oligonucleotides with Eco RV-A / ⁇ e I restriction sites for VH, and Eco RV-Sa / 1 for VK
  • the oligonucleotides used as primers were the following:
  • Oligonucleotide 1 (hybrid in the signal peptide): 5 'ggg gatatc cace atg gaa agg falls tgg ate ttt etc ttc ctg 3'
  • Oligonucleotide 2 (hybrid in JH1):
  • Oligonucleotide 1 (hybrid in the signal peptide): 5 'ggg gatatc cace atg gt (at) t (tc) c (ta) ca ect cag (at) t (ac) ctt gga ctt 3'
  • Oligonucleotide 2 (hybrid in VLJ5):
  • RV-Nhe I for VH
  • Eco RV-Sa / 1 for VK
  • PAH4604 and PAG4622 for VH and VK respectively.
  • the PAH4604 vector has the human constant region lgG1, and the PAG4622, a human kappa constant region. (Coloma J and cois J Immunol Methods 152: 89-104, 1992).
  • NS0 cells were electroporated with 10 ⁇ g of 14F7VH-PAH4604 and 10 ⁇ g of 14F7VK-PAG4622 linearized with the enzyme Pvu I.
  • the DNAs were precipitated with ethanol, mixed and dissolved in 50 ⁇ L of SSTF.
  • Approximately 10 7 cells grown to semiconfluence were collected by centrifugation and resuspended in 0.5 mL of SSTF together with the DNA in an electroporation cuvette. After 10 min on ice the cells were subjected to a pulse of 200 V and 960 F and incubated on ice for 10 min.
  • the cells were grown in 96-well plates in selective medium, Dulbecco Modified (DMEM-F12) with 10% SFT and 10 mM L-histidinol. Transfected clones become visible 10 days after the selection medium is added. The production of chimeric immunoglobulin is determined by ELISA based on the supernatant of the clones. For this, polystyrene plates (High binding, Costar) are coated with human anti-IgG goat serum (Sigma) in 100 mM bicarbonate carbonate buffer, pH 9.8, overnight at 4 ° C.
  • the reactivity of the chimeric (Ac) antibody of 14F7 was determined by means of a competitive ELISA.
  • Figure 2 shows the specificity of chimeric 14F7 compared to murine 14F7, in the recognition of polystyrene plates (Polysorp, Nunc) coated with the GM3 N-glycolylated ganglioside. Both Acs show at similar concentrations a 50% inhibition of the recognition of biotinylated murine Ac 14F7 to the antigen. While no immunoreactivity was observed when coating the plates with the N-acetylated variant of GM3 for any of the antibodies. The murine AcM ior-C5 was used as irrelevant Ac.
  • Example 3 Obtaining different versions of the humanized antibody.
  • VH and VK sequences of 14F7 were compared with a human sequence database, obtaining the human sequence with the highest homology with antibody 14F7, for the VH and VK region (Fig 1A and B). In both sequences, the unfriendly regions or potential T epitopes were also determined. Subsequently, the mutations necessary to convert the murine VH and VK sequences into humanized were determined, following this method of humanization of T epitopes. We next point out the maximum possible mutations that They can be done.
  • Oligonucleotide 1 5 'gtc cag ctt gtg cag tct ggg gct gaa gtg gta aaa cct ggg 3'
  • Oligonucleotide 2 5 'ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3'
  • Oligonucleotide 3 5 'ccc agg ttt tac falls ttc age ecc aga ctg falls aag ctg gac 3'
  • Oligonucleotides for mutations 18, 19 and 20 of the heavy chain are Oligonucleotides for mutations 18, 19 and 20 of the heavy chain:
  • Oligonucleotide 1 5 'ggg gee tea gtg agg gtg tec tgc agg 3'
  • Oligonucleotide 2 5 'ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3'
  • oligonucleotides 1 and 2, and 3 and 4, described for these mutations are shown below.
  • the overlapping of the products of the CPR was done in the same way described above.
  • Oligonucleotide 1 5 'falls tgg tta aga cag gca cct ggc cag ggt ctg 3'
  • Oligonucleotide 2 5 'ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3'
  • Oligonucleotide 3 5 'cag acc ctg gee agg tgc ctg tet taa cea gtg 3'
  • Oligonucleotide 4 5 'ggg gatatc hunt atg gaa agg falls tgg ate ttt etc ttc ctg 3 '
  • the mutations in position 48 were introduced to the DNAs carrying them, replacing amino acid I with V.
  • the oligonucleotides 1 and 2 are shown below, and the 3 and 4, used in this mutation.
  • the overlapping of the products of the CPRs was done in the same manner described above.
  • Oligonucleotides for heavy chain mutation 48 Oligonucleotide 1: 5 'ctg gaa tgg gtt gga tac att 3' Oligonucleotide 2: 5 ' ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3 ' Oligonucleotide 3: 5 'aat gta tec aac cea ttc cag 3 'Oligonucleotide 4: 5' ggg gatatc cace atg gaa agg falls tgg ate ttt etc ttc ctg 3 '
  • Oligonucleotides for mutations 39, 40, 41, and 42 of the light chain Oligonucleotide: 5 'tat caá caá aaa cea ggt cag tet cea agg 3' Oligonucleotide 2: 5 'age gtcgac tta cgt ttc age tec age ttg gtc ce 3' Oligonucleotide 3: 5 'cct tgg aga ctg acc tgg ttt tg ttg 3 'Oligonucleotide 4: 5' ggg gatatc cace atg gt (at) t (tc) c (ta) ca cct cag (at) t (ac) ctt gga ctt 3 'After sequence verification of the previous mutations, we proceeded to introduce a mutation at position 58 to the DNAs carrying them, substituting amino acid I
  • Oligonucleotides for the light chain mutation 58 Oligonucleotide 1: 5 'att tet ggg gtc ccc tec agg 3' Oligonucleotide 2: 5 'age gtcgac tta cgt ttc age tec age ttg gtc ce 3' Oligonucleotide 3: 5 'cct gga ggg gac ccc aga aat 3'
  • Oligonucleotide 4 5 'ggg gatatc cace atg gt (at) t (tc) c (ta) ca cct cag (at) t (ac) ctt gga ctt 3 '
  • the resulting genetic construct was named 14F7hTVK.
  • Humanized VK and VH regions were cloned into vectors PAG4622 and PAH4604, forming constructions 14F7hTVH-PAH4604 and 14F7hTVK-PAG4622, respectively.
  • NSO cells were electroporated with 10 ⁇ g of each of the vectors carrying the humanized variable regions, 14F7hTVH-PAH4604 and 14F7hTVK-PAG4622, previously linearized by digestion with Pvu I.
  • the electroporation process and detection of the clones expressing the humanized antibody 14F7hT was identical to that described for the chimeric antibody.
  • Example 4 Effect of Ac 14F7 on the decrease of tumor growth in an induction model of tumor angiogenesis in vivo.
  • the tumor line (melanoma B16) mixed with matrigel was used as an angiogenesis model in vivo as an inducer of angiogenesis.
  • B16 melanoma cells are mixed with 0.5 mL of matrigel and 64 units / mL of heparin, alone, in the control group, or in combination with antibodies, to be administered by subcutaneous injection into the abdominal region of the animals. 15 days after inoculation, the animals are sacrificed and the gels are removed along with dermis and epidermis residues and the tumor size is examined macroscopically. As seen in Figure 3, the tumors of mice treated with 14F7 dramatically decrease the size of the tumor mass.
  • RNA was isolated with the TriPure Isolation Reagent reagent (Boehringer Mannheim, Germany) from 5.0 x 10 6 cells of the 14F7 hybridoma and the complementary DNA was synthesized with the Pro-STAR First Strand RT-PCR kit (Stratagene reagent kit) , USA).
  • the heavy and light chain variable regions from the hybridoma were amplified by 26 cycles of the polymerase chain reaction, under the following conditions: 50 seconds at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, 1 minute at 72 ° O For this, all possible combinations of a set of degenerate oligonucleotides were used. (designed to hybridize with a wide variety of mouse variable regions), which are shown in the following table:
  • ga acc agt act cea ⁇ c ct ⁇ a ⁇ ⁇ c falls aga gac agt gac cag agt ccc 3'
  • ga acc agt act cea ⁇ c ct ⁇ a ⁇ ⁇ c c ⁇ a gga gac ggt gac tga ggt tec 3'
  • the amplified heavy chain variable regions were purified and digested sequentially with the restriction enzymes Sfi I and ApaLI.
  • the digestion products were purified and ligated with the pHG-1m fagomide vector DNA (Heber Biotec SA, Cuba) ( Figure 5).
  • bacteria of the TG1 strain of E.coli were transformed by electroporation.
  • the set of transformed bacteria formed a semi-library of heavy chain variable regions from the 14F7 hybridoma, with a moderate size of 2.3 x 10 4 members.
  • the semi-library plasmid DNA was purified and digested sequentially with the Not I and Sal I enzymes. This DNA was ligated separately with four collections of variable light chain regions, previously digested with the same enzymes.
  • Bacteria of strain TG1 were transformed with these new genetic constructs and four independent libraries were obtained. One of them was a mini-library of limited diversity that contained the variable regions, both heavy and light chain, from the 14F7 hybridoma, with a size of 1.6 x 10 6 individuals. The other three were chain exchange libraries that incorporated diverse collections of variable light chain regions previously obtained from mice (kappa isotype) and humans (kappa and lambda isotypes) and their sizes were 1.0 x 10 7 , 1.4 x 10 6 , and 1.2 x 10 6 members respectively.
  • Example 6 Isolation of clones producing antibody fragments against N-glycolyl GM3.
  • Phage carrying antibody fragments were produced from 92 randomly cloned clones of each library, in microtiter plate wells, according to procedures already described (Marks, JD et al. J. Mol. Biol. 222,581-597. 1991) . Its specificity was evaluated in an ELISA on polyvinyl chloride plates (Costar, USA) coated with N-glycolyl GM3 and N-acetyl GM3 at 1 ⁇ g / ml. The bound phages were detected with an anti-M13 monoclonal antibody conjugated to horseradish peroxidase (Amersham, Sweden).
  • phages were produced using the M13 K07 auxiliary phage, purified by precipitation with polyethylene glycol according to the aforementioned procedure and contacted with the N-glycolyl GM3 attached to a plastic surface (Immunotubes, Nunc, Denmark). The tubes were washed extensively and the phages were eluted in the presence of 100 mmol / l triethylamine. The eluate was neutralized and used to infect bacteria of the TG1 strain of E.coli.
  • Example 7 Characterization of antibody fragments derived from 14F7 that recognize N-glycolyl GM3
  • the variable regions of 11 antibody fragments were completely sequenced with an automatic sequencer ALF Express II (Pharmacia, Sweden), using oligonucleotides that hybridize in the regions of the pHG-1m vector flanking the 5 ' and 3 ' ends of the sequences encoding the inserted antibody fragments. It was confirmed that the sequence of the heavy chain variable region of all corresponds to that reported for 14F7, only changes in the framework 1 and framework 4 regions, presumably introduced by the use of degenerated oligonucleotides in the CPR. The rest of the sequences, including the three CDRs had no variations.
  • sequences of the light chain variable regions of the 11 clones were all different from that of 14F7 and were grouped into 5 different sequence groups, two of murine origin, one of human origin (kappa isotype) and two others of human origin, but of lambda isotype. A representative clone of each group of sequences was taken for later characterization.
  • the following table shows the differences between the light chain variable regions of the selected clones, in terms of their identity with the original, their origin and isotype and the classification is subgroups according to the Kabat classification.
  • Bound antibody fragments were detected using monoclonal antibody 9E10 (directed against the c-myc peptide that is fused in the gene construct to antibody fragments), at 10 ⁇ g / ml and a mouse anti-immunoglobulin conjugate (Sigma, EUS).
  • Antibody fragments were purified from periplasmic fractions in a single step of metal ion affinity chromatography using the HIS-Select HC Nickel Affinity Gel matrix (Sigma, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Figure 8 shows the activity determined by ELISA of the purified soluble fragments. Brief Description of the Figures.
  • FIG. 1 The amino acid sequence of the VH variable regions is shown in the figure
  • Figure 2 Recognition of the 14F7Q antibody measured by a competitive ELISA.
  • X axis Express the concentration of antibodies.
  • Y axis Absorbance measured at 492 nm
  • the ior C5 monoclonal antibody was used as a negative control.
  • Figure 4 A) Immunohistochemical study of the effect of the 14F7 Monoclonal Antibody on the formation of blood vessels. Arrows indicate immunolabelled vessels.
  • Figure 5 Diagram of the pHG-1m vector.
  • FIG. 6 Protein sequence of the VL regions of the 14F7 monoclonal antibody and of the selected single chain Fv fragments. The dots mean homology with the sequence of the VLs of 14F7.
  • Figure 7 Specificity of recognition by phage carrying antibody fragments. Inhibition of the binding of Ac 14F7 to the gangloside is observed by the fragments exposed in the phages.
  • the plates were coated with N-glycolyl GM3 and the phages were incubated with viral particles and various concentrations of 14F7.
  • X axis Ac concentration 14F7
  • Y axis Absorbance measured at 240 nm.

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Abstract

La presente invención se relaciona fundamentalmente con la producción de inmunoglobulinas menos inmunogénicas por la vía de la ingeniería genética, y mas específicamente con un anticuerpo monoclonal que reconoce antígenos que contienen el gangliósido N-glicolil GM3 y no otros gangliósidos del tipo N-glicolil o N-acetil, ni a los glicolípidos sulfatados. Mas específicamente la presente invención se relaciona con las secuencias peptídicas que codifican un anticuerpo monoclonal recombinante contra el ganliósido n-glicolil GM3, o fragmentos derivados del mismo y composiciones farmacéuticas conteniendo dicho anticuerpo o sus fragmentos y su uso tanto diagnostico o terapéutico en cáncer de mama y melanoma.

Description

ANTICUERPOS RECOMBINANTES Y FRAGMENTOS QUE RECONOCEN EL GANGLIOSIDO N-GLICOLIL GM3 Y SU USO PARA DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE TUMORES. Sector técnico. La presente Invención se relaciona fundamentalmente con la Inmunología y en particular con la obtención de inmunoglobulinas menos ¡nmunogénicas por la vía de la ingeniería genética para su uso en el tratamiento del cáncer. Más específicamente la presente invención se relaciona con las secuencias peptídicas que codifican un anticuerpo monoclonal recombinante o fragmentos derivados del mismo que reconocen específicamente antígenos que contienen el gangliósido N-glicolil GM3 y no otros gangliósidos del tipo N-glicolil o N- acetil, ni a los glicolípidos sulfatados. Técnica anterior.
Los gangliósidos son glicoesfingolípldos que contienen ácido siálico y que están presentes en las membranas plasmáticas de vertebrados (Stults CLM y cois. Methods Enzymology 179:167-214, 1989). Algunas de estas moléculas han sido reportadas en la literatura como antígenos asociados a tumores o marcadores tumorales (Hakamori SH: Curr Opin Immunol 3:646-653, 1991), por lo que se ha descrito el uso de anticuerpos anti-gangliósidos como útiles en el diagnóstico y terapéutica del cáncer (Hougton AN y cois. PNAS USA 82:1242- 1246, 1985; Zhang S y cois. Int J Cáncer 73:42-49, 1997). Los ácidos siálicos más comúnmente encontrados en células de animales son el N-acetil (NAc) y el N-glicolil (NGc) (Corfield AP y col, Cell Biol Monogr 10:5-50, 1982). En general el NGc no está expresado en tejidos normales de humanos y pollos, pero está ampliamente distribuido en otros vertebrados (Leeden RW y cois. Biological Role of Slalic Acld. Rosemberg A and Shengtrund CL (Eds). Plenum Press, New York, 1-48, 1976, Kawai T y cois. Cáncer Research 51 :1242-1246, 2001 ). Sin embargo, reportes de la literatura muestran que anticuerpos anti-NGc reconocen algunos tumores h umanos y l íneas de células tumorales (Higashi H y cois. Jpn J. Cáncer Res. 79:952-956, 1988, Fukui Y y cois. Biochem Biophys Res Commun 160:1149-1154, 1989). Se ha encontrado además un incremento de los niveles del gangliósido GM3 (NGc) en cáncer de mama humano (Marquina G y cois. Cáncer Research 56:5165-5171 , 1996), lo que hace francamente atractivo el uso de esta molécula como blanco para la terapia del cáncer.
La solicitud de patente EP 0972782 A1 describe el anticuerpo monoclonal murino 14F7, producido por el hibridoma depositado según el tratado de Budapest bajo el número de acceso ECACC 98101901. Este anticuerpo monoclonal tiene isotipo lgG1 y fue generado a partir de la inmunización de ratones Balb/c con el gangliósido NGcGMS conjugado hidrofóblcamente con lipoproteínas de baja densidad (VLDL) y en presencia de adyuvante de Freund, dicho anticuerpo se une preferentemente al gangliósido NGcGM3, y reconoce un antígeno expresado en tumores humanos de mama y melanoma (Carr A y col, Hybridoma 19:3:241-247, 2000). Este anticuerpo mostró una fuerte actividad citolítica sobre células portadoras de dicha secuencia, propiedad que podría convertirlo en un arma terapéutica. Por otra parte es conocido que la neovascularización inducida por los tumores constituye uno de los parámetros fundamentales en el control del crecimiento tumoral, lo cual ha dirigido las investigaciones hacia la búsqueda de nuevas armas terapéuticas relacionadas con la inhibición del proceso angiogénico. Existen evidencias experimentales del efecto del anticuerpo 14F7 sobre este proceso, dichas evidencias se han encontrado en ensayos con matrigel (Angiogenesis. Vol.4, Pags. 113-121, 2001; Anti-Cancer Res. Vol.18, Pags.783-790, 1998). El matrigel es una mezcla de proteínas constituyentes de la membrana basal y de la matriz extracelular que rodea a las células endoteliales. Su utilidad en el estudio del proceso de neovascularización radica en la importancia fisiológica de las interacciones endotelio- matriz durante el desarrollo de una nueva vasculatura. Igualmente componentes de este gel, como la laminina, se consideran marcadores importantes en este proceso. En el estudio de los mecanismos relacionados con la angiogénesis inducida por el tumor también ha sido muy utilizado este tipo de modelo, permitiendo evaluar fármacos capaces de modular los eventos relacionados directamente con el tumor para, de esta forma, influir en su crecimiento y metástasis.
El uso de anticuerpos monoclonales no-humanos, tales como el 14F7 murino, tiene ciertas desventajas para tratamiento de humanos, particularmente en un esquema terapéutico repetitivo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales murinos tienen un tiempo de vida media en sangre relativamente corto, además de que pierden importantes propiedades inmunológicas como son las funciones efectoras cuando son usados en humanos. Y lo que podría resultar de mayor Importancia, los anticuerpos monoclonales murinos contienen considerables secuencias de aminoácidos que resultan inmunogénicas cuando son inyectadas a humanos. Numerosos estudios han mostrado que, después de la administración de un anticuerpo extraño, la respuesta inmune producida en el paciente puede ser considerablemente fuerte y eliminar sustancialmente la utilidad terapéutica del anticuerpo después de un tratamiento inicial. Más aún, después de administrar tratamiento a un paciente con un anticuerpo monoclonal murino, tratamientos ulteriores con anticuerpos murinos no-relacionados podrían no ser efectivos e incluso peligrosos debido a la reactividad cruzada conocida como respuesta HAMA (Khazaeli, M.B., y cois. Journal of Immunotherapy 15: 42-52, 1994).
Mateo y colaboradores. (Patente Americana No. US 5 712 120) describen un procedimiento para la reducción de la inmunogenicidad de los anticuerpos murinos. El anticuerpo modificado por el método descrito por Mateo y colaboradores (Mateo C y cois. Hybridoma 19:6:463-471 , 2000), retiene la capacidad de reconocimiento y unión al antígeno del anticuerpo original y resulta menos ¡nmunogénico, lo cual incrementa su utilidad terapéutica. Mediante este procedimiento se logra, con un pequeño número de mutaciones, obtener anticuerpos modificados que muestran una reducción de la inmunogenicidad al ser comparados con el anticuerpo quimérico.
De lo antes expuesto se infiere la necesidad de obtención de versiones de los anticuerpos terapéuticos, que sean menos inmunogénicos en humanos, que se obtengan de forma sencilla y económica y que resulten adecuados para la fabricación de formulaciones terapéuticas u otros usos.
También es conocido que el uso de fragmentos de anticuerpos ha sido muy útil en el inmuno-diagnóstico de enfermedades. Ira Pastan entre otros (Solicitud de Patente Europea EP 0796334 A1 ) describe la construcción de fragmentos de tipo Fv de cadena sencilla usando las regiones variables de anticuerpos que reconocen específicamente el carbohidrato relacionado con el antígeno Lewis Y. Basándose en dichos fragmentos, desarrolla u n m étodo para d etectar células portadoras de dicho antígeno, también aporta evidencias del efecto inhibidor que estos fragmentos ejercen sobre células portadoras del antígeno. El conocimiento del sitio de unión del anticuerpo monoclonal 14F7 resulta interesante desde el punto de vista práctico y teórico, por el potencial de dicho anticuerpo en la ¡nmunoterapia de diversas enfermedades. Souriau, C y cois, en Expert Opin. Biol. Ther. 1 , 845-855, 2001 y Chester, K. A., y cois, en Dis. Markers. 16, 53-62, 2000, muestran que el uso de fragmentos de anticuerpos del tipo scFv podría resultar de gran utilidad terapéutica aprovechando sus propiedades farmacológicas tales como una mejor penetración en el tejido tumoral.
La construcción de mini-bibliotecas de fragmentos de anticuerpo expuestos sobre fagos filamentosos a partir d e h ibridomas, permite la selección d e m oléculas con capacidad d e reconocimiento específico del antígeno dentro de este repertorio. El objetivo es la obtención rápida de fragmentos de anticuerpos que combinan el reconocimiento del anticuerpo original con un menor tamaño molecular y la capacidad de ser producidos por un hospedero bacteriano. Esta técnica permite descartar las múltiples variantes de fragmentos de anticuerpo no funcionales o imposibles de producir en bacterias que se obtienen durante el aislamiento y la manipulación de los genes de las reglones variables de un hibridoma por técnicas convencionales de clonación (Roovers, R. O Y cois. Br. J. Cáncer. 78, 1407-1416, 1998).
La tecnología de presentación de fragmentos de anticuerpo en fagos filamentosos ofrece una oportunidad única para acceder al sitio de unión de un anticuerpo, así como para introducir modificaciones en el mismo con el objetivo de mejorar afinidad (Chames, P. y cois. J. Immunol. 161 , 5421-5429, 1998, Lamminmaki, U y cois. J. Mol. Biol. 291 , 589-602, 1999, Parhami-Seren y cois. J. Immunol. Methods. 259, 43-53, 2002) o modular su especificidad (Iba, Y. y cois. Prot. Engn., 11 , 361-370,1998, Miyazaki, O y cois. Prot. Engn. 12, 407-415, 1999, Darveau, R. P. y cois. J. Clin. Immunoassay. 15, 25-29, 1992). La expresión de fragmentos de anticuerpos en fagos filamentosos permite el intercambio de cadenas (Lantto, J. y cois. Methods Mol. Biol. 178, 303-316, 2002), es decir la combinación de diferentes VLs, con la VH original del anticuerpo o viceversa lo cual hace posible estudiar el papel que juega cada una de las cadenas en el reconocimiento del antígeno y su influencia en la afinidad del anticuerpo (Kabat, E. A., Wu, T. T., J. Immunol.
147, 1709-1719, 1991, Barbas III, C. F., Lerner, R. A. Methods: A companion to Methods in
Enzymology 2, 119-124,1991). El intercambio de cadenas permite modificar las propiedades del sitio de unión y también combinar secuencias de inmunoglobulinas provenientes de diferentes especies, y seleccionar aquellas variantes que conserven la especificidad de reconocimiento. (Klimka, A. Y cois. Br. J. Cáncer. 83, 252-260, 2000, Steinberger, P. y cois., J. Biol. Chem. 275,36073-36078, 2000, Rader, C. y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95,8910-8915, 1998, Beiboer, S. W. H. y cois. J. Mol. Biol. 296,833-849, 2000). La presente invención se refiere a un anticuerpo modificado derivado del anticuerpo murino 14F7, el cual reconoce el antígeno original con igual afinidad y resulta menos ¡nmunogénico cuando es administrado a pacientes. Otro hallazgo de la presente invención ha sido la obtención de fragmentos derivados de dicho anticuerpo que comprenden regiones variables de cadena ligera diferentes de la original, pero retienen sus propiedades en lo que concierne a especificidad, afinidad, y reconocimiento, y pueden ser expresados por un hospedero bacteriano tanto en forma de moléculas solubles como presentadas en la superficie de fagos filamentosos. Los fragmentos derivados del anticuerpo 14F7 son útiles como armas terapéuticas. Adicionalmente la expresión de fragmentos del tipo scFv del anticuerpo 14F7 sobre la superficie del un fago filamentoso M13 permite manipular su sitio de unión y obtener variantes de mayor afinidad con fines terapéuticos. Es otro objetivo de la presente invención la caracterización de fragmentos del anticuerpo que solo conservan parcialmente la secuencia del 14F7, pero retiene sus propiedades en lo que concierne a especificidad, afinidad, y reconocimiento.
Tanto el anticuerpo modificado como los fragmentos obtenidos, reconocen específicamente células tumorales que expresan el antígeno NGcGM3, lo cual permite que pueda ser usado en el diagnóstico o terapia de dichos tumores y tienen como ventaja sobre el anticuerpo murino del cual se originaron, que resultan menos inmunogénicos.
Son objetos de la presente invención nuevas composiciones farmacéuticas las cuales comprenden el anticuerpo modificado 14F7 o sus fragmentos Fv de cadena sencilla, donde dicho anticuerpo o fragmento puede estar enlazado a un isótopo radiactivo útil en la localización o tratamiento de tumores que expresen el antígeno. Es también objeto de la presente invención un método para el radioinmunodiagnóstico o radioinmunoterapia de tumores que expresen el gangliósido NGcGM3, donde sean utilizadas las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo modificado 14F7 ó sus fragmentos unidos a un isótopo radioactivo. Descripción detallada de la invención.
En la presente invención se describe un anticuerpo quimérico derivado del anticuerpo monoclonal murino 14F7 producido por el hlbridoma con número de depósito ECACC 98101901 , caracterizado porque las secuencias de las regiones hipervariables (CDRs) de las cadenas pesada y ligera son: CADENA PESADA
CDR1 SYWIH
CDR2, YIDPATAYTESNQKFKD
CDRS ESPRLRRGIYYYAMDY CADENA LIGERA
CDR1: RASQSISNNLH
CDR2: YASQSIS
CDR3: QQSNRWPLT
Preferiblemente dicho anticuerpo quimérico está caracterizado porque las secuencias de las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera son:
CADENA PESADA
FR1 : QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT
FR2: WLKQRPDQGLEWIG
FR3: KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR FR4: WGQGTTVTVSS
CADENA LIGERA
FR1 : DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC
FR2: WYQQRTHESPRLLIK FR3: GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC
FR4: FGAGTKLELKRA
Y más preferible aún, el anticuerpo quimérico está caracterizado porque contiene la región constante de cadena pesada lgG1 humana y la región constante de cadena ligera Ck humana. En una representación preferible, la presente invención se refiere a un anticuerpo modificado derivado del anticuerpo monoclonal murino 14F7 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 98101901 , caracterizado porque las regiones de los marcos de las cadenas pesada y ligera contienen cualquiera de las siguientes mutaciones:
CADENA PESADA: Posición 5: Q por V
Posición 9: N por A
Posición 11 : L por V
Posición 12: A por R Posición 18 M por V Posición 19 K por R Posición 20 M por V Posición 38 K por R Posición 40 R por A Posición 42: D por G Posición 48 I por V
CADENA LIGERA:
Posición 39 R por K Posición 40 T por P Posición 41 H por G Posición 42 E por Q Posición 58 I por V
Preferiblemente, dicho anticuerpo modfificado está caracterizado porque contiene la región constante de cadena pesada lgG1 humana y la región constante de cadena ligera Ck humana.
En otro aspecto de la presente invención se refiere a fragmentos del tipo Fv de cadena sencilla derivados del anticuerpo 14F7 que comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada obtenida a partir del hibridoma (depósito ECACC 98101901), y conservan la especificidad de reconocimiento del 14F7.
Preferiblemente, dichos fragmentos Fv incluyen regiones variables de cadena ligera provenientes de ratones o humanos no inmunizados, diferentes de la región variable de cadena ligera producida por el citado hibridoma, que permiten su producción por un hospedero bacteriano en forma de fragmentos de anticuerpo presentados sobre fagos filamentosos o moléculas solubles.
La presente invención también se relaciona con las líneas celulares que expresan los anticuerpos quimérico y humanizado, y los clones bacterianos que producen los fragmentos derivados del 14F7.
Además, l a p resente i nvención se relaciona con las composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o localización e identificación de tumores malignos de mama, melanomas, sus metástasis y recidivas, caracterizadas porque contienen uno de los anticuerpos monoclonales recombinantes o sus fragmentos descritos en la presente invención, así como un excipiente apropiado para su aplicación. Dicho anticuerpo o fragmento podría estar unido a un isótopo radioactivo, útil en la localización y/o terapia de los tumores malignos. Por ultimo la presente invención se relaciona con el uso de los anticuerpos recombinantes descritos, para su uso en la fabricación de una composición farmacéutica útil en el tratamiento y/o localización e identificación de tumores malignos La descripción detallada de como llevar a cabo y utilizar la presente invención se realiza a continuación:
1. Síntesis de ADNc y amplificación por la RCP (Reacción en Cadena de la Polimerasa) de las regiones variables del anticuerpo murino 14F7. El anticuerpo murino 14 F7 fue obtenido por inmunización de ratones Balb/c con el gangliósido GM3 ( euGc) conjugado hidrofóbicamenle con lipoproteínas de baja densidad y en presencia del adjuvante de Freund (EP 0972782 A1 , Carr A y cois. Hybridoma 19:3:241- 247, 2000). El ARN se obtiene de 106 células del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal 14F7 (AcM murino, lgG1 , que reconoce al gangliósido NGcGM3, utilizando el método de extracción del TRIZOL (GIBCO BRL, NY), d e a cuerdo a I as i nstrucciones d el fabricante.
La síntesis del ADN complementario (ADNc) y la amplificación de las regiones variables VH y VL se realizan utilizando el juego de reactivos Access RT-PCR (Promega, USA) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, la reacción se realiza a partir de 5 μg de ARN en presencia de 25 pmoles del oiigonucleótido dT diseñado para hibridar en la cola poIyA del ARN, y de los oligonucleótidos correspondientes a los extremos de cada región variable, VH y VK. Se incuba 10 min a 60°C y posteriormente se le añade una mezcla que contiene 0.2 mM de cada deoxinucleótido (dNTPs), 1 mM MgSO4, 5 u de AMV-Transcriptasa Reversa y 5 u de ADN Polimerasa en buffer de reacción, para un volumen total de 50 μL. Se incuban las muestras 45 min a 48°C, 2 min a 94°C, y posteriormente son sometidas a 40 ciclos de RCP con temperaturas de 94°C (30 seg), 60°C (1 min), 68°C (2 min), con una incubación final de 7 min a 68°C.
2. Construcción de genes quiméricos y secuenciación del ADNc amplificado.
Los productos de las RCP de VH y VK son digeridos con las enzimas de restricción Eco RV- Nhe I, para VH, y Eco RV-Sa/ I para VK, y clonadas en los respectivos vectores de expresión (Coloma MJ y cois. J Immunol Methods 152:89-104, 1992). La región VH es clonada en el vector PAH4604 que tiene incluida una región constante lgG1 humana y como marcador de selección el gen de resistencia al L-histidinol. La región VK es clonada en el vector PAG4622, el cual porta un gen de resistencia al ácido micofenólico y una región constante kappa humana. Las construcciones genéticas resultantes se nombran 14F7VH- PAH4604 y 14F7VK-PAG4622, respectivamente.
Ambas construcciones son secuenciadas por el método de los dideoxinucleótidos (Sanger F y cois. PNAS USA 74:5463-5470, 1979) usando el juego de reactivos de secuencia T7 ADN Polimerasa (Amershan-Pharmacia) de acuerdo al protocolo descrito por los fabricantes. 3. Expresión del anticuerpo quimérico.
Células NS0 son electroporadas con 10 μg de 14F7VH-PAH4604 y 10 μg de 14F7VK- PAG4622 linealizados con la enzima Pv I. Los ADNs se precipitan con etanol, se mezclan y disuelven en 50 μL de SSTF (solución salina tamponada de fosfato). Aproximadamente 107 células se crecen hasta semiconfluencia y se colectan por centrifugación, posteriormente se resuspenden en 0.5 mL de SSTF junto con el ADN en una cubeta de electroporación. Después de 10 min en hielo las células son sometidas a un pulso de 200 V y 960 F, y se mantienen en h ielo por 1 0 min. Las células se cultivan en placas d e 96 pozos en medio selectivo, Dulbecco Modificado (DMEM-F12) con 10% de suero fetal de ternera (SFT) y 10 mM de L-histidinoI. Los clones transfectados se hacen visibles a los 10 días de añadido el medio de selección.
La producción de inmunoglobulina quimérica se determina por ELISA partiendo del sobrenadante de los clones. Para ello se recubren placas de poliestireno (High binding, Costar) con suero de chivo anti-lgG humano (Sigma) en tampón carbonato bicarbonato 100 mM, pH 9.8, toda la noche a 4°C. Las mismas se lavan con SSTF-t (solución salina tamponada de fosfato, 0.5% Tween-20, pH 7.5), y se añaden las muestras de sobrenadante de cultivo diluidas en SSTF-t-SFT durante una hora a 37°C. Las placas se lavan nuevamente con SSTF-t y se i ncuban con u n suero de chivo anti-cadena kappa humana conjugado a peroxidasa (Jackson), una hora a 37°C. Posteriormente se lavan las placas de igual forma y se incuban con una solución tampón citrato-fostato pH 4.2 q ue contiene el sustrato o-fenilendiamina. Después de 15 min la absorbancia es medida a 492 nm. La capacidad de reconocimiento del antígeno por el anticuerpo quimérico es verificada por un ELISA competitivo usando los gangliósidos NGcGM3 y NAcGM3. Brevemente, se recubren placas de poliestireno (Polysorp, Nunc) con 50 μL de una solución a 4 μg/mL de NGcGM3 o NAcGM3 en metanol y se i ncuban d urante u na hora a 37°C. Las mismas se bloquean con 200 μL de una solución de seroalbúmina bovina (SAB) 1% en tampón Tris- HCI, pH 7.8-8.0 durante una hora a 37°C. Luego de tres lavados con SSTF, se añaden las muestras diluidas en Tris-HCI-SAB 1% en un rango de concentración entre 2 μg/mL - 0.01 μg/mL en presencia del anticuerpo 14f7 murino biotinilado 1 mg/mL, a 37°C durante 2h. Posteriormente se lava con SSTF y se desarrolla la reacción con un conjugado estreptavidina-peroxidasa (Jackson), a 37°C, 1h, La absorbancia se mide a 492 nm. 4. Construcción del Ac humanizado 14F7hT por humanización de epitopos T. Predicción de epitopos T. Las secuencias de los dominios variables del 14F7 son analizadas con el Programa AMPHI (Margalit H y cois. J Immunol 138: 2213-2229, 1987), el cual permite la identificación de segmentos de 7 u 1 1 aminoácidos con u na estructura de hélice antipática, la cual se ha relacionado con la inmunogenicidad T. Estos algoritmos predicen en este caso fragmentos relacionados con la presentación de epitopos T en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal murino 14F7.
- Análisis de homología con inmunoglobulinas humanas.
Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables del 14F7 son comparadas con las secuencias de regiones variables de inmunoglobulinas humanas reportadas, para identificar la inmunoglobulina humana que posea mayor homología con la molécula murina sometida a análisis. Para ello se puede utilizar la base de datos SWISSPROT disponible en Internet, a través del programa BLAST (Altschul S F y cois. Nucleic Acids Res 25:3389-3402, 1997).
- Análisis para la reducción de inmunogenicidad. La esencia del método radica en lograr una reducción de la inmunogenicidad por la ruptura o humanización de los posibles epítopes T, con un mínimo de mutaciones en los FRs, específicamente en aquellos segmentos que tienen una estructura de hélice antipática, quedando excluidas aquellas posiciones involucradas con la estructura tridimensional del sitio de reconocimiento del antígeno. Según el método, se comparan las secuencias de las regiones variables de VH y VL de la inmunoglobulina murina con la humana más homologa y se identifican los residuos que difieren entre la secuencia murina y la secuencia humana, sólo en los segmentos antipáticos que quedan dentro de la región de los FRs (Kabat E, Sequences of proteins of inmunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health, 1991). Estos residuos "murinos" serán los susceptibles de ser m ufados por a quedos q ue se encuentran en la misma posición en la secuencia humana.
Los residuos que se encuentran en Jas posiciones de los FRs responsables de las estructuras canónicas, aquellos presentes en la zona de Vernier, o los que participan en la interacción de la inferíase VH-VL, no pueden ser mutados, porque pudieran afectar la estructura tridimensional del dominio variable del anticuerpo y por tanto afectar su unión al antígeno. Información adicional sobre la influencia de las sustituciones propuestas sobre la estructura terciaria, pueden ser obtenidas por modelaje molecular de las regiones variables. Dado que en el análisis de las mutaciones pueden tenerse en cuenta elementos tales como la presencia de residuos prolina en la hélice anfipática o el hecho de que un determinado residuo murino no aparezca en la misma posición en la secuencia humana más homologa pero sea frecuente en otras inmunoglobulinas humanas, es posible obtener una versión que contenga un máximo de mutaciones, es decir, donde se muten todos los residuos murinos que difieren de la secuencia humana, pero pueden obtenerse otras versiones con diferentes combinaciones de mutaciones. Después de identificar sobre la secuencia murina del 14F7 los posibles epitopos T y de identificar dentro de estos segmentos los residuos diferentes a los humanos, las sustituciones se hacen por las técnicas convencionales de mutagénesis dirigida.
- Clonaje y expresión del anticuerpo humanizado 14F7hT en células NSO.
Una vez obtenidas las construcciones genéticas correspondientes a las regiones VH y VL del anticuerpo 14F7hT, por el método descrito anteriormente, estas son clonadas en los respectivos vectores de expresión, de manera similar a la descrita anteriormente en el caso de la construcción del Ac quimérico, obteniéndose las construcciones genéticas siguientes: 14F7hTVK-PAG4622 y 14F7hTVH-PAH4604. La transfección de estos genes a las células NSO es exactamente bajo las mismas condiciones descritas para el anticuerpo quimérico. Los clones p roductores d el a nticuerpo h umanizado s on detectados igualmente por ELISA.
La capacidad de reconocimiento específico del antígeno por el anticuerpo humanizado es verificada por un ELISA competitivo usando los gangliósidos NGcGM3 y NAcGMS. El procedimiento es idéntico al descrito para el anticuerpo quimérico.
5. Construcción de bibliotecas de fragmentos de anticuerpo sobre fagos filamentosos a partir del hibridoma 14F7.
Se aisla el ARN mensajero a partir de las células del hibridoma 14F7, se sintetiza el ADN complementario y se amplifican por separado las secuencias correspondientes a las regiones variables de cadena pesada y ligera, utilizando dos juegos de oligonucleótidos diseñados para hibridar con una amplia gama de regiones variables murinas. Las regiones variables de cadena pesada amplificadas se purifican, se digieren con las enzimas apropiadas y se ligan al vector fagomidio pHG-1 m (diseñado para la presentación de anticuerpos de cadena sencilla sobre la superficie de fagos filamentosos), previamente digerido con las mismas enzimas. Los productos de la reacción de ligamiento se purifican y se introducen por electroporación en bacterias de la cepa TG1 de E.coli. Las bacterias transformadas conforman una semi-biblioteca de regiones variables de cadena pesada de diversidad limitada (provenientes todas del hibridoma 14F7). Se purifica el ADN correspondiente a esta semi-biblioteca y se liga por separado a colecciones de regiones variables de cadena ligera (previamente purificadas y digeridas con las enzimas apropiadas). Finalmente se introducen las construcciones genéticas en bacterias de la cepa TG1 por electroporación, para conformar distintos tipos de bibliotecas independientes. Uno de ellos es una mini-biblioteca de diversidad limitada construida con las regiones variables de cadena ligera obtenidas también de las células del hibridoma 14F7. También se obtienen bibliotecas de intercambio de cadenas, donde las regiones variables de cadena pesada provenientes del hibridoma se combinan con colecciones diversas de regiones variables de cadena ligera obtenidas a partir de linfocitos murinos y humanos.
6. Aislamiento y caracterización de clones productores de fragmentos de anticuerpo contra el N-glicolil GM3.
Se toman al azar colonias de cada biblioteca para producir fagos a partir de ellas utilizando el fago auxiliador M13 K07. Se analiza directamente el reconocimiento del N-glicolil GM3 por los fagos portadores de fragmentos de anticuerpo a través de un ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA). Se localizan así clones productores de fragmentos funcionales. Para obtener una preparación rica en fragmentos funcionales de anticuerpo y explorar la diversidad de las bibliotecas, se producen fagos portadores de fragmentos de anticuerpo a partir de la mezcla total de bacterias transformadas que forma cada biblioteca. La mezcla de fagos obtenida se pone en contacto con el antígeno N-glicolil GM3 unido a una superficie sólida, los fagos portadores de fragmentos de anticuerpo con capacidad de unión se retienen y el resto se elimina mediante lavados exhaustivos. Los fagos unidos se eluyen por un cambio de pH y se multiplican para obtener una nueva mezcla de fagos que sirva de material de partida para un nuevo ciclo de selección sobre el antígeno. Después de varios ciclos de selección, se analiza el reconocimiento de los fragmentos de anticuerpo presentados sobre fagos a partir de colonias. De este modo se identifican clones adicionales productores de fragmentos funcionales, que se encontraban diluidos en las bibliotecas iniciales.
La caracterización de los fragmentos de anticuerpo producidos por los c Iones i ncluye e I análisis d e su especificidad por ELISA frente a un panel de gangliósidos relacionados, el estudio del reconocimiento tumoral por inmunohistoquímica, la evaluación de su capacidad para ser producidos como fragmentos de anticuerpo solubles funcionales, fuera del contexto de su presentación en fagos, y la secuenciación completa de sus regiones variables.
Ejemplos de Realización. En los s iguientes ejemplos todas las e nzimas de restricción o modificación utilizadas, así como reactivos y materiales fueron obtenidos de fuentes comerciales a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplo 1. Obtención del Anticuerpo Monoclonal Quimérico 14F7.
La síntesis del ADNc y la amplificación por la RCP de las regiones variables murinas VH y VK se realizó con la enzima Vent Polimerasa utilizando oligonucleótidos específicos con sitios de restricción Eco RV-A/Λe I para VH, y Eco RV-Sa/ 1 para VK. Los oligonucleótidos usados como cebadores fueron los siguientes:
Para VH:
Oligonucleótido 1 (híbrida en el péptido señal): 5' ggg gatatc cace atg gaa agg cae tgg ate ttt etc ttc ctg 3'
Oligonucleótido 2 (híbrida en JH1):
5' ggg getage tga gga gac ggt gac cgt ggt 3'
Para VK:
Oligonucleótido 1 (híbrida en el péptido señal): 5' ggg gatatc cace atg gt(at) t(tc)c (ta)ca ect cag (at)t(ac) ctt gga ctt 3'
Oligonucleótido 2 (híbrida en VLJ5):
5' age gtcgac tta cgt ttc age tec age ttg gtc ce 3'
Los productos de las RCPs de VH y VK fueron digeridos con las enzimas de restricción Eco
RV-Nhe I, para VH, y Eco RV-Sa/ 1 para VK, y clonados e n s us respectivos vectores d e expresión, PAH4604 y PAG4622, para VH y VK respectivamente. Estos vectores son usados para la expresión de inmunoglobulinas en células superiores y fueron donados por
Sherie Morrison (UCLA, California, USA). El vector PAH4604 tiene incluida la región constante humana lgG1 , y el PAG4622, una región constante kappa humana. (Coloma J y cois. J Immunol Methods 152:89-104, 1992). Una vez clonadas las regiones VH y VK del
14F7 en los vectores anteriores, se formaron las construcciones 14F7VH-PAH4604 y
14F7VK-PAG4622.
Doce clones independientes fueron secuenciados por el método de los dideoxinucleótidos (Sanger F et al, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS USA
1979;74:5463-5470) usando el kit de secuencia T7 ADN Polimerasa (Amershan-Pharmacia) de acuerdo al protocolo descrito por los fabricantes. Las secuencias de VH y VK tienen alta relación con el subgrupo IIB y V, respectivamente, (Figuras 1 A y B) según la clasificación de
Kabat (Kabat E, Sequences of proteins of inmunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health, 1991 ).
Células NS0 fueron electroporadas con 10 μg de 14F7VH-PAH4604 y 10 μg de 14F7VK- PAG4622 linealizados con la enzima Pvu I. Los ADNs fueron precipitados con etanol, mezclados y disueltos en 50 μL de SSTF. Aproximadamente 107 células crecidas hasta semiconfluencia, fueron colectadas por centrifugación y resuspendidas en 0.5 mL de SSTF junto con el ADN en una cubeta de electroporación. Después de 10 min en hielo las células fueron sometidas a un pulso de 200 V y 960 F e incubadas en hielo por 10 min. Las células se cultivaron en placas de 96 pozos en medio selectivo, Dulbecco Modificado (DMEM-F12) con 10% de SFT y 10 mM de L-histidinol. Los clones transfectados se hacen visibles a los 10 días de añadido el medio de selección. La producción de inmunoglobulina quimérica se determina por ELISA partiendo del sobrenadante de los clones. Para ello se recubren placas de poliestireno (High binding, Costar) con suero de chivo anti-lgG humano (Sigma) en tampón carbonato bicarbonato 100 mM, pH 9.8, toda la noche a 4°C. Las mismas se lavan con SSTF-t (solución salina tamponada de fosfato, 0.5% Tween-20, pH 7.5), y se añaden las muestras de sobrenadante de cultivo diluidas en SSTF-t-SFT durante una hora a 37°C. Las placas se lavan nuevamente con SSTF-t y se incuban con u n suero de chivo anti-cadena kappa humana conjugado a peroxidasa (Jackson), una hora a 37°C. Posteriormente se lavan las placas de igual forma y se incuban con u na solución tampón citrato-fostato p H 4.2 q ue contiene e l sustrato o-fenilendiamina. Después de 15 min la absorbancia es medida a 492 nm. Ejemplo 2. Reactividad del anticuerpo 14F7Q frente a los gangliósidos NGcGM3 y NAcGM3.
Se determinó la reactividad del anticuerpo (Ac) quimérico del 14F7 por medio de un ELISA competitivo. En la Figura 2 se muestra la especificidad del 14F7 quimérico comparado con el 14F7 murino, en el reconocimiento de placas de poliestireno (Polysorp, Nunc) recubiertas con el gangliósido GM3 N-glicolilado. Ambos Acs muestran a concentraciones similares un 50% de inhibición del reconocimiento del Ac 14F7 murino biotinilado al antígeno. Mientras que no se observó inmunoreactividad al recubrir las placas con la variante N-acetilada del GM3 para ninguno de los anticuerpos. Se usó como Ac irrelevante el AcM murino ior-C5. Ejemplo 3. Obtención de diferentes versiones del anticuerpo humanizado.
Las secuencias de VH y VK del 14F7 fueron comparadas con una base de datos de secuencias humanas, obteniéndose la secuencia humana de mayor homología con el anticuerpo 14F7, para la región VH y VK (Fig 1A y B). En ambas secuencias se determinaron además las regiones antipáticas o potenciales epitopos T. Posteriormente se determinaron las mutaciones necesarias para convertir las secuencias de VH y VK murinas en humanizadas, siguiendo este método de humanización de epitopos T. Señalamos a continuación el máximo de mutaciones posibles que pueden realizarse. En el caso de la región VH se introdujeron mutaciones en las posiciones 5, 9, 11 , 12, 18, 19, 20, 38, 40, 42 y 48, donde se sustituyeron los aminoácidos Q, N, L, A, M, K, M, K, R, D y I, por V, A, V, V, V, R, V, R, A, G y V, respectivamente. Estas mutaciones se realizaron por sobrelapamientos de los productos de la RCP (Kamman M y cois. Nucleic Acids Research 17:5404-5410, 1989), usando los oligonucleótidos 1 y 2, y los 3 y 4, en las primeras RCPs, y el resultado de las mismas se sobrelapó en otra RCP usando solo los oligonucleótidos 2 y 4. Las secuencias de los oligonucleótidos usados se muestran a continuación: Oligonucleótidos para las mutaciones 5, 9, 11 y 12, de la cadena pesada:
Oligonucleótido 1 5' gtc cag ctt gtg cag tct ggg gct gaa gtg gta aaa cct ggg 3'
Oligonucleótido 2 5' ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3' Oligonucleótido 3 5' ccc agg ttt tac cae ttc age ecc aga ctg cae aag ctg gac 3'
Oligonucleótido 4 5' ggg gatatc cace atg gaa agg cae tgg ate ttt etc ttc ctg 3'
Una vez secuenciadas y verificadas las anteriores mutaciones, a los ADNs que portaban las mismas se les introdujo en las posiciones 18, 19 y 20 otras mutaciones, sustituyendo los aminoácidos M, K, M por V, R, V, respectivamente. A continuación se muestran los oligonucleótidos 1 y 2, y los 3 y 4, descritos para dichas mutaciones. El sobrelapamiento de los productos de las RCPs se hizo de la misma manera descrita anteriormente.
Oligonucleótidos para las mutaciones 18, 19 y 20 de la cadena pesada:
Oligonucleótido 1 5' ggg gee tea gtg agg gtg tec tgc agg 3' Oligonucleótido 2 5' ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3'
Oligonucleótido 3 5' cct gca gga cae cct cae tga ggc ccc 3'
Oligonucleótido 4 5' ggg gatatc cace atg gaa agg cae tgg ate ttt etc ttc ctg 3' De igual manera, una vez secuenciadas y verificadas las anteriores mutaciones, a los ADNs que portaban las mismas se les introdujo en las posiciones 38, 40 y 42 las mutaciones R, A y G, que sustituyen los aminoácidos K, R y D, respectivamente.
A continuación se muestran los oligonucleótidos 1 y 2, y los 3 y 4, descritos para estas mutaciones. El sobrelapamiento de los productos de las RCP se hizo de la misma manera descrita anteriormente. Oligonucleótidos para las mutaciones 38, 40 y 42 de la cadena pesada:
Oligonucleótido 1 : 5' cae tgg tta aga cag gca cct ggc cag ggt ctg 3'
Oligonucleótido 2: 5' ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3'
Oligonucleótido 3: 5' cag acc ctg gee agg tgc ctg tet taa cea gtg 3' Oligonucleótido 4: 5' ggg gatatc cace atg gaa agg cae tgg ate ttt etc ttc ctg 3'
Por último, luego de verificar por secuencia las mutaciones anteriores, a los ADNs que portaban las mismas se les introdujo una mutación en la posición 48, sustituyendo el aminoácido I por V. A continuación se muestran los oligonucleótidos 1 y 2, y los 3 y 4, utilizados en esta mutación. El sobrelapamiento de los productos de las RCPs se hizo de la misma manera descrita anteriormente.
Oligonucleótidos para la mutación 48 de la cadena pesada: Oligonucleótido 1 : 5' ctg gaa tgg gtt gga tac att 3' Oligonucleótido 2: 5' ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3' Oligonucleótido 3: 5' aat gta tec aac cea ttc cag 3' Oligonucleótido 4: 5' ggg gatatc cace atg gaa agg cae tgg ate ttt etc ttc ctg 3'
Todas estas mutaciones fueron verificadas por secuencia. La construcción genética obtenida se denominó 14F7hTVH.
En el caso de la cadena pesada hay aminoácidos diferentes entre la cadena VH14F7 y la humana más parecida que no se realizaron porque estas sustituciones involucrarían aminoácidos de la zona de Vernier o son posiciones claves en el reconocimiento del antígeno.
Para la cadena ligera, se realizaron mutaciones en las posiciones 39, 40, 41, 42 y 58, sustituyendo R, T, H, E, I, por K, P, G, Q, y V respectivamente. Las mutaciones fueron introducidas de la misma manera que en la cadena pesada; a continuación se describen las secuencias de los oligonucleótidos utilizados.
Oligonucleótidos para las mutaciones 39, 40, 41, y 42 de la cadena ligera. Oligonucleótido : 5' tat caá caá aaa cea ggt cag tet cea agg 3' Oligonucleótido 2: 5' age gtcgac tta cgt ttc age tec age ttg gtc ce 3' Oligonucleótido 3: 5' cct tgg aga ctg acc tgg ttt ttg ttg ata 3' Oligonucleótido 4: 5' ggg gatatc cace atg gt(at) t(tc)c (ta)ca cct cag (at)t(ac) ctt gga ctt 3' Luego de verificar por secuencia las mutaciones anteriores, se procedió a introducir una mutación en la posición 58 a los ADNs que portaban las mismas, sustituyendo el aminoácido I por V. A continuación se muestran los oligonucleótidos 1 y 2, y los 3 y 4, que se utilizaron para dicha mutación. El sobrelapamiento de los productos de las RCPs se realizó de la misma manera descrita anteriormente.
Oligonucleótidos para la mutación 58 de la cadena ligera: Oligonucleótido 1 : 5' att tet ggg gtc ccc tec agg 3' Oligonucleótido 2: 5' age gtcgac tta cgt ttc age tec age ttg gtc ce 3' Oligonucleótido 3: 5' cct gga ggg gac ccc aga aat 3'
Oligonucleótido 4: 5' ggg gatatc cace atg gt(at) t(tc)c (ta)ca cct cag (at)t(ac) ctt gga ctt 3'
Una vez realizada esta mutación, la misma fue verificada por secuencia.
La construcción genética resultante se denominó 14F7hTVK. Las regiones VK y VH humanizadas fueron clonadas en los vectores PAG4622 y PAH4604, formando las construcciones 14F7hTVH-PAH4604 y 14F7hTVK-PAG4622, respectivamente.
Células NSO fueron electroporadas con 10 μg de cada uno de los vectores que portaban las regiones variables humanizadas, 14F7hTVH-PAH4604 y 14F7hTVK-PAG4622, previamente linealizados por digestión con Pvu I. El proceso de electroporación y detección de los clones que expresaban el anticuerpo humanizado 14F7hT fue idéntico al descrito para el anticuerpo quimérico.
Ejemplo 4: Efecto del Ac 14F7 sobre la disminución del crecimiento tumoral en un modelo de inducción de angiogénesis tumoral in vivo. Como modelo de angiogénesis in vivo se usó la línea tumoral (melanoma B16) mezclada con matrigel como inductor de la angiogénesis.
Con la implantación subcutánea de la línea tumoral (B16) con matrigel en la línea media ventral de ratones machos C57/BL6, se midió la inducción del proceso de angiogénesis tumoral. Brevemente: Se mezclan células de melanoma B16 con 0.5 mL de matrigel y 64 unidades/mL de heparina, solos, en el grupo control, o en combinación con los anticuerpos, para ser administrados por inyección subcutánea en la región abdominal de los animales. A los 15 días de la inoculación, los animales se sacrifican y se les extraen las perlas de geles junto con residuos de dermis y epidermis y se examina macroscópicamente el tamaño del tumor. Como se observa en la Figura 3, los tumores de los ratones tratados con el 14F7, disminuyen drásticamente el tamaño de la masa tumoral. Para distinguir los neovasos se realiza un análisis histopatológico de los geles con tinción hematoxilina/eosina, y con inmunotinción con un AcM anti PECAM (marcador endotelial). En la Figura 4, A y B, se observa una disminución del n úmero d e vasos sanguíneos e n l os cortes de tejidos de los animales tratados con el 14F7, al compararlos con los cortes obtenidos de tumores de animales sin tratamiento. Ejemplo 5: Construcción de bibliotecas de fragmentos de anticuerpo sobre fagos filamentosos a partir del hibridoma 14F7.
Se aisló el ARN mensajero con el reactivo TriPure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim, Alemania) a partir de 5.0 x 106 células del hibridoma 14F7 y se sintetizó el ADN complementario con el juego de reactivos Pro-STAR First Strand RT-PCR kit (Stratagene, EEUU). Las regiones variables de cadena pesada y ligera provenientes del hibridoma se amplificaron mediante 26 ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa, en las siguientes condiciones: 50 segundos a 94° C, 1 minuto a 55° C, 1 minuto a 72° O Para ello se utilizaron todas las posibles combinaciones de un juego de oligonucleótidos degenerados (diseñados para hibridar con una amplia variedad de regiones variables de ratón), que se muestran en la tabla siguiente:
Oligonucleótidos usados para amplificar VH y VL. Las posiciones degeneradas aparecen entre p aréntesis e n I a s ecuencia d e I os o ligonucleótidos. L as s ecuencias d e I os s itios d e restricción aparecen subrayadas.
5' VH Apa U
5'... ttc tat tet cae aαt αca caα (gc)ag gt(gt) cag ct(gt) ac(ag) cag tc(at) gga 3'
5'... ttc tat tet cae aαt αca caα gc(ag) gt(ct) ca(ag) clg cag cag cl(ct) ggg ge 3'
5'... ttc tat tet cae aαt αca caα ga(ag) gtg aag cí(gt) (gc)t(gc) gag tet gg(ag) gga 3' 3' VH Sfi I
5'... ga acc agt act cea ααc ctα aαα ααc cae aga gac agt gac cag agt ccc 3'
5'... ga acc agt act cea ααc ctα aαα ααc cαa gga gac ggt gac tga ggt tec 3'
5'... ga acc agt act cea ggc ctq aqq qqc cqa gga gac (gt)gt ga(gc) (ca) gt gga (gc)cc...3'
5' VL Sal I 5'...gta etc cag tcq acg acá ttg tg(ca) tg(at) t(ac)c agt etc c... 3' 5'... gta etc cag teg acg ata tec aga tga c(ac)c a(ga)a ct(ac) c... 3' 5'... gta etc cag tcq ac(cg) aaa ttg t(tg)c tea ccc agt etc c... 3' 3' VL Not I 5'... aag gaa aaa age ggc cgc ttt (tc)a(tg) (tc)tc cag ctt ggt... 3' 5'...aag gaa aaa age qgc cgc ttt (tg)a(tg) etc caá ctt gt(gt)... 3'
Las regiones variables de cadena pesada amplificadas se purificaron y se digirieron secuencialmente con las enzimas de restricción Sfi I y ApaLI. Se purificaron los productos de la digestión y se ligaron con el ADN del vector fagomidio pHG-1m (Heber Biotec S.A., Cuba) (Figura 5). Con las construcciones genéticas resultantes se transformaron por electroporación bacterias de la cepa TG1 de E.coli. El conjunto de bacterias transformadas conformó una semi-biblioteca de regiones variables de cadena pesada provenientes del hibridoma 14F7, con una talla moderada de 2.3 x 104 miembros. Se purificó el ADN plasmídico de la semi-biblioteca y se digirió secuencialmente con las enzimas Not I y Sal I. Se ligó este ADN por separado con cuatro colecciones de regiones variables de cadena ligera, previamente digeridas con las mismas enzimas. Se transformaron bacterias de la cepa TG1 con estas nuevas construcciones genéticas y se obtuvieron cuatro bibliotecas independientes. Una de ellas era una una mini-biblioteca de diversidad limitada que contenía las regiones variables, tanto de cadena pesada como ligera, provenientes del hibridoma 14F7, con un tamaño de 1.6 x 106 individuos. Las otras tres eran bibliotecas de intercambio de cadenas que incorporaban colecciones diversas de regiones variables de cadena ligera obtenidas previamente a partir de ratones (isotipo kappa) y humanos (isotipos kappa y lambda) y sus tallas fueron 1.0 x 107, 1.4 x 106, y 1.2 x 106 miembros respectivamente. Ejemplo 6. Aislamiento de clones productores de fragmentos de anticuerpo contra el N-glicolil GM3.
Se produjeron fagos portadores de fragmentos de anticuerpo a partir de 92 clones tomados al azar de cada biblioteca, en pocilios de placas de microtitulación, según procedimientos ya descritos (Marks, J. D. y cois. J. Mol. Biol. 222,581-597. 1991). Se evaluó su especificidad en un ELISA sobre placas de cloruro de polivinilo (Costar, EEUU) recubiertas con N-glicolil GM3 y N-acetil GM3 a 1μg/ml. Se detectaron los fagos unidos con un anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado a peroxidasa de rábano picante (Amersham, Suecia). Además de la caracterización individual de clones tomados al azar se procedió a la selección de fagos con capacidad de unión al N-glicolil GM3 a partir de la mezcla de fagos producida por el conjunto de bacterias que conformaban cada biblioteca. Para ello, se produjeron fagos utilizando el fago auxiliador M13 K07, se purificaron por precipitación con polietilenglicol según el procedimiento citado y se pusieron en contacto con el N-glicolil GM3 unido a una superficie plástica (Inmunotubos, Nunc, Dinamarca). Se lavaron extensivamente los tubos y se eluyeron los fagos en presencia de trietilamina 100 mmol/l. El eluato se neutralizó y se utilizó para infectar bacterias de la cepa TG1 de E.coli . A partir del conjunto las bacterias infectadas se produjeron y se purificaron nuevamente fagos portadores de fragmentos de anticuerpo, que se utilizaron como material de partida para una nueva ronda de selección en condiciones idénticas a las descritas. Después de cuatro ciclos de selección se tomaron al azar 92 colonias de bacterias infectadas con los fagos resultantes de cada biblioteca y se analizó el reconocimiento del N-glicolil G M3 de forma similar a la descrita para la evaluación de los clones tomados al azar de las bibliotecas.
A partir del análisis directo de los clones de las bibliotecas se aislaron clones productores de fagos portadores de fragmentos de anticuerpo que reconocían al N-glicolil GM3, que se encontraban en una frecuencia variable en las tres bibliotecas de intercambio de cadenas. No se encontró n ingún clon positivo en la mini-biblioteca formada exclusivamente por las regiones variables provenientes del hibridoma 14f7. Después de los ciclos de selección se aislaron clones adicionales a partir de las bibliotecas de intercambio de cadenas, y no se encontró ninguno en la mini-biblioteca de secuencias originales. La siguiente tabla muestra las cantidades de clones productores de fragmentos de anticuerpo que reconocen al N- glicolil GM3 y la frecuencia que representan del total de clones analizados, a partir de cada biblioteca. Solo un clon produjo fagos que presentaban reactividad cruzada con el N-acetil GM3. Biblioteca Frecuencia de clones Frecuencia de clones positivos positivos (tamizaje directo) (cuatro ciclos de selección)
Mini-biblioteca hibridoma 0/92 0/92 14F7
Intercambio de cadenas 31/92 (33.70%) 52/92 (56.52%) ligeras kappa murinas
Intercambio de cadenas 2/92 (2.17%) 8/92 (17.39%) ligeras kappa humanas
Intercambio de cadenas 4/92 (4.35%) 12/92 (13.04%) ligeras lambda humanas
1 clon con reactividad cruzada con el N-acetil GM3.
Ejemplo 7. Caracterización de los fragmentos de anticuerpo derivados del 14F7 que reconocen al N-glicolil GM3 Se secuenciaron totalmente las regiones variables de 11 fragmentos de anticuerpo con un secuenciador automático ALF Express II (Pharmacia, Suecia), utilizando oligonucleótidos que hibridan en las regiones del vector pHG-1m que flanquean los extremos 5' y 3' de las secuencias que codifican para los fragmentos de anticuerpo insertados. Se confirmó que la secuencia de la región variable de cadena pesada de todos corresponde a la reportada para el 14F7, solo se presentan cambios en las regiones marco 1 y marco 4, presumiblemente introducidos por el uso de oligonucleótidos degenerados en la RCP. El resto de las secuencias, incluidos los tres CDRs no tenían variaciones. Por el contrario, las secuencias de las regiones variables de cadena ligera de los 11 clones fueron todas diferentes a la del 14F7 y se agruparon en 5 grupos de secuencias diferentes entre sí, dos de origen murino, uno de origen humano (isotipo kappa) y otros dos de origen humano, pero de isotipo lambda. Se tomó un clon representativo de cada grupo de secuencias para su caracterización posterior.
La tabla siguiente muestra las diferencias entre las regiones variables de cadena ligera de los clones seleccionados, en cuanto a su identidad con la original, su origen e isotipo y la clasificación es subgrupos según la clasificación de Kabat.
Figure imgf000021_0001
Las diferencias entre las regiones variables de cadena ligera de los clones y la reportada originalmente para el anticuerpo 14F7 se localizan a lo largo de toda la secuencia, incluyendo las tres regiones determinantes de la complementareidad, y se muestran a continuación (Figura 6).
Fr1
14F7Mab D L V L T Q S P A T L S V T P G D S V S F S C
2AmscFv . I . M F . . . . S . A . S L . Q R A T I .
3Fm scFv . I Q M . T S S . A S L . R . T I .
7BhkscFv . I Q M . T S S . A S V . R . T I T
7Ah!scFv Q S V V . P S A G G . Q . L T I .
8BhlscFv S S E L . D V . A L Q T . R I T
CDR1 R A S S I S N N H
S V S S Y S Y
. . Y N
. S F N
T G T S S D V G G Y . H V S Q G D S L R . Y Y A S
Fr2 W Y Q R T E S R L L I K K P Q P K K P G T K V K P K A K Y H P K A K M Y
K P G Q A V
CDR2
Y A S Q S I S
N L E
. T R L H
A . N L Q
D V K R P
G K N N Fr 3
G 1 P S R F s G s G s G T D F T L S 1 1 A V E T E D F G M Y F C
. V . A N . H P . . E . . A A T . Y .
. V . Y S . T . S N L . Q . . 1 A T . . .
. V . R T . s S L Q P . . . A A . Y .
. V . H . . . . , K - . N T A s . T V s G L Q A . . E A ¥ . Y .
T> ¡s¡ N T A s . T . T G A Q A . . E A D . Y .
CD 3
Q Q S N R W P L T F
. H . R D V . „ „
. . G „ T L . P ,
. . G Y T T , , ,
S S Y A G s N N . V
N S R D S s G N H V V
Fr 4
G A G T K L E L K 1
. Q .
. G . V T V L
. G . m T V L
La especificidad de la unión se confirmó por ELISA, según el procedimiento descrito, pero utilizando como recubrimiento, además d el N -glicolil G M3 y el N-acetil GM3, un panel de gangliósidos relacionados que incluía varios gangliósidos N-acetilados y uno N-glicolilado. La Figura 7 muestra el reconocimiento de los distintos antígenos por los cinco clones productores de fragmentos de anticuerpo caracterizados. Solo se detectó la unión al antígeno blanco N-glicolil GM3. El resto de los antígenos no fueron reconocidos.
La producción de fragmentos de anticuerpo solubles (fuera del contexto de los fagos) por los clones se indujo en presencia de isopropil-tiogalactopiranósido a 1 mmol/l. Se colectaron los sobrenadantes y se obtuvieron las fracciones periplasmáticas según procedimientos ya establecidos (de Haard, H. J.Biol. Chem. 274, 18218-18230, 1999.) Se detectó actividad de reconocimiento del N-glicolil GM3 tanto en los sobrenadantes de cultivo como en las fracciones periplasmáticas, a través de un ELISA sobre placas recubiertas con dicho antígeno similar al descrito, pero con el siguiente cambio. Los fragmentos de anticuerpo unidos se detectaron utilizando el anticuerpo monoclonal 9E10 (dirigido contra el péptido c- myc que está fusionado en la construcción genética a los fragmentos de anticuerpo), a 10 μg/ml y un conjugado anti-inmunoglobulinas de ratón (Sigma, E EUU). Se purificaron los fragmentos de anticuerpo a partir d e l as fracciones periplasmáticas e n u n paso ú nico d e cromatografía de afinidad a iones metálicos utilizando la matriz HIS-Select HC Nickel Affinity Gel (Sigma, EEUU) según las instrucciones del fabricante. La figura 8 muestra la actividad determinada por ELISA de los fragmentos solubles purificados. Breve Descripción de las Figuras.
Figura 1 : En la figura se muestra la secuencia aminoacídica de las regiones variables VH
(a) y VK (b) del AcM 14F7, y la secuencia humana respectiva más homologa. Los CDRs se encuentran subrayados, y las regiones antipáticas, potenciales epitopos T, aparecen sombreados. Se muestra además la secuencia resultante de la humanización de las regiones variables con las mutaciones realizadas.
Figura 2: Reconocimiento del anticuerpo 14F7Q medidO por un ELISA competitivo.
Eje X: Expresa la concentración de los anticuerpos. Eje Y: Absorbancia medida a 492 nm
El anticuerpo monoclonal ior C5 se uso como control negativo.
Figura 3: Efecto del anticuerpo monoclonal 14F7 sobre el crecimiento de tumores murinos
(línea tumoral melanoma B16).
Figura 4 : A ) Estudio Inmunohistoquímico de del efecto del Anticuerpo Monoclonal 14F7 sobre la formación de vasos sanguíneos. Las flechas indican los vasos inmunomarcados.
B) Inhibición de la Angiogénesis inducida por el Anticuerpo Monoclonal 14F7.
Figura 5: Diagrama del vector pHG-1m.
Figura 6: Secuencia de proteínas de las regiones VL del anticuerpo monoclonal 14F7 y de los fragmentos Fv de cadena sencilla seleccionados. Los puntos significan homología con la secuencia de las VL del 14F7.
Figura 7: Especificidad del reconocimiento por los fagos portadores de fragmentos del anticuerpo. Se observa la inhibición de la unión del Ac 14F7 al ganglósido por los fragmentos expuestos en los fagos. Las placas se recubrieron con N-glicolil GM3 y los fagos fueron incubados con partículas virales y varias concentraciones de 14F7. Eje X: Concentración del Ac 14F7
Eje Y: Absorbancia medida a 240 nm.
Figura 8. Reconocimiento del N-glicolil Gm3 por los fragmentos solubles purificados.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un anticuerpo recombinante derivado del anticuerpo monoclonal murino 14F7 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 98101901 , caracterizado porque las secuencias de las regiones hipervariables (CDRs) de las cadenas pesada y ligera son las que se muestran a continuación:
CADENA PESADA
CDR1 : SYWIH CDR2: YIDPATAYTESNQKFKD
CDRS: ESPRLRRGIYYYAMDY
CADENA LIGERA
CDR1 : RASQSISNNLH
CDR2: YASQSIS CDR3: QQSNRWPLT
2.- El anticuerpo según la reivindicación 1 , caracterizado porque es una variante quimérica del anticuerpo 14F7 el cual contiene los CDRs y las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo 14F7 y la región constante de cadena pesada lgG1 humana y la región constante de cadena ligera Ck humana, siendo las secuencias de las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera las siguientes:
CADENA PESADA
FR1 : QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT
FR2: WLKQRPDQGLEWIG
FR3: KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR FR4: WGQGTTVTVSS
CADENA LIGERA
FR1 : DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC
FR2: WYQQRTHESPRLLIK
FR3: GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC FR4: FGAGTKLELKRA
3.- Un anticuerpo según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque es una variante humanizada del anticuerpo monoclonal 14F7 el cual contiene mutaciones puntuales las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera para reducir su inmunogenicidad.
4.- Un anticuerpo según la reivindicación 3 caracterizado porque es una variante humanizada del anticuerpo monoclonal 14F7 cuyas regiones de los marcos de las cadenas pesada y ligera contienen cualesquiera de las siguientes mutaciones:
CADENA PESADA: Posición 5: Q por V Posición 9: N por A
Posición 11 L por V Posición 12 A por R Posición 18 M por V Posición 19 K por R Posición 20 M por V Posición 40 R por A Posición 42 D por G CADENA LIGERA:
Posición 39: R por K
Posición 40: T por P
Posición 41 : H por G
Posición 42: E por Q
5. Fragmento Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo monoclonal murino 14F7 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 98101901, caracterizado porque contiene la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 14F7 y una región variable de cadena ligera de un anticuerpo murino.
6. Fragmento Fv de cadena sencilla según la reivindicación 6, caracterizado porque la región variable de la cadena ligera es del propio anticuerpo 14F7.
7. Fragmento Fv de cadena sencilla según las reivindicaciones 6 y 7 caracterizado porque las secuencias de las regiones hipervariables (CDRs) de las cadenas pesada y ligera son las que se muestran a continuación:
CADENA PESADA CDR1 : SYWIH
CDR2: YIDPATAYTESNQKFKD
CDR3: ESPRLRRGIYYYAMDY
CADENA LIGERA
CDR1 : RASQSISNNLH CDR2: YASQSIS
CDR3: QQSNRWPLT
8.- Fragmento Fv de cadena sencilla según la reivindicación 8 caracterizado porque contiene los CDRs y las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo 14F7, siendo las secuencias de las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera las siguientes:
CADENA PESADA
FR1 : QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT
FR2: WLKQRPDQGLEWIG FR3:
KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR
FR4: WGQGTTVTVSS
CADENA LIGERA FR1:DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC
FR2: WYQQRTHESPRLLIK
FR3:GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC
FR4: FGAGTKLELKRA
9.- Fragmento Fv de cadena sencilla de acuerdo con la reivindicación 9 el cual contiene mutaciones puntuales las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera para reducir su inmunogenicidad.
10.- Fragmento Fv de cadena sencilla de acuerdo con la reivindicación 10 cuyas regiones de los marcos de las cadenas pesada y ligera contienen cualesquiera de las siguientes mutaciones: CADENA PESADA:
Posición 5: Q por V
Posición 9: N por A
Posición 11: L por V
Posición 12: A por R Posición 18: MporV
Posición 19: K por R
Posición 20: M por V
Posición 40: R por A
Posición 42: D por G CADENA LIGERA:
Posición 39: R por K
Posición 40: T por P
Posición 41 : H por G
Posición 42: E por Q
11.- Fragmento Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo monoclonal murino 14F7 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 98101901 según la reivindicación 6, caracterizado porque contiene la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 14F7 y una región variable de cadena ligera cuya secuencia es la siguiente: Frl
D I V ftfl F Q S P A S L A V S L G Q R A T I S C
CDR1 R A S Q S V S S S S Y S Y M H Fr2 WY Q Q K P G Q P P K L L I K
Y A S N L E S
Fr3
GV P A R F S G S G S GT D F T L M I H P V E E E D AAT Y Y C
QH S R D V P L T F
Fr4
G A G T K L E I K
12.- Fragmento Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo monoclonal murino 14F7 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 98101901 según la reivindicación 6, caracterizado porque contiene la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 14F7 y una región variable de cadena ligera cuya secuencia es la siguiente: Fr1 D I Q M T Q T P S S L S A S L G D R V T I S C
CDR1
R A S Q D I S N Y L N
Fr2
WY Q Q K P D G T V K L L I V
CDR2
Y T S R L H S
Fr3
GV P S R F S G S G S GT D Y S L T I S N L E Q E D I AT Y F C
CDR3 QQG N T L P P T F
Fr4
GA GT K L E L K
13.- Fragmento Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo monoclonal murino 14F7 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 98101901, caracterizado porque contiene la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 14F7 y una región variable de cadena ligera de un anticuerpo humano.
14.- Fragmento Fv de cadena sencilla según la reivindicación 14, caracterizado porque contiene la secuencia déla región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 14F7 y una región variable de cadena ligera cuya secuencia es la siguiente: Fr1
D I Q M T Q T P S S L S A S V G D R V T I T C
CD 1
RA S ΘS I S S F L N
Fr2 WY QQK P G A P K L L I Y
CDR2
A A S N L Q S
Fr3 GV P S R F S G R GS GT D F T L T I S S L QP E D F AAY Y C
CDR 3
QQ GY T T P L T F
Fr4
GQGT K L E L K
15.- Fragmento Fv de cadena sencilla según la reivindicación 14, caracterizado porque contiene la secuencia déla región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 14F7 y una región variable de cadena ligera cuya secuencia es la siguiente: Fr1 Q S V V T Q P P S A S G G P G Q S L T l S C
CDR1 T G T S S D V G G Y N H V S
Fr2 WY Q Q H P G K A P K L M I Y
CDR 2
D V S K R P S
Fr3
GV P H R F S GS KS G N T AS L T V S G L QA E D E AV Y Y C
CDR 3 S S Y AG S N N L V F Fr4
G G G T K V T V L
16.- Fragmento Fv de cadena sencilla según la reivindicación 14, caracterizado porque contiene la secuencia déla región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 14F7 y una región variable de cadena ligera cuya secuencia es la siguiente: Fr1
S S E L T Q D P A V S V A L G Q T Y R I T C
CDR1 Q G D S L R S Y Y A S
Fr2 WY Q Q K P G Q A P V L V I Y
CDR 2
G K N N R P S
Fr3
G l P D R F S G S S S G N T AS L T I T GA QA E D E A D Y Y C
CDR3 N S R D S S G N H V V F
Fr4 G G G T K L T V L
17.- Una línea celular caracterizada porque expresa el anticuerpo recombinante o el fragmento Fv de cadena sencilla de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17.
18.- Composición farmacéutica para el tratamiento de tumores malignos caracterizada porque comprende el anticuerpo recombinante o el fragmento Fv de cadena sencilla de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17, y un excipiente apropiado.
19.- Composición farmacéutica según la reivindicación 19 caracterizada porque es útil para el tratamiento de tumores malignos de mama, melanomas, sus metástasis y recidivas.
20.- Reactivo para la localización e identificación "¡n vivo" de tumores malignos caracterizada porque comprende el anticuerpo recombinante o el fragmento Fv de cadena sencilla de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17 y un marcador apropiado.
21.- Un reactivo según la reivindicación 21 caraterizado porque es utilizado para la localización e identificación "in vivo" de tumores malignos de mama, melanomas, sus metástasis y recidivas.
PCT/CU2004/000006 2003-04-23 2004-04-22 Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliosido n-glicolil gm3 y su uso para diagnostico y tratamiento de tumores. WO2004094477A1 (es)

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