WO2004070362A1 - Mehrparametriges zell-identifikations- und sortierverfahren und zugehörige vorrichtung - Google Patents

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Stefan Hummel
Annette Pfennig
Gabriele Gradl
Axel Bonsen
Thomas Schnelle
Rüdiger Meyer
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    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Definitions

  • the invention relates to an examination method for preferably biological particles, in particular for the examination of biological cells in a cell sorter, according to claim 1 and a corresponding examination device according to claim 14.
  • a sorting device which consists of a dielectrophoretic electrode arrangement arranged downstream in the carrier stream behind the dielectrophoretic cage.
  • a disadvantage of the known examination method described above is that the cells to be examined are in a of a sample are often very different.
  • the target cells In the case of very heterogeneous samples, from which, for example, certain target cells are identified by a method and these target cells are then to be isolated, the target cells often make up only a small proportion of the total sample.
  • the other cells do not have the desired properties or are no longer vital, ie already dead.
  • it often happens that the cells are not completely isolated, but that some cells pass through the system as an aggregate of two or more cells. This is an undesirable result.
  • the detailed examination of individual cells or aggregates in a field cage is a time-consuming process, so that the examination of the entire cell sample in the field cage would take a very long time.
  • the invention is therefore based on the object of improving the known examination method described above in such a way that an examination of biological cells of no interest (e.g. dead cells) or cell clumps in the dielectrophoretic cage can be avoided.
  • biological cells of no interest e.g. dead cells
  • cell clumps in the dielectrophoretic cage can be avoided.
  • the invention encompasses the general technical teaching that, prior to the examination of the particles suspended in the carrier stream in the dielectrophoretic cage, a preliminary examination of the particles moving with the carrier stream is carried out in order to subsequently catch the particles of interest for further investigation in the dielectrophoretic cage and to be able to examine.
  • the preliminary examination can concern, for example, the intensity of a fluorescence, the vitality of a cell and / or the question of whether it is a single cell or an aggregate.
  • it can be determined whether it is cells or material whose shape and size is not the primary objective of the detailed examination, for example impurities or other cells, provided that they differ from the target cells.
  • a preliminary examination of the particles suspended in the carrier stream and a selection of certain particles depending on the result of the preliminary examination are therefore carried out, while the actual main examination is carried out only for the previously selected particles which are slowed down by one to enable meaningful main inspection, which would be made difficult by a movement of the particles.
  • the particles selected as a function of the preliminary examination are brought to a complete standstill before the main examination, for example by capturing them in a dielectrophoretic cage. Rather, it is also possible within the scope of the invention that the particles selected as a function of the preliminary examination are braked in the carrier stream only to such an extent that a meaningful examination of the particles is possible.
  • particle used in the context of the invention is to be understood generally and is not restricted to individual biological cells. Rather, this term also includes synthetic or biological particles, with particular advantages if the particles are biological materials, for example biological cells, cell groups, cell components or biologically relevant macromolecules, each possibly in combination with other biological particles or synthetic carrier particles. Synthetic particles can be solid particles, liquid particles or particles separated from the suspension medium
  • the particle selected as a function of the preliminary examination and subsequently examined in more detail as part of the main examination is sorted and / or treated depending on the result of the main examination. For example, different types of cells can be distinguished during the main inspection and then sorted accordingly.
  • dielectrophoretic elements The above-mentioned publication by Müller, T. et al. described dielectrophoretic elements can be used.
  • a transmitted light measurement for example, a transmitted light measurement, a fluorescence measurement and / or an impedance spectroscopy can be carried out.
  • a transmitted light measurement is carried out first and then a fluorescence measurement, the transmitted light measurement and the fluorescence measurement preferably taking place in spatially separate examination windows (“region of interest”).
  • the transmitted light measurement can make it possible, for example, to distinguish between living and dead biological cells, while the fluorescence measurement can be used to investigate whether the particles suspended in the carrier stream carry a fluorescence marker.
  • both a transmitted light measurement and a fluorescence measurement are carried out in spatially separate examination windows as part of the preliminary examination, then it is advantageous if the examination window for the transmitted light measurement in the carrier stream is upstream of the examination window for the fluorescence measurement.
  • the examination window for the transmitted light measurement it is alternatively also possible for the examination window for the transmitted light measurement to be arranged downstream in the carrier stream behind the examination window for the fluorescence measurement.
  • optical image is preferably recorded in the course of the preliminary examination of the particles moving with the carrier stream, which enables digital image evaluation to classify the particles.
  • the particles are preferably examined morphologically in order, for example, to be able to distinguish a single biological cell from a cell clump.
  • optical image used in the context of the present description is to be understood generally and is not restricted to two-dimensional images in the conventional sense of the word. Rather, the term optical image in the sense of the invention also includes a point-like or line-shaped optical scanning of the carrier stream or of the particles suspended in the carrier stream.
  • the brightness can be integrated along a line transverse to the carrier current channel in order to detect and classify individual particles.
  • living and dead cells in the context of the preliminary examination can be made in a transmitted light measurement by evaluating the intensity distribution in the recorded optical image.
  • a special principle of this transmitted light measurement with the properties mentioned is, for example, phase contrast illumination.
  • living biological cells have a ring structure with a light measurement relatively bright edge and a darker center, whereas dead biological cells have an approximately uniform brightness when transmitted light measurement and appear dark against the background.
  • certain molecules can be localized within a cell.
  • molecules can be located within a cell that are marked with a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye can be, for example, molecularly produced “tags” of “green fluorescent protein” and its derivatives, other autofluorescent proteins.
  • fluorescent dyes which bind covalently or non-covalently to a cellular molecule are also suitable as fluorescent dyes.
  • fluorogenic substances which are converted by cellular enzymes into fluorescent products or so-called FRET pairs (fluorescence resonance energy transfer) can also be used as fluorescent dyes.
  • the state of the fluorescent dyes used can be distinguished, for example, on the basis of their spectral properties or by means of bioluminescence.
  • the structure and function of the molecules can also be determined on the basis of the localization of molecules within a cell.
  • a distinction can be made here, for example, according to the occurrence in the plasma membrane, in the cytosol, in the mitochondria, in the Golgi apparatus, in endosomes, in lysosomes, in the cell nucleus, in the spindle apparatus, in the cytoskeleton, colocalization with actin, tubulin.
  • the morphology of a cell can be determined in the course of the main and / or preliminary examination, it also being possible to use dyes.
  • two or more states of a cell population can be distinguished in the course of the main and / or preliminary examination.
  • a cellular signal based on the translocation of a fluorescence-labeled molecule, e.g. Receptor activation followed by receptor internalization, receptor activation followed by binding of arrestin, receptor aggregation, transition of a molecule from the plasma membrane into the cytosol, from the cytosol into the plasma membrane, from the cytosol into the cell nucleus or from the cell nucleus into the cytosol.
  • a fluorescence-labeled molecule e.g. Receptor activation followed by receptor internalization, receptor activation followed by binding of arrestin, receptor aggregation, transition of a molecule from the plasma membrane into the cytosol, from the cytosol into the plasma membrane, from the cytosol into the cell nucleus or from the cell nucleus into the cytosol.
  • the interaction of two molecules can be determined in the course of the main and / or preliminary examination, preferably at least one of the interacting molecules carrying a fluorescent marker and the interaction e.g. is shown by colocalization of two fluorescent colors, a FRET or a change in the fluorescence lifetime.
  • the status of a cell within a cell cycle can also be determined in the course of the main and / or preliminary examination, the morphology of the cell or the staining of the cellular chromatin preferably being evaluated.
  • Another possibility for the main and / or preliminary examination is to determine the membrane potential of a cell, preferably using membrane-sensitive dyes. Dyes are preferably used here which are sensitive to the plasma membrane potential and / or the mitochondrial membrane potential.
  • the vitality of a cell can also be determined in the course of the main and / or preliminary examination, the cell morphology preferably being evaluated and / or fluorine substances being used which can distinguish between living and dead cells.
  • cytotoxic effects can also be examined and / or the intracellular pH values determined during the main and / or preliminary examination.
  • An enzymatic activity within a cell can also be determined during the main and / or preliminary examination, wherein fluorine or chromogenic substances, in particular kinases, phosphatases or proteases, can preferably be used.
  • the production output of cells which produce biological products such as proteins, peptides, antibodies, carbohydrates or fats, can be determined, it being possible to use one of the methods described.
  • cell stress paths can also be determined as part of the main investigation.
  • the invention comprises a corresponding examination device for carrying out the examination method described above.
  • the examination device according to the invention preferably has optics to record an image of the particles.
  • the optics of the examination device according to the invention can preferably be adjusted in order to adjust the magnification, the focus and / or the field of view or to select a specific optical filter, wherein the optics can be adjusted by an actuator (e.g. an electric motor).
  • an actuator e.g. an electric motor
  • the braking of the particles is preferably carried out by a dielectrophoretic cage, which is known per se.
  • the dielectrophoretic cage not only serves to brake the suspended particles for a detailed examination, but also fulfills the function of a switch or switch, in that the suspended particles are dependent on the detailed examination by the Cage can be fed to one of several output lines.
  • the individual electrodes of the dielectrophoretic cage can preferably be controlled independently of one another.
  • the dielectrophoretic cage is preferably arranged at the branching point of the output lines for this purpose.
  • a funnel-shaped electrode arrangement (“funnel”) can be arranged in one or more of the output lines in order to prevent the suspended particles in the output lines from sinking.
  • the carrier stream in the outlet lines has a speed profile that shows only a low flow velocity near the wall, so that a sinking of the particles in the outlet lines could lead to deposits near the wall.
  • the suspended particles are supplied via two separate carrier flow lines which open into a common carrier flow line.
  • a partition can be arranged in the common carrier flow line, which also separates two separate partial flows from one another in the common carrier flow line, the two partial flows being able to be subjected to an examination.
  • the particles suspended in the two partial streams can then be combined.
  • the combined particles can then be fixed in a dielectrophoretic cage in the manner described above and subjected to a detailed examination.
  • the cells released from the dielectrophoretic cage can then be fed to one of several output lines.
  • a particular advantage of the invention is the fact that cells can be examined under aseptic, low-germ conditions and isolated accordingly.
  • FIG. 1 shows a fluidic diagram of a cell sorter according to the invention with a sorting chip
  • FIG. 2 shows the carrier current channel of the sorting chip with several dielectrophoretic elements
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of the examination optics of the cell sorter from FIG. 1,
  • Figure 4 is a graph to illustrate the distinction between dead and living biological
  • Figure 5a-5e an example of the examination method according to the invention in the form of a flow chart
  • FIGS. 6-9 alternative embodiments of the carrier current channel of the sorting chip with a plurality of dielectrophoretic elements.
  • FIG. 1 shows a cell sorter according to the invention, which uses a microfluidic sorting chip 1 to sort biological cells dielectrophoretically.
  • the sorting chip 1 has a plurality of connections 2-6 for fluidic contacting, the fluidic contacting of the connections 2-6 being described in DE 102 13 272, the content of which is attributable to the present description.
  • the connection 2 of the sorting chip 1 serves to receive a carrier current with the biological cells to be sorted, while the connection 3 of the sorting chip 1 serves to discharge the selected biological cells, which are not further examined on the sorting chip 1.
  • the selected biological cells can be collected by a suction syringe 7, which can be connected to the connection 3 of the sorting chip 1.
  • the output 5 of the sorting chip 1 serves to remove the biological cells of interest, which can then be further processed or examined.
  • connections 4 and 6 of the sorting chip 1 serve to supply a so-called envelope current, which has the task of connecting the selected biological cells to the connection 5 of the
  • connections 4 and 6 of the sorting chip are connected via two sheath flow lines 8, 9, a Y-piece 10 and a four-way valve 11 to a pressure vessel 12 in which a cultivation medium for the sheath flow is located.
  • the pressure vessel 12 is pressurized via a compressed air line 13 so that the buffer solution (for example a cultivation medium) in the pressure vessel 12 with a corresponding position of the four-way valve 11 via the Y-piece 10 and the sheath flow lines 8, 9 flows to the connections 4, 6 of the sorting chip 1.
  • the sheath flow can alternatively also be realized using principles other than the pressure container 12 with the buffer solution, such as, for example, a syringe pump or a peristaltic pump.
  • connection 2 of the sorting chip 1 is connected to a particle injector 15 via a carrier current line 14.
  • the particle injector 15 is connected via a T-piece 16 to a carrier flow syringe 17, which is mechanically driven and injects a predetermined liquid flow of a carrier flow.
  • the T-piece 16 is connected upstream via a further four-way valve 18 and a sheath flow line 19 to a three-way valve 20.
  • the three-way valve 20 enables the sheath flow lines 8, 9 and the carrier flow line 14 to be flushed before the actual operation.
  • the three-way valve 20 is connected upstream via a peristaltic pump 21 to three three-way valves 22.1-22.3, to each of which a syringe reservoir 23.1-23.3 is connected.
  • the syringe reservoirs 23.1-23.3 are used to supply a filling stream for flushing the entire fluidic system before the actual operation, the
  • Syringe reservoir 23.1 e.g. Contains 70% ethanol, while the syringe reservoir 23.2 preferably contains aqua destillata as filler substance.
  • the syringe reservoir 23.3 contains e.g. a buffer solution as a filling flow substance.
  • the cell sorter has a collecting container 27 for excess envelope flow and a collection container 28 for excess filling flow.
  • the rinsing process which is carried out before the cell sorter is actually operated is first described below in order to free the sheath flow lines 8, 9, the carrier flow line 14 and the remaining fluid system of the cell sorter from air bubbles and contaminants.
  • the three-way valve 22.1 is first opened and ethanol is injected from the syringe reservoir 23.1 as a filling stream, the ethanol being initially conveyed to the three-way valve 20 by the peristaltic pump 21.
  • the ethanol is used both to reduce the number of bacteria in the system (for setting up an aseptic analysis and selection process) and to completely displace the air from the fluidic system.
  • the three-way valve 20 is set such that a part of the filling flow conveyed by the peristaltic pump 21 is passed on via the filling flow line 19, while the remaining part of the filling flow conveyed by the peristaltic pump 21 is passed on to the four-way -Valve 11 arrives.
  • the two four-way valves 11, 18 are in turn set so that the filling flow is passed through the sheath flow lines 8, 9 and the carrier power line 14. Cultivation medium also flows from the pressure container 12 into the collecting container 27 in order to briefly flood the lines.
  • the three-way valves 22.1-22.3 are closed and the peristaltic pump 21 is switched off.
  • the four-way valve 11 is set in such a way that the pressure vessel 12 is connected to the Y-piece 10, so that the culture medium located in the pressure vessel 12, due to the excess pressure prevailing in the pressure vessel 12, into the sheath flow lines 8, 9 is pressed.
  • the four-way valve 18 is set during the sorting operation so that there is no flow connection between the T-piece 16 and the four-way valve 18.
  • the carrier flow injected by the carrier flow syringe 17 then flows via the T-piece 16 into the particle injector 15, wherein 29 biological cells are injected into the carrier flow by a further injection syringe.
  • the carrier stream with the injected biological cells then flows from the particle injector 15 via the carrier stream line 14 to the connection 2 of the sorting chip.
  • a temperature sensor 30 is attached to the particle injector 15 in order to measure the temperature T of the particle injector 15.
  • a temperature control element 31 in the form of a Peltier element around which the To be able to heat or cool the particle injector 15 and the sorting chip 1.
  • the heating or cooling energy Q is predefined here by a temperature controller 32, which is connected on the input side to the temperature sensor 30 and regulates the temperature T of the particle injector 15 to a predefined setpoint.
  • a carrier current channel 33 is now described below with reference to FIG. 2, which is arranged in the sorting chip 1 of the cell sorter and branches into two output lines 34, 35, the output line 34 being connected to the connection 5 of the sorting chip 1 and for forwarding the positively selected particle is used, while the output line 35 is connected to the connection 3 of the sorting chip 1 and is used to discharge the selected particles.
  • a funnel-shaped electrophoretic electrode arrangement 36 is arranged, which has the task of arranging the particles suspended in the carrier flow one behind the other in the carrier flow channel 33.
  • the exact technical structure and the mode of operation of the electrode arrangement 36 is described in the publication by Müller, T. et al. described, the content of which is attributable to the present description, so that a detailed description of the electrode arrangement 36 can be dispensed with below.
  • a dielectrophoretic cage 37 is arranged in the carrier flow channel 33, which enables the particles suspended in the carrier current 33 to be captured and used for an in-depth examination. fixation in an examination window UF.
  • the dielectrophoretic cage 37 reference is also made to the publication by Müller, T. et al. referenced, so that a detailed description can be dispensed with in this regard.
  • a sorting device which consists of a dielectrophoretic electrode arrangement 38, with regard to the structure and the functioning of the electrode arrangement 38 also referring to the publication by Müller, T. et al , is referred.
  • the electrode arrangement 38 sorts the particles suspended in the carrier stream either into the outlet line 34 or into the outlet line 35, the selection taking place as a function of a main inspection carried out on the particles fixed in the cage 37, as will be described in detail below.
  • a flow guide device is arranged, which likewise consists of a dielectrophoretic electrode arrangement 39 and has the task of preventing particles from flowing back from the outlet line 35 into the outlet line 34.
  • the electrode arrangement 39 is V-shaped and has two legs, one leg of the electrode arrangement 39 projecting into the output line 34, while the other leg of the electrode arrangement 39 projects into the output line 35.
  • FIGS. 2 and 3 describe how the particles suspended in the carrier stream are examined in the sorting chip 1.
  • a transmitted light measurement is first carried out in an examination window ROH (region of interest 1) and a fluorescence measurement in another examination window ROI2 (region of interest 2), the examination window ROH in the carrier flow channel 33 upstream of the examination window ROI2 for the fluorescence measurement is arranged.
  • Both the transmitted light measurement and the fluorescence measurement are carried out here by the detection unit D shown schematically in FIG. 3, which has a CCD camera 40 for image acquisition, which is arranged below the sorting chip 1 and is aligned with a deflection mirror 41.
  • the sorting chip 1 is a light source for the
  • a light-emitting diode 42 is arranged, a condenser 43 being located between the light-emitting diode 42 and the sorting chip 1, which can have, for example, a phase contrast diaphragm.
  • a lens 44 is arranged below the sorting chip 1 in the beam path of the condenser 43.
  • the CCD camera 40 therefore takes an image of the examination window ROH via the deflection mirror 41 and the objective 44.
  • the detection unit D has a plurality of electromotive actuators 45.1-45.3, which enable the objective 44, the filter block 47 or the deflection mirror 41 to be adjusted.
  • the adjustment of the objective 44 enables the magnification and the focus to be changed.
  • the filter block 47 can be adjusted to select different filters.
  • the adjustment of the deflecting In contrast, gel 41 has the purpose of shifting the field of view along the carrier flow channel 33 in order to be able to recognize any deposits in the carrier flow channel 33.
  • the detection unit D has a light source 46 (e.g. a laser), which enables a fluorescence excitation of the biological cells suspended in the carrier current line 33 via a filter block 47, the CCD camera 40 taking a corresponding fluorescence image.
  • a light source 46 e.g. a laser
  • FIG. 4 shows a living cell 48 and a dead cell 49 in the upper region and the associated intensity profiles 50, 51 in the fluoroscopic image in the lower region. It can be seen from this that the living cell 48 has a relatively dark nucleus, whereas the dead cell 49 is uniformly illuminated on the inside, which makes it possible to distinguish the living cell 48 from the dead cell 49, as will be described in detail.
  • the carrier flow line 14 and the sheath flow lines 8, 9 are first rinsed with a 70% ethanol solution, then with aqua destillata and finally with a buffer solution in order to clean the fluid sorter of the cell sorter and, in particular, to remove air bubbles and dirt.
  • the carrier stream is then injected from the carrier stream syringe 17 into the carrier stream line 14, the biological cells to be examined being injected from the injection syringe 29 at the particle injector 15 into the carrier stream after the supply of the sheath stream as described below.
  • the culture medium in the pressure vessel 12 for the enveloping stream is pressed out of the pressure vessel 12 into the enveloping stream lines 8, 9 by the compressed air supplied via the compressed air line 13, which leads into the connections 4 and 6 of the sorting chip 1 and the forwarding support the particles selected in the sorting chip 1 via the connection 5 of the sorting chip 1.
  • the suspended particles are first lined up in succession in the flow direction by the electrode arrangement 36, as is indicated schematically by a dashed arrow.
  • phase contrast images Bi, ..., B n are recorded one after the other in order to determine the speed of movement of the suspended particles and to distinguish living from dead cells, as will be described in detail below.
  • an intensity signal Ii, ..., I n is determined for each of the phase contrast images Bi, ..., B n by the image intensity in the phase contrast images B ⁇ , ..., B n in columns, ie at right angles to the direction of flow, is integrated.
  • the individual intensity signals Ii, ..., I n therefore each have a signal peak at the location of a biological cell, with a signal peak between the in- shifts intensity signals I ⁇ , ..., I n according to the speed of movement of the cells and the time interval between the intensity signals I ⁇ , ..., I n .
  • a cross correlation function ⁇ i is calculated for successive intensity signals Ii, Ii + i.
  • the calculation of the cross-correlation function ⁇ i serves to determine the speed of movement of the cells in the carrier flow channel 33 of the sorting chip 1 so that the electrophoretic cage 37 can be actuated at the right time to catch a specific cell.
  • the maxima are then calculated for the individual cross-correlation functions ⁇ i (x) as a function of the displacement x in the longitudinal direction of the carrier flow channel 33.
  • the movement speed v of the cells in the carrier current channel 33 results from this as the quotient of the mean value of the maxima of the cross-correlation functions and the time interval between the successive phase contrast images Bi, ..., B n .
  • the speed of movement v of the cells can be used in a feedback for pump control, i.e. to check whether the calculated and actual pumping rate match and how it may need to be adjusted.
  • the speed of movement v can be used to identify whether there are faults in the system which cause the cells to flow too slowly (constipation), stop or even flow backwards. All of these faults can be identified and eliminated in this way, e.g. by flushing the system.
  • the above-described determination of the speed of movement v of the cells can alternatively also be carried out outside the examination window ROH, ROI2 take place. Basically, it is possible to track the cell movement within the entire carrier flow channel 33 or any areas of the carrier flow channel 33.
  • the signal form of the intensity signals I ⁇ , ..., I n provides information about the size of the particles and any aggregate formation.
  • the evaluation of the intensity signals is important for the control and automation of the entire system, namely the pumps, the dielectrophoretic electrode elements (for example, when is “switching” and when “switching"), the detailed image recording in the cage 37 and the sample storage.
  • the capture time t F is then calculated at which the cage 37 has to be activated in order to capture the examined particles for the subsequent main inspection in the examination window UF.
  • the capture time t F is simply the result of the speed of movement v of the particle and the distance to the cage 37.
  • the particle spacing d P between adjacent particles is also determined. This is important for the distinction between a single cell and a cell aggregate, as will be described in detail.
  • cell edge points i, x r are determined at which the intensity in the phase contrast image exceeds a predetermined limit value I TH . It is then checked whether there is an intensity minimum between the cell edge points xi, x r . If this is the case and there is a minimum intensity, then the cell is a living cell, as can be seen from FIG. 4. Otherwise, the cell is classified as dead, in order to subsequently make a corresponding selection, as will be described in detail below.
  • the luminance L of the individual cells is determined in the method section in FIG. 5d by integrating the intensity I of a cell between the cell edge groups xi and x r .
  • the luminance L so determined is compared to the cell with a minimum value L m i n and a maximum value L max.
  • the transmitted light illumination is switched off and the fluorescence excitation by the light source 46 is switched on.
  • a fluorescence image is then recorded in the examination window ROI2 and the fluorescence I of the cell is measured.
  • the fluorescence excitation it is also possible for the fluorescence excitation to be switched on permanently, with only the transmitted light illumination being switched off if the determined luminance of the cell is within the aforementioned window.
  • the predetermined threshold may I m i n below, so assumed that the cell in question does not carry a fluorescent amplifier.
  • certain cells are then selected, taking into account the distinction between living and dead cells and the check for a fluorescent marker. For example, those cells can be selected which are alive and which carry a fluorescent marker, whereas other cells are selected.
  • the cells selected in this way are then captured in the dielectrophoretic cage 37 at the predetermined capture time t F and thereby fixed, so that a main inspection of the captured cell with a higher resolution and a longer exposure time is subsequently possible.
  • the selected cells ie generally the living cells provided with a fluorescent marker, are then passed from the electrode arrangement 38 into the output line 34. left, whereas the selected cells (eg dead cells) are conveyed into the output line 35.
  • the main examination in the examination window UF can be images with fluorescence excitation, one or more excitation wavelengths being used simultaneously or at different times.
  • suitable dichroic mirrors are used in the filter block 47.
  • the fluorescent light from one or more wavelengths is simultaneously directed to one or more cameras.
  • Suitable emission filter inserts in filter block 47 or suitable emission splitters are used for this purpose. It is thus possible to generate images of the selected cell with several fluorescent colors simultaneously or in succession. It is also possible to generate an image of the selected cell with white-light phase contrast illumination. This is necessary to determine whether one or more non-fluorescence-labeled cells are still attached to a fluorescence-labeled cell, which leads to a — generally undesirable — contamination of this one fluorescence-labeled cell.
  • FIG. 6 largely corresponds to the exemplary embodiment shown in FIG. 2, so that in order to avoid repetition reference is made to the above description and the same reference numerals are used below for corresponding components, which are identified only by an apostrophe for differentiation.
  • a special feature of this exemplary embodiment is the simpler structural design of the dielectrophoretic electrode arrangement 36 'arranged in the carrier flow channel 33' on the input side, oscillated particles in the carrier flow channel 33 'one behind the other.
  • a further peculiarity of this exemplary embodiment is that a hook-shaped electrode arrangement 52 'is arranged downstream of the electrode arrangement 36' in the carrier flow channel 33 ', which is also referred to as a "hook” in accordance with its shape and has the task of holding particles and virtually parking them ,
  • the exact structure and mode of operation of the electrode arrangement 52 ' is described, for example, in Müller, T. et al. : “Life Cells in Cellprocessors" in Bioworld 2-2002, so that a detailed description of the electrode arrangement 52 'can be dispensed with here and the content of the above publication can be fully attributed to this description.
  • Another examination window 54 ' is located in the dielectrophoretic cage 37', so that the decelerated particles can be examined in the di-electrophoretic cage 37 '.
  • a further special feature of this exemplary embodiment is that a funnel-shaped electrode arrangement 55 'is arranged in the output line 34' for the positively selected particles, the function of which corresponds to the electrode arrangement 36 'and the function of which is to supply the particles in the output line 34' center.
  • This is advantageous because the particles in the outlet line 34 'have a tendency to have sunk and can therefore deposit close to the wall where the flow velocity is low.
  • the electrode arrangements 36 ', 52' and the dielectrophoretic cage 37 ' are arranged off-center in the carrier current line 33'.
  • the particles contained in the carrier stream after being released by the dielectrophoretic cage 37 ', automatically enter the output line 35' for negatively selected particles if the electrode arrangement 38 'is not activated.
  • FIG. 7 largely corresponds to the exemplary embodiment described above and shown in FIG. 6, so that in order to avoid repetition reference is made to the above description and in the following the same reference numerals are used for corresponding components which are used to distinguish them two apostrophes are marked.
  • a special feature of this exemplary embodiment is that the dielectrophoretic cage 37 "is arranged at the point at which the carrier current channel 33" branches into the two output lines 34 ", 35".
  • the individual electrodes of the dielectrophoretic cage 37 " can be controlled separately, so that the dielectrophoretic cage 37" can perform two functions, namely the function of a cage ("cage") and others the function of a switch.
  • the dielectrophoretic cage 37 can thus fix the particles in the carrier stream on the one hand for the examination in the examination window 54" and on the other hand feed the particles to one of the two output lines 34 ", 35".
  • branch point used in the context of the present description is to be understood generally and is not restricted to the geometric intersection of the output lines. Rather, it is also possible for the cage 37 "or the switch to be arranged upstream of the intersection of the output lines.
  • branching point also includes the so-called" sepa-matrix ". This is the dividing line of the laminar flow in the carrier flow channel.
  • the electrode arrangements 36 ′′, 52 ′′, the cage 37 ′′ and the measuring stations 53 ′′, 54 ′′ are arranged centrally in the carrier current channel 33 ′′ here and in the following exemplary embodiments.
  • FIG. 8 largely corresponds to the exemplary embodiment described above and shown in FIG. 7, so that in order to avoid repetition, reference is made to the above description and the same reference numerals are used below for corresponding components, which, however, are used to distinguish them three apostrophes are marked.
  • a special feature of this exemplary embodiment is the constructive design of the dielectrophoretic cage 37 '", which here only consists of six spatially arranged electrodes, the individual electrodes being controllable separately are so that the cage 37 '"can either act as a switch or switch or as a cage.
  • FIG. 9 finally shows a further exemplary embodiment of a possible arrangement in a sorting chip.
  • two carrier flow lines 56, 57 open into a common carrier flow line 58, suspended particles being supplied in each case via the two carrier flow lines 56, 57.
  • a funnel-shaped electrode arrangement 59, 60 is arranged in each of the two carrier flow lines 56, 57 in order to center the particles contained in the carrier flows of the two carrier flow lines 56, 57.
  • the common carrier flow channel 58 there is a partition 61 upstream at the junction of the two carrier flow lines 56, 57, so that the particles suspended in the carrier flows of the two carrier flow lines 56, 57 are first carried in parallel next to one another and separately from one another in the carrier flow line 58.
  • a further electrode arrangement 67 Downstream of the dielectrophoretic cage 65 there is a further electrode arrangement 67 which, after being released by the cage 65, supplies the particles suspended in the carrier stream to one of three output lines 68, 69, 70 in the examination window 66 depending on the result of the examination ,
  • the output lines 68, 70 serve to discharge the negatively selected particles, while the outlet line 69 serves to continue the positively selected particles.
  • the electrode arrangement 67 must therefore be actively activated if particles are to be conveyed into the output lines 68, 70 for the negatively selected particles, whereas there is no activation for the positively selected particles. This arrangement is therefore particularly suitable for investigations in which only a few particles are selected negatively.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Untersuchungsverfahren für biologische Partikel, insbesondere zur Ausführung in einem Zellsortierer, mit den folgenden Schritten: Einbringung der zu untersuchenden Partikel in einen Trägerstrom, Durchführung einer ersten Untersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden Partikel, Selektion mindestens eines Partikels in Abhängigkeit von dem Ergebnis der ersten Untersuchung, Abbremsen des selektierten Partikels, Durchführung einer zweiten Untersuchung des selektierten Partikels im abgebremsten Zustand. Weiterhin umfasst die Erfindung eine entsprechende Untersuchungseinrichtung.

Description

MEHRPARAMETRIGΞS ZEL -IDENTIFIKATIONS- UND SORTIERVERFAHREN UND ZUGEHÖRIGE VORRICHTUNG
Die Erfindung betrifft ein üntersuchungsverfahren für vorzugsweise biologische Partikel, insbesondere zur Untersuchung biologischer Zellen in einem Zellsortierer, gemäß Anspruch 1 sowie eine entsprechende Untersuchungseinrichtung gemäß An- spruch 14.
Aus Müller, T. et al . : "A 3-D microelectrode System for hand- ling and caging Single cells and particles", Biosensors and Bioelectronics 14 (1999) 247-256 ist ein Untersuchungsverfah- ren für biologische Zellen bekannt, bei dem die zu untersuchenden Zellen in einem Trägerstrom eines mikrofluidischen Systems suspendiert sind und dielektrophoretisch manipuliert und sortiert werden. In dem Trägerstrom werden die zu untersuchenden Zellen zunächst durch eine trichterförmige di- elektrophoretische Elektrodenanordnung (engl. "Funnel") aufgereiht und anschließend in einem dielektrophoretischen Käfig (engl. "Cage") festgehalten, um die in dem Käfig befindlichen Zellen im ruhenden Zustand untersuchen zu können, wozu mikroskopische, spektroskopische oder fluoreszenzoptische Messme- thoden angewendet werden können. In Abhängigkeit von der Untersuchung der in dem dielektrophoretischen Käfig gefangenen Zellen können diese anschließend sortiert werden, wozu der Bediener eine Sortiereinrichtung ansteuert, die aus einer in dem Trägerstrom stromabwärts hinter dem dielektrophoretischen Käfig angeordneten dielektrophoretischen Elektrodenanordnung besteht .
Nachteilig an dem vorstehend beschriebenen bekannten Untersuchungsverfahren ist, dass die zu untersuchenden Zellen in ei- ner Probe oft sehr unterschiedlich sind. Bei sehr heterogenen Proben, aus denen z.B. gewisse Zielzellen durch ein Verfahren identifiziert und diese Zielzellen dann isoliert werden sollen, machen die Zielzellen oftmals nur einen geringen Anteil an der gesamten Probe aus. Die anderen Zellen tragen nicht die gewünschten Eigenschaften oder sind nicht mehr vital, also bereits tot. Zudem kommt es oft vor, dass die Zellen nicht vollständig vereinzelt sind, sondern dass manche Zellen das System als Aggregat von zwei oder mehr Zellen passieren. Dies ist ein unerwünschtes Ergebnis. Die detaillierte Untersuchung einzelner Zellen oder Aggregate in einem Feldkäfig ist aber ein zeitaufwändiger Prozess, so dass die Untersuchung der gesamten Zellprobe im Feldkäfig sehr lange dauern würde.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, das vorstehend beschriebene bekannte Untersuchungsverfahren dahingehend zu verbessern, dass eine Untersuchung von nicht interessierenden biologischen Zellen (z.B. toten Zellen) oder Zellklumpen in dem dielektrophoretischen Käfig vermieden werden kann.
Die Aufgabe wird, ausgehend von dem eingangs beschriebenen bekannten Untersuchungsverfahren, durch die Merkmale des Anspruchs 1 bzw. - hinsichtlich einer entsprechenden Untersuchungseinrichtung - durch die Merkmale des Anspruchs 14 ge- löst.
Die Erfindung umfasst die allgemeine technische Lehre, vor der Untersuchung der in dem Trägerstrom suspendierten Partikel in dem dielektrophoretischen Käfig zunächst eine Vorun- tersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden Partikel durchzuführen, um die für eine weitere Untersuchung interessanten Partikel anschließend in dem dielektrophoretischen Käfig fangen und untersuchen zu können. Die Voruntersuchung kann beispielsweise die Intensität einer Fluoreszenz, die Vitalität einer Zelle und/oder die Frage betreffen, ob es sich um eine einzelne Zelle oder ein Aggregat handelt. Weiterhin kann bei der Voruntersuchung ermittelt werden, ob es sich um Zellen oder Material handelt, das in Form und Größe nicht Primärziel der näheren Untersuchung ist, z.B. Verunreinigungen oder andere Zellen, sofern sie sich von den Zielzellen unterscheiden.
Bei dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren erfolgt also zunächst eine Voruntersuchung der in dem Trägerstrom suspendierten Partikel und eine Selektion bestimmter Partikel in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Voruntersuchung, während die eigentliche Hauptuntersuchung nur für die zuvor selek- tierten Partikel durchgeführt wird, die hierzu abgebremst werden, um eine aussagefähige Hauptuntersuchung zu ermöglichen, die durch eine Bewegung der Partikel erschwert würde.
Es ist im Rahmen der Erfindung nicht zwingend erforderlich, dass die in Abhängigkeit von der Voruntersuchung selektierten Partikel vor der Hauptuntersuchung vollständig zum Stillstand gebracht werden, indem diese beispielsweise in einem dielektrophoretischen Käfig gefangen werden. Es ist im Rahmen der Erfindung vielmehr auch möglich, dass die in Abhängigkeit von der Voruntersuchung selektierten Partikel in dem Trägerstrom lediglich soweit abgebremst werden, dass eine aussagekräftige Untersuchung der Partikel möglich ist.
Weiterhin ist zu erwähnen, dass der im Rahmen der Erfindung verwendete Begriff eines Partikels allgemein zu verstehen ist und nicht auf einzelne biologische Zellen beschränkt ist. Vielmehr umfasst dieser Begriff auch synthetische oder biologische Partikel, wobei sich besondere Vorteile ergeben, wenn die Partikel biologische Materialien, also beispielsweise biologische Zellen, Zellgruppen, Zellbestandteile oder biologisch relevante Makromoleküle, jeweils ggf. im Verbund mit anderen biologischen Partikeln oder synthetischen Trägerpartikeln umfassen. Synthetische Partikel können feste Partikel, flüssige, vom Suspensionsmedium abgegrenzte Teilchen oder
Mehrphasenpartikel umfassen, die gegenüber dem Suspensionsmedium in dem Trägerstrom eine getrennte Phase bilden.
Vorzugsweise wird der in Abhängigkeit von der Voruntersuchung selektierte und anschließend im Rahmen der Hauptuntersuchung näher untersuchte Partikel in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Hauptuntersuchung sortiert und/oder behandelt. Beispielsweise können bei der Hauptuntersuchung verschiedene Zelltypen unterschieden und anschließend entsprechend sortiert werden. Es ist jedoch auch möglich, die im Rahmen der Voruntersuchung selektierten Partikel in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Hauptuntersuchung durch dielektrophoretische Elemente zu manipulieren, wobei die in der eingangs erwähnten Veröffentlichung von Müller, T. et al . beschriebenen dielektrophoreti- sehen Elemente Verwendung finden können.
Im Rahmen der Voruntersuchung kann beispielsweise eine Durch- lichtmessung, eine Fluoreszenzmessung und/oder eine Impedanzspektroskopie erfolgen. In dem bevorzugten Ausführungsbei- spiel der Erfindung erfolgt jedoch zunächst eine Durchlicht- messung und anschließend eine Fluoreszenzmessung, wobei die Durchlichtmessung und die Fluoreszenzmessung vorzugsweise in räumlich getrennten Untersuchungsfenstern (engl. "Region of Interest") erfolgen. Die Durchlichtmessung kann beispielswei- se die Unterscheidung zwischen lebenden und toten biologischen Zellen ermöglichen, während die Fluoreszenzmessung dazu verwendet werden kann, um zu untersuchen, ob die in dem Trägerstrom suspendierten Partikel einen Fluoreszenzmarker tragen. Falls im Rahmen der Voruntersuchung sowohl eine Durchlichtmessung als auch eine Fluoreszenzmessung in räumlich getrennten Untersuchungsfenstern erfolgt, so ist es vorteilhaft, wenn das Untersuchungsfenster für die Durchlichtmessung im Trägerstrom stromaufwärts vor dem Untersuchungsfenster für die Fluoreszenzmessung liegt. Es ist jedoch alternativ auch möglich, dass das Untersuchungsfenster für die Durchlichtmessung in dem Trägerstrom stromabwärts hinter dem Untersuchungsfenster für die Fluoreszenzmessung angeordnet ist.
Vorzugsweise wird im Rahmen der Voruntersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden Partikel ein optisches Bild aufgenommen, was eine digitale Bildauswertung zur Klassifizierung der Partikel ermöglicht. Vorzugsweise werden die Partikel hierbei morphologisch untersucht, um beispielsweise eine einzelne biologische Zelle von einem Zellklumpen unterscheiden zu können. Der im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff eines optischen Bildes ist jedoch allgemein zu verstehen und nicht auf zweidimensionale Bilder im her- kömmlichen Wortsinne beschränkt. Vielmehr umfasst der Begriff eines optischen Bildes im Sinne der Erfindung auch eine punkt- oder linienför ige optische Abtastung des Trägerstroms bzw. der in dem Trägerstrom suspendierten Partikel. Beispielsweise kann die Helligkeit entlang einer Linie quer zum Trägerstromkanal aufintegriert werden, um einzelne Partikel zu detektieren und zu klassifizieren.
Die Unterscheidung lebender und toter Zellen im Rahmen der Voruntersuchung kann bei einer Durchlichtmessung durch eine Auswertung der Intensitätsverteilung in dem aufgenommenen optischen Bild erfolgen. Ein spezielles Prinzip dieser Durchlichtmessung mit den erwähnten Eigenschaften ist beispielsweise die Phasenkontrast-Beleuchtung. So weisen lebende biologische Zellen eine Ringstruktur mit einem in der Durch- lichtmessung relativ hellen Rand und einem dunkleren Mittelpunkt auf, wohingegen tote biologische Zellen bei einer Durchlichtmessung eine annähernd einheitliche Helligkeit aufweisen und dunkel gegen den Hintergrund erscheinen.
Bei der Hauptuntersuchung der Partikel können beispielsweise bestimmte Moleküle innerhalb einer Zelle lokalisiert werden. Beispielsweise können im Rahmen der Hauptuntersuchung innerhalb einer Zelle Moleküle lokalisiert werden, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Bei dem Fluoreszenzfarbstoff kann es sich beispielsweise um molekularbiologisch produzierte "Tags" von "Green Fluorescent Protein" und dessen Derivate, andere autofluoreszente Proteine handeln. Als Fluoreszenzfarbstoffe eignen sich jedoch auch solche Fluoreszenz- farbstoffe, die an ein zelluläres Molekül kovalent oder nicht-kovalent binden. Darüber hinaus können als Fluoreszenzfarbstoffe auch fluorigene Substanzen eingesetzt werden, die von zellulären Enzymen in fluoreszierende Produkte umgesetzt werden oder sogenannte FRET-Paare (Fluoreszenz Resonanz Ener- gietransfer) . Der Zustand der eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe kann beispielsweise anhand ihrer spektralen Eigenschaften oder durch Bioluminenz unterschieden werden.
Anhand der Lokalisation von Molekülen innerhalb einer Zelle kann auch die Struktur und Funktion der Moleküle ermittelt werden. Hierbei kann beispielsweise unterschieden werden nach dem Vorkommen in der Plasmamembran, im Zytosol, in den Mito- chondrien, im Golgi-Apparat, in Endosomen, in Lysosomen, im Zellkern, im Spindelapparat, im Zytoskelett, Kolokalisation mit Aktin, Tubulin.
Ferner kann im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung die Morphologie einer Zelle bestimmt werden, wobei auch Farbstoffe eingesetzt werden können. Darüber hinaus können im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch zwei oder mehr Zustände einer Zellpopulation unterschieden werden.
Weiterhin ist es im Rahmen der Hauptuntersuchung möglich, ein zelluläres Signal anhand der Translokation eines fluoreszenzmarkierten Moleküls zu bestimmen, z.B. Rezeptoraktivierung gefolgt von Rezeptor-Internalisierung, Rezeptoraktivierung gefolgt von der Bindung von Arrestin, Rezeptoraggregation, Übergang eines Moleküls von der Plasmamembran ins Zytosol, vom Zytosol in die Plasmamembran, vom Zytosol in den Zellkern oder vom Zellkern ins Zytosol.
Ferner kann im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch die Wechselwirkung zweier Moleküle bestimmt werden, wobei vorzugsweise mindestens eines der wechselwirkenden Moleküle einen Fluoreszenzmarker trägt und die Wechselwirkung z.B. durch Kolokalisation zweier Fluoreszenzfarben, ein FRET oder eine Änderung der Fluoreszenz-Lebenszeit gezeigt wird.
Im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung kann jedoch auch der Status einer Zelle innerhalb eines Zellzyklus' bestimmt werden, wobei vorzugsweise die Morphologie der Zelle oder die Anfärbung des zellulären Chromatins ausgewertet wird.
Eine weitere Möglichkeit für die Haupt- und/oder Voruntersuchung besteht darin, das Membranpotential einer Zelle zu bestimmen, wobei vorzugsweise membranpotentialsensitive Farb- Stoffe eingesetzt werden. Vorzugsweise werden hierbei Farbstoffe verwendet, die hinsichtlich des Plasmamembranpotentials und/oder des mitochondrialen Membranpotentials sensitiv sind. Darüber hinaus kann im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch die Vitalität einer Zelle ermittelt werden, wobei vorzugsweise die Morphologie der Zelle ausgewertet wird und/oder fluorigene Substanzen eingesetzt werden, die zwi- sehen lebenden und toten Zellen unterscheiden können.
Ferner können bei der Haupt- und/oder Voruntersuchung auch zytotoxische Effekte untersucht und/oder der intrazelluläre pH-Werte bestimmt werden.
Es ist auch möglich, im Rahmen der Haupt- und/oder Voruntersuchung die Konzentration eines oder mehrerer Ionen innerhalb einer Zelle zu bestimmen.
Auch kann bei der Haupt- und/oder Voruntersuchung eine enzy- matische Aktivität innerhalb einer Zelle ermittelt werden, wobei vorzugsweise fluorigene oder chromogene Substanzen, insbesondere Kinasen, Phosphatasen oder Proteasen, eingesetzt werden können.
Ferner kann bei der Haupt- und/oder Voruntersuchung die Produktionsleistung von Zellen bestimmt werden, die biologische Produkte erzeugen, wie beispielsweise Proteine, Peptide, Antikörper, Kohlenhydrate oder Fette, wobei eine der beschrie- benen Methoden angewendet werden kann.
Schließlich können im Rahmen der Hauptuntersuchung auch Zell- Stress-Pfade, metabolische Pfade, Zellwachstums-Pfade, Zellteilungs-Pfade und andere Signaltransduktions-Pfade bestimmt werden.
Darüber hinaus umfasst die Erfindung eine entsprechende Untersuchungseinrichtung zur Ausführung des vorstehend beschriebenen Untersuchungsverfahrens . Die erfindungsgemäße Untersuchungseinrichtung weist vorzugsweise eine Optik auf, um ein Bild der Partikel aufzunehmen.
Vorzugsweise ist die Optik der erfindungsgemäßen Untersu- chungseinrichtung verstellbar, um die Vergrößerung, den Fokus und/oder das Sehfeld einzustellen oder ein bestimmtes optisches Filter auszuwählen, wobei die Einstellung der Optik durch ein Stellglied (z.B. einen Elektromotor) erfolgen kann.
Es wurde bereits vorstehend ausgeführt, dass die Abbremsung der Partikel vorzugsweise durch einen dielektrophoretischen Käfig erfolgt, der an sich bekannt ist. In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung dient der dielektrophoretische Käfig jedoch nicht nur zum Abbremsen der suspendierten Partikel für eine Detailuntersuchung, sondern erfüllt auch die Funktion eines Schalters (engl. "Switch") oder einer Weiche, indem die suspendierten Partikel in Abhängigkeit von der Detailuntersuchung durch den Käfig einer von mehreren Ausgangsleitungen zugeführt werden. Hierzu sind die einzelnen Elektroden des dielektrophoretischen Käfigs vorzugsweise unabhängig voneinander ansteuerbar. Darüber hinaus ist der dielektrophoretische Käfig hierzu vorzugsweise an der Verzweigungsstelle der Ausgangsleitungen angeordnet.
Darüber hinaus kann in einer oder mehreren der Ausgangsleitungen eine trichterförmige Elektrodenanordnung (engl. "Fun- nel") angeordnet sein, um ein Absinken der suspendierten Partikel in den Ausgangsleitungen zu verhindern. Dies ist vorteilhaft, da der Trägerstrom in den Ausgangsleitungen ein Ge- schwindigkeitsprofil aufweist, das wandungsnah nur eine geringe Strömungsgeschwindigkeit zeigt, so dass ein Absinken der Partikel in den Ausgangsleitungen zu wandnahen Ablagerungen führen könnte. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass die suspendierten Partikel über zwei getrennte Trägerstromleitungen zugeführt werden, die in eine gemeinsame Trägerstromleitung münden. Im Bereich der Mündungsstelle der beiden Trägerstromlei- tungen kann hierbei in der gemeinsamen Trägerstromleitung eine Trennwand angeordnet sein, welche auch noch in der gemeinsamen Trägerstromleitung zwei getrennte Teilströme voneinander trennt, wobei die beiden Teilströme einer Untersuchung unterzogen werden kann. In Abhängigkeit von dem Ergebnis die- ser Untersuchung können die in den beiden Teilströmen suspendierten Partikel dann zusammengeführt werden. Die zusammengeführten Partikel können dann in der vorstehend beschriebenen Weise in einem dielektrophoretischen Käfig fixiert und einer Detailuntersuchung unterzogen werden. Schließlich können die von dem dielektrophoretischen Käfig freigegebenen Zellen dann in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Detailuntersuchung einer von mehreren Ausgangsleitungen zugeführt werden.
Besonders vorteilhaft an der Erfindung ist die Tatsache, dass Zellen unter keimarmen, aseptischen Bedingungen untersucht und entsprechend isoliert werden können.
Andere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet oder werden nachstehend zusam- men mit der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 ein Fluidikdiagramm eines erfindungsgemäßen Zellsortierers mit einem Sortierchip,
Figur 2 den Trägerstromkanal des Sortierchips mit mehreren dielektrophoretischen Elementen, Figur 3 eine schematische Darstellung der Untersuchungsoptik des Zellsortierers aus Figur 1,
Figur 4 ein Schaubild zur Verdeutlichung der Unter- Scheidung von toten und lebenden biologischen
Zellen,
Figur 5a-5e ein Beispiel des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens in Form eines Flussdiagramms sowie
Figuren 6-9 alternative Ausführungsformen des Trägerstromkanals des Sortierchips mit mehreren dielektrophoretischen Elementen.
Die schematische Darstellung in Figur 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Zellsortierer, der mittels eines mikrofluidi- schen Sortierchips 1 biologische Zellen dielektrophoretisch sortiert .
Die Techniken der dielektrophoretischen Beeinflussung von biologischen Zellen sind beispielsweise in Müller, T. et al.: "A 3-D microelectrode System for handling and caging Single cells and particles", Biosensors & Bioelectronics 14 (1999) 247-256 beschrieben, so dass im Folgenden auf eine detaillierte Beschreibung der dielektrophoretischen Prozesse in dem Sortierchip 1 verzichtet wird und diesbezüglich auf die vorstehende Veröffentlichung verwiesen wird.
Der Sortierchip 1 weist zur fluidischen Kontaktierung mehrere Anschlüsse 2-6 auf, wobei die fluidische Kontaktierung der Anschlüsse 2-6 in DE 102 13 272 beschrieben ist, deren Inhalt der vorliegenden Beschreibung zuzurechnen ist. Der Anschluss 2 des Sortierchips 1 dient zur Aufnahme eines Trägerstroms mit den zu sortierenden biologischen Zellen, während der Anschluss 3 des Sortierchips 1 zur Abführung der ausselektierten biologischen Zellen dient, die auf dem Sor- tierchip 1 nicht weiter untersucht werden. Die ausselektierten biologischen Zellen können von einer Saugspritze 7 aufgefangen werden, die an den Anschluss 3 des Sortierchips 1 angeschlossen werden kann. Der Ausgang 5 des Sortierchips 1 dient dagegen zur Abführung der interessierenden biologischen Zellen, die anschließend weiter verarbeitet oder untersucht werden können.
Ferner dienen die Anschlüsse 4 und 6 des Sortierchips 1 zur Zuführung eines sogenannten Hüllstroms, der die Aufgabe hat, die selektierten biologischen Zellen zu dem Anschluss 5 des
Sortierchips 1 zu führen. Hinsichtlich der Funktionsweise des Hüllstroms wird auf die deutsche Patentanmeldung DE 100 05 735 verwiesen, so dass im Folgenden auf eine detaillierte Beschreibung der Funktionsweise des Hüllstroms verzichtet wer- den kann.
Die Anschlüsse 4 und 6 des Sortierchips sind über zwei Hüllstromleitungen 8, 9, ein Y-Stück 10 und ein Vier-Wege-Ventil 11 mit einem Druckbehälter 12 verbunden, in dem sich ein Kul- tivierungsmedium für den Hüllstrom befindet.
Der Druckbehälter 12 wird über eine Druckluftleitung 13 unter Überdruck gesetzt, so dass die in dem Druckbehälter 12 befindliche Pufferlösung (z.B. ein Kultivierungsmedium) bei ei- ner entsprechenden Stellung des Vier-Wege-Ventils 11 über das Y-Stück 10 und die Hüllstromleitungen 8, 9 zu den Anschlüssen 4, 6 des Sortierchips 1 strömt. Der Hüllstrom kann jedoch alternativ auch über andere Prinzipien als durch den Druckbehälter 12 mit der Pufferlösung realisiert werden, wie beispielsweise mit einer Spritzenpumpe oder einer peristaltischen Pumpe.
Der Anschluss 2 des Sortierchips 1 ist dagegen über eine Trägerstromleitung 14 mit einem Partikelinjektor 15 verbunden.
Stromaufwärts ist der Partikelinjektor 15 über ein T-Stück 16 mit einer Trägerstromspritze 17 verbunden, die maschinell angetrieben wird und einen vorgegebenen Flüssigkeitsstrom eines Trägerstroms injiziert.
Darüber hinaus ist das T-Stück 16 stromaufwärts über ein wei- teres Vier-Wege-Ventil 18 und eine Hüllstromleitung 19 mit einem Drei-Wege-Ventil 20 verbunden. Das Drei-Wege-Ventil 20 ermöglicht eine Spülung der Hüllstromleitungen 8, 9 sowie der Trägerstromleitung 14 vor dem eigentlichen Betrieb.
Hierzu ist das Drei-Wege-Ventil 20 stromaufwärts über eine Peristaltikpumpe 21 mit drei Drei-Wege-Ventilen 22.1-22.3 verbunden, an die jeweils ein Spritzenreservoir 23.1-23.3 angeschlossen ist. Die Spritzenreservoire 23.1-23.3 dienen hierbei zur Zuführung eines Füllstroms zum Spülen des gesam- ten Fluidiksystems vor dem eigentlichen Betrieb, wobei das
Spritzenreservoir 23.1 z.B. 70% Ethanol enthält, während das Spritzenreservoir 23.2 als Füllstromsubstanz vorzugsweise Aqua destillata enthält. Das Spritzenreservoir 23.3 enthält z.B. eine Pufferlösung als Füllstromsubstanz.
Ferner weist der Zellsortierer einen Auffangbehälter 27 für überschüssigen Hüllstrom sowie einen Auffangbehälter 28 für überschüssigen Füllstrom auf. Im Folgenden wird zunächst der Spülvorgang beschrieben, der vor dem eigentlichen Betrieb des Zellsortierers durchgeführt wird, um die Hüllstromleitung 8, 9, die Trägerstromleitung 14 und das restliche Fluidiksystem des Zellsortierers von Luft- blasen und Verunreinigungen zu befreien.
Hierzu wird zunächst das Drei-Wege-Ventil 22.1 geöffnet und Ethanol von dem Spritzenreservoir 23.1 als Füllstrom eingespritzt, wobei das Ethanol von der Peristaltikpumpe 21 zu- nächst zu dem Drei-Wege-Ventil 20 gefördert wird. Das Ethanol dient sowohl zur Reduzierung der Keimzahl im System (für das Einrichten eines aseptischen Analyse- und Selektionsprozesses) , als auch zur vollständigen Verdrängung der Luft aus dem fluidischen System.
Während des Spülvorgangs ist das Drei-Wege-Ventil 20 so eingestellt, dass ein Teil des von der Peristaltikpumpe 21 geförderten Füllstroms über die Füllstromleitung 19 weiter geleitet wird, während der restliche Teil des von der Peristal- tikpumpe 21 geförderten Füllstroms zu dem Vier-Wege-Ventil 11 gelangt. Die beiden Vier-Wege-Ventile 11, 18 sind wiederum so eingestellt, dass der Füllstrom durch die Hüllstromleitungen 8, 9 und die TrägerStromleitung 14 durchgeleitet wird. Weiterhin fliesst Kultivierungsmedium aus dem Druckbehälter 12 in den Auffangbehälter 27, um die Leitungen kurz zu fluten.
Nach der vorstehend beschriebenen Spülung des Zellsortierers mit Ethanol erfolgt in der gleichen Weise eine Spülung mit Aqua destillata bzw. Pufferlösung, wobei jeweils die Drei- Wege-Ventile 22.2 bzw. 22.3 geöffnet werden. Bei dem vorstehend beschriebenen Spülvorgang kann überschüssiger Füllstrom von dem Vier-Wege-Ventil 18 in den Auffangbehälter 28 abgeleitet werden.
Nach dem Spülvorgang werden die Drei-Wege-Ventile 22.1-22.3 geschlossen und die Peristaltikpumpe 21 abgeschaltet.
Zur Einleitung des Sortierbetriebs wird das Vier-Wege- Ventil 11 so eingestellt, dass der Druckbehälter 12 mit dem Y-Stück 10 verbunden wird, so dass das in dem Druckbehälter 12 befindliche Kultivierungsmedium aufgrund des in dem Druckbehälter 12 herrschenden Überdrucks in die Hüllstromleitungen 8, 9 gedrückt wird.
Weiterhin wird während des Sortierbetriebs das Vier-Wege- Ventil 18 so eingestellt, dass keine Strömungsverbindung zwischen dem T-Stück 16 und dem Vier-Wege-Ventil 18 besteht.
Der von der Trägerstromspritze 17 eingespritzte Trägerstrom fließt dann über das T-Stück 16 in den Partikelinjektor 15, wobei durch eine weitere Injektionsspritze 29 biologische Zellen in den Trägerstrom eingespritzt werden. Anschließend fließt der Trägerstrom mit den injizierten biologischen Zellen von dem Partikelinjektor 15 über die Trägerstromlei- tung 14 zu dem Anschluss 2 des Sortierchips.
Weiterhin ist zu erwähnen, dass an dem Partikelinjektor 15 ein Temperatursensor 30 angebracht ist, um die Temperatur T des Partikelinjektors 15 zu messen.
Darüber hinaus befindet sich sowohl an dem Partikelinjektor 15 als auch an der Aufnahme für den Sortierchip 1 ein Temperierelement 31 in Form eines Peltier-Elements, um den Partikelinjektor 15 und den Sortierchip 1 beheizen oder abkühlen zu können.
Die Heiz- bzw. Kühlenergie Q wird hierbei von einem Tempera- turregler 32 vorgegeben, der eingangsseitig mit dem Temperatursensor 30 verbunden ist und die Temperatur T des Partikelinjektors 15 auf einen vorgegebenen Sollwert einregelt.
Im Folgenden wird nun unter Bezugnahme auf Figur 2 ein Trä- gerstromkanal 33 beschrieben, der in dem Sortierchip 1 des Zellsortierers angeordnet ist und in zwei Ausgangsleitungen 34, 35 verzweigt, wobei die Ausgangsleitung 34 mit dem Anschluss 5 des Sortierchips 1 verbunden ist und zur Weiterleitung der positiv selektierten Partikel dient, während die Ausgangsleitung 35 mit dem Anschluss 3 des Sortierchips 1 verbunden ist und zum Abführen der ausselektierten Partikel dient.
In dem Trägerstromkanal 33 ist stromabwärts hinter dem An- schluss 2 des Sortierchips 1 eine trichterförmige die- lektrophoretische Elektrodenanordnung 36 angeordnet, welche die Aufgabe hat, die in dem Trägerström suspendierten Partikel in dem Trägerstromkanal 33 hintereinander aufzureihen. Der genaue technische Aufbau und die Funktionsweise der Elektrodenanordnung 36 ist in der eingangs erwähnten Veröffentlichung von Müller, T. et al. beschrieben, deren Inhalt der vorliegenden Beschreibung zuzurechnen ist, so dass im Folgenden auf eine detaillierte Beschreibung der Elektrodenanordnung 36 verzichtet werden kann.
Stromabwärts hinter der Elektrodenanordnung 36 ist in dem Trägerstromkanal 33 ein dielektrophoretischer Käfig 37 angeordnet, der es ermöglicht, die in dem Trägerstrom 33 suspendierten Partikel zu fangen und für eine eingehende Untersu- chung in einem Untersuchungsfenster UF zu fixieren. Hinsichtlich des Aufbaus und der Funktion des dielektrophoretischen Käfigs 37 wird ebenfalls auf die eingangs zitierte Veröffentlichung von Müller, T. et al . verwiesen, so dass diesbezüg- lieh auf eine detaillierte Beschreibung verzichtet werden kann.
In einem Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals 33 stromabwärts hinter dem dielektrophoretischen Käfig 37 befindet sich eine Sortiereinrichtung, die aus einer dielektrophoretischen Elektrodenanordnung 38 besteht, wobei hinsichtlich des Aufbaus und der Funktionsweise der Elektrodenanordnung 38 e- benfalls auf die eingangs zitierte Veröffentlichung von Müller, T. et al. verwiesen wird. Die Elektrodenanordnung 38 sortiert die in dem Trägerstrom suspendierten Partikel entweder in die Ausgangsleitung 34 oder in die Ausgangsleitung 35, wobei die Selektion in Abhängigkeit von einer an den in dem Käfig 37 fixierten Partikeln durchgeführten Hauptuntersuchung erfolgt, wie noch detailliert beschrieben wird.
Ferner ist im Verzweigungsbereich der Trägerstromleitung 33 eine Strömungsleiteinrichtung angeordnet, die ebenfalls aus einer dielektrophoretischen Elektrodenanordnung 39 besteht und die Aufgabe hat, eine Rückströmung von Partikeln aus der Ausgangsleitung 35 in die Ausgangsleitung 34 zu verhindern. Hierzu ist die Elektrodenanordnung 39 v-förmig ausgebildet und weist zwei Schenkel auf, wobei der eine Schenkel der Elektrodenanordnung 39 in die Ausgangsleitung 34 hinein ragt, während der andere Schenkel der Elektrodenanordnung 39 in die Ausgangsleitung 35 hineinragt.
Im Folgenden wird nun anhand der Figuren 2 und 3 beschrieben, wie die in dem Trägerstrom suspendierten Partikel in dem Sortierchip 1 untersucht werden. Im Rahmen einer Voruntersuchung der Partikel erfolgt zunächst eine Durchlichtmessung in einem Untersuchungsfenster ROH (region of interest 1) sowie eine Fluoreszenzmessung in einem weiteren Untersuchungsfenster ROI2 (region of interest 2) wo- bei das Untersuchungsfenster ROH in dem Trägerstromkanal 33 stromaufwärts vor dem Untersuchungsfenster ROI2 für die Fluoreszenzmessung angeordnet ist.
Sowohl die Durchlichtmessung als auch die Fluoreszenzmessung erfolgt hierbei durch die in Figur 3 schematisch dargestellte Detektionseinheit D, die zur Bilderfassung eine CCD-Kamera 40 aufweist, die unterhalb des Sortierchips 1 angeordnet und auf einen Umlenkspiegel 41 ausgerichtet ist.
Oberhalb des Sortierchips 1 ist als Lichtquelle für die
Durchlichtmessung eine Leuchtdiode 42 angeordnet, wobei sich zwischen der Leuchtdiode 42 und dem Sortierchip 1 ein Kondensor 43 befindet, der beispielsweise eine Phasenkontrastblende aufweisen kann.
Unterhalb des Sortierchips 1 ist im Strahlengang des Kondensors 43 ein Objektiv 44 angeordnet.
Bei der Durchlichtmessung nimmt die CCD-Kamera 40 also über den Umlenkspiegel 41 und das Objektiv 44 ein Bild des Untersuchungsfensters ROH auf.
Weiterhin weist die Detektionseinheit D mehrere elektromotorische Stellglieder 45.1-45.3 auf, die eine Verstellung des Objektivs 44, des Filterblocks 47 bzw. des Umlenkspiegels 41 ermöglichen. Die Verstellung des Objektivs 44 ermöglicht hierbei eine Änderung der Vergrößerung und des Fokus. Der Filterblock 47 kann dagegen verstellt werden, um unterschiedliche Filter auszuwählen. Die Verstellung des Umlenkspie- gels 41 hat dagegen den Zweck, das Sehfeld entlang dem Trägerstromkanal 33 zu verschieben, um etwaige Ablagerungen in dem Trägerstromkanal 33 erkennen zu können.
Zur Fluoreszenzanregung bei der Fluoreszenzmessung weist die Detektionseinheit D eine Lichtquelle 46 (z.B. ein Laser) auf, die über einen Filterblock 47 eine Fluoreszenzanregung der in der Trägerstromleitung 33 suspendierten biologischen Zellen ermöglicht, wobei die CCD-Kamera 40 ein entsprechendes Fluo- reszenzbild aufnimmt.
Im Folgenden werden anhand von Figur 4 die unterschiedlichen Erscheinungsformen biologischer Zellen in dem Durchleuchtungsbild beschrieben So zeigt die Darstellung in Figur 4 im oberen Bereich eine lebende Zelle 48 sowie eine tote Zelle 49 und im unteren Bereich die zugehörigen Intensitätsverläufe 50, 51 in dem Durchleuchtungsbild. Daraus ist erkennbar, dass die lebende Zelle 48 einen relativ dunklen Kern aufweist, wohingegen die tote Zelle 49 im Inneren gleichmäßig ausgeleuch- tet ist, was eine Unterscheidung der lebenden Zelle 48 von der toten Zelle 49 ermöglicht, wie noch detailliert beschrieben wird.
Im Folgenden wird nun anhand des in den Figuren 5a bis 5e dargestellten Flußdiagramms das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren beschrieben.
Zu Beginn des Verfahrens werden zunächst die Trägerstromleitung 14 und die Hüllstromleitungen 8, 9 mit einer 70%-igen Ethanollösung, anschließend mit Aqua destillata und schließlich mit einer Pufferlösung gespült, um das Fluidiksystem des Zellsortierers zu reinigen und insbesondere von Luftblasen und Verschmutzungen zu befreien. Anschließend wird dann aus der Trägerstromspritze 17 der Trägerstrom in die Trägerstromleitung 14 eingespritzt, wobei nach der Zufuhr des Hüllstroms wie nachfolgend beschrieben die zu untersuchenden biologischen Zellen von der Injektions- spritze 29 an dem Partikelinjektor 15 in den Trägerstrom eingespritzt werden.
Weiterhin wird das in dem Druckbehälter 12 befindliche Kultivierungsmedium für den Hüllstrom durch die über die Druck- luftleitung 13 zugeführte Druckluft aus dem Druckbehälter 12 heraus in die Hüllstromleitungen 8, 9 gedrückt, die in die Anschlüsse 4 bzw. 6 des Sortierchips 1 münden und die Weiterleitung der in dem Sortierchip 1 selektierten Partikel über den Anschluss 5 des Sortierchips 1 unterstützen.
In dem Trägerstromkanal 33 des Sortierchips 1 werden die suspendierten Partikel zunächst durch die Elektrodenanordnung 36 in Strömungsrichtung hintereinander aufgereiht, wie schematisch durch einen gestrichelten Pfeil angedeutet ist.
Anschließend werden in dem Untersuchungsfenster ROH zeitlich hintereinander mehrere Phasenkontrastbilder Bi, ... , Bn aufgenommen, um die Bewegungsgeschwindigkeit der suspendierten Partikel zu ermitteln und lebende von toten Zellen zu unter- scheiden, wie nachfolgend detailliert beschrieben wird.
Zur Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeit der suspendierten Partikel wird für jedes der Phasenkontrastbilder Bi, ...,Bn jeweils ein Intensitätssignal Ii, ...,In ermittelt, indem die Bildintensität in den Phasenkontrastbildern Bι,...,Bn spaltenweise d.h. rechtwinklig zur Strömungsrichtung, aufintegriert wird. Die einzelnen Intensitätssignale Ii, ... , In weisen also jeweils an der Stelle einer biologischen Zelle eine Signalspitze auf, wobei sich eine Signalspitze zwischen den In- tensitätssignalen Iι,...,In entsprechend der Bewegungsgeschwindigkeit der Zellen und dem zeitlichen Abstand zwischen den Intensitätssignalen Iι,...,In verschiebt.
Anschließend wird für zeitlich aufeinander folgende Intensitätssignale Ii, Ii+i jeweils eine Kreuzkorrelationsfunktion φi berechnet. Die Berechnung der Kreuzkorrelationsfunktion φi dient zur Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeit der Zellen in dem Trägerstromkanal 33 des Sortierchips 1, damit der die- lektrophoretische Käfig 37 im richtigen Zeitpunkt angesteuert werden kann, um eine bestimmte Zelle zu fangen.
Anschließend werden für die einzelnen Kreuzkorrelationsfunktionen φi(x) in Abhängigkeit von der Verschiebung x in Längs- richtung des Trägerstromkanals 33 die Maxima berechnet.
Die Bewegungsgeschwindigkeit v der Zellen in dem Trägerstromkanal 33 ergibt sich daraus als Quotient aus dem Mittelwert der Maxima der Kreuzkorrelationsfunktionen und dem zeitlichen Abstand zwischen den aufeinander folgenden Phasenkontrastbil- dern Bi, ... ,Bn.
Die Bewegungsgeschwindigkeit v der Zellen kann im Rahmen einer Rückkopplung zur Pumpensteuerung verwendet werden, d.h. zur Kontrolle, ob berechnete und tatsächliche Pumprate übereinstimmen und wie ggf. nachgeregelt werden muss. Insbesondere kann anhand der Bewegungsgeschwindigkeit v erkannt werden, ob es Störungen im System gibt, aufgrund derer die Zellen zu langsam fliessen (Verstopfung) , stehenbleiben oder sogar rückwärts fliessen. Alle diese Störungen können so erkannt und behoben werden, z.B. durch Spülen des Systems.
Die vorstehend beschriebene Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeit v der Zellen kann jedoch alternativ auch außerhalb der Untersuchungsfenster ROH, ROI2 erfolgen. Grundsätzlich ist eine Verfolgung der Zellbewegung (engl.: "Cell Tracking") innerhalb des gesamten Trägerstromkanals 33 oder beliebiger Bereiche des Trägerstromkanals 33 möglich.
Darüber hinaus liefert die Signalform der Intensitätssignale Iι,...,In Informationen über die Größe der Partikel und eine etwaige Aggregatbildung. Insgesamt ist die Auswertung der Intensitätssignale wichtig für die Steuerung und Automatisie- rung der gesamten Anlage, nämlich der Pumpen, der dielektrophoretischen Elektrodenelemente (z.B. wann erfolgt "Ca- ging" und wann "Switching") , der detaillierten Bildaufnahme in dem Käfig 37 und der Probenablage.
In einem weiteren Schritt wird dann der Fangzeitpunkt tF berechnet, zu dem der Käfig 37 angesteuert werden muss, um den untersuchten Partikel für die anschließende Hauptuntersuchung in dem Untersuchungsfenster UF zu fangen. Der Fangzeitpunkt tF ergibt sich hierbei einfach aus der Bewegungsgeschwindig- keit v des Partikels und dem Abstand zu dem Käfig 37.
Ferner wird in einem weiteren Schritt der Partikelabstand dP zwischen benachbarten Partikeln ermitteln. Dies ist wichtig für die Unterscheidung zwischen einer einzelnen Zelle und ei- nem Zellaggregat, wie noch detailliert beschrieben wird.
Im Folgenden wird nun der in Figur 5c beschriebene Verfahrensabschnitt erläutert, in dem eine Unterscheidung von toten und lebenden Zellen erfolgt. Hierzu werden jeweils Zellrand- punkte i, xr ermittelt, bei denen die Intensität in dem Pha- senkontrastbild einen vorgegebenen Grenzwert ITH überschreitet. Anschließend wird überprüft, ob sich zwischen den Zellrandpunkten xi, xr ein Intensitätsminimum befindet. Falls dies der Fall ist und eine Mindestintensität vorhanden ist, so handelt es sich bei der Zelle um eine lebende Zelle, wie aus Figur 4 ersichtlich ist. Andernfalls wird die Zelle dagegen als tot klassifiziert, um nachfolgend eine entsprechende Selektion vorzunehmen, wie noch detailliert beschrieben wird.
Nach der vorstehend beschriebenen Unterscheidung von toten und lebenden Zellen wird in dem Verfahrensabschnitt in Figur 5d die Leuchtdichte L der einzelnen Zellen ermittelt, indem die Intensität I einer Zelle zwischen den Zellrandgruppen xi und xr aufintegriert wird.
Anschließend wird die so ermittelte Leuchtdichte L der Zelle mit einem Minimalwert Lmin und einem Maximalwert Lmax verglichen.
Falls sich die ermittelte Leuchtdichte der Zelle innerhalb dieses Fensters befindet, so wird die Durchlichtbeleuchtung ausgeschaltet und die Fluoreszenzanregung durch die Lichtquelle 46 eingeschaltet. Anschließend wird dann ein Fluoreszenzbild in dem Untersuchungsfenster ROI2 aufgenommen und die Fluoreszenz I der Zelle gemessen.
Es ist jedoch auch möglich, dass die Fluoreszenzanregung dauerhaft angeschaltet ist, wobei lediglich die Durchlichtbeleuchtung ausgeschaltet wird, wenn sich die ermittelte Leuchtdichte der Zelle innerhalb der vorstehend erwähnten Fensters befindet.
Falls die gemessene Fluoreszenz IF der Zelle einen vorgegebenen Grenzwert Imj.n überschreitet, so deutet dies darauf hin, dass die betreffende Zelle einen Fluoreszenzmarker trägt. Falls die gemessene Fluoreszenz IF dagegen den vorgegebenen Grenzwert Imin unterschreitet, so kann davon ausgegangen werden, dass die betreffende Zelle keinen Fluoreszenz arker trägt .
In dem in Figur 5e dargestellten Verfahrensabschnitt werden dann bestimmte Zellen selektiert, wobei die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen sowie die Überprüfung auf einen Fluoreszenzmarker berücksichtigt wird. Beispielsweise können solche Zellen selektiert werden, die lebend sind und einen Fluoreszenzmarker tragen, wohingegen andere Zellen ausselektiert werden.
In einem weiteren Schritt erfolgt dann eine Unterscheidung von einzelnen Zellen einerseits und Zellaggregaten andererseits, indem der zuvor ermittelte Partikelabstand dP mit einem vorgegebenen Minimalwert dMιN verglichen wird. Beim Unterschreiten des Minimalwerts dMiN wird davon ausgegangen, dass der Partikel ein Zellaggregat ist, so dass das Verfahren be- endet wird. Falls der Partikelabstand dP den vorgegebenen Minimalwert dMIN dagegen überschreitet, so wird davon ausgegangen, dass der Partikel eine einzelne Zelle ist und das Verfahren wird mit den nachfolgend beschriebenen Schritten fortgeführt .
Die auf diese Weise selektierten Zellen werden dann zu dem vorbestimmten Fangzeitpunkt tF in dem dielektrophoretischen Käfig 37 gefangen und dadurch fixiert, so dass anschließend eine Hauptuntersuchung der gefangenen Zelle mit einer höheren Auflösung und einer größeren Belichtungszeit möglich ist.
Die selektierten Zellen, d.h. in der Regel die lebenden und mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Zellen, werden dann von der Elektrodenanordnung 38 in die Ausgangsleitung 34 wei- tergelassen, wohingegen die ausselektierten Zellen (z.B. tote Zellen) in die Ausgangsleitung 35 befördert werden.
Bei der Hauptuntersuchung in dem Untersuchungsfenster UF kann es sich um Bilder mit Fluoreszenzanregung handeln, wobei eine oder mehrere Anregungswellenlängen gleichzeitig oder zeitlich versetzt zum Einsatz kommen. Hierzu werden in dem Filterblock 47 geeignete dichroitische Spiegel verwendet. Dabei wird das Fluoreszenzlicht von einer oder mehreren Wellenlängen gleich- zeitig auf eine oder mehrere Kameras geleitet. Hierzu werden geeignete Emissions-Filtereinsätze in dem Filterblock 47 oder auch geeignete Emissions-Splitter verwendet. So ist es möglich, gleichzeitig oder hintereinander weg Bilder bei mehreren Fluoreszenzfarben von der selektieren Zelle zu erzeugen. Weiterhin ist es möglich, ein Bild der selektierten Zelle bei einer Weisslicht-Phasenkontrastbeleuchtung zu erzeugen. Dies ist erforderlich, um festzustellen, ob an einer fluoreszenzmarkierten Zelle noch eine oder mehrere nicht fluoreszenzmarkierte Zellen anhaften, was zu einer - in der Regel uner- wünschten - Verunreinigung dieser einen fluoreszenzmarkierten Zelle führt.
Das in Figur 6 dargestellte Ausführungsbeispiel stimmt weitgehend mit dem in Figur 2 dargestellten Ausführungsbeispiel überein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung verwiesen wird und im Folgenden für entsprechende Bauteile dieselben Bezugszeichen verwendet werden, die zur Unterscheidung lediglich durch einen Apostroph gekennzeichnet sind.
Eine Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht in der einfacheren konstruktiven Gestaltung der in dem Trägerstromkanal 33' eingangsseitig angeordneten dielektrophoretischen Elektrodenanordnung 36', welche die in dem Trägerstrom sus- pendierten Partikel in dem Trägerstromkanal 33' hintereinander aufreiht.
Eine weitere Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass in dem Trägerstromkanal 33' stromabwärts hinter der Elektrodenanordnung 36' eine hakenförmige Elektrodenanordnung 52' angeordnet ist, die entsprechend ihrer Form auch als "Hook" bezeichnet wird und die Aufgabe hat, Partikel festzuhalten und quasi zu parken. Der genaue Aufbau und die Funktionsweise der Elektrodenanordnung 52' ist beispielsweise in Müller, T. et al. : "Life Cells in Cellprocessors" in Bio- world 2-2002 beschrieben, so dass hier auf eine detaillierte Beschreibung der Elektrodenanordnung 52 ' verzichtet werden kann und der Inhalt der vorstehenden Druckschrift dieser Be- Schreibung in vollem Umfang zuzurechnen ist.
In dem Trägerstromkanal 33' befindet sich zwischen der Elektrodenanordnung 52' und dem dielektrophoretischen Käfig 37' ein Untersuchungsfenster 53', um die vorstehend bezüglich der Untersuchungsfenster ROH und ROI2 beschriebene Voruntersuchung durchzuführen.
Ein weiteres Untersuchungsfenster 54' befindet sich hierbei in dem dielektrophoretischen Käfig 37', so dass in dem di- elektrophoretischen Käfig 37' eine Untersuchung der abgebremsten Partikel durchgeführt werden kann.
Eine weitere Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass in der Ausgangsleitung 34 ' für die positiv selek- tierten Partikel eine trichterförmige Elektrodenanordnung 55' angeordnet ist, deren Funktion der Elektrodenanordnung 36' entspricht und welche die Aufgabe hat, die Partikel in der Ausgangsleitung 34' zu zentrieren. Dies ist vorteilhaft, da die Partikel in der Ausgangsleitung 34' die Tendenz zum Ab- sinken haben und sich deshalb wandnah ablagern können, wo die Strömungsgeschwindigkeit gering ist. Die Elektrodenanordnung 55' verhindert ein derartiges Absinken der Partikel und hält die Partikel dadurch in der Mitte der Ausgangsleitung 34', wo die Strömungsgeschwindigkeit maximal ist.
Ferner ist zu erwähnen, dass die Elektrodenanordnungen 36', 52 ' sowie der dielektrophoretische Käfig 37 ' in der Trägerstromleitung 33' außermittig angeordnet sind. Dies hat zur Folge, dass die in dem Trägerstrom enthaltenen Partikel nach der Freigabe durch den dielektrophoretischen Käfig 37' automatisch in die Ausgangsleitung 35' für negativ selektierte Partikel gelangen, wenn die Elektrodenanordnung 38' nicht angesteuert wird. Dies bietet den Vorteil, dass die Elektroden- anordnung 38' nur selten angesteuert werden muss, wenn in dem Trägerstrom nur wenig Partikel enthalten sind, die positiv selektiert werden sollen.
Das in Figur 7 dargestellte alternative Ausführungsbeispiel stimmt weitgehend mit dem vorstehend beschriebenen und in Figur 6 dargestellten Ausführungsbeispiel überein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung verwiesen wird und im Folgenden für entsprechende Bauteile dieselben Bezugszeichen verwendet werden, die zur Un- terscheidung durch zwei Apostrophe gekennzeichnet sind.
Eine Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass der dielektrophoretische Käfig 37" an der Stelle angeordnet ist, an der der Trägerstromkanal 33" in die beiden Ausgangsleitungen 34", 35" verzweigt. Darüber hinaus sind die einzelnen Elektroden des dielektrophoretischen Käfigs 37" hierbei getrennt ansteuerbar, so dass der dielektrophoretische Käfig 37" zwei Funktionen ausführen kann, nämlich zum einen die Funktion eines Käfigs (engl. "Cage") und zum anderen die Funktion eines Schalters (engl. "Switch") bzw. einer Weiche. Der dielektrophoretische Käfig 37" kann die Partikel in dem Trägerstrom also zum einen für die Untersuchung in dem Untersuchungsfenster 54" fixieren und die Par- tikel zum anderen einer der beiden Ausgangsleitungen 34", 35" zuführen.
Der im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff einer Verzweigungsstelle ist allgemein zu verstehen und nicht auf den geometrischen Schnittpunkt der Ausgangsleitungen beschränkt. Es ist vielmehr auch möglich, dass der Käfig 37" bzw. die Weiche stromaufwärts vor dem Schnittpunkt der Ausgangsleitungen angeordnet ist. Beispielsweise umfasst der Begriff einer Verzweigungsstelle auch den sogenannten "Sepa- ratrix". Dabei handelt es sich um die Trennungslinie der laminaren Strömung in dem Trägerstromkanal.
Darüber hinaus sind die Elektrodenanordnungen 36", 52", der Käfig 37" und die Messstationen 53", 54" hierbei sowie in den folgenden Ausführungsbeispielen in dem Trägerstromkanal 33" mittig angeordnet.
Das in Figur 8 dargestellte Ausführungsbeispiel stimmt weitgehend mit dem vorstehend beschriebenen und in Figur 7 darge- stellten Ausführungsbeispiel überein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung verwiesen wird und im Folgenden für entsprechende Bauteile dieselben Bezugszeichen verwendet werden, die jedoch zur Unterscheidung durch drei Apostrophe gekennzeichnet sind.
Eine Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht in der konstruktiven Gestaltung des dielektrophoretischen Käfigs 37'", der hier nur aus sechs räumlich angeordneten Elektroden besteht, wobei die einzelnen Elektroden getrennt ansteuerbar sind, damit der Käfig 37'" wahlweise als Schalter bzw. Weiche oder als Käfig fungieren kann.
Figur 9 zeigt schließlich ein weiteres Ausführungsbeispiel einer möglichen Anordnung in einem Sortierchip. Hierbei münden zwei Trägerstromleitungen 56, 57 in eine gemeinsame Trägerstromleitung 58, wobei über die beiden Trägerstromleitungen 56, 57 jeweils suspendierte Partikel zugeführt werden.
In den beiden Trägerstromleitungen 56, 57 ist jeweils eine trichterförmige Elektrodenanordnung 59, 60 angeordnet, um die in den Trägerströmen der beiden Trägerstromleitungen 56, 57 enthaltenen Partikel zu zentrieren.
In dem gemeinsamen Trägerstromkanal 58 befindet sich stromaufwärts an der Mündungsstelle der beiden Trägerstromleitungen 56, 57 eine Trennwand 61, so dass die in den Trägerströmen der beiden Trägerstromleitungen 56, 57 suspendierten Partikel in der Trägerstromleitung 58 zunächst parallel neben- einander und getrennt voneinander geführt werden.
Im Bereich der Trennwand 61 befinden sich in der Trägerstromleitung 58 zwei Untersuchungsfenster 62, 63, um die suspendierten Partikel während des Vorbeiströmens einer Voruntersu- chung zu unterziehen, wobei die Voruntersuchung beispielsweise in der vorstehend zu Figur 2 beschriebenen Weise folgen kann.
Stromabwärts hinter den beiden Untersuchungsfenstern 62, 63 befindet sich in der Trägerstromleitung 58 eine trichterförmige Elektrodenanordnung 64, welche die in den beiden Teilströmen beiderseits der Trennwand 61 suspendierten Partikel zentriert und einem dielektrophoretischen Käfig 65 zuführt, der die Partikel für eine Untersuchung in einem weiteren Untersuchungsfenster 66 fixieren kann.
Stromabwärts hinter dem dielektrophoretischen Käfig 65 befin- det sich eine weitere Elektrodenanordnung 67, welche die in dem Trägerstrom suspendierten Partikeln nach der Freigabe durch den Käfig 65 in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Untersuchung in dem Untersuchungsfenster 66 einer von drei Ausgangsleitungen 68, 69, 70 zuführt. Die Ausgangsleitungen 68, 70 dienen hierbei zur Abführung der negativ selektierten Partikel, während die Ausgangsleitung 69 der Weiterführung der positiv selektierten Partikel dient. Die Elektrodenanordnung 67 muss also aktiv angesteuert werden, wenn Partikel in die Ausgangsleitungen 68, 70 für die negativ selektierten Parti- kel befördert werden sollen, wohingegen keine Ansteuerung für die positiv selektierten Partikel erfolgt. Diese Anordnung eignet sich deshalb besonders bei solchen Untersuchungen, bei denen nur wenige Partikel negativ selektiert werden.
Die Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr ist eine Vielzahl von Varianten und Abwandlungen möglich, die ebenfalls von dem Erfindungsgedanken Gebrauch machen und deshalb in den Schutzbereich fallen.

Claims

Patentansprüche
1. Untersuchungsverfahren für Partikel (48, 49), insbesondere für biologische Partikel (48, 49), mit den folgenden Schritten:
- Einbringung der zu untersuchenden Partikel (48, 49) mindestens in einen Trägerstrom, - Durchführung mindestens einer ersten Untersuchung der sich mit dem Trägerstrom bewegenden Partikel (48, 49),
- Selektion mindestens eines Partikels (48, 49) in Abhängigkeit von dem Ergebnis der ersten Untersuchung,
- Abbremsen des selektierten Partikels (48, 49), - Durchführung mindestens einer zweiten Untersuchung des selektierten Partikels (48, 49) im abgebremsten Zustand.
2. Untersuchungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der selektierte Partikel (48, 49) in Abhängig- keit von dem Ergebnis der zweiten Untersuchung sortiert und/oder behandelt wird.
3. Untersuchungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung und/oder im Rahmen der zweiten Untersuchung eine Durchlichtmessung und/oder eine Fluoreszenzmessung erfolgt.
4. Untersuchungsverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlichtmessung in einem ersten Untersu- chungsfenster (ROH) und die Fluoreszenzmessung in einem zweiten Untersuchungsfenster (ROI2) durchgeführt wird, wobei die beiden Untersuchungsfenster (ROH, ROI2) räumlich voneinander getrennt sind.
5. Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung mindestens ein optisches Bild der Partikel (48, 49) aufgenommen wird.
6. Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung eine elektrische und/oder elektromagnetische A- nalyse durchgeführt wird.
7. Untersuchungsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung eine Impedanzanalyse durchgeführt wird.
8. Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (48, 49) bei der ersten Untersuchung und/oder bei der zweiten Untersuchung morphologisch und/oder hinsichtlich ihrer Größe untersucht werden.
9. Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der ersten Untersuchung überprüft wird, ob die Partikel (48, 49) in dem Trägerstrom jeweils aus einer einzelnen biologischen Zelle oder aus mehreren biologischen Zellen bestehen, wobei solche Partikel (48, 49) für die zweite Untersuchung selektiert werden, die aus einer einzigen biologischen Zelle bestehen.
10. Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der ersten Untersuchung überprüft wird, ob die Partikel (48, 49) in dem Trägerstrom lebende Zellen (48) oder tote Zellen (49) sind.
11. Untersuchungsverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der ersten Untersuchung eine Durchlichtmessung der Partikel (48, 49) erfolgt, wobei ein optisches Bild der Partikel (48, 49) aufgenommen und die Intensi- tätsverteilung (50, 51) in dem Bild der Partikel (48, 49) ausgewertet wird.
12. Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der ersten Untersu- chung durch eine Fluoreszenzmessung überprüft wird, ob die
Partikel (48, 49) in dem Trägerstrom eine bestimmte Schwelle für einen Fluoreszenzmarker überschreiten.
13. Untersuchungsverfahren nach einem der vorhergehenden An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die erste Untersuchung selektierte Partikel (48, 49) zum Abbremsen in einem Feldkäfig (37, 37", 37", 37'", 65) fixiert und/oder der Trägerstrom verlangsamt wird.
14. Untersuchungseinrichtung zur Untersuchung von Partikeln (48, 49), insbesondere von biologischen Partikeln (48, 49), mit
- einem Trägerstromkanal (33, 33', 33", 33'", 58) zur Aufnahme eines Trägerstroms mit den darin suspendierten Par- tikeln (48, 49),
- einer ersten Messstation (ROH, ROI2, 53', 53", 53'", 62, 63) zur Durchführung einer ersten Untersuchung der sich mit dem Trägerström bewegenden Partikel (48, 49) ,
- einer Selektionseinheit (37, 37', 37", 37'", 65) zur Se- lektion von Partikeln in Abhängigkeit von dem Ergebnis der ersten Untersuchung, wobei die Selektionseinheit (37, 37', 37", 37"', 65) eine Bremseinrichtung (37, 37', 37", 37'", 65) zum Abbremsen der selektierten Partikel (48, 49) aufweist, - sowie mit einer zweiten Messstation (UF, 54', 54", 54'", 66) zur Durchführung einer zweiten Untersuchung der selektierten Partikel (48, 49) im abgebremsten Zustand.
15. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Messstation (UF, 54', 54", 54'", 66) stromabwärts hinter der ersten Messstation (ROH, ROI2, 53', 53", 53'" ) angeordnet ist.
16. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass stromabwärts hinter der zweiten Messstation (UF, 54', 54", 54"', 66) eine Behandlungseinrichtung und/oder eine Sortiereinrichtung (38, 38', 67) angeordnet ist, um die selektierten Partikel (48, 49) in Abhängig- keit von dem Ergebnis der ersten und/oder der zweiten Untersuchung zu behandeln und/oder zu sortieren.
17. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerstromkanal (33, 33', 33", 33'", 58) stromabwärts hinter der zweiten Messstation (UF, 54',
54", 54'", 66) in mindestens zwei Strömungskanäle (34, 34', 34", 34'", 35, 35', 35", 35'") verzweigt ist, wobei die Sortiereinrichtung (38, 38', 37", 37'") im Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals (33, 33', 33", 33'", 58) angeordnet ist.
18. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Sortiereinrichtung (38) eine dielektrische Weiche aufweist, die im Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals (33, 33', 33", 33"', 58) angeordnet ist.
19. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass im Verzweigungsbereich des Trägerstromkanals (33, 33', 33", 33"', 58) eine Strömungsleitein- richtung (39) angeordnet ist, um eine Rückströmung des Trägerstroms und/oder der Partikel (48, 49) von einem der beiden Strömungskanäle (34, 35) in den anderen Strömungskanal (34, 35) zu verhindern.
20. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Strömungsleiteinrichtung (39) eine E- lektrode aufweist.
21. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrode der Strömungsleiteinrichtung (30) im wesentlichen v-förmig ausgebildet ist und zwei Schenkel aufweist, die sich im wesentlichen in Richtung der beiden abzweigenden Strömungskanäle (34, 35) erstrecken.
22. Untersuchungseinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bremseinrichtung (37, 37', 37", 37"', 65) einen dielektrischen Käfig aufweist.
23. Untersuchungseinrichtung nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Trägerstromkanal (33, 33', 33", 33'", 58) stromaufwärts vor der ersten Messstation (ROH, ROI2) Fokussierelektroden (36) angeordnet sind.
24. Untersuchungseinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Messstation
(ROH, ROI2, 53', 53", 53'", 62, 63) und/oder die zweite Messstation (UF, 54', 54", 54'") zur Aufnahme eines Bildes eine Optik (44) aufweist.
25. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Optik (44) beweglich ist, um das Bild zumindest entlang des Trägerstromkanals (33, 33', 33", 33'", 58) zu verschieben.
26. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 25, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Optik (44) zur Bildverschiebung mit einem elektro-mechanischen Stellglied (45) verbunden ist.
27. Verwendung einer Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 26 in der medizinischen und/oder pharmazeu- tischen Forschung und/oder in der Diagnostik und/oder in der forensischen Medizin.
28. Verwendung einer Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 26 zur Separation verschiedener Zelltypen voneinander, wie insbesondere apoptischer und nekrotischer Zellen, Zellen mit unterschiedlichen Expressionsmustern und/oder Stammzellen.
•k -k - -k -k
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