WO2004057321A1 - バイオセンサ - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも一対の電極を含む電極系と、前記電極系を支持するための少なくとも１つの絶縁性の基板と、前記電極系の少なくとも作用極上に設けられた第一の反応層であって、電極に結合または吸着し得る官能基および疎水性の炭化水素基を含む有機化合物を含む第一の反応層と、前記第一の反応層上に設けられた第二の反応層であって、当該第一の反応層の疎水性部分に結合または吸着し得る両親媒性脂質を含む第二の反応層と、前記第一および第二の反応層によって構成される二成分膜に担持された試薬系であって、少なくとも膜結合型のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼおよび電子伝達体を含む試薬系と、を備える、バイオセンサに関する。

Description

明細書 バィ 才セ ノサ 技 分野

本発明は β式料液中 に含まれる基質 (測定対象物 ) の測 定を行 ためのバィ ォセ ンサに関する 特に 本発明は β式料液中 に含まれる グル ―ス の濃度を測定するため のパ、 ィ ォセ ンサに関する 背景技術

パィ ォセ ンサによ り 得 ら れる基質濃度等の測定値にお け る測定誤差は 料液中 に含まれる 測定対象物 (基質 ) 以外の他の物質の影響によ て引 さ起 さ れる

例えば 血液 料中 の グル ―ス濃度を測定する ため に 電流検出型の電気化学セ ンサを用 い る 場 □ 血液中 に含 まれる ァス ル ビン酸 ( ピ夕 'ン C ) 尿酸 ァセ 卜 ァ ノ フ X ンな どの易酸化性の化学物質が 当該セ ンサの電極

(作用極 ) で電気化学的酸化さ れる と によ り 発生する電 流が グル ス につ いての電流に重畳する ため グル ス濃度の測定値に正誤差が生 じ る

れ ら の化 物の血中濃度は 各個人 に よ て異な Ό また同一人物でめ て 曰 化する ため 生ずる測定 誤差を予め推測 して補正する と は困吴隹でめ る

の う な誤 を生む化学物質は易酸化性阻 口 物質 ( o

X i d i z a b 1 e I n t e r f e r i n g C o m P o u n d S 以下 o I C と略記する ) と呼ばれて Ό 当該分野において れ ら によ る影響を除去する ため に様々 な方策が み ら れてい る

そのよ う な方策に 1 つ に 例えば 米国特許第 6 3 4 0

4 2 8 号に開示さ れる方法がめ り そ では 作用極 び対極以外に O I C を測定する ための第二電極をバィ ォ セ ンサの基板上に設ける と に よ て O I C の影響を補正 するェ夫を してい る

ま た 0 I C の影響を除去する ための方法 と しては O

I C の作用極への拡散をブ D ッ クする ため の膜を作用極上

？にき B又ける と によ つ て O I C によ る電流を抑制する方法 よびバィ ォセ ンサ 開発さ れてい る その よ う なバィ ォ セ ンサの例 と しては 例えば W a n g J • ら著 「 E n h a n c e d s e 1 e c t i V i t y a n d s e n s i t i V i t y o f f i r s t ― g e n e r a t i o n e n z y m e e 1 e c t r o d e s b a s e d o n t h e c o u P 1 i n g o f r h o d i n i z e d c a r b o n P a s t e t r a n s d u c e r s a n d P e r m s e 1 e c t i V e P o 1 y ( o ― P h e n y 1 e n e d i a m i n e ) c o a t i n g s J E 1 e c t r o a n a 1 y s i s 8 巻 1

9 9 6 年 P 1 1 2 7 一 1 1 3 0 に 開示さ れる ポ V ( o 一 フ ェ レ ンンァ ン ) 膜を使用 したパ、ィ ォセ ンサがあ る 。

方 血液中 に会まれる血球や蛋白な どのぺプチ ド は電 極表面に吸着 し易 いため れ ら ぺプチ が電極表面に吸 着する と によ つ て も 流阻 が引 さ起 さ れる れ ら 吸 性の阻害物 ( A d S o r P t i V e I n t e r f e r i n g c o m P 0 U n d s 以下 A I C と 略記す る ) がグル 一スセ ンサの電極 (作用極 ) に吸着する と 実効の 極面積が減少 し その 果 グルコ ス の 1关]与す る酸化還元反応に基づ < 電流が減少 し 測定にお いて負誤 差が生 じ る その電流減少の い は A I C の 極表面 への吸着の度 □ い によ て変化する さ ら に その吸着の 度 □ いは 料液中 の A I C 濃度によ り 変化する ため 電流 の低下の α い を予測 し 生 じ る誤差を補正する と は非 常に困難であ る

A I C の影響を排除する ため に種 の方策が B式み ら れて い る 例え ば 血球分離用 の ろ紙がバィ ォセ ンサの 毛極系 上に設け ら れ れによ Ό 血球な ど を物理的に効率 < 除 去する方法が 示さ れてい る (例え ば 米国特許第 6 0 3

3 8 6 6 号参照 )

ま た バィ 才セ ンサの 極系表面に力ルポキシメ チルセ ル 口 一ス な どの親水性高分子を塗 する と に り 血球 や蛋白な どの A I C の吸着を抑制する と い う と も行われ てい る (例えば 特 平 3 ― 2 0 2 7 6 4 号公報参照 )

発明 の 開示

しか しなが ら 刖 従来のバィ ォセ ンサでは O I C や

A I C を含む流体を試料液 とする と 作用極にお ける 記

■ヽ

〇 I C の酸化の抑制 な ら びに 刖 A I C の電極 (作用極

) 表面への吸着の抑制が必ず し わ 兀全ではな < 未だに基 質濃度の測定にお いて測定誤差が発生 し B式料液中 の基 の を 際の 度よ 低 < あ る いは高 < 見 も つ て し ま と い 課 百があ つ た あ る い は Ο I C の酸化電流の 補正 な ら びに A I C の ろ過を行 う ため に セ ンサの構造 が複雑にな る と い つ た課 百があ た

本発明は のよ う な従来技術の課題を解決する も ので め り バィ ォセ ンサにお ける測定 差を排除 し 迅速かつ 高 度に 料液中 の基質 を測定する とができる簡易構造 のバィ ォセ ンサを提供する と を 巨 的 とする

刖記従来の課題を解決する ため に 本発明 は 料中 の 基質濃 を正確に再現性よ < 測定するため のハ、ィ ォセ ンサ を提供し そのバィ ォセ ンサは 少な < と も 対の電極を 含む電極系 と 前記電極系 を支持する ための少な ぐ と ち 1 つ の絶縁性の基板と 刖記電極系 の少な < と ち作用極上に

HXけ られた第 の反応層 と 刖記第 の反応層上に け ら れた第 の反応層 と を備えてい る

上記バィ 才セ ンサに いて 第 の反応層 は 電極に結 ま たは吸着 し得る官能基および疎水性の灰化水素基を含 む有機化合物 を含む 第 の反応 は 第 の反応層 の疎 水性部分に結 D または吸着 し得る両親媒性脂質 を含む

さ ら に 本発明のパィ ォセ ンサは 第 の反応層お び 第 の反応層 によ つ て構成さ れる 成分膜に担持さ れた Β式 薬系 を備えてお り の試薬系は 少な < と あ膜結 □ 型の ピ □ Π キ ノ ンキ ノ ン依存型グル ス ヒ ド、 Ρ ゲナ ゼ および電子伝 体を含んでい る と を特徴とする

好ま し い実施形態では 第 の反応層 よび第 の反応 層 は それぞれ単分子 μを形成 してい る 好ま し い実施形態では 上記有機化 α 物は 下記一般式

( 1 ) ( 2 ) または ( 3 ) で表さ れる化合物であ る •

H S ― ( C h ₂ ) _n - - X ( 1 )

X ― ( C H 2 ) ' 1 ( C Η ₂ ) X ( 2 )

S ( C H ₂ ) , X ( 3 )

(伹し 上記 般式 ( 1 ) ( 2 ) よび ( 3 ) にお いて n は 1 2 0 の 数 X はメ チル基、 ベ ンンル基 ァ ミ ノ ベ ンンル基 、 力ルポキシベ ンンル基、 ま たは フ ェ ル基であ る ) n は 5 1 5 の整数であ る とがさ ら に好 ま し い

好ま し い実施形態では 上記両親媒性脂質は a ― ホス フ ァ チンルコ リ ン β ―才 レォィ ル r パル ^ 卜 ィ ルであ る

好ま し い実施形態では 上記電子伝 体は 1 ― メ 卜 キ シ 5 ―メ チルフ ェナジ ゥムであ る

好ま し い実施形 # では 上記作用極は 、 金 白金 、 ま た はパ ラ ジクム を含有する

好ま し い実施形態では 上記電極系の対極は 金 、 白金

、 またはパ ラ ジゥム のいずれ ち含有 していない

好ま し い実施形能では 上記電極系の作用極の表面全体 と 、 対極の表面の 部が上記 成分膜で被覆さ れて い る さ ら に好ま し く は 、 対極の 成分膜で被覆さ れていな い部 分の面積が 作用極の面積よ Ό も大さ い

好ま し い実施形態では 上記電極系の作用極の表面のみ が、 成分膜で被覆されてい る

好ま し い実施形態では 上記一対の 極の各々 は 、 上記 W

§式料液の供給路をその間に形成する よ に互い に向き □ て配 さ れた 2 つの絶縁性 板の対向面上にそれぞれ支持 さ れてい る

好ま し い実施形能では 上記 薬系は P Η緩衝剤 を さ ら に含む

本発明 は さ ら に別の局面において バィ ォセ ンサの製 造方法を 供する 本発明のバィ ォセ ンサの製 方法は 絶縁性の基板上に少な < と ち '対の電極を合む電極系 を形 成するェ程 刖記 極系の少な < と も作用極上に第 の反 応層 を けるェ程であ て 電極に 口 または吸着 し得る 官能基および疎水性の灰化水素基を含む有機化合物を含む 溶液を 刖記作用極に接触させる と を含む ェ 刖記第 の反応層上に第 の反応層 を けるェ であ つ て 両親 媒性脂質を含む溶液を刖記第 の反応層 に接触させる と を含む ェ程を包含 し こ で 刖記有機化 D 物を含む溶 液および前記両親媒性脂質を含む溶液の う ち の少な < と

1 つ は電子伝 体を今み 前記両親媒性脂質を含む溶液は さ ら に膜結 σ 型の ピ □ Π キ ノ ンキ ノ ン依存型グル Π ス テ ヒ ド、 U ゲナ ゼを含む と を特徴 とする

本発明 のバィ ォセ ンサの製 it方法の好ま し い実施形肯、 gで は 第 の反応層ねよび第 の反応 は それぞれ単分子 層 を形成 してい る

さ ら に好ま し い実施形能では 上記有機化 α 物は 下記 般式 ( 1 ) ( 2 ) また は ( 3 ) で表さ れる化 物で あ る •

H S ( c Η 2 ) , - X ( 1 ) X― ( c H -

2 ·* ) 】 n - s - ( C H ₂ ) _n - X ( 2 )

S ― ( C H 2 - 】 - X ( 3 )

(伹 し 上記 般式 ( 1 ) ( 2 ) よび ( 3 ) にお いて η は 1 2 0 の敕数 X はメ チル基 ベ ンンル基 ァ ノ ベ ン ンル基 力 ルポキシベ ンンル基 ま たはフ ェ ル基でめ る は 5 1 5 の敕

) □ n であ る と がさ ら に好 ま し い

本発明のバィ ォセ ンサの製造方法の好ま し い実施形 で は 上記両親媒性脂質は L ― ホス フ ァ チジルコ )J ン

， β ―ォ レォィ ル r ―パル h ィ ルでめ る

本発明のバィ ォセ ンサの製造方法の好ま し い実施形台 で は 上記電子伝達体は 1 ―メ 卜 キシ ― 5 ―メ チルフ Xナン ヴムであ る

本発明 のバィ ォセ ンサの製造方法の好ま し い実施形 で は 上記作用極は 金 白金 ま たはパ ラ ンゥム を含有す る

本発明 のハ、ィ ォセ ンサの製 方法の好ま し い実施形態で は 上記電極系の対極は 金 白金 またはパ ラ ンゥム の いずれ 含有 していない

本発明のバィ ォセ ンサの製造方法の好ま し い実施形 で は 上記 極系の作用極の表面全体 と 対極の表面の 部 が上記第 お よ び第 の反応層で被覆さ れてい る さ ら に 好ま し < は 対極の上記第 お よび第 の反応層で被覆さ れて いな い部分の面積が 作用 の面積よ り ち大きい

本発明のバィ ォセ ンサの製造方法の好ま し い実施形 で は 上 PL 極系の作用極の表面のみが 第 お よび の 反 層で被 さ れてい る

本発明のバィ ォセ ンサの製 方法の好ま し い実施形 で は 上記 対の電極の各々 は 上記 料液の供給路をその 間 に形成する よ う に互い に向さ て配置さ れた 2 つ の絶 緣性基板の対向面上にそれぞれ支持さ れてい る

本発明のハ、ィ ォセ ンサの製 l 方法の好ま し い実施形 で は 上記有機化 α 物を含む溶液および上記両親媒性脂質 を 含む溶液の う ち の少な < と 1 つ は P H緩衝剤 を さ ら に 含む

本発明は ピ Π 口 キ ノ U ンキ ノ ン依存型グル ス ヒ ド、 口 ゲナ ゼ (以下 P Q Q ― G D H と略記 ) が 基体上 の電極表面に結 α させた硫黄原子を含む有機化 □ 物の膜と さ ら にその有機化 □ 物の膜の上に設け ら れた両親媒性脂 質の膜とか ら な る 成分膜を利用する と に よ り 上記電 極表面に安定的に固定化さ れ得る と を本発明者 ら が見出 した と に基づいてい る

極表面で起 る酸化 M元反応に対する O I C の影響お よび 極表面に吸着する A I C の影響を効果的に防止 し 且 電極 と の間でグル Π ―ス の関与する酸化還元反応の みを選択的に行 う 手段 と して 本発明は 電極上に設け ら れた上記 成分膜とその 成分膜に結 ま たは吸着さ せた 酵素 すなわち 膜結 α 型の P Q Q ― G D H を使用する 本発明者 ら の知 る 限 Ό こ のよ Ό な 成分膜と膜結 α 型 P

Q Q ― G D H と を グル スセ ンサへ M用 した例は 本発 明以 にはなか た

のよ Ό に 電極上に形成さ れた 成分 中 に P Q Q ― G D Hが固 化さ れてい るバィ ォセ ンサ用 極を用 い か 適切な 子伝 体をその 成分膜中 に □ わせて用 い る と によ 基質であ る グル 一ス に対 して高度に aa 択的 な電ス 化学酸化を可能 とする 系が実現する

に グル ス の選択的な酸化反応を触媒する酵素 は その反応の様式か ら グル n スォキ シダ ゼ ( G O

X ) お よびグル ス丁 ヒ ド π ゲナ ゼ ( G D H ) に大 別 さ れる さ ら に G D H には 3 チ ンァ ド ァ丁 ン ンヌ ク レォチ H ( N A D ) 依存型 G D H ( N A D 一 G D H

) と P Q Q ― G D Hが存在する とが知 ら れてい る

さ ら に P Q Q G D H には 従来か ら そのバィ ォセ ン サへの適用が公知であ た水溶型 P Q Q G D H と それ と は別に 膜結八□ 型の P Q Q 一 G D Hが存在する とが知 ら れてい る (例え ば 0 u b r i e e t a 1 • T h e E M B O J 0 U r n a 1 V o 1 • 1 8 N o •

1 9 P P - 5 1 8 7 ― 5 1 9 4 1 9 9 9 お よび M a t s u s h i t a e t • a 1 • B i o c h e m i s t r y 1 9 8 9 2 8 ( 1 5 ) 6 2 7 6 ― 8 0 を 参照の と ) 膜結 Q 型の P Q Q ― G D H と は その蛋白 質分子の表面 に疎水性 メ ィ ン を有 してお り その疎水性 メ ィ ンが 例えば 細胞膜の よ う な脂質 重 It の疎水性 部分 と疎水相互作用 によ Ό 问親和性で結 する と で 生 体内 にお いて生体膜への安定的な固 が実現さ れてい る う な P Q Q 一 G D H の と でめ る 方 G O X お よび N

A D ― G D H には こ の う な膜結 □ 型の も のは知 ら れて お ら ず 水溶 のみが現在利用可能であ る W 200 れ ら の 、 すなわち 、 G 0 X 、 N A D ― G D H 、 お よび P Q Q 一 G D Hの う ち 、 本発明 にお ける硫黄を含む有 機化 Π 物 /両親媒性脂質 を主成分 とする一成分膜への固定 に は 、 膜結 型の P Q Q 一 G D H を用 い る こ と が最 も好 M であ る なぜな ら 、 膜 σ 型で めれば 、 上記 成分膜の疎 水性部分へ 、 グル 一ス の選択的酸化反応を触媒する酵素 を安定的に im合または吸着させる とがでさ る か ら であ る 他方 、 水溶型では 、 酵素分子表面に実質的に疎水性 メ ィ ンがないため 、 上記一成分膜の疎水性部分に高親和性で 結 □ させる とが困難でめ る

本発明は 、 O I C や A I C を今む流体を試料液とする ィ ォセ ンサにおいて 、 刖記 0 I C が作用極で酸化さ れる と に よ Ό 発生する測定き fi差 、 な ら びに該 A I C が電極 (作 用極 ) 表面に吸着する と によ り 発生する測定誤差を排除 し 、 迅 か 高精度に 料液中 の基質を測定する とがで さ る簡易な構造のバィ ォセ ンサを 是供する

本発明のハ、ィ ォセ ンサは 、 〇 I C の作用極での酸化 、 な ら びに A I c の電極 (ま たは 、 作用極 ) 表面への吸着を上 一成分膜によ て阻止 し 、 なおかつ 、 使用する酵素 と作 用極 と の間 の電子伝達を 成する と によ つ て 、 れまで の課題であ た基質濃度測定にお ける測定誤差を排除する 特筆すベさ と に 、 本発明は 、 酸素によ る P Q Q ― G D

Hか ら の電子受容は起 ら な い の で 、 従来のグルコ 一ス ォ キ シダ ―ゼを用 いた と き の う な グル ス酸化 に対する 溶存酸素の影 も ま た発生 しない と い Ό 利 占 を有する 図面 の簡単な SB明

図 1 は 本発明の一実施の形能におけるバィ ォセ ンサの 試薬系 を除いた分解斜視図で め る

図 2 は 本発明の一実施の形態に けるバィ ォセ ンサの 長手方向断面図であ る

図 3 は 本発明の一実施の形能におけるバィ ォセ ンサ作 製ス キ ム の 部 と 、 本発明の原理の概略と を示 した模式 図であ る

図 4 は 本発明のバィ ォセ ンサにおいて使用する電子伝 体の例 を示す図であ る • ( A ) 電子伝達体 (図 中 Aで示 さ れる ) がポ U マ バ V ク ポ一ン に α した形食 ( B ) 電子伝達体 (全部 ) 同士が互い に結 □ してポ リ マ 鎖を形 成 し た形台 図 5 は 本発明の一実施の形 において得 ら れた電流の

H c t 依存性を示す図であ る

図 6 は 本発明の一実施の形 Hpにお て ί守 ら れた電流の ァ ス Πル ビ ン酸濃度依存性を示す図であ る □

図 7 は 本発明の一実施の形台 におけるバィ ォセ ンサの 式薬系 を除いた分解斜視図でめ る 発明 を実施する ための最良の形態 本 明の 実施の形能にお けるバィ ォセ ンサは、 少な < と 対の電極を含む電極系 と _t 0し 極系 を支持する た め の少な < と も 1 つの絶縁性の基板 と 、 上記電極系 の少な

< と ち作用極上に設け ら れた第 の反応層であ つ て 極 に結 口 また は吸着 し得る官能基およ び疎水性の炭化水 基 を含む有機化 α 物を含む の反 j¾ と 上記 、の反 J心 層上 に χけ ら れた第 の反応層であ つ て 当該第 の反応 層の疎水性部分に結 Π ま たは吸着 し得る両 媒性脂質を含 む第 の反応層 と 上記第 および第 の反応層 に よ て 構成さ れる 成分膜に担持さ れた B式薬系であ て 少な < と も膜結 α 型の ピ P キ ノ ンキ ノ ン依存型グル ス ヒ ド Π ゲナ ゼおよび電子伝達体を含む 薬系 と を備えて い る

以下 図面を参眧 しなが ら 本発明 につ いて §兌明する 図 1 は 本発明の 実施の形態に係るバィ ォセ ンサにお いて 成分膜およびそれに 内包される B式薬系 を取 り 除い た状 の分解斜視図であ る 基板 1 上には 作用極 2 及び 対極 3 が Xけ ら れてい る のよ Ό な電極を形成する には

、 ガ ラ ス のよ う な 気絶縁性の基板 1 上に 電極パ夕 ン を形.成すベさ基板上の部分以外の基板表面を覆 う ため の樹 脂の よ う な のででさた電極パ夕 ンマス ク を置さ その 上か ら 金のよ な金属をス 夕 リ ングすればよ い の よ う な方法は 該分野で常法 と して用 い ら れる も のであ る なお 本願にお いて 用 ロロ 厂作用極 J は 主 と して電 子伝達体の酸化反応を起 させる m極 (ァ ノ ド、 ) の と を、 用 α Γ対極 J は 主 と してその他の反応を起 させる 電極 (力 ソ ― ) の と を指す ち の と して用 い ら れる 伹 し、 M元反応を 基質の検出および /または ΛΕ 里に用 い る 場合は ァ ノ一 と力 ソ と は上記 と逆にな る

代替的に 米国特許第 6 3 4 0 4 2 8 号に記載さ れてい る に 例えば樹脂製の基板 1 上にス ク ン印刷 に W 200

Ό 属 ぺ ス 卜 を印刷 して 極 夕 ン を形成 して も い なお 金 とガ ラス と の接着を よ < する ため に 金 とガ ラ ス と の間 に ク Π ム の を形成 して両者間の密着性を高めて よ い れ ら 作用極 2 及び対極 3 は それぞれ リ ドヽ 4 及び 5 に よ て バ ィ ォセ ンサ外部の測定用 子と m 的 に接 さ れる なお 本明細書中で文脈に応 じて作用極 2 と対極 3 と を特に区別せずに 単に電極 と い Ό とがあ る ま た 図 1 か ら も わかる よ に m極 と U ~ ド、 と は 同 じ材料に よ て 体的に形成さ れてい る とが多いが そ のよ う な場 a 本発明では 電極 と は そ した構造の う ち の試料液と接触するため の部分を い ち の とする

次に 図 2 及び図 3 を参照 して 明する 図 2 は 本発 明の 実施形能に係るパィ ォセ ンサの長手方向断面図でめ

Ό 図 3 は 本発明の 実施形 に係る ィ ォセ ンサ作製 ス キ ム の 部 と本発明の原理の概略を示 した p.式図であ る 。

基板 1 上に形 された作用極 2 上に 硫黄原子を含む有 機化 物の膜 1 0 と さ ら にその上に 両親媒性脂質の膜

1 1 が形成さ れる B式薬系 と して P Q Q ― G D Η の よ う な 酵素及び 1 メ キシ ― 5 メ チルフ X ナンクム のよ う な 子伝達体は 膜 1 0 よび膜 1 1 か ら な る 成分膜に 内 包さ れて い る

図 3 に示す う に 硫黄原子を含む有機化 α 物の膜 1 0 は 硫黄原子 (図 中 S で示さ れる ) を介 して作用極 2 に結

□ し てい る 刖述の一般式であ ら わさ れる の有機化 a 物 は 疎水性部分 (図 3 中で一本の折れ線で示さ れてい る ) を有 してい る 上記有 化 n 物は 基板上 に上記両親媒性 脂質 と の均 な 成分層を形成させる ため に の疎水性 部分が均 な長さ の の を使用する とが好ま し い それ に り 上記有機化 α 物の単分子層が基板上に形成さ れや す < な り 、 結果 と して 成分層が均 にな 安定 した ブ口 ッ キ ング効果が得 られる 上記疎水性部分を形成する 灰化水素鎖の長さ は 上記 般式 ( 1 ) ( 2 ) ま たは

( 3 ) にお ける n の大さ さ に依存する n は 1 2 0 の 敕数であ る こ とが好ま し < 5 1 5 の整数でめ る とが さ ら に好ま し い 最適な η は 0 I C によ る 妨害電流の排 除と と に、 グル ス の酸化 is.元に基づ < 電流を検出 し 易 ぐ する と い う 観 占か ら 上記範囲内で M宜選択され得る 硫 原子を含む有機化 O 物 と しては 述の 般式 ( 1

) ( 2 ) または ( 3 ) で表さ れる化 物であ る とが 好ま し い れ ら に は 例えば ェチルチォ ル プ ピ ルチォ ル、 ブチルチォ ル ぺ ンチルチォ ル へキシ ルチォ ル、 へプチルチォ ル ォク チルチォ ル ノ ルチォ ル、 丁力 ンチォ ル ゥン丁力 ンチォ ル ァ 力 ンチォ ル 卜 U 了力 ンチォ ル テ ラ 丁力 ンチォ ル ぺ ン夕 デ力 ンチォ ル へキサ 力 ンチォ ―ル へプ 夕 丁力 ンチォ ―ル ォク 夕 丁力 ンチォ ル ノ ナ 力 ンチ ォ ―ル ィ ： サ ンチォ ル お よびそれ ら各 に対応する ジスルフ ド (同一構造の上記チ才 ルが s ― S 力 ッ プ U ング した構造を有する ) な ら びにそれ ら の末 がベ ンン ル基 ァ ¾ ノ ベ ンンル基 力 ルポキ シベ ンンル基 め る い はフ 一ル な どでめ るチォ一ルおよびンスルフ ィ な ど が例 と して挙げ ら れる これ ら の有機化 □ 物は 、 当業者に 周知の供給業者か ら巿販品 と して入手可能でめ る 上記チ

、

ォ ル化 □ 物及びンスルフ ィ 化 □ 物は金属表面に非可逆 的に強 < 吸着 、 結 n υ 、 実質的に単分子膜を形成する傾向 が強いため好ま し い さ ら に 、 のよ う な単分子膜か ら な る薄膜は 、 規則性を持つ て酉己列 してい る ため 、 その膜表面 と両親媒性脂質の親和性を利用 して 、 両親媒性脂質の膜を その上に さ ら に形成させる上で好都 であ る □

図 3 を再び参照 して 、 硫黄原子を含む有機化 物の膜 1

0 で基板 1 上の作用極 2 を被覆 した後 、 さ ら にその上に疎 水性部分 (図 3 中 、 一本の折れ線で示す ) と親水性部分 ( 図 3 中 、 白抜さ の楕円で示す ) と を有する両親媒性の脂質 が均一に単層 を成 した膜 1 1 を形成する その手順につ い ては 、 後 する 図 3 か ら わか る よ う に 、 両親媒性脂質の 疎水性部分が上記硫黄原子を含む有機化 □ 物の疎水性部分 と疎水相互作用 によ り 結 Π する と 'によ て 、 一成分膜 (

1 0 、 1 1 ) を形成する ―成分膜の中 には 、 電子伝達体

1 2 が散 り ばめ ら れて内包さ れてい る さ ら に 、 膜結 Π 性

P Q Q 一 G D Ηが 、 一成分膜の疎水性部分 と疎水相互作用 によ Ό 高 和性で □ し 、 膜に埋め込まれてい る 実施例 では 、 その両親媒性脂質 と して 、 L 一 一 ホス フ ァ チジル ン β 一 ォ レォィ ル ― r ―パル h ィ ルを使用 して い るが 、 他の両親媒性脂質で め て よ い その疎水性部分 の長さ は 、 一成分膜を形成 した際に 、 酵素を埋め込め る程 度に長い のが選択される その長さ は 、 使用する酵 ftの 大さ さ お よびその疎水 メ ィ ンの大き さ に依存する 上記の よ Ό に 本発明 に使用する 刖記両親媒性脂質 と し ては L a ―ホス フ ァ チンル Π V ン β ―ォ レォィ ル ― r ル h ィ ルが好ま し い L ― ホス フ ァ チンル 3 リ ノ β ―ォ レォィ ル ― r ― パル ィ ルは 本の疎水 鎖の長さ が比較的揃つ てい る ため 両親媒性脂質の膜 1 1 の厚さ が均 とな り り 安定 した O I C 1 5 と A I C

1 4 に対する ブ □ ッ キ ング効果が得 ら れる 本発明 に使用 する ため に好適な他の両親媒性脂質の例 と しては 例えば

L ― ―フ ォ ス フ ァ チン ン酸 L ― ―フ 才 ス フ ァ チ ン ル U ン L ― ―フ ォ ス フ ァ チジルェ夕 ノ ルァ ン および L ― フ ォ ス フ ァ チンル D L ― グ セ ルの それぞれの ジォ レォィ ル ジ ル h ィ ル ンステァ 口 ィ ル ン ラ ゥ 口ィ ル ジ ス h ィ ル ン U ノ レォィ ル 導 体な どの V ン脂質 または糖脂質 胆汁酸な どが挙げ ら れ る の う な両親媒性脂質は 当業者に周知の供給業者 か ら 市販 a と して入手可能であ る

上記の よ う な一成分膜を使用する と 0 I C 1 5 のバ ィ ォセ ンサ電極表面への拡散を元全 (ま たは ほぼ兀全 ) にブ ッ ク する こ とができ P Q Q ― G D H と グル ス と の反応に続 < 電子伝 体 1 2 と作用極 2 と の反応 と い う 連の反応のみを選択的に行 う とがで る その結果 作用極 2 で 〇 I C 1 5 が酸化さ れる こ と に よ り 生 じ る 測定誤差が排除さ れ 高精度な測 を行 と が可能 と な る さ ら に A I C 1 4 の作用極 2 表面への吸着 も 兀全

( ま た は ほ ぼ完全） 1： ： ブ ロ ッ ク で き -る ； ま た A I C 1 4 の 親媒性脂 1 1 に対する親和性は A I C 1 4 の金属に対す る親和性に比 て者 し < 低いため 作用極 2 の表面に A I C 1 4 が吸着する と に よ る測定き IB差が低 減され 高精度な測定を行 う と が可能 と な る

で 本発明 にお いて使用する 成分膜について さ ら に 明する

まず 硫黄原子を含有する有機化 n 物の膜 1 0 に関 して 硫黄原子は の有機化 □ 物にお いて 極への接着を確 保する役割を果た してい る また 上記 般式 ( 1 ) (

2 ) または ( 3 ) か ら 明 ら かなよ う に 上記 機化 α 物 は ( C H 2 ) n X： で表 さ ：れる 疎水性部分 を有 し て い る の疎水性部分は 先に説明 したよ う に両親媒性の膜

1 1 の疎水性部分 と疎水相互作用 によ り 高い親和性で結 する と によ て 成分膜を安定的に維持する の に役立 てい る したが て のよ な考察に れば 本発明 において膜 1 0 を形成する ため に使用 さ れ得る化 物は 上記の硫黄原子を含有する有機化ム口 物 に限定さ れず れ と機能的に等価な ので も 同様に使用 さ れ得る と は理解 さ れ得る すなわち 電極 と の安定的な接着を実現する官 能基 と 両親媒性脂質 と の同親和性の結 を実現 し得る疎 水性部分 と を有する化 □ 物であれば 本発明の一成分膜を 形成する ため に使用する とがでさ る さ ら に 先に 兌明 したよ う に そのよ Ό な機能的 に等価な化 α 物は 電極表 面上に単分子層 を形成 し得る よ う な構 .を有する とが好 ま し い それに よ り 層 の厚さ が均 と な り よ り 安定し た O I C の ブ □ ッ キ ング効 を得る と がでさ る しか し なが ら 1 0 は必ずし も単分子層でめ る必要はない 例 え ば 膜 1 0 は 部の上記有機化 α 物分子の官能基が 極 と接 してお ら ず かつ 刖記分子の疎水性部分が実質的な 単分子層の隙間 に揷入さ れてい る よ な状 を有する層で あ て も よ い あ る いは 基板お び電極の表面ラ フ ネス の影響によ り 膜 1 0 を構成する が全体 と して波打 て い る よ な構 も し < は層の 部あ る い は全部が多分子 層 を形成 してい る よ う な構造を と る場 α が考え られる 以上の よ う な場 Π で 本願発明の効果は得 られる の と考え る とがでさ る m m極上に形成さ れた硫黄原子を合 有する有機化 n 物の膜 1 0 および れと機能的に等価な膜 を包括的 に い Ό 概 、を指 して 本明細 にお いて 厂第 の反応層 J と い Ό 用 を使用する

さ ら に 上記膜 1 0 上に形成さ れる両親媒性脂質の膜 1

1 に関 して 両親媒性脂質の疎水性部分は 上記第 の反 応層 を形成する化 □ 物の疎水性部分 と 疎水相互作用 に よ り 高 い親和性で π する役割を担 てい る で 膜 1

1 は必ず し 図 3 に示したよ Ό な単分子層であ る必要はな い 例え ば 膜 1 1 は 部の上記両親媒性脂質分子の疎 水性基の先顺が膜 1 0 と接 してお ら ず か 刖記分子の疎 水性部分が実質的な単分子層の隙間 に揷入さ れてい る よ う な状能を有する層でめ つ て ち よ い あ る い は 基板および 電極の表面 ラ フ ネス あ る い は膜 1 0 の構造の影響によ り 膜 1 1 を構成する 層が全体 と して波打つ てい る よ Ό な構

IB. も し < は層の 部め る いは全部が多分子層 を形成 して い る よ う な構造を と り る場 □ が老え ら れる のよ う な 場 □ で も 本 発明の効果は得 ら れる の と考える と が でき る 第 の反応層上に形成さ れる両親媒性脂質の膜 1

0 お よび れ と機能的に等価な膜を包括的に い う 概念を指 して 本明細 にお いて Γ第 の反応 J と い 用 PP を 使用する

厂 成分膜 J と は 要する に 電極上に形成された の よ Ό な第 の反応層 と第一の反応層 とか ら なる も の をい う 概今であ る 代表的には 図 2 お よ び図 3 で模式的に示す よ う に 細胞膜な ど に見 ら れる脂質 重層 に似た環境を 供する のであ る それによ Ό 膜結 型の酵素が 天然 の細胞膜な どで見 ら れる う に 成分膜の 中 に埋め込ま れた状 を と る とがでさ る ただ し 述 したよ Ό に 膜 1 0 お よび膜 1 1 は必ずし ¾単分子層であ る必要はな い ため 成分膜は必ず し も図 3 に示 したよ な 2 の単分 子層の組 α せか ら 成る 分子層であ る必要はない さ ら に は 第 の反応層 と第 の反応層の境界部分付近が 刖記 官能基を有する有機化 □ 物の分子 と両親媒性脂質分子と が 複雑に α • 分散さ れたよ う な構造を有 していて い 本発明の 成分膜は 電極表面で起 る グル ス の酸化

M元反応に対する o I C の影響お び電極表面に吸着する

A I C の影響を効果的に防止 し 且つ 電極 と の間でグル

3 ス の関与する酸化 元反応のみを 択的に行 Ό と い ラ 機能 を実現する も のであ る 本発明 にお いて 成分膜に はさ ら に 上記酵素 と作用極 2 と の間で m子輸送を実現す る ための電子伝達体 1 2 が含まれてい る

本発明 にお いて使用 される電子伝達体 1 2 と しては P Q Q ― G D Hか ら 作用極 2 への電 輸送を 現する化 物 が用 い ら れる 本発明 において使用 さ れる電子伝 体 1 2 と しては 1 ―メ キ シ ― 5 ― メ チルフ ェ ナジゥム の う な化 α 物が 分子の平面性が高 < 膜の内部に揷入さ れる ので 作用極近傍に存在 し 効率の高い 子伝 をする た め 好ま し さ ら に フ Xナン ン 導体 フ ノ チ ジ ン 導体 (ァズ ルおよびチォ ンな ど ) およびキ ノ ン

07b導体な ど も 同様に分子の平面性が高 < 好ま しい れ ら の化合物は 当業者に周知の供給業者か ら市販 □ と して 入手可能であ る

さ ら に 刖記電子伝達体 1 2 は ポ U ―バ ッ ク ポ ―ン に結合 した形台 (図 4 A を麥照 ) またはそれ自 身の 部 も し < は全部がポ マ ―鎖を形成する よ な形 (図 4 B を参日召 ) で つ て も よ い のよ う な電子伝達体は 当業 者に周知の供給業者か ら市販 □ と して入手可能でめ る

子伝達体 1 2 は れ ら の 種または 種以上が使用 さ れる ま た ( _れ ら は 例であ て 本発明の実施に用 い る電子伝達体 1 2 は上記の例に限定さ れない

次に 電極上への 成分膜の形成の仕方について 兑明す る 。

図 2 に 式的 に すよ つ に 作用極 2 の 面のほぼ全部 が硫黄原子を含む有機化 α 物の膜 1 0 で被覆さ れてい る とが好ま し い 硫黄原子を含む有機化 口 物の膜 1 0 の被覆 は 作用極 2 表面を 刖記有機物の溶液に浸漬する方法あ る いは作用極 2 表面にその溶液を滴下する方法に よ て 成 さ れる め る いは 刖記有 物の蒸 に表面を さ ら す と

20 に つ て ち 1 J の被 δを行つ とができ る しか しなが ら 図 1 および図 2 に示すよ う に作用極 2 と対極 3 と が同 基板上に配置さ れてい る場 作用極表面のみ あ る い は 対極の 部 と作用極の表面の全体またはほ ぼ全体を被覆す る と いつ た場 P に は 刖記有機化 a 物の溶液によ る被覆領 域を正確に規定す る ため には 次の よ にする とが好ま し い

すなわち 作用極 2 および必要に応 じて対極 3 と ほぼ同 じ形状を有する 面であ て それ ら と所望の接触面積を形 成 し得る面を有する樹脂製の棒状の部材のその表面に 、 刖 記有機化 物の溶液を少 塗布 し の部材の当該表面を 作用極 2 の表面ね よび必要に応 じて対極 3 を含む所望の領 域に接触させる こ と によ Ό 刖記部材の表面上に塗 さ れ た刖記有機化八 σ 物の溶液を 作用極 2 表面上に転写する こ と ができ る の Ό に して 有機化 □ 物の膜で覆われる 電極上の領域が正確に規定さ れ バィ ォセ ンサの測定精度 を保持する と がでさ る の な いわ る転写法は 当該分野でよ < 用 い られてお り 当業者の周知の技術であ る 。

作用極 面を被覆 してい る 硫 原子を合む有機化 □ 物 の膜 1 0 を両親媒性脂質によ て さ ら に被覆する に は 両 親媒性脂質のベ シク ル ( リ ポ ソ一ム ) 分散液に 刖記の 表面が硫黄原子を含む有機化 Π 物の膜に よ 被覆さ れた作 用極を浸漬すればよ い

Ρ Q Q ― G D Η 及び電子伝 体を上記両親媒性脂質膜 内 に包埋する に は それぞれの膜の形成過程において P Q Q― G D Η 及び 子伝 体を溶存さ せてお < 方法が効 果的であ る

本発明 の実施において測定対象 と な る基質 を含む試料液 と しては グルコ 一ス を含有する 料液が好ま し い 。 例 と しては 血液 血漿 血清 細胞間質液 唾液や尿な どの 生体 si料液 あ る い は食品や飲料水な どが挙げ ら れる。 さ ら には 通常の実験室 レベルで使用 さ れる電解液 環境測 定に使用 される液体な ど 用 い る とが可能であ る 。 特に グル ス の測定においては 全血や血漿 あ る いは尿な ど グル ス の他に 0 I Cや A I C を含む液体を 8式料液 とする とが多い

で 試料液中 に今まれる基質の測定にお ける Γ は 気化学反応に よ り 変化する 出力であればよ < 例え ば 電流や通電 荷 を用 い る と ができ る

本発明 のパィ ォセ ンサに いて 作用極 2 は金 白金ま たはパ ラ ンゥム を含有する とが好ま し い のよ う にす る と 作用極 2 に印加さ れる電位が安 Εする ため よ り 精 度の良い測定が実現さ れる

また 上記硫黄原子を含む有機化 □ 物 の吸着が強固でめ る と い う 観 占か ら 作用極 2 が金 パ ラ ジヴ ム 白金等の 貴金属や 銀 銅 力 ゥムな どの他の遷移金属を含有 する と が好ま し い したがつ て 実質的に作用極 2 のみ

-、

を 刖記有機化 □ 物の膜 1 0 で被覆する 巨 的においては、 対 極 3 に れ ら 金属 を今有させな い と が好ま し い

さ ら に 対極 3 の表面の少な < と 部が 硫黄原子を 含む有機化 α 物の膜 1 0 および両親媒性脂質の 1 1 で 被覆されて いな い とが好ま し い o こ のよ Ό にする と 対 極 3 の表面にお いて W\ PC膜で覆われていない部分では 肓 ij 膜に覆われてい る部分に比ベて Ρϊ 料液中 に含まれる 還元される物質が到達 しやす < なる ため 対極 3 での還元 反応 (力 ソ 反応 ) が進行 しやす く な Ό り 安定な測 定を行 と が可能 と なる ま た 対極 3 にお ける 硫黄 原子を含む有機化 a 物の膜 1 0 および両親媒性脂質の膜

1 1 で被覆さ れていない部分の面積が、 作用極 2 の面積よ り も大き い とがよ Ό 好ま し い o さ ら には 対極 3 上に硫 黄原子を含む有機化 Π 物の膜 1 0 ねよび両親媒性脂質の 膜 1 1 が実質的に存在しない とが好ま し い さ ら には 実質的に作用極 2 のみが硫黄原子を含む有機化 □ 物の膜 1

0 お び両親媒性脂質の膜 1 1 で被覆さ れてい る とが 好ま しい o の よ にする と 対極 3 での還元反応がよ り 円滑に進行 し さ ら に安定な測定を行 う とが可能 と な る 図 1 を参照 して 上 pDのよ つ に P周 した基 1 に ス ッ 6 を有する スぺ ―サ 7 および 気孔 8 を備えた力 バ 9 を図 1 の 占鎖線で示すよ Ό な位置関係 を も つ て接 着する と に り 本発明のバィ ォセ ンサ 作製さ れる o スぺ サ 7 のス U ッ 卜 6 の部分に 料液供給路が形成さ れる バィ ォセ ンサの端部にお ける ス U ッ 卜 6 の 放顺部 は B式料液供給路への試料液供給 □ と なる

図 1 に示す構造のバィ ォセ ンサの ø式料液供 路と な る ス

U ッ 卜 6 の開放端に 式料液を接触さ せる と 試料液は Θ式 料液供 'TP路内へ毛細管現象に り 導入さ れ §式 の作用 によ て 反 J心が進行する の よ フ に m極 ru 系 を け た基板 1 に ス ぺ サ 7 および力 バ 9 か ら なる 力 部材を組み わせて試料液供給路を形成する と 測定対象 となる基質 を含む 料液のパィ ォセ ンサへの供給里を 定 にする と がでさ る ので 測定の精度を向上さ せる とが でき る また 試料液供和給路を けたバィ ォセ ンサにおい ては P H緩衝剤を力パ 部材側に e又ける と もでさ る また 図 7 に示すよ に 対極 3 または作用極 2 の ち どち ら か 方を それに対応する ϋ 5 または 4 と と ち に形成 した絶縁性の第 2 の基板を 力バ 9 のかわ り に用 いて ち よ い の場合も 基板 1 スぺ サ 7 及び第 2 の基板によ り 料液供 *厶

TO路が形成さ れる ので 料液の n ィ ォセ ンサへの供和 を 定にする とがでさ 測定の精 度を向上させる とがでさ る の よ う な形 g のバィ ォセ ンサの例は 例えば 米国特 ΡΤ第 6 4 5 8 2 5 8 号に 記載さ れてい る

さ ら に 上記のよ う に S式料液供給路を形成せず 基板 1 のみでハ、ィ ォセ ンサを構成する と でさ る の場 o 試薬系は電極系上またはその近傍に ける のよ う な形 態のバィ ォセ ンサの例は 例え ば 刖 の特開平 3 ― 2 0

2 7 6 4 号公報に記載されてい る

以下 実施例 を用 いて本発明 を説明する が これ ら の実 施例は 本発明の例示であ つ て本発明 を制限する ち のでは ない

(実施例 1 )

本発明のパィ ォセ ンサの作製 a プロ テオソ―ム懸濁液の調製

以下の 5周製法は 例でめ つ て れのみに限定さ れる わけではな い

まず L ―ホス フ ァ チジル U ン β ―ォ レォィ ル 一 r ― ル b ィ ル (以下 Ρ C 〇 P と略記する ) ( W a k o P u r e C h e m i c a 1 s (和光純薬ェ業 (株

) ) か ら 入手 ) の U ポソ ム を以下の う に して 周製 し た P C 0 P を その濃度が 1 0 m M となる う に丸底フ ラ ス コ 中の 卜 リ ク P 口 メ 夕 ン に溶解 した Π 夕 U ェバポ レ 夕 を用 いて 減圧下 溶媒を兀全に蒸発させた 。 次 いで P C O P 濃度が 4 0 m Μ と な る よ 2 ―プ Pパ ノ

―ルを用 いて フ ラ ス 中 の P C O P を再度溶解 し 得 ら れ た溶液の 0 • 5 m L を 0 • 1 5 M の N a C 1 を今む 2 0 m Mの U ス ― H C 1 緩衝液 ( P H = 7 • 3 ) 1 0 m L に 加えた こ の溶液を 1 0 分間激 し < 攪拌する と によ り 、

P C 0 P の U ポ ソ ム の縣濁液を得た

次いで 酵素 と電子伝達体を上記の U ポソ ム に組み込 むため に 上記の P C o P の リ ポ ソ ム縣濁液 1 0 m L に

P Q Q ― G D H ( A c i n e t ο b a c t e r c a 1 c o a c e t i c u s か ら i 述の M a t S u s h i t a e t . a 1 ( 1 9 8 9 ) に記載の う に精製 し た ) 1 m g と 、 電子伝 体でめ る 1 一 メ h キシ 一 5 ―メ チルフ ェナジ 二ゥ ム (以下 M M P と略記 ) ( D o j i n d 0 L a b o r a t o r i e s (株式 社 同仁化学研究所 ) か ら 入 手） 3 0 m g と を添加 し の溶液を 1 0 分間激 し < 攪拌 した のよ Ό に して得た Ρ Q Q ― G D H と M M P と を含 む P C 0 P の U ポ ソ― 濁 を 以下 M M P プ口 テ ォソ ム縣濁液と表記する

b • 基板の調製

方 作用極お び対極を基板上に作製する ため に 、 ま ず ガラ ス製の電 絶縁性の基板 1 上に 樹脂製の電極パ 夕 ンマス ク を設置 し 、 その上か ら ク ム をスパ ッ 夕 リ ン グ してク P ム層 を形成した さ ら にその上に金をスパ ッ 夕 ングする と によ Ό 、 作用極 2 および リ 4 な ら びに 対極 3 および U ド、 5 を形成 した

c • 極の加ェ

のよ う に形成 した作用極 2 を n ―ォク チルチォ ル

(以下 o T と表記する） に よ Ό 刖述の転写法に従つ て 以下のよ う に被覆 した。 まず 基板 1 上の作用極 2 と ほ ぼ同 じ形状の平面を有する棒状の樹脂製 具の該平面に、 o T のェ夕 ノ ル溶液 (濃度 5 m M ) を少量 した 。 次 いで その 0 T を塗布した面を 作用極 2 表面のほぼ全面 と重なる う に 注意深く 位置調節 してか ら 重ね □ わせた 次いで 作用極 2 上に 0 T溶液を残存させる に して 刖記棒状の 目 を作用極 2 か ら 引 さ離 し O Tが作用極表 面へ吸着さ れる まで放置 した

れによ Ό 分子内に硫黄原子を含む有機化 α 物の膜 1

0 すなわち o T の膜を形成 し 1 時間後 ェ夕 ノ ル、 超純水を順に用 いて作用極 2 を U ンス した ィ守 ら れた基板

1 を 1 0 m M の M M P 水溶液に 1 時間浸漬 し 〇 T膜内へ の M M P の浸入を促進 した 超純水を用 いて基板 1 を十分 に U ンス した後 上 己の M M P プ π テォソ ム縣濁液に 8 時間浸 貴 し 作用極 2 上の 0 Τ の膜 1 0 と Μ M P プ D テ才ソ一ム 1 7 と の融 σ を行つ た (図 3 を参ハ日召、、 )

上記の基板 1 を 純水にて U ンス し 、 乾燥さ せた後 、 基 板 1 にス ぺ一サ一 7 および力ハ、 ― 9 を組み α わせて図 2 の よ う なハ、ィ ォセ ンサを作製 した

ま た 、 比較例 と して 、 Ρ Q Q ― G D H 1 m g と M M P 3

0 m g を 2 0 m Μ の ス ― H C 1 緩衝液 ( P H = 7 3

) 1 0 m L に溶解した溶液 1 L を 、 基板 1 上の作用極 2 の表面に滴下 し乾燥させ 、 基板 1 にスぺ一サ 7 お よび力 バ 9 を組み α わせてバィ ォセ ンサを作 し た

( 施例 2 )

本 明のバィ ォセ ンサに対する A I C の影

一定 の D グル ス ( 4 0 0 m g / d L ) を含む血 液を 料液と し て 、 上記のよ う な 製 した本発明の一実施 形台

、に係るバィ ォセ ンサお よび比較例のバィ ォセ ンサの 料液供給路の開 Ρ部 、 すなわち ス ぺ ―サ一 7 のス リ ッ h 8 の開放端部に供給し た なお 、 血液中の 血球容積比 (へ マ 卜 ク リ ヅ 卜 、 以下 H C t と略記する ) が 2 5 、 4 0 、 6

0 % と異な る P 料液を用 いた 一定時間 (反応時間 2 5 秒

) 経過後に対極 3 に対して 5 0 0 m V の 圧を作用極 2 に 印加 し 、 その 5 秒後に流れた 流値を測定 した 図 5 に示 すよ う に 、 比較例のバィ ォセ ンサの場 D には 、 H c t の増 加に伴い 、 電流が低下する傾向が見 ら れた o

れは 、 作用極表面に吸着する赤血球の が H c t の増 加 に伴い増大する傾向が り 、 その傾向 に対応 して電極反 応が阻口 されてい る と を示唆 してい る その結果 、 グル W ス 晨度が 1口 J であ て ち 電 値は H c t の存在に よ つ て変化 し 測定誤差が生 じた の と考え ら れる

方 本実施例のパィ ォセ ンサは H c t の存在に拘わ ら ずほぼ 1口 J の電流値が得 ら れた よ つ て 赤血球の作用 極 2 表面への吸着は 作用極 2 表面に存在する o T と P C ο Ρ の膜に よ て抑制さ れた も の と考え ら れる 有機化 n 物であ る o T と P C 0 P の膜で被覆された電極表面の物性 は 未被覆の金の表面か ら 大さ < 変化 している あ る いは 極の界面は被覆膜の末顺基によ て 正 ち し < は負 に 帯 してい る

れ ら の亦

久化の両方 あ る いは どち ら か 方の効果に り 血球の吸着が抑制さ れる う にな た の と考え る と がでさ る また 0 T と P C 〇 P の膜内 に取 込まれた

Μ M Ρ は P Q Q G D H と作用極 と の間の 子伝 を 成する能力があ る とがわか た のよ Ό に o T と P

C O Ρ の膜で被覆する と によ り A I C の吸着に よ る測 定誤差を排除する とが可能であ つ た

(実施例 3 )

本発明のバィ ォセ ンサに対する O I C の影

さ ら に H c t が 4 0 % の血液に 〇 I C のひ と つでめ る ァス 3 ル ビ ン酸を添加 し 元か ら血液中 に含まれてい る と あわせた全濃度が 1 1 5 2 m M とな る よ Ό 整 し た これ ら の血液を使用 し 上記 と 同様に して 流値を 測 した 図 6 に示すよ に 比較例のバィ ォセ ンサの場 には ァス 3 ル ビ ン酸濃度の増加に伴い 電流が増大す る傾向が見 ら れた れは 作用極でァス ル ビ ン酸の酸 W

化反 J心が 行 してい る と をポ唆 してい る その結 、 グ ル ス濃度が同 でめ て も 電流値はァス ル ビ ン酸 度に つ て変化 し 測定誤 が生 じた も の と え ら れる 濃 差 方 本実施例のパィ ォセ ンサは ァス ル ビ ン酸濃度 に拘わ ら ずほぼ同 の電流値が得 ら れた れは 作用極

2 の金 ¾極表面が分子鎖長の長い有機化 Π 物でめ る o Τ と

P C O P の膜で被覆されてい る ため 金電極表面への ァス

Π ル ビ ン酸の接近が の膜に て抑制さ れたため に 1守 t> れた結果であ る と考え ら れる の よ う に O T と P C 0

P の膜で被覆する と によ り A I C の吸着によ る誤差だ けでな < O I C の 気化ナ酸化によ る測定誤差を排除す る とが可能であ た

(実施例 4 )

参 極の使用

本実施例では 実施例 1 と 问様の手順によ り 作製 した本 発明の 実施形台 に係るバィ ォセ ンサに 料液を供 /卞口 した 直後に 塩化力 U ゥム と ゝ天か ら な る 橋を介 して 銀 / 化銀電極を 料液供給 □付近の B式料液と接触させた 。 銀

/塩化銀電極はその 位が安定 してお Ό 参照極と して用 い る とが可能であ る

定 の D 一 グルコ ス ( 4 0 0 m s d L ) を含む、 種々 の H c t の血液を試料液と してバィ ォセ ンサの試料液 供給路の開 □部 すなわち ス ぺ サ 7 のス U ッ 卜 8 の開 放顺部に供給 した 2 5 秒経過後に銀 / 化銀電極に対 し て 5 0 0 m V の電圧を作用極 2 に印加 し 5 秒後に流れた 電 値を測定 した

その 果 Η C t に拘わ ら ずほぼ の電流値が得 ら れ た 同 条件下にお ける 流値の ばら さは 実施例 2 で 得 ら れた結果 と比較 してよ り 小さ い のであ た よ て バィ ォセ ンサ系への参照極の導入によ Ό 測定値の安定性 がよ り 向上 した とがわか つ た

H C t が 4 0 % ァス ル ビ ン酸濃度が 1 1 5 2 m Mの血液を用 い 上記 と 同様に して 電流値を測定 した その 士果 ァス ルビ ン酸濃 に拘わ ら ずほぼ同 の電 流値が得 ら れた 条件下にお ける電流値の ば ら つ さ は 実施例 3 で得 られた 果 と 比較 してよ り 小 さ い のであ た バィ ォセ ンサ系への参照極の導入によ り ァス ル ビ ン酸濃度の変化に対する測定値の安定性ち よ り 向上す る とがわか た

(実施例 5 )

n ―ォク チルジスルフ ィ ド、 の お用

本実施例では n ―ォク チルンスルフ ィ ド、 を o T の代わ り に用 いて 実施例 1 に示 した方法でバィ ォセ ンサを作製 した 血液中の グル ス に対する応答は 実施例 2 よ び 3 に述ベた方法 と 同様に して測定 した □

その 果 本実施例にお いて ち 実施例 2 お よ び 3 と 同 様に H c t およびァス ル ビ ン酸濃度に拘わ らずほぼ同 の 电流値が得 られた o T は n ォク チルンスル フ の S S α が開裂する と によ 得 ら れる化 □ 物であ る のよ Ό な対応関係に め る チォ ル と ンスル フ ィ は同 様の膜を形成する とが知 ら れてい る (実施例 6 ) - 異なる基板上に形成 した作用極および対極

本 施例では力 バ ¹ 9 上に対極 3 を形 した 作用極 2 の表面は実施例 1 に述ベたよ に修飾した 血液中 の グル ス に対する応答の測定を 実施例 2 お び 3 に述ベた 方法 と 様に して行 た

その結果 本実施例において も 実施例 2 お よび 3 と 1 J 様に H C t およびァス n ル ビ ン酸濃度に拘わ らずほぼ の電流値が得 ら れた よ て複数の基板上に電極を形成 させた場 C3 も 同様の効果が得 ら れる と が分か た 本 実施例の場合 作用極 2 と対極 3 は異な る基板上に存在す る よ て 対極 3 を膜で被覆せず 実質的 に作用極 2 の みを膜で被覆するセ ンサを作製する にめた て 作用極 2 を配置 した基板 1 を o T溶液に浸漬する め る い は基板 1 上の作用極 2 表面を o T の蒸気に さ らす方法を用 い る と が可能であ る のよ Ό に 本実施例の形台 よれば 同 面上に作用極 と対核とが設け ら れたセ ンサ と 比ベて 実質 的に作用極のみが膜で被覆されたセ ンサを容易 に製造する と がでさ る

(実施例 7 )

白 ま たは Λ ラ ンゥム の使用

本実施例では 白金あ る いはパ ラ ンクム を用 いて 作用 極 2 ¾ よび対極 3 を作製 した ガ ラ ス製の電 絶縁性の基 板 1 上に樹脂製の電極パ 夕 ンマス ク を sru

B又置 して ク ム の 層 を形成 し さ ら に 白金またはパ ラ ジゥ ム をスパ タ 'J ン グする と によ て各電極を形成 し た さ ら に 施例 1 に述ベた方法 と 同 に して作用極 2 面を被 した 血液 中 の グル ス に対する応答の測定を 実施例 2 お よび 3 に述 た方法と 同様に して行 た

その 果 白金を用 いた場 D 電流値は H c t に対 して 若干の依存性を示 し たが ァス Π ル ビン酸濃度を変化さ せ て も ほぼ同 の 流値を示 した 方 金の代わ に 白金 を用 いて 実施例 1 に記載 した比較例 と同様に して作製 し たバィ ォセ ンサでは 電流がよ Ό 大さ < H c t お びァス ル ビ ン酸濃度に対 して依存 した

の とか ら 白金を作用極の材料と して用 いた場 Π に ち 本発明の膜で被覆する と によ る O I C A I C の影 響抑制効果が得 ら れる と がわか た ま た ラ ジヴム を作用極の材料 と して用 いた場八□ には 金で得 ら れた結果 と比較して同程スの H C t およびァス ル ビ ン酸濃度に 対する 非依存性が観測さ れ パ ラ ンクム も ま た 本発明 に ける非常に好適な 極材料でめ る とがわか た

(実施例 8 )

P H緩衝剤の効果

P H緩衝剤をバィ 才セ ンサ系内 に さ ら に包含させた場 □ のバィ ォセ ンサ特性を評価 した 本実施例 にお いて 製 し た ィ ォセ ンサは P H緩衝剤 と して U ン酸水素 力 U ヴ ム と U ン酸 水 力 U ゥ ム の混 物を試薬系 と して P Q Q

G D Hお よび電子伝 体を含む両親媒性脂質の膜 1 1 内 に担持 し た以外 実施例 1 で用 いた も の と 同様でめ る

定 の D ― グル ス ( 4 0 0 m g / d L ) を含み

H c t の異な る血液を試料液と してバィ ォセ ンサの空間部 に供給 した 定時間経過後に対極 3 に対 して 5 0 0 m V の電圧を作用極 2 に印加 し その際に流れた電流値を測定 し た その 果 得 ら れた 流値は H C t に依存 しない も のであ つ た

実施例 2 および 3 で得 ら れた結果 と比較する と 電流値 の ァス n ル ビン酸濃度に対する依存性はほぼ変わ ら ないが

H C t 依存性はさ ら に軽減さ れた すなわち よ り H c t に依存 しない 定の電流値が同 グル ス濃 /又に対 し て得 ら れた

のよ な 4 m士果がィ守 ら れた理由 は以下の よ に して考え る とがでさ る P H緩衝剤 をバィ ォセ ンサ系内 に包含さ せる と によ り バィ ォセ ンサ内の試料液の P H は安定す る そのため 電極上に存在する膜の末端基の荷電状 が 安定化 し 血液中の A I C に対する 吸着防止効果が 式料液 と に 定 となつ た の と考え ら れる

さ ら に そのよ な P H の安定によ り 酵素活性 安定 し 定時間後に生成する電子伝 体の M兀体の里 も ま た

S式料液 と に一定 となフ た の と考え ら れる P H安定化 に よ る _ れ ら つ の両方め る い は 方の安定化効果によ り 電流値の Η c t に対する依存性が軽減さ れた の と考え ら れる 本実施例 において特に安定化効果が見 ら れたの は 測定液の Ρ Hが 4 9 であ る と さであ つ た したが て 好ま し い Ρ H領域は P H 4 9 であ る 酵素活性が最 も安定 と い う 観ハ占、、か ら は さ ら に好ま し い P H領域は Ρ

H 5 8 の範囲であ る

なお 上記実施例 2 8 では電流値の測定を行つ たが 値に代んて 荷 を測 ΛΕ した場 □ について も 上述の 流値 と 同様の傾向が見 ら れた

ま た 上記実施例では 極系への印加電圧を 5 0 0 m

マ

V と したが 印加電圧は の値に限定さ れる と はない m子伝達体が作用極にお いて 化される電圧であればよ い 上記実施例においては反応時間 を 2 5 秒あ る い は 5 5 秒 電圧印加時間 と電流検出時間 をその 5 秒後 と したが れに限定されず 観測可能な大き さ の 流を得る と ので さ る 時間であればよ い

さ ら に 必要に応 じて 上記 P 薬系また は 薬系 に今ま れる 薬の う ち つ あ る いは複数を作用極に固定化する と に よ て 酵素 子伝達体を不溶化また は非溶出化さ せる とが好ま し い その場 □ には 膜と の間の フ ァ ン丁 ルヮ ルス 力 によ る相互作用 を利用する方法 有結 α 法 架橋固定法または配位結 □ や特異的 □ 性の相互作用 を 用 いた固定化法を用 い る とがでさ る 特に本発明 を実施 する にお いては 電極上の硫黄原子を含む有機化 α 物の膜 に 刖記 薬を共有結 固定する方法 また好ま し い

膜結 口 型 P Q Q ― G D Hが本発明の実施にお いて好適な 酵素であ る こ と を記載 し たが れは 必ず し 本発明 に お いて使用すベさ酵素は 膜 □ 型 P Q Q ― G D Η のみに 限定さ れる と い う 意図ではない 膜結 n 型 P Q Q ― G D Η 以外の他の酵素であ て ち 分子表面の少な < と も 一部に 疎水性 メ ィ ンを有 してお り 上記のよ う な 成分膜の疎 水性部分 と高親和性で 口 し得る酵素 (あ る いは 成分 膜に埋め込まれる形 が実現でさ る ) であ て 且つ グル ス の選択的酸化反応を触媒する酵素あれば 同 様に使用 し得る も ち ろ ん 好適な 成分膜を構成する成 分の組み □ わせは その Ό な酵素に応 じて変化 し得る 上記 薬系 に P Q Q ― G D H以外の酵素を含ませる と に よ り グル ス以外の基質の測定を行 と ち可能で め る 例え ば ス ク ス を グル ス と フ ルク 卜 ス に 分解する機能を有するィ ンベル夕 ―ゼを 薬系 に追加する と に り ス ク 口 ス の定 を行 Ό とがでさ る 上記実施例 においては 電極お よびそれ ら のパタ ンの 作製方法 と してマス ク を通 したス ッ 夕 U ング法を用 いた が それに限定されず 例えば スパ ッ タ ン グ法 ィ ォ ンプ レ ティ ング法 着法 化学 着法の いずれかで作 製 し た金属膜を フ ォ U ソ グラ フ ィ およびェ ッ チ ング と 組み α わせてパ夕 ン作製を して よ い 八 夕 ン形成は レ ザ によ る金属の 卜 U ングによ て 行 う とがで さ る 金属ぺ ス 卜 を用 いて基板にス ク リ ン印刷 を施 し 極パ夕 ン を形成 して も よ い さ ら には パ夕 ―ン化 し た金属箱をその ま ま絶縁性基板上に接着さ せて も い れ ら 電極系の形状 配置 個数等は上記実施例 に示 し た の に限定される も のではない 例えば 作用極 と対極 をそれぞれ異なる絶縁性基板上に形成させて も よ い し (図

7 を参日召 ) 作用極 と対極をそれぞれ複数個形成さ せて よ い ま た ね び顺子の形状 配置 個数等も上 記実施例 に示 した も のに限定される も のではな い

測定精度を向上させる 巨 的においては 測定対き とな る を含む溶液の を容易 に 定 に規定する とができ る ため 、 スぺ サ が上記バィ 才バィ ォセ ンサの構成要素 と して今まれてい る と が好ま し い しか し 、 一定体積の

§式料液を採取する と のでき る .具 と α わせて本発明のハ、 ィ ォセ ンサを用 い る場 Π には 、 スぺ ―サ 及び力バ一か ら な る 力 一部材は必ずし 必要ではな れ ら のス 一 サ一 、 力ハ、一 、 ま たは基板に使用する材料は 、 実施例で基 板の材料 と して使用 したガ ラス のみに限 ら ず 、 その他 、 例 え ば 、 シ U ンお びその酸化物な どの 機材料 、 ポ U ェ チ レ ンテ レ フ 夕 レ P E T ) およびポ プ Π ピ レ ン

P P ) な どの樹脂のよ な電 絶縁性の材料 も 様に本発 明のバィ ォセ ンサの 施 に使用 され得る 産業上の利用可能

以上のよ Ό に本発明のバィ ォセ ンサは 、 料液中 に含ま れる A I C よび ο I C の影響を受けず 、 迅速か 高精度 に 料液中の基質 を測定する こ とができ る簡易な構造のバ ィ ォセ ンサと して Μしてい る 特に 、 本発明のバィ ォセ ン サは 、 si料液中 の グル ス濃度を検出する ための使い て夕 ィ プのパィ ォセ ンサ と して してい る

Claims

請求の範囲 1 • 少な < と も一対の電極を含む電極 刖記電極系 を支持する ための少な < と 1 つ の絶縁性の 基板と 、 前記 極系の少な < と 作用極上に設け ら れた第一の反 応層でめ て 、 極に結 口 または吸着 し得る官能 あ び 疎水性の灰化水素基を含む有機化 α 物を含む第一の反応 層 と 、 刖 第一の反応層上に口又け ら れた第 .の汉応層であ つ て、 当該第一の反応層の疎水性部分に — "¾士 D ま たは吸着 し得る 両親 性脂質を含む第一の反応層 と 、 刖記第一および第 の反応層 に よ つ て構成さ れる二成分 膜に担持さ れた試薬系であ て 、 少な < と も膜結合型の ピΠ P キ ノ U ンキノ ン依存型グル 一ステ ヒ ド 口 ゲナ一ゼ よ び電子伝達体を含む 系 と 、 を備え る 、 バィ 才セ ンサ 2 • 第一の反 心層および第 .の反応層は 、 それぞれ単分子 を形成 してい る 、 口 求項 1 に記載のバィ ォセ ンサ。 3 • 刖記有機化合物は 、 下記一般式 ( 1 ) 、 ( 2 ) 、 ま た は ( 3 ) で表される化 物であ る 、 6肓求項 1 e己載のバ ィ ォセ ンサ • H S ― ( C Η 2 ) 一 X ( 1 )X 一 ( C H 2 ) , S - S - ( C H 2 ) n - X ( 2 )S 一 ( C H 2 ) X ( 3 ： )(伹 し 、 般式 ( 1 ) 、 （ 2 ) 、 および ( 3 ) において n は 1 〜 2 0 の 敕 X はメ チル基、 ベ ンジル基、 ア ミ ノ ベ ンンル基 力 ルポキ シベ ンジル基、 ま たはフ エニル基 で め る ) 、 4 • 刖記両親媒性脂質は L 一 α — ホス フ ァ チジルコ リ ン―ォ レォィ ル一 r ― nルミ ト イ ルであ る 、 請求項 1 に 記載のバィ ォセ ンサ ,ヽ-5 • 刖 電子伝達体は 1 ―メ 卜 キシ ― 5 ― メ チルフェナン 一ゥムであ る 求項 1 に記載のバィ ォセ ンサ 、 6 • 記作用極は 金 白金 または ラ ンゥム を含有す る 求項 1 に記載の nィ ォセ ンサ 7 刖記電極系の対極は 金 白金 また は ラ ンゥム の いずれも含有 していな い 請求項 1 に記 の ィ ォセ ンサ 8 • 、 刖記 極系 の作用極の表面全体 と 、 対極の表面の一部 が刖記一成分膜で被覆さ れてい る 、 請求項 1 に記載のバイ ォセ ンサ 9 • 前記対極の 刖記一成分膜で被覆さ れていない部分の面 積が 刖記作用極の面積 り も大き い、 請求項 8 に記載の バィ ォセ ンサ 1 0 • 前記電極系 の作用極の 面のみが 刖記 成分 で 被覆されている 請求項 1 に記載のバィ ォセ ンサ 1 1 • 記一対の電極の各 は 記試料液の供和路をそ の間に形成する よ に互いに向き □ て配置さ れた 2 つの 絶縁性基扳の対向面上にそれぞれ支持さ れて い る 請求項1 に記載のパィ ォセ ンサ 1 2 記試薬系は m 刖 P H 衝剤 を さ ら に今む 求項 1 に記 のバィ ォセ ンサ 1 3 • パィ ォセ ンサの製造方法で つ て 絶縁性の基板上 に少な < と 対の電極を含む電極系 を 形成するェ程 刖記電極系の少な < と も作用極上に第 の反応層 を設け るェ程でめ て 電極に結 □ または吸着 し得る官能基お び疎水性の灰化水素基を含む有機化 □ 物 を含む溶液を 刖記 作用極に接触させる と を含む ェ程 刖記第 の反応層上に第 の反応 をき口又 ¾けるェ程であ つ て 両親媒性脂質を含む溶液を 記第 の反応層 に接触さ せる と を含む ェ程を包含 し で 刖記有機化 O 物を含む溶液お よび刖 両親媒性 脂質を含む溶液の ち の少な < と も 1 つ は電子伝達体を含 み 刖記両親媒性脂質を含む溶液はさ ら に膜結合型の ピ 口 キ ノ U ンキ ノ ン依存型グル ―ス ヒ ロ ゲナーゼを含 む 方法 1 4 - 第 の反応層お び第 の反応層 は 、 それぞれ単分 子層 を形成 してい る 請求項 1 3 に記載の方法。 1 5 刖記有機化 α 物は 下記 般式 ( 1 ) ( 2 ) ま たは ( 3 ) で表さ れる化合物であ る 求項 1 3 に記載の 方法 -H S ( C H 2 ) 】 - X ( 1 )X ― ( C H 2 ) , - S - - S - ( C H 2 ) X ( 2 )S ( C H 2 ) , - X ( 3 )

(但 し 般式 ( 1 ) ( 2 ) お び ( 3 ) において n は 1 2 0 の整数 X はメ チル基、 ベ ン ジル基、 ア ミ ノ ベ ンジル基、 カ ルポキシベ ンジル基、 ま たはフ エニル基 であ る） 。

1 6 . 前記両親媒性脂質は、 L — ひ 一 ホス フ ァ チジルコ リ ン， /3 — ォ レオイ ル一 ア ーノ ルミ ト イ ルであ る 、 請求項 1 3 に記載の方法。

1 7 . 前記電子伝達体は 1 ー メ ト キ シー 5 — メ チルフ エナ ジニゥムであ る 、 請求項 1 3 に記載の方法。

1 8 . 前記作用極は、 金、 白金、 またはパ ラ ジウム を含有 する、 請求項 1 3 に記載の方法。

1 9 . 前記電極系の対極は、 金、 白金、 またはパ ラ ジウム のいずれ 含有 していない 、 ft求項 1 3 に記 の方法

2 0 刖記電極系の作用極の表面全体 と 、 対極の表面の一 部が前記第一お よび第一の反応層で被覆さ れている 、 求 項 1 3 に記載の方法

2 1 刖記対極の 刖記第一および第一の反 )心層で被覆さ れ ていない部分の面積が 、 刖記作用極の面積よ Ό も大さい 、 求項 2 0 に記載の方法

、 '·

2 2 前記電極系 の作用極の表面のみが 、 刖記第一および 第一の反応 で被 さ れてい る 、 求項 1 3 に記 の方法 層

、

2 3 刖記一対の ¾極の各 は 、 刖記試料液の供給路をそ の間に形成する よ に互い に向 き □ つ て配置さ れた 2 つ の 絶縁性基板の対向面上にそれぞれ支持さ れてい る 、 請求項

1 3 に記載の方法

、

2 4 刖記有機化 □ 物を含む溶液お よび刖記両親媒性脂質 を含む溶液の う ち の少な < と ち 1 つ は 、 P H緩衝剤 を さ ら 請求項 1 3 に記載の方法