WO2020221382A1 - Verfahren zur bestimmung der anzahl von antikörpern auf exosomen mit einer qualitätskontrolle durch ein erstes verfahren der mustererkennung und durch ein zweites verfahren der elektrophorese - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der anzahl von antikörpern auf exosomen mit einer qualitätskontrolle durch ein erstes verfahren der mustererkennung und durch ein zweites verfahren der elektrophorese Download PDF

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    • G01N2015/0038—Investigating nanoparticles

Definitions

  • the application relates to a method for determining the fluorescence and the number of antibodies on exosomes with a quality control by a first method of pattern recognition and by a second method of electrophoresis
  • Vesicles in biology are intracellular, very small, rounded to oval vesicles that are surrounded by a single or double membrane or a network-like shell made of proteins.
  • the vesicles form their own cell compartments in which different cellular processes take place. Their size is about one
  • Micrometer Vesicles are responsible for the transport of many substances in the cell
  • Exosomes are small vesicles with a size of approx. 50 to 150 nm.
  • Extracellular vesicles play a major role in intercellular communication in healthy tissue, but also in various diseases. They are of interest for various therapy methods.
  • exosomes are extracellular microvesicles that are released from living cells through exocytosis, contain a large number of proteins and RNA and perform biological functions.
  • Nanoparticle tracking analysis therefore also has the potential to diagnose the different proteins that are located on the surface of the membrane of the exosomes, the detection of different proteins on the surface of the exosomes is made with special molecules that are known from the immune system. They are antibodies.
  • Antibodies are very specific and only recognize and bind to a certain protein
  • Fluorescence channel one can assume that the corresponding exosome carries the protein of interest on its surface. If no fluorescence signal is visible, the corresponding protein does not exist on the surface of the exosm.
  • Colocalization means having two or more different proteins
  • antibody X can, for example, be marked with a red fluorescent dye and antibody Y with a blue fluorescent dye.
  • Fig. 1 a special NTA nanoparticle analysis is shown.
  • FIG. 2 shows a change wheel for a color filter 17
  • FIG. 1 shows a Particle Metrix proprietary NTA nanoparticle tracking measurement arrangement that enables the detection of multiple antibodies on the same exosome. For this purpose, several combinations of lasers and filters must follow one another in rapid succession. Since the nanoparticles a Brown 'sche
  • the optics to be imaged consists of an objective with an optional additional liquid lens 6, which points onto the particulate sample 9 in the Measuring cell 10 is directed and a video camera 15, or a detector, which records the movement of the particles.
  • the lasers 1 to 4 shown here as a light source switched temporarily via the collecting prisms 14 and the beam path 21 serve as a stimulating light source for scattered light and fluorescent light and radiate into the at an angle of 90 degrees
  • a change wheel 17 for color filters is arranged in the transverse direction on a filter wheel axis 11 and a counter bearing 7 via an interchangeable coupling 12 and a filter drive 13, the change wheel being equipped with color filter 16, and the control of the color filter wheel by means of a device 26 he follows.
  • the filter wheel axle 11 is surrounded by the filters 25, 26, 27, 28 and 29.
  • the filter 25 in the form of an insert made of quartz glass is to be regarded as neutral, while the filter with the number 26 opens at a wavelength from 420 nm.
  • the filter with the number 27 opens at a wavelength from 500 nm, the filter 28 opens at a wavelength from 540 nm and the filter 29 opens at 660 nm.
  • FIG. 3 shows an analysis course of the position of the respective color filter of the fluorescence emission measurement and of the respective laser.
  • the color filter 16 On the left-hand side of FIG. 3, six positions of the color filter 16 are shown by way of example, the color filter that is switched on in each case being designated by its number at the top and the laser being on in each case being designated.
  • FIGS. 1 to 3 The method of the prior art method shown in FIGS. 1 to 3 can be compared with 2 other methods, in order to produce in this way one
  • the present application is based on the object of obtaining an easily obtainable quality control for the prior art described. This is achieved by the method according to claim 1
  • a method for determining the fluorescence and the number of antibodies on exosomes with a quality control of the measurement having the following characteristics
  • the measuring cell (10) is irradiated in vitro in rapid alternation and imaged by means of an optical device (15),
  • a Particle Metrix measuring arrangement serves as the overall control of the measuring arrangement
  • FIG. 4 Diagrams in the monitor 19 through camera recording and pixel analysis from the pattern recognition to compare the measurement from FIG.
  • FIG. 6 Representation of the cumulative electrophoretic mobility distribution curves of two samples
  • FIG. 4 shows that subgroups of particles (exosomes) can be displayed differently in the video. What are meant are groups of exosomes with docked
  • Antibodies proteins or exosomes without antibodies.
  • the subgroups can be calculated in the scattered light measurement as in the fluorescence light measurement by the video pattern recognition and displayed in diagrams.
  • the pattern recognition analysis can be carried out in the scattered light measurement and the fluorescent light measurement and is used for quality control of the method from the prior art
  • Figure 4 a shows in the video the Brown ' movement of the particles, from which the size follows the mean square displacement (Dc. Ay) of an individual Partilels 44 the starting position (1a) and the end position (2a) - measured in one second and inserted into Stokes' Einstein formula - provides the particle size.
  • the video recording also contains further information that is analyzed and evaluated by the pattern recognition program.
  • FIG. 4c shows a scatter diagram from the pattern analysis, showing the calculated particle size distributions of the two patterns.
  • the example shows the size distribution of exosomes from a cell culture HEK293, with the time behavior of the intensity of each particle (mean intensity) being plotted against the size. Two groups of particles can be seen in the scatter diagram. Group G1 corresponds to the
  • Group G2 corresponds to
  • the differences in the pattern can be derived from the comparison of group G1 of exosomes, which are measured before the conjugation with antibodies and afterwards.
  • the video pattern recognition enables the antibodies on an exosome to be quantified, i.e. the number of antibodies that have docked on an exosome.
  • FIG. 4d shows the time course of a video recording of a particle of group G1.
  • the particle is small, less bright and its intensity appears evenly over the course.
  • exosomes because they have a membrane shell, are approximately spherically symmetrical and do not flicker.
  • FIG. 4e shows the time course of a video recording of a particle of group G 2.
  • the particle is larger and its light flickers between very bright and very dark.
  • FIG. 4b shows the size distribution of the two particle groups in a bar chart.
  • group G1 can be seen as exosomes (1 15 nm) and group G2 as non-exosomes (247 nm).
  • the exosomes are distinguished from other particles and their number is calculated in the sample, as shown in FIG. 4c and FIG. 4d.
  • the exosomes can be calculated in terms of their size after a measurement before and after a conjugation, as shown in FIG. 4a. The difference between the two measurements provides information about how many antibodies have docked on an exosome.
  • FIG. 5 shows that an applied field 41, generated by the electrode 30 plus and 31 minus, triggers an electroosmosis. Their course of movement is shown by curve 36.
  • the electrodes 30, 31 consist of highly conductive graphene in order to create optimal contact with the suspension in the measuring cell. This prevents annoying bubble formation and the movements of the particles are more homogeneous.
  • Electrophoresis and electroosmosis are independent of each other and add up. The amount of addition is shown by three arrows 40. Curve 37 shows the course of movement of electroosmosis and electrophoresis p e together in field 41. The dimension of mobility is given in pm / sA / cm. With very high loads, the mobility can show the value up to 5 pm / sA / cm.
  • the laser radiates into the measuring cell at an angle of 90 degrees to the microscope plane and perpendicularly through the window 22.
  • Microscope focus 38, 39 alternately directed at SL1, 34 and SL2, 35.
  • a comparison measurement is carried out in 7 steps.
  • a sample 1+ (without antibodies) is compared with a sample 2 (with antibodies.
  • Step 1-3 the calibration (sample 1) is the starting point for the measurement
  • a certain amount of suitable liquid is placed in a vessel
  • the electrophoretic mobility of sample 1 is measured in the measuring cell 10 and a mean value is calculated, the EM 50.
  • the EM50 (1) is described in more detail in FIG.
  • a precise amount of a cationic polymer (reagent) is added to sample 1 and the EM50 is determined as in step 2.
  • the EM 50 (1) is our constant value which is shown in FIG. 5 as curve 37 and in FIG. 6 as curve 1. This value is used for all further attempts with the Suspension of sample 1+ saved. The calibration is complete.
  • a certain amount with different fluorescent antibodies is added to a certain amount of the calibrated exosome suspension (sample 1+) and the conjugation is measured in the measuring cell 10 according to the method (St.d.T)
  • step 3 The value from step 3 (EM 50 (1) calibration) is compared with the value from step 5 (EM50 (2) exosomes + antibodies) and the number of antibodies docked on an exosome is calculated.
  • step 5 By comparing the value from the method according to the St.d.T (step 5) and the value from step 6, the quality of the measurement from the St.d.T can be checked.
  • Figure 6 shows a diagram for the cumulative electrophoretic
  • Color filter edge filter or band pass filter
  • Laser passage window of the measuring cell 10 Optical window - measuring cell 10 control for color filter wheel filter neutral (quartz glass) filter opens from 420 nm filter opens from 500 nm filter opens from 540 nm filter opens from 660 nm field electrode + field electrode - counter-ion layer inside measuring cell glass wall (- negatively charged) stationary layer 1 ( SL 1) Stationary layer 2 (SL 2) Curve of pure electroosmosis movement (particles are not charged) Curve of electroosmosis and electrophoresis movement (particles are positively charged) Exosomes without antibodies (faster) focus plane of layer 1 (34) focus plane from layer 2 (35) amount of electrophoresis v / E electric field (direction of movement) curve of electroosmosis and electrophoresis movement exosomes with antibodies (slower) amount between exosomes with and without antibody particles

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz von Antikörpern auf Exosomen mit der Möglichkeit einer Qualitätskontrolle der Messung mittels zweier verschiedener Kontrollverfahren.

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER ANZAHL VON ANTIKÖRPERN AUF EXOSOMEN MIT EINER QUALITÄTSKONTROLLE DURCH EIN ERSTES VERFAHREN DER MUSTERERKENNUNG UND DURCH EIN ZWEITES VERFAHREN DER
ELEKTROPHORESE
Die Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz und der Anzahl von Antikörpern auf Exosomen mit einer_Qualitätskontrolle durch ein erstes Verfahren der Mustererkennung und durch ein zweites Verfahren der Elektrophorese
Vesikel in der Biologie sind intrazelluläre, sehr kleine, rundliche bis ovale Bläschen, die von einer einfachen oder doppelten Membran oder einer netzartigen Hülle aus Proteinen umgeben sind. Die Vesikel bilden eigene Zellkompartimente, in denen unterschiedliche zelluläre Prozesse ablaufen. Ihre Größe beträgt etwa einen
Mikrometer. Vesikel sind für den Transport vieler Stoffe in der Zelle verantwortlich,
Die Mechanismen, die zur Entstehung von extrazellulären Vesikeln führen, sind bisher noch nicht vollständig geklärt.
Exosomen sind hierbei kleine Vesikel mit einer Größe von ca, 50 bis 150 nm.
Extrazelluläre Vesikel spielen eine große Rolle in der interzellulären Kommunikation im gesunden Gewebe, aber auch bei verschiedenen Erkrankungen. Sie sind für verschiedene Therapieverfahren interessant.
Kurz gesagt: Exosomen sind extrazelluläre Mikrovesikel, die von lebenden Zellen durch Exozytose abgegeben werden, eine Vielzahl von Eiweißen und RNA enthalten und biologische Funktionen ausüben.
Die einzige und umfassende Analysemethode, welche die Exosomen in ihrer natürlichen Umgebung belässt und fähig ist Partikel bis in kleinste Dimensionen von an 20 nm auf alle möglichen Messparameter auszuwerten, ist die NTA, die
Nanopartikel Tracking Analyse. Diese Analysemethode hat deshalb auch das Potential die unterschiedlichen Proteine, die sich auf der Oberfläche der Membran der Exosomen befinden, diagnostizieren zu können, Die Detektion von unterschiedlichen Proteinen auf der Oberfläche der Exosomen erfolgt mit speziellen Molekülen, die man aus dem Immunsystem kennt, Es handelt sich um Antikörper.
Antikörper sind sehr spezifisch und erkennen und binden sich ausschließlich an ein bestimmtes Protein,
Wenn man also wissen möchte, ob ein bestimmtes Protein X auf der Oberfläche eines Exosoms vorhanden ist, bedient man sich eines Antikörpers, von dem man weiß, dass dieser spezifisch das Protein X erkennt und daran andockt. Hat das Exosom viele von solchen Proteinen X, können im Optimalfall alle diese Proteine von den spezifischen Antikörpern erkannt und gebunden werden, Sind diese Antikörper künstlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen, kann der gesamte Komplex, bestehend aus Exosom - Antikörper - Fluoreszenzfarbstoff durch das Zetaview - Gerät detektiert werden.
Interessiert man sich für ein anderes Protein Y, bedient man sich demnach eines Antikörpers Y, der ausschleßlich spezifisch Protein Y erkennt und bindet. Sofern dieser Antikörper Y auch mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, kann man diesen Komplex Exosom - Antikörper - Y - Fluoreszenzfarbstoff ebenfalls im
Fluoreszenzkanal sichtbar machen, Erkennt das Zetaview nun ein Signal im
Fluoreszenzkanal, so kann man davon ausgehen, dass das entsprechende Exosom das Protein von Interesse auf seiner Oberfläche trägt. Ist kein Fluoreszenzsignal sichtbar, existiert das entsprechende Protein nicht auf der Oberfläche des Exosms.
Mit dieser Vorrichtung ist es nun möglich, sogenannte Kolokalisationsexperimente durchzuführen.
Kolokalisation bedeutet, dass zwei oder mehrere unterschiedliche Proteine
nebeneinander auf der Oberfläche der Exosomen vertreten sind. In unserem Beispiel wären das Protein X und Protein Y. Wir möchten also wissen, ob diese beiden Proteine auf der Exosomenoberfläche nebeneinander existieren. Dazu kann man Antikörper X zum Beispiel mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markieren und Antikörper Y mit einem blauen Fluoreszenzfarbstoff.
Wenn beide markierten Antikörper die entsprechenden Proteine auf der
Exosomenoberfläche erkennen und binden, bzw. vertreten sind ( kolokalisiert ), werden in beiden Fluoreszenzkanälen des ZetaView - Geräts Signale erfasst. Ist nur Protein X vertreten, detektiert man nur im roten Fluoresenzkanal ein Signal ( weil nur Antikörper X binden kann ), im blauen aber nicht ( und umgekehrt ),
Man kann also mit nur einer einzigen Messung und einer einzigen Probe
herausfinden, ob unterschiedliche Proteine von Interesse gleichzeitig auf der
Oberfläche der Exosomen vertreten ( kolokalisikert ) sind.
Zum Stand der Technik wird im Folgenden die Kolokalisationsanalyse von zwei Antikörpern auf demselben Exosomen mit einem NTA beschrieben.
In Fiq.1 wird eine besondere NTA Nanopartikel - Analyse aufgezeigt.
In Fiq.2 erfolgt die Darstellung eines Wechselrades für ein Farbfilter 17
In Fiq.3 ist der Verlauf einer Analyse, mehrere Laser und mehrere Farbfilter gezeigt.
In der Fiq.1 ist eine Particle Metrix eigene NTA Nanoparticletracking - Messanordnung dargestellt, die die Detektion mehrerer Antikörper auf demselben Exosom ermöglicht. Zu diesem Zweck müssen mehrere Kombinationen von Lasern und Filtern rasch hintereinander folgen. Da die Nanopartikel eine Brown'sche
Zappelbewegung durchfuhren, können diese nach einigen Sekunden wieder aus dem Videobild verschwinden, sodass man nur wenige Sekunden Zeit hat, um an ein und demselben Partikel mehrere Fluoreszenzen gleichzeitig zu messen, dafür aber in vitro. Das bedeutet, in Bruchteilen von Sekunden die Laser / Filter - Kombination wechseln zu müssen. Da heute bereits mehrere Laser an eine Faser geleitet werden können und durch elektronisches Schalten schnell von einer auf die nächste
Wellenlänge gewechselt werden kann, ist dies kein Problem mehr. Es bleibt nur noch den schnellen Filterwechsel zu bewältigen und die Analysemessung schnell (in 1 bis 10 sec) durchzuführen.
In dieser Form der NTA besteht die abzubildende Optik aus einem Objektiv mit einer optional zusätzlichen Flüssigkeitslinse 6, das auf die partikuläre Probe 9 in der Messzelle 10 gerichtet ist und einer Videokamera 15, bzw. einem Detektor, welcher die Bewegung der Partikel aufnimmt.
Die hier gezeigten Laser 1 bis 4 als zeitweise über die Sammelprismen 14 und den Strahlengang 21 geschaltete Lichtquelle dienen als anregende Lichtquelle für Streulicht und Fluoreszenzlicht und strahlen im Winkel von 90 Grad in das
Laserdurchgangsfenster 22 der Messzelle 10.
An der Kamera 15 wird dabei gleichzeitig Licht von der Fluoreszenz - Ebene 5 und der Streulicht - Ebene 8 über den konvergenten Strahlengang durch eine
Kombination von Mikroskop - Objektiv ( nicht bezeichnet ) und Flüssigkeitslinse 6 mit einstellbarem Fokus mittels der Optik - Steuerung 18 registriert, Das Display mit Touchscrean 19 und die Steuerung mit dem Partikel - Tracking - Programm 20 sind mit der Videokamera 15 verbunden.
Im konvergenten Strahlengang ist in Querrichtung ein Wechselrad 17 für Farbfilter auf einer Filterrad - Achse 11 und einem Gegenlager 7 über eine Wechselkupplung 12 und einem Filterantrieb 13 angerordnet, wobei das Wechselrad mit Farbfilter 16 bestückt ist, und wobei die Steuerung des Farbfilterrades mittels einer Einrichtung 26 erfolgt. Das durch das Optikdurchgangsfenster 23 der Messzelle 10 und den
Farbfilter 16 durchtretende Licht wird über die Kombination von Mikroskop-Objektiv mit Flüssiglinse 6 in die Videokamera 15 geleitet und dort registriert.
Fig.2 zeigt die Darstellung des Wechselrades für das Farbfilter 17.
In der Mitte ist die Filterrad - Achse 11 umgeben von den Filtern 25, 26, 27,, 28 und 29 zunehen. Hierbei ist das Filter 25 in der Form eines Einsatzes aus Quarzglas als neutral anzusehen, während das Filter mit der Nummer 26 bei einer Wellenlänge ab 420 nm öffnet. Das Filter mit der Nummer 27 öffnet bei einer Wellenlänge ab 500 nm, das Filter 28 öffnet bei einer Wellenlänge ab 540 nm und das Filter 29 öffnet bei 660 nm.
Fiq,3 zeigt einen Analyse - Verlauf der Stellung des jeweiligen Farbfilters der Fluoreszenzemissions - Messung und des jeweiligen Lasers. Auf der linken Seite der Fiq.3 sind beispielhaft sechs Stellungen des Farbfilters 16 gezeigt, wobei an der obersten Stelle das jeweils eingeschaltete Farbfilter mit seiner Nummer bezeichnet und der jeweils eingeschaltete Laser bezeichnet ist.
Das Verfahren der Methode aus dem Stand der Technik, gezeigt in Figur 1 bis 3 kann mit 2 weiteren Verfahren, verglichen werden, um auf diese Weise eine
Aussage über die Qualität der Messungen zu erhalten.
Der vorliegenden Anmeldung liegt die Aufgabe zugrunde, eine leicht zu erhaltende Qualitätskontrolle für den beschriebenen Stand der Technik zu erhalten. Dies wird durch das Verfahren nach Anspruch 1
Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz und der Anzahl von Antikörpern auf Exosomen mit einer Qualitätskontrolle der Messung, mit den folgenden Merkmalen
a) Zur Vorbereitung einer Messung wird eine Lösung aus fluoreszierenden Antikörpern und Exosomen als Probe (9) in eine Mess - Zelle (10 ) verfüllt,
b) mittels einer Kombination von Lasern und Filtern wird die Mess - Zelle (10) in vitro in schnellem Wechsel bestrahlt und mittels einer optischen Einrichtung (15) abgebildet,
c) als Gesamt - Steuerung der Messanordnung dient eine Particle Metrix Messanordnung,
d) eine Kontrollmessung stellt Musterunterschiede fest zwischen
Exosomen ohne Antikörper-Konjugation und solchen mit Antikörper- Konjugation.
e) eine weitere Kontrollmessung stellt Unterschiede zum Stand der Technik mittels einer Elektrophoreseanalyse fest.
Gelöst. Es werden die Proben aus der Methode aus dem Stand der Technik mit einem Gerät und der gleichen Messzelle in zwei verschieden Verfahren analysiert und verglichen , einmal durch das Verfahren der Mustererkennung und das
Elektrophorese-Verfahren.
Im Folgenden wird die Erfindung näher beschrieben.
Es zeigen:
Figur 4 : Diagramme im Monitor 19 durch Kameraaufnahme und Pixelanalyse aus der Mustererkennung zum Vergleich der Messung aus FigJ.
Figur 5: Darstellung einer Elektrophorese und Elektroosmose-Messung in der
Messzelle zum Vergleich der Messung aus dem Stand der Technik
Figur 6: Darstellung der kumulative elektrophoretische Mobilitätsverteilungskurven von zwei Proben
Figur 4 zeigt, dass sich Subgruppen von Partikeln(Exosomen) im Video unterschiedlich darstellen lassen. Gemeint sind Gruppen von Exosomen mit angedockten
Antikörpern(Proteinen) oder Exosomen ohne Antikörper Die Subgruppen lassen bei der Streulichtmessung wie bei der Fluoreszenzlichtmessung durch die Video- Mustererkennung berechnen und in Diagrammen darstellen. Die Mustererkennungsanalyse kann in der Streulichtmessung und der Fluoreszenzlichtmessung durchgeführt werden und dient zur Qualitätskontrolle der Methode aus dem Stand der Technik
Figur 4 a zeigt Im Video die Brown 'sehen Bewegung der Partikel, aus welcher die Größe folgt die mittlere quadratische Verschiebung (Dc . Ay ) eines einzelnen Partilels 44 die Anfangsposition (1a) und die Endposition (2a) - gemessen in einer Sekunde und in die Einstein-Formel von Stokes eingefügt - liefert die Teilchengröße. In der Videoaufnahme sind noch weitere Informationen enthalten die durch das Mustererkennungsprogramm analysiert und ausgewertet werden.
Dazu zählen Helligkeit, Form , zeitliches Verhalten und Trajektorien-Längen eines Partikels.
Figur 4c zeigt ein Streudiagramm aus der Musteranalyse, dargestellt sind die berechneten Partikelgrößenverteilungen der beiden Muster.
Im Beispiel wird die Größenverteilung von Exosomen einer Zellkultur HEK293 gezeigt, wobei gleichzeitig das zeitliche Verhalten der Intensität jedes Partikels (mittlere Intensität ) gegen die Größe aufgetragen wurde. Im Streudiagramm sind zwei Gruppen von Partikeln Zusehen Die Gruppe G1 entspricht den
Partikelmerkmalen wie in Figur 4d dargestellt. Die Gruppe G2 entspricht den
Partikelmerkmalen wie in der Figur 4e (nicht Exosomen ) dargestellt.
Aus dem Vergleich der Gruppe G1 von Exosomen, welche vor der Konjugation mit Antikörpern und danach gemessen werden, lassen sich die Unterschiede im Muster ableiten. Dadurch ist durch die Videomustererkennung eine Quantifizierung der Antikörper auf einem Exosom möglich, d.h. die Anzahl der Antikörper die sich an einem Exosom angedockt haben.
Figur 4d zeigt den zeitlichen Verlauf einer Videoaufnahme von einem Partikel der Gruppe G1.
Der Partikel ist klein , weniger hell und seine Intensität wirkt im Verlaufe gleichmäßig.
Es handelt sich hier um Exosomen, denn sie haben eine Membranhülle, sind annähernd kugelsymmetrisch und flackern nicht.
Figur 4e zeigt den zeitlichen Verlauf einer Videoaufnahme von einem Partikel der Gruppe G 2 .
Der Partikel ist größer und sein Licht flackert zwischen sehr hell und sehr dunkel.
Im Beispiel kann man die„flackernden“ Partikeln als Nicht-Exosomen ausgrenzen. Figur 4b zeigt die Größenverteilung der beiden Partikelgruppen in einem Balkendiagramm . Hier zu sehen die Gruppe G1 als Exosomen (1 15 nm) und die Gruppe G2 als nicht Exosomen ( 247 nm).
In der Mustererkennung werden die Exosomen von anderen Partikeln unterschieden und ihre Anzahl, wie in Figur 4c und Figur 4d gezeigt, in der Probe errechnet. Die Exosomen lassen sich nach einer Messung vor und nach einer Konjugation in ihrer Größe, wie in Figur 4a gezeigt , berechnen. Die Differenz der beiden Messungen gibt Aufschluss darüber wie viele Antikörper sich an ein Exosom angedockt haben.
Das Ergebnis dient zur Überprüfung der Messung aus der Methodel ( ST.d.T. ) gezeigt in Figurl bis Figur 3 .
Figur 5
Zeigt die schematische Darstellung einer Elektrophoreseanalyse bei Partikeln als zweite Vergeichsmessung zur Methode aus dem St.d.T.
Aus der Darstellung von Figur 5 geht hervor, dass durch ein angelegtes Feld 41 , erzeugt durch die Elektrode 30 plus und 31 minus eine Elektroosmose ausgelöst wird. Deren Bewegungsverlauf ist dargestellt durch die Kurve 36 .
Die Elektroden 30 ,31 bestehen aus hochleitendem Graphen um optimalen Kontakt zu der Suspension in der Messzelle zu erzeugen . Damit werden störende Blasenbildungen vermieden und die Bewegungen der Partikel sind homogener.
Befinden sich geladene Partikel in der Flüssigkeit, so bewegen sie sich mit der Geschwindigkeit v im elektrischen Feld E 41 . Dieser Effekt ist über den gesamten Zellquerschnitt gleich groß und wird Elektrophorese genannt. Gemessen wird die elektrophoretische Beweglichkeit pe = v/E. Elektrophorese und Elektroosmose sind voneinander unabhängig und addieren sich. Der Betrag der Addition ist durch drei Pfeile 40 dargestellt. Die Kurve 37 zeigt den Bewegungsverlauf von Elektroosmose und Elektrophorese pe zusammen im Feld 41. Die Dimension der Mobilität wird in pm/sA//cm angegeben. Bei sehr hohen Beladungen kann die Mobilität den Wert bis zu 5 pm/sA//cm anzeigen.
Möchte man die Elektrophorese pe unabhängig von der Elektroosmose messen, muss man dies in den sogenannten stationären Schichten 34 und 35 ( Stationary Layers SL ) des Messzellenkanals tun . An den Schichten 34 , 35 , kehrt die Elektroosmose um und ist deshalb null. Somit ist an diesen beiden Schichten die Elektrophorese alleine ablesbar. Aus der Messzellengeometrie können die
stationären Schichten von SL1 34 und SL2 35 abgeleitet werden. Der Laser strahlt im Winkel von 90 Grad zur Mikrosskopebene und senkrecht durch das Fenster 22 in die Messzelle ein. Zur Messung wird synchron der Laserfokus 21 und der
Mikroskopfokus 38, 39 abwechselnd auf SL1 , 34 und SL2, 35 gerichtet.
Müssen nur die Vergleiche der elektrophoretischen Eigenschaften, d.h, Unterschiede in der ionischen Beladung der Partikeloberflächen untersucht werden, so kann man den an jeder beliebigen Schicht der Messzelle 10 ( längs der Zellwände ) messen. Das bedeutet, man kann Vergleiche der elektrophoretischen Mobilität pe an jeder beliebigen Stelle der Messzelle anstellen, sofern sich der Abstand von den
Zellwänden bei der Vergleichsmessung nicht ändert. Um reine Exosomen und Exosomen, die mit Antikörpern konjugiert sind, miteinander zu vergleichen müssen die ionischen Verhältnisse der Umgebungsflüssigkeit (Salzart und Leitfähigkeit) identisch sein.
Der Ablauf einer Vergleichsmessung wird in 7 Schritten vollzogen.
Eine Probe 1+ (ohne Antikörper ) wird mit einer Probe 2 ( mit Antikörper Verglichen. Schritt 1-3 ist die Kalibrierung (Probe 1) der Ausgangspunkt der Messung
1. Schritt :
In einem Gefäß werden eine bestimmte Menge geeigneter Flüssigkeit
Mit einer bestimmten Menge neutraler Exosomen vermischt.
2. Schritt :
In der Messzelle 10 wird die elektrophoretische Mobilität von Probe 1 gemessen und ein Mittelwert errechnet, der EM 50 . Der EM50(1) wird in Figur 6 näher beschrieben
3. Schritt :
Zur Probe 1 wird eine genaue Menge eines kationischen Polymer, s (Reagenz ) hinzugegeben und wie in Schritt 2 der EM50 ermittelt.
Der EM 50 (1) ist unser Konstanter Wert der in der Figur 5 als Kurve 37 und in Figur 6 als Kurve 1 abgebildet ist. Dieser Wert wird für alle weiteren Versuche mit der Suspension der Probe 1 + gespeichert. Die Kalibration ist abgeschlossen.
4. Schritt :
Zu einer bestimmten Menge der kalibrierten Exosomen-Suspension (Probe 1+) wird eine bestimmte Menge mit unterschiedlichen fluoreszierenden Antikörpern zugegeben und in der Messzelle 10 die Konjugation nach der Methodel (St.d.T ) gemessen
5. Schritt :
Gleichzeitig kann in der Messzelle mit der Probe aus Schritt 4 (Exosomen
+Antikörper) der EM 50 (2) ermittelt werden. In Figur 5, durch die Kurve 42 , und in Figur 6 durch die Kurve 2 dargestellt .
6. Schritt:
Der Wert aus Schritt 3 (EM 50 (1) Kalibration) wird mit dem Wert aus Schritt 5 ( EM50(2) Exosomen +Antikörper ) verglichen und die Anzahl der auf einem Exosom angedockten Antikörper errechnet.
7. Schritt :
Vergleich der Messwerte
Durch den Vergleich des Wertes aus der Methode nach dem St.d.T ( Schritt 5 ) und dem Wert aus dem Schritt 6 kann die Qualität der Messung aus dem St.d.T überprüft werden.
Figur 6 zeigt ein Diagramm zur Kumulativen elektrophoretischen
Mobilitätsverteilung in % zur leichteren Ablesbarkeit von Unterschieden in den Ladungszuständen dargestellt am EM50 (1) von der Probei + und der EM50 (2) der Probe 2 (Exosomen +Antikörper ). Gezeigt wird die Änderung der spezifischen Oberflächenladung Q eines Exosoms bei einer Konjugation mit einem Antikörper pro Oberfläche F [C/nm2] . Noch klarer, um wie viele Elementarladungen x pro
Oberflächenelement [#e/nm2] den Exosomen durch die Anbindung pro pg
Antikörpern verloren gehen .
Die Analyse erfordert eine komplexe Steuerung , der beschriebenen Verfahrens- und Bewegungsabläufe, durch ein spezielles Steuerungs- und Analyseprogramm. Bezuqszeichenliste Laser ( violett = 405 nm)
Laser ( blau = 488 nm )
Laser ( grün = 520 nm )
Laser ( rot = 640 nm )
Fluoreszenz - Ebene
Flüssigkeits - Linse mit einstellbarem Fokus
Gegenlager der Filterrad - Achse
Streulicht - Ebene
Probe
Mess - Zelle
Filterrad - Achse
Wechsel - Kupplung
Filterrad - Antrieb ( Schrittmotor )
Sammelprismen ( führen alle Laser in einen Strahlengang ) Detektor bzw. Videokamera CCD , CMOS
Farbfilter ( Kantenfilter oder Bandpassfilter )
Wechselrad für Farbfilter
Optik - Steuerung
Display mit Touchscrean
Gesamt - Steuerung mit Partikel - Tracking - Programm Strahlen - Gang Laser
Laserdurchgangsfenster der Messzelle 10 Optikdurchgangsfenster - Messzelle 10 Steuerung für Farbfilterrad Filter neutral ( Quarzglas ) Filter öffnet ab 420 nm Filter öffnet ab 500 nm Filter öffnet ab 540 nm Filter öffnet ab 660 nm Feldelektrode + Feldelktrode - Gegenionen-Schicht Meßzellenglaswand innen (- Negativ geladen ) Stationäre Schicht 1 (SL 1) Stationäre Schicht 2 (SL 2) Kurve der reinen Elektroosmose-Bewegung ( Partikel sind nicht geladen) Kurve der Elektroosmose und der Elektrophorese-Bewegung ( Partikel sind positiv geladen) Exosomen ohne Antikörper (schneller ) Fokusebene von Schicht 1 (34 ) Fokusebene von Schicht 2 (35 ) Betrag der Elektrophorese v/E Elektrisches Feld ( Richtung der Bewegung ) Kurve der Elektroosmose und der Elektrophorese-Bewegung Exosomen mit Antikörper (langsamer) Betrag zwischen Exosomen mit und ohne Antikörper Partikel

Claims

Patentansprüche
Anspruch 1 :
Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz und der Anzahl von Antikörpern auf Exosomen mit einer Qualitätskontrolle der Messung, mit den folgenden Merkmalen
f) Zur Vorbereitung einer Messung wird eine Lösung aus fluoreszierenden Antikörpern und Exosomen als Probe (9) in eine Mess - Zelle (10 ) verfüllt,
g) mittels einer Kombination von Lasern und Filtern wird die Mess - Zelle (10) in vitro in schnellem Wechsel bestrahlt und mittels einer optischen Einrichtung (15) abgebildet,
h) als Gesamt - Steuerung der Messanordnung dient eine Particle Metrix Messanordnung,
i) eine Kontrollmessung stellt Musterunterschiede fest zwischen
Exosomen ohne Antikörper-Konjugation und solchen mit Antikörper- Konjugation.
j) eine weitere Kontrollmessung stellt Unterschiede zum Stand der Technik mittels einer Elektrophoreseanalyse fest.
Anspruch 2:
Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass in der Elektrophoreseanalyse bei der Wahl der Elektroden für die Elektroden hochleitendes Graphen verwendet wird.
Anspruch 3:
Computerprogramm mit einem Programmcode zur
Durchführung der Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1 und 2, wenn das Programm in einem Computer ausgeführt wird. Anspruch 4:
Maschinenlesbarer Träger mit dem Programmcode eines Computerprogramms zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 und 3, wenn das Verfahren in einem Computer ausgeführt wird.
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