JPH01163649A

JPH01163649A - バイオ素子

Info

Publication number: JPH01163649A
Application number: JP62323343A
Authority: JP
Inventors: Michihiro Onishi; 通博大西; Hikari Ishimoto; 光石本
Original assignee: Sony Corp
Current assignee: Sony Corp
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1987-12-21
Publication date: 1989-06-27
Anticipated expiration: 2011-12-18
Also published as: JP2565240B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は複数の生体触媒の組の合わせによる一連の多段
階反応を可能とするバイオ素子に関する。

〔発明の概要〕

本発明は、基体上に単分子型あるいは累積型のラングミ
ュア・ブロジェット膜に生体触媒を固定化したラングミ
ュア・ブロジェット膜−生体触媒複合体を複数個累積す
ることにより、効率の高い多段階反応を可能とするもの
である。

〔従来の技術〕

生体内で起こっている化学反応の多くは多種の生体触媒
が関与する多段階反応であり、これを人工的な系により
模倣しようとする種々の試みがこれまでになされている
。

一ト述のような試みの一つに、固定化酵素カラムを使用
したグリセルアルデヒド−３−リン酸ノ連続合成がある
（「固定化生体触媒」２１９ページ。

講談社すイエンティフィク刊）。上記固定化酵素カラム
は、解糖系に関与している酵素のうちアルドラーゼ、ボ
スホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ
、ヘキソキナーゼの４種の酵素をそれぞれポリアクリル
アミドゲルにより包括して固定化酵素とし、垂直に立て
たカラム内にこれら各固定化酵素を水平な層状に順次詰
めたものである。この固定化酵素カラムにグルコース、
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、およびマグネシウムイ
オンを含む溶液を流すと、グルコースは各固定化酵素の
層を通過するにつれてグルコース−６＝リン酸、フルク
ト−ス−６−リン酸、フルクト−ス−１，６−ニリン酸
を経てグリセルアルデヒド−３−リン酸に変換される。

また別の試のとして、マイクロカプセルリアクターを使
用したデンプンからのグルコノ−δ−ラクトンの製造が
ある（「高分子」第３６巻、９月号。

６７２ページ）。このマイクロカプセルリアクターは、
ポリウレア膜からなるマイクロカプセルの表面にグルコ
アミラーゼ分子が物理吸着され、内部にグルコースオキ
シダーゼが封じごまれた構成を有している。上記マイク
ロカプセルをデンプンを含む水相中に分散させると、該
マイクロカプセル表面に物理的に固定されたグルコアミ
ラーゼによりデンプンが分解され、生成したグルコース
がポリウレア膜を透過して該マイクロカプセル内に流入
し、グルコースオキシダーゼの作用によりグルコノ−δ
−ラクトンに変換される。

〔発明が解決しようきする問題点〕

しかしながら、上述の固定化酵素カラムを使用する技術
においては、Ｊ）反応系が大型化する、１１）各反応段
階における中間生成物が各層間で拡散するため次段の反
応効率が低下する、１１１）反応終了時間が長くなり、
たとえば七ンサーとして使用すると測定時間が著しく長
時間に及ぶ等の問題点がある。

一方、マイクロカプセルリアクターを使用する技術にお
いては、ｌ）たとえば上述の系では２段階反応しか行う
ことができず、３段階以上の多段階反応を行わせるため
にはマイクロカプセルの多重化等、反応系を構築する上
での困難を伴う、１１）各反応段階における酵素活性の
制御が困難である、１１１）マイクロカプセルの外部で
生産された中間生成物の該マイクロカプセル内部への移
行に時間がかかる等の問題点がある。

そこで本発明は、上述の問題点を解決し、小型で効率の
良い多段階反応を可能とするバイオ素子の提供を目的と
する。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明者らは、上述の問題点を解決するためには多段階
反応に関与する各生体触媒を極めて薄い構造を介して精
密に配列する必要があるが、これら生体触媒の変性を防
止する必要から配列過程において高いエネルギーを印加
することができないという条件を踏まえて種々の検討を
重ねた結果、ラングミュア・ブロジェット膜の使用が有
効であることを見出し、本発明に至ったものである。す
なわち本発明にかかるバイオ素子は、基体上に形成され
た単分子型あるいは累積型のラングミュア・ブロジェッ
ト膜の間に生体触媒を固定化したラングミュア・ブロジ
ェット膜−生体触媒複合体が複数累積されてなるもので
ある。

ここで、上記ラングミュア・ブロジェット膜（以下Ｌ　
Ｂ膜と称する。）は単分子型でも累積型でも良い。Ｌ　
Ｂ膜は典型的には水槽（トラフ）を使用して作成され、
まず気水界面に展開した単分子膜にバリアによって一定
の表面圧をかけ、次に該気水界面を横切るように適当な
固体基板を上下させて上記単分子膜を該固体基板上に移
し取る。

この方法はいわゆる垂直浸漬法と呼ばれる方法の一種で
ある。最も安定なＬ　Ｂ膜は２分子層をひとつの単位と
するいわゆるＹ型と呼ばれるものであるが、固体基板の
浸漬時にのめ単分子膜が移行するＸ型、あるいは固体基
板の引き上げ時にのみ単分子膜が移行するＺ型であって
も良い。

ＬＢ膜の作成に関しては、上述の方法の他にも種々の改
良法が提案されているので、目的に応じて適宜選択すれ
ば良い。

上記ＬＢ膜に固定化される生体触媒としては、まず天然
に存在する酵素、補酵素、補助因子等が挙げられる。こ
の他、たとえば表面付近のアミノ酸残基を修飾して表面
電荷あるいは吸着性を変化させた酵素、基質特異性を変
化させた酵素、タンパク質工学を利用して耐熱性や耐圧
性を（４与した酵素等も使用することができる。

さらに、生体触媒は単離精製されたものでなくても良く
、たとえば特定の機能を有する微生物や細胞等をそのま
まＬ　Ｂ　ｉｌｌに固定化したもので代用させでも良い
。

本発明にがかるバイオ素子は、多段階反応系に関与する
生体触媒をＬ　Ｂ膜を介して順次累積することにより、
あらゆる反応系を構築できる可能性を有している。以下
にこのような反応系の例をいくつか挙げる。

■　ＮＡＤ　にコチンアミドーアデニンジヌクレオチ１
′）の合成 □＞　　ＮＡＤ　　にコチンアミト−アテニンソメクレ
オチト）十　ＰＰ１−に記反応系では、生成したピロリ
ン酸を開裂させてオルトリン酸に変化させ平衡を移動さ
せることにより、第１段階の反応を促進する。

■　Ｌ−リジンの合成一−−−−−−−□→Ｌ−リシン　＋　　Ｄ−α−アミ
八へε　−カプロラクタム１ｉ）Ｄ　−α−アミ八へ　
−カブＵラクタムカブロラクタムラセマーセ −−〉Ｄ　　Ｌ　−α−アミＪ−ε−カブ■ラクタム上
記反応系では、第２段階の反応により原料となろうセミ
化合物を再生している。

■　解糖系の一部 ■　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ（還元型ニコチンアミドジヌク
レオチドリン酸）の再生 ■　尿素サイクルのゴ部Ｌ　−シト）トリフ ■　クエン酸サイクルの一部 ■　乳糖の分解ラクターセｉ　）　乳糖　−一一一−−÷グ１１：］−スヘキソキ
ブーセｉｊ）　　クルコース　　　　　　　　　　　り）トコ
ースー６−リン酸■　ＡＴＰ　（アデノシン三リン酸）
の再生ＮＡＤ’　　　　ＮＡＤＩ（１１１）　　酢酸　＋　ＣｏＡ　　　　　　　　　　　
　　アＨＩＬ　　ＣｏＡ　＋　Ｈ□０■　グルタチオン
の合成八ＴＰ　　　　　ＡＤＰ［相］　■、−ロイシンの合成１　）　ギ酸　十　ＰＥＧ　（ポリエチレングリコール
）−ＮＡＤ’ＣＯ□＋ＰＥＧ−ＮＡＤＩ＋ ■　プレドニソロンの合成１　）　１１−テオキンフルチゾン　−一一ン　コルチ
ジールここで、」二記１１−デオキシコルチ゛シンから
コルチヅールへの酸化は、地衣類の一種であるタルブラ
リア・ルナータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　１ｕｎａｔａ
）を添加することにより行っている。

以上■〜■は各種の物質の多段階的な合成あるいは分解
反応の例であり、各反応に必要な酵素あるいは微生物等
をＬＢ膜の間に順次累積すれば、いわゆるバイオリアク
ターを構成することができる。

一方、本発明にかかるバイオ素子にはバイオセン勺−と
しての利用法も考えられる。ずなわら、特定の物質の反
応過程において生した生成物によりで起こる反応系内の
電流変化等を検出し、その物質の濃度等を測定したり、
反応の進行状況をモニターするものである。このような
反応系としては、以下のものが例示される。

■　マルトテトラオースの測定マルトトリオースシンターセｌ　）　マルトテトラオース　−−−マルトトリオース
　−ト　グルゴースフ１１コースオキンターセ１１）　　クルコース　＋　０゜　□９　グ）シＪへδ
−ラクトン　＋　ｌＩ２０□＠　ショ糖の測定インベルクーセ１　）　ン３ｆ唐　−−−−−−−→　り（トコース■
　デンプンの測定り）■コアミラーセｉ　）　デンプン　　　　　　　　　　　　クルコース
クｌＬ：Ｉ−スオキシグーセ１１）　　クルコース　＋　０２　　　　　　　　　　
　　　　　クルコ）−６−ラクトン　＋　１１□０□■
　アンモニアの測定一１１＝＋　）　ＮＨｉ　＋３／２０□−→ＮＯ□−＋１１２０
　＋　ＩＩ’１ｉ）ＮＯ□−＋１／２０□　−□−→間
、−ここで、上記アンモニアの酸化はニトロソモナス（
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、亜硝酸イオンの酸化は硝
化細菌（Ｎｉ　ｔｒｏｂａｃｔｅｒ）により行われる。

［相］　イノシン−５−モノホスフェートの測定ヌクレ
オ子グーセｉ　）　イノシン−５−モ１本スフエート　　　　　　
　　　　　　イノシン　＋　Ｐｉ以」二＠〜［相］の例
においては、分解反応により生成する過酸化水素、硝酸
イオン等が起こす反応系内の電流変化を検出して、それ
ぞれ出発物質の濃度を測定したり、反応の進行状況をモ
ニターすることができる。

このように、本発明にかかるノ入イオ素子ではＬＢ膜を
介してあらゆる生体触媒を何層にも順次配列することが
できるが、これらの生体触媒は各層ごとに異なっている
必要はない。たとえば、同じ生体触媒を含む層を幾つか
連続して配置することにより触媒活性を制御することが
可能であり、これは−層当たりの活性量を制御するより
も容易に実施できる。

〔作用〕

本発明にかかるバイオ素子においては、各生体触媒がＬ
　Ｂ膜を介して何層にも配列されるため、個々の層の安
定性が確保されれば理論的には何段階の反応系でも構築
することができ、しかも素子全体を極めて小型化するこ
とができる。また、個々の生体触媒を含む層は非常に薄
いので、中間生成物が拡散する以前に次の段階の反応に
移行することができ、反応効率が向上すると共に、全反
応終了時間が短縮される。さらに生体触媒の種類によっ
ては、Ｌ　Ｂ膜に吸着された状態は実際の生体内におい
て生体膜に固定化されている状態に類催しているものと
考えらるので、木バイオ素子は生体触媒の保護・安定化
の観点からも有効である。

〔実施例］以下、本発明の好適な実施例について図面を参照しなが
ら説明する。

本実施例は、Ｌ　Ｂ膜としてトリメチルステアリルアン
モニウムクロリド（以下、ＴＳＡと称する。）とアラキ
ン酸メチル（以下、ＭＡと称する。）の混合膜（以下、
ＴＳＡ−ＭＡ膜と称する。）およびアラキン酸膜（以下
、ＡＡ膜と称する。）を、また生体触媒としてグルコア
ミラーゼ（以下、ＧＡと称する。）およびグルコースオ
キシダーゼ（以下、ＣＯＤと称する。）を使用し、デン
プンの加水分解によるグルコースの生成、および生成し
たグルコースの酸化によるグルコノ−δ−ラクトンの生
成を連続的に行わせる例である。

上記反応は、次式により表される。

グルコアミラーゼｉ　）　デンプン　＋　１１□０　−□）　　クルコー
ス　　ｅｔｃ。

グルコースオキシダーゼ１１）　　クルコース　＋　０□　　　　　　　　　　
　　　　　グルコ／−６−９クトン　＋　８２０□上述
のような反応を可能とするバイオ素子の構成を模式的に
示すと第１図のようになる。このバイオ素子は、親水基
側にＧ　Ａ　（２）を吸着したＴＳＡ−ＭＡ膜（１）の
単分子膜２層が相対向した第１の反応層（３）、親水基
側にＧ　ＯＤ　（５）を吸着したＡＡ膜（４）の単分子
Ｎ２層が相対向した第２の反応層（６）、該第２の反応
層（６）のアラキン酸の疎水基に接し、上記反応系内の
電流変化を検出するための金電極（７）を被着した石英
ガラス基板（８）から構成されている。

ここで、１）の反応は」上記第１の反応層（３）内で進
行し、１１）の反応は上記第２の反応層（６）内で進行
する。第２の反応層（６）内では反応の進行に伴ってＨ
２Ｏ２が生成するが、これはただちに反応系内の電流変
化として金電極（７）により検出される。

上述のようなバイオ素子は、ガラス基板（８）上にまず
第２の反応層（６）を、続いて第１の反応層（３）を累
積することにより作成することができる。以下に、いわ
ゆる単分子掃引法によるバイオ素子の作成法を述べる。

まず、３個の水槽が仕切りを介して一列に並べられた３
槽式フロムヘルツ型トラフの各水槽に純水を満たし、左
端の水槽にはクロロポルムに溶解したアラキン酸（ＡＡ
）を滴下し、右端の水槽にはＣ０Ｄを５０ｍｇ／ｄｆｆ
の濃度となるように溶解する。ＡＡを滴下した左端の水
槽ではＡＡが純水の表面に気体膜となって広がっている
ので、バリヤを移動させることによりこの気体膜に３０
ｍＮ−ｍ−’の表面圧を加えて固体膜とし、ＡＡの単分
子膜（ＡＡ膜）を形成する。

次に、上記ＡＡ膜をＣＯＤを溶解した右端の水槽へ掃引
し、１時間保持してＣＯＤを吸着させる。

次に、」上記ＧＯＤを吸着したＡＡ膜を再び左端の水槽
まで掃引する。このとき、純水のみを満たした真中の水
槽を通過することにより余分のＣＯＤを除去している。

左端の水槽ではバリヤを移動させて３５ｍＮ−ｍ−’の
表面圧を加える。この表面圧を一定に保ったまま、この
層に対して予め２個の金電極を被着形成しかつ表面を疎
水化した石英ガラス基板を垂直に横切るように上下させ
る。すると、まず該石英ガラス基板の下降に伴ってＡＡ
膜がその疎水基を石英ガラス基板の方へ向けるようにし
て配向する。この段階で、石英ガラス基板の表面にはＡ
Ａ膜の親水基を介して親水性のＣＯＤが吸着された状態
となっている。次にこの石英ガラス基板を引き上げると
、今度はＡＡ膜の親水基がその親水基を該石英ガラス基
板の方へ向けるようにして配向する。このようにして、
ＣＯＤが２層のＡＡ膜でサンドインチされた状態の第２
の反応層が石英ガラス基板上に形成される。

次に、同じく３槽式フロムヘルツ型トラフの各水槽に純
水を満たし、左端の水槽にはトリメデルステアリルアン
モニウムクロリド（ＴＳＡ）とアラキン酸メチルエステ
ル（ＭＡ）の１：４混合物をクロロホルム溶液としたも
のを滴下し、右端の水槽にばＧＡを５０ｍｇ／ｄでの濃
度となるように溶解する。ＴＳＡとＭＡを滴下した左端
の水槽ではこの両者が純水の表面に気体膜となって広が
っているので、バリヤを移動させることによりこの気体
膜に３０ｍ　Ｎ　−ｍ−’の表面圧を加えて固体膜とし
、ＴＳＡとＭＡの混合単分子膜（ＴＳＡ−ＭＡ膜）を形
成する。

次に、」二記ＴＳＡ−ＭＡ膜をＧＡを溶解した右端の水
槽へ掃引し、１時間保持してＧＡを吸着させる。

次に、上記ＧＡを吸着したＴＳＡ−ＭＡ膜を再び左端の
水槽まで掃引し、バリヤを移動さゼて３５ｍＮ・ｍ−’
の表面圧を加える。ここへ、先に第２の反応層を表面に
形成した上記石英ガラス基板を垂直に横切るように上下
させる。すると、同様にしてＧＡがＴＳＡ−ＭＡ膜でサ
ンドイッチされた状態の第１の反応層が形成される。こ
のようにして、第１の反応層と第２の反応層が累積され
たバイオ素子が作成される。

このようにして作成されたバイオ素子を使用して、実際
に上記反応による電流変化を測定した。まず、通常の吸
光分析用の１　ｃｍＸ　Ｉ　ｃｍのガラスセルに０．０
５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，帆２０°Ｃ）を満たし、上記
バイオ素子をセットし、ポテンショスタンドと結線した
。上記ポテンショスタンドから０．８■の電圧を印加し
、定電圧となったところで初濃度が５００ｍ　ｇ　／　
ｄ　ｐ、となるように可）容性デンプンを上記酢酸緩衝
液に添加した。

ここで、反応の進行に伴う電流変化の様子を第２図に示
す。この図において、縦軸は電流（ｎＡ）、横軸は可溶
性デンプンを添加した時点からの経過時間（分）をそれ
ぞれ表す。電流の変化が可溶性デンプンの添加後ただち
に現れていることから、木バイオ素子において極めて迅
速にグルコノ−δ−ラクトンが生産され、これに伴って
副生ずる１１□０２が鋭敏に検出されていることがわか
る。

〔発明の効果〕

以上の説明からも明らかなように、本発明にがかるバイ
オ素子においてはＬ　Ｂ膜が使用されているために、多
段階反応系を容易に構築することができ、しかも個々の
段階の反応に関与する生体触媒を極めて狭い間隔で安定
に配列することができる。したがって、本バイオ素子を
バイオリアクターとして使用する場合には高速で効率の
良い反応が期待でき、またハイオセンザーとして使用す
る場合には極めて鋭敏な検出能力が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかるバイオ素子の構成の一例を示す
模式図である。第２図は上記バイオ素子をデンプンの分
解反応系に適用した場合の電流変化を示す特性図である
。特許出願人　　　　ソニー株式会社代理人　弁理士　　　　小　池　　　見回　　　田村榮
− 同　　　佐藤　腋

Claims

【特許請求の範囲】

基体上に形成された単分子型あるいは累積型のラングミ
ュア・ブロジェット膜の間に生体触媒を固定化したラン
グミュア・ブロジェット膜−生体触媒複合体が複数累積
されてなるバイオ素子。