DE102019003132A1 - Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz und der Anzahl von Antikörpern auf Exosomen mit einer Qualitätskontrolle durch ein erstes Verfahren der Mustererkennung und durch ein zweites Verfahren der Elektrophorese - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz und der Anzahl von Antikörpern auf Exosomen mit einer Qualitätskontrolle durch ein erstes Verfahren der Mustererkennung und durch ein zweites Verfahren der Elektrophorese Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz von Antikörpern auf Exosomen mit der Möglichkeit einer Qualitätskontrolle der Messung mittels zweier verschiedener Kontrollverfahren

Description

  • Die Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz und der Anzahl von Antikörpern auf Exosomen mit einer_Qualitätskontrolle durch ein erstes Verfahren der Mustererkennung und durch ein zweites Verfahren der Elektrophorese
  • Vesikel in der Biologie sind intrazelluläre, sehr kleine, rundliche bis ovale Bläschen, die von einer einfachen oder doppelten Membran oder einer netzartigen Hülle aus Proteinen umgeben sind. Die Vesikel bilden eigene Zellkompartimente, in denen unterschiedliche zelluläre Prozesse ablaufen. Ihre Größe beträgt etwa einen Mikrometer. Vesikel sind für den Transport vieler Stoffe in der Zelle verantwortlich,
  • Die Mechanismen, die zur Entstehung von extrazellulären Vesikeln führen, sind bisher noch nicht vollständig geklärt.
  • Exosomen sind hierbei kleine Vesikel mit einer Größe von ca, 50 bis 150 nm.
  • Extrazelluläre Vesikel spielen eine große Rolle in der interzellulären Kommunikation im gesunden Gewebe, aber auch bei verschiedenen Erkrankungen. Sie sind für verschiedene Therapieverfahren interessant.
  • Kurz gesagt: Exosomen sind extrazelluläre Mikrovesikel, die von lebenden Zellen durch Exozytose abgegeben werden, eine Vielzahl von Eiweißen und RNA enthalten und biologische Funktionen ausüben.
  • Die einzige und umfassende Analysemethode, welche die Exosomen in ihrer natürlichen Umgebung belässt und fähig ist Partikel bis in kleinste Dimensionen von an 20 nm auf alle möglichen Messparameter auszuwerten, ist die NTA, die Nanopartikel Tracking Analyse. Diese Analysemethode hat deshalb auch das Potential die unterschiedlichen Proteine, die sich auf der Oberfläche der Membran der Exosomen befinden, diagnostizieren zu können, Die Detektion von unterschiedlichen Proteinen auf der Oberfläche der Exosomen erfolgt mit speziellen Molekülen, die man aus dem Immunsystem kennt, Es handelt sich um Antikörper.
  • Antikörper sind sehr spezifisch und erkennen und binden sich ausschließlich an ein bestimmtes Protein,
  • Wenn man also wissen möchte, ob ein bestimmtes Protein X auf der Oberfläche eines Exosoms vorhanden ist, bedient man sich eines Antikörpers, von dem man weiß, dass dieser spezifisch das Protein X erkennt und daran andockt. Hat das Exosom viele von solchen Proteinen X, können im Optimalfall alle diese Proteine von den spezifischen Antikörpern erkannt und gebunden werden, Sind diese Antikörper künstlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen, kann der gesamte Komplex, bestehend aus Exosom - Antikörper - Fluoreszenzfarbstoff durch das Zetaview - Gerät detektiert werden.
  • Interessiert man sich für ein anderes Protein Y, bedient man sich demnach eines Antikörpers Y, der ausschleßlich spezifisch Protein Y erkennt und bindet. Sofern dieser Antikörper Y auch mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, kann man diesen Komplex Exosom - Antikörper - Y - Fluoreszenzfarbstoff ebenfalls im Fluoreszenzkanal sichtbar machen, Erkennt das Zetaview nun ein Signal im Fluoreszenzkanal, so kann man davon ausgehen, dass das entsprechende Exosom das Protein von Interesse auf seiner Oberfläche trägt. Ist kein Fluoreszenzsignal sichtbar, existiert das entsprechende Protein nicht auf der Oberfläche des Exosms.
  • Mit dieser Vorrichtung ist es nun möglich, sogenannte Kolokalisationsexperimente durchzuführen.
  • Kolokalisation bedeutet, dass zwei oder mehrere unterschiedliche Proteine nebeneinander auf der Oberfläche der Exosomen vertreten sind. In unserem Beispiel wären das Protein X und Protein Y. Wir möchten also wissen, ob diese beiden Proteine auf der Exosomenoberfläche nebeneinander existieren. Dazu kann man Antikörper X zum Beispiel mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markieren und Antikörper Y mit einem blauen Fluoreszenzfarbstoff.
  • Wenn beide markierten Antikörper die entsprechenden Proteine auf der Exosomenoberfläche erkennen und binden, bzw. vertreten sind (kolokalisiert), werden in beiden Fluoreszenzkanälen des ZetaView - Geräts Signale erfasst. Ist nur Protein X vertreten, detektiert man nur im roten Fluoresenzkanal ein Signal (weil nur Antikörper X binden kann), im blauen aber nicht (und umgekehrt),
  • Man kann also mit nur einer einzigen Messung und einer einzigen Probe herausfinden, ob unterschiedliche Proteine von Interesse gleichzeitig auf der Oberfläche der Exosomen vertreten (kolokalisikert) sind.
  • Zum Stand der Technik wird im Folgenden die Kolokalisationsanalyse von zwei Antikörpern auf demselben Exosomen mit einem NTA beschrieben.
    • In 1 wird eine besondere NTA Nanopartikel - Analyse aufgezeigt.
    • In 2 erfolgt die Darstellung eines Wechselrades für ein Farbfilter 17
    • In 3 ist der Verlauf einer Analyse, mehrere Laser und mehrere Farbfilter gezeigt.
  • In der 1 ist eine Particle Metrix eigene NTA Nanoparticletracking - Messanordnung dargestellt, die die Detektion mehrerer Antikörper auf demselben Exosom ermöglicht. Zu diesem Zweck müssen mehrere Kombinationen von Lasern und Filtern rasch hintereinander folgen. Da die Nanopartikel eine Brown'sche Zappelbewegung durchfuhren, können diese nach einigen Sekunden wieder aus dem Videobild verschwinden, sodass man nur wenige Sekunden Zeit hat, um an ein und demselben Partikel mehrere Fluoreszenzen gleichzeitig zu messen, dafür aber in vitro. Das bedeutet, in Bruchteilen von Sekunden die Laser / Filter - Kombination wechseln zu müssen. Da heute bereits mehrere Laser an eine Faser geleitet werden können und durch elektronisches Schalten schnell von einer auf die nächste Wellenlänge gewechselt werden kann, ist dies kein Problem mehr. Es bleibt nur noch den schnellen Filterwechsel zu bewältigen und die Analysemessung schnell (in 1 bis 10 sec) durchzuführen.
  • In dieser Form der NTA besteht die abzubildende Optik aus einem Objektiv mit einer optional zusätzlichen Flüssigkeitslinse 6, das auf die partikuläre Probe 9 in der Messzelle 10 gerichtet ist und einer Videokamera 15, bzw. einem Detektor, welcher die Bewegung der Partikel aufnimmt.
  • Die hier gezeigten Laser 1 bis 4 als zeitweise über die Sammelprismen 14 und den Strahlengang 21 geschaltete Lichtquelle dienen als anregende Lichtquelle für Streulicht und Fluoreszenzlicht und strahlen im Winkel von 90 Grad in das Laserdurchgangsfenster 22 der Messzelle 10.
  • An der Kamera 15 wird dabei gleichzeitig Licht von der Fluoreszenz - Ebene 5 und der Streulicht - Ebene 8 über den konvergenten Strahlengang durch eine Kombination von Mikroskop - Objektiv (nicht bezeichnet) und Flüssigkeitslinse 6 mit einstellbarem Fokus mittels der Optik - Steuerung 18 registriert, Das Display mit Touchscrean 19 und die Steuerung mit dem Partikel - Tracking - Programm 20 sind mit der Videokamera 15 verbunden.
  • Im konvergenten Strahlengang ist in Querrichtung ein Wechselrad 17 für Farbfilter auf einer Filterrad - Achse 11 und einem Gegenlager 7 über eine Wechselkupplung 12 und einem Filterantrieb 13 angerordnet, wobei das Wechselrad mit Farbfilter 16 bestückt ist, und wobei die Steuerung des Farbfilterrades mittels einer Einrichtung 26 erfolgt. Das durch das Optikdurchgangsfenster 23 der Messzelle 10 und den Farbfilter 16 durchtretende Licht wird über die Kombination von Mikroskop-Objektiv mit Flüssiglinse 6 in die Videokamera 15 geleitet und dort registriert.
  • 2 zeigt die Darstellung des Wechselrades für das Farbfilter 17.
  • In der Mitte ist die Filterrad - Achse 11 umgeben von den Filtern 25,26,27„28 und 29 zunehen. Hierbei ist das Filter 25 in der Form eines Einsatzes aus Quarzglas als neutral anzusehen, während das Filter mit der Nummer 26 bei einer Wellenlänge ab 420 nm öffnet. Das Filter mit der Nummer 27 öffnet bei einer Wellenlänge ab 500 nm, das Filter 28 öffnet bei einer Wellenlänge ab 540 nm und das Filter 29 öffnet bei 660 nm.
  • 3 zeigt einen Analyse - Verlauf der Stellung des jeweiligen Farbfilters der Fluoreszenzemissions - Messung und des jeweiligen Lasers.
  • Auf der linken Seite der 3 sind beispielhaft sechs Stellungen des Farbfilters 16 gezeigt, wobei an der obersten Stelle das jeweils eingeschaltete Farbfilter mit seiner Nummer bezeichnet und der jeweils eingeschaltete Laser bezeichnet ist.
  • Das Verfahren der Methode aus dem Stand der Technik, gezeigt in 1 bis 3 kann mit 2 weiteren Verfahren, verglichen werden, um auf diese Weise eine Aussage über die Qualität der Messungen zu erhalten.
  • Der vorliegenden Anmeldung liegt die Aufgabe zugrunde, eine leicht zu erhaltende Qualitätskontrolle für den beschriebenen Stand der Technik zu erhalten.
  • Es werden die Proben aus der Methode aus dem Stand der Technik mit einem Gerät und der gleichen Messzelle in zwei verschieden Verfahren analysiert und verglichen , einmal durch das Verfahren der Mustererkennung und das Elektrophorese-Verfahren.
  • Im Folgenden wird die Erfindung näher beschrieben.
  • Es zeigen:
    • 4 : Diagramme im Monitor 19 durch Kameraaufnahme und Pixelanalyse aus ... der Mustererkennung zum Vergleich der Messung aus 1
    • 5: Darstellung einer Elektrophorese und Elektroosmose-Messung in der Messzelle zum Vergleich der Messung aus dem Stand der Technik
    • 6: Darstellung der kumulative elektrophoretische Mobilitätsverteilungskurven von zwei Proben 4

    zeigt, dass sich Subgruppen von Partikeln(Exosomen) im Video unterschiedlich darstellen lassen. Gemeint sind Gruppen von Exosomen mit angedockten Antikörpern(Proteinen) oder Exosomen ohne Antikörper Die Subgruppen lassen bei der Streulichtmessung wie bei der Fluoreszenzlichtmessung durch die VideoMustererkennung berechnen und in Diagrammen
    darstellen. Die Mustererkennungsanalyse kann in der Streulichtmessung und der Fluoreszenzlichtmessung durchgeführt werden und dient zur Qualitätskontrolle der Methode aus dem Stand der Technik
  • 4 a zeigt Im Video die Brown'schen Bewegung der Partikel, aus welcher die Größe folgt die mittlere quadratische Verschiebung (Δx Δy) eines einzelnen Partilels 44 die Anfangsposition (1a) und die Endposition (2a) - gemessen in einer Sekunde und in die Einstein-Formel von Stokes eingefügt - liefert die Teilchengröße. In der Videoaufnahme sind noch weitere Informationen enthalten die durch das Mustererkennungsprogramm analysiert und ausgewertet werden.
  • Dazu zählen Helligkeit, Form , zeitliches Verhalten und Trajektorien-Längen eines Partikels.
  • 4c zeigt ein Streudiagramm aus der Musteranalyse, dargestellt sind die berechneten Partikelgrößenverteilungen der beiden Muster.
  • Im Beispiel wird die Größenverteilung von Exosomen einer Zellkultur HEK293 gezeigt, wobei gleichzeitig das zeitliche Verhalten der Intensität jedes Partikels (mittlere Intensität) gegen die Größe aufgetragen wurde. Im Streudiagramm sind zwei Gruppen von Partikeln zusehen Die Gruppe G1 entspricht den Partikelmerkmalen wie in 4d dargestellt. Die Gruppe G2 entspricht den Partikelmerkmalen wie in der 4e (nicht Exosomen) dargestellt.
  • Aus dem Vergleich der Gruppe G1 von Exosomen, welche vor der Konjugation mit Antikörpern und danach gemessen werden, lassen sich die Unterschiede im Muster ableiten. Dadurch ist durch die Videomustererkennung eine Quantifizierung der Antikörper auf einem Exosom möglich, d.h. die Anzahl der Antikörper die sich an einem Exosom angedockt haben.
  • 4d zeigt den zeitlichen Verlauf einer Videoaufnahme von einem Partikel der Gruppe G1.
  • Der Partikel ist klein , weniger hell und seine Intensität wirkt im Verlaufe gleichmäßig.
  • Es handelt sich hier um Exosomen, denn sie haben eine Membranhülle, sind annähernd kugelsymmetrisch und flackern nicht.
  • 4e zeigt den zeitlichen Verlauf einer Videoaufnahme von einem Partikel der Gruppe G 2 .
  • Der Partikel ist größer und sein Licht flackert zwischen sehr hell und sehr dunkel.
  • Im Beispiel kann man die „flackernden“ Partikeln als Nicht-Exosomen ausgrenzen.
  • 4b zeigt die Größenverteilung der beiden Partikelgruppen in einem Balkendiagramm . Hier zu sehen die Gruppe G1 als Exosomen (115 nm) und die Gruppe G2 als nicht Exosomen (247 nm).
  • In der Mustererkennung werden die Exosomen von anderen Partikeln unterschieden und ihre Anzahl, wie in 4c und 4d gezeigt, in der Probe errechnet. Die Exosomen lassen sich nach einer Messung vor und nach einer Konjugation in ihrer Größe, wie in 4a gezeigt, berechnen. Die Differenz der beiden Messungen gibt Aufschluss darüber wie viele Antikörper sich an ein Exosom angedockt haben.
  • Das Ergebnis dient zur Überprüfung der Messung aus der Methode1 (ST.d.T.) gezeigt in 1 bis 3 .
  • 5
    Zeigt die schematische Darstellung einer Elektrophoreseanalyse bei Partikeln als zweite Vergeichsmessung zur Methode aus dem St.d.T.
  • Aus der Darstellung von 5 geht hervor, dass durch ein angelegtes Feld 41, erzeugt durch die Elektrode 30 plus und 31 minus eine Elektroosmose ausgelöst wird. Deren Bewegungsverlauf ist dargestellt durch die Kurve 36 .
  • Die Elektroden 30 ,31 bestehen aus hochleitendem Graphen um optimalen Kontakt zu der Suspension in der Messzelle zu erzeugen . Damit werden störende Blasenbildungen vermieden und die Bewegungen der Partikel sind homogener.
  • Befinden sich geladene Partikel in der Flüssigkeit, so bewegen sie sich mit der Geschwindigkeit v im elektrischen Feld E 41. Dieser Effekt ist über den gesamten Zellquerschnitt gleich groß und wird Elektrophorese genannt. Gemessen wird die elektrophoretische Beweglichkeit µe = v/E. Elektrophorese und Elektroosmose sind voneinander unabhängig und addieren sich. Der Betrag der Addition ist durch drei Pfeile 40 dargestellt. Die Kurve 37 zeigt den Bewegungsverlauf von Elektroosmose und Elektrophorese µe zusammen im Feld 41. Die Dimension der Mobilität wird in µm/s/V/cm angegeben. Bei sehr hohen Beladungen kann die Mobilität den Wert bis zu 5 µm/s/V/cm anzeigen.
    Möchte man die Elektrophorese µe unabhängig von der Elektroosmose messen, muss man dies in den sogenannten stationären Schichten 34 und 35 (Stationary Layers SL) des Messzellenkanals tun . An den Schichten 34 , 35 , kehrt die Elektroosmose um und ist deshalb null. Somit ist an diesen beiden Schichten die Elektrophorese alleine ablesbar. Aus der Messzellengeometrie können die stationären Schichten von SL1 34 und SL2 35 abgeleitet werden. Der Laser strahlt im Winkel von 90 Grad zur Mikrosskopebene und senkrecht durch das Fenster 22 in die Messzelle ein. Zur Messung wird synchron der Laserfokus 21 und der Mikroskopfokus 38, 39 abwechselnd auf SL1, 34 und SL2, 35 gerichtet.
    Müssen nur die Vergleiche der elektrophoretischen Eigenschaften, d.h, Unterschiede in der ionischen Beladung der Partikeloberflächen untersucht werden, so kann man den an jeder beliebigen Schicht der Messzelle 10 (längs der Zellwände) messen. Das bedeutet, man kann Vergleiche der elektrophoretischen Mobilität µe an jeder beliebigen Stelle der Messzelle anstellen, sofern sich der Abstand von den Zellwänden bei der Vergleichsmessung nicht ändert. Um reine Exosomen und Exosomen, die mit Antikörpern konjugiert sind, miteinander zu vergleichen müssen die ionischen Verhältnisse der Umgebungsflüssigkeit (Salzart und Leitfähigkeit) identisch sein.
  • Der Ablauf einer Vergleichsmessung wird in 7 Schritten vollzogen.
  • Eine Probe 1+ (ohne Antikörper) wird mit einer Probe 2 (mit Antikörper)verglichen. Schritt 1-3 ist die Kalibrierung (Probe 1) der Ausgangspunkt der Messung
    1. 1. Schritt:
      • In einem Gefäß werden eine bestimmte Menge geeigneter Flüssigkeit Mit einer bestimmten Menge neutraler Exosomen vermischt.
    2. 2. Schritt:
      • In der Messzelle 10 wird die elektrophoretische Mobilität von Probe 1 gemessen und ein Mittelwert errechnet, der EM 50 . Der EM50(1) wird in 6 näher beschrieben
    3. 3. Schritt:
      • Zur Probe 1 wird eine genaue Menge eines kationischen Polymer,s (Reagenz) hinzugegeben und wie in Schritt 2 der EM50 ermittelt. Der EM 50 (1) ist unser Konstanter Wert der in der 5 als Kurve 37 und in 6 als Kurve 1 abgebildet ist. Dieser Wert wird für alle weiteren Versuche mit der Suspension der Probe 1+ gespeichert. Die Kalibration ist abgeschlossen.
    4. 4. Schritt:
      • Zu einer bestimmten Menge der kalibrierten Exosomen-Suspension (Probe 1+) wird eine bestimmte Menge mit unterschiedlichen fluoreszierenden Antikörpern zugegeben und in der Messzelle 10 die Konjugation nach der Methode1 (St.d.T) gemessen
    5. 5. Schritt:
      • Gleichzeitig kann in der Messzelle mit der Probe aus Schritt 4 (Exosomen +Antikörper) der EM 50 (2) ermittelt werden. In 5, durch die Kurve 42 , und in 6 durch die Kurve 2 dargestellt.
    6. 6. Schritt:
      • Der Wert aus Schritt 3 (EM 50 (1) Kalibration) wird mit dem Wert aus Schritt 5 (EM50(2) Exosomen +Antikörper) verglichen und die Anzahl der auf einem Exosom angedockten Antikörper errechnet.
    7. 7. Schritt:
      • Vergleich der Messwerte
      Durch den Vergleich des Wertes aus der Methode nach dem St.d.T (Schritt 5) und dem Wert aus dem Schritt 6 kann die Qualität der Messung aus dem St.d.T überprüft werden.
  • 6 zeigt ein Diagramm zur Kumulativen elektrophoretischen Mobilitätsverteilung in % zur leichteren Ablesbarkeit von Unterschieden in den Ladungszuständen dargestellt am EM50 (1) von der Probe1+ und der EM50 (2) der Probe 2 (Exosomen +Antikörper). Gezeigt wird die Änderung der spezifischen Oberflächenladung Q eines Exosoms bei einer Konjugation mit einem Antikörper pro Oberfläche F [C/nm2] . Noch klarer, um wie viele Elementarladungen x pro Oberflächenelement [#e/nm2] den Exosomen durch die Anbindung pro µg Antikörpern verloren gehen .
  • Die Analyse erfordert eine komplexe Steuerung , der beschriebenen Verfahrens- und Bewegungsabläufe, durch ein spezielles Steuerungs- und Analyseprogramm.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Laser (violett = 405 nm)
    2
    Laser (blau = 488 nm)
    3
    Laser (grün = 520 nm)
    4
    Laser (rot = 640 nm)
    5
    Fluoreszenz - Ebene
    6
    Flüssigkeits - Linse mit einstellbarem Fokus
    7
    Gegenlager der Filterrad - Achse
    8
    Streulicht - Ebene
    9
    Probe
    10
    Mess - Zelle
    11
    Filterrad - Achse
    12
    Wechsel - Kupplung
    13
    Filterrad - Antrieb (Schrittmotor)
    14
    Sammelprismen (führen alle Laser in einen Strahlengang)
    15
    Detektor bzw. Videokamera CCD , CMOS
    16
    Farbfilter (Kantenfilter oder Bandpassfilter)
    17
    Wechselrad für Farbfilter
    18
    Optik - Steuerung
    19
    Display mit Touchscrean
    20
    Gesamt - Steuerung mit Partikel - Tracking - Programm
    21
    Strahlen - Gang Laser
    22
    Laserdurchgangsfenster der Messzelle 10
    23
    Optikdurchgangsfenster - Messzelle 10
    24
    Steuerung für Farbfilterrad
    25
    Filter neutral (Quarzglas )
    26
    Filter öffnet ab 420 nm
    27
    Filter öffnet ab 500 nm
    28
    Filter öffnet ab 540 nm
    29
    Filter öffnet ab 660 nm
    30
    Feldelektrode +
    31
    Feldelktrode -
    32
    Gegenionen-Schicht
    33
    Meßzellenglaswand innen (- Negativ geladen)
    34
    Stationäre Schicht 1 (SL 1)
    35
    Stationäre Schicht 2 (SL 2)
    36
    Kurve der reinen Elektroosmose-Bewegung (Partikel sind nicht geladen)
    37
    Kurve der Elektroosmose und der Elektrophorese-Bewegung (Partikel sind positiv geladen) Exosomen ohne Antikörper (schneller)
    38
    Fokusebene von Schicht 1 (34)
    39
    Fokusebene von Schicht 2 (35)
    40
    Betrag der Elektrophorese v/E
    41
    Elektrisches Feld (Richtung der Bewegung)
    42
    Kurve der Elektroosmose und der Elektrophorese-Bewegung Exosomen mit Antikörper (langsamer)
    43
    Betrag zwischen Exosomen mit und ohne Antikörper
    44
    Partikel,

Claims (4)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz und der Anzahl von Antikörpern auf Exosomen mit einer Qualitätskontrolle der Messung, mit den folgenden Merkmalen a) Zur Vorbereitung einer Messung wird eine Lösung aus fluoreszierenden Antikörpern und Exosomen als Probe (9) in eine Mess - Zelle (10) verfüllt, b) mittels einer Kombination von Lasern und Filtern wird die Mess - Zelle (10) in vitro in schnellem Wechsel bestrahlt und mittels einer optischen Einrichtung (15) abgebildet, c) als Gesamt - Steuerung der Messanordnung dient eine Particle Metrix Messanordnung, d) eine Kontrollmessung stellt Musterunterschiede fest zwischen Exosomen ohne Antikörper-Konjugation und solchen mit Antikörper-Konjugation. e) eine weitere Kontrollmessung stellt Unterschiede zumStand der Technik mittels einer Elektrophoreseanalyse fes
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Elektrophoreseanalyse bei der Wahl der Elektroden für die Elektroden hochleitendes Graphen verwendet wird.
  3. Computerprogramm mit einem Programmcode zur Durchführung der Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1 und 2, wenn das Programm in einem Computer ausgeführt wird.
  4. Maschinenlesbarer Träger mit dem Programmcode eines Computerprogramms zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 und 3, wenn das Verfahren in einem Computer ausgeführt wird.
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